ES2911253T3 - miARN-574-5p como biomarcador para la estratificación de tumores dependientes de prostaglandina e - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para identificar a un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E que comprende las etapas de: a) determinar en una muestra de ensayo del sujeto la cantidad de microARN-574-5p; b) comparar la cantidad determinada con una referencia; y c) identificar a un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E como susceptible de recibir una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E en base a dicha comparación.

Description

DESCRIPCIÓN

miARN-574-5p como biomarcador para la estratificación de tumores dependientes de prostaglandina e

La presente divulgación se refiere al campo de los procedimientos de diagnóstico. Más específicamente, se refiere a un procedimiento para identificar a un sujeto que sufre de un tumor dependiente de prostaglandina E como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E que comprende las etapas de determinar en una muestra de prueba del sujeto la cantidad de miARN-574-5p, comparar la cantidad determinada con una referencia, e identificar a un sujeto que sufre de un tumor dependiente de prostaglandina E como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E en base a dicha comparación. Además, la divulgación también abarca el uso de miARN-574-5p o de un agente de detección que se une específicamente al mismo en una muestra de un sujeto que padece un tumor dependiente de prostaglandina E para identificar al sujeto como susceptible de una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E y un dispositivo así como un kit para llevar a cabo el procedimiento de la divulgación.

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es la forma más común de cáncer de pulmón y representa aproximadamente el 80% de todos los casos. A pesar de los recientes avances en el tratamiento y el diagnóstico del CPNM, la tasa de supervivencia a 5 años es de aproximadamente el 18%. Sin embargo, se ha informado de la variabilidad en la respuesta a las terapias dirigidas y puede implicar la activación de vías de señalización compensatorias de la proliferación y la supervivencia celular.

Uno de estos mecanismos alternativos implica la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidérmico por la prostaglandina (PG) E2 (Pai, 2002). Este prostanoide desempeña un papel fundamental en el desarrollo y la progresión de varios tipos de cáncer, incluido el de pulmón. En la inflamación y el cáncer, la principal vía implicada en el aumento de la biosíntesis de PGE² es la actividad coordinada de la ciclooxigenasa (COX)-2, que convierte el ácido araquidónico en prostaglandina H² (PGH2), y de la prostaglandina sintasa microsomal E (mPGES-1), que cataliza la isomerización de PGH2 en PGE² (Jakobsson, 1999). Tanto la COX-2 como la mPGES-1 suelen estar reguladas al alza en el CPNM, pero su grado relativo de sobreexpresión varía, lo que indica diferentes mecanismos reguladores subyacentes.

La biosíntesis de PGE² puede ser inhibida por fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que comprenden inhibidores selectivos y no selectivos de la COX (Patrignani, 2015). Sin embargo, sólo se encontró un aumento significativo de la supervivencia en individuos con tumores que sobreexpresaban COX-2 o que se caracterizaban por una biosíntesis reducida de PGE² in vivo (Hughes, 2008).

Un enfoque alternativo para evitar el aumento de la biosíntesis de PGE² podría implicar el uso de fármacos que afecten únicamente a la actividad de la mPGES-1, tales como el inhibidor selectivo de la mPGES-1, el compuesto III (CIII, un benzoimidazol), que inhibe tanto la mPGES-1 recombinante murina como la humana, con efectos inhibitorios marginales sobre otras sintasas de prostanoides (Leclerc, 2013). Este fármaco también inhibe profundamente la biosíntesis de PGE² en las células A549, una línea celular epitelial pulmonar humana derivada de un adenocarcinoma de pulmón, así como en la sangre completa humana estimulada con LPS, es decir, en presencia de proteínas plasmáticas (Leclerc, 2013).

El valor terapéutico de los AINE y de los inhibidores de las PEG sintasas se discute en el campo de la oncología con gran controversia, dado que no todos los pacientes parecen ser aptos para dichos tratamientos.

La expresión desregulada de los microARN (miARN), una clase de pequeños ARN no codificantes, ha ocupado un lugar central en el desarrollo y la progresión del cáncer de pulmón. Entre ellos, se ha identificado miR-574-5p, que representa un biomarcador para el CPNM en fase inicial. Además, este miARN favorece la progresión tumoral por medio de la regulación a la baja del gen supresor del punto de control 1 en el cáncer de pulmón humano (Li, 2012). La sobreexpresión de miR-574-5p puede distinguir a los pacientes con cáncer de pulmón metastásico y promueve la migración y la invasión de las líneas celulares de CPNM (Zhou, 2016).

Zhou et al. (2015), Oncotarget 6(42):44609 informa sobre la invasión tumoral y la metástasis reguladas por el microARN-184 y el microARN-574-5p en el cáncer de pulmón de células pequeñas. WO 2013/082624 A2 describe procedimientos para prevenir el cáncer, tratar el cáncer, inhibir el crecimiento de los tumores, predecir los resultados de los pacientes, optimizar la dosis y supervisar la eficacia del tratamiento mediante el uso de ciertos microARN y ARN mensajeros como indicadores. Forsberg et al. (2000), FEBS Lett 471(1):78 informa sobre la estructura del gen y la regulación de la prostaglandina E sintasa dependiente de glutatión humana. El documento WO 2011/135459 A2 describe procedimientos, dispositivos y kits para predecir la sensibilidad de un paciente a un compuesto o tratamiento médico en base a los microARN. El documento US 2012/016002 A1 se refiere a un proceso de selección de pacientes para identificar a los individuos para el tratamiento del cáncer, la inflamación, el dolor y/o las afecciones relacionadas con un inhibidor selectivo de la COX-2 en base a los niveles del metabolito PGE².

Sin embargo, hasta ahora no se dispone de medios que permitan estratificar tumores tales como el CPNM para que respondan o no al tratamiento con fármacos terapéuticos tales como los AINE o los inhibidores de la PEG sintasa. No obstante, estos medios de estratificación serían muy deseables.

La presente invención, por lo tanto, se relaciona con un procedimiento para identificar a un sujeto que sufre de un tumor dependiente de prostaglandina E como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E que comprende las etapas de:

a) determinar en una muestra de ensayo del sujeto la cantidad de miARN-574-5p;

b) comparar la cantidad determinada con una referencia; y

c) identificar a un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E como susceptible de recibir una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E en base a dicha comparación.

El procedimiento de la presente invención, preferentemente, es un procedimiento ex vivo. Además, puede comprender otras etapas además de las mencionadas explícitamente. Por ejemplo, otras etapas se pueden referir a los pretratamientos de las muestras o a la evaluación de los resultados obtenidos por el procedimiento. El procedimiento se puede llevar a cabo manualmente o con ayuda de la automatización. Preferentemente, las etapas (a), (b) y/o (c) pueden estar total o parcialmente asistidas por la automatización, por ejemplo, por un equipo robótico y sensorial adecuado para la determinación en la etapa (a) o un algoritmo de comparación y/o diagnóstico implementado por ordenador que se ejecuta en un dispositivo de procesamiento de datos en las etapas (b) o (c).

El término “sujeto”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, tal como un animal de laboratorio, por ejemplo, un ratón o una rata, un animal de granja, por ejemplo, un cerdo, una vaca, un caballo o una cabra o un animal de compañía, por ejemplo, un gato o un perro. Más preferentemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto de acuerdo con la presente invención deberá padecer un tumor dependiente de la prostaglandina E como se describe en la presente memoria.

El término “tumor dependiente de la prostaglandina E”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una entidad tumoral cancerosa cuyo crecimiento y/o desarrollo depende de la formación de prostaglandina E. Preferentemente, dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, carcinoma de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cánceres de cabeza y cuello, carcinoma papilar de tiroides, gliomas de bajo y alto riesgo, neuroblastoma, meduloblastoma, carcinoma de cuello uterino, tumores cerebrales y cáncer de estómago. Más preferentemente, dicho tumor es un cáncer de pulmón y, más preferentemente, un cáncer de pulmón de células no pequeñas.

El término “ identificar”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a asignar una característica al sujeto, es decir, la característica de ser susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E, o no. Como comprenderán los expertos en la técnica, normalmente no se pretende que dicha asignación sea correcta para el 100% de los sujetos a investigar. Sin embargo, el término requiere que la asignación, es decir, la identificación, sea correcta para una porción estadísticamente significativa de los sujetos (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohortes). Los expertos en la técnica pueden determinar sin más si una porción es estadísticamente significativa mediante el uso de diversas herramientas de evaluación estadística muy conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación del valor p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferentes son al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Los valores p son, preferentemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001.

El término “susceptible a una terapia”, como se utiliza en la presente memoria, significa que un sujeto es capaz de responder a una terapia como se menciona de acuerdo con la presente invención. Una respuesta del sujeto, preferentemente, es una respuesta terapéutica. Una respuesta terapéutica significa que el sujeto muestra una mejoría, una curación u otro tipo de mejora de una enfermedad o afección o de los síntomas asociados a dicha enfermedad o afección. Además, el término también puede significar que un sujeto que recibe una dosis de terapia no reacciona negativamente a dicha terapia. Normalmente, una reacción adversa de este tipo da lugar a efectos secundarios perjudiciales asociados a la terapia.

El término “ inhibidor de la formación de prostaglandina E” se refiere a un compuesto o composición que es capaz de prevenir o reducir la formación de prostaglandina E in vivo. Preferentemente, la reducción es una reducción estadísticamente significativa. El inhibidor de la formación de prostaglandina E puede proceder de varias clases de moléculas químicas o de composiciones de las mismas. Puede ser un compuesto o composición sintetizada artificialmente o ser un derivado natural, por ejemplo, de plantas, partes de plantas o microorganismos. El hecho de que un compuesto o composición sea capaz de prevenir o reducir la formación de prostaglandina E in vivo se puede determinar por medio de pruebas conocidas por los expertos y descritas con más detalle, entre otros, en los Ejemplos adjuntos, más adelante. Preferentemente, el inhibidor de la formación de prostaglandina E es un inhibidor o antagonista de la prostaglandina E-sintasa-1 microsomal. Además, se ha informado que los antiinflamatorios no esteroideos también interfieren en la formación de prostaglandina E. De este modo, preferentemente, el inhibidor de la formación de prostaglandina E es un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y/o un inhibidor de la prostaglandina E-sintasa-1 microsomal (inhibidor de mPGES1). Más preferentemente, dicho AINE se selecciona del grupo que consiste en: inhibidores selectivos de la COX-2, preferentemente, parecoxib, etoricoxib o celecoxib, inhibidores selectivos de la COX1, preferentemente, Aspirina en dosis bajas, e inhibidores no selectivos de la COX1/2, preferentemente, naproxeno, ibuprofeno o diclofenaco. Más preferentemente, dicho inhibidor de mPGES1 se selecciona del grupo que consiste en: Derivados del MK-886, fenantreno o benzo imidazoles, biarilimidazoles, derivados del ácido piriníxico, ácido 2-mercaptohexanoico, derivados de la licofelona, benzo(g)indol-3-carboxilato, oxicams, ureas trisustituidas y benzamidas de carbazol.

El término “muestra de ensayo”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una muestra de tejido o de fluido corporal. Preferentemente, dicha muestra de tejido comprenderá tejido tumoral del tumor dependiente de prostaglandina E y dicha muestra de fluido corporal se sospechará que comprende miARN-574-5p (también denominado microRNA-574-5p). Más preferentemente, dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en: sangre completa, suero, plasma, orina y linfa.

El término “miARN-574-5p” o “miR-574-5p” se refiere a un miARN que tiene una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la SEC. ID Núm.: 3 o como se muestra en la Fig. 3, a continuación. Los microARNs son pequeños ARNs no codificantes, de una sola hebra, que son capaces de silenciar el gen del ARN y la regulación post-transcripcional de la expresión génica. Por lo general, estos efectos se producen por el emparejamiento de bases con una secuencia objetivo dentro de una molécula de ARNm y la subsiguiente escisión del ARNm, el acortamiento de la cola poli-A del ARNm y la desestabilización de la misma y/o la traducción menos eficiente del ARNm por parte de las ribozimas. Los microARN se generan dentro de la célula a partir de moléculas precursoras, los denominados pre-miARN, que son ARN monocatenarios autocomplementarios con una estructura de bucle de tallo. Estos pre-miARNA son el resultado de otros precursores, los pri-miARNs o de pre-mARNAs.

La determinación de la cantidad de miARN-574-5p se refiere a la medición de la cantidad o concentración, preferentemente de forma semicuantitativa o cuantitativa. La medición se puede hacer directa o indirectamente. La medición directa se refiere a la medición de la cantidad o concentración del miARN-574-5p basada en una señal que se obtiene del propio miARN-574-5p y cuya intensidad se correlaciona directamente con el número de moléculas del miARN-574-5p presentes en la muestra. Dicha señal (algunas veces denominada en la presente memoria como señal de intensidad) se puede obtener, por ejemplo, por medio de la medición de un valor de intensidad de una propiedad física o química específica del miARN-574-5p. La medición indirecta incluye la medición de una señal obtenida a partir de un componente secundario (es decir, un componente que no sea el propio miARN-574-5p) o un sistema de lectura biológica, por ejemplo, respuestas celulares medibles, ligandos, etiquetas o productos de reacciones enzimáticas.

De acuerdo con la presente invención, la determinación de la cantidad de miARN-574-5p se puede lograr por todos los medios conocidos para determinar la cantidad de un miARN en una muestra. Dichos medios comprenden dispositivos y procedimientos de análisis de ácidos nucleicos que pueden utilizar moléculas marcadas que se unen específicamente al miARN-574-5p en varios formatos de ensayo. Dichos ensayos desarrollarán una señal indicativa de la presencia o ausencia del miARN-574-5p. Además, la intensidad de la señal se puede, preferentemente, correlacionar directa o indirectamente (por ejemplo, inversamente proporcional) con la cantidad de miARN-574-5p presente en una muestra. Normalmente, para determinar cuantitativamente la cantidad de un miARN se aplican técnicas de análisis de ácidos nucleicos basadas en la hibridación o en la PCR. Dichas técnicas, preferentemente, utilizan moléculas de ácido nucleico que se hibridan específicamente con el ácido nucleico diana, es decir, el miARN, como agentes de detección específicos. Además, las técnicas basadas en la PCR también utilizan moléculas de ácido nucleico como cebadores para amplificar específicamente el miARN objetivo y, por lo tanto, otros agentes de detección específicos. Las moléculas de ácido nucleico que se unen específicamente al miARN diana pueden ser derivadas de la secuencia de ácido nucleico del miARN-574-5p por los expertos sin más. Tales secuencias, típicamente, tienen una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia objetivo. Además, los oligonucleótidos adecuados como ácidos nucleicos de cebado también se pueden derivar de la secuencia de miARN para ser amplificada por los expertos sin más.

Otros procedimientos adecuados comprenden la medición de una propiedad física o química específica para el miARN-574-5p, tal como su masa molecular precisa o su espectro de RMN. Dichos procedimientos comprenden, preferentemente, biosensores, dispositivos ópticos acoplados a analizadores de ácidos nucleicos, biochips y, en particular, arrays de ácidos nucleicos, inmunoensayos, dispositivos analíticos tales como espectrómetros de masas, analizadores de RMN o dispositivos de cromatografía.

Preferentemente, la cantidad de miARN-574-5p se puede determinar por medio de una tecnología de análisis de ácidos nucleicos y, más preferentemente, por medio de una tecnología basada en PCR. En particular, la cantidad de miARN-574-5p se puede determinar por medio de PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), más preferentemente, llevada a cabo como se describe en los Ejemplos adjuntos, a continuación.

Preferentemente, las tecnologías de PCR digital se pueden utilizar también para la cuantificación de miARN-574-5p. Para ello, el miARN también se transcribe de forma inversa y posteriormente se analiza por medio de tecnologías de PCR digital.

También preferentemente, la cantidad de miARN-574-5p se puede determinar por medio de tecnologías de hibridación in situ en las que se utiliza una sonda marcada a fin de determinar las moléculas de miARN en una muestra de tejido. La cuantificación se puede llevar a cabo por medio de la determinación óptica de una etiqueta, tal como una etiqueta fluorescente o quimioluminiscente acoplada a la sonda de detección.

Sin embargo, preferentemente, la cantidad de miARN-574-5p también se puede determinar por medio de técnicas de hibridación mediante el uso de una sonda específica para la diana que posteriormente se une a las sondas enlazadoras y potenciadoras, tal como la tecnología RNAscope. Esta tecnología también se puede utilizar en un enfoque in situ en muestras de tejido. A fin de evaluar la cantidad de sondas marcadas unidas, se puede aplicar la citometría de flujo.

También preferentemente, la determinación de la cantidad de miARN-574-5p puede comprender la etapa de medir una señal de intensidad específica obtenida del miARN-574-5p en la muestra. Como se ha descrito anteriormente, dicha señal puede ser la intensidad de la señal observada en una variable m/z específica para el miARN-574-5p observada en los espectros de masas o en un espectro de RMN específico.

El término “cantidad”, como se utiliza en la presente memoria, abarca la cantidad absoluta de miARN-574-5p, la cantidad o concentración relativa de miARN-574-5p, así como cualquier valor o parámetro que se correlacione con ella o se pueda derivar de ella. Dichos valores o parámetros comprenden los valores de la señal de intensidad de todas las propiedades físicas o químicas específicas obtenidas de dichas moléculas de miARN-574-5p por medio de mediciones directas. Además, se engloban todos los valores o parámetros que se obtienen por medio de mediciones indirectas especificadas en otra parte de esta descripción, por ejemplo, los niveles de respuesta determinados a partir de sistemas de lectura bioquímica o biológica en respuesta al miARN-574-5p o las señales de intensidad obtenidas a partir de ligandos específicamente unidos. Se debe entender que los valores correspondientes a las cantidades o parámetros mencionados también se pueden obtener por medio de todas las operaciones matemáticas habituales.

El término “comparar”, como se utiliza en la presente memoria, abarca la comparación de la cantidad de miARN-574-5p comprendida por la muestra de ensayo con una cantidad de una referencia adecuada especificada en otra parte de esta descripción. Se debe entender que la comparación, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una comparación de parámetros o valores correspondientes, por ejemplo, una cantidad absoluta se compara con una cantidad de referencia absoluta, mientras que una concentración se compara con una concentración de referencia o una señal de intensidad obtenida de una muestra de prueba se compara con el mismo tipo de señal de intensidad de una muestra de referencia. La comparación a la que se refiere la etapa (b) del procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo manualmente o con ayuda de un ordenador. En el caso de una comparación asistida por ordenador, el valor de la cantidad determinada se puede comparar con valores correspondientes a referencias adecuadas que están almacenadas en una base de datos por un programa informático. El programa informático puede además evaluar el resultado de la comparación, es decir, proporcionar automáticamente la evaluación deseada en un formato de salida adecuado. La referencia se debe elegir de forma que una diferencia o una similitud en las cantidades comparadas permita identificar a los sujetos de prueba que pertenecen al grupo de sujetos susceptibles a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

Por consiguiente, el término “referencia”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cantidad de referencia que permite evaluar si un sujeto que sufre de un tumor dependiente de la prostaglandina E es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E, o no. En consecuencia, la referencia se puede, por ejemplo, derivar de un sujeto o un grupo de sujetos que padecen un tumor dependiente de la prostaglandina E que se sabe que es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E, una muestra de tejido no tumoral o de un sujeto o un grupo de sujetos que padecen un tumor dependiente de la prostaglandina E que se sabe que no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E o, alternativamente, un sujeto o grupo de sujetos sanos. El importe de referencia se puede utilizar para definir y establecer un importe umbral. La cantidad del umbral, preferentemente, permite un diagnóstico de entrada y/o de salida. La cantidad de referencia aplicable a un sujeto individual puede variar en función de diversos parámetros fisiológicos, tales como la edad, el sexo o la subpoblación, así como de los medios utilizados para la determinación del miARN a que se refiere la presente memoria. Una cantidad de referencia adecuada se puede determinar a partir de una muestra de referencia que se analizará conjuntamente, es decir, simultánea o posteriormente, con la muestra de ensayo.

Preferentemente, dicha referencia procede de un sujeto o grupo de sujetos que padecen un tumor dependiente de la prostaglandina E y que se sabe que son susceptibles a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E. Más preferentemente, una cantidad esencialmente idéntica o aumentada de miARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E y en la que una cantidad disminuida de miARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

También es preferente que dicha referencia se derive de (i) una muestra de tejido no tumoral o de (ii) un sujeto o un grupo de sujetos que padecen un tumor dependiente de la prostaglandina E que se sabe que no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E o (iii) un sujeto o grupo de sujetos sanos. Más preferentemente, una cantidad esencialmente idéntica o disminuida de microARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E y en la que una cantidad aumentada de microARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

Ventajosamente, se observó, de acuerdo con los estudios en los que se basa la presente invención, que en los pacientes con cáncer de pulmón, la expresión de miR-574 está fuertemente regulada al alza en el tejido canceroso en comparación con el tejido normal. Los estudios también tenían como objetivo investigar: (i) si la sobreexpresión de miR-574-5p en las células tumorales influye en la biosíntesis de PGE² y desentrañar los mecanismos moleculares implicados, (ii) las consecuencias funcionales de la sobreexpresión de miR-574-5p en las células tumorales sobre el crecimiento de los tumores de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes y (iii) si la inhibición de la actividad de mPGES-1 inducida por miARN por medio de un inhibidor de la PEG sintasa frena el crecimiento de las células tumorales de pulmón. De este modo, se debería dilucidar un posible vínculo entre el microARN y la formación de cáncer de pulmón mediada por PEG. Los microARN (miR) son importantes reguladores postranscripcionales de la expresión génica. Además de sus efectos inhibidores bien caracterizados sobre la estabilidad del ARNm y la traducción, los miRs también pueden activar la expresión de los genes. En los estudios en los que se basa la presente invención, se identificó una función no canónica de miR-574-5p. Actúa como ARN señuelo de la proteína 1 de unión a CUG (CUGBP1) y antagoniza sus funciones. Se observó una fuerte regulación al alza de miR-574-5p en los tumores de pulmón humanos. Este aumento se asoció a una mayor biosíntesis de PGE² dependiente de mPGES-1, un mediador lipídico bioactivo que desempeña un papel predominante en la progresión del tumor de pulmón. MiR-574-5p indujo la expresión de mPGES-1 por medio de la prevención de la unión de CUGBP1 a su 3'UTR, lo que condujo a una mayor formación de PGE² y al crecimiento del tumor in vivo. Gracias a esta asociación recién descubierta, miR-574-5p se reveló como un biomarcador útil para seleccionar a los pacientes con tumores de pulmón que responderán a la inhibición farmacológica de la PGE². En concreto, se demostró que miR-574-5p está fuertemente regulado al alza en el tejido del cáncer de pulmón. Cuando se sobreexpresa en las células A549, miR-574-5p induce un fuerte aumento de la formación de PGE². En un modelo de ratón de xenoinjerto en el que se inyectaron células A549 que sobreexpresaban miR-574-5p en ratones nude, se observó una inducción altamente significativa del crecimiento tumoral y de los niveles de PGE-M en la orina en comparación con las células A549 de control, que se bloqueó con el inhibidor selectivo de mPGES-1. Los datos sugieren que miR-574-5p presenta propiedades oncogénicas y promueve el crecimiento tumoral a través de la inducción de la síntesis de PGE² derivada de mPGES-1. De forma ventajosa, se descubrió que CUGBP1 inhibe la expresión de mPGES-1 a través del splicing alternativo y la represión de la traducción por medio de la unión a los GRE en la 3'UTR del gen mPGES-1. Además, miR-574-5p puede actuar como señuelo al unirse a CUGBP1, para de ese modo impedir su función reguladora. De este modo, se reveló una nueva función no canónica de miR-574-5p, a saber, actuar como señuelo regulador de la proteína de unión al ARN CUGBP1. De este modo, se pudo demostrar que el equilibrio de CUGBP1 y miR-574-5p regula la proliferación celular, el crecimiento tumoral y la síntesis de PGE² dependiente de mPGES-1. De acuerdo con estos resultados in vivo, miR-574-5p parece desempeñar un papel importante en la regulación de la liberación de PGE² dependiente de mPGES-1 en el cáncer de pulmón y, por lo tanto, ofrece una nueva diana terapéutica en el tratamiento del cáncer de pulmón y otros tumores dependientes de PEG. Curiosamente, la regulación de la síntesis de PGE² por miR-574-5p sólo implica a mPGES-1 mientras que la COX-2 no está regulada por CUGBP1 y miR-574-5p. El vínculo recién descubierto entre la sobreexpresión de miR-574-5p y el crecimiento de las células de cáncer de pulmón mediado por la PGE² in vivo sugiere que la inhibición farmacológica de la formación de PGE² con AINE o inhibidores de mPGES-1 podría tener un valor terapéutico considerable para los pacientes con CPNM con niveles elevados de miR-574-5p.

Se debe entender que las definiciones y explicaciones de los términos hechas arriba y abajo se aplican en consecuencia para todas las realizaciones descritas en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que la acompañan.

La presente invención se refiere además al uso del microARN-574-5p o de un agente de detección que se une específicamente al mismo en una muestra de un sujeto que padece un tumor dependiente de prostaglandina E para identificar al sujeto como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

La presente invención también se refiere a un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 14. La presente divulgación también se refiere a un dispositivo adaptado para llevar a cabo el procedimiento de la invención que comprende

a) una unidad de análisis que comprende un agente de detección que se une específicamente al microARN-574-5p adaptado para determinar la cantidad de dicho microARN-574-5p en una muestra de un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E; y

b) una unidad de evaluación para comparar la cantidad determinada con una referencia que permita identificar al sujeto como susceptible de recibir una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E; dicha unidad comprende una base de datos con referencias como las definidas anteriormente y un algoritmo implementado por ordenador para llevar a cabo la comparación.

El término “dispositivo”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un sistema que comprende las unidades mencionadas anteriormente, vinculadas entre sí de forma operativa para permitir la realización del procedimiento de la invención. Los agentes de detección preferentes que se pueden utilizar para la unidad de análisis son moléculas de ácido nucleico utilizadas como sondas o cebadores, como se describe en la presente memoria. La unidad de análisis, preferentemente, comprende dichos agentes de detección en forma inmovilizada sobre un soporte sólido que se debe poner en contacto con la muestra que comprende el microARN-574-5p, cuya cantidad se debe determinar. Además, la unidad de análisis puede comprender también recipientes con cebadores de PCR que amplifican específicamente el microARN-574-5p. Dichos cebadores de PCR pueden ser suministrados desde los recipientes a un área de reacción donde la muestra de ensayo se pone en contacto con los cebadores en condiciones que permiten la amplificación de la PCR y la detección del miARN. Además, la unidad de análisis puede comprender también un detector que determina la cantidad de agente de detección que se une específicamente al miARN o a un producto de amplificación del mismo. La cantidad determinada se puede transmitir a la unidad de evaluación. Dicha unidad de evaluación comprende un elemento de procesamiento de datos, tal como un ordenador, con un algoritmo implementado para llevar a cabo una comparación entre la cantidad determinada y una referencia adecuada. Las referencias adecuadas se definen anteriormente en el contexto del procedimiento de la presente invención. Los resultados se pueden presentar como salida de datos brutos de diagnóstico paramétrico, preferentemente, como cantidades absolutas o relativas. Se debe entender que estos datos necesitarán ser interpretados por el clínico. Sin embargo, también se prevén dispositivos de sistemas expertos en los que la salida comprende datos brutos de diagnóstico procesados cuya interpretación no requiere un clínico especializado.

Además, la presente divulgación se refiere a un kit adaptado para llevar a cabo el procedimiento de la invención que comprende un agente de detección que se une específicamente al microARN-574-5p, así como instrucciones para llevar a cabo dicho procedimiento.

El término “kit”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una colección de los componentes antes mencionados, preferentemente, suministrados por separado o dentro de un único recipiente. El envase también incluye instrucciones para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Estas instrucciones pueden ser en forma de manual o pueden ser proporcionadas por un código de programa de ordenador que es capaz de llevar a cabo las comparaciones a las que se refieren los procedimientos de la presente invención y establecer un diagnóstico en consecuencia cuando se implementa en un ordenador o un dispositivo de procesamiento de datos. El código del programa informático se puede proporcionar en un medio o dispositivo de almacenamiento de datos, tal como un medio de almacenamiento óptico (por ejemplo, un disco compacto) o directamente en un ordenador o dispositivo de procesamiento de datos. Además, el kit comprenderá al menos un estándar para una referencia como la definida anteriormente, es decir, una solución con una cantidad predefinida para el microARN-574-5p que representa una cantidad de referencia. Dicho estándar puede representar, por ejemplo, la cantidad de microARN-574-5p útil como referencia como se describe en otra parte de la presente memoria.

La presente invención también contempla un inhibidor de la formación de prostaglandina E para su uso de acuerdo con la reivindicación 15. La presente divulgación también se refiere a un inhibidor de la formación de prostaglandina E para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de prostaglandina E en un sujeto, en el que dicho sujeto presenta un aumento de las cantidades de miARN-574-5p (i) en el tejido tumoral en comparación con el tejido no tumoral o (ii) en un fluido corporal del sujeto en comparación con una referencia de un sujeto sano o un grupo de sujetos sanos o un sujeto que se sabe que no padece un tumor dependiente de prostaglandina E o un grupo de dichos sujetos. Preferentemente, el sujeto ha sido identificado por el procedimiento de la presente invención antes mencionado.

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento de tratamiento de un tumor dependiente de prostaglandina E por medio de un inhibidor de la formación de prostaglandina E identificando a un sujeto como susceptible de una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E por medio del procedimiento de la invención referido anteriormente y la administración a dicho sujeto identificado el inhibidor de la formación de prostaglandina E en una cantidad terapéuticamente aceptable.

Figuras

Figura 1: La sobreexpresión de miR-574-5p aumenta la biosíntesis de PGE². (a) Expresión de miR-574-5p en tejido no tumoral (NT) y tumoral (T) de pacientes con CPNM (tres adenocarcinomas y un carcinoma escamoso). La expresión se analizó por medio de qRT-PCR y se normalizó con respecto al control miRTC. Los datos se muestran como media SEM. (b) La expresión de miR 574-5p en las células A549 transducidas de forma estable con miR-574-5p (A549 miR-574-5p oe) o con el vector lentiviral de control se analizó por medio de qRT-PCR y se normalizó con los niveles de snRNA U6 como estándar interno. Los datos se muestran como media SEM. (c) La sobreexpresión de miR-574-5p aumenta la biosíntesis de PGE² en las células A549 estimuladas con IL-1p. Las células A549 miR574-5p oe o las células de control se trataron con vehículo (PBS) o IL-1p (5 ng/ml) durante 24 hs. A continuación, se determinaron los niveles de PGE² en el medio condicionado por medio de un radioinmunoensayo validado y se normalizaron con respecto a la concentración total de proteínas. Los datos se muestran como media SEM. (d) La expresión de las proteínas mPGES-1 y (e) COX-2 se determinó por Western blot en las células A549 de control y a 549 miR-574-5p oe incubadas con o sin IL-1p durante 24 hs. GAPDH se utilizó como control de carga. Los cambios relativos con respecto al control t0 (establecido como 1) se indican como media SEM, prueba t, *p<0,05, **p<0,01, ***p < 0,001. Se muestran las manchas de un experimento representativo. (f) Expresión de miR-574-5p en tejido no tumoral (NT, n = 6) y tumoral (T, n = 11) de pacientes con CPNM (diez adenocarcinomas y un carcinoma escamoso). La expresión se analizó por medio de qRT-PCR y se normalizó con respecto al control miRTC. Los datos se muestran como media SEM.

Figura 2: Efectos de la sobreexpresión de miR-574-5p y de la inhibición de mPGES-1 en células A549 sobre el crecimiento tumoral y la biosíntesis sistémica de PGE² en ratones nude con xenoinjerto A549. (a) Representación esquemática del diseño experimental. (b) El volumen del tumor se midió por medio de un calibrador digital en ratones nude inoculados con células A549 de control o A549 miR-574-5p oe y tratados con vehículo. Los datos se muestran como media SEM. Análisis ANOVA y prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keus, *p<0,05, **p<0,01. (c) Volumen del tumor y (d) peso del tumor evaluado en el día 28. Los datos se presentan como media SEM, prueba t, *p<0,05, **p<0,01. (e) Los niveles de PGE-M se determinaron por medio de análisis de LC-MS/MS en muestras de orina recolectadas durante 24 hs. Los niveles de PGE-M están corregidos por los niveles de creatinina urinaria y los datos se presentan como media SEM, prueba t, **p<0,01. Los ratones inyectados con (f) células A549 control o (g) A549 miR-574-5p oe se trataron con CIII (50 mg/kg) o vehículo durante 4 semanas y se evaluó el volumen tumoral. Los datos se muestran como media ± SEM. Análisis ANOVA y prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keus. §<0,05, *p<0,05, **p<0,01. (h) Peso del tumor evaluado en el día 28. Los datos se expresan como media SEM, prueba t, *p<0,05, **p<0,01. (i) Los niveles de PGE-M se determinaron por medio de análisis de LC-MS/MS en muestras de orina recolectadas durante 24 hs. Los niveles de PGE-M están corregidos por los niveles de creatinina urinaria y los datos se presentan como media SEM, prueba t, *p<0,05, **p<0,01.

Figura 3: CUGBP1 se une a los elementos ricos en GU de mPGES-1 3'UTR y a miR-574-5p maduro. (a) Secuencias de GRE1 (SEC. ID Núm.: 1), GRE2 (SEC. ID Núm.: 2), miR-574-5p (SEC. ID Núm.: 3) y mGRE mutado (SEC. ID Núm.: 4). Los sitios de unión de CUGBP1 están sombreados en recuadros grises. Acceso a RefSeq NM_004878.4: GRE1 en la posición 406-445 y GRE2 en la posición 1403-1449. (b) Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) de la sonda miR-574-5p radiomarcada incubada con las cantidades indicadas de lisados citosólicos de A549. (c) EMSA de la sonda miR-574-5p radiomarcada con extractos citosólicos (50 |jg de proteína) de células A549 sin o con sobreexpresión de CUGBP1. Se añadió ARN de miR-574-5p sin etiquetar (con un exceso de 1000 veces) en las muestras como se indica. (d) EMSAs de GRE1, GRE2 y mGRE radiomarcados con extractos citosólicos de células A549 sin o con sobreexpresión de CUGBP1 (10 jg de proteína). (e) EMSAs de GRE1, GRE2 y mGRE radiomarcados con extractos citosólicos de células A549 sin o con CUGBP1 oe (50 jg de proteína). Se añadió ARN de miR-574-5p sin etiquetar (con un exceso de 1000 veces) en las muestras como se indica. Los complejos ARN-proteína se separaron por electroforesis en condiciones no desnaturalizantes (gel de PAA al 6%). Los geles se analizaron en un generador de imágenes de fósforo. En cada caso, se muestra un EMSA representativo de tres experimentos independientes.

Figura 4: Identificación y caracterización de una nueva isoforma de ARNm mPGES-1 3'UTR. (a) Productos de RT-PCR obtenidos con un par de cebadores que revisten la 3'UTR de mPGES-1 en fibroblastos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide, células A549 y HeLa. Los productos de la PCR se separaron en un gel de agarosa al 1%. Se muestra un gel representativo de tres experimentos independientes. (b) Representación esquemática de la isoforma de ARNm mPGES-1 3'UTR identificada. Los elementos ricos en GU se indican con recuadros negros. (c) Las células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con construcciones mPGES-1 3'UTR con pCUGBP1 o plásmido de control pCMV-MS durante 48 hs. Los recuadros negros describen los GREs dentro de mPGES-1 3'UTR, mientras que los recuadros grises indican los GREs eliminados. Después de 48 hs se determinó la actividad de la luciferasa y se normalizó para la eficiencia de transfección mediante el uso del sistema de ensayo de luciferasa Dual-GloTM. Los cambios relativos se dan como media SEM; prueba t, p* < 0,05 **p < 0,01. (d) Análisis de RT-PCR mediante el uso de un par de cebadores que revisten la 3'UTR de mPGES-1 en células HeLa transfectadas con construcciones de mPGES-1 3'UTR con y sin CUGBP1 oe. Los productos de la RT-PCR se separaron en un gel de agarosa al 1%. Se muestra un gel representativo de tres experimentos independientes. (e) Determinación de la estabilidad de las isoformas de mPGES-1 y mPGES-1 3'UTR por medio de qRT-PCR. Las células A549 se trataron con actinomicina D (2 jg/m l) y se analizaron los niveles de ARNm de la mPGES-1 y de la isoforma 3'UTR de la mPGES-1 en los puntos temporales indicados. la p-actina se utilizó como control. Los cambios relativos con respecto al punto temporal 0 (fijado como 1) se indican como media SEM, ANOVA de 2 vías, postest de Bonferroni, *p<0,05, ***p<0,001.

Figura 5: Efecto de la eliminación de CUGBP1 en la expresión de mPGES-1 y COX-2. Las células A549 se transfectaron con 20 pmol/jl de ARNsi CUGBP1 o ARNsi de control y se incubaron con 5 ng/ml de IL-1p durante 24 hs. A continuación, el medio de cultivo celular se sustituyó por un medio sin IL-1p. Las células se cultivaron durante 24 hs más. Se llevó a cabo un análisis de qRT-PCR de (a) la expresión del ARNm de la isoforma mPGES-1 y (b) de la mPGES-1 3'UTR en los puntos temporales indicados tras el cambio de medio. La p-actina se utilizó como control. (c) Análisis de Western blot de la expresión de mPGES-1. Se utilizó GAPDH como control de carga. Se muestra un blot representativo de tres experimentos independientes (panel derecho). (d) Análisis LC-MS/MS de los niveles de PGE², (e) Análisis qRT-PCR de la expresión del ARNm de COX-2. la p-actina se utilizó como control. (f) Análisis de Western blot de la expresión de la proteína COX-2. Se utilizó GAPDH como control de carga. Se muestra un blot representativo de tres experimentos independientes (panel derecho). Los cambios relativos con respecto al punto temporal -24 hs (fijado como 1) se indican como media SEM, ANOVA de 2 vías, postest de Bonferroni, *p < 0,05, *p < 0,01, ***p<0,001.

Figura 6: Efecto de la sobreexpresión y del knockdown de miR-574-5p sobre la expresión de mPGES-1. (a,b) Las células A549 sin o con miR-574-5p oe cultivaron sin o con 5 ng/ml de IL-1p durante 24 hs como se indica. (a) Análisis qRT-PCR de la expresión del ARNm de la isoforma mPGES-1 y mPGES-1 3'UTR. la p-actina se utilizó como control. (b) Análisis de Western blot de la expresión de la proteína mPGES-1. Se utilizó GAPDH como control de carga. Se muestra un blot representativo de tres experimentos independientes. (c, d) Las células A549 sin o con knockdown de miR-574-5p se cultivaron sin o con 5 ng/ml de IL-1p durante 24 hs como se indica. (c) Análisis qRT-PCR de la expresión del ARNm de la isoforma mPGES-1 y mPGES-1 3'UTR. La p-actina se utilizó como control. Los cambios relativos respecto al control t0 se dan como media SEM, prueba t, *p < 0,05. **p< 0,01. (d) Análisis de Western blot de la expresión de la proteína mPGES-1. Se utilizó GAPDH como control de carga. Se muestra un blot representativo de cuatro experimentos independientes.

Figura 7: CUGBP1 se une a los elementos ricos en GU de mPGES-1 3'UTR y a miR-574-5p maduro. Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP) para determinar el enriquecimiento de ARNm de mPGES-1 (a) y miR-574-5p (b) en CUGBP1-IP en comparación con IgG-IP. COX-2 y miR-16 se utilizaron como controles negativos. Las células A549 se trataron con 5 ng/ml de IL1-p durante 24 hs y se llevó a cabo la inmunoprecipitación con anticuerpos contra CUGBP1 o IgG normal de ratón, respectivamente. El ARN coprecipitado unido a CUGBP1 se cuantificó entonces por medio de qRT-PCR (n = 4). El enriquecimiento relativo normalizado con respecto a la IgG se da como media SEM, prueba t **p<0,01. (c) Validación de la inmunoprecipitación de CUGBP1 por Western Blot. 16,6% ± 7,7 (SEM) del total de CUGBP1 se recuperó en los precipitados inmunes. Se muestra un blot representativo de cuatro experimentos independientes.

Figura 8: Influencia de la expresión de mPGES-1 y CUGBP1 en la tasa de supervivencia de los pacientes con CPNM. (a) Una expresión elevada de mPGES-1 y (b) una expresión baja de ARNm de CUGBP1 se correlacionan con una menor tasa de supervivencia de los pacientes con CPNM. Los gráficos de Kaplan Meier muestran la supervivencia global de 1926 pacientes con cáncer de pulmón de acuerdo con la herramienta de metaanálisis “Kaplan Meier plotter” (http://kmplot.com/analysis/; versión 2015). El análisis de la supervivencia global se llevó a cabo a partir de los datos del array de genes de 1926 pacientes con cáncer de pulmón. Las muestras se dividieron en dos grupos. En rojo: pacientes con expresión superior a la mediana y en negro: pacientes con expresión inferior a la mediana.

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos se limitarán a ilustrar la invención. No obstante, no se deben interpretar como una limitación del ámbito de aplicación.

Ejemplo 1: miR-574-5p está regulado al alza en los tumores de pacientes con CPNM en estadio IMII

Se analizó la expresión de miR-574-5p en el tejido pulmonar tumoral y no tumoral de cuatro pacientes con CPNM. Tres de los tumores se clasificaron histológicamente como adenocarcinoma y uno como carcinoma escamoso. Se observó un fuerte aumento de la expresión de miR-574-5p en los tumores en comparación con el tejido no tumoral, de acuerdo con se evaluó por medio de qRT-PCR (Fig. 1a). Los datos se confirmaron además aumentando el número de muestras de pacientes de CPNM para medir la expresión de miR-574-5p en tejido no tumoral (NT, n = 6) y en tejido tumoral (T, n = 11; diez adenocarcinomas y un carcinoma escamoso) de pacientes de CPNM (Fig. Si). Estos datos apoyan el importante papel sugerido anteriormente de miR-574-5p en la progresión tumoral.

Ejemplo 2: La sobreexpresión de miR-574-5p en las células A549 aumenta la biosíntesis de PGE2

A fin de investigar si miR-574-5p afecta a la síntesis de PGE², se utilizaron células A549 que sobreexpresan de forma estable miR-574-5p (~ 33 veces de regulación) (Fig. 1b). La expresión de mPGES-1 fue inducida por IL-1p. MiR-574-5p oe produce un aumento significativo de la biosíntesis de PGE² en comparación con el control A549 sólo después de la inducción con IL-1p (Fig. 1c). Este efecto se asoció a un aumento de los niveles de mPGES-1, pero no de COX-2 (Fig. 1d,e). El papel clave de mPGES-1 en el aumento de la biosíntesis de PGE² por la sobreexpresión de miR-574-5p está respaldado por el hallazgo de que la biosíntesis de PGF²a (que depende de COX-2 pero no de mPGES-1) no se vio afectada (datos no mostrados).

En conjunto, estos resultados muestran que miR-574-5p oe promueve la biosíntesis de PGE² dependiente de mPGES-1. A continuación, se investigó en un modelo de ratón de xenoinjerto, si la inducción de mPGES-1 por miR-574-5p en las células A549 conduce a tumores de pulmón de crecimiento más rápido.

Ejemplo 3: La sobreexpresión de miR-574-5p en las células A549 aumenta el crecimiento tumoral in vivo asociado a una mayor biosíntesis sistémica de PGE2

Se inyectaron células A549 miR-574-5p oe o A549 de control en los flancos traseros de ratones nude y se monitorizó la formación de tumores hasta 4 semanas después de la inyección (Fig. 2a). El volumen del tumor se evaluó tres veces por semana mediante el uso de un calibrador digital. El grupo de ratones inyectados con células A549 de control desarrolló 11 tumores, mientras que el grupo de ratones inyectados con miR-574-5p oe desarrolló 12 tumores que crecieron de forma dependiente del tiempo (Fig. 2b). En el día 28, el volumen tumoral era de una media de 0,059+0,08 cm3 en el control A549 (n=11) y de 0,138+0,096 en los animales tratados con miR-574-5p oe, respectivamente (n=12) (Fig. 2c). En el momento del sacrificio, el peso del tumor era significativamente mayor en los tumores derivados de A549 miR-574-5p (Fig. 2d).

En el día 27, se evaluó la biosíntesis sistémica de PGE² por medio de la evaluación de los niveles de PGE-M en la orina de 24 hs. Como se muestra en la Figura 2e, los niveles medios de PGE-M en orina fueron significativamente mayores en los ratones inyectados con A549 miR-574-5p oe frente a los inyectados con células A549 de control.

En general, estos resultados muestran que la sobreexpresión de miR-574-5p promueve un crecimiento más rápido de las células de cáncer de pulmón asociado a una mayor biosíntesis de PGE² in vivo. Estos resultados llevaron a verificar si la biosíntesis de PGE² dependiente de mPGES-1 es responsable del aumento del crecimiento tumoral causado por miR-574-5p oe en ratones nude con xenoinjertos.

Ejemplo 4: La inhibición de mPGES-1 reduce el potencial tumorígeno de las células A549 in vivo

Se utilizó el inhibidor selectivo de mPGES-1 CIII para evaluar si la estimulación del crecimiento tumoral por miR-574-5p in vivo depende del aumento de la formación de PGE². A fin de comprobar esta hipótesis, los ratones a los que se les inyectó células A549 de control (n=11) y A549 miR-574-5p oe (n=11) se trataron con CIII y se evaluó la progresión del tumor. Los resultados se compararon con los obtenidos en ratones inyectados con células A549 de control (n=11) 0 A549 miR-574-5p oe (n=12) tratados sólo con vehículo (Fig. 2b). La administración de CIII no afectó al crecimiento tumoral basal de los ratones de control (Fig. 2f), mientras que el compuesto redujo significativamente el aumento dependiente del tiempo del crecimiento tumoral de los ratones a los que se les inyectaron células A549 miR-574-5p oe y la progresión tumoral fue comparable a la de los ratones de control A549 (Fig. 2f,g). En el día 28, el peso del tumor se redujo significativamente con la administración de CIII sólo en los ratones miR-574-5p oe (Fig. 2h). La medición de la excreción urinaria de PGE-M reveló que el fármaco afectaba a los niveles de PGE-M sólo en los ratones miR-574-5p oe, al frenar el aumento de la biosíntesis de PGE² que se producía tras la implantación de las células tumorales (Fig. 2i). Se evaluó el impacto de la administración de CIII en la biosíntesis sistémica de otros prostanoides. Los niveles urinarios de PGI-M y TX-M no se vieron significativamente afectados por el fármaco en los ratones miR-574-5p oe, así como en los ratones de control (datos no mostrados). Los niveles de PGD-M tendían a ser mayores en los ratones miR-574-5p oe frente a los ratones A549 de control y la administración de CIII no produjo un cambio significativo en los niveles urinarios de PGD-M en ambos grupos de ratones (datos no mostrados).

Los datos sugieren que el CIII reduce el desarrollo de tumores sólo en ratones inyectados con células A549 miR-574-5p oe por la inhibición selectiva de la biosíntesis de PGE² sin causar una desviación sustancial de PGH² hacia otros prostanoides. Un análisis inmunohistoquímico apodado que la inhibición de mPGES-1 por CIII reduce la proliferación celular y la angiogénesis (datos no mostrados)

Ejemplo 5: miR-574-5p regula la expresión de mPGES-1 de forma no canónica

Los datos in vivo indican que el crecimiento del tumor se acelera a través de la biosíntesis de PGE² inducida por miR-574-5p. Sin embargo, el ARNm de mPGES-1 no contiene ningún sitio de unión directa para miR-574-5p y, por lo tanto, no es una diana para el silenciamiento canónico de miARN. En cambio, la sobreexpresión de miR-574-5p aumenta la biosíntesis de PGE², lo que sugiere un mecanismo de regulación alternativo al silenciamiento del ARNm mediado por miARN.

Recientemente, se ha descubierto un nuevo mecanismo de miARN que conduce a la activación de la expresión génica. En este caso, miR-328 actúa como señuelo para la proteína de unión al ARN hnRNP E2 contrarrestando su función como represor de la traducción. A fin de encontrar un mecanismo similar para miR-574-5p, se encontraron secuencias ricas en GU tanto dentro de la región no traducida 3' (3' UTR) de mPGES1 como en la forma madura de miR-574-5p. Estas secuencias ricas en GU (GREs) representan sitios de unión para CUGBP1 (Fig. 3a). De este modo, se investigó si miR-574-5p puede inducir la síntesis de PGE² antagonizando la función de CUGBP1.

Se llevaron a cabo ensayos de cambio de movilidad electroforética para determinar si CUGBP1 se une a miR-574-5p maduro. Se incubó miR-574-5p radiomarcada con extractos citosólicos de células A549 y de células A549 que sobreexpresaban CUGBP1 (CUGBP1 oe) en 3,5 veces (datos no mostrados). La formación del complejo CUGBP1/miR-574-5p se correlaciona bien con cantidades crecientes de extracto citosólico (Fig. 3b). La sobreexpresión de CUGBP1 media un desplazamiento más fuerte del ARN, mientras que la adición de ARN no marcado impide la formación del complejo (Fig. 3c). Los ensayos de desplazamiento también se llevaron a cabo con dos elementos ricos en GU situados en la 3'UTR de mPGES-1 (Fig. 3a). La formación de complejos específicos sólo se observa con GRE1 y GRE2, pero no con mGRE (Fig. 3d). Las señales se eliminaron por medio de la adición de cantidades excesivas de sondas de ARN no marcadas (Fig. 3e). Estos experimentos demuestran que CUGBP1 se une específicamente tanto al miARN maduro como a la 3 'UTR de mPGES-1.

Ejemplo 6: El empalme 3'UTR de mPGES-1 está regulado por CUGBP1

La unión directa de CUGBP1 a los elementos ricos en GU indica que CUGBP1 está involucrado en el control de la expresión de mPGES-1. El análisis bioinformático de la secuencia 3'UTR de la mPGES-1 sugirió un intrón putativo con sitios de empalme GT-TG no canónicos que se encuentran dentro de los dos elementos GRE. El análisis de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) en células A549, células HeLa y fibroblastos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide verificó la existencia de la variante 3'UTR empalmada en los tres tipos celulares (isoforma 3'UTR de mPGES-1, Fig. 4a). El análisis de la secuencia reveló que la isoforma 3'UTR de mPGES-1 se generó por medio del empalme de la parte central de la 3'UTR que estaba flanqueada por los dos GRE (Fig. 4b).

Para desentrañar si CUGBP1 influye en el empalme 3'UTR a través de la unión a los dos elementos GRE, se clonó el mPGES-1 3'UTR al marco de lectura abierta del gen de la luciferasa de luciérnaga (Fig. 4c). La actividad de la luciferasa se midió en células HeLa con y sin CUGBP1 oe (8,5 veces más). El análisis de RT-PCR mostró que la supresión de GRE1, GRE2 o ambos impide completamente el empalme 3'UTR (Fig. 4d) mientras que la sobreexpresión de CUGBP1 aumenta el proceso de empalme (Fig. 4d). A fin de analizar la función de los dos GREs, se llevó a cabo un ensayo con un gen reportero que reveló una ligera pero significativa reducción de la actividad de la luciferasa en respuesta a CUGBP1 oe cuando ambos GREs están presentes pero no cuando uno o ambos GREs estaban mutados (Fig. 4c).

Además, se determinó la estabilidad de ambas formas de ARNm. Las células A549 se trataron con actinomicina D, un inhibidor transcripcional. Se extrajo el ARN en diferentes momentos y se analizaron las respectivas isotermas por medio de qRT-PCR en los puntos temporales indicados. Como se observa en la Figura 4e, la estabilidad del ARNm de la isoforma mPGES-1 3'UTR es significativamente menor que la forma canónica.

Ejemplo 7: CUGBP1 regula la síntesis de PGE2 a través de la expresión de mPGES-1

Para investigar el efecto de CUGBP1 en la expresión de mPGES-1 y la formación de PGE², se eliminó la expresión de CUGBP1 por medio de siRNA (ACUGBP1) en las células A549 (datos no mostrados). Para evaluar la regulación de mPGES-1 dependiente de CUGBP1, se trataron las células A549 con IL-1p durante 24 hs para inducir la expresión de mPGES-1, seguido por un cultivo adicional de 24 hs en medio sin estímulos. Reveló que la estimulación de la IL-1p conduce a un aumento tanto de la isoforma 3'UTR como de la forma canoncial (Fig. 5a,b). ACUGBP1 aumenta aún más la expresión de la isoforma 3'UTR de mPGES-1 (Fig. 5a) y también regula significativamente la expresión del ARNm de mPGES-1 (Fig. 5b), aunque en menor medida que la isoforma mPGES-1. La expresión de la proteína mPGES-1 fue fuertemente regulada en respuesta a ACUGBP1, incluso después de cambiar al medio libre de estímulos (Fig. 5c). Los datos demuestran que CUGBP1 inhibe la expresión de mPGES1 en condiciones inflamatorias.

A continuación, se investigó si estos cambios en la expresión de mPGES-1 conducen a una biosíntesis alterada de PGE². En las células A549 que expresan la CUGBP1 endógena, expuestas durante 24 hs a la IL-1p, los niveles de PGE² aumentaron significativamente por la simulación con IL-1p durante 24 hs y volvieron a los niveles de referencia cuando se retiró el estímulo (Fig. 5d). Cabe destacar que la formación de PGE² depende de la actividad de la COX-2 y de la mPGES-1. Los niveles reducidos de PGE² detectados en el medio de las células A549 tras la eliminación del estímulo inflamatorio se deben obviamente a la regulación a la baja de la COX-2 tanto a nivel de ARNm como de proteínas (Fig. 5e,f), mientras que los niveles de mPGES1 se mantuvieron constantes (Fig. 5c).

En las células A549 ACUGBP1, la formación de PGE² fue significativamente regulada por -50 veces en presencia de IL-1p (Fig. 5d). El nivel de COX-2 no se vio influenciado por el ACUGBP1 (Fig. 5 e,f). Los resultados muestran que CUGBP1 influye en la producción de PGE² en las células A549 regulando la expresión de mPGES-1 (Fig. 5c), pero no de COX-2.

Ejemplo 8: CUGBP1 actúa como represor de la traducción de mPGES-1

Además de su acción en el control del splicing, se ha demostrado que CUGBP1 también actúa como represor de la traducción. A fin de investigar si CUGBP1 regula la expresión de mPGES-1 afectando a la traducción de la proteína, se llevaron a cabo experimentos de sobreexpresión de CUGBP1 en células A549. Se encontró una significativa regulación a la baja de los niveles de proteína mPGES-1 en respuesta a CUGBP1 oe, pero ninguna alteración a nivel de ARNm (datos no mostrados). Estos datos indican claramente que CUGBP1 reprime la traducción de mPGES-1.

Recientemente, se demostró que la represión traslacional del ARNm de ocludina se debía a la colocalización de CUGBP1 y del ARNm marcado en los cuerpos de procesamiento (cuerpos P). Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que CUGBP1 podría reprimir la traducción de mPGES-1 por medio del reclutamiento del ARNm de mPGES-1 a los cuerpos P.

En primer lugar, se investigó la distribución por medio de tinción de inmunofluorescencia y se encontró una amplia colocalización de CUGBP1 y DCPla (decapping ARNm 1A), un componente clave de los cuerpos P. Además, se ha demostrado que la eliminación del componente del cuerpo P GW182 (Trinucleotide Repeat Containing 6A) puede interrumpir la formación del cuerpo P. Por lo tanto, se agotaron las GW182 (AGW182) para determinar si la formación de cuerpos P está relacionada con la represión traslacional de la proteína mPGES-1. El ARNm maduro de mPGES-1 no se vio afectado por el AGW182, mientras que la expresión de la proteína mPGES-1 se vio significativamente aumentada en las células A549. Estos datos indican un papel de CUGBP1 como represor traslacional de mPGES-1 en combinación con la formación de cuerpos P.

Ejemplo 9: El equilibrio entre miR-574-5p y CUGBP1 regula la expresión de mPGES-1

Se analizó cómo se regula la actividad de CUGBP1. Dado que el nivel de expresión, la localización y el estado de fosforilación de CUGBP1 no se vieron afectados por la estimulación de IL-1p, se planteó la hipótesis de que una regulación al alza de miR-574-5p antagoniza la función de CUGBP1 en la biosíntesis de mPGES1.

Dado que se halló que CUGBP1 se une a miR-574-5p (Fig. 4B,C), se planteó la hipótesis de que la fuerte regulación al alza de los niveles de miR-574-5p en el cáncer (Fig. 1A) y tras el tratamiento con IL-1p de las células A549 (datos no mostrados) quizá sea responsable de la regulación al alza de la expresión de mPGES-1 al contrarrestar la acción represiva de CUGBP1 sobre la biosíntesis de mPGES1.

Por lo tanto, se sobreexpresó miR-574-5p en las células A549 mediante el uso de imitadores de miARN (miR-574-5p oe). miR-574-5p oe dio lugar a un aumento de la expresión de la isoforma 3'UTR de mPGES-1, mientras que el ARNm de mPGES-1 canónico no se vio afectado significativamente (Fig. 6a). Se observó una regulación al alza del nivel de proteína mPGES-1 en respuesta a miR-574-5p oe (Fig. 6b). Estos resultados fueron comparables a los obtenidos por ACUGBP1 (Fig. 5c).

A continuación, se agotaron los niveles de expresión de miR-574-5p (AmiR-574-5p) mediante el uso de LNAs™ específicos para miR-574-5p. La expresión de ARNm de mPGES-1 no se vio afectada por AmiR-574-5p, mientras que la isoforma 3'UTR de mPGES-1 se redujo significativamente en respuesta a AmiR-574-5p (Fig. 6c). El nivel de proteína mPGES-1 se redujo con el AmiR-574-5p, aunque la reducción no alcanzó significación estadística (p=0,066, prueba t).

Ejemplo 10: Los cambios en CUGBP1 y miR-574-5p causan efectos opuestos en la proliferación de las células A549

Se llevó a cabo un ensayo de MTT para dilucidar el papel de miR-574-5p y CUGBP1 en la proliferación celular. En este ensayo, la proliferación celular inducida por IL1p en las células A549 se vio potenciada por la depleción de miR-574-5p o de CUGBP1, mientras que se redujo por la depleción de miR-574-5p o de CUGBP1 oe (datos no mostrados). Estos resultados apoyan la hipótesis de que la sobreexpresión de miR-574-5p se traduce en una mayor proliferación al contrarrestar la acción de CUGBP1.

Ejemplo 11: Procedimientos generales

Líneas celulares y condiciones de cultivo celular

La línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano A549 (ATCC Manassas, VA, EE.UU.) y la línea celular de cáncer cervical HeLa (DMSZ) se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.) con 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS, Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.), 100 U/ml de penicilina 100 pg/ml de estreptomicina y 1 mM de piruvato sódico (PAA the Cell Culture Company, Colbe, GER). Los fibroblastos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide se cultivaron como se ha descrito anteriormente. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético Institucional (Solna, Estocolmo, Suecia número ético 2009/1262-31/3) y cumple con todas las normas éticas y el consentimiento de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El cultivo celular se llevó a cabo en una atmósfera humidificada de 5% de CO² a 37 °C. Las células A549 se estimularon con 5 ng/ml de IL-1p (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) durante 24 hs.

Tejido tumoral de pulmón

Se recolectó tejido pulmonar no tumoral y tumoral de 4 pacientes diferentes de CPNM (tres adenocarcinomas y un carcinoma de células escamosas). Estos tejidos pulmonares de donantes eran tejidos pulmonares no trasplantados de donantes de trasplantes. El protocolo de estudio para la donación de tejidos fue aprobado por el comité de ética (“Ethik Kommission am Fachbereich Humanmedizin der Justus Liebig Universitat Giessen”) de1Hospital Universitario de Giessen (Giessen, Alemania) de acuerdo con la legislación nacional y con las directrices de la “Good Clinical Practice/International Conference on Harmonisation”. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente o de su familiar más cercano (AZ 31/93). En otro experimento, se recolectaron muestras de tejido pulmonar no tumoral y tumoral de 11 pacientes diferentes de CPNM (diez adenocarcinomas y un carcinoma de células escamosas). Estos tejidos pulmonares de donantes eran tejidos pulmonares no trasplantados de donantes de trasplantes. El protocolo de estudio para la donación de tejidos fue aprobado por el comité de ética (“Ethik Kommission am Fachbereich Humanmedizin der Justus Liebig Universitat Giessen”) del Hospital Universitario de Giessen (Giessen, Alemania) de acuerdo con la legislación nacional y con las directrices de la “Good Clinical Practice/International Conference on Harmonisation”. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente o de su familiar más cercano (AZ 31/93).

Interferencia de ARN

CUGBP1 y GW182 se agotaron transitoriamente mediante el uso de oligonucleótidos de ARNsi. 24 hs antes de la transfección, se sembraron células A549 a una densidad de 5*105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Se transfectaron 20 pmol/pl de oligonucleótidos de ARNsi mediante el uso de Lipofectamine 2000® (Invitrogen, Karlsruhe, GER) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el knockdown de GW182 se utilizó el siRNA MISSION® SASI_Hs01_00244664 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), respectivamente. Para el knockdown de CUGBP1 se utilizó un siRNA previamente publicado (5'-GCUGUUUAUUGGUAUGAUU-3'; SEC. ID Núm.: 5) para nuestros experimentos. Como control, se utilizó un siRNA con una secuencia inespecífica (5'-UCUCACAACGg Ca UUU-3'; SEC. ID Núm.: 6). Las células se cosecharon 24 hs y 48 hs después de la transfección. La eficiencia del knockdown de CUGBP1 y GW182 se determinó por medio de qRT-PCR, Western blot y tinción de inmunofluorescencia.

Sobreexpresión de CUGBP1

24 hs antes de la transfección, se sembraron células A549 a una densidad de 4*104 por pocillo en una placa de 24 pocillos. Se transfectaron 500 ng/pocillo del plásmido pCUGBP1 o del plásmido de control pCMV-MS (amablemente proporcionado por Julia Weigand y Katrin Kemmerer, de la Universidad Técnica de Darmstadt) mediante el uso de Lipofectamine 2000® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Del mismo modo, las células HeLa se transfectaron con 300 ng/pocillo de pCUGBPI de pCMV-MS. La eficacia de la sobreexpresión se analizó por medio de Western blot.

Transfección de un imitador o inhibidor de miR-574-5p

24 hs antes de la transfección, se sembraron células A549 a una densidad de 5*105 por pocillo en una placa de 6 pocillos. Se transfectaron 20 pmol/jl de miRIDIAN miR-574-5p mimics (HMI0794, Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) o de control negativo (HMC0002, Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) mediante el uso de Lipofectamine 2000® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Del mismo modo, las células A549 se transfectaron con 40 pmol/jl de inhibidor de miR-574-5p-LNA™ (4101451-001) o con un control negativo (199006-001, Exiqon, Kopenhagen, DEN) para el derribo de miR-574-5p. La eficacia de la transfección se determinó por medio de qRT-PCR.

Sobreexpresión estable de miR-574-5p en la línea celular de cáncer de pulmón A549

Las partículas lentivirales Mission® lenti miR-574-5p (HLMIR0794, Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) o Mission® lenti control (NCLMIR002, Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) se utilizaron para generar una línea celular A549 que sobreexpresa de forma estable miR-574-5p (A549 miR-574-5p-5p oe) y la línea celular de control (A549 control). 24 hs antes de la transducción, se sembraron células A549 a una densidad de 1*105 por pocillo en una placa de 6 pocillos. Las partículas lentivirales se descongelaron rápidamente y se añadieron a las células A549 a una MOI de 0,83 para su espinoculación (875 g, 32 °C durante 60 min). Las células transducidas se cultivaron durante 1 día antes de añadir 1,5 |jg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) durante 4 días para seleccionar los clones transducidos. La eficacia de la transducción se verificó por medio de qRT-PCR.

Extracción de ARN y RT-PCR

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, GER) y se trató con Turbo DNasa (Ambion, ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó 1 jg de ARN tratado con DNasa para la transcripción inversa mediante el uso del kit de conversión de ARN en ADN de alta capacidad (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de primera cadena se utilizó finalmente como plantilla para la reacción de PCR. Los cebadores mPGES-1 3'UTR_F y mPGES-1 3'UTR_R (Tabla 1) se utilizaron para la amplificación específica de mPGES-1 3'UTR. La RT-PCR se llevó a cabo mediante el uso de 2,5 U de Taq polimerasa (New England Biolabs, Ipswish, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la adición de 50 jM de betaína (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER). El número de ciclos se minimizó a fin de mantener la reacción de RT-PCR en la fase exponencial y evitar los efectos de saturación. Una décima parte de cada muestra de RT-PCR se analizó por electroforesis en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Se utilizó el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) para la extracción en gel de los productos de la RT-PCR. Se utilizó el kit PCR CloningPLUS (Qiagen, Hilden, GER) para clonar los fragmentos aislados de la RT-PCR. A continuación se secuenciaron los plásmidos seleccionados.

Transcripción inversa cuantitativa PCR (qRT-PCR)

Se utilizó 1 |jg de ARN tratado con DNasa para la transcripción inversa mediante el uso del kit de ARN a ADN de alta capacidad (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR) se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus™ de Applied Biosystems (Applied Biosystem, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.) mediante el uso de la mezcla maestra de p Cr Fast s Yb R Green (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.). Se utilizó 1 j l de ADNc (diluido 1:2) por reacción. La p-actina se utilizó como control endógeno para normalizar las variaciones en las cantidades de ADNc en las diferentes muestras. Las secuencias de los pares de cebadores figuran en la Tabla 1.

La cuantificación de miR-574-5p basada en la qRT-PCR se llevó a cabo mediante el uso del sistema miScript (Qiagen, Hilden, GER), se utilizó 1 jg de ARN digerido con DNasa para la transcripción inversa. La qRT-PCR de miR-574-5p se llevó a cabo mediante el uso del cebador específico de miR-574-5p (MS00043617, Qiagen, Hilden, GER). La expresión de miR-574-5p de las muestras de tejido de CPNM se normalizó con respecto al control de transcripción inversa de miARN mediante el uso de un cebador miRTC (MS00000001, Qiagen, Hilden, Alemania), dado que snRNA U6, hsa-miR-16 y SNORD72 no eran controles válidos y porque están regulados en el cáncer de pulmón37. Los valores de miR-574-5p se normalizaron con respecto a la expresión del control miRTC. La qRT-PCR se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las inducciones de pliegues se calcularon mediante el uso de los valores de 2(-AACt).

Construcciones de plásmidos

El ADNc de mPGES-1 3'UTR se amplificó a partir de células A549 con los cebadores NotI-mPGES-1 3'UTR_F y HindIII-mPGES-1 3'UTR_R (Tab. S1) y se clonó en el plásmido pDL Dual Luciferase38 a través de los sitios de restricción Notl e HindlII, lo que dio lugar al plásmido mPGES-1 3'UTR. Las supresiones de los dos elementos ricos en GU (elementos GRE) se generaron por medio de PCR de mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del plásmido mPGES-1 3'UTR como plantilla. Para la mutación del primer elemento rico en GU, se utilizaron AGRE1_F y AGRE1_R, lo que dio lugar al plásmido AGRE1_mPGES-1 3'UTR. La mutación del segundo elemento rico en GU se generó mediante el uso de Ag RE2_F y AGRE2_R, lo que dio lugar a AGRE2_mPGES-1 3'UTR. Todas las secuencias de los cebadores figuran en la Tabla 1. Los plásmidos se comprobaron por medio de la secuenciación del ADN.

Ensayo del gen reportero de la luciferasa

24 hs antes de la transfección, se sembraron 4*104 células de HeLa por pocillo en placas de 24 pocillos. Se utilizaron 100 ng/pocillo de las construcciones mPGES-1 3'UTR y 300 ng/pocillo de pCUGBP1 y pCMV-MS como control para la transfección con Lipofectamine 2000® (Invitrogen, Karlsruhe, GER) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 hs, se analizó la actividad de la luciferasa en las células mediante el uso del sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo™ Stop and Glow (Promega, Madison, EE.UU.) con un lector TECAN infinite M200. La actividad de la luciferasa Renilla se utilizó para normalizar la actividad de la luciferasa a la eficacia de la transfección.

Western blotting

Para obtener un lisado de células enteras, las células A549 se lisaron en el reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER™ (Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) durante 30 minutos a 4 °C. Para la separación de la fracción nuclear y citosólica, las células se lisaron en un tampón de extracción citosólica que contenía 10 mM de HEPES pH 7,9 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 1,5 mM de MgCh (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 10 mM de KCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), inhibidor de la proteasa sin EDTA (Roche, Basel, CHE) en hielo durante 5 min. Las muestras se centrifugaron durante 3 minutos (6.500 rpm). El sobrenadante era la fracción citosólica. El gránulo se resuspendió en un tampón de extracción nuclear que contenía 20 mM de HEPES, pH 7,9, 1,5 mM de MgCh, 0,42 M de NaCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), 0,2 mM de EDTA (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), 25% de glicerol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) y un inhibidor de la proteasa sin EDTA (Roche, Basilea, Suiza) durante 15 minutos a -80 °C. Las muestras se congelaron y descongelaron tres veces a 37 °C. Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a 13.300 rpm. El sobrenadante era la fracción nuclear. El contenido de proteínas se determinó por medio del ensayo de Bradford (BioRad Laboratories, Hercules, USA). El análisis de Western blot se llevó a cabo como se ha descrito previamente. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios que reconocen mPGES-1 (Cayman-Chemical, Ann Arbor, EE.UU. y 40), GAPDH (2118, Cell signaling, Cambrige, UK), CUGBP1 (ab9549, Abcam, Cambrige, UK), CUGBP1 fosforilada (15903, Abnova, Heidelberg, GER), Lamin a/c (4777S, Cell signaling, Cambrige, UK) y COX-2 (sc-1745, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). En los experimentos con las líneas celulares A549 miR-574-5p oe y A549 de control, las células se lisaron y el análisis de mPGES1, COX-2 y GAPDH se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.

Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética

Los extractos citoplásmicos se prepararon por medio de la lisis de las células durante 10 minutos en hielo en un tampón que contenía 0,2% de Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 40 mM de KCl (Sigma-Aldrich, St. Louis/USA), 10 mM de HEPES (pH 7,9) (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 3 mM de MgCh (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 1 mM de DTT (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 5% de glicerol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) e inhibidor de la proteasa (Roche, Basel, CHE). Los núcleos se eliminaron por centrifugación a 13.300 rpm durante 2 minutos y los extractos citoplasmáticos se congelaron inmediatamente en hielo seco y se almacenaron a -80 °C. La concentración de proteínas de los extractos se determinó por medio del ensayo de Bradford. El ARN de GRE1 y GRE2 se transcribió in vitro. Se anillaron cebadores específicos (Tabla 1) para GRE1 (GRE1_Fy GRE1_R) y GRE2 (GRE2_F y GRE2_R) y se clonaron en el plásmido de alto número de copias pHDV. De este modo, la ribozima del VHD se añadió al extremo 3' de GRE1 y GRE2 para dar extremos 3' homogéneos tras la transcripción in vitro. Los ARN se marcaron con [y32P] ATP (6,000 Ci/mmol, Hartmann, Braunschweig, Alemania) mediante el uso de la polinucleótido quinasa T4 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Los ARN de miR-574-5p y mGREI fueron sintetizados comercialmente por Sigma-Aldrich. Los ensayos EMSA se llevaron a cabo por medio de la incubación de extractos citoplasmáticos con la sonda de ARN marcada con 32P en un tampón que contenía 0,2% de Nonidet P-40, 40 mM de KCl, 10 mM de HEPES (pH 7,9), 3 mM de MgCh, 1 mM de DTT, y 5% de glicerol y 5 mg/ml de sulfato de heparina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER). Cada reacción contenía de 10 a 70 |jg de proteína citoplasmática y 10 fmol de sonda de ARN radiomarcada en un volumen total de 15 j l durante 20 min. Cada muestra se mezcló con 3 j l de tampón de carga nativo 5x (50%, v/v, glicerol, 0,2% de azul de bromofenol, 0,5x de tampón de TRIS-Borato EDTA, Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER). Las muestras se separaron por electroforesis en condiciones de no desnaturalización en geles de poliacrilamida al 6% (PAA). Los geles se analizaron en un fosforímetro Typhoon (Amersham Biosciences, Friburgo, Alemania).

Ensayo de proliferación celular MTT

Para la detección de células viables, se llevó a cabo un ensayo de reducción de tetrazolio MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Carl Roth, Karlsruhe, GER). 24 hs antes de la transfección, se sembraron células A549 a una densidad de 1*104 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Para el ensayo de reducción del MTT, se añadieron 20 j l de 5 mg/ml de MTT (en PBS) a las células en cultivo y se incubaron durante 4 hs. Se eliminó el medio y se añadieron 100 j l de DMSO (Carl Roth, Karlsruhe, GER). La cantidad de formazán se midió por medio del registro de los cambios en la absorbancia a 570 nm por medio de un espectrofotómetro de lectura en placa. Como referencia se utilizó la longitud de onda de 630 nm para corregir el fondo inespecífico.

Tinción de inmunofluorescencia

Las células A549 (5*105) se sembraron en cubreobjetos (18 * 18 cm, Carl Roth, Karlsruhe, GER) en placas de 6 pocillos y se fijaron mediante el uso de paraformaldehído frío al 4% (PFA, Carl Roth, Karlsruhe, GER) durante 15 minutos, luego se lavaron dos veces con PBS, seguido por una permeabilización de 5 minutos con Triton X-100 al 0,5% (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER). Las células se bloquearon con BSA al 2% en PBS (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER). Los anticuerpos primarios DCPla 1:1000 (ab70522, Abcam, Cambrige, Reino Unido), GW182 1:100 (ab66009, Abcam, Cambrige, Reino Unido) y CUGBP1 1:500 (ab9549, Abcam, Cambrige, Reino Unido) se diluyeron en tampón de bloqueo y se incubaron con las células fijadas durante la noche a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón (Alexa Fluor® 594, abl50116), respectivamente IgG de cabra anti-conejo (Alexa Fluor® 488, ab150077) de Abcam durante 2 hs a temperatura ambiente. Las células se tiñeron con dihidrocloruro de 4',6-diamidina-2'-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER). Las imágenes se procesaron con una magnitud de 20x mediante el uso del microscopio Axio Observer (Zeiss, Jena, GER) con el software de procesamiento de imágenes LSM 510 Meta (Zeiss, Jena, GER).

Determinación de prostanoides en sobrenadantes de cultivos celulares

Los prostanoides de los sobrenadantes de los cultivos celulares se extrajeron de los sobrenadantes de los cultivos celulares por extracción en fase sólida y se analizaron por LC-MS/MS dirigida mediante el uso de estándares internos deuterados como se describió previamente.

En los experimentos llevados a cabo con las líneas celulares A549 miR-574-5p oe y A549 de control, se recolectó el medio condicionado de las células cultivadas y se centrifugó a 10.000 g durante 2 minutos para descartar los restos celulares. El nivel de PGE² y PGF²a de los sobrenadantes se determinó por radioinmunoanálisis y se normalizó con respecto a la concentración total de proteínas.

Experimentos con ratones

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (CEE) de 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y el Comité Ético Nacional. El estudio fue aprobado por el Ministerio de Salud italiano (MSP), autorización n. 190/2017-PR. Los ratones CD-1® Nude se obtuvieron de Charles River (Milán, ITA). Los animales se alojaron en jaulas de hasta cinco ratones cada una y se aclimataron durante una semana en condiciones de temperatura controlada (20 ± 2 °C), humedad (55 ± 10%) e iluminación (7:00 a.m. a 7:00 p.m.) antes de iniciar los experimentos. Los animales se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos, con comida y agua ad libitum, y el estado de salud de los animales se controló diariamente. Se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados. Para todos los experimentos se utilizaron hembras de la misma edad (de 6 a 8 semanas). Las células de control A549 o las células A549 miR-574-5p-5p oe fueron cultivadas en condiciones estándar como se ha descrito anteriormente, cosechadas por medio de tripsina y resuspendidas en PBS (5*107/ml). Se inyectaron 100 j l de suspensión celular (con 5*106 células) por vía subcutánea en ambos flancos dorsales de los ratones para establecer un modelo de ratones portadores de tumores (Fig. 2A). El inhibidor de mPGES-1 (CIII, 28575, proporcionado por Novasaid, Stockolm, Suecia) se disolvió en el vehículo que contenía un 1% de Tween 80 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) y un 0,5% de carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) en una solución de NaCl al 0,9%.

Los ratones recibieron células A549 de control (n=11) o células A549 miR-574-5p-5p oe (n=12) y se trataron con vehículo, todos los días, una vez al día por inyección i.p. desde la implantación de las células tumorales hasta el sacrificio (día 28, es decir, durante 4 semanas) (Fig. 2A). Los ratones tratados con CIII recibieron células A549 de control (n=11) o células A549 miR-574-5p-5p oe (n=11) y el compuesto CIII (50 mg/kg) se administró una vez al día por inyección i.p. desde la implantación de las células tumorales hasta el sacrificio. El crecimiento del tumor se controló tres veces por semana desde la implantación de las células tumorales hasta el sacrificio, por medio de la medición de su diámetro con un calibrador digital. El volumen tumoral (TV) se calculó por medio de TV(cm3) = longitud[D(cm)]*anchura [d(cm)2]*0,44. Se controló el peso corporal tres veces por semana hasta el sacrificio y se evaluó el peso del tumor (gr) de los tumores disecados en el momento del sacrificio. Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas desde la implantación de las células tumorales, 30 minutos después de la administración de la última dosis de fármaco. En el día 28, los animales se sacrificaron y los tumores y los pulmones se recolectaron e incrustaron en Tissue-Tek O.C.T. (Sakura, San Marcos, EE.UU.), enfriada en isopentano y congelada en nitrógeno líquido para la histología. Se tiñeron con hematoxilina y eosina secciones criostáticas de 7 mm de espesor de muestras de tejido tumoral y se utilizaron secciones adyacentes para la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-Ki67 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-VEGF (Bioss, SIAL srl, Roma, ITA) o CD40 (Santa Cruz, DBA, Milán, ITA). Las secciones de criostato se fijaron primero en acetona helada y se incubaron durante 10 minutos en H²O² al 3%, se lavaron (3x5 min) en TBS y se incubaron en albúmina de suero bovino (BSA, Sigma Aldrich, Milán, ITA) al 3%. Las secciones se expusieron a 37 °C durante 1 hora a una solución diluida de CD40 (1:30), Ki67 (1:50) y VEGF (1:50) y luego se lavaron (3x5 min en TBS). La localización de los anticuerpos primarios se logró por medio de la aplicación posterior, durante 20 minutos, del anticuerpo antisecundario conjugado con biotina específico de la especie (un sistema de detección secundaria de estreptavidina (KIT Immunoperoxidase Secondary Detection System, Chemicon, Millipore, Milán ITA). Tras el lavado (3x5 min en TBS), las secciones se incubaron durante 15 min en HRP conjugada con estreptavidina. Tras esta incubación, las secciones se expusieron al tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina (DAB, Sigma Aldrich, Milán, ITA) durante 10 minutos para producir un producto de reacción marrón. A continuación, las secciones se tiñeron con hematoxilina y se montaron en Aquatex (Merck, Milán, ITA). Las imágenes se analizaron con la Nikon Eclypse T200 con un aumento de 60x. En todos los animales, se recolectaron muestras de orina de 24 hs en la línea de base, antes de la implantación de las células, y en el día 27, antes del sacrificio para la evaluación de los niveles de metabolitos urinarios prostanoides.

Evaluación de los niveles urinarios de PGE-M, PGD-M, PGI-M y TX-M.

Se aplicó un procedimiento LC/MS que permite la cuantificación simultánea del tetranor PGE-M y del tetranor PGD-M, así como del 2,3-dinor-6-keto-PGF1a (PG-IM) y del 2,3-dinor-TXB2 (TX-M). Las muestras de orina (alícuota de 0,2 ml) se complementaron con tetranor PGEM-d6 (a una concentración final de 2 ng/0,2 ml) (Cayman Chemical, Ann Arbor, EE.UU.), tetranor PGDM-d6 (2 ng/0,2 ml) (Cayman Chemical, Ann Arbor, EE.UU.), 2,3-dinor-6-ceto-PGF1a-d9 (sal sódica) (1 ng/0,2 ml) (Cayman Chemical, Ann Arbor, EE.UU.), 2,3-dinor-TXB2-d9 (2 ng/0,2 ml) (Cayman Chemical, Ann Arbor, EE.UU.) como estándares internos, y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, se añadió ácido fórmico (5 pl). Tras 15 minutos de incubación, se añadió metoxiamina-HCl (1 g/ml, 0,1 ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.) para generar oximas de O-metilo de cada grupo cetónico. Tras 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras de orina se diluyeron a 1 ml con agua, se ajustaron a pH 3 con HCl y se extrajeron con fase inversa polimérica Number Strata * 33u (30 mg/ml) (Phenomenex, Torrance, EE.UU.) que había sido preacondicionada con 1 ml de acetonitrilo y 1 ml de agua. La columna de fase inversa polimérica Number Strata * 33u se lavó con 1 ml de agua (5% de acetonitrilo) y luego se eluyó con 1 ml de acetato de etilo. El eluido se evaporó y el residuo seco se resuspendió en 50 pl de fase móvil (10% de acetonitrilo en agua), y se inyectaron 40 pl en el sistema LC-MS/MS y se analizaron.

Estadísticas

Los resultados se presentan como media SEM de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se llevó a cabo por medio de la prueba t de Student emparejada o no emparejada (de dos colas), respectivamente, para los experimentos de curso temporal con ANOVA de dos vías (postest de Bonferroni) mediante el uso de GraphPad Prism 5.0. Las diferencias se consideraron significativas para p<0,05 (indicado como * para p<0,05, ** para p<0,01 y ***para p<0,001). Los experimentos con ratones se analizaron por medio de análisis ANOVA y pruebas de comparación múltiple de Newman-Keuls (§p<0,05, *p<0,01, **p<0,001).

Inmunoprecipitación de ARN

Se sembraron 3*106 células A549 en dos placas de 10 cm y se cultivaron durante la noche, antes de la estimulación con 5 ng/ml de IL-1p durante 24 hs. A continuación, se lavaron las células con 5 ml de PBS frío y se cosecharon con un raspador de células en 5 ml de PBS con inhibidor de la proteasa sin EDTA (Roche, Basilea, CHE). Las células se agruparon, se centrifugaron durante 5 minutos y a 400 * g a 4 °C y se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis que contenía 10 mM de Tris-HCl (Carl Roth, Karlsruhe, GER), pH 7,5, 10 mM de KCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 15 mM MgCl², 0,5 mM de DTT (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 0,9% Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 20 |jl de inhibidor de ribonucleas y de inhibidor de proteasas sin EDTA (Roche, Basel, CHE). La suspensión se incubó 10 minutos en hielo y luego se sonicó 4 veces durante 10 segundos con una amplitud del 30%, con 20 segundos de pausa. Después, las muestras se centrifugaron con 10.000 * g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se tomó un 10% como muestra de entrada.

Las perlas de sefarosa GammaBind Plus (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) se bloquearon con tampón de bloqueo que contenía 0,2 mg/ml de BSA en PBS (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) y 0,1 mg/ml de ARNt de levadura durante 90 minutos a 4 °C. Antes de su utilización, las perlas se lavaron 3 veces con tampón de lisis y se centrifugaron a 300 * g durante 5 minutos. Las microesferas y los anticuerpos se unieron por medio de la mezcla de 50 j l de suspensión de microesferas con 10 jg de anticuerpo CUGBP1 (05-621 clon3B1, Merck, Darmstadt, GER) o de anticuerpo IgG normal de ratón (12-371, Merck, Darmstadt, GER) seguido por la incubación durante 30 a 60 min a 4 °C. A continuación, se llevó a cabo la inmunoprecipitación por medio de la división del lisado en partes iguales con la mezcla de CUGBP1-/IgG-perlas y se incubó durante 2 hs a 4 °C. Después, las muestras se lavaron con cada tampón de lavado B1-B3 (composición véase más abajo) durante 5 min en la cámara fría, con etapas de centrifugación de 5 min y 300 * g entre ellos. Los tampones de lavado contenían: Tampón B1 - 20mM de Tris-HCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) pH 7,5, 150 mM de NaCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 2 mM de EDTA (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 0,1% de SDS (Carl Roth, Karlsruhe, GER), 1% de Triton (Carl Roth, Karlsruhe, GE) e inhibidor de la proteasa sin EDTA (Roche, Basel, CHE). Tampón B2 - 20 mM de Tris-HCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) pH 7,5, ^{500 mM de NaCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt,} gEr), ^{2 mM de EDTA (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 0,1% de SDS} (Carl Roth, Karlsruhe, GER), 1% de Triton (Carl Roth, Karlsruhe, GE) e inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche, Basel, CHE). Tampón B3 - 10 mM de Tris-HCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER) pH 7,5, 250 mM de LiCl (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 1 mM de EDTA (Sigma-Aldrich, Darmstadt, GER), 1% de desoxicolato de sodio (Sigma-Aldrich, ^{Darmstadt, GER), 1% de Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Darmstadt,} gEr), ^{e inhibidor de la proteasa sin EDTA (Roche,} Basel, CHE). Tras la última etapa de lavado, se tomó un 10% de cada precipitado para el análisis de Western blot para validar la inmunoprecipitación. Los precipitados restantes se resuspendieron en 500 j l de reactivo TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, GER) y se aisló el ARN como se ha descrito anteriormente. La posterior cuantificación de miR-574-5p o ARNm basada en la qRT-PCR se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Cebadores para mPGES-1 CDS (mPGES-1-cds_F: GAAGAAGGCCTTTGCCAAC; mPGES-1-cds_R: CCAGGAAAAGGAAGGGGTAG), COX-2 (COX-2_F: CCGGGTACAATCGCACTTAT; COX-2_R: GGCGCTCAGCCATACAG); miR-574-5p (MS00043617, Qiagen), Hilden, GER o miR-16 (MS00031493, Qiagen, Hilden, GER ) fueron utilizados.

Ejemplo 12: CUGBP1 se une a los GRE en el mPGES-1 3'UTR y a miR-574-5p

A fin de confirmar aún más la unión del ARNm de mPGES1 así como de miR-574-5p a CUGBP1, se llevaron a cabo ensayos de inmunoprecipitación de ARN (RIP) con un anticuerpo dirigido contra CUGBP1 (Fig. 7 a,b). De este modo, los ARN coprecipitados unidos a CUGBP1 se pueden cuantificar por medio de qRT-PCR. La validación de la inmunoprecipitación de CUGBP1 por medio de Western Blot reveló que el 16,6% ± 7,7 (SEM) del total de CUGBP1 se recuperó en los precipitados inmunes (Fig. 7c). En la Fig. Xc se muestra un blot representativo de cuatro experimentos independientes. Se halló que tanto miR-574-5p como mPGES-1 ARNm están altamente enriquecidos en el CUGBP1-RIP (Fig. 7a y 7b, respectivamente). No se observó ningún enriquecimiento para el ARNm de la COX-2 o el miR-16, que sirvieron de controles negativos, respectivamente. Esto confirma aún más la interacción específica de CUGBP1 con miR-574-5p y mPGES-1 ARNm. Se llevaron a cabo ensayos de inmunoprecipitación de ARN (RIP) para confirmar la interacción entre mPGES-1 3'UTR y miR-574-5p.

Ejemplo 13: La expresión de mPGES-1 y CUGBP1 determina la tasa de supervivencia en el CPNM

Se analizó la expresión de mPGES-1 y CUGBP1 en correlación con la supervivencia global de los pacientes con cáncer de pulmón, mediante el uso de la herramienta de meta-análisis “Kaplan-Meier Plotter” (http://kmplot.com/analysis/; versión 2015). El análisis de la supervivencia global se llevó a cabo a partir de los datos del array de genes de 1926 pacientes con cáncer de pulmón. El conjunto óptimo de sondas de microarray se seleccionó para representar las mejores sondas específicas que reconocieran mPGES-1 y CUGBP1. Las muestras se dividieron en dos grupos (alta y baja expresión) mediante el uso del valor medio de expresión génica y se compararon por medio del gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier. Los gráficos de Kaplan-Meier muestran que los pacientes con cáncer de pulmón con un alto nivel de expresión de mPGES-1 y una baja expresión de CUGBP1 se asocian a una menor tasa de supervivencia (Fig. 8a,b).

Bibliografía citada

Pai, R., et al. Prnstaglandin E2 transactivates EGF receptor: a novel mechanism forpromoting colon cáncer growth and gastrointestinal hypertrophy. Nat. Med. 8, 289 a 293 (2002).

Jakobsson, P.J., Thoren, S., Morgenstern, R. & Samuelsson, B. Identification of human prostaglandin E synthase: a microsomal, glutathione-dependent, inducible enzyme, constituting a potential novel drug target. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7220 a 7225 (1999).

Patrignani, P. & Patrono, C. Cyclooxygenase inhibitors: From pharmacology to clinical readouts. Biochim. Biophys.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para identificar a un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E que comprende las etapas de:

a) determinar en una muestra de ensayo del sujeto la cantidad de microARN-574-5p;

b) comparar la cantidad determinada con una referencia; y

c) identificar a un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E como susceptible de recibir una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E en base a dicha comparación.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha referencia procede de un sujeto o grupo de sujetos que padecen un tumor dependiente de la prostaglandina E que se sabe que es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que una cantidad esencialmente idéntica o aumentada de microARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E y en el que una cantidad disminuida de microARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha referencia se deriva de (i) una muestra de tejido no tumoral o de (ii) un sujeto o un grupo de sujetos que padecen un tumor dependiente de prostaglandina E que se sabe que no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E o (iii) un sujeto o grupo de sujetos sanos.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que una cantidad esencialmente idéntica o disminuida de microARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto no es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E y en el que una cantidad aumentada de microARN-574-5p en la muestra de ensayo es indicativa de que un sujeto es susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra es una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en: sangre completa, suero, plasma, orina y linfa.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, carcinoma de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cánceres de cabeza y cuello, carcinoma papilar de tiroides, gliomas de bajo y alto riesgo, neuroblastoma, meduloblastoma, carcinoma de cuello uterino, tumores cerebrales y cáncer de estómago.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho sujeto es un mamífero y, preferentemente, un ser humano.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho inhibidor de la formación de prostaglandina E es un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y/o un inhibidor de la prostaglandina E-sintasa-1 microsomal (inhibidor de mPGES1).

11. El procedimiento reivindicativo 10, en el que dicho AINE se selecciona del grupo que consiste en: inhibidores selectivos de la COX-2, preferentemente, parecoxib, etoricoxib o celecoxib, inhibidores selectivos de la COX1, preferentemente, Aspirina en dosis bajas, e inhibidores no selectivos de la COX1/2, preferentemente, naproxeno, ibuprofeno o diclofenaco.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho inhibidor de mPGES1 se selecciona del grupo que consiste en: Derivados del MK-886, fenantreno o benzo imidazoles, biarilimidazoles, derivados del ácido piriníxico, ácido 2-mercaptohexanoico, derivados de la licofelona, benzo(g)indol-3-carboxilato, oxicams, ureas trisustituidas y benzamidas de carbazol.

13. Uso del microARN-574-5p o de un agente de detección que se une específicamente al mismo en una muestra de un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E para identificar al sujeto como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E.

14. Un dispositivo adaptado para llevar a cabo el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende

a) una unidad de análisis que comprende un agente de detección que se une específicamente al microARN-574-5p adaptado para determinar la cantidad de dicho microARN-574-5p en una muestra de un sujeto que padece un tumor dependiente de la prostaglandina E; y

b) una unidad de evaluación para comparar la cantidad determinada con una referencia que permita identificar al sujeto como susceptible de recibir una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E, dicha unidad comprende una base de datos con referencias como las definidas en la reivindicación 2 o 4 y un algoritmo implementado por ordenador para llevar a cabo la comparación.

15. Un inhibidor de la formación de prostaglandina E para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de prostaglandina E en un sujeto, en el que dicho sujeto presenta cantidades aumentadas de miARN-574-5p (i) en el tejido tumoral en comparación con el tejido no tumoral o (ii) en un fluido corporal del sujeto en comparación con una referencia de un sujeto sano o un grupo de sujetos sanos o un sujeto que se sabe que no padece un tumor dependiente de prostaglandina E o un grupo de dichos sujetos, preferentemente, en el que dicho sujeto fue identificado como susceptible a una terapia con un inhibidor de la formación de prostaglandina E por el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.