ES2909902A1

ES2909902A1 - Beta-galactosidase and uses of the same (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2909902A1
Application number: ES202031111A
Authority: ES
Inventors: De Antonio Maria Eugenia Castro; Siso Maria Isabel Gonzalez; Belmonte Maria Esther Rodriguez; Fernandez Manuel Becerra; Villanueva Maria Esperanza Cerdan
Original assignee: Universidade da Coruna
Current assignee: Universidade da Coruna
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: ES2909902B2

Abstract

Beta-galactosidase and use of it. The invention provides an enzyme that has beta-galactosidase activity, this enzyme comprising a selected sequence of between (a) a sequence of amino acids with a sequence identity of at least 85% with the sec sequence ID ID no: 1; and (b) an amino acid sequence coded by a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 85% with the sec sequence ID no: 2. The present invention also provides recombinant nucleotide sequences and expression constructions coding of the enzyme of the invention, as well as transformed cells. The enzyme of the invention is capable of hydrolyzing lactose, reducing its content in dairy products, as well as producing galactooligosaccharides (gos), under conditions of low and high temperature. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Beta-galactosidasa y usos de la mismaBeta-galactosidase and uses thereof

La presente invención está relacionada con los campos de la enzimología y la industria agroalimentaria. En particular, la presente invención se refiere a una nueva enzima pgalactosidasa y a su uso en la hidrólisis de lactosa, así como en la producción de galactooligosacáridos (GOS) a partir de lactosa. Las propiedades únicas de la enzima de la invención la hace especialmente útil para llevar a cabo la producción de GOS tanto en condiciones de pasteurización como a baja temperatura, lo cual supone una ventaja industrial importante respecto a otras enzimas.The present invention is related to the fields of enzymology and the food industry. In particular, the present invention relates to a new p-galactosidase enzyme and its use in the hydrolysis of lactose, as well as in the production of galactooligosaccharides (GOS) from lactose. The unique properties of the enzyme of the invention make it especially useful for carrying out the production of GOS both under pasteurization conditions and at low temperature, which represents an important industrial advantage over other enzymes.

ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE ART

La p-galactosidasa (EC 3.2.1.23), también llamada lactasa, tiene como función primaria la hidrólisis de la lactosa en D-galactosa y D-glucosa. Por ello, la aplicación fundamental de las p-galactosidasas se circunscribe al ámbito de los productos y subproductos lácteos. Además, esta enzima posee actividad transgalactosilasa y se utiliza para la síntesis de galactosil-oligosacáridos, compuestos con un interés creciente en el área agroalimentaria y farmacéutica.p-galactosidase (EC 3.2.1.23), also called lactase, has as its primary function the hydrolysis of lactose into D-galactose and D-glucose. For this reason, the fundamental application of p-galactosidases is limited to the field of dairy products and by-products. In addition, this enzyme has transgalactosylase activity and is used for the synthesis of galactosyl-oligosaccharides, compounds of growing interest in the agri-food and pharmaceutical areas.

Como alternativa no enzimática a la hidrólisis con p-galactosidasas se puede utilizar la hidrólisis química, pero produce efectos no deseables (p. ej.: pérdida de nutrientes, defectos organolépticos, etc.)As a non-enzymatic alternative to hydrolysis with p-galactosidases, chemical hydrolysis can be used, but it produces undesirable effects (eg loss of nutrients, organoleptic defects, etc.)

Las p-galactosidasas se emplean en la industria agroalimentaria para reducir el contenido en lactosa de productos lácteos y derivados, lo que tiene un interés muy variado.The p-galactosidases are used in the agri-food industry to reduce the lactose content of dairy products and derivatives, which has a very varied interest.

Industrialmente, dos tipos de p-galactosidasas son de creciente importancia en los procesos: las termoestables y las resistentes al frío. El empleo de enzimas termoestables a altas temperaturas está relacionado a la disminución de la viscosidad del sustrato y a la reducción de la posibilidad de contaminación microbiana. Las enzimas activas en el frío posibilitan su aplicación en el tratamiento de la leche y de los productos lácteos bajo condiciones que permiten preservar el sabor y las características nutricionales de esos alimentos. Industrially, two types of p-galactosidases are of growing importance in processes: thermostable and cold-resistant. The use of thermostable enzymes at high temperatures is related to the decrease in the viscosity of the substrate and the reduction of the possibility of microbial contamination. Cold-active enzymes enable their application in the treatment of milk and dairy products under conditions that allow the flavor and nutritional characteristics of these foods to be preserved.

La producción de derivados lácteos con niveles reducidos de lactosa se atribuye a tres principales ventajas: (a) la obtención de productos para los grupos de población con intolerancia a la lactosa; (b) formación de los galatooligosacáridos (GOS), que favorecen el crecimiento de la microflora intestinal; y (c) mejora en las características tecnológicas de los productos lácteos.The production of dairy products with reduced levels of lactose is attributed to three main advantages: (a) obtaining products for population groups with lactose intolerance; (b) formation of galatooligosaccharides (GOS), which favor the growth of the intestinal microflora; and (c) improvement in the technological characteristics of dairy products.

La hidrólisis de la lactosa con la p-galactosidasa tiene su mayor foco en el desarrollo de leche y derivados lácteos que estén exentos o con contenidos reducidos de ese azúcar, posibilitando su consumo por individuos intolerantes a la lactosa.The hydrolysis of lactose with p-galactosidase has its main focus on the development of milk and milk derivatives that are free or with reduced content of this sugar, allowing their consumption by lactose intolerant individuals.

Por otro lado, la alta concentración de la lactosa en productos lácteos no fermentados, como por ejemplo en helado y leche condensada, puede llevar a la cristalización excesiva de la lactosa, resultando en productos con textura arenosa o áspera. De esta forma, la hidrólisis mejora la capacidad de absorción y cremosidad, y estos productos se tornan más digeribles.On the other hand, the high concentration of lactose in unfermented dairy products, such as ice cream and condensed milk, can lead to excessive crystallization of lactose, resulting in products with a gritty or rough texture. In this way, hydrolysis improves the absorption capacity and creaminess, and these products become more digestible.

Otra perspectiva de la utilización de esta enzima es la producción de galactooligosacáridos, carbohidratos considerados prebióticos y que presentan propiedades tecnológicas y nutricionales reconocidas. Entre las ventajas asociadas a la síntesis de estos carbohidratos a partir de la lactosa está la reducción en el contenido calórico del alimento, la reducción de la intolerancia a la lactosa y otros tres importantes efectos provenientes de la sinergia entre los GOS y los probióticos, es decir, en la modulación del sistema inmune, el tránsito intestinal y el estímulo a la asimilación de nutrientes.Another perspective of the use of this enzyme is the production of galactooligosaccharides, carbohydrates considered prebiotics and that have recognized technological and nutritional properties. Among the advantages associated with the synthesis of these carbohydrates from lactose is the reduction in the caloric content of the food, the reduction of lactose intolerance and three other important effects from the synergy between GOS and probiotics, namely that is, in the modulation of the immune system, intestinal transit and the stimulation of the assimilation of nutrients.

A pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha, existe todavía la necesidad de enzimas p-galactosidasas termoestables con una actividad mejorada.Despite efforts to date, there is still a need for thermostable p-galactosidase enzymes with improved activity.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓNEXPLANATION OF THE INVENTION

Los presentes inventores han encontrado una nueva enzima beta-galactosidasa (BWpgl) que muestra ser estable y eficiente en la producción de GOS a temperaturas elevadas, compatibles con los tratamientos de esterilización de productos lácteos, disminuyendo significativamente el riesgo de contaminación por crecimiento microbiano adventicio. The present inventors have found a new enzyme beta-galactosidase (BWpgl) that shows to be stable and efficient in the production of GOS at high temperatures, compatible with the sterilization treatments of dairy products, significantly reducing the risk of contamination by adventitious microbial growth.

Los datos proporcionados más abajo también muestran que la enzima de la invención tiene una alta afinidad por su sustrato natural, la lactosa. Y, por otro lado, que la enzima de la invención es altamente eficiente en la producción de GOS, produciendo cantidades significativas de galactooligosacáridos en un corto periodo de tiempo. Además, es versátil en cuanto a la naturaleza del sustrato, ya que partiendo de lactosa o leche se alcanzan rendimientos altos.The data provided below also shows that the enzyme of the invention has a high affinity for its natural substrate, lactose. And, on the other hand, that the enzyme of the invention is highly efficient in the production of GOS, producing significant amounts of galactooligosaccharides in a short period of time. In addition, it is versatile in terms of the nature of the substrate, since high yields are achieved starting from lactose or milk.

Por lo que la enzima de la invención ejerce un doble papel: hidroliza la lactosa y, a la vez, sintetiza GOS. Ambas actividades, además, a bajas y altas temperaturas.Therefore, the enzyme of the invention plays a double role: it hydrolyzes lactose and, at the same time, synthesizes GOS. Both activities, moreover, at low and high temperatures.

La buena capacidad catalítica de la beta-galactosidasa de la invención, por lo tanto, tiene un impacto sorprendente en las propiedades finales del producto ya que la enzima es capaz de degradar la lactosa, que puede tener un efecto perjudicial, e incorporar GOS, con un efecto beneficioso, al producto. Por lo tanto, la enzima de la invención permite obtener productos con propiedades beneficiosas para la salud.The good catalytic capacity of the beta-galactosidase of the invention, therefore, has a surprising impact on the final properties of the product since the enzyme is capable of degrading lactose, which can have a detrimental effect, and incorporate GOS, with a beneficial effect, to the product. Therefore, the enzyme of the invention makes it possible to obtain products with beneficial properties for health.

En relación con lo anterior, es remarcable que esa doble función es exhibida por la enzima en las mismas condiciones de temperatura y pH, es decir que en una sola etapa de incubación de la enzima con el sustrato, se consigue la reducción en el contenido de lactosa y la producción de GOS.In relation to the above, it is remarkable that this double function is exhibited by the enzyme in the same conditions of temperature and pH, that is to say that in a single stage of incubation of the enzyme with the substrate, the reduction in the content of lactose and GOS production.

Sorprendentemente, las condiciones de temperatura y pH óptimas hacen que la enzima de la invención se pueda usar en un proceso de pasteurización. Tal y como se muestra más abajo, los investigadores llevaron a cabo la pasteurización de un producto lácteo en presencia de la enzima de la invención y de dos enzimas comerciales: únicamente en el caso de la enzima de la invención, se consiguió simultáneamente una producción notable de GOS y una reducción significativa de la lactosa.Surprisingly, the optimal temperature and pH conditions mean that the enzyme of the invention can be used in a pasteurization process. As shown below, the researchers carried out the pasteurization of a dairy product in the presence of the enzyme of the invention and two commercial enzymes: only in the case of the enzyme of the invention, a remarkable production was simultaneously achieved. of GOS and a significant reduction of lactose.

Lo anterior supone una mejora sustancial en el sector agroalimentario, en particular de productos lácteos, ya que la enzima de la invención permite llevar a cabo en una única etapa a condiciones de temperatura, tiempo y pH: la hidrólisis de lactosa, la producción de GOS y la destrucción de microorganismos. The foregoing represents a substantial improvement in the agri-food sector, in particular dairy products, since the enzyme of the invention allows carrying out in a single stage at conditions of temperature, time and pH: the hydrolysis of lactose, the production of GOS and the destruction of microorganisms.

Sorprendentemente, los inventores han encontrado, además, que esta enzima es altamente activa a temperaturas bajas, entre 3 y 10°C. Ventajosamente, trabajando a estas temperaturas se previene el crecimiento de microorganismos.Surprisingly, the inventors have further found that this enzyme is highly active at low temperatures, between 3 and 10°C. Advantageously, working at these temperatures prevents the growth of microorganisms.

Es la primera vez que se reporta una enzima beta-galactosidasa con semejante perfil de actividad en condiciones de temperatura tan diferentes, haciendo de esta enzima una herramienta altamente versátil.It is the first time that a beta-galactosidase enzyme with such an activity profile under such different temperature conditions has been reported, making this enzyme a highly versatile tool.

La versatilidad, así como la alta eficacia en síntesis de GOS e hidrólisis de lactosa hacen de la enzima de la invención una herramienta muy atractiva en el sector agroalimentario, en particular de los productos lácteos.The versatility, as well as the high efficiency in GOS synthesis and lactose hydrolysis make the enzyme of the invention a very attractive tool in the agri-food sector, in particular dairy products.

Así, en un primer aspecto la presente invención proporciona una enzima que tiene actividad p-galactosidasa, dicha enzima comprendiendo una secuencia seleccionada de entre (a) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos un 85% con la secuencia SEC ID NO: 1; y (b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con la secuencia SEC ID NO: 2.Thus, in a first aspect, the present invention provides an enzyme having p-galactosidase activity, said enzyme comprising a sequence selected from (a) an amino acid sequence with a sequence identity of at least 85% with the sequence SEQ ID NO: 1; and (b) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to the sequence SEQ ID NO: 2.

En una realización, la enzima tiene una identidad de secuencia aminoacídica de al menos un 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o es 100% con la secuencia SEC ID NO: 1. En una realización, la enzima tiene una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEC ID NO: 1.In one embodiment, the enzyme has at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 amino acid sequence identity or is 100% with the sequence SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the enzyme has 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1.

En una realización, la enzima tiene una identidad de secuencia nucleotídica de al menos un 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o es 100% con la secuencia SEC ID NO: 2. En una realización, la enzima tiene una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEC ID NO: 2.In one embodiment, the enzyme has a nucleotide sequence identity of at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or is 100% with the sequence SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the enzyme has 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2.

En la presente invención, el término "identidad” se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias se alinean óptimamente. Si, en el alineamiento óptimo, una posición en una primera secuencia está ocupada por el mismo residuo que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las secuencias presentan identidad con respecto a esa posición. El nivel de identidad entre dos secuencias (o "porcentaje de identidad de secuencia”) se mide como una relación del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias con respecto al tamaño de las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = (número de posiciones idénticas / número total de posiciones) x 100).In the present invention, the term "identity" refers to the percentage of residues that are identical in the two sequences when the sequences are optimally aligned. If, in the optimal alignment, a position in a first sequence is occupied by the same residue as corresponding position in the second sequence, the sequences exhibit identity with respect to that position.The level of identity between two sequences (or "percent sequence identity") is measured as a ratio of the number of identical positions shared by the sequences with regarding the size of the sequences (ie, percent sequence identity = (number of identical positions / total number of positions) x 100).

Se conocen varios algoritmos matemáticos para obtener rápidamente el alineamiento óptimo y calcular la identidad entre dos o más secuencias y se incorporan en varios programas de software disponibles. Ejemplos de dichos programas incluyen los programas MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA y ROBUST, entre otros, para el análisis de secuencias. Los programas de análisis de software preferidos incluyen los programas ALIGN, CLUSTAL W y BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ y versiones posteriores de los mismos).Various mathematical algorithms for quickly obtaining the optimal alignment and calculating the identity between two or more sequences are known and incorporated into various available software programs. Examples of such programs include the MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA, and ROBUST programs, among others, for sequence analysis. Preferred software analysis programs include the ALIGN, CLUSTAL W, and BLAST programs (eg, BLAST 2.1, BL2SEQ, and later versions thereof).

Para el análisis de secuencias de aminoácidos, se usan matrices de pesos, tales como las matrices BLOSUM (por ejemplo, las matrices BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62 y BLOSUM80), matrices Gonnet o matrices PAM (por ejemplo, las matrices PAM30, PAM70, PAM120, PAM160, PAM250 y PAM350), con el fin de determinar la identidad.For amino acid sequence analysis, weight matrices are used, such as BLOSUM matrices (for example, BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62, and BLOSUM80 matrices), Gonnet matrices, or PAM matrices (for example, PAM30, PAM70, PAM120 matrices). , PAM160, PAM250 and PAM350), in order to determine the identity.

Los programas BLAST proporcionan el análisis de al menos dos secuencias de aminoácidos, ya sea alineando una secuencia seleccionada contra múltiples secuencias en una base de datos (por ejemplo, GenSeq), o, con BL2SEQ, entre dos secuencias seleccionadas. Los programas BLAST se modifican preferentemente con programas de filtrado de baja complejidad tales como los programas DUST o SEG, que preferentemente se integran en las operaciones del programa BLAST. Si se usan costes por existencia de huecos (o puntuaciones por hueco), el coste por existencia de huecos se establece preferentemente entre aproximadamente -5 y -15. Se pueden usar parámetros por hueco similares con otros programas según convenga. Los programas BLAST y los principios que los subyacen se describen adicionalmente en, por ejemplo, Altschul et al., "Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403-410.BLAST programs provide analysis of at least two amino acid sequences, either by aligning a selected sequence against multiple sequences in a database (eg, GenSeq), or, with BL2SEQ, between two selected sequences. BLAST programs are preferably modified with low complexity filter programs such as DUST or SEG programs, which are preferably integrated into the operations of the BLAST program. If gap costs (or gap scores) are used, the gap cost is preferably set between about -5 and -15. Similar per-gap parameters can be used with other programs as appropriate. BLAST programs and the principles underlying them are further described in, for example, Altschul et al., "Basic local alignment search tool", 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410.

Para el análisis de múltiples secuencias, se puede usar el programa CLUSTAL W. El programa CLUSTAL W se ejecuta deseablemente usando parámetros "dinámicos” (frente a "rápidos”). Las secuencias de aminoácidos se evalúan usando un conjunto variable de matrices BLOSUM dependiendo del nivel de identidad entre las secuencias. El programa CLUSTAL W y los principios de operación subyacentes se describen adicionalmente en, por ejemplo, Higgins et al., "CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8(2), páginas 189-191. For analysis of multiple sequences, the CLUSTAL W program can be used. The CLUSTAL W program is desirably run using "dynamic" (vs. "fast") parameters. Amino acid sequences are evaluated using a variable set of BLOSUM arrays depending on the level of identity between sequences. The CLUSTAL W program and underlying operating principles are further described in, for example, Higgins et al., "CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment", 1992, CABIOS, 8(2), pages 189-191.

En una realización del primer aspecto de la invención, la enzima tiene actividad en un rango de pH entre 6 y 9, y en un rango de temperatura entre 3 y 10°C y/o entre 60 y 89°C. En otra realización del primer aspecto de la invención, la enzima tiene actividad a un pH entre 6.5 y 8 y un rango de temperatura entre 4 y 9°C y/o entre 75 y 85°C.In an embodiment of the first aspect of the invention, the enzyme has activity in a pH range between 6 and 9, and in a temperature range between 3 and 10°C and/or between 60 and 89°C. In another embodiment of the first aspect of the invention, the enzyme is active at a pH between 6.5 and 8 and a temperature range between 4 and 9°C and/or between 75 and 85°C.

Para los fines de la presente invención, cualquier intervalo dado incluye los valores de los extremos inferior y superior del intervalo.For purposes of the present invention, any given range includes the values of the lower and upper ends of the range.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia nucleotídica recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la enzima de la invención, unida operativamente a un promotor de expresión.In a second aspect, the present invention provides a recombinant nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence encoding the enzyme of the invention, operatively linked to an expression promoter.

En una realización, la secuencia nucleotídica recombinante comprende una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia que tiene una identidad de al menos un 85% con la secuencia SEC ID NO: 2. En otra realización del segundo aspecto de la invención la secuencia nucleotídica codifica para una secuencia que tiene una identidad de al menos un 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o es 100% con la secuencia SEC ID NO: 2. En otra realización del segundo aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica la enzima se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 2.In one embodiment, the recombinant nucleotide sequence comprises a nucleotide sequence that encodes a sequence that has an identity of at least 85% with the sequence SEQ ID NO: 2. In another embodiment of the second aspect of the invention, the nucleotide sequence encodes for a sequence having an identity of at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or is 100% with the sequence SEQ ID NO: 2 In another embodiment of the second aspect of the invention, the nucleotide sequence that encodes the enzyme corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2.

Ejemplos ilustrativos y no limitativos de promotores de expresión son los promotores de: LTR, SV40, lac o trp de E. coli, PL del fago lambda y otros conocidos por controlar la expresión de genes en células eucariotas, procariotas o virus.Illustrative and non-limiting examples of expression promoters are the promoters of: LTR, SV40, lac or trp of E. coli, PL of phage lambda and others known to control the expression of genes in eukaryotic or prokaryotic cells or viruses.

En un tercer aspecto la presente invención proporciona una construcción de expresión que comprende la secuencia nucleotídica recombinante del segundo aspecto de la invención.In a third aspect the present invention provides an expression construct comprising the recombinant nucleotide sequence of the second aspect of the invention.

Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido, en el que se inserta la secuencia de la enzima en una orientación directa o inversa. En una realización del tercer aspecto, la construcción génica es un vector de expresión.Constructs comprise a vector, such as a plasmid, into which the enzyme sequence is inserted in a forward or reverse orientation. In an embodiment of the third aspect, the gene construct is an expression vector.

Ejemplos ilustrativos y no limitativos de vectores comerciales son: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174, pBluescript II KS; pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eukaryotic: pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).Illustrative and non-limiting examples of commercial vectors are: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174, pBluescript II KS; pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagen); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eukaryotic: pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).

Los vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.Vectors include chromosomal, non-chromosomal, and synthetic DNA sequences, eg, derivatives of SV40; bacterial plasmids; phage DNA; baculoviruses; yeast plasmids; vectors derived from combinations of plasmids and phage DNA, viral DNA such as vaccinia, adenovirus, fowlpox virus and pseudorabies. However, any other vector can be used as long as it is replicable and viable in the host.

El vector de expresión también proporciona un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.The expression vector also provides a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator. The vector may also include appropriate sequences to amplify expression.

Además, los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli. In addition, expression vectors may contain one or more selectable marker genes to provide a phenotypic trait for selection of transformed host cells such as dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, or such as tetracycline or ampicillin resistance in E. .coli

La inserción del gen de la presente invención en un vector, la inserción del gen marcador de selección (si es necesario) y la inserción de un promotor (si es necesario), y similares, pueden llevarse a cabo mediante una tecnología de ADN de recombinación estándar.Insertion of the gene of the present invention into a vector, insertion of the selectable marker gene (if necessary) and insertion of a promoter (if necessary), and the like can be carried out by recombinant DNA technology standard.

En un cuarto aspecto la presente invención proporciona una célula hospedadora recombinante transformada con el ácido nucleico recombinante del segundo aspecto de la invención o la construcción del tercer aspecto de la invención.In a fourth aspect the present invention provides a recombinant host cell transformed with the recombinant nucleic acid of the second aspect of the invention or the construct of the third aspect of the invention.

Ejemplos ilustrativos y no limitativos de células hospedadoras adecuadas son: células bacterianas, como Escheríchia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; fúngicas como la levadura; células de insecto como la Dmsophila S2 y Spodoptera Sf9; de animal tal como CHO, COS o de melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales, etc. la selección de un hospedador adecuado forma parte del conocimiento del experto en la materia. Illustrative and non-limiting examples of suitable host cells are: bacterial cells, such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; fungal like yeast; insect cells such as Dmsophila S2 and Spodoptera Sf9; animal such as CHO, COS or Bowes melanoma; adenoviruses; plant cells etc the selection of a suitable host is part of the knowledge of those skilled in the art.

La célula hospedadora transformada se puede obtener por transfección o transformación, usando el vector de la presente invención mencionado anteriormente. La transfección y transformación se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante un método de coprecipitación de fosfato cálcico, electroporación, lipofección, microinyección, un método de Hanahan, un método de acetato de litio, método de protoplasto - polietilenglicol, y similares.The transformed host cell can be obtained by transfection or transformation, using the aforementioned vector of the present invention. The transfection and transformation can be carried out, for example, by a calcium phosphate coprecipitation method, electroporation, lipofection, microinjection, a Hanahan method, a lithium acetate method, a protoplast-polyethylene glycol method, and the like.

Otro aspecto de la invención es proporcionar un método para producir una pgalactosidasa. En una realización del método de producción de la invención, la pgalactosidasa se produce utilizando el transformante mencionado anteriormente. En el método de producción de esta realización, el transformante se cultiva en condiciones tales que se produzca la enzima codificada.Another aspect of the invention is to provide a method of producing a p-galactosidase. In one embodiment of the production method of the invention, p-galactosidase is produced using the aforementioned transformant. In the production method of this embodiment, the transformant is cultivated under such conditions that the encoded enzyme is produced.

Los métodos de cultivo y las condiciones de cultivo no están particularmente limitadas siempre que se pueda producir la proteína p-galactosidasa deseada. Es decir, los métodos y las condiciones de cultivo adecuadas para cultivar los microorganismos que se van a utilizar pueden ajustarse de forma apropiada a las condiciones en las que se produce la p-galactosidasa. Se puede emplear cultivo líquido o cultivo sólido como método de cultivo, en particular cultivo líquido.Culture methods and culture conditions are not particularly limited as long as the desired p-galactosidase protein can be produced. That is, suitable culturing methods and conditions for culturing microorganisms to be used can be appropriately adjusted to the conditions under which p-galactosidase is produced. Liquid culture or solid culture can be used as the culture method, particularly liquid culture.

Como medio, se puede utilizar cualquier medio en el que puedan crecer los transformantes que se van a utilizar. Por ejemplo, un medio suplementado con una fuente de carbono como glucosa, sacarosa, gentiobiosa, almidón soluble, glicerina, dextrina, melaza y ácido orgánico; y además, una fuente de nitrógeno tal como sulfato de amonio, carbonato de amonio, fosfato de amonio, acetato de amonio o peptona, extracto de levadura, licor de maceración de maíz, hidrolizado de caseína, salvado y extracto de carne; y además, se puede usar una sal inorgánica tal como sal de potasio, sal de magnesio, sal de sodio, sal de fosfato, sal de manganeso, sal de hierro y sal de zinc, y similares. Con el fin de promover el crecimiento de los transformantes que se van a usar, se puede añadir al medio vitaminas, aminoácidos y similares. El medio se cultiva en condiciones aeróbicas de manera que el pH del medio se ajuste, por ejemplo, a aproximadamente 3 a 10 (preferiblemente aproximadamente 7 a 8), y la temperatura de cultivo es generalmente aproximadamente 10 ° C a 50 ° C (preferiblemente aproximadamente 20 ° C a 37 ° C) durante 1 a 7 días (preferiblemente 3 a 4 días). Un ejemplo del método de cultivo puede incluir un método de cultivo por agitación y un método de cultivo aeróbico sumergido. Una vez se transforman las células con la construcción génica, estas se cultivan hasta alcanzar una densidad deseada y se induce, mediante métodos rutinarios, la activación del promotor de expresión.As the medium, any medium in which the transformants to be used can grow can be used. For example, a medium supplemented with a carbon source such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, and organic acid; and in addition, a nitrogen source such as ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate or peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, bran and meat extract; and further, an inorganic salt such as potassium salt, magnesium salt, sodium salt, phosphate salt, manganese salt, iron salt and zinc salt, and the like can be used. In order to promote the growth of the transformants to be used, vitamins, amino acids and the like may be added to the medium. The medium is cultured under aerobic conditions such that the pH of the medium is adjusted to, for example, about 3 to 10 (preferably about 7 to 8), and the culture temperature is generally about 10°C to 50°C (preferably about 20°C to 37°C) for 1 to 7 days (preferably 3 to 4 days). An example of the culture method may include a shake culture method and an aerobic submerged culture method. Once the cells are transformed with the gene construct, these are grown to a desired density and activation of the expression promoter is induced by routine methods.

Las células transformadas se pueden recoger por centrifugación, romper por medios químicos o físicos, y el crudo resultante someterse a purificación.The transformed cells can be collected by centrifugation, disrupted by chemical or physical means, and the resulting crude subjected to purification.

La enzima se puede recuperar y purificar de los medios de cultivo de células recombinantes mediante métodos que incluyen la precipitación por sulfato de amonio o etanol, la separación por cromatografía y la ultrafiltración. Se pueden incorporar también etapas de plegamiento para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la purificación se puede llevar a cabo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).The enzyme can be recovered and purified from recombinant cell culture media by methods including ammonium sulfate or ethanol precipitation, chromatographic separation, and ultrafiltration. Folding steps can also be incorporated to complete the configuration of the mature protein. Finally, purification can be carried out by high performance liquid chromatography (HPLC).

La p-galactosidasa de la presente invención se proporciona en forma de, por ejemplo, una preparación enzimática. La preparación enzimática puede contener, además de un ingrediente activo (p-galactosidasa de la presente invención), excipiente, agentes tampón, agentes de suspensión, estabilizador, conservantes, antisépticos, solución salina fisiológica y similares. Los ejemplos del excipiente pueden incluir lactosa, sorbitol, D-manitol, sacarosa y similares. Los ejemplos del agente tampón pueden incluir fosfato, citrato, acetato y similares. Los ejemplos del estabilizador pueden incluir propilenglicol y ácido ascórbico y similares. Los ejemplos del conservante pueden incluir fenol, cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, clorobutanol, metil parabeno y similares.The p-galactosidase of the present invention is provided in the form of, for example, an enzyme preparation. The enzyme preparation may contain, in addition to an active ingredient (p-galactosidase of the present invention), an excipient, buffering agents, suspending agents, stabilizer, preservatives, antiseptics, physiological saline and the like. Examples of the excipient may include lactose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, and the like. Examples of the buffering agent may include phosphate, citrate, acetate and the like. Examples of the stabilizer may include propylene glycol and ascorbic acid and the like. Examples of the preservative may include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraben, and the like.

Alternativamente, la enzima se puede inmovilizar sobre un material en fase sólida adecuado tal como un material de intercambio iónico, tal como DEAE-celulosa o material similar, para proporcionar productos de composición enzimática inmovilizada.Alternatively, the enzyme may be immobilized on a suitable solid phase material such as an ion exchange material, such as DEAE-cellulose or similar material, to provide immobilized enzyme composition products.

Alternativamente, la enzima, opcionalmente en combinación con excipiente, agentes tampón, agentes de suspensión, estabilizador, conservantes, antisépticos, solución salina fisiológica y similares, se puede congelar o liofilizar. Ventajosamente, gracias al perfil de termoestabilidad mostrado por la enzima de la invención, el material resultante puede almacenarse o transportarse al laboratorio o entorno en el que se vaya a llevar a cabo posteriormente la reacción. El material liofilizado proporciona una forma más conveniente de almacenamiento y transporte, ya que no se requiere refrigeración. Alternatively, the enzyme, optionally in combination with excipient, buffering agents, suspending agents, stabilizer, preservatives, antiseptics, physiological saline and the like, can be frozen or lyophilized. Advantageously, thanks to the thermostability profile shown by the enzyme of the invention, the resulting material can be stored or transported to the laboratory or environment in which the reaction will subsequently be carried out. Lyophilized material provides a more convenient form of storage and transportation since refrigeration is not required.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un producto lácteo que comprende la enzima según se ha definido en el primer aspecto, la secuencia nucleotídica recombinante según el segundo aspecto, la construcción de expresión según el tercer aspecto o la célula hospedadora recombinante según el cuarto aspecto. En una realización, el producto lácteo comprende la enzima inactivada. Esta realización se corresponderá al producto final, una vez llevado a cabo el proceso de hidrólisis de lactosa/producción de GOS y se ha llevado a cabo la inactivación de la enzima mediante cualquiera de los protocolos rutinarios.In a fifth aspect, the present invention provides a dairy product comprising the enzyme as defined in the first aspect, the recombinant nucleotide sequence according to the second aspect, the expression construct according to the third aspect or the recombinant host cell according to the fourth aspect. appearance. In one embodiment, the dairy product comprises the inactivated enzyme. This embodiment will correspond to the final product, once the lactose hydrolysis/GOS production process has been carried out and the inactivation of the enzyme has been carried out by means of any of the routine protocols.

En el contexto de la presente invención, el término "enzima inactivada" significa que la enzima se ha desnaturalizado, modificado o degradado y ha perdido su actividad betagalactosidasa.In the context of the present invention, the term "inactivated enzyme" means that the enzyme has been denatured, modified or degraded and has lost its beta-galactosidase activity.

De la caracterización que se incorpora más abajo, los GOS producidos por la enzima de la invención, de 3 y 4 unidades, se han reportado en el estado de la técnica por ejercer un papel beneficioso en la salud.From the characterization that is incorporated below, the GOS produced by the enzyme of the invention, of 3 and 4 units, have been reported in the state of the art to exert a beneficial role in health.

Por lo tanto, la enzima, secuencia recombinante, construcción de expresión o célula hospedadora descrita anteriormente puede usarse para producir una mezcla de galactooligosacáridos que puede formar parte de un producto para mejorar la salud intestinal. Dicho producto puede seleccionarse del grupo que consiste en productos lácteos (por ejemplo leche líquida, leche en polvo seca tal como la leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, leche desnatada enriquecida en grasa en polvo, suero de leche en polvo, leches infantiles, leche maternizada, helados, yogur, queso, productos de leche fermentada), bebidas tales como el zumo de fruta, los alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, alimentos para animales, alimentos para aves o por supuesto cualquier otro alimento o bebida. La presencia de galacto-oligosacáridos en dichos productos tiene la ventaja de incrementar el crecimiento de las Bifidobacterium promotoras de la salud en el producto o en la flora intestinal del consumidor después de la ingesta del producto o en ambos.Thus, the enzyme, recombinant sequence, expression construct, or host cell described above can be used to produce a galactooligosaccharide mixture that can form part of a product to improve intestinal health. Said product may be selected from the group consisting of dairy products (for example fluid milk, dry milk powder such as whole milk powder, skimmed milk powder, enriched fat skimmed milk powder, whey powder, infant milk infant formula, ice cream, yogurt, cheese, fermented milk products), beverages such as fruit juice, baby food, cereals, bread, biscuits, sweets, cakes, food supplements, dietary supplements, animal feed, birds or of course any other food or drink. The presence of galacto-oligosaccharides in such products has the advantage of increasing the growth of health promoting Bifidobacterium in the product or in the consumer's intestinal flora after ingestion of the product or both.

En un sexto aspecto, la invención proporciona el uso de la enzima, de la secuencia nucleotídica recombinante, de la construcción de expresión o de la célula hospedadora recombinante de la invención, para la producción de galactooligosacáridos a partir de lactosa. In a sixth aspect, the invention provides the use of the enzyme, the recombinant nucleotide sequence, the expression construct or the recombinant host cell of the invention, for the production of galactooligosaccharides from lactose.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de la enzima, de la secuencia nucleotídica recombinante, de la construcción de expresión o de la célula hospedadora recombinante de la invención, para incrementar la cantidad de GOS en un producto a base de lactosa.In another aspect, the invention provides the use of the enzyme, recombinant nucleotide sequence, expression construct or recombinant host cell of the invention to increase the amount of GOS in a lactose-based product.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de galactooligosacáridos que comprende la etapa de incubación de la enzima o célula hospedadora transformada según se definen más arriba con un producto a base de lactosa a un pH entre 6.5 y 8.0. En una realización, esta etapa de incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 55 y 89°C o entre 65 y 85°C o entre 70 y 75°C, y a un pH entre 6.5 y 8. El tiempo de la etapa de incubación será el necesario para alcanzar la cantidad de GOS deseada y dependerá, entre otros factores, de la naturaleza del sustrato. El experto en la materia puede parar la incubación en cualquier momento inactivando la enzima, por ejemplo subiendo la temperatura por encima de 90°C, por ejemplo entre 90-100°C.En otra realización, previamente y/o posteriormente a la etapa de incubación a alta temperatura, el procedimiento comprende el enfriamiento del medio de reacción (que incluye el producto a base de lactosa y la enzima) a una temperatura entre 3 y 10°C, en particular entre 5 y 9°C, en particular 8°C durante un periodo de tiempo de entre 10 y 48 horas, particularmente entre 15 y 30 horas, a un pH entre 6.5 y 8. Alternativamente, en otra realización, la etapa de incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 3 y 10°C, entre 5 y 9°C, o a 8°C.In a seventh aspect, the invention provides a process for the production of galactooligosaccharides comprising the step of incubating the transformed enzyme or host cell as defined above with a lactose-based product at a pH between 6.5 and 8.0. In one embodiment, this incubation step is carried out at a temperature between 55 and 89°C or between 65 and 85°C or between 70 and 75°C, and at a pH between 6.5 and 8. The time of the step of incubation will be the one necessary to reach the desired amount of GOS and will depend, among other factors, on the nature of the substrate. The person skilled in the art can stop the incubation at any time by inactivating the enzyme, for example by raising the temperature above 90°C, for example between 90-100°C. In another embodiment, before and/or after the stage of incubation at high temperature, the procedure comprises cooling the reaction medium (which includes the lactose-based product and the enzyme) to a temperature between 3 and 10°C, in particular between 5 and 9°C, in particular 8° C for a period of time between 10 and 48 hours, particularly between 15 and 30 hours, at a pH between 6.5 and 8. Alternatively, in another embodiment, the incubation step is carried out at a temperature between 3 and 10 °C, between 5 and 9°C, or at 8°C.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el contenido en galactooligosacáridos en un producto lácteo, que comprende la etapa de incubación de la enzima o célula hospedadora transformada según se definen más arriba con un producto a base de lactosa a un pH entre 6.5 y 8.0. En una realización, la incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 55 y 89°C o entre 65 y 85°C o entre 70 y 75°C, a un pH entre 6.5 y 8. El tiempo de la etapa de incubación será el necesario para alcanzar la cantidad de GOS deseada y dependerá, entre otros factores, de la naturaleza del sustrato. El experto en la materia puede parar la incubación en cualquier momento inactivando la enzima, por ejemplo subiendo la temperatura por encima de 90°C, por ejemplo entre 90-100°C. En otra realización, previamente y/o posteriormente a la etapa de incubación a alta temperatura, el procedimiento comprende el enfriamiento del medio de reacción (que incluye el producto a base de lactosa y la enzima) a una temperatura entre 3 y 10°C, en particular entre 5 y 9°C, en particular 8°C, a un pH entre 6.5 y 8, durante un periodo de tiempo de entre 10 y 48 horas, particularmente entre 15 y 30 horas. Alternativamente, en otra realización, la etapa de incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 3 y 10°C, entre 5 y 9°C, o a 8°C.In another aspect, the invention provides a process for increasing the content of galactooligosaccharides in a dairy product, comprising the step of incubating the transformed enzyme or host cell as defined above with a lactose-based product at a pH between 6.5 and 8.0. In one embodiment, the incubation is carried out at a temperature between 55 and 89°C or between 65 and 85°C or between 70 and 75°C, at a pH between 6.5 and 8. The time of the incubation step it will be necessary to reach the desired amount of GOS and will depend, among other factors, on the nature of the substrate. The person skilled in the art can stop the incubation at any time by inactivating the enzyme, for example by raising the temperature above 90°C, for example between 90-100°C. In another embodiment, before and/or after the high temperature incubation step, the procedure comprises cooling the reaction medium (which includes the lactose-based product and the enzyme) to a temperature between 3 and 10°C, in particular between 5 and 9°C, in particular 8°C, at a pH between 6.5 and 8, for a period of time between 10 and 48 hours, particularly between 15 and 30 hours. Alternatively, in another embodiment, the incubation step is carried out at a temperature between 3 and 10°C, between 5 and 9°C, or at 8°C.

En la presente invención, "producto a base de lactosa” tiene el mismo significado que "sustrato que contiene lactosa” y "producto lácteo” y se refiere a cualquier producto, natural o sintético, que incorpora en su composición lactosa o, alternativamente, consiste en lactosa. El producto a base de lactosa se puede seleccionar de entre lactosa comercial, leche entera, leche semidesnatada, leche desnatada, suero de leche, leche desnatada enriquecida en grasa y suero de leche filtrado. Estos productos lácteos pueden obtenerse de vacas, búfalas, ovejas, camellas, llamas o cabras. La leche desnatada enriquecida en grasa se define como la leche entera que ha sido desnatada para eliminar la grasa de la leche, la cual se reemplaza posteriormente añadiendo aceite o grasa vegetal.In the present invention, "lactose-based product" has the same meaning as "lactose-containing substrate" and "dairy product" and refers to any product, natural or synthetic, that incorporates lactose in its composition or, alternatively, consists of in lactose. The lactose-based product can be selected from commercial lactose, whole milk, semi-skimmed milk, skimmed milk, whey, fat-enriched skimmed milk and filtered whey. These dairy products can be obtained from cows, buffalo , sheep, camels, llamas or goats Enriched fat skimmed milk is defined as whole milk that has been skimmed to remove the milk fat, which is then replaced by adding vegetable oil or fat.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona el uso de la enzima, de la secuencia nucleotídica recombinante, de la construcción de expresión o de la célula hospedadora recombinante de la invención, según se han definido más arriba, en la hidrólisis de lactosa.In an eighth aspect, the present invention provides the use of the enzyme, recombinant nucleotide sequence, expression construct or recombinant host cell of the invention, as defined above, in the hydrolysis of lactose.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de la enzima, de la secuencia nucleotídica recombinante, de la construcción de expresión o de la célula hospedadora recombinante de la invención, según se han definido más arriba, para reducir el contenido de lactosa en un producto a base de lactosa.In another aspect, the present invention provides the use of the enzyme, recombinant nucleotide sequence, expression construct or recombinant host cell of the invention, as defined above, to reduce lactose content by a lactose-based product.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de hidrólisis de lactosa que comprende la etapa de incubación de la enzima o de la célula hospedadora recombinante según se ha definido más arriba, con un producto a base de lactosa, a un pH entre 6.5 y 8.0. En una realización, la incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 55 y 89°C o entre 65 y 85 o entre 70 y 75°C, a un pH entre 6.5 y 8. El tiempo de la etapa de incubación será el necesario para alcanzar el nivel de lactosa deseado y dependerá, entre otros factores, de la naturaleza del sustrato. El experto en la materia puede parar la incubación en cualquier momento inactivando la enzima, por ejemplo subiendo la temperatura por encima de 90°C, por ejemplo entre 90-100°C. Alternativamente, en otra realización, la etapa de incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 3 y 10°C, entre 5 y 9°C, o a 8°C, a pH entre 6.5 y 8. En otra realización, previamente y/o posteriormente a la etapa de incubación, el procedimiento comprende el enfriamiento del medio de reacción (que incluye el producto a base de lactosa y la enzima) a una temperatura entre 3 y 10°C, en particular entre 5 y 9°C, en particular 8°C, a un pH entre 6.5 y 8, durante un periodo de tiempo de entre 10 y 48 horas, particularmente entre 15 y 30 horas.In a ninth aspect, the present invention provides a lactose hydrolysis process comprising the step of incubating the enzyme or the recombinant host cell as defined above, with a lactose-based product, at a pH between 6.5 and 8.0. In one embodiment, the incubation is carried out at a temperature between 55 and 89°C or between 65 and 85 or between 70 and 75°C, at a pH between 6.5 and 8. The time of the incubation step will be the necessary to reach the desired lactose level and will depend, among other factors, on the nature of the substrate. The person skilled in the art can stop the incubation at any time by inactivating the enzyme, for example by raising the temperature above 90°C, for example between 90-100°C. Alternatively, in another embodiment, the incubation step is carried out at a temperature between 3 and 10°C, between 5 and 9°C, or at 8°C, at a pH between 6.5 and 8. In another embodiment, previously and /or after the incubation stage, the The procedure comprises cooling the reaction medium (which includes the lactose-based product and the enzyme) to a temperature between 3 and 10°C, in particular between 5 and 9°C, in particular 8°C, at a pH between 6.5 and 8, for a period of time between 10 and 48 hours, particularly between 15 and 30 hours.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de reducción del contenido de lactosa en un producto lácteo, que comprende la etapa de incubación de la enzima o de la célula hospedadora recombinante según se ha definido más arriba, con un producto a base de lactosa, a un pH entre 6.5 y 8.0. En una realización, la incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 55 y 89°C o entre 65 y 85 o entre 70 y 75°C, a un pH entre 6.5 y 8. El tiempo de la etapa de incubación será el necesario para alcanzar la cantidad de GOS deseada y dependerá, entre otros factores, de la naturaleza del sustrato. El experto en la materia puede parar la incubación en cualquier momento inactivando la enzima, por ejemplo subiendo la temperatura por encima de 90°C, por ejemplo entre 90-100°C.Alternativamente, en otra realización, la etapa de incubación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 3 y 10°C, entre 5 y 9°C, o a 8°C, a un pH entre 6.5 y 8. En otra realización, previamente y/o posteriormente a la etapa de incubación, el procedimiento comprende el enfriamiento del medio de reacción (que incluye el producto a base de lactosa y la enzima) a una temperatura entre 3 y 10°C, en particular entre 5 y 9°C, en particular 8°C, durante un periodo de tiempo de entre 10 y 48 horas, particularmente entre 15 y 30 horas, a un pH entre 6.5 y 8.In another aspect, the present invention provides a process for reducing the lactose content in a dairy product, comprising the step of incubating the enzyme or the recombinant host cell as defined above, with a lactose-based product. , at a pH between 6.5 and 8.0. In one embodiment, the incubation is carried out at a temperature between 55 and 89°C or between 65 and 85 or between 70 and 75°C, at a pH between 6.5 and 8. The time of the incubation step will be the necessary to achieve the desired amount of GOS and will depend, among other factors, on the nature of the substrate. The person skilled in the art can stop the incubation at any time by inactivating the enzyme, for example by raising the temperature above 90°C, for example between 90-100°C. Alternatively, in another embodiment, the incubation step is carried out carried out at a temperature between 3 and 10°C, between 5 and 9°C, or at 8°C, at a pH between 6.5 and 8. In another embodiment, before and/or after the incubation step, the procedure comprises cooling the reaction medium (which includes the lactose-based product and the enzyme) at a temperature between 3 and 10°C, in particular between 5 and 9°C, in particular 8°C, for a period of time of between 10 and 48 hours, particularly between 15 and 30 hours, at a pH between 6.5 and 8.

Generalmente los procedimientos y aparatos empleados para la hidrólisis de lactosa son similares a los usados comúnmente en procesos de hidrólisis enzimática equivalentes y una amplia gama de posibles sistemas y procedimientos serán evidentes para los expertos en la técnica. Por tanto, en una realización, en un modo de incubación continua, el sustrato que contiene lactosa en forma de solución se pasa a un reactor que contiene la enzima o la preparación de células enteras enzimáticamente activa, preferiblemente en forma inmovilizada. La composición de enzima inmovilizada o la preparación de células enteras inmovilizadas, y los productos de glucosa y galactosa se recuperan aguas abajo del reactor.Generally the procedures and apparatus employed for lactose hydrolysis are similar to those commonly used in equivalent enzymatic hydrolysis processes and a wide range of possible systems and procedures will be apparent to those skilled in the art. Thus, in one embodiment, in a continuous incubation mode, the lactose-containing substrate in solution form is passed into a reactor containing the enzyme or enzymatically active whole cell preparation, preferably in immobilized form. The immobilized enzyme composition or immobilized whole cell preparation, and the glucose and galactose products are recovered downstream of the reactor.

En una realización de los procedimientos proporcionados por la presente invención, el sustrato a base de lactosa que se utiliza en la etapa de incubación es líquido. In one embodiment of the methods provided by the present invention, the lactose-based substrate used in the incubation step is liquid.

En otra realización de los procedimientos proporcionados por la presente invención, el sustrato a base de lactosa que se utiliza en la etapa de incubación es sólido. En esta realización, la enzima se puede incorporar en forma de preparación enzimática líquida o, alternativamente, añadirla en forma sólida, para, posteriormente, incorporar un medio acuoso a un pH entre 6.5 y 8.0.In another embodiment of the methods provided by the present invention, the lactose-based substrate used in the incubation step is solid. In this embodiment, the enzyme can be incorporated in the form of a liquid enzyme preparation or, alternatively, added in solid form, to subsequently incorporate an aqueous medium at a pH between 6.5 and 8.0.

Además, en vista de la alta estabilidad térmica la enzima puede incorporarse directamente con productos lácteos UHT antes del tratamiento térmico y puede esterilizarse ventajosamente junto con la leche durante el tratamiento térmico.Furthermore, in view of the high thermal stability the enzyme can be directly incorporated with UHT dairy products before heat treatment and can be advantageously sterilized together with the milk during heat treatment.

Así, en un décimo aspecto la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un producto lácteo esterilizado, en particular pasteurizado, que comprende pasteurizar el producto lácteo, tal como leche, en presencia de la enzima o la célula hospedadora recombinante según se han definido más arriba.Thus, in a tenth aspect the present invention provides a process for preparing a sterilized dairy product, in particular pasteurized, comprising pasteurizing the dairy product, such as milk, in the presence of the enzyme or the recombinant host cell as defined further. up.

En una realización del décimo aspecto, la etapa de pasteurización se lleva a cabo a una temperatura entre 55 y 90°C, durante un periodo de tiempo entre 5 y 30 segundos.In an embodiment of the tenth aspect, the pasteurization step is carried out at a temperature between 55 and 90°C, for a period of time between 5 and 30 seconds.

En otra realización del décimo aspecto, previamente a la etapa de pasteurización, el producto lácteo, en presencia de la enzima, se enfría a una temperatura entre 3 y 10°C, particularmente entre 4 y 9°C, particularmente entre 6 y 8.5°C.In another embodiment of the tenth aspect, prior to the pasteurization step, the dairy product, in the presence of the enzyme, is cooled to a temperature between 3 and 10°C, particularly between 4 and 9°C, particularly between 6 and 8.5°C. c.

En otra realización del décimo aspecto, posteriormente a la etapa de pasteurización, el producto lácteo resultante se enfría a una temperatura entre 3 y 10°C, particularmente entre 3.5 y 5°C, particularmente a 4°C.In another embodiment of the tenth aspect, after the pasteurization step, the resulting dairy product is cooled to a temperature between 3 and 10°C, particularly between 3.5 and 5°C, particularly at 4°C.

En otra realización del décimo aspecto, se lleva a cabo una etapa de enfriamiento antes (entre 3-10°C) y después de la pasteurización (entre 4-9°C).In another embodiment of the tenth aspect, a cooling step is carried out before (between 3-10°C) and after pasteurization (between 4-9°C).

En otra realización del décimo aspecto, la(s) etapa(s) de enfriamiento se lleva(n) a cabo durante un periodo de tiempo de entre 10 y 48 horas, particularmente entre 15 y 30 horas.In another embodiment of the tenth aspect, the cooling step(s) is(are) carried out for a period of time between 10 and 48 hours, particularly between 15 and 30 hours.

En una realización de los procedimientos de la invención, estos comprenden opcionalmente una o más de las etapas de inactivación y/o eliminación de la enzima, conversión del producto resultante a polvo y empaquetado en forma líquida o en polvo. In one embodiment of the methods of the invention, these optionally comprise one or more of the steps of enzyme inactivation and/or removal, conversion of the resulting product to powder and packaging in liquid or powder form.

Como se ha ido explicando con anterioridad y se demuestra más abajo, el producto resultante de la acción enzimática de la beta-galactosidasa de la invención presenta un bajo contenido en lactosa y está enriquecido en GOS.As explained above and demonstrated below, the product resulting from the enzymatic action of beta-galactosidase of the invention has a low lactose content and is enriched in GOS.

Por lo tanto, en undécimo aspecto, la presente invención proporciona un producto lácteo obtenible mediante cualquiera de los procedimientos proporcionados por la presente invención.Therefore, in the eleventh aspect, the present invention provides a dairy product obtainable by any of the methods provided by the present invention.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra “comprende” incluye el caso “consiste en”. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Los signos numéricos relativos a los dibujos y colocados entre paréntesis en una reivindicación, son solamente para intentar aumentar la comprensión de la reivindicación, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la protección de la reivindicación. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.Throughout the description and claims the word "comprise" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. Furthermore, the word “comprises” includes the case “consists of”. Other objects, advantages and features of the invention will be apparent to those skilled in the art in part from the description and in part from the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention. Numerical signs relative to the drawings and placed in parentheses in a claim are intended only to increase the understanding of the claim, and should not be construed as limiting the scope of protection of the claim. Furthermore, the present invention covers all possible combinations of particular and preferred embodiments indicated herein.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

FIG. 1 representa el efecto de la temperatura (T) expresada en grados centígrados en la actividad relativa (A) de la enzima, expresado en % (actividad relativa: % de actividad respecto al máximo de actividad registrada en el ensayo). El eje Y representa la actividad, y el eje X la temperatura.FIG. 1 represents the effect of temperature (T) expressed in degrees centigrade on the relative activity (A) of the enzyme, expressed in % (relative activity: % activity with respect to the maximum activity recorded in the assay). The Y axis represents activity, and the X axis temperature.

FIG. 2 representa la actividad enzimática relativa (A), expresada en %, en función de la temperatura: a 75 °C (a), 65 °C (b) y 55 (°C) y a diferentes tiempos (t) expresados en horas. El eje “Y” representa la actividad relativa enzimática y el eje “Y” el tiempo.FIG. 2 represents the relative enzymatic activity (A), expressed in %, as a function of temperature: at 75 °C (a), 65 °C (b) and 55 (°C) and at different times (t) expressed in hours. The "Y" axis represents relative enzymatic activity and the "Y" axis time.

FIG. 3 representa el efecto del pH en la actividad relativa (A) de la enzima, expresada en %. El eje Y representa la actividad relativa, y el eje X el pH.FIG. 3 represents the effect of pH on the relative activity (A) of the enzyme, expressed in %. The Y axis represents relative activity, and the X axis pH.

FIG. 4 representa la producción de GOS por la enzima de la invención (barra negra) y los preparados comerciales Biocon (barra gris) y Maxilact (barra blanca) a las 16 y 24 horas de incubación a 8°C y tras la pasteurización a tiempo cero (HTST 0 h) y 24 horas después a 4°C (HTST 24 h). Las estrellas indican si hay diferencias significativas aplicando una t-student del resultado obtenido con la enzima BWpgl con respecto a la p-galactosidasa de Biocon (estrella gris) o con la p-galactosidasa de Maxilact (estrella blanca).FIG. 4 represents the production of GOS by the enzyme of the invention (black bar) and the commercial preparations Biocon (grey bar) and Maxilact (white bar) at 16 and 24 hours of incubation at 8°C and after pasteurization at zero time (HTST 0 h) and 24 hours later at 4°C (HTST 24 h). The stars indicate whether there are significant differences by applying a t-student of the result obtained with the enzyme BWpgl with respect to Biocon's p-galactosidase (gray star) or Maxilact's p-galactosidase (white star).

EJEMPLOSEXAMPLES

1. Clonaje, expresión y purificación de la B-galactosidasa1. Cloning, expression and purification of B-galactosidase

Un clon de secuencia SEC ID NO: 2, seleccionado por búsqueda funcional en una metagenoteca en plásmido construida a partir de las aguas termales de As Burgas (Ourense), se comprobó que era capaz de hidrolizar X-Gal (5-bromo-4-cloro-indolyl-B-D-galactopiranósido) ya que dio lugar a una coloración azulada en placas sólidas de medio Luria Bertani (LB) suplementadas con 100 ^g/ml de ampicilina y 0.04 % X-Gal en N,N-dimetilformamida. La secuencia de aminoácidos deducida para dicha enzima se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 1.A clone with sequence SEQ ID NO: 2, selected by functional search in a plasmid meta-library constructed from the thermal waters of As Burgas (Ourense), was found to be capable of hydrolyzing X-Gal (5-bromo-4- chloro-indolyl-B-D-galactopyranoside) as it gave rise to a bluish coloration in solid plates of Luria Bertani (LB) medium supplemented with 100 ^g/ml ampicillin and 0.04% X-Gal in N,N-dimethylformamide. The deduced amino acid sequence for said enzyme corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1.

La ORF de la B-galactosidasa (BWpgl) se amplificó directamente a partir del clon positivo con los cebadores MCA141 (5'CAATTCCCCTCTAGAATGACCCTGCGTGAGTTC3' (SEC ID No: 3)) y MCA140 (5'AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCACCCTCATACATAGCCTCAC3' (SEC ID NO: 4)). Para el ligamiento en el vector pET21a se utilizó el kit NEBuilder HiFi DNA assembly (New England Biolabs, “NEB”).The B-galactosidase ( BWpgl) ORF was amplified directly from the positive clone with the primers MCA141 (5'CAATTCCCCTCTAGAATGACCCTGCGTGAGTTC3' (SEQ ID NO: 3)) and MCA140 (5'AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCACCCTCATACATAGCCTCAC3' (SEQ ID NO: 4)). . For ligation into the pET21a vector, the NEBuilder HiFi DNA assembly kit (New England Biolabs, "NEB") was used.

La construcción se usó para transformar en células de E. coli T7 Express (C2566) (NEB) mediante choque térmico, siguiendo las instrucciones del fabricante y expresar la proteína, para lo cual se indujo con 0.4 mM IPTG durante 2 horas a 37°C.The construct was used to transform into E. coli T7 Express (C2566) (NEB) cells by heat shock, following the manufacturer's instructions, and express the protein, for which it was induced with 0.4 mM IPTG for 2 hours at 37°C. .

A continuación, se centrifugaron las células (5000 rpm 15 min 4°C) y se resuspendieron en tampón fosfato sódico 20mM pH 7.2 con 500 mM NaCl y un cocktail inhibidor de proteasas Complete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor Cocktail (Roche). La lisis celular se llevó a cabo mediante sonicación en hielo con un Vibra Cell sonicator (100W, 5min 2”ON/8”OFF), (Sonics & Materials). El extracto crudo resultante se calentó a 70°C durante 10 minutos para desnaturalizar las proteínas de E. coli.Cells were then centrifuged (5000 rpm 15 min 4°C) and resuspended in 20mM sodium phosphate buffer pH 7.2 with 500mM NaCl and Complete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor Cocktail (Roche). Cell lysis was carried out by sonication on ice with a Vibra Cell sonicator (100W, 5min 2”ON/8”OFF), (Sonics & Materials). The resulting crude extract was heated at 70°C for 10 min to denature E. coli proteins.

Posteriormente, el sobrenadante obtenido tras la centrifugación (14000 rpm 20 min) se hizo pasar a través de una columna de histidinas HisTrapTM HP column (GEHealthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante y empleando un sistema de cromatografía ÁKTA (GEHealthcare). Brevemente, la columna se equilibró con tampón fosfato sódico 20mM pH 7.2, 500 mM NaCl y 20 mM imidazol y la elución de la proteína se llevó a cabo con tampón fosfato sódico 20mM pH 7.2, 500 mM NaCl y 500 mM imidazol.Subsequently, the supernatant obtained after centrifugation (14,000 rpm 20 min) was passed through a HisTrapTM HP column (GEHealthcare). following the manufacturer's instructions and using an ÁKTA chromatography system (GEHealthcare). Briefly, the column was equilibrated with 20mM sodium phosphate buffer pH 7.2, 500mM NaCl and 20mM imidazole and protein elution was carried out with 20mM sodium phosphate buffer pH 7.2, 500mM NaCl and 500mM imidazole.

Se seleccionaron aquellas fracciones correspondientes al pico de elución de la cromatografía, realizándose posteriormente un ensayo de actividad p-galactosidasa en cada una de ellas para comprobar la presencia de la enzima. Las fracciones seleccionadas se concentraron y dializaron empleando una columna Amicon Ultra-15 30,000 MWCO (Millipore). La concentración de proteína purificada se cuantificó siguiendo el protocolo del kit Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad), utilizando seroalbúmina bovina como estándar.Those fractions corresponding to the chromatography elution peak were selected, subsequently performing a p-galactosidase activity assay on each of them to verify the presence of the enzyme. Selected fractions were concentrated and dialyzed using an Amicon Ultra-15 30,000 MWCO column (Millipore). The concentration of purified protein was quantified following the protocol of the Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad), using bovine serum albumin as standard.

Las muestras de proteína en las diferentes etapas de la purificación se cargaron en un gel de acrilamida al 10% SDS-PAGE para la determinación de su peso molecular. El NZYcolour Protein Marker II (Nzytech) fue utilizado como marcador de pesos moleculares y la visualización de las proteínas se llevó a cabo mediante tinción con azul de Coomasie. De esta manera se acabó concluyendo que la enzima con actividad betagalactosidasa tenía un peso molecular de aproximadamente 75 kDa.Protein samples at different stages of purification were loaded onto a 10% acrylamide SDS-PAGE gel for molecular weight determination. The NZYcolour Protein Marker II (Nzytech) was used as a molecular weight marker and the visualization of the proteins was carried out by staining with Coomasie blue. In this way, it was concluded that the enzyme with betagalactosidase activity had a molecular weight of approximately 75 kDa.

Análisis de la secuencia aminoacídica de la proteínaProtein amino acid sequence analysis

La secuencia aminoacídica deducida a partir de la secuencia de nucleótidos obtenida tras la secuenciación del clon positivo se comparó con otras secuencias conocidas utilizando una herramienta de búsqueda por alineamiento local proteína-proteína (BLAST) (Altschul et al., "Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403-410). Los motivos conservados en las secuencias se buscaron empleando la herramienta ScanProsite (de Castro et al., 2006, "ScanProsite: Detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins". Nucleic Acids Res., v. 34). Asimismo, se llevó a cabo un alineamiento múltiple de secuencias con Clustal Omega (Sievers et al., 2011, Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol., v. 7) y el mismo programa se utilizó para construir los árboles filogenéticos con otras pgalactosidasas de familias de Glicosil Hidrolasas (GHs) conocidas.The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence obtained after sequencing of the positive clone was compared with other known sequences using a protein-protein local alignment search tool (BLAST) (Altschul et al., "Basic local alignment search tool ”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410).Conserved motifs in the sequences were searched using the ScanProsite tool (de Castro et al., 2006, "ScanProsite: Detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins". Nucleic Acids Res., v. 34). In addition, a multiple sequence alignment was carried out with Clustal Omega (Sievers et al., 2011, Fast, scalable generation of high- quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol., v. 7) and the same program was used to build phylogenetic trees with other known p-galactosidases from Glycosyl Hydrolases (GHs) families. ace.

Con los tests anteriores se concluyó que la secuencia de aminoácidos de BWbg1 consistía en 664 residuos aminoacídicos y que la enzima del estudio pertenece a la familia de las GH-35. With the above tests it was concluded that the amino acid sequence of BWbg1 consisted of 664 amino acid residues and that the enzyme under study belongs to the GH-35 family.

Determinación de la actividad enzimáticaDetermination of enzyme activity

La cuantificación de la actividad enzimática se realizó empleando el sustrato ortonitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG). Las preparaciones de proteína purificada se diluyeron en 150 ^L de tampón Z (100 mM Na²HPO⁴, 40 mM NaH²PO⁴, 10 mM KCl, 1.6 mM MgSO⁴pH 7). Tras incubar durante 5 minutos a 80°C, se inició la reacción con la adición de 150 ^L de ONPG a una concentración de 4 mg mL-1. Para parar la reacción se adicionaron 100 ^L de Na²CO³1 M a 100 ^L de la mezcla de reacción. El o-nitrofenol producido en la reacción se cuantificó mediante absorbancia UV a 420 nm.The quantification of the enzymatic activity was carried out using the substrate orthonitrophenyl-pD-galactopyranoside (ONPG). Purified protein preparations were diluted in 150 ^L of buffer Z (100 mM Na ² HPO ⁴ , 40 mM NaH ² PO ⁴ , 10 mM KCl, 1.6 mM MgSO ⁴ pH 7). After incubating for 5 minutes at 80°C, the reaction was started by adding 150 ^L of ONPG at a concentration of 4 mg mL-1. To stop the reaction, 100 ^L of 1 M Na ² CO ³ were added to 100 ^L of the reaction mixture. The o-nitrophenol produced in the reaction was quantified by UV absorbance at 420 nm.

En los ensayos de pH, temperatura óptima y termoestabilidad se expresó la actividad enzimática como porcentaje de actividad relativa, es decir, porcentaje de actividad respecto al máximo de actividad registrada en el test.In the pH, optimum temperature and thermostability tests, the enzymatic activity was expressed as a percentage of relative activity, that is, a percentage of activity with respect to the maximum activity recorded in the test.

En los ensayos de cinética de ONPG e hidrólisis de lactosa la actividad p-galactosidasa se expresó en unidades enzimáticas (U), definidas como la cantidad de enzima capaz de liberar un ^mol de producto (o-nitrophenol) por minuto (^molmin-1) en diferentes condiciones experimentales de temperatura y pH. En todos los casos las medidas se llevaron a cabo por triplicado.In ONPG kinetics and lactose hydrolysis assays, p-galactosidase activity was expressed in enzymatic units (U), defined as the amount of enzyme capable of releasing one ^mol of product (o-nitrophenol) per minute (^molmin- 1) under different experimental conditions of temperature and pH. In all cases the measurements were carried out in triplicate.

Cinética de ONPG e hidrólisis de lactosa. Determinación de la afinidad por lactosa ONPG kinetics and lactose hydrolysis. Determination of affinity for lactose

La caracterización cinética de la enzima se basó en la determinación de la actividad pgalactosidasa de la proteína purificada a diferentes concentraciones de ONPG (0-10 mM) siguiendo el protocolo descrito en la sección anterior. Las medidas se realizaron por triplicado con 0.3 ^g mL-1 de enzima. Para estimar los valores de las constantes cinéticas se llevó a cabo un ajuste de regresión no lineal por mínimos cuadrados a partir de las gráficas de Michaelis Menten, con el software Prism 6.00 para Windows (GraphPad Software Inc.).The kinetic characterization of the enzyme was based on the determination of the p-galactosidase activity of the protein purified at different concentrations of ONPG (0-10 mM) following the protocol described in the previous section. Measurements were performed in triplicate with 0.3 ^g mL-1 of enzyme. To estimate the values of the kinetic constants, a nonlinear least squares regression fit was carried out from the Michaelis Menten graphs, with the Prism 6.00 software for Windows (GraphPad Software Inc.).

La cinética de la hidrólisis de lactosa se llevó a cabo determinando la glucosa liberada por la enzima a diferentes concentraciones de lactosa. Para ello, la proteína purificada se diluyó en tampón Z a una concentración de 104.5 ^g/mL. La velocidad inicial se determinó por triplicado utilizando 104.5 ^g mL-1 de enzima y una concentración de lactosa de 0, 10, 20 y 80 mM. Los tiempos de reacción fueron 6-20 min a 80 °C. Finalmente, se calentaron las muestras a 96 °C durante 5 min con el fin de parar la reacción. The kinetics of lactose hydrolysis was carried out by determining the glucose released by the enzyme at different concentrations of lactose. For this, the purified protein was diluted in buffer Z at a concentration of 104.5 ^g/mL. The initial rate was determined in triplicate using 104.5 ^g mL-1 of enzyme and a lactose concentration of 0, 10, 20 and 80 mM. Reaction times were 6-20 min at 80 °C. Finally, the samples were heated at 96 °C for 5 min in order to stop the reaction.

La actividad p-galactosidasa se expresa en unidades enzimáticas (U), definidas como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 ^mol de producto (D-glucosa) por minuto en las condiciones experimentales (^mol min -1). La concentración de glucosa se cuantificó empleando el kit comercial D-Glucose GOD-POD (Nzytech). Se utilizó un ajuste de regresión no linear por mínimos cuadrados para inferir los parámetros cinéticos a partir de las gráficas de Michaelis-Menten generadas (via Prism 6).The p-galactosidase activity is expressed in enzymatic units (U), defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 ^mol of product (D-glucose) per minute under the experimental conditions (^mol min -1). Glucose concentration was quantified using the commercial kit D-Glucose GOD-POD (Nzytech). A nonlinear least squares regression fit was used to infer the kinetic parameters from the generated Michaelis-Menten plots (via Prism 6).

Tabla 2. Valores cinéticos de K^my V^máxpara la hidrólisis de lactosa y ONPG. Table 2. K ^m and V ^max kinetic values for the hydrolysis of lactose and ONPG.

ONPG LactosaONPG Lactose

Vmax (U/mg) 42.75±3.94 25.86±1.03Vmax (U/mg) 42.75±3.94 25.86±1.03

Km (mM) 1.16±0.42 13.85±1.69Km (mM) 1.16±0.42 13.85±1.69

Vmax/Km 36.85 1.87Vmax/Km 36.85 1.87

Efecto de la temperatura en la estabilidad y actividad enzimáticaEffect of temperature on enzyme stability and activity

El efecto de la temperatura se determinó cuantificando la actividad relativa (porcentaje de actividad respecto a la máxima actividad registrada) de la enzima a 55-90°C con ONPG (4mg mL-1) en tampón Z utilizando el procedimiento descrito en la sección “Determinación de la actividad enzimática”.The effect of temperature was determined by quantifying the relative activity (percentage of activity with respect to the maximum activity recorded) of the enzyme at 55-90°C with ONPG (4mg mL-1) in buffer Z using the procedure described in the section “ Determination of enzymatic activity”.

En un primer ensayo, se determinó la temperatura que proporciona la actividad óptima de la enzima. Así, se pre-incubó la enzima a una concentración final de 113 ^g mL-1 en el tampón Z a cada una de las temperaturas de prueba y se midió la actividad en función del o-nitrofenol liberado (tal y como se ha detallado en secciones anteriores). Los resultados se expresaron como porcentaje de actividad relativa (porcentaje de actividad enzimática respecto al máximo registrado). A partir de los datos que se proporcionan en la FIG. 1, se concluyó que la temperatura óptima se encontraba entorno a los 80°C. In a first test, the temperature that provides the optimal activity of the enzyme was determined. Thus, the enzyme was pre-incubated at a final concentration of 113 ^g mL-1 in buffer Z at each of the test temperatures and the activity was measured as a function of the o-nitrophenol released (as detailed in previous sections). The results were expressed as a percentage of relative activity (percentage of enzymatic activity with respect to the maximum recorded). From the data provided in FIG. 1, it was concluded that the optimum temperature was around 80°C.

A continuación, se llevó a cabo un estudio de termoestabilidad de la enzima, en un rango de temperaturas de 55-75°C durante 1-2 horas. Los resultados se muestran en FIG. 2. De estos datos se concluye que la enzima es extremadamente activa durante largos periodos de tiempo en condiciones de temperatura elevadas, entre 55 y 75°C. Esto es indicativo de la elevada estabilidad de la enzima de la invención. Next, a thermostability study of the enzyme was carried out in a temperature range of 55-75°C for 1-2 hours. The results are shown in FIG. 2. From these data it is concluded that the enzyme is extremely active for long periods of time under high temperature conditions, between 55 and 75°C. This is indicative of the high stability of the enzyme of the invention.

Efecto del pH en la actividad enzimáticaEffect of pH on enzyme activity

Para estimar el efecto del pH en la actividad enzimática, se preincubaron 113 ^g mL-1 de la enzima a la temperatura óptima (80°C) en tampón Britton-Robinson 20 mM (Britton and Robinson, 1931, CXCVIII.— Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal. J. Chem. Soc., v. 0, páginas 1456-1462) con diferentes valores de pHs , dentro del rango entre 5.0-8.5 ajustados con una solución de NaOH 1M empleando un pHmetro. A continuación, se cuantificó la actividad relativa frente a ONPG (4mg mL-1). Los resultados se expresan como porcentaje de actividad relativa (porcentaje de actividad respecto a la máxima actividad registrada) y se recogen en la FIG. 3.To estimate the effect of pH on enzyme activity, 113 ^g mL-1 of the enzyme were preincubated at the optimum temperature (80°C) in 20 mM Britton-Robinson buffer (Britton and Robinson, 1931, CXCVIII.— Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal J. Chem. Soc., v. 0, pages 1456-1462) with different pH values, within the range between 5.0-8.5 adjusted with a 1M NaOH solution using a pH meter. Next, the relative activity against ONPG (4mg mL-1) was quantified. The results are expressed as a percentage of relative activity (percentage of activity with respect to the maximum activity recorded) and are shown in FIG. 3.

Tal y como se puede observar, el óptimo de pH para la enzima de la invención se encontró entre 6.5-7.5.As can be seen, the optimal pH for the enzyme of the invention was between 6.5-7.5.

Estudio de producción y caracterización a temperaturas elevadas (70°C)Production and characterization study at elevated temperatures (70°C)

Las concentraciones de GOS, glucosa, galactosa y lactosa se determinaron mediante HPLC (HPLC Waters Breeze I), utilizando una columna Waters Sugar-Pak eluida a 90 °C con EDTA disódico 0.1 M en agua Milli-Q a un flujo de 0.5 mL min-1, y un detector de índice de refracción: 2414 (Waters).The concentrations of GOS, glucose, galactose and lactose were determined by HPLC (HPLC Waters Breeze I), using a Waters Sugar-Pak column eluted at 90 °C with 0.1 M disodium EDTA in Milli-Q water at a flow rate of 0.5 mL min. -1, and a refractive index detector: 2414 (Waters).

Para llevar a cabo las reacciones se mezclaron 0.034 mg de proteína pura en tampón fosfato 0.1 M (pH 6.8), suplementado con un 40% de lactosa. Las muestras (500 ^L) se incubaron a 70°C y 650 rpm. A las 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 y 24 h se paró la reacción por calentamiento a 99 °C para inactivar la enzima. Todas las muestras se conservaron a -20 °C para su posterior análisis.To carry out the reactions, 0.034 mg of pure protein were mixed in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8), supplemented with 40% lactose. Samples (500 ^L) were incubated at 70°C and 650 rpm. At 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 and 24 h, the reaction was stopped by heating to 99 °C to inactivate the enzyme. All samples were stored at -20 °C for later analysis.

Los carbohidratos se cuantificaron mediante calibración externa empleando unas soluciones estándar de galactosa, glucosa, lactosa, rafinosa y estaquiosa. La producción total de GOS se estimó expresando la concentración final como porcentaje de la concentración inicial de lactosa (en % p/v).Carbohydrates were quantified by external calibration using standard solutions of galactose, glucose, lactose, raffinose, and stachyose. The total production of GOS was estimated by expressing the final concentration as a percentage of the initial concentration of lactose (in % w/v).

Se detectó un nivel de producción de GOS máximo del 48% utilizando 0.034 mg, con una concentración inicial de lactosa de 400 mg/mL. y tras cuatro horas de reacción. Los perfiles cromatográficos obtenidos mediante HPLC indican que los GOS predominantes producidos por BWpg1 son también trisacáridos seguidos de tetrasacáridos que son los que muestran los mejores efectos. A maximum GOS production level of 48% was detected using 0.034 mg, with an initial lactose concentration of 400 mg/mL. and after four hours of reaction. The chromatographic profiles obtained by HPLC indicate that the predominant GOS produced by BWpg1 are also trisaccharides followed by tetrasaccharides, which are the ones that show the best effects.

Estudio de producción y caracterización a bajas temperaturas (8°C) Production and characterization study at low temperatures (8°C)

Los inventores llevaron a cabo un estudio comparativo con enzimas comerciales para comprobar la diferencia de eficacia en la obtención de un producto rico en GOS.The inventors carried out a comparative study with commercial enzymes to check the difference in efficiency in obtaining a product rich in GOS.

En estos experimentos se comparó la capacidad de hidrólisis y de producción de GOS de la p-galactosidasa BWpgl de la invención con las p-galactosidasas comerciales Biolactasa NL Super (Biocon) y Maxilact LGi 5000 (DSM). Para poder comparar se utilizaron las mismas unidades enzimáticas (UE) en las tres enzimas (34,32 micromoles/min en 50 microlitros de agua bidestilada) por lo que se tuvo que diluir cien veces los preparados comerciales.In these experiments, the hydrolysis and GOS production capacity of the p-galactosidase BWpgl of the invention was compared with the commercial p-galactosidases Biolactase NL Super (Biocon) and Maxilact LGi 5000 (DSM). In order to be able to compare, the same enzymatic units (EU) were used in the three enzymes (34.32 micromoles/min in 50 microliters of bidistilled water), so the commercial preparations had to be diluted one hundred times.

Para el experimento, se pusieron 50 microlitros de cada una de las enzimas diluidas (todas ellas con las mismas UE totales, como se ha indicado previamente) en presencia de 450 microlitros de leche fresca semidesnatada de la casa Milbona (de LIDL). Se incubaron a 8°C durante 24 horas y se sacó una muestra a las 16 horas y a las 24 horas. Tras las 24 horas se llevó a cabo la etapa de pasteurización que consistió en someter la muestra a 79°C durante 17 segundos. Se tomó una muestra inmediatamente después de la pasteurización (HTST 0 h) y tras dejar transcurrir un periodo de 24 horas en nevera a 4°C (HTST 24 h). Posteriormente, las muestras se guardaron congeladas, hasta que se pasaron por filtros de corte 10K (para eliminar la enzima, así como las proteínas y grasa de la leche) centrifugando a 13000 durante 10 minutos. El eluido se diluyó diez veces y se pasó por filtros de 0,22 micras a través de una jeringuilla. Se cargaron 15 microlitros en el HPLC para determinar la concentración de GOS, siguiendo el protocolo descrito en la sección anterior. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Como control, se hizo un triplicado de la leche fresca semidesnatada con lactosa (450 microlitros más 50 microlitros de agua) y de la leche fresca semidesnatada sin lactosa (450 microlitros más 50 microlitros de agua), las dos de la marca Milbona de LIDL.For the experiment, 50 microliters of each of the diluted enzymes (all with the same total EU, as previously indicated) were placed in the presence of 450 microliters of fresh semi-skimmed milk from Milbona (from LIDL). They were incubated at 8°C for 24 hours and a sample was removed at 16 and 24 hours. After 24 hours, the pasteurization stage was carried out, which consisted of subjecting the sample to 79°C for 17 seconds. A sample was taken immediately after pasteurization (HTST 0 h) and after allowing a period of 24 hours to elapse in the refrigerator at 4°C (HTST 24 h). Subsequently, the samples were stored frozen until they were passed through 10K cut-off filters (to remove the enzyme, as well as the proteins and milk fat) by centrifuging at 13,000 for 10 minutes. The eluate was diluted tenfold and passed through 0.22 micron filters via syringe. 15 microliters were loaded onto the HPLC to determine the GOS concentration, following the protocol described in the previous section. All samples were performed in triplicate. As a control, a triplicate of semi-skimmed fresh milk with lactose (450 microliters plus 50 microliters of water) and semi-skimmed fresh lactose-free milk (450 microliters plus 50 microliters of water) was made, both from the LIDL Milbona brand.

Se encontró que la enzima beta-galactosidasa de la invención era capaz de producir cantidades significativas y superiores de GOS independientemente de la temperatura, ya fuera de 79°C (temperatura de pasteurización) o de 8°C (temperatura de almacenamiento), tal y como se muestra en la Fig. 4.The beta-galactosidase enzyme of the invention was found to be capable of producing significant and higher amounts of GOS regardless of temperature, whether it was 79°C (pasteurization temperature) or 8°C (storage temperature), as as shown in Fig.4.

Por otro lado, los inventores encontraron que la enzima, una vez finalizado en proceso de pasteurización y tras un periodo de reposo de 24 horas, continuaba produciendo de manera significativa GOS.On the other hand, the inventors found that the enzyme, once finished in the pasteurization process and after a rest period of 24 hours, continued to produce significantly GOS.

Finalmente, se encontró que la enzima BWpgl de la invención, aun siendo una enzima termoestable, tiene actividad a la temperatura baja de ensayo, 8°C, y en las condiciones experimentales probadas, presenta una reducción de lactosa del 63% tras 24 horas de incubación a 8°C y posterior pasteurización, frente al 52,6% de la enzima comercial de la marca Biocon y el 38,5% de la enzima comercial Maxilact, lo que supone una diferencia significativa de hidrólisis de lactosa de la enzima BWpgl con respecto a las dos preparaciones comerciales.Finally, it was found that the enzyme BWpgl of the invention, even though it is a thermostable enzyme, has activity at the low test temperature, 8°C, and under the experimental conditions tested, it shows a 63% reduction in lactose after 24 hours of storage. incubation at 8°C and subsequent pasteurization, compared to 52.6% of the Biocon brand commercial enzyme and 38.5% of the Maxilact commercial enzyme, which represents a significant difference in lactose hydrolysis of the BWpgl enzyme with compared to the two commercial preparations.

Así, se encontró que la enzima de la invención era capaz de producir prácticamente la misma cantidad de GOS incubando el sustrato con la enzima en frío que durante el proceso de pasteurización. Esto es significativo del comportamiento dual y la extraordinaria estabilidad y versatilidad en semejante rango de temperaturas.Thus, it was found that the enzyme of the invention was capable of producing practically the same amount of GOS by incubating the substrate with the enzyme in the cold as during the pasteurization process. This is significant of the dual behavior and the extraordinary stability and versatility in such a range of temperatures.

LISTA DE CITASAPPOINTMENT LIST

Altschul, S. F.et al., "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol., 1990, v. 215, páginas 403—410.Altschul, SFet al., "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol., 1990, v. 215, pages 403-410.

Britton, H. T. S., et al.,"CXCVIII.— Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal", J. Chem. Soc., 1931, v. 0, 1456-1462.Britton, HTS, et al., "CXCVIII.— Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal", J. Chem. Soc., 1931, v. 0, 1456-1462.

de Castro, E., et al., "ScanProsite: Detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins", Nucleic Acids Res., 2006, v. 34, páginas W362-W365.de Castro, E., et al., "ScanProsite: Detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and residue structurals in proteins", Nucleic Acids Res., 2006, v. 34, pages W362-W365.

Sievers, F. et al. "Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega", Mol. Syst. Biol., v. 7, 539. Sievers, F. et al. "Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega", Mol. Syst. Biol., v. 7, 539.

Claims

Claims 1. An enzyme having beta-galactosidase activity, said enzyme comprising a sequence selected from (a) an amino acid sequence with at least 85% sequence identity to the sequence SEQ ID NO: 1; and (b) an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to the sequence SEQ ID NO: 2.

2. Enzyme according to claim 1, which is selected from (a) an amino acid sequence consisting of the sequence SEQ ID NO: 1; and (b) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.

3. Enzyme according to any of claims 1-2, consisting of the sequence SEQ ID NO: 1.

4. Enzyme according to any of claims 1-3, which is immobilized on a support, in particular on a solid phase material.

5. Recombinant nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence encoding the enzyme as defined in any of claims 1-3, operatively linked to an expression promoter.

6. Expression construct comprising the nucleotide sequence of claim 5.

7. Recombinant host cell transformed with the nucleic acid of claim 5 or the expression construct of claim 6.

8. Dairy product comprising the enzyme according to any of claims 1-4, the recombinant nucleotide sequence according to claim 5, expression construct of claim 6 or the recombinant host cell according to claim 7.

9. Dairy product according to claim 8, wherein the enzyme is inactivated.

10. Use of the enzyme as defined in any of claims 1-4, of the recombinant nucleotide sequence of claim 5, of the expression construct of claim 6, or of the recombinant host cell according to claim 7, for the production of galactooligosaccharides from lactose.

11. Use of the enzyme as defined in any of claims 1-4, of the recombinant nucleotide sequence of claim 5, of the expression construct of claim 6 or of the recombinant host cell according to claim 7, to increase the content of galactooligosaccharides in a dairy product.

12. Use of the enzyme as defined in any of claims 1-4, of the recombinant nucleotide sequence of claim 5, of the expression construct of claim 6 or of the recombinant host cell according to claim 7, for the lactose hydrolysis.

13. Use of the enzyme as defined in any of claims 1-4, of the recombinant nucleotide sequence of claim 5, of the expression construct of claim 6 or of the recombinant host cell according to claim 7, to reduce the lactose content in a dairy product.

14. Process for the production of galacto-oligosaccharides, the process comprising the step of incubating the enzyme as defined in any of claims 1-4 or the recombinant host cell of claim 7, with a lactose-based product, at a pH between 6.5 and 8, and at a temperature between 3 and 10°C, or between 55-89 °C

15. Procedure to increase the content of galactooligosaccharides in a lactose-based product, the procedure comprising the enzyme incubation step defined in any of claims 1-4 or of the recombinant host cell of claim 7, with the lactose-based product, at a pH between 6.5 and 8, and at a temperature between 3 and 10°C, or between 55-89 °C

16. Lactose hydrolysis process, the process comprising the step of incubating, in a liquid medium, the enzyme as defined in any of claims 1-4 or the recombinant host cell of claim 7, with a lactose-based product, at a pH between 6.5 and 8 and at a temperature between 3 and 10°C, or between 55-89 °C.

17. Process for reducing the lactose content in a dairy product, the process comprising the step of incubating the enzyme as defined in any of claims 1-4 or the recombinant host cell of claim 7, with the product to lactose base, at a pH between 6.5 and 8 and at a temperature between 3 and 10°C, or between 55-89 °C

18. Method according to any of claims 14-17, wherein the incubation step is carried out at a temperature between 55 and 89°C and the method optionally comprises a cooling step before and/or after the step incubation, where the temperature in the cooling step(s) is between 3 and 10°C.

19. Process for preparing a pasteurized dairy product comprising pasteurizing the dairy product in the presence of an enzyme as defined in any of claims 1-4 or the recombinant host cell according to claim 7, at a pH between 6.5 and 8.

20. The method of claim 19, wherein the pasteurization stage is carried out at a temperature between 55 and 89°C, for a period of time between 5 and 30 seconds.

21. Process according to any of claims 19-20, wherein prior to the pasteurization stage, the dairy product and the enzyme are cooled to a temperature between 3 and 10°C, particularly between 4 and 9°C, particularly between 6 and 8°C.

22. Process according to any of claims 19-21, wherein after the pasteurization stage, the resulting dairy product is cooled to a temperature between 3 and 10°C, particularly between 3.5 and 5°C.

23. Process according to any of claims 19-22, wherein the cooling step is carried out for a period of time between 10 and 48 hours, particularly between 15 and 30 hours.