ES2924863T3 - Conjugados que comprenden nanopartículas recubiertas con derivados de platino a través de enlazadores que contienen sulfonilo o fosfonilo - Google Patents

Conjugados que comprenden nanopartículas recubiertas con derivados de platino a través de enlazadores que contienen sulfonilo o fosfonilo Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a conjugados que tienen estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores de fórmula (II) que comprenden un resto sulfonilo o un resto fosfonilo como se define en este documento, y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores, donde: NP es una nanopartícula de oro, plata o platino; con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) estén en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en medio acuoso. También se relaciona con un proceso para la preparación de estos conjugados y con composiciones farmacéuticas. conteniéndolos. Los conjugados de la invención se usan para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados que comprenden nanopartículas recubiertas con derivados de platino a través de enlazadores que contienen sulfonilo o fosfonilo
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea 19382009.9 presentada el 08.01.2019.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a conjugados que comprenden nanopartículas funcionalizadas con compuestos de platino, donde el agente quimioterápico está unido al menos parcialmente a la nanopartícula a través de un enlazador específico que tiene un grupo terminal sulfonilo o fosfonilo. Los conjugados de la invención muestran una mayor liberación del fármaco, y una estabilidad y eficacia mejoradas contra las células tumorales. La invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de estos conjugados y a composiciones farmacéuticas que los contienen, así como a su uso en el tratamiento del cáncer.
Estado de la técnica
Los compuestos de platino desempeñan un papel importante en la quimioterapia del cáncer. El cisplatino, la primera generación de fármacos quimioterápicos a base de platino, es uno de los agentes antineoplásicos más comunes, y tiene un amplio espectro de actividad antineoplásica. Sin embargo, inconvenientes tales como la escasa selectividad entre células malignas y normales, que genera efectos tóxicos graves (tales como nefrotoxicidad, neurotoxicidad y ototoxicidad), y la presencia de resistencia intrínseca o adquirida, que obliga a aumentar la dosis, limitan enormemente su eficacia. Por otra parte, el cisplatino tiene inconvenientes adicionales, tales como baja solubilidad en soluciones acuosas y efectos secundarios tales como náuseas y vómitos.
Aunque se han dedicado grandes esfuerzos en superar estos importantes problemas mediante el desarrollo de nuevas generaciones de derivados del platino que sean menos tóxicos y más activos que el cisplatino y/o que no muestren resistencia cruzada, las mejoras son todavía bastante pequeñas. Por tanto, los fármacos a base de platino de segunda generación, tales como carboplatino u oxaliplatino, tienen toxicidades renales y gastrointestinales inferiores, pero la toxicidad de la médula ósea provocada por el carboplatino y la neurotoxicidad del oxaliplatino son limitantes. Su espectro antineoplásico y su eficacia son diferentes a los del cisplatino.
Los sistemas de liberación de fármacos en los que los portadores incorporan el fármaco a través de enlaces químicos o adsorción pasiva pueden liberar el fármaco a células específicas y evitar la eliminación por parte del sistema inmunitario. De forma ideal, dichos sistemas de liberación extravasan la vasculatura del tumor y se acumulan dentro del entorno tumoral. Un sistema de liberación de partículas capaz de liberar un fármaco contra el cáncer únicamente dentro del tumor también puede reducir la acumulación del fármaco en los tejidos sanos.
Hay varios sistemas de liberación de fármacos descritos en la bibliografía que se basan en nanomateriales. En algunos casos, el fármaco se adsorbe en el nanomaterial o se encapsula en nanocápsulas. En otros casos, se une covalentemente a la superficie del nanomaterial.
En este contexto, el documento WO 2010/069941 divulga derivados de platino conjugados con nanopartículas de oro a través de enlazadores que contienen azufre que tienen grupos terminales carboxilo, tales como, por ejemplo, ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA), para el tratamiento del cáncer.
La investigación de nuevos sistemas de liberación de fármacos en el cáncer es todavía un campo emergente, y existe la necesidad de explorar más a fondo sistemas de liberación que aumenten la eficacia y seguridad relativas de una terapia contra el cáncer y reduzcan la resistencia del tumor.
Resumen de la invención
Los inventores han descubierto que, cuando los conjugados que contienen platino divulgados en el documento WO 2010/069941 se modifican de manera que los grupos terminales carboxilo de los enlazadores se reemplazan al menos parcialmente por grupos terminales sulfonilo o fosfonilo, los conjugados resultantes muestran una mayor liberación de los compuestos de platino unidos a una mayor velocidad de liberación.
Además de eso, como se ilustra en los ejemplos que figuran más adelante, la modificación del ácido carboxílico terminal del enlazador por un resto ácido de un heteroátomo tal como P o S no solo tiene un efecto en el perfil de liberación, sino que también mejora inesperadamente tanto la estabilidad de los conjugados en condiciones fisiológicas, como su eficacia frente a las células tumorales, lo que podría ayudar a reducir la resistencia del tumor. No es posible predecir a priori ningún efecto sobre la eficacia de los conjugados in vivo a partir de un perfil de liberación dado debido al balance entre riesgos y beneficios. Por tanto, mientras que cabría esperar que una mayor liberación a una mayor velocidad podría ser ventajosa para obtener un efecto antitumoral más rápido, esto también podría conducir a un aumento de la liberación inespecífica y, por lo tanto, a una posible toxicidad debido a la alta acumulación sistémica del fármaco quimioterápico libre.
Adicionalmente, es difícil predecir cómo un cambio en las propiedades físico-químicas del conjugado, en particular, un cambio en los grupos terminales de los enlazadores, (por ejemplo, la carga superficial y/o la densidad de la capa de ligando) puede afectar a la eficacia contra las células tumorales teniendo en cuenta que hay muchos actores que desempeñan un papel in vivo, tales como, por ejemplo, la captación celular, interacciones con el sistema inmunitario, así como la penetración tumoral del conjugado, que finalmente determina una mayor o menor acumulación por el efecto de Potenciación de la Retención y la Permeabilidad (PRP) en los tumores.
Adicionalmente, los conjugados de la invención son muy solubles en comparación con los compuestos de platino libres utilizados en la actualidad, cuya solubilidad es baja.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores L unidos a la nanopartícula, y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores, en donde:
NP es una nanopartícula de oro, plata o platino;
los enlazadores L comprenden enlazadores de fórmula (II): en donde:
Figure imgf000003_0001
cuando n es 0, el enlazador de fórmula (II) está unido a la nanopartícula NP a través de un átomo de azufre; y cuando n es 1, el enlazador de fórmula (II) está unido a la nanopartícula NP a través de dos átomos de azufre; p representa un valor seleccionado de 1 a 3; y
X representa una cadena de hidrocarburo (C2-C20), o una cadena de hidrocarburo (C2-C20) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N; y en donde estas cadenas de hidrocarburo (C2-C20) están opcionalmente sustituidas con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, OH, CONH2, CO2-alquilo (C-i-Ca) y -CHO;
— o bien está ausente o, alternativamente, representa un enlace sencillo; en donde:
cuando — está ausente, Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i) o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (¡i):
Figure imgf000003_0002
y cuando — es un enlace sencillo, Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii'), que está unido a A por el átomo de oxígeno:
Figure imgf000004_0001
los grupos A son birradicales de platino (II) seleccionados independientemente del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V), fórmula (VI), y una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos:
Figure imgf000004_0002
en donde el birradical de platino (II) está unido a dos moléculas de enlazador independientes de fórmula (II), en donde — es un enlace sencillo, e Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii'), a través del átomo de oxígeno del resto de fórmula (i') o (ii');
con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L del conjugado se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
Este aspecto también se puede formular como un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP y una pluralidad de enlazadores L unidos a la nanopartícula, en donde una cantidad igual o inferior al 50% de los enlazadores L también se une a los grupos A; y en donde la nanopartícula NP, los enlazadores L, los grupos A son como se han definido anteriormente.
Particularmente, en el primer aspecto de la invención, una cantidad igual o superior al 55% de los enlazadores L son enlazadores de fórmula (II). Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores L que están unidos a la nanopartícula y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores; en donde una cantidad igual o superior al 55% de los enlazadores L son enlazadores de fórmula (II); en donde la nanopartícula NP, los enlazadores de fórmula (II) y los grupos A son como se han definido anteriormente; y con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L del conjugado se encuentre en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
Este segundo aspecto también se puede formular como un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP y una pluralidad de enlazadores L unidos a la nanopartícula, en donde:
i) una cantidad igual o inferior al 50% de los enlazadores L están unidos a grupos A,
ii) una cantidad igual o superior al 55% de los enlazadores L son enlazadores de fórmula (II); y en donde la nanopartícula NP, los enlazadores de fórmula (II) y los grupos A son como se han definido anteriormente.
Un tercer aspecto se refiere al conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores de fórmula (II) unidos a la nanopartícula,
Figure imgf000004_0003
y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores, en donde:
NP es una nanopartícula de oro, plata o platino;
n representa 0 o 1; en donde:
cuando n es 0, el enlazador de fórmula (II) está unido a la nanopartícula NP a través de un átomo de azufre; y cuando n es 1, el enlazador de fórmula (II) está unido a la nanopartícula NP a través de dos átomos de azufre; p representa un valor seleccionado de 1 a 3; y
X representa una cadena de hidrocarburo (C2-C20), o una cadena de hidrocarburo (C2-C20) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N; y en donde estas cadenas de hidrocarburo (C2-C20) están opcionalmente sustituidas con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, OH, CONH2, CO2-alquilo (C1-C6) y -CHO;
— o bien está ausente o, alternativamente, representa un enlace sencillo; en donde:
cuando — está ausente, Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i) o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (¡i):
Figure imgf000005_0001
(i) (i¡)
y cuando — es un enlace sencillo, Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (¡¡'), que está unido a A por el átomo de oxígeno:
Figure imgf000005_0002
(¡') ("')
los grupos A son birradicales de platino (II) seleccionados independientemente del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V), fórmula (VI), y una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos:
Figure imgf000005_0003
en donde el birradical de platino (II) está unido a dos moléculas de enlazador independientes de fórmula (II), en donde — es un enlace sencillo, e Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii'), a través del átomo de oxígeno del resto de fórmula (i') o (ii');
con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
Este tercer aspecto también puede formularse como un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP y una pluralidad de enlazadores de fórmula (II) unidos a la nanopartícula; en donde una cantidad igual o inferior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) se unen a los grupos A; y en donde la nanopartícula NP, los enlazadores de fórmula (II) y los grupos A son como se han definido anteriormente.
Los conjugados coloidales estables de la invención se pueden preparar convenientemente mediante un método de conjugación apropiado. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un conjugado como se ha definido anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
a) hacer reaccionar una nanopartícula NP de oro, plata o platino con un exceso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en la fórmula (Ila), fórmula (IIb), y una sal cualquiera del compuesto de fórmula (IIa) o del compuesto de fórmula (IIb),
Figure imgf000006_0001
en donde X y p tienen el mismo significado definido anteriormente, e Y es un resto sulfonilo de fórmula (i') o un resto fosfonilo de fórmula (ii') como se ha definido anteriormente; en una solución acuosa para dar lugar a un conjugado intermedio; en donde:
cuando se utiliza un compuesto de fórmula (IIa) o una sal del mismo, se obtiene un conjugado intermedio en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 0; y
cuando se utiliza un compuesto de fórmula (IIb) o una sal del mismo, se obtiene un conjugado intermedio en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 1;
b) hacer reaccionar el conjugado intermedio obtenido en la etapa a) con una cantidad apropiada de un compuesto de platino (II) seleccionado del grupo que consiste en la fórmula (IVa), fórmula (Va), fórmula (VIa) y una sal de cualquiera de las fórmulas (IVa), (Va) o (VIa):
Figure imgf000006_0002
en una solución acuosa en presencia de una base, para obtener el conjugado deseado.
Los conjugados de la presente invención pueden administrarse a mamíferos, incluidos los seres humanos, que padezcan un cáncer. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados definidos anteriormente junto con uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento del cáncer.
También se describe en el presente documento, pero sin formar parte de la presente invención, el uso de los conjugados definidos anteriormente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Alternativamente, este aspecto, que no forma parte de la presente invención, también puede formularse como un método para el tratamiento del cáncer en un mamífero, incluido un ser humano, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de los conjugados definidos anteriormente junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra una vista esquemática de un conjugado de acuerdo con la invención, en particular, un conjugado de fórmula (I) NP-L-A, donde NP es una nanoesfera de oro; L corresponde al enlazador que contiene un resto fosfonilo; y A es un birradical de platino (II) obtenido a partir de cisplatino.
La FIG. 2 es una imagen de MET representativa de las nanopartículas obtenidas en el ejemplo 1 (izquierda) y el histograma correspondiente (C = recuentos, derecha) que muestra un diámetro promedio de la nanopartícula de 14,6 /-1,8 nm.
La FIG. 3 muestra los espectros UV-Vis de las diferentes fases de funcionalización del ejemplo 1 (AuNP, AuNP-MPA y AuNP-MPA-cisPt, izquierda) y del ejemplo 2 (AuNP, AuNP-MPA y AuNP-MPA-oxaliPt, derecha).
La FIG. 4 muestra los espectros UV-Vis de las diferentes fases de funcionalización del ejemplo 3 (AuNP, AuNP-MSA y AuNP-MSA-cisPt, izquierda) y del ejemplo 4 (AuNP, AuNP-MSA y AuNP-MSA-oxaliPt, derecha).
La FIG. 5 muestra los espectros UV-Vis de las diferentes fases de funcionalización del ejemplo comparativo 1 (AuNP, AuNP-MUA y AuNP-MUA-cisPt, izquierda) y del ejemplo comparativo 2 (AuNP, AuNP-MUA y AuNP-MUA-oxaliPt, derecha) y la carga de cisplatino.
La FIG. 6 muestra el % de compuesto de platino liberado del conjugado del ejemplo comparativo 1 (AuNP-MUA-cisPt, izquierda) y del conjugado del ejemplo comparativo 2 (AuNP-MUA-oxaliPt, derecha) a diferentes valores de pH.
La FIG. 7 muestra el % de compuesto de platino liberado del conjugado del ejemplo 1 de la invención (AuNP-MPA-cisPt, izquierda) y del conjugado del ejemplo 2 de la invención (AuNP-MPA-oxaliPt, derecha) a diferentes valores de pH.
La FIG. 8 muestra el % de compuesto de platino liberado del conjugado del ejemplo 1 de la invención (AuNP-MSA-cisPt, izquierda) y del conjugado del ejemplo 2 de la invención (AuNP-MSA-oxaliPt, derecha) a diferentes valores de pH.
La FIG. 9 muestra los resultados de la estabilidad en medios de cultivo celular de los conjugados del ejemplo comparativo 1 (izquierda) y de los conjugados del ejemplo 1 (derecha) hasta las 24 h.
La FIG. 10 muestra los resultados de los experimentos de viabilidad celular con los conjugados del ejemplo comparativo 1 (AuNP-MUA-cisplatino).
La FIG. 11 muestra los resultados de los experimentos de viabilidad celular con los conjugados del ejemplo 1 (AuNP-MPA-cisplatino) (izquierda) y del ejemplo 3 (AuNP-MSA-cisplatino) (derecha).
Descripción detallada de la invención
Todos los términos del presente documento como se usan en la presente solicitud, a menos que se indique de otro modo, se entenderán en su significado habitual, como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos como se usan en la presente solicitud son como se establecen a continuación y tienen por objeto aplicarse a lo largo de la descripción y las reivindicaciones.
El término "aproximadamente" o la expresión "alrededor de", como se usan en el presente documento, se refiere a un intervalo de valores ±10% de un valor especificado. Por ejemplo, la expresión "aproximadamente 10" o "alrededor de 10" incluye ±10% de 10, es decir, de 9 a 11.
Como se ha mencionado anteriormente, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores L unidos a la nanopartícula, y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores.
Para los fines de la invención, "enlazadores L" se refiere a todos los enlazadores presentes en la nanopartícula que pueden ser de un tipo (es decir, solo enlazadores de fórmula (II), que pueden ser iguales o diferentes) o, alternativamente, de diferentes tipos (por ejemplo, una mezcla de enlazadores de fórmula (II) y enlazadores de fórmula (III)).
Como se utiliza en el presente documento, el término "pluralidad" se refiere a un número superior a uno, y es equivalente a las expresiones "dos o más" o "al menos 2".
Cuando los conjugados de la invención se definen como aquellos que comprenden una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores L unidos a la nanopartícula, y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores, las expresiones "pluralidad de enlazadores" y "pluralidad de grupos A" no significan lo mismo, es decir, el número de enlazadores no es el mismo que el número de grupos A, ya que deben cumplir la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L (es decir, todos los enlazadores presentes en el conjugado) estén en forma iónica cuando el conjugado está en un medio acuoso. Esta condición también se puede formular de manera que una cantidad igual o inferior al 50% de los enlazadores L del conjugado se unen a los grupos A. Como se explica a continuación, para que un conjugado tenga estabilidad coloidal es necesario que al menos algunos de los enlazadores permanezcan desprotonados in vivo y no estén unidos a los grupos A.
De acuerdo con la invención, el término "conjugado" se refiere a una nanopartícula metálica (también denominada en el presente documento NP) que está unida a una pluralidad de compuestos de platino a través de enlazadores, en donde al menos parte de los enlazadores, particularmente una cantidad igual o superior al 55% de los enlazadores, tienen un grupo terminal sulfonilo o fosfonilo. Mediante una nomenclatura simplificada, el conjugado de la invención también se denomina en el presente documento NP-L-A. Sin embargo, como se describe en el presente documento, esta nomenclatura simplificada pretende describir un conjugado en donde no todos los enlazadores L del conjugado (siendo particularmente el 55% o más de los enlazadores L enlazadores de fórmula (II) que tienen un grupo terminal sulfonilo o fosfonilo) están conjugados con grupos A de platino. Particularmente, una cantidad igual o inferior al 50% de los enlazadores del conjugado están unidos a grupos A.
Más particularmente, la nanopartícula está unida a la pluralidad de enlazadores L a través de enlaces pseudocovalentes, como el que se produce entre el S y el Au (aproximadamente 45 kcal/mol), y parte de los enlazadores están unidos a los compuestos de platino a través de un enlace de coordinación entre el O y el Pt. El enlace de coordinación no es sensible a variaciones débiles del pH. Solo se obtiene una liberación significativa del fármaco de platino a un pH inferior a 5-6. Por tanto, aunque el conjugado es estable en suero, libera su carga de fármaco cuando se baja el pH, como ocurre en el endolisosoma de una célula tumoral.
En los conjugados de la invención, los enlazadores y/o los birradicales de platino (II) pueden tener centros quirales que pueden dar lugar a diferentes estereoisómeros. Como se utiliza en el presente documento, el término "estereoisómero" se refiere a todos los isómeros de enlazadores individuales que difieren únicamente en la orientación de sus átomos en el espacio. El término estereoisómero incluye isómeros de imagen especular (enantiómeros), mezclas de isómeros de imagen especular (racematos, mezclas racémicas), isómeros geométricos (cis/trans o syn/anti o E/Z), e isómeros de compuestos con más de un centro quiral que no son imágenes especulares entre sí (diastereoisómeros). La presente invención abarca cada uno de estos estereoisómeros y también sus mezclas. Los diastereoisómeros y enantiómeros se pueden separar mediante técnicas convencionales como la cromatografía o la cristalización fraccionada. Los isómeros ópticos pueden resolverse mediante técnicas convencionales de resolución óptica para dar isómeros ópticamente puros. Esta resolución se puede llevar a cabo sobre cualquier intermedio sintético quiral o sobre compuestos de la invención. Los isómeros ópticamente puros también se pueden obtener individualmente mediante síntesis enantioespecífica.
Los conjugados de la invención comprenden nanopartículas de oro, plata o platino. Estos metales muestran una alta afinidad por los grupos de azufre (incluidos los grupos SH tiol y los grupos S-S disulfuro), tales como los presentes en un compuesto de fórmula (IIa) o fórmula (IIb)
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en donde X y p tienen los significados descritos previamente, e Y es un resto sulfonilo de fórmula (i') o un resto fosfonilo de fórmula (ii') como se ha definido anteriormente.
Por tanto, un grupo tiol libre (SH) o un grupo disulfuro (S-S) tienen una alta tendencia a reaccionar espontáneamente con la nanopartícula metálica para formar un enlace pseudocovalente metal-S. La unión fuerte entre el enlazador y la nanopartícula es necesaria para evitar la desorción de la molécula de enlazador.
Adicionalmente, la nanopartícula inorgánica es una buena antena para los campos electromagnéticos, incluidos, por ejemplo, los rayos y, radiografías, infrarrojo cercano (NIR) o UV-Vis y microondas).
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, se utilizan nanopartículas de oro (en el presente documento también denominadas AuNP). Las AuNP tienen una fuerte absorción y dispersión potenciadas por plasmón superficial, lo que las hace ideales como marcadores de imágenes y agentes de contraste. No son susceptibles al fotoblanqueo, son biocompatibles y no son citotóxicas. Por otra parte, pueden calentarse cuando absorben luz a su frecuencia resonante, lo que permite el tratamiento fototérmico del cáncer o pueden potenciar la eficacia de la radioterapia mediante la generación de electrones Auger tras la exposición del oro a los rayos X.
Para los fines de la invención, el término "nanopartículas" se refiere a partículas de tamaño nanométrico que pueden tener diferentes formas y tamaños. En cuanto a la forma de las nanopartículas descritas en el presente documento, las esferas y los poliedros que comprenden caras planas y aristas rectas están comprendidas dentro del alcance de la invención. Los ejemplos de dichos poliedros incluyen, sin limitación, cubos, prismas y varillas. Los poliedros tienen la ventaja de que pueden ser sensibles al infrarrojo cercano (NIR) y, por lo tanto, las nanopartículas pueden calentarse localmente. En una realización preferida, las nanopartículas son esferas. En una realización preferida, las nanopartículas son nanoesferas de oro.
El tamaño de la nanopartícula debe ser aquel que permita prolongar la vida en plasma, es decir, el conjugado permanece en la circulación sistémica hasta que encuentra capilares tumorales hiperpermeables.
En el caso de las nanoesferas, el diámetro está comprendido en el intervalo de 3 a 100 nm, preferentemente, en el intervalo de 4 a 20 nm.
En el caso de los nanocubos y los nanoprismas, el tamaño se define en términos de la esfera, inscrita dentro del nanocubo o del nanoprisma, que tiene el máximo diámetro posible. En ambos casos, el diámetro de dicha esfera está comprendido en el intervalo de 3 a 100 nm, preferentemente, en el intervalo de 4 a 20 nm.
Además, en el caso de las varillas, el tamaño es de 100 nm de largo y 15 nm de ancho, preferentemente 45 nm de largo x 15 nm de ancho.
Los valores de tamaño mencionados anteriormente producen conjugados que son lo suficientemente grandes para evitar el riñón y lo suficientemente pequeños para minimizar las interacciones con el sistema reticuloendotelial, parte del sistema inmunitario, que consiste en las células fagocíticas ubicadas en el tejido conjuntivo reticular, principalmente monocitos y macrófagos. Por otra parte, este tamaño de los conjugados de la invención (superior al de pequeñas moléculas esenciales como aminoácidos o pequeños péptidos) favorece la endocitosis.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, las nanopartículas son nanoesferas de la invención que tienen un diámetro igual o inferior a 20 nm, más particularmente, de 4 a 20 nm, de 10 a 20 nm, y aún más particularmente aproximadamente 14 nm. En una realización más particular, las nanopartículas son nanoesferas de oro.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, las nanopartículas son nanocubos o nanoprismas en donde su esfera inscrita tiene un diámetro de aproximadamente 10-15 nm.
Los conjugados de la invención comprenden una pluralidad de enlazadores de fórmula (II),
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en donde —, X, Y, n y p tienen los significados descritos anteriormente.
En el enlazador de fórmula (II), X representa una cadena de hidrocarburo (C2-C20), o una cadena de hidrocarburo (C2-C20) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N; y en donde estas cadenas de hidrocarburo (C2-C20) están opcionalmente sustituidas con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, OH, CONH2 , CO2-alquilo (C-i -Ca) y -CHO.
Para los fines de la presente invención, la expresión cadena de hidrocarburo (C2-C20) se refiere a una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que comprende de 2 a 20 átomos de carbono que puede comprender opcionalmente una o más insaturaciones en forma de dobles enlaces y/o triples enlaces.
En el enlazador de fórmula (II), n representa 0 o 1. Cuando n es 0, el enlazador está unido a la nanopartícula NP metálica a través del único átomo de azufre disponible; mientras que, cuando n es 1, está unido a la nanopartícula NP a través de los dos átomos de azufre como se ilustra a continuación:
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En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (II), n = 0.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (II), n = 1.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (II), X representa una cadena de hidrocarburo (C6-C15) saturada o una cadena de hidrocarburo (C6-C15) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N, opcionalmente sustituido como se ha definido previamente.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (II), X representa una cadena de hidrocarburo (C2-C20) no sustituido o una cadena de hidrocarburo (C2-C20) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N, particularmente una cadena de hidrocarburo (C2-C20) no sustituido.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (II), X representa -(CH2)m- y, en donde m representa un valor de 2 a 20, más particularmente de 6 a 15, aún más particularmente de 8 a 12, y aún más particularmente m es 10 u 11.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, una cantidad igual o superior al 55% de la cantidad total de enlazadores presentes en la nanopartícula son enlazadores de fórmula (II).
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, una cantidad del 50 al 100%, más particularmente del 55 al 95%, más particularmente del 60 al 95% y aún más particularmente del 75 al 95% de la cantidad total de enlazadores presentes en la nanopartícula son enlazadores de fórmula (II).
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, todos los enlazadores L de los conjugados de la invención son enlazadores de fórmula (II), es decir, el 100% de la cantidad total de enlazadores presentes en la nanopartícula son enlazadores de fórmula (II).
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, el conjugado de la invención tiene diferentes tipos de enlazadores de fórmula (II), es decir, enlazadores de fórmula (II) que tienen diferentes estructuras químicas.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, todos los enlazadores de fórmula (II) del conjugado de la invención son iguales, es decir, todos los enlazadores de fórmula (II) tienen la misma estructura química.
Como se ha mencionado anteriormente, en el enlazador de fórmula (II), Y puede ser un resto sulfonilo o un resto fosfonilo. En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en todos los enlazadores de fórmula (II) presentes en el conjugado de la invención, Y es un resto sulfonilo. En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en todos los enlazadores de fórmula (II) presentes en el conjugado de la invención, Y es un resto fosfonilo. En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los enlazadores de fórmula (II) presentes en el conjugado de la invención comprenden enlazadores, donde Y es un resto sulfonilo y enlazadores en los que Y es un resto fosfonilo. Por ejemplo, los enlazadores de fórmula (II) del conjugado pueden comprender el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de enlazadores, donde Y es un resto sulfonilo, siendo el resto de los enlazadores de fórmula (II) enlazadores donde Y es un resto fosfonilo.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los enlazadores de fórmula (II) se seleccionan del grupo que consiste en:
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10, e Y es un resto sulfonilo (es decir, 10-mercaptodecanosulfonilo, también denominado en el presente documento enlazador MSA);
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 11, e Y es un resto sulfonilo (es decir, 11-mercaptoundecilsulfonilo);
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10, e Y es un resto fosfonilo (10-mercaptodecilfosfonilo);
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 11, e Y es un resto fosfonilo (11­ mercaptoundecilfosfonilo, también denominado en el presente documento MPA); y
- una combinación de los mismos.
En una realización del primer aspecto, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los enlazadores L de los conjugados de la invención comprenden una pluralidad de fórmula (II), y una pluralidad de enlazadores de fórmula (III):
Figure imgf000011_0001
en donde X, p y n son como se definen para los enlazadores de fórmula (II), y
— o bien está ausente o, alternativamente, representa un enlace sencillo; en donde:
cuando — está ausente, Z es un resto de fórmula (iii):
Figure imgf000011_0002
en donde s representa un valor de 0 a 1; y
cuando — es un enlace sencillo, Z es un resto de fórmula (iii'), que está unido a A por los átomos de oxígeno:
Figure imgf000011_0003
en donde s representa un valor de 0 a 1.
Los enlazadores de fórmula (III) están unidos a la nanopartícula y, cuando no están en forma iónica, también están unidos a grupos A. Estos grupos A son birradicales de platino (II) seleccionados independientemente del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V), fórmula (VI), y una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos como se ha definido previamente; en donde, cuando el birradical de platino (II) está unido a un enlazador de fórmula (III), y s = 1, está unido a una molécula de enlazador de fórmula (III); y cuando s = 0; el birradical de platino (II) está unido a dos moléculas de enlazador independientes de fórmula (III).
En una realización del tercer aspecto, la nanopartícula además comprende enlazadores de fórmula (III) que están unidos a la nanopartícula, y grupos A unidos a los enlazadores de fórmula (III); con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) y fórmula (III) del conjugado se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso; y en donde los enlazadores de fórmula (II), los enlazadores de fórmula (III) y los grupos A son como se han definido anteriormente.
Esta realización puede formularse, alternativamente, en forma del conjugado del tercer aspecto, en donde la nanopartícula además comprende enlazadores de fórmula (III) que están unidos a la nanopartícula, y en donde una cantidad igual o inferior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) y fórmula (III) están unidos a grupos A; en donde los enlazadores de fórmula (II), los enlazadores de fórmula (III) y los grupos A son como se han definido anteriormente. En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, del 55 al 95%, aún más particularmente del 75 al 95%, de los enlazadores L son enlazadores de fórmula (II), y del 5 al 45%, aún más particularmente del 5 al 25%, de los enlazadores L son enlazadores de fórmula (III).
Como en los enlazadores de fórmula (II), cuando, en los enlazadores de fórmula (III), n es 0, el enlazador está unido a la nanopartícula NP metálica a través del único átomo de azufre disponible; mientras que, cuando n es 1, está unido a la nanopartícula NP a través de los dos átomos de azufre.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), n = 0.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), n = 1.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), s = 0.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), s = 1.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), X representa una cadena de hidrocarburo (C6-C15) saturada o una cadena de hidrocarburo (C6-C15) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N, opcionalmente sustituido como se ha definido previamente.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), X representa una cadena de hidrocarburo (C2-C20) no sustituido o una cadena de hidrocarburo (C2-C20) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N, particularmente una cadena de hidrocarburo (C2-C20) no sustituido.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en el enlazador de fórmula (III), X representa -(CH2)m- y, en donde m representa un valor de 2 a 20, más particularmente de 6 a 15, aún más particularmente de 8 a 12, y aún más particularmente m es 10 u 11.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los enlazadores de fórmula (III) se seleccionan del grupo que consiste en:
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10 y s = 0, (es decir, 11-mercaptoundecanoilo, también denominado en el presente documento MUA);
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 1, p = 2, X es -(CH2)m-, m = 4 y s = 0; y
- una combinación de los mismos.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los conjugados de la invención comprenden una pluralidad de enlazadores de fórmula (II) seleccionados entre:
- enlazadores de fórmula (II) en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10 e Y es un resto sulfonilo;
- enlazadores de fórmula (II) en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 11 e Y es un resto sulfonilo;
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10 e Y es un resto fosfonilo;
- enlazadores de fórmula (II), en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 11 e Y es un resto fosfonilo; y
- una combinación de los mismos; y
opcionalmente una pluralidad de enlazadores de fórmula (III) seleccionados entre:
- enlazadores de fórmula (III), en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10 y s = 0;
- enlazadores de fórmula (III), en donde n = 1, p = 2, X es -(CH2)m-, m = 4 y s = 0;
- una combinación de los mismos.
Como se ha mencionado anteriormente, parte de los enlazadores del conjugado (por ejemplo, solo enlazadores de fórmula (II) o una mezcla de enlazadores de fórmula (II) y enlazadores de fórmula (III)) están unidos a grupos A que son birradicales de platino (II) seleccionados independientemente del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V), fórmula (VI):
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El resto de los enlazadores del conjugado, en particular, una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores, se desprotonan, es decir, están en forma aniónica cuando los conjugados están en un medio acuoso.
Esto significa que, cuando los conjugados de la invención comprenden varios enlazadores, particularmente menos del 45% de la cantidad total de los enlazadores, que tienen una estructura distinta de la fórmula (II), tales como enlazadores de fórmula (III), entonces la cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores que tienen que estar en forma aniónica se refiere a la cantidad total de enlazadores del conjugado, incluidos los enlazadores de fórmula (II) y los enlazadores que tienen una estructura diferente a la fórmula (II), tales como enlazadores de fórmula (III).
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, del 50 al 90%, del 50 al 80%, del 55 al 75%, del 60 al 70%, y más particularmente aproximadamente el 65% de los enlazadores presentes en el conjugado, con respecto a la cantidad total de enlazadores, están en forma iónica cuando los conjugados están en un medio acuoso en condiciones neutras o básicas.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, del 10 al 49%, del 20 al 49%, del 25 al 45%, del 30 al 40%, y más particularmente aproximadamente el 35% de los enlazadores presentes en el conjugado, con respecto a la cantidad total de enlazadores, están unidos a grupos A.
El número total de enlazadores de las nanopartículas se puede estimar considerando la huella de las moléculas de tiol utilizadas como enlazadores en el oro (0,21 nm2). Por ejemplo, según este cálculo, podría haber como máximo 2930 moléculas de tiol en una nanopartícula de 14 nm. La carga de Pt se mide mediante espectrometría de masas de plasma acoplado por inducción (ICP-MS, Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry). Entonces se puede calcular el número de Pt por nanopartícula conociendo la concentración de nanopartículas. En una síntesis típica, una nanopartícula de 14 nm se carga con alrededor de 500 moléculas de compuesto de Pt. Suponiendo que cada compuesto de Pt está unido a dos grupos terminales de un enlazador de fórmula (II), lo que sería una ocupación del 35% de los ligandos del ejemplo, quedando el 65% en su forma iónica cuando los conjugados están en un medio acuoso.
Aunque no se mencionen específicamente, cualquier estereoisómero de los birradicales de platino de fórmulas (IV), (V) y (VI) se contempla en el presente documento y forma parte de la invención. Además de eso, los birradicales de platino pueden estar en forma de sal.
No hay ninguna limitación en cuanto al tipo de sal de los compuestos de la invención que puede utilizarse, siempre que sean farmacéuticamente aceptables cuando se usen con fines terapéuticos. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" abarca las sales utilizadas comúnmente, tales como, sin limitación, cloruro, nitrato o hidróxido.
La preparación de las sales farmacéuticamente aceptables puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar mediante métodos químicos convencionales. Los compuestos de platino y sus sales pueden diferir en algunas propiedades físicas, pero son equivalentes a los efectos de la presente invención. Generalmente, la funcionalización parcial de los conjugados como se ha definido anteriormente con compuestos de platino da lugar a un desorden superficial. El empaquetamiento de las moléculas de fármaco que contiene platino en la nanopartícula, especialmente por sus extremos reactivos, protege las moléculas de la biodegradación hasta que se liberan.
Por tanto, los conjugados de la invención son estables en el sentido de que no precipitan en un medio como se ha mencionado anteriormente, y en el sentido de que el fármaco que contiene platino no se separa sustancialmente de la nanopartícula en el entorno de trabajo. En el contexto de la invención, la expresión "no se separa sustancialmente de la nanopartícula" significa que al menos el 70%, más particularmente el 80%, 85%, 90% o 95% del fármaco que contiene platino no se separa sustancialmente de la nanopartícula en 24 h. En un medio acuoso, al menos el 90% del fármaco que contiene platino de los conjugados de la invención no se separa sustancialmente de la nanopartícula en 24 h.
Los birradicales de platino (II), como se han definido anteriormente, están unidos a dos moléculas de enlazador de fórmula (II), en donde — es un enlace sencillo, e Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii'), a través del átomo de oxígeno del resto de fórmula (i') o (ii'), formando así enlaces O-Pt con cada uno de estas, como se ilustra a continuación:
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Cuando los conjugados además comprenden enlazadores de fórmula (III) y estos están unidos a compuestos de platino (II), el birradical de platino (II) puede unirse a los enlazadores de fórmula (III) a través de una o dos moléculas de enlazador. Por tanto, cuando, en el enlazador de fórmula (III), s = 1, el birradical de platino (II) está unido a una molécula de enlazador de fórmula (III), formando así dos enlaces COO-Pt con la misma molécula de enlazador; y cuando s = 0; el birradical de platino (II) está unido a dos moléculas de enlazador independientes de fórmula (III), formando así un enlace COO-Pt con cada una de estas dos moléculas de enlazador como se ilustra a continuación:
Figure imgf000014_0002
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, el birradical de platino muestra configuración cis.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, el birradical de platino tiene la fórmula (IV).
Los conjugados de la invención tienen estabilidad coloidal en un medio. La expresión "estabilidad coloidal", como se usa en el presente documento, significa que los conjugados de la invención, cuando se dispersan en un medio, son capaces de resistir la agregación (es decir, la precipitación). Una dispersión que tiene estabilidad coloidal en un medio presenta un largo período de estabilidad y tiene el aspecto de una solución. La estabilidad coloidal de los conjugados de la invención es fundamental, ya que si los conjugados no son estables, no muestran ningún beneficio in vivo o in vitro con respecto al fármaco libre. La espectroscopia UV-Vis es una técnica útil para determinar la estabilidad coloidal de los conjugados. En caso de agregación irreversible que produzca precipitación, se observa un desplazamiento hacia el rojo y un ensanchamiento del máximo de resonancia de plasmones superficiales (SPR, Surface Plasmon Resonance) con respecto al máximo correspondiente observado para las correspondientes nanopartículas no funcionalizadas. Más particularmente, el desplazamiento hacia el rojo en caso de agregación es igual o superior a 15 nm, más particularmente igual o superior a 25 nm, con respecto al máximo observado para las correspondientes nanopartículas no funcionalizadas (es decir, nanopartículas sin enlazadores).
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los conjugados de la invención muestran estabilidad coloidal en condiciones fisiológicas, es decir, la condición o el estado del cuerpo o las funciones corporales que comprenden un pH cercano a la neutralidad (es decir, un pH de aproximadamente 7) y una alta concentración de solución salina. Como se describirá con detalle a continuación, en la preparación de un conjugado que tiene estabilidad coloidal, es clave controlar el número de moléculas de compuesto de platino que están unidas a las moléculas de enlazador, para que una cantidad suficiente de estas últimas quede desprotonada in vivo. Por tanto, la concentración de compuesto de platino que puede soportar un conjugado está relacionada con la carga superficial. Al pH operativo, las moléculas de enlazador se desprotonan y, por lo tanto, se cargan. Generalmente, el pH operativo corresponde al pH en condiciones fisiológicas. La adición del complejo de coordinación de platino inactiva parte de esa carga. Esto se puede medir por la disminución de los valores de potencial zeta a un pH dado. Es bien sabido que una partícula coloidal generalmente necesita aproximadamente 30 mV (positivos o negativos) para ser estable frente a la agregación. Este valor depende del pH y de la fuerza iónica.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, los conjugados de la invención tienen una carga electrostática absoluta superficial (potencial zeta) igual o superior a 25 mV, más particularmente igual o superior a 30 mV, en condiciones fisiológicas.
Como se ha mencionado anteriormente, los conjugados de la invención (que, mediante una nomenclatura simplificada, pueden denominarse NP-L-A), pueden prepararse convenientemente mediante un procedimiento de dos etapas, en primer lugar preparando un conjugado intermedio que comprende una nanopartícula NP y una pluralidad de enlazadores L (mediante una nomenclatura simplificada, el conjugado intermedio de la invención también se denomina NP-L), en donde los enlazadores están unidos a la nanopartícula NP a través de los átomos de azufre disponibles (etapa a); y, en segundo lugar, uniendo el compuesto que contiene platino (II) a este conjugado intermedio (etapa b). Para controlar la conjugación, se puede utilizar espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS, X-Ray Photoelectron Spectroscopy).
En la primera etapa del procedimiento, un exceso de un compuesto de fórmula (IIa) o fórmula (IIb),
Figure imgf000015_0001
o un estereoisómero o una sal de cualquiera de estos compuestos, como se ha definido anteriormente, se hace reaccionar con una nanopartícula NP de oro, plata o platino en una solución acuosa, para dar lugar al conjugado intermedio de fórmula NP-L como se ha definido anteriormente, en donde:
cuando se utiliza un compuesto de fórmula (Ila) o una sal del mismo, se obtiene un conjugado intermedio en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 0; y
cuando se utiliza un compuesto de fórmula (IIb) o una sal del mismo, se obtiene un conjugado intermedio en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 1.
Esta primera etapa se muestra en el siguiente esquema:
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Las nanopartículas metálicas sin recubrimiento utilizadas como material de partida pueden prepararse mediante protocolos de síntesis de nanopartículas que permitan la producción sencilla y escalable de nanopartículas monodispersas con control de tamaño y forma. En particular, las nanopartículas pueden prepararse mediante la inyección rápida de una sal metálica seleccionada entre una sal de Au, Ag y Pt en un agente reductor, produciendo así una nucleación homogénea temporalmente diferenciada empleada para la producción de nanopartículas metálicas monodispersas. El agente reductor puede ser, por ejemplo, citrato a alta temperatura (método clásico de Turkevitch), borohidruro de sodio o una mezcla de borohidruro de sodio y ácido ascórbico, opcionalmente en presencia de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). Por ejemplo, las nanopartículas pueden prepararse como se describe en Langmuir 201127 (17), 11098-11105.
La formación de nanopartículas metálicas puede observarse por un cambio de color en el medio de reacción. Dependiendo del método utilizado, las nanopartículas obtenidas tendrán un tamaño y una forma diferentes en presencia de los tensioactivos adecuados como CTAB.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la etapa a) se lleva a cabo con un exceso de 2 a 500, más particularmente de 20 a 70 equivalentes, del compuesto de fórmula (IIa) o fórmula (IIb) con respecto a la cantidad calculada necesaria para recubrir toda la nanopartícula. Normalmente, esta reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente.
Generalmente, se supone que esta reacción en presencia de un exceso de un compuesto de fórmula (IIa) o fórmula (IIb), o un estereoisómero o una sal de cualquiera de estas fórmulas, conduce a un conjugado intermedio NP-L, en donde toda la superficie está recubierta con restos L. Como se ha mencionado anteriormente, se pueden utilizar un solo tipo de enlazadores de fórmula (II) o diferentes tipos de enlazadores. Adicionalmente, también pueden combinarse otros enlazadores, tales como los enlazadores de fórmula (III) como se ha definido previamente, con los enlazadores de fórmula (II). Los enlazadores de fórmula (III) pueden introducirse en los conjugados como se describe en el documento WO 2010/069941.
Mediante una nomenclatura simplificada, cuando el compuesto de fórmula (IIa) es ácido 10-mercaptodecanosulfónico o ácido 11-mercaptoundecilfosfónico, los productos intermedios obtenidos también se denominan en el presente documento NP-m Sa y NP-MPA, respectivamente.
En una realización, opcionalmente, junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la etapa a) se lleva a cabo en presencia de una base. En una realización particular, la base es NaOH.
Las nanopartículas pequeñas son difíciles de purificar por centrifugación, por lo tanto, las moléculas que no han reaccionado del compuesto de fórmula (IIa) o fórmula (IIb) se pueden eliminar mediante la diálisis de la solución coloidal presente en la solución tras la conjugación, junto con el agente reductor restante utilizado en la síntesis de las nanopartículas, si es necesario.
Por tanto, en una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, en la etapa a) tras la formación de NP-L, las moléculas sin reaccionar del compuesto de fórmula (IIa) o fórmula (IIb), y opcionalmente el agente reductor restante utilizado en la síntesis de las nanopartículas, se eliminan de la reacción de la solución coloidal, más particularmente por diálisis. En la segunda etapa del procedimiento (etapa b), los conjugados intermedios de fórmula NP-L se hacen reaccionar además con un compuesto de platino seleccionado del grupo que consiste en fórmula (IVa), fórmula (Va) y fórmula (VIa), incluidos los estereoisómeros o las sales de todos ellos,
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dando lugar a un conjugado como se ha definido anteriormente, en donde A es un birradical de platino (II) seleccionado del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V) y fórmula (VI) respectivamente, en donde el birradical de fórmulas (IV), (V) y (VI) está opcionalmente en forma de sal. Esta reacción se puede llevar a cabo en una solución acuosa en presencia de una base (por ejemplo, a pH 8,3) para desprotonar los grupos de ácido sulfónico o fosfónico del enlazador de fórmula (IIa) o fórmula (IIb).
Los compuestos (IVa), (Va) y (VIa), incluidos los estereoisómeros de todos ellos, pueden formar una sal en presencia de un anión tal como, por ejemplo, cloruro o nitrato.
Como se ha mencionado anteriormente, para obtener un conjugado soluble de la invención, es decir, un conjugado que tiene estabilidad coloidal en el medio, se debe mantener algo de carga en la superficie para proporcionar a las NP suficiente carga electrostática y repulsión para evitar la agregación y la precipitación. Por tanto, la superficie está recubierta con moléculas de enlazador que terminan en grupos sulfonilo o fosfonilo, que, a pH fisiológico, están desprotonadas y presentan carga superficial negativa. A continuación, las moléculas de fármaco de platino se unen a una fracción de las terminaciones de sulfonilo o fosfonilo, de modo que parte de la carga superficial se cancela, pero dejan suficiente carga para la repulsión electrostática.
Para alcanzar el grado deseado de carga de fármaco (es decir, los efectos terapéuticos más altos posibles mientras se conserva suficiente carga superficial para evitar la desestabilización y la agregación), se pueden seguir dos enfoques diferentes: a) una cantidad calculada previamente de compuesto de platino, que cumpla con los requisitos anteriores, se mezcla con los conjugados intermedios NP-L o, alternativamente, b) se mezcla un exceso de compuesto de platino con los conjugados intermedios NP-L, y la reacción se detiene cuando se cumple la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L del conjugado se encuentra en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
La expresión "exceso de compuesto de platino" que se mezcla con los conjugados intermedios NP-L, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un exceso con respecto a la cantidad teórica necesaria para cumplir la condición mencionada anteriormente.
En el primer caso a), la cantidad del compuesto de platino (II) debe calcularse previamente. Esta cantidad se puede determinar mediante tareas habituales. En particular, se puede utilizar una curva de calibración que utilice diferentes cantidades de compuesto de platino (II). La idea subyacente es que diferentes cantidades de compuestos de platino (II) reaccionen con los conjugados intermedios, y los conjugados resultantes se analicen mediante espectroscopia UV-Vis. Cuando la cantidad de compuesto de platino es demasiado alta para dar lugar a un conjugado que tiene estabilidad coloidal y, por tanto, se forma un agregado, esto se puede detectar por el desplazamiento al rojo del máximo UV-Vis al compararse los espectros UV-Vis del conjugado resultante y del conjugado intermedio correspondiente. Por tanto, la cantidad de compuesto de platino se reduce posteriormente hasta que no se observa agregación.
En el segundo caso b), cuando se utiliza un exceso de compuesto de platino, la conjugación se detiene antes de que se unan demasiadas moléculas de compuesto de platino a las moléculas de enlazador. Los inventores han descubierto que, al controlar la unión del compuesto de platino a las nanopartículas recubiertas de enlazador, si el procedimiento no se detiene eficazmente, el compuesto de platino sigue recubriendo la capa de enlazador y las nanopartículas se vuelven inestables.
Por lo tanto, cuando se trabaja con un exceso de compuesto de platino, la unión de las moléculas del compuesto de platino a las moléculas de enlazador debe detenerse cuando la carga del fármaco de platino es máxima y el conjugado resultante aún es estable. Esto no se puede lograr de manera espontánea. Para detener la conjugación, se coloca la solución de conjugación, por ejemplo, en una bolsa de diálisis donde las moléculas del compuesto de platino libres escapan rápidamente dejando el conjugado NP-L parcialmente recubierto con el compuesto de platino. El momento en el que se debe detener la reacción se puede calcular previamente. Este último procedimiento tiene la ventaja de que es más rápido y controlado.
La conjugación puede controlarse mediante la combinación de series de experimentos que incluyan dispersión de luz dinámica (DLS, Dynamic Light Scattering), espectroscopia UV-Vis, potencial zeta, microscopia electrónica de transmisión (MET), microscopía óptica, electroforesis en gel e ICP-MS para análisis cuantitativo.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la etapa b) comprende hacer reaccionar el conjugado intermedio obtenido en la etapa a) con el compuesto de platino (II) como se ha definido previamente en una cantidad calculada, de modo que, en el conjugado final, una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
En otra realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la etapa b) comprende hacer reaccionar el conjugado intermedio obtenido en la etapa a) con un exceso del compuesto de platino (II) como se ha definido anteriormente y detener la reacción cuando, en el conjugado final, una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L están en forma iónica cuando el conjugado está en un medio acuoso.
En una realización más particular, la reacción se detiene eliminando el compuesto de platino (II) que no ha reaccionado de la solución, por ejemplo, a través de diálisis.
En una realización, opcionalmente, junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, la etapa b) se lleva a cabo con un exceso de 1 a 10 veces, más particularmente de 1,2 a 5 veces, del compuesto de platino (II) como se ha definido anteriormente con respecto a la cantidad teórica necesaria para cumplir con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores L del conjugado se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso. En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la etapa b) se lleva a cabo a pH básico, más particularmente a un pH de 8,2 a 8,5, aún más particularmente a pH = 8,3.
El compuesto de fórmula (IVa) puede sintetizarse a partir del compuesto de fórmula (VII) (cisplatino) o fórmula (VIII) (carboplatino); el compuesto de fórmula (Va) puede sintetizarse a partir del compuesto de fórmula (IX) (oxaliplatino); y el compuesto de fórmula (VIa) puede sintetizarse a partir del compuesto de fórmula (X).
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En el caso del cisplatino, la conversión se lleva a cabo tratando el compuesto con una fuente de un catión Ag, tal como AgNO3, para eliminar el Cl de la molécula de cisplatino (VII) y producir las especies hidratadas (IVa). De manera similar, un compuesto de fórmula (X) puede convertirse en un compuesto de fórmula (VIa) mediante métodos análogos.
En el caso del carboplatino (VIII), el compuesto se convierte en un compuesto de fórmula (IVa) a través de la hidrólisis de los enlaces COO mediante métodos convencionales muy conocidos en la técnica. De manera similar, un compuesto de fórmula (IX) puede convertirse en un compuesto de fórmula (IVa) mediante métodos análogos.
Alternativamente, los compuestos de fórmula (Va) y (VIa) pueden obtenerse mediante una síntesis en dos etapas que comprende:
1) hacer reaccionar PtCl4 con la amina correspondiente: ciclohexano-1,2-diamina o amoníaco/ciclohexilamina para producir los productos intermedios (Vb) y (VIb), y
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2) tratar los productos intermedios obtenidos en la etapa 1) con una fuente de un catión Ag, tal como AgNO3, para eliminar Cl y producir las especies hidratadas (Va) y (VIa) respectivamente.
Los productos secundarios no deseados, en particular, los compuestos de platino trans, pueden eliminarse mediante cromatografía.
El hecho de que un compuesto de platino de fórmula (IVa), (Va) o (VIa) se conjugue con el conjugado intermedio NP-L en lugar de los compuestos de platino de fórmulas (VII) a (X) tiene consecuencias importantes. Por tanto, en los conjugados de la invención, se forman enlaces de coordinación entre el enlazador y el compuesto de platino. Estos enlaces, como ya se ha mencionado, son fuertes y proporcionan estabilidad a la molécula, en particular en un medio en condiciones fisiológicas. Estos enlaces solo se hidrolizan a pH bajo, tal como el presente en los endosomas y endolisosomas.
Aunque los derivados de cisplatino y oxaliplatino (en lugar del propio cisplatino y oxaliplatino, respectivamente) se utilizan para la conjugación, mediante una nomenclatura simplificada, los conjugados de la invención que contienen derivados de cisplatino y oxaliplatino también se denominan en el presente documento NP-L-cisplatino y NP-L-oxaliplatino, respectivamente.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden formularse en forma sólida o líquida.
En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o que se describen a continuación, la administración de la composición farmacéutica es intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o intratumoral. Generalmente, las formulaciones adecuadas incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas, isotónicas, que tienen un pH y una estabilidad adecuados, que pueden contener, por ejemplo, agentes antioxidantes, tampones y agentes bacteriostáticos; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, polímeros biocompatibles, polisacáridos y conservantes.
Como ya se ha mencionado, los conjugados de la invención pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer en un paciente que lo padezca, especialmente en los casos en que la cirugía no sea viable.
Los cánceres representativos de interés incluyen, pero sin limitación, de cabeza, cuello y tejido pulmonar; tubo gastrointestinal y páncreas, tal como carcinoma gástrico, adenoma colorrectal, carcinoma colorrectal y carcinoma pancreático; tejido hepático, tal como carcinoma hepatocelular; riñón y vías urinarias, tales como carcinoma de vejiga, carcinoma renal; tejido mamario, tal como carcinoma de mama; tejido neuronal, tales como neuroblastoma y meningioma maligno; tejido cutáneo, tal como melanoma; y tejidos hemáticos, tales como linfoma y leucemia. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar, entre otros, en función del compuesto específico, la naturaleza del vehículo de liberación y la naturaleza del tumor que se vaya a tratar. En una realización particular, con el fin de tener dosis realistas para la aplicación in vivo de la invención, la concentración de los conjugados se aumenta aproximadamente 50 veces. Para ello, se hacen precipitar las nanopartículas por centrifugación y se recoge el sedimento y se vuelve a disolver en cantidades progresivamente decrecientes de disolvente sin perder estabilidad. Alternativamente, también se puede utilizar la filtración de flujo tangencial.
Los conjugados de la invención tienen la ventaja de que reducen los efectos secundarios en comparación con los tratamientos con cisplatino y análogos que se utilizan en la actualidad.
Los conjugados de la invención pueden concentrarse en los tumores como resultado del efecto de potenciación de la retención y la permeabilidad (PRP). En síntesis, el efecto de PRP, es el resultado de una integridad tisular defectuosa, cambios en los mediadores de la permeación y alteración del drenaje linfático en los tumores. Por tanto, el endotelio vascular de los tumores tiende a tener huecos relativamente grandes que permiten que especies moleculares de mayor tamaño, de hasta 200 nm, penetren en el tejido en lugar de en los tejidos sanos. Los mediadores de la permeación alterados y el mecanismo de drenaje linfático deteriorado garantizan que las moléculas que han penetrado en el tumor permanezcan allí. Por tanto, los conjugados de la invención se acumulan pasivamente en el tumor y, desde allí, se interiorizan por endocitosis.
Por otra parte, debido a la conjugación, los conjugados son inactivos en la circulación sistémica y solo son activables tras llegar al tumor, o en el hígado, como lo hacen las partículas, donde no se ha observado toxicidad. Al entrar en la célula tumoral, una vez en el endosoma, el bajo pH utilizado por el aparato digestivo de la célula (el endolisosoma, resultante de la fusión del endosoma y el lisosoma) conduce a la hidrólisis del enlace de coordinación entre el enlazador y el fármaco de platino, para que el fármaco de platino se libere cerca del núcleo.
Como ya se ha mencionado, la invención también se refiere a un conjugado para su uso en un método para tratar el cáncer que comprende administrarlo a un mamífero que lo necesite, incluido un ser humano, una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado como se ha definido previamente junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicho método además comprende irradiar localmente el tumor a cualquier frecuencia (desde y hasta XR, NIR y MW) para que el fármaco de platino se vuelva más eficaz. En todos los casos, el núcleo de oro interactúa con la radiación y finalmente produce calor u otros efectos que pueden dañar el tejido tumoral. Particularmente, el núcleo de oro produce electrones Auger después de interactuar con los rayos X, lo que finalmente se traduce en altas dosis locales de radicales libres, induciendo daños en la cadena doble del ADN.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y las variaciones de la misma, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Asimismo, la palabra "comprender" abarca el caso de "consistir en". Objetos adicionales, ventajas y características de la invención serán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención. Asimismo, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.
Ejemplos
1. Síntesis de conjugados
Técnicas de caracterización
1) Espectroscopia UV-Vis: se adquirieron espectros UV-Visible con un espectrofotómetro Shimadzu UV-2400. Se colocó 1 ml de nanopartículas o conjugados en una célula y se realizó un análisis espectral en el intervalo de 300 nm a 800 nm.
2) Microscopia electrónica de transmisión (MET): se visualizaron nanopartículas de oro mediante MET a 80 keV (JEOL 1010). Se depositaron gotículas de diez microlitros de la muestra sobre una pieza de rejilla de cobre de malla 200 recubierta con Formvar ultradelgada (Ted-pella, Inc.) y se dejaron secar al aire.
3) Espectrometría de masas de plasma acoplado por inducción (ICP-MS): se determinó la cantidad de Pt en las nanopartículas mediante análisis de ICP-MS de la muestra tras la digestión con agua regia.
Ejemplo 1: síntesis de nanoesferas de oro (AuNP) funcionalizadas con MPA y un derivado de cisplatino (AuNP-MPA-cisplatino)
1.1. Síntesis de nanopartículas de oro (AuNP, diámetro de 14 nm)
Se calentó una solución de citrato de sodio en agua (2,2 mM, 150 ml) a reflujo en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 250 ml con una manta calefactora. Después de 10 minutos, Se añadió rápidamente solución acuosa de HAuCl4'3H2O (25 mM, 1 ml). La solución se dejó durante 5 minutos con agitación vigorosa. El color cambió rápidamente a gris azulado, luego a rosa y, finalmente, a rojo. A continuación, se dejó enfriar la solución de nanopartículas de oro hasta 90 °C. Se añadió 1 ml solución acuosa de HAuCl4'3H2O (25 mM) y la solución se mantuvo en agitación vigorosa durante 10 minutos a 90 °C. Esta adición de oro a 90 °C se repitió 2 veces más. Se transfirió la solución a un frasco de vidrio y se dejó a temperatura ambiente. Caracterización de la síntesis de las nanopartículas de oro obtenidas: la FIG. 2 (izquierda) es una imagen de MET representativa de las nanopartículas y la FIG. 2 (derecha) muestra el histograma correspondiente, el diámetro promedio fue de 14,6 /-1,8 nm.
1.2. Funcionalización con MPA (AuNP-MPA)
Se preparó una solución acuosa básica de ácido 11-mercaptoundecilfosfónico (MPA) antes de añadirla a 150 ml de AuNP: se mezclaron 17,7 mg de MPA 6,6 ml de agua MilliQ 54 pl de NaOH 2 M y se sometieron a ultrasonidos hasta la disolución total (concentración final de MPA = 10 mM). Se mezcló la solución de MPA obtenida (6,6 ml, 10 mM) con 150 ml de AuNP de 13 nm como se sintetizó anteriormente con agitación vigorosa durante los primeros 5 minutos y agitación suave durante la noche. Los volúmenes se calcularon para 150 ml, pero se pueden aumentar a escala proporcionalmente. Las nanopartículas resultantes se concentraron por centrifugación. Se colocaron alícuotas de 1 ml de solución de AuNP-MPA en tubos eppendorf de 1,5 ml. Se centrifugaron a una FCR de 14000 durante 18 minutos. Se desecharon los sobrenadantes y se recogieron los sedimentos. El volumen final se ajustó con agua para que fuera 50 veces inferior al volumen inicial. A continuación, se transfirieron las nanopartículas a membranas de diálisis de 20 KDa de celulosa regenerada y se sometieron a diálisis dos veces frente a 2 l de agua 160 pl de NaOH 2 M.
1.3. Funcionalización con í.Pt(H2O)2(NH3)2¡(NO3)2 (AuNP-MPA-cisPt)
En primer lugar, se ajustó la solución de AuNP-MPA (como se obtuvo anteriormente) a pH = 8,3 mediante pequeños volúmenes de NaOH 0,2 M. A continuación, se añadieron 78 pl de solución acuosa de [Pt(H2O)2(NH3)2](NO3)2 (4,3 mg/ml) gota a gota a 3 ml de AuNP-MPA concentrado con agitación vorticial. La solución se dejó en agitación durante 30 minutos y luego se transfirió a membranas de diálisis de 20 KDa de celulosa regenerada y se sometió a diálisis dos veces frente a 2 l de agua 160 pl de NaOH 2 M.
Caracterización del conjugado del ejemplo 1: la FIG. 3 (izquierda) muestra los espectros UV-Vis de las diferentes etapas de funcionalización (AuNP, AuNP-MPA y AuNP-MPA-cisPt). La carga de compuesto de platino fue >30 mg de Pt/L.
Ejemplo 2: síntesis de nanoesferas de oro funcionalizadas con MPA (AuNP-MPA) y un derivado de oxaliplatino (AuNP-MPA-oxaliPt)
Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 1, pero utilizando un derivado de oxaliplatino en lugar de un derivado de cisplatino, se obtuvieron las nanopartículas deseadas. En particular, se añadieron 234 pl de solución acusa de [[Pt(H2O)2(1R,2R-diaminociclohexano)] (2,1 mg/ml) gota a gota a 3 ml de AuNP-MPA concentrado como se preparó en el ejemplo 1 bajo agitación vorticial.
Caracterización del ejemplo 2: la FIG. 3 (derecha) muestra los espectros UV-Vis de las diferentes etapas de funcionalización (AuNP, AuNP-MPA y AuNP-MPA-oxaliPt). La carga de compuesto de platino fue >30 mg de Pt/L. Ejemplo 3: síntesis de nanoesferas de oro funcionalizadas con MSA (AuNP-MSA) y un derivado de cisplatino (AuNP-MSA-cisPt)
Siguiendo el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 1, pero utilizando ácido 10-mercaptodecanosulfónico (MSA) en lugar de MPA, se obtuvieron las nanopartículas deseadas. En particular, se añadieron 150 ml de AuNP de 13 nm como se sintetizaron anteriormente a una solución de MSA (32,5 ml, 10 mM) con agitación vigorosa durante los primeros 5 minutos y agitación suave durante la noche. se añadieron 78 pl de solución acuosa de [Pt(H2O)2(NH3)2](NO3)2 (4,3 mg/ml) gota a gota a 3 ml de AuNP-MSA concentrado con agitación vorticial.
Caracterización del Ejemplo 3: la FIG. 4 (izquierda) muestra los espectros UV-Vis de las diferentes etapas de funcionalización (AuNP, AuNP-MSA y AuNP-MSA-cisPt). La carga de compuesto de platino fue >30 mg de Pt/L. Ejemplo 4: síntesis de nanoesferas de oro funcionalizadas con MSA (AuNP-MSA) y un derivado de oxaliplatino (AuNP-MSA-oxaliPt)
Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 3, pero utilizando un derivado de oxaliplatino en lugar de un derivado de cisplatino, se obtuvieron las nanopartículas deseadas. En particular, se añadieron 234 pl de solución acusa de [[Pt(H2O)2(1R,2R-diaminociclohexano)] (2,1 mg/ml) gota a gota a 3 ml de AuNP-MPA concentrado como se preparó en el ejemplo 1 bajo agitación vorticial.
Caracterización del Ejemplo 4: la FIG. 4 (derecha) muestra los espectros UV-Vis de las diferentes etapas de funcionalización (AuNP, AuNP-MSA, AuNP-MSA-oxaliPt). La carga de compuesto de platino fue >30 mg de Pt/L. Ejemplo comparativo 1: síntesis de nanoesferas de oro funcionalizadas con MUA (AuNP-MUA) y un derivado de cisplatino (AuNP-MUA-cisplatino)
Siguiendo el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 1, pero utilizando pero utilizando ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) en lugar de MPA, se obtuvieron las nanopartículas deseadas.
Caracterización del ejemplo comparativo 1: la FIG. 5 (izquierda) muestra los espectros UV-Vis de las diferentes etapas de funcionalización (AuNP, AuNP-MUA, AuNP-MUA-cisPt). La carga de compuesto de platino se muestra en el recuadro.
Ejemplo comparativo 2: síntesis de nanoesferas de oro funcionalizadas con MUA (AuNP-MUA) y un derivado de oxaliplatino (AuNP-MUA-oxaliplatino)
Siguiendo el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 2, pero utilizando MUA en lugar de MPA.
Caracterización del ejemplo comparativo 2: la FIG. 5 (derecha) muestra los espectros UV-Vis de las diferentes etapas de funcionalización (AuNp , AuNP-MUA, AuNP-MUA-oxaliPt). La carga de compuesto de platino se muestra en el recuadro.
2. Liberación de Pt de los conjugados
Preparación de tampones
Se prepararon 50 ml de los siguientes tampones en tubos PS de 50 ml:
1a. pH 7,6: HEPES 50 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) 11 mg/ml de SAB (seroalbúmina bovina)
lb. pH 6,2: MES 50 mM (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 11 mg/ml de SAB
lc. pH 4,4: Gly/HCl 50 mM 11 mg/ml de SAB
ld. pH 2,8: Gly/HCl 50 mM 11 mg/ml de SAB
El pH se reajustó tras la adicción de la SAB con NaOH o HCl 2 M
Preparación y recogida de muestras
4,5 ml de tampón x1 0,5 ml de los conjugados de los ejemplos 1-4 y ejemplos comparativos 1-2. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente y se agitaron suavemente. Se tomaron alícuotas de 0,5 ml de cada muestra a las 0 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. Después de la recogida, las muestras se centrifugaron inmediatamente (FCR de 15000, 30 min). Se recogieron los sobrenadantes resultantes y se realizaron otros 2 ciclos de centrifugación para garantizar que el sobrenadante fuera transparente (es decir, sin absorbancia a 520 nm), lo que indicaba la ausencia de AuNP. Cuantificación del Pt liberado
La cantidad de Pt en los sobrenadantes resultantes se analizó mediante ICP-MS. La carga inicial de Pt en los conjugados probados se analizó mediante ICP-MS midiendo directamente la cantidad de Pt tras la digestión de nanopartículas de oro con agua regia. Se añadió un control (conjugados en agua) para evaluar/descartar cualquier liberación inespecífica de derivado de Pt y para cuantificar cualquier posible derivado de Pt no unido presente en la solución inicial de nanopartículas. Se mezclaron 4,5 ml de agua 0,5 ml de los conjugados probados y se trataron como se ha indicado anteriormente para el resto de las muestras. La cantidad de Pt en el sobrenadante resultante también se analizó mediante ICP-MS.
Los resultados se muestran en las FIGS. 6-8. Se vio que el enlace entre AuNP-MPA o AuNP-MSA y los derivados de Pt era más lábil que el enlace entre AuNP-MUA y los derivados de Pt. Esto se tradujo en una mayor liberación del derivado de Pt a pH bajo para MPA y MSA en comparación con MUA.
3. Estabilidad de los conjugados
En agua: los diferentes conjugados se dejaron como se sintetizaron. Se mezclaron 5 pl de cada muestra con 995 pl de agua en una cubeta de plástico en los diferentes puntos de tiempo del experimento (0 h, 1 día, 3 días, 6 días, 9 días, 14 días). A continuación, se midió el espectro UV-Vis de 300 a 800 nm.
En medios de cultivo celular: se añadieron 120 pl de una solución de SAB 5,2 mM en agua a 1 ml de cada conjugado y se agitó suavemente. Se añadieron 4 ml de medio de cultivo celular (modificación de Dulbecco del medio Eagle (DMEM) complementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%) a 1 ml de la solución de conjugado SAB. Se tomaron alícuotas a las 0 y 24 horas. Se mezclaron 100 pl de cada muestra con 900 pl de agua en una cubeta de plástico. A continuación, se midió el espectro UV-Vis de 300 a 800 nm.
Se observó que los conjugados de los ejemplos 1-4 mostraron mantenimiento de la estabilidad coloidal en todos los puntos de tiempo medidos en el presente documento. La FIG. 9 muestra los resultados de la estabilidad en medios de cultivo celular de los conjugados del ejemplo comparativo 1 (izquierda) y ejemplo 1 (derecha) respectivamente hasta las 24 h. En realidad, la estabilidad fue controlada hasta las 96 h, pero no se observaron diferencias. En el caso de MUA, aunque se mantuvo la estabilidad coloidal, se observó un ligero ensanchamiento de su banda del espectro UV-Vis en medio de cultivo celular. Esto era indicativo de un ligero grado de agrupamiento. Se observó un escenario diferente para los conjugados funcionalizados con MPA, donde no se observaron diferencias en los espectros tras la incubación en medios de cultivo celular.
4. Viabilidad celular
Se realizaron experimentos de viabilidad celular. En este caso, se trataron células de carcinoma urotelial de ratón (MB49) con los conjugados del ejemplo 1 (AuNP-MPA-cisplatino) o el conjugado intermedio AuNP-MPA, los conjugados del ejemplo 3 (AuNP-MSA-cisplatino) o el conjugado intermedio AuNP-MSA, y se compararon con células tratadas con los conjugados del ejemplo comparativo 1 (AuNP-MUA-cisplatino) o el conjugado intermedio correspondiente AuNP-MUA. El tratamiento consistió en 24 horas de incubación con las diferentes nanopartículas, seguidas de 24 horas de incubación con medio nuevo. La viabilidad celular se midió mediante un ensayo comercial (PrestoBlue™) y siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Los resultados se muestran en las FIGS. 10 y 11. Se observó que los conjugados del ejemplo 1 (AuNP-MPA-cisplatino) (FIG. 11 [izquierda]) y del ejemplo 3 (AuNP-MSA-cisplatino) (FIG. 11 [derecha]) mostraron una disminución significativa en la viabilidad celular con concentraciones de 12 x 1012 AuNP/ml o superior para AuNP-MPA-cisplatino y 1,2 x 1012 AuNP/ml o superior para AuNP-MPA-cisplatino. Por otro lado, no se observó disminución de la viabilidad celular para los conjugados del ejemplo comparativo 1 (AuNP-MUA-cisplatino) (FIG. 10). En todos los casos, un control de las mismas nanopartículas sin cisplatino no mostró toxicidad (MUA y MPA) o mostró una toxicidad mucho menor a las concentraciones más altas (MSA), lo que indicó que la disminución observada en la viabilidad se debió principalmente al cisplatino. Cabe señalar que el cisplatino debe liberarse de la nanopartícula para dañar el ADN.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que tiene estabilidad coloidal en un medio que comprende una nanopartícula NP, una pluralidad de enlazadores de fórmula (II) unidos a la nanopartícula,
Figure imgf000024_0001
y una pluralidad de grupos A unidos a los enlazadores, en donde:
NP es una nanopartícula de oro, plata o platino;
n representa 0 o 1; en donde:
cuando n es 0, el enlazador de fórmula (II) está unido a la nanopartícula NP a través de un átomo de azufre; y cuando n es 1, el enlazador de fórmula (II) está unido a la nanopartícula NP a través de dos átomos de azufre; p representa un valor seleccionado de 1 a 3; y
X representa una cadena de hidrocarburo (C2-C20), o una cadena de hidrocarburo (C2-C20) en donde al menos un átomo de carbono está reemplazado por un grupo carbonilo o un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O y N; y en donde estas cadenas de hidrocarburo (C2-C20) están opcionalmente sustituidas con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, OH, C0 NH2, CO2-alquilo (C1-C6) y -CHO;
— o bien está ausente o, alternativamente, representa un enlace sencillo; en donde:
cuando — está ausente, Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i) o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii):
Figure imgf000024_0002
y cuando — es un enlace sencillo, Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii'), que está unido a A por el átomo de oxígeno:
Figure imgf000024_0003
los grupos A son birradicales de platino (II) seleccionados independientemente del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V), fórmula (VI), y una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos:
Figure imgf000025_0001
en donde el birradical de platino (II) está unido a dos moléculas de enlazador independientes de fórmula (II), en donde — es un enlace sencillo, e Y es o bien un resto sulfonilo de fórmula (i') o, alternativamente, un resto fosfonilo de fórmula (ii'), a través del átomo de oxígeno del resto de fórmula (i') o (ii');
con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
2. El conjugado según la reivindicación 1, en donde, en el enlazador de fórmula (II), Y comprende un resto sulfonilo.
3. El conjugado según la reivindicación 1, en donde, en el enlazador de fórmula (II), Y comprende un resto fosfonilo.
4. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 0.
5. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde, en el enlazador de fórmula (II), X representa -(CH2)m-, en donde m representa un valor de 6 a 15.
6. El conjugado según la reivindicación 1, en donde los enlazadores de fórmula (II) se seleccionan del grupo que consiste en:
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10 e Y es un resto sulfonilo;
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 11 e Y es un resto sulfonilo;
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 10 e Y es un resto fosfonilo;
- una pluralidad de enlazadores en donde n = 0, X es -(CH2)m-, m = 11 e Y es un resto fosfonilo; y
- una combinación de los mismos.
7. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la nanopartícula además comprende enlazadores de fórmula (III) que están unidos a la nanopartícula,
Figure imgf000025_0002
y grupos A unidos a los enlazadores de fórmula (III), en donde:
en donde X, p y n son como se definen para los enlazadores de fórmula (II) en la reivindicación 1, y
— o bien está ausente o, alternativamente, representa un enlace sencillo; en donde:
cuando — está ausente, Z es un resto de fórmula (iii):
Figure imgf000026_0001
en donde s representa un valor de 0 a 1; y
cuando — es un enlace sencillo, Z es un resto de fórmula (Ni'), que está unido a A por los átomos de oxígeno:
Figure imgf000026_0002
en donde s representa un valor de 0 a 1;
los grupos A son birradicales de platino (II) seleccionados independientemente del grupo que consiste en la fórmula (IV), fórmula (V), fórmula (VI), y una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos:
Figure imgf000026_0003
en donde, cuando el birradical de platino (II) está unido a un enlazador de fórmula (III), y s = 1, está unido a una molécula de enlazador de fórmula (III); y cuando s = 0; el birradical de platino (II) está unido a dos moléculas de enlazador independientes de fórmula (III); y
con la condición de que una cantidad igual o superior al 50% de los enlazadores de fórmula (II) y fórmula (III) del conjugado se encuentran en forma iónica cuando el conjugado se encuentra en un medio acuoso.
8. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la nanopartícula es una nanopartícula de oro.
9. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la nanopartícula es una nanoesfera que tiene un diámetro de 4 a 20 nm.
10. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que tiene estabilidad coloidal en un medio fisiológico.
11. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde A es un birradical de platino (II) de fórmula (IV).
12. Un procedimiento de preparación de un conjugado como se define en la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:
a) hacer reaccionar una nanopartícula NP de oro, plata o platino con un exceso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en la fórmula (Ila), fórmula (IIb), y una sal cualquiera del compuesto de fórmula (IIa) o del compuesto de fórmula (IIb),
Figure imgf000027_0001
en donde X y p tienen el mismo significado que se define en la reivindicación 1, e Y es un resto sulfonilo de fórmula (i') o un resto fosfonilo de fórmula (ii') como se define en la reivindicación 1; en una solución acuosa para dar lugar a un conjugado intermedio; en donde:
cuando se utiliza un compuesto de fórmula (IIa) o una sal del mismo, se obtiene un conjugado intermedio en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 0; y
cuando se utiliza un compuesto de fórmula (Ilb) o una sal del mismo, se obtiene un conjugado intermedio en donde, en el enlazador de fórmula (II), n es 1;
b) hacer reaccionar el conjugado intermedio obtenido en la etapa a) con una cantidad apropiada de un compuesto de platino (II) seleccionado del grupo que consiste en la fórmula (IVa), fórmula (Va), fórmula (VIa) y una sal de cualquiera de las fórmulas (IVa), (Va) o (VIa):
Figure imgf000027_0002
en una solución acuosa en presencia de una base, para obtener el conjugado deseado.
13. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11, junto con uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
14. Un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento del cáncer.
15. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la composición se administra por inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular.
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