ES2908436T3 - Una proteína quimérica recombinante que actúa sobre las selectinas - Google Patents

Abstract

Una proteína dimérica que comprende dos proteínas quiméricas recombinantes del ligando 1 de la glucoproteína P-selectina (PSGL-1), en donde la proteína quimérica recombinante PSGL-1 comprende por lo menos: un dominio de unión a selectina capaz de unirse específicamente a una proteína selectiva y que comprende por lo menos aa 5-16 de SEQIDNO:11 (secuencia PSGL-1 madura), un dominio de unión a la cremallera de leucina capaz de formar una α hélice del lado derecho, promoviendo así la dimerización a través de la interacción proteína-proteína, y que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 187-208 de la SEQIDNO:12 (cremallera de leucina específica de retina neural) y una región promotora de enlaces disulfuro que comprende por lo menos una cisteína disponible para formar un enlace disulfuro con otra cisteína en una contrapartida de proteína quimérica monomérica, de modo tal que los dos monómeros de proteína dimérica están covalentemente enlazados entre sí por al menos un enlace disulfuro.

Description

DESCRIPCIÓN

Una proteína quimérica recombinante que actúa sobre las seleotinas

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de una nueva proteína dirigida a seleotinas para usos diagnósticos y terapéuticos.

Estado de la técnica

El ligando 1 de la glucoproteína P-selectina (PSGL-1) es una molécula de adhesión a los leucocitos que media el enlace y el rodamiento en células del endotelio activadas bajo flujo sanguíneo fisiológico. Esta actividad es un paso inicial importante en la extravasación de los leucocitos. PSGL-1 se identificó inicialmente como un ligando de P-selectina, y trabajos posteriores han revelado que PSGL-1 es también un ligando de E-selectina y L-selectina (véase, p. ej., la patente de Ee . UU. núm. 6.277.975).

Dos miembros de la familia de selectina tienen particular relevancia en el contexto de las imágenes moleculares: P-selectina y E-selectina. Se sabe que el aumento o la expresión de P- y E-selectina sobre el endotelio vascular ocurren bajo condiciones de inflamación, mientras que la presencia de selectinas endoteliales bajo condiciones de reposo es en general baja o nula. Los estados de enfermedad en los que las selectinas son dianas de adquisición de imágenes moleculares útiles incluyen lesión post-isquémica, síndrome coronario agudo, artritis, enfermedad intestinal inflamatoria como ileítis y colitis, aterosclerosis, miocarditis, trombosis y esclerosis múltiple. No obstante, la obtención de imágenes de selectinas puede ser útil para delinear e identificar tejidos en los que la expresión de selectinas ocurre bajo condiciones normales, como la microvasculatura de la piel.

Se sabe que el aumento de P-selectina (también llamada CD62P) ocurre muy rápidamente (en minutos), convirtiendo a la P-selectina en un marcador potencial de etapas muy tempranas de enfermedad inflamatoria. La P-selectina también se encuentra en la superficie de plaquetas activadas, convirtiéndola en un marcador de trombosis. La E-selectina (CD62E) también se expresa en vasculatura inflamada, aunque en general más tarde en la respuesta inflamatoria que en la P-selectina. La E-selectina es por lo tanto un marcador útil de inflamación en etapas posteriores de la enfermedad. Entre los ligandos de selectina, la PSGL-1 cumple una función importante en la incorporación de glóbulos blancos a los tejidos inflamados. Los glóbulos blancos normalmente no interactúan con el endotelio de los vasos sanguíneos. Sin embargo, la inflamación causa la expresión de las moléculas de adhesión celular (CAM) tales como P-selectina sobre la superficie de la pared de los vasos sanguíneos. Los glóbulos blancos presentes en el torrente sanguíneo pueden interactuar con las CAM. El primer paso en este proceso de interacción se lleva a cabo mediante PSGL-1 que interactúa con la P-selectina y/o la E-selectina sobre las células endoteliales y las plaquetas adherentes. Esta interacción produce el "rodamiento" del glóbulo blanco sobre la superficie de las células endoteliales seguido de adhesión y transmigración estable de los glóbulos blancos en el tejido inflamado.

La PSGL-1 humana (Núm. de acceso en GenBank Q14242.1; Gl 2498904) es una glucoproteína unida a disulfuro homodimérica de tipo mucina que se expresa en la superficie de la mayoría de las células hematopoyéticas, como p. ej., los neutrófilos, monocitos, linfocitos, células dendríticas y plaquetas.

La secuencia de aminoácidos de la PSGL-1 humana muestra un péptido de señalización amino terminal (residuos de aminoácidos 1-17) y un propéptido (residuos de aminoácidos 18-41) con un sitio de escisión de consenso para enzimas convertidoras de aminoácidos básicos apareados (PACE). La región N-terminal extracelular de la proteína madura comienza en el residuo 42. El dominio extracelular de la molécula PSGL-1 contiene varias repeticiones decaméricas ricas en serina /treonina que contienen múltiples sitios de enlace de O-glucosilación y también sitios de enlace de N-glucosilación. Esta región de la molécula, que se pliega en una estructura de tipo varilla, es responsable de las características de tipo mucina de PSGL-1. En neutrófilos, esta estructura de tipo varilla y la localización de PSGL-1 en las puntas de las microvellosidades facilita la unión de PSGL-1 a células que expresan selectinas. A la región de repetición decamérica de PSGL-1 le sigue la región transmembrana (residuos 268-292) y el dominio citoplásmico (residuos 293-361).

La expresión de PSGL-1 lograda primero por Sako et al. (Cell, 1993, 75(6), 1179-1186) ha permitido definir regiones y modificaciones relevantes a la unión a selectinas, que han descrito, por mencionar algunos: Liu et al J. Biol. Chem.

1998, 12:7078-7087, Cummings RD, Brazilian Journal of Medical and Biological research, 1999, 32:519-528, Sako et al. Cell, 1995, 83: 323-331 etc., mencionados más adelante. A partir de estudios generales de PSGL-1, se han mapeado regiones importantes para la unión de selectinas en la porción N-terminal de la PSGL-1 madura y abarcan los residuos 5-16 con los tres sitios de sulfatación de tirosina y el oligosacárido O-enlazado que porta sLex localizado en Thr 16.

El patrón de modificación post-traducción complejo de PSGL-1 (la proteína requiere dos modificaciones post­ traducción distintas para el reconocimiento dependiente del Ca2+ por el dominio lectina de P-selectina: sulfatación de selectina y una glucosilación de núcleo específico 2 O-enlazado por fucosa y ácido siálico) requiere que esta molécula se exprese en sistemas euoariotas recombinantes. Fugang L¡ et al. J. BíoI. Chem, 1996, 271:3255-3264 describen Ios requerimientos para la expresión reoombinante de la forma correctamente gluoosilada de rPSGL-1. Los documentos US 5.827,817 y US 6.277.975 describen varias variantes de la proteína PSGL-1, entre ellas proteína de fusión PSGL-1-Fc lgG1, y su expresión en células CHO y COS en combinación con un gen de fucosiltransferasa (FT). Por tanto, las quimeras de PSGL-1 con porciones del fragmento Fc de inmunoglobulina se han expresado o bien en CHO o COS portando enzima(s) adecuadas para la correcta glucosilación.

El mismo solicitante ya ha hallado que una variante más corta de dicha proteína de fusión PSGL-1 lgG1 Fc, covalentemente unida a fosfolípidos de microvesículas de imágenes de ultrasonido muestra una mejor unión a la diana y aumentan la estabilidad de las microburbujas. Estos hallazgos se describen en el documento WO2012/020030 del mismo solicitante de la presente invención.

La presente solicitud describe la expresión recombinante de una proteína quimérica de PSGL-1 que depende de dominios de dimerización no covalentes para la producción de una forma homodimérica de la proteína de fusión a PSGL-1, mediante la cual se evita el uso de fragmentos Fc de anticuerpos y las desventajas de la presencia de dichos fragmentos. En efecto, el constructo recombinante de la presente invención explota el uso de fragmentos funcionales de proteínas reguladoras de ADN, las "cremalleras de leucina", que promueven interacciones proteína-proteína y homo- o hetero-dímeros/multímeros, formas bajo las cuales actúan como factores de transcripción capaces de interactuar con ADN y regular su expresión.

Las cremalleras de leucina son dominios de proteínas con repeticiones de leucina cada 7 (a veces 4) posiciones de aminoácidos, capaces de forma una hélice a del lado derecho mediante lo cual promueven la oligomerización con contraparte(s) idéntica o diferente, generando de este modo homo- o hetero- dímeros/multímeros y propiedades reguladoras de expresión de ADN.

El uso de cremalleras de leucina como dominios de dimerización en E. coli se ha explotado para producir anticuerpos diméricos o sus fragmentos funcionales, ScFv, F(ab')2. Preparación de ScFv bifuncionales en De Kruif, J. and Logtenberg T., J. Biol. Chem., 1996, 271:7630-7634.

GCN4, una cremallera de leucina de levadura, se ha utilizado en Chingwei V. Lee et al., J. Immunological Methods, 2004, 284: 119-132, para la exhibición de fagos de fragmentos F(ab^')2 en el sistema M13 en E. coli.

El documento WO2005/105840, que se refiere a CD40 recombinante, propone el uso de las llamadas "compañeras de fusión" para inducir oligomerización de las variantes CD40 en células eucariotas. La proteína de unión a manosa, el dominio de unión a colágeno de tetranectina y cremalleras de leucina, incluida la cremallera de leucina específica de la retina neural, NRL (núm. GenBank M81840), se mencionan como posibles proteínas de fusión.

El solicitante ha descubierto ahora que cuando los fragmentos funcionales de PSGL-1 se clonan en dirección 5’ de una secuencia de NRL, no solamente se procesan y expresan correctamente como homodímeros funcionales, sino que además la segregación y expresión ocurre muy eficientemente, mucho más que la observada para constructos de PSGL-1 derivados con el esqueleto de IgG estándar que portan la región bisagra y el Fc, comúnmente utilizada para expresión de proteína dimérica, que se ha convertido en el estándar de referencia de la expresión del homodímero de PSGL-1.

La presente invención permite ahora la preparación de un reactivo específico de selectina P/E en cantidades adecuadas y con una calidad estándar para uso in vivo en aplicaciones o bien terapéuticas o diagnósticas.

La proteína quimérica se puede expresar en altos niveles en el sistema de células CHO, reconocidas con propiedades de uso seguro para la producción de proteínas recombinantes y que pueden proporcionar la glucosilación y procesamiento post-traducción requeridos para la unión a selectinas. Los altos niveles de expresión y el procesamiento post-traducción funcional permiten ahora la ampliación industrial de este reactivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Inmunotransferencia Western-blot del medio acondicionado de las Variantes 1-5 bajo condiciones de reducción y no reducción. Carriles 1 y 6: variante 5, respectivamente bajo condiciones de reducción y no reducción; carriles 2 y 7: Variante 1, respectivamente bajo condiciones de reducción y no reducción; carriles 3 y 8: Variante 2, respectivamente bajo condiciones de reducción y no reducción; carriles 4 y 9: Variante 3, respectivamente bajo condiciones de reducción y no reducción; carriles 5 y 10: Variante 2, respectivamente bajo condiciones de reducción y no reducción. Marcadores de PM a la izquierda.

Figura 2. Comparación SPR Biacore (respuesta de unión a la proteína en P-selectina) entre el Fragmento 1 (Fr-1, línea continua) y la proteína quimérica de la invención (Variante 1A, línea sombreada) a 125 nM cada una. Eje Y: respuesta de la Unidad de Resonancia (RU) que incluye asociación/disociación/regeneración en función del tiempo (seg) en el eje X.

Figura 3. imágenes de ultrasonido de extremidades traseras inflamatorias de rata. Las imágenes se obtuvieron con imágenes de burbujas fijas (FBI), 10 minutos después de la inyección de microburbujas del fragmento 1 o la variante 1A.

Figura 4. imágenes ópticas del modelo LPS inflamatorio de extremidades traseras de ratones después de la inyección de liposomas cargados o bien con Variante 1A-liposomas-DIR (ratones 1 a 6) o Fr-1-liposomas-DIR (ratones 7 a 12).

Las imágenes fluorescentes se obtuvieron dos horas después de la inyección de los liposomas (extremidad izquierda; extremidad inflamada; extremidad derecha; extremidad contralateral).

Figura 5. Análisis RP-HPLC de la combinación final de fracciones después de la purificación HA descrita en el Ejemplo 13 (negativo). El tiempo de retención (Rt) de la proteína diana es aproximadamente 9,7 min.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una proteína dimérica que comprende dos proteínas Ligando 1 de glucoproteína P-selectina (PSGL-1) quiméricas recombinantes, en donde la proteína glucoproteína Ligando-1 de P-Selectina (PSGL-1) quimérica recombinante comprende por lo menos un dominio de unión a selectina capaz de unirse específicamente a una proteína selectina y que comprende por lo menos aa 5-16 de SEQIDNO:11 (secuencia PSGL-1 madura), un dominio de cremallera leucina capaz de formar una hélice a del lado derecho, promoviendo así la dimerización a través de la interacción proteína-proteína y que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 187-208 de la SEQIDNO:12 (cremallera de leucina específica de la retina neural) y enlaces disulfuro que promueven la región que comprende por lo menos una cisteína disponible para formar un enlace disulfuro con otra cisteína en una contraparte de proteína quimérica monomérica, de modo que los dos monómeros quiméricos de proteína se enlazan en forma covalente entre sí a un enlace disulfuro.

El dominio cremallera de leucina comprende una secuencia de aminoácidos preferiblemente por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 181-215 de SEQIDNO:12.

En la proteína PSGL-1 quimérica recombinante de la invención, la región que promueve los enlaces disulfuro (dominio de dimerización covalente) comprende una secuencia de aminoácidos definida por la siguiente fórmula general;

(X1)n-C(X2)m-(X3) en donde;

- X¹, X² representa cualquier aminoácido o secuencia de aminoácidos con la exclusión de cisteína (Cys),

- C es Cys

- X³ es cualquier aminoácido y

- n, m son números enteros comprendidos por 1-6,

o es preferiblemente (SEQ IDNO:20).

La proteína quimérica recombinante es una proteína dimérica que comprende dos monómeros PSGL-1 quiméricos recombinantes como se definió anteriormente, covalentemente enlazados entre sí por al menos un enlace disulfuro y es preferiblemente un homodímero.

Se expresa en un sistema mamífero en el que se modifica correctamente en forma post-traducción y se segrega en el medio de cultivo a altos niveles como un dímero soluble.

La invención comprende además la secuencia de ADN que codifica la proteína quimérica recombinante monomérica definida anteriormente y los vectores de expresión eucariotas que promueven su expresión en un sistema mamífero, preferiblemente células CHO. El sistema de expresión mamífera comprende además las enzimas de glucosilación beta 1,6 N-acetilglucosaminiltransferasa (C2GnT) y fucosil-transferasa VII (FTVII) en un mismo vector o en un vector de expresión diferente para correcta glucosilación.

Por consiguiente, la invención comprende además la célula mamífera transformada con el ADN que codifica la proteína PSGL-1 recombinante, quimérica, monomérica o el vector que se definió anteriormente y la proteína purificada aislada segregada por la célula mamífera.

La proteína quimérica aislada es homodimérica, Glucosilada enlazada en O por lo menos en Thr en la posición 16 y sulfatada por lo menos en Tyr en las posiciones 5, 7 y 10 de la SEQ IDNO:11.

La proteína es un agente dirigido útil para restos diagnósticos o terapéuticos a la que se puede conjugar mediante un enlazador o espaciador que comprende el aminoácido Cys o Lisina, preferiblemente presente y dispuesto en el término C.

Los restos que son útiles desde el punto de vista diagnóstico preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en: una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, un compuesto quelante de metales, una microvesícula de lípidos rellena con gases y una combinación de los restos activos desde el punto de vista diagnóstico, y son más preferiblemente compuestos quelantes de metales o microvesículas rellenas de gases. Estos conjugados son útiles para obtención de imágenes por ultrasonido, resonancia magnética, optoacústica, escintigrafía, tomografía computada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía por emisión de positrones (PET), rayos x, radiofrecuencia acústica y óptica, y en condiciones patológicas caracterizadas por expresión excesiva de una selectina, tal como: síndrome coronario agudo (ACS), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, neo-angiogénesis asociada con tumores, artritis reumatoidea, lesión de reperfusión por isquemia, rechazo de injerto o, más en general, de cualquier órgano o tejido que exprese P-selectina y/o E-selectina encima de los niveles fisiológicos. Más preferiblemente, la patología es IBD, ACS, detección de tumores o rechazo de injertos.

Más preferiblemente, la proteína quimérica dimérica de la invención es un agente diana útil para IBD, ACS, detección de tumores y rechazo de injertos.

El resto terapéuticamente activo preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en: citocina, agente citostático, toxina, agente antiinflamatorio, inmunomodulador, antiagregante, corticoesteroide, anticuerpo monoclonal, factor de crecimiento o agentes radioterapéuticos que comprenden restos quelantes metálicos para llevar a cabo un radionúclido.

La invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína dimérica recombinante o sus conjugados para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, como se definió anteriormente.

Otra realización de la invención es un proceso para preparar la proteína quimérica recombinante de la invención, que comprende transformar una célula eucariota con la secuencia de ADN que la codifica o el vector de expresión eucariota que comprende dicha secuencia de ADN para lograr un sistema recombinante que expresa establemente la proteína quimérica, cosechando el medio de cultivo y purificando la proteína recombinante de dicho medio de cultivo.

La invención se refiere además a un proceso de purificación de la proteína soluble recombinante, que comprende hidroxiapatita como el último paso cromatográfico. La hidroxiapatita, preferiblemente la Hidroxiapatita Cerámica, se lleva a cabo después de un fuerte intercambio aniónico y una cromatografía de interacción hidrófoba.

La presente invención describe además métodos para el tratamiento terapéutico de una afección patológica caracterizada por la expresión excesiva de una selectina, usando los conjugados dirigidos que comprenden la proteína quimérica soluble recombinante de acuerdo con la invención y la obtención de imágenes de diagnósticas de una afección patológica caracterizada por la expresión excesiva de una selectina, que comprende pre-administrar los conjugados diagnósticos o las composiciones farmacéuticas a un sujeto y registrar la imagen mediante un método de obtención de imágenes. Dichos métodos de obtención de imágenes se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en: ultrasonido, resonancia magnética, optoacústica, escintigrafía, tomografía computada por emisión de un fotón único (SPECT), tomografía por emisión de positrones (PET), rayos x, radiofrecuencia acústica y óptica.

Las afecciones patológicas caracterizadas por la expresión excesiva de una selectina preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en: síndrome coronario agudo (ACS), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, neo-angiogénesis asociada con tumores, artritis reumatoidea, lesión de reperfusión por isquemia, rechazo de injertos o, más en general, de cualquier órgano o tejido que expresa P-selectina y/o E-selectina por encima de niveles fisiológicos. Más preferiblemente, la afección patológica es IBD, ACS, cáncer o rechazo de injerto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

A menos que se indique otra cosa, la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de PSGL-1 humana a la que se refiere la presente invención se identifica mediante el núm. de acceso en GenBank Q14242.1. Este número de acceso identifica también dominios funcionales, tal como la región de péptidos de señalización de PSGL-1, comprendida desde aa 1-17, la región de pro-péptido comprendida desde aa 18 a 41, que identifica el comienzo de la proteína madura en aa 42 (correspondiente a aa 1 de SEQIDNO:11), los sitios de N- y O-glucosilación y los sitios de sulfatación.

La secuencia de aminoácidos de cremallera de leucina específica de retina neural (NRL) se identifica mediante NCBI Acc. N° NP_006168.1 (GI:1709348, humano). En la presente invención, la referencia a la proteína de cremallera de leucina específica de retina neural (NRL) comprende todas las secuencias de aminoácidos por lo menos 90% homólogas en la región de cremallera de leucina de NRL, incluida NRL de ratón (P54846).

En NRL, primero asilada y caracterizada por Swaroop et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89: 266-270, se han identificado polimorfismos de nucleótidos sencillos: están comprendidos, si son funcionales, en la presente invención; en la secuencia NP_006168.1, el dominio de cremallera de leucina se ha Identificado entre Ios aminoácidos 187-208. Los aminoácidos flanqueantes en el término N o en el término C de esta región, derivados de la secuencia NRL, también pueden ser pate del dominio funcional (motivo de dimerización no covalente).

Tal como se emplea en la presente memoria, el término "recombinante" se usa para describir ácidos nucleicos no naturales alterados o manipulados, células hospedantes transfectadas con ácidos nucleicos exógenos, o polipéptidos que se expresan de manera no natural a través de la manipulación de ADN aislado y transformación de células hospedantes. Recombinante es un término que abarca específicamente moléculas de ADN que se han construido in vitro usando técnicas de ingeniería genética, y el uso del término "recombinante" como adjetivo para describir una molécula, constructo, vector, célula transfectada, polipéptido o polinucleótido incluye dichas moléculas, constructos, vectores, células, polipéptidos o polinucleótidos, incluso si tienen una secuencia parcial idéntica a la molécula que ocurre naturalmente.

El término "polipéptido" se usa para hacer referencia a un compuesto de dos o más aminoácidos unidos a través de la cadena principal (en oposición a la cadena lateral) mediante un enlace amida peptídico (-C(:0)NH-). El término "péptido" se usa de manera intercambiable en este documento con "polipéptido" pero en general se utiliza para hacer referencia a polipéptidos que tienen menos de 40, y preferiblemente menos de 25 aminoácidos.

El término "proteína" se utiliza para hacer referencia a un compuesto de más de 40 aminoácidos unidos a través de la cadena principal (en oposición a la cadena lateral) por un enlace amida peptídico (-C(:0)NH-).

La expresión "proteína quimérica" o "proteína de fusión" o "quimera", tal como se emplea en la presente invención, comprende un polipéptido de PSGL-1 operativamente enlazado a por lo menos un polipéptido no PSGL-1. Un "polipéptido de PSGL-1" comparte la secuencia de aminoácidos de PSGL-1, preferiblemente humana, mientras que el "polipéptido no PSGL-1" tiene una secuencia de aminoácidos que no es sustancialmente homóloga a PSGL-1 y que deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. En una realización preferida, el "polipéptido PSGL-1" comprende la porción extracelular de PSGL-1 o sus fragmentos más cortos, incluso uniendo selectinas (en particular P y E selectina), tal como el fragmento 1-47 de PSGL-1 (SEQIDN0:11) que abarca aa 5-16, región que define la región de unión a selectina. La región de unión a selectina puede opcionalmente comprender aminoácido(s) flanqueante en el término N o C de aa 5-16 derivado de la secuencia de PSGL-1.

La "fusión" o "proteína quimérica" se expresa y produce en un sistema recombinante enlazando operativamente a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de PSGL-1 a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido no PSGL-1 condensados en marco entre sí bajo el control de regiones reguladoras de expresión eucariota, como un promotor o un sitio de poliadenilación.

El término "unión" se refiere a la determinación por ensayos estándar, incluidos aquellos descritos en este documento, que reconoce un polipéptido de unión y se une reversiblemente a una diana determinada. Dichos ensayos estándar incluyen, aunque sin limitarse a ello, diálisis de equilibrio, filtración en gel, resonancia de plasmones de superficie, ensayos de inmunoafinidad incluidos inmunoensayos competitivos y el monitoreo de cambios espectroscópicos que resultan de la unión.

Un "grupo de etiquetado" o "etiqueta detectable", tal como se emplea en esta memoria, es un grupo o resto capaz de generar una señal detectable. Se prefieren particularmente las etiquetas útiles para imágenes de diagnóstico, es decir, etiquetas detectables por resonancia magnética, detección radiactiva, ultrasonido, rayos X, luz (o bien UV, infrarroja, fluorescente, etc.) que portan un resto, tal como un metal u otra entidad, que se pueden usar en radioterapia u otras formas de terapia. Las etiquetas específicas se detallarán a continuación.

El término "especificidad" se refiere a un polipéptido de unión que tiene una afinidad de unión superior hacia una diana frente a otra. La especificidad de unión se puede caracterizar por una constante de equilibrio de disociación (Kd) o una constante de equilibrio de asociación (Ka) para los dos materiales diana ensayados. En una realización preferida, los polipéptidos de unión de la invención tienen una constante de disociación para una diana deseada que es inferior a aproximadamente 10 pM, más preferiblemente inferior a aproximadamente 1 pM, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,5 pM o incluso menos. La expresión "especificidad de selectina" se refiere a un resto de unión a PSGL-1 que tiene una afinidad mayor hacia por lo menos una selectina entre selectina P, L, E que una diana irrelevante.

El término "paciente", tal como se emplea en este documento, se refiere a cualquier mamífero, especialmente seres humanos.

La expresión vehículo o excipiente "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o excipiente no tóxico que se puede administrar a un paciente, junto con un compuesto de la presente invención, y que no destruye su actividad farmacológica.

El término "diana" o la expresión "molécula diana" se refiere a cualquier sustancia a la que se puede unir un resto de unión o un polipéptido de unión, tal como proteínas o polipéptidos, células, receptores, carbohidratos, lípidos, etc. Tal como se emplea en este documento, "diana" incluye la familia de Selectinas o bien en forma aislada o expresadas en o sobre la superficie de una célula, tejido u órgano. Por consiguiente, resto "dirigido", tal como se emplea en este documento, se refiere a una proteína PSGL-1 o sus fragmentos funcionales capaces de unirse a selectinas, preferiblemente P y E-selectinas, si no se especifica de manera diferente.

La expresión "agente terapéutico" o el término "terapéutico" se refieren a un compuesto o un agente que tiene un efecto beneficioso, terapéutico o citotóxico para, por ejemplo, células malignas in vivo. Los agentes terapéuticos incluyen aquellas composiciones a las que se hace referencia, por ejemplo, como agentes bioactivos, agentes citotóxicos, fármacos, agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, material genético, etc.

La expresión aminoácido "positivamente cargado" se refiere a aminoácidos en el siguiente grupo: Arginina, Histidina, Lisina. Estos aminoácidos usualmente se consideran "intercambiables", lo que significa que la sustitución de un residuo con otro en el mismo grupo es usualmente bien tolerada dentro de una proteína o polipéptido, incluso si esto puede no aplicarse cuando el residuo está comprendido en un dominio crítico de la proteína (tal como hélice alfa, saco de unión, una restricción estéricamente dependiente, etc.)

La expresión aminoácido "negativamente cargado" se refiere a aminoácidos en el siguiente grupo: ácido aspártico y ácido glutámico. Estos aminoácidos usualmente se consideran "intercambiables", lo que significa que la sustitución de un residuo con otro en el mismo grupo es usualmente bien tolerada dentro de una proteína o polipéptido, incluso si esto puede no aplicarse cuando el residuo está comprendido en un dominio crítico de la proteína (tal como un saco de unión o una restricción de una región estéricamente dependiente, etc.)

La expresión aminoácido con "cadena lateral no cargada polar" se refiere a aminoácidos en el siguiente grupo: Serina, Treonina, Asparagina y Glutamina. Estos aminoácidos usualmente se consideran "intercambiables", lo que significa que la sustitución de un residuo con otro en el mismo grupo por lo general es bien tolerada dentro de una proteína o polipéptido, con las excepciones ilustrativas anteriormente mencionadas.

La expresión aminoácido con "cadena lateral hidrófoba" se refiere a aminoácidos en el siguiente grupo: Alanina, Valina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina y Triptófano. Estos aminoácidos usualmente se consideran "intercambiables", lo que significa que la sustitución de un residuo con otro en el mismo grupo usualmente es bien tolerada dentro de una proteína o polipéptido, incluso si esto puede no aplicar cuando el residuo está comprendido en un dominio crítico de la proteína (tal como un hélice alfa, un saco de unión, una restricción estéricamente dependiente, etc.).

Los aminoácidos con funciones específicas en la proteína son aquellos comprendidos en el siguiente grupo: Cisteína, Glicina y Prolina. Dependiendo de si la función se realiza debido al tamaño del residuo, la glicina se puede reemplazar por otros residuos de tamaño más pequeño, tales como Serina o Alanina. En desacuerdo, la Cisteína no puede reemplazarse cuando está implicada en un puente disulfuro.

Por dominio de dimerización covalente, el Solicitante se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende una Cisteína que se puede unir en un puente disulfuro con otra cisteína en una cadena de polipéptidos diferente (puente disulfuro de cadena extra), estable en el entorno extracelular.

Por dominio de dimerización no covalente, el Solicitante se refiere a una secuencia de aminoácidos capaz de determinar y/o favorecer las interacciones proteína-proteína. Los dominios de dimerización no covalentes preferidos son hélice alfa estructural, determinados por repetición periódica de residuos leucina, usualmente denominados en la técnica "cremalleras de leucina".

Las regiones de aminoácidos de residuos de cremallera que se pueden utilizar de acuerdo con la invención están preferiblemente desprovistas de cualquier lisina (K o Lys). Los dominios de cremallera de leucina habitualmente son fácilmente identificables en proteínas "reguladoras" eucariotas, por repetición periódica de la leucina aa. Entre ellas, por ejemplo, la cremallera de leucina de Q9Y2D1, correspondiente a aa 236-250, o la cremallera de leucina del factor de transcripción de activación 5 (GI:114678546).

No obstante, las cremalleras de leucinas preferidas de acuerdo con la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en:

- un fragmento de proteína de cremallera de Leucina específica de Retina Neural, aislado de mamíferos y que comparte un grado de homología > 90% con los fragmentos 187-208 de la proteína NRL humana, incluso más preferiblemente dominios de la cremallera de leucina de NRL de ratón (Q543Y0) o NRL humana, isoforma 2 (P54845-2) o proteína bovina F1N4J1.

Descripción detallada

La invención se refiere a una proteína dimérica que comprende dos proteínas quiméricas PSGL-1 recombinantes, en donde la proteína quimérica PSGL-1 monomérica recombinante comprende un dominio de unión a selectina capaz de unirse específicamente a una proteína de selectina y que comprende por lo menos aa 5-16 de SEQIDNOíI 1 (secuencia PSGL-1 madura), dominio de cremallera de leucina a, a capaz de formar una hélice a del lado derecho, promoviendo así la dimerización a través de la interacción proteína-proteína y que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 187-208 de SEQIDNO:12 (Cremallera de Leucina específica de Retina Neural), y una región que promueve enlaces disulfuro que comprende por lo menos una cisteína disponible para formar un enlace disulfuro con otra cisteína en una contraparte de proteína quimérica, monomérica, de modo que los monómeros de las dos proteínas quiméricas están covalentemente enlazados entre sí por al menos un enlace disulfuro. El dominio de cremallera de leucina es más preferiblemente el dominio de cremallera de leucina de la Cremallera de Leucina específica de Retina Neural de ratón, preferiblemente correspondiente a por lo menos la región 187-208 de NP_006168.1 (SEQ ID NO: 12), o más preferiblemente por lo menos la región 181-215 de SEQ ID NO:12. Alternativamente, el dominio de dimerización no covalente comparte un grado de homología > 90% con el fragmento 187-208 de la proteína NRL humana, incluso más preferiblemente consiste en los dominios de la cremallera de leucina de NRL de ratón (Q543Y0) o NRL humana, isoforma 2 (P54845-2) o proteína bovina F1N4J1. Por dominios de unión a P-selectina, nos referimos en este documento a péptidos o polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos con afinidad de unión hacia selectinas ("secuencias activas"), particularmente hacia P-selectina; dichas secuencias activas comprenden por lo menos 5-16 aminoácidos (Cummings RD, Brazilian Journal of Medical and Biological research, 1999, 32:519-528) o preferiblemente se seleccionan entre los fragmentos 1-19, 5-41 y 1-47 de SEQ ID NO: 11 en donde el aminoácido 1 representa el primer aminoácido de la proteína PSGL-1 madura y corresponde a aa 42 del registro GenBank, núm de acceso Q14242.1.

La proteína PSGL-1 es un homodímero transmembrana enlazado por un enlace disulfuro en Cys 320, cercano al dominio transmembrana, como se define en el registro de GenBank. Hasta el momento, la dimerización de PSGL-1 recombinante se ha logrado introduciendo el dominio IgG 1 Fc en dirección 3’, un dominio de unión a selectina PSGL-1. El dominio Fc comprende una región bisagra que porta por lo menos dos cisteínas, enganchadas en puentes disulfuro para asociar de manera covalente la proteína quimérica en homodímeros. La región Fc de inmunoglobulina se ha utilizado en varios sistemas recombinantes para mejorar o facilitar la dimerización que es esencial para la unión de selectinas. Sin embargo, la presencia del dominio Fc presenta algunas desventajas. En primer lugar, se demostró que la PSGL-1 condensada a un dominio Fc, unido en la superficie de microvesículas de gas produce la formación de agregados (W02012/020030). Asimismo, el dominio Fc podría además desencadenar una reacción inmune, a través del reconocimiento específico del receptor Fc expresado por macrófagos. Esto podría conducir al aclaramiento de la molécula que porta el fragmento de la proteína Fc de la circulación sanguínea, o desencadenar una respuesta inmune tal como reacciones alérgicas.

De hecho, el mismo Solicitante de la presente invención ha descubierto que una región Fc más corta ofrece mejores propiedades a los derivados utilizados para la preparación de microburbujas. Dichas desventajas se han superado con la presente invención, en donde el dominio de cremallera de leucina de NRL humana reemplaza la región Fc. Esta región es preferiblemente el dominio de cremallera de leucina de la Cremallera de Leucina específica de Retina Neural, que comprende por lo menos aa 187-208 de NP_006168.1 o preferiblemente aa 186-209, 185-210, 184-211, 183-212, 182-213, 181-214, 181-215, 186-208, 186-210, 187-208 o cualquier fragmento que comprenda por lo menos aa 187­ 208 más 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos flanqueantes adicionales en el término N o C, o ambos, desde la región 181 -215 de la secuencia NP_006168.1 (SEQIDN0:12).

El Solicitante ha descubierto que el dominio de cremallera de leucina de las proteínas reguladoras de ADN NRL, no solamente permite una dimerización covalente eficiente del monómero quimérico favoreciendo la formación de puentes disulfuro, sino que además proporciona una expresión y segregación muy eficientes de la proteína funcional dimérica en sistemas recombinantes mamíferos.

Incluso más sorprendentemente, esta nueva proteína quimérica está correctamente modificada de forma post­ traducción, es decir está correctamente 0-glucosilada y sulfatada en Tyr en la región PSGL-1 esperada, está dimérica y covalentemente unida por puente(s) disulfuro y une dianas de selectina con una afinidad superior o por lo menos equivalente al Fragmento 1 (Fr-1) optimizado, descrito en el documento W02012/020030. Estas conclusiones se han obtenido con un número de datos que se han detallado mejor en la parte experimental.

Los hallazgos anteriores son bastante sorprendentes, ya que la proteína quimérica presente (ligando 1 de la glucoproteína P-selectina y Cremallera de Leucina específica de la Retina Neural), en este documento denominada sPSGL-1-NRL, es la combinación de dominios de proteínas no relacionadas y es incluso más peculiar cuando se compara con los niveles de expresión de otras proteínas quiméricas modificadas genéticamente para portar el dominio de unión a selectina PSGL-1 como la región N-terminal, condensada en marco con otros dominios de dimerización utilizados en la técnica, tal como el fragmento lgG1 Fc.

Específicamente, en una de las realizaciones preferidas de la invención, el dominio PSGL-1 1-47 de SEQlDN0:11 se ha condensado en marco con:

- un dominio de dimerización covalente, que comprende por lo menos una cisteína como se define a continuación, preferiblemente seguido o alternativamente precedido y condensado en marco con un dominio de dimerización no oovalente (o dominio de estabilización), tal como la cremallera de leucina de NRL, en lugar del dominio Fc o CH3 de lgG1 humana;

- opcional y preferiblemente un espaciador en el término C, para evitar cualquier impedimento estérico con grupos o restos que se han de enlazar en el término C, y

- un péptido de señalización para segregación en el término N de la proteína quimérica, que es adecuado para ser escindido en la proteína quimérica madura y que preferiblemente no es la señal de PSGL-1 endógena ni la secuencia pro-péptido.

Entre las varias Variantes que se han producido y ensayado para expresión en un sistema mamífero: las Variantes 1 y 1A, que representan realizaciones preferidas de la presente invención de la proteína quimérica PSGL-1-NRL (s EQIDNO:2 y SEQlDNO:37), Variante 2 (SEQlDNO:4), que corresponde a la PSGL-1 condensada en marco con la bisagra lgG1 humana y el dominio CH3, utilizadas respectivamente como dominios de dimerización covalente y no covalente (o estabilización), o Variante 5 (SEQlDNO:10), que comprende los mismos dominios funcionales del Fragmento 1 optimizado descrito en el documento W02012/020030 preparado para propósitos comparativos. Cabe destacar, en las variantes de proteínas de interés, que los listados de secuencias mencionados anteriormente identifican un péptido de señalización que se escinde en la forma madura expresada.

En particular, se ha observado que solamente la cremallera de leucina de NRL que contiene la Variante 1 proporciona niveles de expresión que son adecuados para la producción de un agente farmacéutico. Los datos comparativos de la expresión relativa de las Variantes 1 -5, expresadas en el mismo sistema celular se exponen en la Figura 1, en donde el nivel de expresión de las proteínas quiméricas marcadas se ha evaluado por expresión transitoria, SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes y análisis Western-blot con un anticuerpo dirigido a una marca común (es decir, el octapéptido FLAG) dispuesto en el término C. En consecuencia, sin estar vinculados a una teoría particular, se cree que la presencia de un dominio de dimerización no covalente tal como una cremallera de leucina y más preferiblemente la cremallera de leucina de NRL que favorece la interacción proteína-proteína, en una proteína que es fisiológicamente un dímero (PSGL-1), resulta, o bien por un pliegue favorable o un efecto de estabilización de la proteína quimérica final de la presente invención, en mejores niveles de expresión, que además se pueden optimizar por aislamiento de clones sencillos y estabilización en cultivo. Las titulaciones provistas después de una selección clonal preliminar están muy por encima de 0,1 g/l.

En la proteína quimérica de la presente invención, el dominio de dimerización covalente, alternativamente llamado región promotora de enlace(s) disulfuro, comprende por lo menos un residuo Cys disponible para formar un enlace disulfuro con otro Cys en una contraparte de proteína quimérica, monomérica, de modo tal que los dos monómeros de la proteína quimérica están covalentemente unidos a través de por lo menos un puente disulfuro.

Una fórmula general que abarca el dominio de dimerización covalente es:

(X1)n-C(X2)m-(Xa),

en donde X 1 y X2 representan cualquier aminoácido o secuencia de aminoácidos con la exclusión de Cys; C es cisteína, X3 es cualquier aminoácido y n y m son números enteros comprendidos por 1-6. X1 preferiblemente comprende una Prolina, Histidina o Treonina; incluso más preferiblemente comprende una Prolina y una Histidina, o una Histidina y una T reonina, o una prolina y una T reonina. Según una realización preferida, X1 comprende una prolina, una Histidina y una Treonina, preferiblemente en este orden, y n es como máximo 5. X2 es cualquier aminoácido o secuencia de aminoácidos con la exclusión de Cys y preferiblemente comprende Prolina. Preferiblemente, X2 es Pro­ Pro; X3 es preferiblemente Cisteína y comprende por lo menos una Prolina. Más preferiblemente, la región que porta la cisteína es la región bisagra lgG1, o sus fragmentos funcionales. Una región promotora de enlaces disulfuro preferida es: PHTCPPCP (SEQlDN0:20).

De acuerdo con una realización preferida, la proteína quimérica comprende además un espaciador en el término C, que comprende un residuo adecuado para bioconjugación covalente con otro péptido o restos químicos, tal como obtención de imágenes y/o restos terapéuticos. Los aminoácidos ilustrativos para bioconjugación son cisteína y lisina. El espaciador tiene aproximadamente 4-20 aminoácidos de longitud y comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: Gly, Ser, Pro, Ala, Val, Leu; porta una cisteína o lisina en su término C, preferiblemente en la penúltima posición. El espaciador es preferiblemente una poli-glicina que incrusta una alanina u otro aminoácido neutro, tal como valina o similar, y porta una cisteína o lisina, preferiblemente una lisina, en donde dicho aminoácido de conjugación es seguido por Gly, Ser, Pro, Ala, Val, Leu, preferiblemente por lo menos un Gly. El espaciador tiene preferiblemente la secuencia G4AG4KG (SEQlDN0:17). Alternativamente, la proteína quimérica comprende una secuencia Flag en su término C, es decir, para propósitos de identificación y purificación. El experto en la técnica utiliza comúnmente las secuencias Flag y se conocen en el campo. Un ejemplo es la secuencia DYDDDDK (SEQlDN0:35), que permite el reconocimiento y/o la purificación de proteínas por inmunoafinidad con anticuerpos adecuados. De acuerdo con una realización preferida, la proteína monomérica se traduce como precursor con el péptido de señalización y luego se procesa y finalmente segrega en el medio de cultivo (medio acondicionado} como un homodfmero después de la escisión del péptido de señalización.

Un péptido de señalización para segregación está presente en el término N del precursor de la proteína quimérica. Preferiblemente, el péptido de señalización es el péptido de señalización IgH de ratón, que tiene la secuencia: MEWSWWVFLFFLSVTTGVHS (SEQIDNO:18). Se pueden emplear otros péptidos de señalización (o péptidos líderes}, como la secuencia de péptidos de señalización endógenos PSGL-1 u otras secuencias de péptidos de señalización heterólogos comúnmente utilizadas en la técnica de expresión de proteínas recombinantes, permitiendo la segregación de proteínas recombinantes procesadas post-traducción. Un ejemplo de algunos péptidos de señalización (o líderes} conocidos en el campo se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de péptidos de señales líderes

Como alternativa a la SEQIDNO:18, cualquiera de Ios péptidos de señalización anteriores de las SEQIDNO:24 a SEQIDNO:34 se pueden utilizar para lograr la segregación de la proteína recombinante.

La proteína recombinante quimérica PSGL-1-NRL de la presente invención une eficientemente P/E selectina en una forma dimérica en donde cada monómero es PSGL-1 recombinante como se definió anteriormente y se produce en una forma correctamente glucosilada y sulfatada. Varios estudios publicados hasta ahora han revisado los requerimientos post-traducción de PSGL-1 para la unión de P/E/L selectina, es decir, la glucosilación, sulfatación, y mapearon los residuos importantes para este procesamiento y para unión a selectina (R.D Cumming, Braz. J. Biol. Res., 1999, 32(5): 520-528 and D. Sako Cell, 1995, 83: 323-331).

En la realización preferida de la proteína quimérica de acuerdo con la presente invención, la sialilación (presencia de ácido siálico) se ha evaluado por cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) después de un tratamiento ácido leve. El contenido de residuos de sialilo de las proteínas recombinantes de la invención puede estar comprendido entre aproximadamente 5% y 30% p/p, 10% a 28% p/p, 15% a 25% p/p, más preferiblemente 15% a 25%.

Con el fin de caracterizar la proteína quimérica recombinante, se llevó a cabo el mapeo de péptidos con Asp-N y digestión enzimática de quimotripsina.

La ciclización de glutamina N-terminal (Gln) a piroglutamina (pGlu), sulfatación de Tyr, O-glucosilación de Thr (presencia de Core 2 SLex) y estructura dimérica también se han evaluado y se detallan mejor en la parte experimental.

La estructura dimérica de las proteínas se ha confirmado por escisión de quimotripsina, que provee un fragmento (TCPPCPL⁾² de acuerdo con una realización preferida de la proteína recombinante.

La sulfatación de residuos tirosina N-terminal (Y) 5, 7 y 10 se ha confirmado por digestión de Asp-N. La O-glucosilación con un motivo de tetrasacárido SLex se ha confirmado en treonina 16 por escisión de quimotripsina.

A partir de lo anterior, se puede concluir que, en las proteínas quiméricas, el dominio N-terminal de PSGL-1 importante para la unión a selectina, es correctamente sulfatado en los residuos Tyr correspondientes a la posición 5, 7 y 10 de la proteína PSGL-1 madura, y glucosilado, en particular glucosilado enlazado en O en el residuo treonina en la posición 16; los glicanos O-enlazados típicamente comprenden residuos azúcar tales como N-acetilgalactosamina (GalNac), N-acetilglucosamina (GlcNAc), fucosa, glucosa, galactosa, mañosa (Man), hexosa, xilosa, ácido siálico o mezclas de estos.

Estas modificaciones post-traducción (PTM) se han resumido en la SEQIDNO:38.

Los glicanos O-enlazados preferiblemente presentes en la porción PSGL-1 de la proteína quimérica de la presente invención son preferiblemente GalNac, GlcNAc, fucosa, ácido siálico y galactosa. Los glicanos O-enlazados en PSGL-1 son preferiblemente sialilados y fucosilados y preferiblemente consisten en estructura de glicano sialilo Lewis X (sLex, ácido siálico-galactopiranosil-fucosa-N-acetilglucosamina) unidos a residuos treonina.

Este tipo de modificación post-traducción se ha descrito como esencial para la unión de P-selectina (R.D Cumming, Braz. J. Biol. Res., 1999, 32(5): 520-528 and D. Sako Cell, 1995, 83: 323-331).

Se forman los dímeros y cada monómero se enlaza en forma covalente mediante por lo menos un puente disulfuro al otro.

El procesamiento post-traducción correcto de las proteínas quiméricas se ha logrado por expresión en células mamíferas tales como células HEK-293, COS-1 o CHO, que se han utilizado en el pasado para la expresión de PSGL-1. En cualquier caso, PSGL-1 preferiblemente se co-expresa en células mamíferas junto con C2GnT (core 2 ^1-6-N acetilglucosaminiltransferasa) y o bien una enzima fucosil-transferasa tal como una de las siguientes: Fuc-TIII (Fuc-T: fucosiltransferasa), Fuc-IV o Fuc TVII (Fugang Li et al. J. Biol. Chem, 1996, 271:3255-3264) o sus fragmentos funcionales. Preferiblemente, se usan Fuc TVII o sus fragmentos funcionales. Las células, preferiblemente CHO adaptadas al crecimiento en suspensión, se dejan crecer durante por lo menos 7 días, usualmente hasta 14 días, usando medio OptiCHO™ (LifeTechnology) (se puede usar exitosamente otro medio definido químicamente libre de suero, p. ej., ActiCHO™ de GE/PAA, FortiCHO™, CellVento™ CHO 200 y CellVento™ CHO 220 de Millipore, 83836C de SAFC, BalanCD™ de Irvine, EX-CELL® de Sigma-Aldrich y similares) y en ausencia de presión de selección. Glutamina (o el análogo GlutMax™) enriquecida a 1-10 mM, preferiblemente 4-8 mM. OptiCHO™ y ActiCHO™ (LifeTechnology) se prefieren para propósitos de expresión.

La proteína quimérica se puede purificar hasta el nivel de pureza requerido mediante una cromatografía de tres pasos que comprende: un intercambio aniónico, una interacción hidrófoba y una cromatografía de hidroxiapatita (HA) por exclusión de tamaño. Se prefiere la purificación que comprende la columna de HA como la última etapa de purificación y proporciona una proteína quimérica pura de grado terapéutico.

Por consiguiente, de acuerdo con otra realización, la presente invención comprende un proceso de purificación para la proteína quimérica como se definió anteriormente, que comprende como la etapa una cromatografía de hidroxiapatita (HA). Más preferiblemente, el proceso de purificación comprende una primera cromatografía que se lleva a cabo en un intercambio aniónico (AE) fuerte, una segunda cromatografía que se lleva a cabo en una fase sólida de interacción hidrófoba (Hl) y una tercera etapa que se lleva a cabo en HA, preferiblemente hidroxiapatita cerámica.

Más en general, la presente invención se refiere a un proceso para la purificación de cualquier proteína quimérica o de fusión que contiene PSGL-1 soluble, en donde dicha PSGL-1 comprende por lo menos aa 5-16 de la PSGL-1 madura (SEq IDNO:11), que además comprende uno o más aminoácidos flanqueantes en el término N o C de dicho fragmento 5-16.

Más preferiblemente, el fragmento de PSGL-1 en la proteína quimérica comprende todos los aminoácidos flanqueantes hasta por lo menos aa 1-47 de la PSGL-1 madura. Incluso más preferiblemente, la proteína quimérica comprende además por lo menos aa 187-208 de SEQlDNO:12 (Cremallera de Leucina específica de Retina Neural) o una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a dicha región 187-208 y un dominio de dimerización covalente como se definió anteriormente con la fórmula general. Una realización general para la proteína quimérica tiene SEQlDNO:39.

No obstante, el proceso de purificación de la invención, que comprende HA como la última etapa, se puede aplicar exitosamente a cualquier proteína quimérica o recombinante que porta en el término N, la región N terminal de PSGL-1 madura que comprende por lo menos aa 5-16 o 1 -47 de PSGL-1.

El proceso que comprende HA como la última etapa de purificación permite lograr una pureza de la PSGL-1 superior a 95%, preferiblemente 96%, 97%, 98% o 99% que otras proteínas y sustancialmente libre de ADN contaminante, según lo medido, por ejemplo, por ensayos comerciales de cuantificación de ADN, como el ADN Quantitation Kit, Fluorescence Assay (Sigma).

En cuanto a los rendimientos finales, la proteína diana se recupera mediante el proceso descrito anteriormente con rendimientos encima de 50% del contenido diana quimérico total, típicamente encima de 60% y en general aproximadamente o encima de 70%. Estos rendimientos representan un buen resultado y, lo más importante para un proceso industrial, es que están bastante estandarizados y se pueden reproducir con muy bajas variaciones.

Las resinas o columnas comerciales estándar con estas funciones se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La HA cerámica se comercializa, p. ej., de BIORAD. Las condiciones de purificación y elución se pueden ajustar como es sabido por el experto en la técnica.

Para facilidad de ampliación, la elución en gradiente se puede sustituir ventajosamente con elución gradual discreta, con el fin de limitar el número de análisis en proceso y reducir el tiempo total del proceso. La proteína purificada (pureza > 90%), en las realizaciones preferidas de la Variante 1 y 1A que se describen a continuación, se caracterizó y:

• Se confirmó la eliminación correcta del péptido líder;

• La estructura del término N de la glucoproteína PSGL Variante 1A es principalmente la forma piroglutámica pQATEYEYL. De hecho, el uso de la enzima de digestión Asp N permitió la detección de la ciclización Gln del término N, el proceso mediante el cual el residuo Gln presente en el término N tiende a someterse a ciclización espontánea para formar ácido piroglutámico;

• El carácter dimérico de la PSGL Variante 1A se ha confirmado por electroforesis en gel bajo condiciones reductoras y no reductoras y digestión enzimática seguida de caracterización de fragmentos usando LC-MS. Los datos experimentales muestran que PSGL Variante 1A podría estar completamente bajo su forma dimérica;

• La presencia del resto O-glicano en Thr16 se ha confirmado y su estructura ha sido identificada. El motivo X sialilo Lewis, una estructura Core 2 que comprende N-Acetilgalactosamina, N-Acetilglucosamina, galactosa, fucosa y ácido siálico se ha demostrado, como se detalla mejor en la parte experimental;

• La sulfatación de los residuos Y5, Y7 y Y10 de la proteína madura importante para la unión tanto a L como a P selectina también se ha confirmado. El monitoreo de la sulfatación de glucoproteína se efectuó por espectrometría de masas. Como se conoce en la técnica, la sulfatación de Tirosinas 5, 7 y 10, demostrada en la proteína quimérica diana presente, es extremadamente importante para la bioactividad de PSGL-1 y Variante 1A.

Se han aportado datos adicionales de caracterización de proteínas en la presente solicitud y se detallan mejor en la parte experimental.

Por lo tanto, de acuerdo con el aspecto principal, la invención se refiere a una proteína quimérica PSGL-1 aislada y purificada, como se definió anteriormente, capaz de unirse a P, L y E selectinas, preferiblemente a P selectina.

La proteína recombinante aislada es un homodímero en donde cada homodímero tiene una secuencia primaria que comprende o preferiblemente que consiste en, las siguientes secuencias de aminoácidos, más preferiblemente en este orden:

- aminoácido 1-47 de la proteína PSGL-1 madura (SEQIDNO:11) en el término N;

- por lo menos una secuencia de aminoácidos que comprende o que consiste en una cisteína adecuada para un puente disulfuro con la fórmula: (X1)n-C(X2)m-(X3), como se definió anteriormente, más preferiblemente SEQIDNO:20;

- por lo menos aa 181-215 de la NRL (SEQIDNO:12);

- opcionalmente, un espaciador de aminoácidos de hasta 15 aa de longitud, que porta: por lo menos uno o más Gly y/o Ala, y preferiblemente un aminoácido tal como Lys o Cys en el término C o, más preferiblemente en la penúltima posición. Más preferiblemente, dicho espaciador es una poliglicina, hecha de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 glicinas, que preferiblemente comprende e incrusta por lo menos una alanina, más preferiblemente que además comprende una lisina en la penúltima posición para posterior conjugación química. Incluso más preferiblemente, el espaciador de aminoácidos es SEQIDNO:17. En consecuencia, en una realización particularmente preferida, la proteína quimérica tiene la secuencia SEQIDNO:37, en donde el péptido de señalización, escindido en la proteína madura, todavía se representa. Un monómero de proteína diana quimérica modificado post-traducción se representa en SEQIDNO:38 como una realización preferida.

Una fórmula general de la proteína variante quimérica con motivos o regiones esenciales para:

- unión a selectina, como se definió anteriormente en detalle,

- dimerización covalente (a saber, un motivo que comprende Cys con regiones flanqueantes),

- la dimerización no covalente (a saber, un motivo que comprende por lo menos NRL aa 187-208), preferiblemente que comprende residuo(s) para conjugar la proteína quimérica, preferiblemente en la última o penúltima posición (a saber, Lys o Cys) también se ha descrito en SEQIDNO:39.

La pureza de la proteína quimérica PSGL-1 aislada y purificada se puede determinar por UPLC-UV o resonancia por plasmones de superficie, p. ej., en un aparato Biacore, como se describe en más detalle en la parte experimental.

La presente invención también se refiere a cualquier secuencia de ADN que codifica la proteína anterior en la forma monomérica, preferiblemente que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-118 de SEQIDNO:2 de la proteína quimérica como se definió previamente.

De acuerdo con una realización particularmente preferida, la secuencia de nucleótidos abarca nt 1-354 de SEQIDNO:36 y preferiblemente consiste en el nucleótido 1-360. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la proteína quimérica de la presente invención comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de unión a P-selectina de PSGL-1, preferiblemente aa 1-47 de SEQIDNO:11 y la secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos aa 187-208 del dominio de cremallera de leucina específico de Retina Neural (SEQIDNO:12), que opcionalmente comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 aminoácidos flanqueantes en el término N o C, o más preferiblemente que codifica por lo menos aa 181-215 de la NRL (SEQIDNO:12).

La redundancia del código genético permite que se usen diferentes codones para un solo aminoácido, por ende, diferentes combinaciones de codones, es decir diferentes secuencias de ADN, permiten expresar la proteína con la misma secuencia de aminoácidos primaria y producir la misma proteína recombinante. Dichas diferentes secuencias de ADN, que se pueden diseñar para optimizar la expresión en el sistema recombinante seleccionado usando codones preferenciales para cada organismo, están por lo tanto todas comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Una proteína quimérica recombinante particularmente preferida abarca aa 1-118 de SEQIDNO:2, codificada por nt 1 -354 de SEQIDNO:1. Los aminoácidos 1-118 de SEQIDNO:2 opcionalmente comprenden además en el término C por lo menos un aminoácido adecuado para conjugación química con grupos reactivos de un etiquetado o restos terapéuticos, en donde dicho aminoácido es Lisina o Cisteína. Más preferiblemente, a dicho aminoácido reactivo le sigue por lo menos otro aminoácido no cargado, preferiblemente Glicina. Incluso más preferiblemente, el aminoácido adecuado para conjugación se dispone en el término C de una secuencia de aminoácidos de hasta 15 aa y le sigue por lo menos un aminoácido neutro o no cargado, tal como Glicina.

La invención comprende además un vector de expresión que comprende dicha secuencia de ADN y el clon de la célula transfectada que porta la secuencia recombinante, o bien transitoriamente o establemente integrada en el genoma. Los clones celulares preferidos son aquellos que portan copias de ADN establemente integradas del vector, como aquellas obtenidas en células CHO, más preferiblemente en células CHO adaptadas de crecimiento en suspensión, que se comercializan, por ejemplo, en el kit Freedom™ CHO-S™ de Lifescience (ThermoFisher Scientific) junto con un vector de expresión utilizado en forma estándar para expresión de células mamíferas.

Las células CHO adaptadas en suspensión se pueden ampliar y desarrollar hasta una densidad de aproximadamente 2,107 células/l, con el fin de lograr segregación de alta eficiencia de la proteína recombinante.

De acuerdo con otro aspecto, la invención comprende el proceso para preparar la proteína quimérica recombinante como se definió anteriormente, que comprende transformar una célula eucariota con la secuencia de ADN que la codifica o el vector que comprende la secuencia de ADN que la codifica para lograr un sistema eucariota recombinante, preferiblemente un sistema de células CHO que expresa establemente la proteína quimérica y en donde dicha proteína quimérica preferiblemente se segrega en el medio, cosechando el medio de cultivo y recuperando la proteína recombinante de dicho medio de cultivo por purificación. La proteína quimérica recombinante purificada puede luego conjugarse exitosamente a través del residuo del término C para restos diagnósticos y/o terapéuticos, o usarse como tal, es decir, en combinación con ingredientes o excipientes adecuados en composiciones farmacéuticas.

Conjugados de la proteína quimérica para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas

La proteína quimérica de la presente invención se usa para seleccionar restos activos desde el punto de vista diagnóstico y terapéutico enlazados a esta, para tejidos, células u órganos que expresan selectina. La especificidad de la proteína quimérica que es provista por la región PSGL-1 o sus fragmentos, se dirige a selectinas si están correctamente modificadas en forma post-traducción (Liu et al. J. Biol. Chem., 1998, 273:7078-7087). Se ha confirmado en este sistema de expresión que la fuerza de unión a la diana no se altera con la presencia de dominios de dimerización no covalentes tales como cremalleras de leucina que están dotadas por una estructura secundaria muy peculiar.

Por consiguiente, de acuerdo con una de las realizaciones principales, la presente invención se refiere a conjugados que comprenden la proteína quimérica como el agente dirigido de restos de obtención de imágenes para células, tejidos, órganos, etc. que expresan selectina.

Por "restos de obtención de imágenes" nos referimos a cualquier resto detectable por procedimientos de imágenes diagnósticas, es decir, cualquier resto eficaz desde el punto de vista diagnóstico para proporcionar, mejorar o, en cualquier forma, modificar ventajosamente la señal detectada por una técnica de diagnóstico por imágenes actualmente en uso, como: ultrasonido (US), tomografía computada (TC), resonancia magnética (RMN), tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computada por emisión de fotón único (SPECT), imágenes de rayos X, imágenes fotoacústicas, imágenes por fluorescencia e imágenes ópticas, que en la presente invención comprende imágenes intraoperativas, es decir, cualquier técnica que permita el registro de imágenes preferiblemente contrastadas útiles desde el punto de vista diagnóstico. También se contemplan en la presente invención los métodos de imágenes híbridas, en donde la proteína quimérica se enlaza a por lo menos dos restos detectables con diferentes métodos de obtención de imágenes. Ejemplos de imágenes híbridas son PET/CT, SPECT/TC, MR/PET, MR/SPECT; ultrasonido y MR, ultrasonido y CT; MR y TC.

El resto de obtención de imágenes puede comprender cualquier combinación posible de los restos de obtención de imágenes para detección dual, por ejemplo, para MRI/PET puede comprender una unidad quelante metálica paramagnética y una unidad quelante de radionúclido. Los ejemplos de restos eficaces desde el punto de vista diagnóstico de acuerdo con la invención comprenden, por ejemplo, radionúclidos de emisión de positrones o gamma quelados; iones metálicos paramagnéticos en la forma de complejos quelados o poliquelados, agentes absorbentes de rayos X que incluyen átomos que tienen un número atómico mayor que 20; una molécula de tinte; una molécula fluorescente; una molécula fosforescente; una molécula que absorbe en el espectro de UV; un quantum dot; una molécula capaz de absorción dentro de cerca o lejos de las radiaciones infrarrojas y, en general, todos los restos que generan una señal detectable o interactúan específicamente con un sistema de detección. A partir de lo antedicho, el experto en la técnica sabe que la modalidad de adquisición de imágenes que se ha de utilizar se debe seleccionar de acuerdo con el resto detectable de imágenes al que están unidos los compuestos diagnósticos de la invención. De modo que, por ejemplo, para un resto de obtención de imágenes fluorescentes tal como CyC5 enlazado a la proteína quimérica, será apropiado un sistema de detección de luz de fluorescencia.

La tabla a continuación ofrece algunos agentes productores de contraste ilustrativos y la modalidad de obtención de imágenes preferida.

Tabla 2. Agentes ilustrativos que producen contraste y modalidad de obtención de imágenes preferida

Conjugación de la proteína quimérica para restos de diagnóstico y tratamiento para selección molecular.

La preparación de conjugados de la proteína quimérica de la invención usualmente se lleva a cabo por medios químicos.

Los grupos reactivos de las parejas de conjugación, es decir, la proteína quimérica y el grupo(s) que se ha de conjugar a esta, están presentes o se preparan en forma "protegida", En la presente descripción, a menos que se indique algo distinto, la expresión "grupo protector" designa un grupo protector adaptado para conservar la función química característica del grupo funcional al que se une, Concretamente, en el presente contexto, los grupos protectores se usan para conservar funciones amino o carboxilo, Los grupos protectores apropiados pueden por lo tanto incluir, por ejemplo, Fmoc, bencilo, benciloxicarbonilo o alquil ésteres u otros grupos comúnmente destinados a la protección de dichas funciones, y se conocen en la técnica,

Otros grupos químicos, capaces de reaccionar químicamente con el grupo N-terminal (-NH²) o el grupo C-terminal (-COOH) de una unidad de polipéptidos, tal como la proteína quimérica de la invención transformando dicho grupo, a través de una reacción química, en un derivado adecuado que mantiene la especificidad del correspondiente polipéptido/proteína hacia selectina, pero incapaz de reaccionar químicamente con, respectivamente, una funcionalidad carboxilo o amino en un resto diferente, se denominan "grupos desactivantes", Los grupos desactivantes no deben implicarse en las reacciones de reticulación de carboxamido, Un ejemplo se representa con el grupo acetilo [también denominado CH³(CO)- o incluso Ac], utilizado para desactivar el término amino de una cadena de péptidos convirtiéndola en el correspondiente grupo AcHN- acetilado, no reactivo,

Por otra parte los grupos amino propiamente dichos y sus derivados tales como, por ejemplo, -NH² , -NH(CH3) o H²NOC-CH²-NH- se pueden usar como "grupos desactivantes" para el grupo carboxilo libre, proporcionando las correspondientes amidas no reactivas -CONH² , - CONH(CH3) o -CONH-CH²-CONH² , respectivamente,

Por ejemplo, si la proteína quimérica incluye un grupo amino reactivo (p, ej,, un grupo amino primario de Lisina), se puede someter a reacción con un resto diagnóstico, tal como un componente de microvesículas que contiene un resto reactivo correspondiente adecuado, tal como un grupo isotiocianato (para formar un enlace tiourea), un éster reactivo (para formar un enlace amida), un grupo carbonilo (para formar un enlace imina, que se puede reducir a un enlace amina), un grupo hidroxilo activado, p, ej,, en la forma de un grupo tosilato, un grupo hidroxilo activado, p, ej,, en la forma de un tosilato, tresilado o cianato, una vinilsulfona o un epóxido,

Alternativamente, cuando el ligando dirigido de la presente invención incluye un grupo reactivo tiol, un resto reactivo complementario adecuado en el resto diagnóstico o terapéutico, es decir un componente de microvesículas puede incluir derivados haloacetilo, maleimidas (para formar un enlace tioéter) o un disulfuro mixto que comprende un sulfuro en la forma de un grupo 2-piridiltio (PDT) (que, tras la reacción con un tiol derivado del ligando dirigido, resulta en la formación de un enlace disulfuro estable), un grupo hidroxilo activado, p, ej,, en la forma de un tosilato, tresilado o cianato, una vinilsulfona o un epóxido,

Alternativamente, de acuerdo con una realización de la invención, un ligando dirigido que contiene un resto reactivo amino (p, ej,, un grupo amino primario, en particular el grupo -NH² terminal) se puede someter primero a reacción con un compuesto que contiene azufre, para introducir un resto tiol reactivo en el ligando dirigido, que luego se somete a reacción con un resto complementario correspondiente en el componente diagnóstico, es decir, un componente de microvesículas como se ilustró anteriormente. Los ejemplos adecuados de compuestos que contienen azufre útiles para introducir un resto tiol reactivo en un ligando diana que contienen un resto amino reactivo incluyen, por ejemplo: tioimidato (tal como reactivo de Traut) N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) o N -succinimidil 3-(2-piridiltio)propionato (SPDP). La descripción detallada de los agentes que contienen S y las respectivas reacciones de tiolación se pueden hallar, por ejemplo, en el libro de Greg T. Hermanson: "Bioconjugate Techniques", Elsevier ed., 2a ed. (abril 2008), capítulo 1, sección 4-1. Por ejemplo, se puede preparar un fosfolípido derivado de maleimida (p. ej., fosfatidiletanolamina - PE - o PE pegilado) y someterse a reacción con un ligando dirigido (p. ej., SEQ ID NO:3) en donde el grupo amino primario (p. ej., -NH² de la cadena lateral de lisina) se ha sometido previamente a reacción con un compuesto que contiene azufre (tal como aquellos ilustrados previamente), para introducir un resto tiol reactivo; el compuesto obtenido puede luego usarse en la preparación de microvesículas rellenas con gas dirigidas. Según otra alternativa, cuando el ligando dirigido incluye un grupo carboxílico reactivo, los restos reactivos adecuados en el grupo diagnóstico o terapéutico, es decir, el componente de microvesículas, pueden ser aminas e hidrazidas (para formar funciones amida o N-acilo, N'-alquilhidrazida).

De acuerdo con la realización preferida anterior, el ligando dirigido que contiene un resto reactivo amino (p. ej., en un residuo lisina), se puede someter a reacción con un compuesto que contiene maleimida, para introducir un resto maleimida reactivo en el ligando dirigido, que luego se somete a reacción con un resto complementario correspondiente en el componente de microvesículas. Los agentes que contienen maleimida útiles para introducir un resto maleimida reactivo en un ligando dirigido que contiene un resto amino reactivo y reacción respectiva de adición del grupo maleimida se conocen en la técnica. Los ejemplos adecuados de compuestos que contienen maleimida incluyen, por ejemplo: AMAS (N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida éster), BMPS (N-(p-maleimidopropoxil)succinimida éster), EMCS (N-(s -maleimidocaproiloxi)succinimida éster), GMBS (N-(Y-maleimidobutiriloxi)succinimida éster), LC-SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato)), MBS (m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccimida éster), SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), SMPB (succinimidil-4-(pmaleimidofenil)butirato), reactivo SM(PEG)n (succinimidil-(N-maleimidopropionamido)-etilenglicol) éster), SMPH (succinimidil-6-((p -maleimidopropionamido) hexanoato)), sulfo-EMCS (N-(s -maleimidocaproiloxi) sulfosuccinimida éster), sulfo-GMBS (N-(y-maleimidobutiroiloxi)sulfosuccinimida éster), sulfo-KMUS (N-(K-maleimidoundecanoiloxi)-sulfosuccinimida éster), sulfo-MBS (m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida éster), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato), sulfo-SMPB (sulfosuccinimidil 4-(pmaleimidofenil(butirato)).

Otros reactivos análogos pueden contener grupos reactivos sulfhidrilo diferentes de maleimida, p. ej., LC-SPDP (succinimidil 6-[3-2-piridiltio)propionamido]hexanoato, NHS-Bromoacetato (N-hidroxisuccinimidil bromoacetato), NHS-Yodoacetato (N-hidroxisuccinimidil yodoacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato), SULFO-LC-SPDP (sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridiltio)propionamido]hexanoato).

De acuerdo con la realización de microvesículas para imágenes de diagnóstico por ultrasonido, se puede someter a reacción un fosfolípido que contiene tiol (p. ej., fosfatidiletanolamina tiolada - PE - o PE pegilada) con el ligando dirigido en donde un grupo amino primario (p. ej., NH² de la cadena lateral de lisina) se ha sometido previamente a reacción con un compuesto reactivo tiol (p. ej., una maleimida tal como aquellas previamente ilustradas), para introducir allí un resto reactivo tiol; el compuesto obtenido se puede usar luego en la preparación de las microvesículas u otros conjugados diagnósticos o terapéuticos.

En la proteína quimérica de la invención, los conjugados preferiblemente se preparan en el término C de la proteína quimérica, dejando el término N disponible para unión con la diana de selectinas.

Restos eficaces desde el punto de vista diagnóstico para ultrasonido

Microvesículas

Una clase de agentes de contraste, particularmente útiles para imágenes de contraste por ultrasonido, incluye suspensiones de burbujas de gas de tamaño nano- y/o micro-métrico dispersadas en un medio acuoso. Son de particular interés las formulaciones en las que las burbujas de gas se estabilizan, por ejemplo, usando emulsionantes, aceites, espesantes o azúcares, o atrapando o encapsulando el gas o su precursor en una diversidad de sistemas. Se hace referencia en general en la técnica a estas burbujas de gas estabilizadas con diversas terminologías, dependiendo típicamente del material estabilizante empleado para su preparación; estos términos incluyen, por ejemplo, "microesferas", "microburbujas", "microcápsulas" o "microglobos". La expresión "microvesículas rellenas de gas", o simplemente "microvesículas", tal como se emplean en este documento, incluyen cualquier terminología anteriormente mencionada.

Microvesículas rellenas de gas

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, las microvesículas rellenas de gas se preparan con lípidos o fosfolípidos covalentemente asociados a la proteína quimérica de la presente invención, como ligando dirigido de selectina, y preferiblemente son microburbujas. Por microburbujas se hace referencia a burbujas de gas suspendidas en un vehículo acuoso, que, en la interface gas-líquido poseen una envoltura (película) delgada con un material anfífilo estabilizante. Los ejemplos de suspensiones acuosas de microburbujas de gas se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.271.928, US 5.445.813, US 5.413.774, US 5.556.610, 5.597.549, US 5.827.504 y WO 04/069284. El término también comprende precursor de microburbujas en la forma de componente liofilizado o secado por pulverización, preferiblemente que comprende dispersiones de fosfolípidos.

En contraste con las microburbujas de acuerdo con la definición anterior, los términos "microglobos" o "microcápsulas" incluyen suspensiones en las que las burbujas de gas están rodeadas de una envoltura de material sólido de un lípido o de polímeros naturales o sintéticos. Los ejemplos de microglobos y de la preparación de éstos se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.711.933 y US 6.333.021.

Los componentes adecuados para formar envolturas estabilizantes de microburbujas comprenden, por ejemplo, fosfolípidos; lisofosfolípido; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidónico o ácido oleico; lípidos que portan polímeros tales como quitina, ácido hialurónico, polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG), también denominados "lípidos pegilados"; lípidos que portan mono- di-, oligo- o polisacáridos sulfonatados; colesterol, sulfato de colesterol o hemisuccinato de colesterol; hemisuccinato de tocoferol; lípidos con ácidos graso enlazados a éter o éster; lípidos polimerizados; diacetil fosfato; diacetil fosfato; ceramidas; ésteres de ácido graso de polioxietileno (como estearatos de ácido graso de polioxietileno), alcoholes grasos de polioxietileno, éteres de alcohol graso de polioxietileno, ésteres de ácido graso de sorbitán polioxietilado, polietilenglicol ricinoleato de glicerol, esteroles de soja etoxilados, aceite de ricino etoxilado o copolímeros en bloque de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de ácido esterol alifático incluidos colesterol butirato, colesterol iso-butirato, colesterol palmitato, colesterol estearato, lanosterol acetato, ergosterol palmitato o fitoesterol n-butirato; esterol ésteres de ácidos de azúcar como colesterol glucurónidos, lanosterol glucorónidos, 7-deshidrocolesterol glucorónido, ergosterol glucorónido, colesterol gluconato, lanosterol gluconato o ergosterol gluconato; ésteres de ácidos de azúcar y alcoholes que incluyen lauril glucurónido, estearoil glucorónido, miristoil glucorónido, lauril gluconato, miristoil gluconato o estearoil gluconato; ésteres de azúcares con ácidos alifáticos que incluyen sacarosa laurato, fructosa laurato, sacarosa palmitato, sacarosa estearato, ácido glucurónico, ácido glucónico o ácido poliurónico; saponinas que incluyen sarsasapogenina, smilagenina, hederagenina, ácido oleanólico o digitoxigenina; glicerol o glicerol ésteres que incluyen glicerol tripalmitato, glicerol diestearato, glicerol triestearato, glicerol dimiristato, glicerol trimiristato, glicerol dilaurato, glicerol trilaurato, glicerol dipalmitato; alcoholes de cadena larga que incluyen n-decil alcohol, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico o alcohol n-octadecílico; 6-(5-colesten-3p-iloxi)-1-tio- p-D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5-colesten-3 p -iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-p-D-galactopiranósido; 6-(5-colesten-3 piloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1 -tio-p-D-mannopiranósido; ácido 12-(((7'-dietilaminocumarina-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoico; ácido N-[12-(((7'-dietilaminocoumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoil]-2-aminopalmítico; N-succinil-dioleilfosfatidiletanolamina; 1,2-dioleil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina o palmitoilhomocisteína; alquilaminas o sales de alquilamonio, que comprenden por lo menos una cadena de alquilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), tal como, por ejemplo, N-estearilamina, N,N'-diestearilamina, N-hexadecilamina, N,N'-dihexadecilamina, cloruro de N-estearilamonio, cloruro de N,N'-diestearilamonio, cloruro de N-hexadecilamonio, cloruro de N,N'-dihexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio terciario o cuaternario que comprenden una o preferiblemente dos cadenas de acilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18) enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno (C3-C6) tal como, por ejemplo, 1,2-distearoil-3-trimetilammoniopropano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-distearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP); y sus mezclas o combinaciones.

Dependiendo de la combinación de componentes y del proceso de fabricación de las microburbujas, los compuestos ilustrativos mencionados anteriormente se pueden emplear como el compuesto principal para formar la envoltura de las microburbujas o como aditivos simples, por lo tanto, presentes solamente en cantidades menores.

De acuerdo con una realización preferida, por lo menos uno de los compuestos que forman la envoltura de las microburbujas es un compuesto anfífilo (es decir, una molécula orgánica que comprende tanto un resto hidrófilo como lipófilo), preferiblemente un fosfolípido, opcionalmente en mezcla con cualquiera de los otros materiales anteriormente citados. De acuerdo con la presente invención, el término fosfolípido está destinado a abarcar cualquier compuesto fosfolípido anfífilo, cuyas moléculas sean capaces de formar un material de película estabilizante (típicamente en la forma de una capa mono-molecular) en la interfaz del límite gas-agua en la suspensión de microburbujas final. Por consiguiente, a estos materiales también se hace referencia en la técnica como "fosfolípidos formadores de película". Los compuestos fosfolípidos anfífilos típicamente contienen por lo menos un grupo fosfato y por lo menos uno, preferiblemente dos, grupos hidrocarbonados de cadena larga lipófilos. Los ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen ésteres de glicerol con uno o preferiblemente dos residuos (iguales o diferentes) de ácidos grasos y con ácido fosfórico, en donde el residuo de ácido fosfórico está a su vez unido a un grupo hidrófilo, tal como, por ejemplo, colina (fosfatidiloolinas - PC), serina (fosfatidilserinas - PS), glicerol (fosfatidilglioeroles - PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas - PE), inositol (fosfatidilinositol - Pl). Los ésteres de fosfolípidos con solamente un residuo de ácido graso en general se denominan en la técnica "liso" formas del fosfolípido o "lisofosfolípidos". Los residuos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos en general son ácidos alifáticos de cadena larga, típicamente que contienen entre 12 y 24 átomos de carbono, preferiblemente entre 14 y 22; la cadena alifática puede contener una o más insaturaciones o está preferiblemente completamente saturada. Los ejemplos de ácidos grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Preferiblemente, se emplean los ácidos grasos saturados, tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido araquídico.

Otros ejemplos de fosfolípidos son ácidos fosfatídicos, es decir, los diésteres de ácido glicerol-fosfórico con ácidos grasos; esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir, aquellos análogos de fosfatidilcolina en los que el residuo de glicerol con ácidos grasos se reemplaza con una cadena de ceramida; cardiolipinas, es decir, los ésteres de 1,3-difosfatidilglicerol con ácido graso; glucolípidos tales como gangliósidos GM1 (o GM2) o cerebrósidos; glucolípidos; sulfátidos y glucoesfingolípidos.

Tal como se emplea en este documento, el término fosfolípidos incluye productos naturales, semisintéticos o sintéticos que se pueden emplear o bien en forma individual o como mezclas.

Los ejemplos de fosfolípidos naturales son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, típicamente, lecitina de soja o yema de huevo.

Los ejemplos de fosfolípidos semisintéticos son los derivados parcial o totalmente hidrogenados de las lecitinas naturales. Los fosfolípidos preferidos son di-ésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol o de esfingomielina.

Los ejemplos preferidos de fosfolípidos son, por ejemplo, dilauroil-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC), distearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2 Diestearoil-sn-glicero-3-Etilfosfocolina (Etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1 -miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1 -palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina (PMPC), 1 -palmitoil-2-stearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1 -estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1 -palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1 -oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metal alcalino, diaraquidoilfosfatidil-glicerol (DAPG) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metal alcalino, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metal alcalino, distearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metal alcalino, dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metal alcalino, ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA) y sus sales de metal alcalino, ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA) y sus sales de metal alcalino, ácido diestearoil fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoil fosfatidil-etanolamina (DSPE), dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE), diaraqudoilfosfatidil-etanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), distearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoil esfingomielina (DPSP) y distearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidilinositol (DLPl), diarachidoilfosfatidilinositol (DAPl), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPl), distearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoilfosfatidilinositol (DOPl).

Los fosfolípidos adecuados incluyen fosfolípidos modificados enlazando allí un polímero hidrófilo, tal como un polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG). Los fosfolípidos modificados con polímero preferidos incluyen "fosfolípidos pegilados", es decir fosfolípidos enlazados a un polímero PEG. Los ejemplos de fosfolípidos pegilados son fosfatidiletanolaminas pegiladas ("PE-PEG" en síntesis) es decir fosfatidiletanolaminas en donde el resto etanolamina hidrófilo se enlaza a una molécula de PEG de peso variable (p. ej., entre 300 y 20000 daltons, preferiblemente entre 500 y 5000 daltons), tal como DPPE-PEG (o DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG o DOPE-PEG). Por ejemplo, DPPE-PEG2000 se refiere a DPPE acoplado un polímero PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000.

Los fosfolípidos particularmente preferidos son DAPC, DSPC, DSPG, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS y Etil-DSPC. Los más preferidos son DSPG o DSPC.

Las mezclas de fosfolípidos también se pueden utilizar, tal como por ejemplo mezclas de DSPE, DPPE, DPPC, DSPC y/o DAPC con DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG, Etil-DSPC y/o Etil-DPPC.

En realizaciones preferidas, el fosfolípido es el componente principal de la envoltura estabilizante de microburbujas, equivaliendo a por lo menos 50% (p/p) de la cantidad total de los componentes que forman la envoltura de las microburbujas rellenas de gas. En algunas realizaciones preferidas, prácticamente la totalidad de la envoltura (es decir, por lo menos 80% y hasta 100% en peso) puede estar formada por fosfolípidos.

Los fosfolípidos pueden convenientemente utilizarse en mezcla con cualquiera de Ios compuestos anteriormente mencionados. Por lo tanto, por ejemplo, las sustancias tales como colesterol, ergosterol, fotoesterol, sitoesterol, lanoesterol, tocoferol, propil galato o ascorbil palmitato, ácidos grasos tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico y sus derivados o hidroxitolueno butilado y/u otros compuestos no fosfolípidos pueden opcionalmente añadirse a uno o más de Ios fosfolípidos anteriores en proporciones que oscilan entre cero y 50% en peso, preferiblemente hasta 25%. Se prefieren particularmente Ios compuestos anfífilos, tales como Ios ácidos carboxílicos C10-C20, preferiblemente ácido palmítico.

De acuerdo con una realización preferida, la envoltura de las microburbujas de acuerdo con la invención incluye un compuesto que porta una carga de red (positiva o negativa) general. Dicho compuesto puede ser un material anfífilo cargado, preferiblemente un lípido o un fosfolípido.

Los ejemplos de fosfolípidos que portan una carga negativa general son derivados, en particular derivados de di-éster de ácido graso, de fosfatidilserina, tal como DMPS, DPPS, DSPS; de ácido fosfatídico, tal como DMPA, DPPA, DSPA; de fosfatidilglicerol tal como DMPG, DPPG y DSPG o de fosfatidilinositol, tal como DMPI, DPPI o DPPI. También se pueden usar Ios fosfolípidos modificados, en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, tal como DPPE-PEG o DSPE-PEG, como moléculas negativamente cargadas. También se puede usar ventajosamente la forma liso de Ios fosfolípidos previamente mencionados, tal como derivados de lisofosfatidilserina (p. ej., liso-DMPS, -DPPS o -DSPS), derivados de ácido lisofosfatídico (p. ej., liso-DMPA, -DPPA o -DSPA) y derivados de lisofosfatidilglicerol (p. ej. Iíso-DMPG, -DPPG o -DSPG), como compuestos negativamente cargados. Otros ejemplos de compuestos negativamente cargados son sales de ácido biliar tales como sales de ácido cólico, ácido desoxicólico o sales de ácido glicólico; y sales de ácido graso (C12-C24), preferiblemente (C14-C22) tales como, por ejemplo, sales de ácido palmítico, sales de ácido esteárico, sales de 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol o sales de 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol. Preferiblemente, el compuesto negativamente cargado se selecciona entre DPPA, DPPS, DSPG, DPPG, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG5000 o sus mezclas.

El componente negativamente cargado típicamente se asocia con un correspondiente contraión positivo, que puede ser mono- (p. ej., un metal alcalino o amonio), di-(p. ej., metal alcalino térrreo) o tri-valente (p. ej., aluminio). Preferiblemente, el contraión se selecciona entre cationes de metal alcalino, tales como Na+ o K+, más preferiblemente Na+. Los ejemplos de fosfolípidos que portan una carga positiva son derivados de etilfosfatidilcolina, en particular diésteres de etilfosfatidilcolina con ácidos grasos, tales como 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil-DSPC o DSEPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil-DPPC o DPEPC). El contraión negativo es preferiblemente un ion de haluro, en particular un ion de cloruro o bromuro. Los ejemplos de compuestos positivamente cargados que se pueden incorporar en la envoltura de microburbujas son sales de mono-, di- tri-, o tetra-alquilamonio con un contraión de haluro (p. ej., cloruro o bromuro) que comprende por lo menos una cadena de alquilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), tal como por ejemplo cloruro de mono- o di-estearilamonio, cloruro de mono o di-hexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) o bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB). Otros ejemplos de compuestos positivamente cargados que se pueden incorporar en la envoltura de microburbujas son sales de amonio terciario o cuaternario con un contraión de haluro (p. ej., cloruro o bromuro) que comprenden una o preferiblemente dos cadenas de acilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), enlazadas al átomo N a través de un puente alquileno (C3-C6), tal como por ejemplo 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) o 1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP).

DSEPC, DPEPC y/o DSTAP preferiblemente se emplean como compuestos positivamente cargados en la envoltura de microburbujas.

El componente positivamente cargado típicamente se asocia con un contraión negativo correspondiente, que puede ser mono- (p. ej., haluro), di-(p. ej., sulfato) o tri-valente (p. ej., fosfato). Preferiblemente, el contraión se selecciona entre iones de haluro, tales como F-(flúor), Cl-(cloro) o Br-(bromo).

Las mezclas de compuestos neutros y cargados, en particular de fosfolípidos y/o lípidos, se pueden emplear satisfactoriamente para formar la envoltura de microburbujas. La cantidad de lípido o fosfolípido cargado puede variar entre aproximadamente 95 % mol y aproximadamente 0,1 % mol con respecto a la cantidad total de lípido y fosfolípido, preferiblemente entre 80 % mol y 0,5 % mol.

Las mezclas preferidas de fosfolípidos neutros y lípidos o fosfolípidos cargados son, por ejemplo, DPPG/DSPC, DSTAP/DAPC, DPPS/DSPC, DPPS/DAPC, DPPE/DPPG, DSPA/DAPC, DSPA/DSPC, DSPC/PA (Diestearoilfosfatidilcolina/Ácido Palmítico) y DSPG/DSPC.

Cualquiera de Ios componentes ilustrados anteriormente útiles para formar la envoltura estabilizante de la microvesícula rellena de gas, en particular fosfolípidos, preferiblemente fosfolípidos pegilados, se puede modificar insertando allí un resto reactivo adecuado, con el propósito de permitir la unión de compuestos adecuados, tales como un ligando dirigido que comprende la secuencia expuesta como SEQ ID NO:1, o más preferiblemente una secuencia que comprende Ios aminoácidos 1-118 de SEQIDNO:1. Por ejemplo, un fosfolípido pegilado (p. ej., DSPE-PEG2000) puede comprender un resto reactivo terminal (p. ej., maleimida, abreviado "mal", formando así un componente DSPE PEG-mal) capaz de reaccionar (en forma oovalente} con un resto reactivo correspondiente en un compuesto que comprende la secuencia anterior. Los ejemplos de restos reactivos adecuados se ilustran más adelante en esta memoria.

Según una realización alternativa, el componente ligando dirigido se puede asociar con microcápsulas rellenas de gas. Los ejemplos preferidos de microcápsulas son aquellas que tienen una envoltura estabilizante que comprende un polímero, preferiblemente un polímero biodegradable, o un lípido insoluble en agua biodegradable (tal como tripalmitina) opcionalmente en mezcla con un polímero biodegradable. Los ejemplos de microcápsulas adecuadas y de su preparación se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.711.933 y US 6.333.021, incorporados a la presente memoria por referencia en su totalidad. Las microcápsulas que tienen una envoltura proteinácea, es decir, hecha de proteínas naturales (albúmina, hemoglobina) como aquellas descritas en los documentos US-A-4.276.885 o EP-A-0 324 938 (se incorporan a la presente memoria por referencia), también se pueden emplear. El ligando dirigido se puede incorporar en las microcápsulas, p. ej., uniéndose a un componente formador de la envoltura de las microcápsulas, de acuerdo con los métodos de preparación ilustrados anteriormente, o añadiendo a los componentes que forman la envoltura de las microcápsulas un componente anfífilo, tal como aquellos previamente ilustrados, unido en forma covalente al ligando dirigido.

Otros excipientes o aditivos pueden estar presentes en la formulación seca de las microvesículas o se pueden añadir junto con el vehículo acuoso utilizado para su reconstitución, sin estar necesariamente implicados (o solamente parcialmente implicados) en la formación de la envoltura estabilizante de las microvesículas. Estos incluyen reguladores de pH (como histidina), agentes que ajustan la osmolalidad, potenciadores de la viscosidad, emulsionantes, agentes de carga, etc. y se pueden usar en cantidades convencionales. Por ejemplo, se pueden utilizar compuestos como polioxipropilenglicol y polioxietilenglicol, así como también sus copolímeros. Los ejemplos de potenciadores o estabilizantes de la viscosidad son compuestos seleccionados entre poli y oligosacáridos lineales y reticulados, azúcares y polímeros hidrófilos tales como polietilenglicol.

Ya que la preparación de microvesículas rellenas de gas puede implicar una etapa de liofilización o secado por atomización, puede ser ventajoso incluir en la formulación un aditivo de liofilización, tal como un agente con efecto crioprotector y/o lioprotector y/o un agente de carga, por ejemplo un aminoácido tal como glicina, un carbohidrato, p. ej., un azúcar tal como sacarosa, manitol, maltosa, trehalosa, glucosa, lactosa o una ciclodextrina, o un polisacárido tal como dextrano; o un polioxialquilenglicol tal como polietilenglicol. Típicamente, la cantidad del aditivo de liofilización puede oscilar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1000 veces (p/p) la cantidad de los componentes que forman las microvesículas.

Cualquier gas biocompatible, precursor de gas o mezcla de éstos se puede emplear para rellenar las microvesículas anteriores (en lo sucesivo, también identificado como "gas formador de microvesículas"). El gas puede comprender, por ejemplo, aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas noble o inerte tal como helio, argón, xenón o criptón; un gas radiactivo tal como Xe133 o Kr81; un gas noble hiperpolarizado tal como helio hiperpolarizado, xenón hiperpolarizado o neón hiperpolarizado; un hidrocarburo de bajo peso molecular (p. ej., que contiene hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo un alcano tal como metano, etano, propano, butano, pentano o isopentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o cicopentano, un alqueno tal como propeno, buteno o isobuteno, o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; gases halogenados, preferiblemente gases fluorados, tales como hidrocarburos de bajo peso molecular halogenados, fluorados o perfluorados (p. ej. que contienen hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Si se emplea un hidrocarburo halogenado, preferiblemente al menos alguno, más preferiblemente todos, los átomos de halógeno en dicho compuesto son átomos de flúor.

Se prefieren los gases fluorados, en particular los gases perfluorados, especialmente en el campo de imágenes de ultrasonido. Los gases fluorados incluyen materiales que contienen por lo menos un átomo de flúor tal como por ejemplo hidrocarburos fluorados (compuestos orgánicos que contienen uno o más átomos de carbono y flúor); hexafluoruro de azufre; cetonas fluoradas, preferiblemente perfluoradas tales como perfluoroacetona; y éteres fluorados, preferiblemente perfluorados, tales como perfluorodietil éter. Los compuestos preferidos son gases perfluorados, tales como SF6 o perfluorocarbonos (hidrocarburos perfluorado), es decir, hidrocarburos en los que todos los átomos de hidrógeno se reemplazan con átomos de flúor, que se sabe que forman suspensiones de microburbujas particularmente estables, como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0554213, incorporado a la presente memoria por referencia.

El término perfluorocarbono incluye perfluorocarbonos saturados, insaturados y cíclicos. Los ejemplos de perfluorocarbonos biocompatibles, fisiológicamente aceptables son: perfluoroalcanos, tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (p. ej., perfluoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoro-isobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos o perfluoroheptanos; perfluoroalquenos, tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (p. ej., perfluorobut-2eno) o perfluorobutadieno; perfluoroalquinos (p. ej., perfluorobut-2-ino); y perfluorocicloalcanos (p. ej., perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano). L ^{o s} perfluorocarbonos saturados preferidos incluyen, por ejemplo, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12 y C6F12.

Puede que también sea ventajoso usar una mezcla de cualquiera de los gases mencionados en cualquier relación. Por ejemplo, la mezcla puede comprender un gas convencional, tal como nitrógeno, aire o dióxido de carbono y un gas que forme una suspensión de microburbujas estables, tal como hexafluoruro de azufre o un perfluorocarbono como se indicó anteriormente. Los ejemplos de mezclas de gases adecuadas se pueden hallar, por ejemplo, en el documento WO 94/09829, que se incorpora a la presente memoria por referencia. Las siguientes combinaciones se prefieren particularmente: una mezcla de gases (A) y (B) en donde el gas (B) es un gas fluorado, seleccionado entre aquellos previamente ilustrados, incluidas mezclas de estos, y (A) se selecciona entre aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono o mezclas de estos. La cantidad de gas (B) puede representar entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 95% v/v de la mezcla total, preferiblemente entre aproximadamente 5% y 80%.

Los gases particularmente preferidos son SF⁶ , C3F8, C4F10 o sus mezclas, opcionalmente en mezcla con aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono o sus mezclas.

En determinadas circunstancias puede ser conveniente incluir un precursor a una sustancia gaseosa (es decir, un material capaz de convertirse a un gas in vivo). Preferiblemente, el precursor gaseoso y el gas derivado de éste son fisiológicamente aceptables. El precursor gaseoso puede ser activado por el pH, fotoactivado, activado por temperatura, etc. Por ejemplo, se pueden utilizar ciertos perfluorocarbonos como precursores gaseosos activados por temperatura. Estos perfluorocarbonos, tales como perfluoropentano o perfluorohexano, tienen una temperatura de transición de fase líquido/gas encima de la temperatura ambiente (o la temperatura a la cual se producen y/o almacenan los agentes) pero debajo de la temperatura corporal; por lo tanto, se someten a la transición de la fase líquido/gas y se convierten a un gas dentro del cuerpo humano.

Para uso en RMN, las microvesículas preferiblemente contendrán un gas noble hiperpolarizado tal como neón hiperpolarizado, helio hiperpolarizado, xenón hiperpolarizado o mezclas de estos, opcionalmente en mezcla con aire, dióxido de carbono, oxígeno, nitrógeno, helio, xenón o cualquiera de los hidrocarburos halogenados anteriormente definidos.

Para uso en escintigrafía, la microvesícula preferiblemente contendrá gases radiactivos tales como Xe¹³³ o Kr⁸¹ o mezclas de estos, opcionalmente en mezcla con aire, dióxido de carbono, oxígeno, nitrógeno, helio, criptón o cualquiera de los hidrocarburos halogenados anteriormente definidos.

Agentes quejantes de metales para imágenes de RMN y terapia

El método más fiable y más frecuentemente aplicado para enlazar un ion de metal que puede ser o bien la sonda de obtención de imágenes o el efector radioterápico, a una biomolécula tal como la proteína quimérica de la invención, es mediante agentes quelantes bifuncionales, que portan la cesta quelante de metal y un grupo reactivo para enlazar en forma covalente la biomolécula.

Las cestas de coordinación de metales se pueden dividir en cíclicas, tales como DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético) o TETA (ácido 1,4,8,11 tetraazaciclododecano-1,4,8,11-tetraacético), o lineales tales como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o DTPA (ácido dietilenetriaminopentaacético). Una vez que se ha seleccionado la cesta quelante de metales más adecuada, o "ligando quelante", se puede llevar a cabo la conjugación a la biomolécula de interés mediante un grupo reactivo por síntesis de fase sólida o en disolución. Lattuada L. et al. reviews in Chem Soc. Rev, 2011,40, 3019-3049, planteamientos sintéticos para conjugar ligandos quelantes de metales a otros restos, en particular biomoléculas, para preparar agentes quelantes de metales dirigidos.

Según la realización descrita en este párrafo, el metal es o bien detectable por una técnica de formación de imágenes o un radionúclido útil para terapia. Los metales adecuados para obtención de imágenes incluyen específicamente iones de metales paramagnéticos detectables por imágenes de resonancia magnética (RMN), o radionúclidos detectables por técnicas de obtención de imágenes tales como escintigrafía, tomografía computada por emisión de fotón único (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET).

En este contexto, el término: "quelante", o las expresiones "ligando quelante " o "agente quelante" comprenden restos químicos, agentes, compuestos o moléculas que se caracterizan por la presencia de grupos polares capaces de formar un complejo que contiene más de un enlace coordinado con un metal de transición u otro metal. En un aspecto preferido de la invención, dicho ligando quelante incluye ácidos poliamino policarboxílicos o polifosfónicos cíclicos o lineales y contiene por lo menos un grupo amino, tiol o carboxilo presente como funcionalidad libre u opcionalmente activada, adecuado para conjugar los grupos funcionales de la proteína dirigida o un enlazador bifuncional adecuado.

Los enlazadores se pueden usar como espaciadores o para mejorar las propiedades de farmacocinética de toda la molécula. Algunos de los enlazadores más frecuentemente utilizados se han resumido en Liu S. and Edwards S. Bioconjugate Chem. 2001, 12: 7-34, y además se han descrito para conjugación de péptidos en el documento WO2008/071679.

Por el término "etiquetado" o la expresión "que forma complejo" tal como se emplean en este documento, es decir, en el contexto del "ligando quelante etiquetado con un metal", se hace referencia a un ligando que forma complejo con el metal, es decir, un ligando que está en la forma de un quelato o complejo de coordinación con el elemento metálico.

Por las expresiones "entidad metálica" o "elemento metálico", se hace referencia a un ion de metal que es detectable por una técnica de formación de imágenes, o radionúclidos para obtención de imágenes o terapia, La expresión abarca iones metálicos paramagnéticos detectables por imágenes de resonancia magnética (RMN) y metales que emiten radiación tales como radionúclidos, detectables por imágenes escintigráficas, tomografía computada por emisión de fotón único (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET) o adecuados para radioterapia, como se define a continuación, Los ligandos quelantes adecuados se seleccionan del grupo que consiste en: un ácido poliaminopolicarboxílico y su derivado, que comprende, por ejemplo, ácido dietilenetriamina pentaacético (DTPA) y su derivado que incluye benzo-DTPA, dibenzo-DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA y dibencil DTPA, N, N-Bis[2-[(carboximetil)[(metilcarbamoil)metil]etil]-glicina (DTPA-BMA), N-[2-[bis(carboximetil)amino]-3-(4-etoxifenil)propil)]-N-[2-[bis(carboximetil) amino]etil]glicina (EOB-DTpA), ácido 4-carboxi-5,8,11-tris(carboximetil)-1-fenil-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-oico (BOpTA), ácido N,N-bis[2-[bis(carboximetil)amino]etil]L-glutámico (DTPA-GLU); DTPA-Lys (véase el compuesto 1 de la Figura 3a); ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); ácido 1,4,7,10-teraazaciclododecano 1,4,7,-triacético (D03A) y sus derivados que incluyen, por ejemplo, ácido [10-(2-hidroxipropil)-1,4,7,10-teraazaciclododecano 1,4,7,-triacético (HPD03A); ácido 1,4,7-triazaciclononano N,N',N"-triacético (NOTA); ácido 6-[bis(carboximetil)amino]tetrahidro-6-metil-1H-1,4-diazepina-1,4(5H)-diacético (AAZTA) y su derivado, por ejemplo como se describe en el documento W003/008390, incorporado a la presente memora por referencia, ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclotetradecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) y sus derivados que incluyen, por ejemplo, benzo-DOTA, ácido dibenzo-DOTA, (a,a',a",a"')-tetrametil-1,4,7,10-tetraazaciclotetradecano-1,4,7,10-tetraacético (D0TMA); o ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N",N"'-tetraacético (TETA); o los correspondientes compuestos en donde uno o más de los grupos carboxílicos se reemplazan con un grupo fosfónico y/o fosfínico, incluido, por ejemplo, ácido N,N'-bis-(piridoxal-5-fosfato) etilendiamina-N,N'-diacético (DPDP); ácido etilendinitrilo tetraquis(metilfosfónico) (EDTP), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclotetradecano-1,4,7,10-tetra(metilenofosfónico) (D0TP), los compuestos fosfonoalquilpoliaza macrocíclicos, por ejemplo descritos en los documentos US 5,362,476 y US 5,409,689, y los derivados de fosfonoalquilo lineal descritos en el documento US 6,509,324; o quelantes macrocíclicos tales como texafirinas, porfirinas, ftalocianinas,

Entre los anteriores, se prefieren particularmente: derivados de DTPA, DTPA-Glu, DTPA-Lys, DOTA y DOTA, tales como aquellos descritos en Price EW and Orvig, Chem, Soc, Rev, 2014, 43:260 y piridil-D03A descrito en Hermann et al, Dalton Trans,, 2008, 3027-3047 o el ligando multidentado AAZTA y sus derivados, descrito en los documentos W003/008394 y W02013/135750,

Los elementos metálicos paramagnéticos preferidos para RMN son aquellos que tienen un número atómico comprendido entre 20 y 31,39, 42, 43, 44, 49, y entre 57 y 83,

Los iones de metales paramagnéticos incluso más preferidos se seleccionan entre los siguientes: Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Ni(2+), Rh(2+), Co(2+), Cr(3+), Gd(3+), Eu(3+), Dy(3+), Tb(3+), Pm(3+), Nd(3+), Tm(3+), Ce(3+), Y(3+), Ho(3+), Er(3+), La(3+), Yb(3+), Mn(3+), Mn(2+; siendo Gd(3+) el más preferido,

Imágenes nucleares (imágenes con radionúclidos) y radioterapia

En otra realización de la invención, el resto al cual se enlaza la proteína quimérica dirigida a selectina de la presente invención es un radionúclido, para radioimágenes (diagnósticas) o radioterapia (aplicación terapéutica),

Las características principales de un resto quelante de radiometales se relacionan con su uso in vivo en condiciones extremadamente diluidas, es decir, entre concentraciones nM y pM; no obstante, algunas de las correspondencias más adecuadas entre el resto quelante y el radiometal se conocen y resumen en Price EW and Orvig C Chem, Soc, Rev, 2014, 43, 260,

Para radioimágenes, el agente dirigido se puede enlazar a un "resto detectable de radioimágenes", es decir, un resto que es detectable por técnicas de obtención de imágenes tales como imágenes escintigráficas, tomografía computada por emisión de fotón único (SPECT) o tomografía por emisión de positrones (PET),

Preferiblemente, dicho resto detectable de radioimágenes comprende un radionúclido quelado a un agente quelante que usualmente es bifuncional y que comprende el resto quelante con propiedades formadoras de complejo con el metal y un grupo funcional para sujeción a la biomolécula, tal como el agente dirigido a selectina de la presente invención o, alternativamente, se enlaza directamente a la biomolécula (es decir, yodo),

Los grupos funcionales que forman una amida, tiourea, urea, base Schiff o enlaces tioéter con grupos amina o tiol en proteínas se pueden preparar portando el agente quelante, etiquetado con un radionúclido detectable mediante dichas técnicas de imágenes escintigráficas, SPECT o PET,

En cualquier caso, Ios ligandos quelantes más preferidos son ligandos quelantes lineales o más preferiblemente macrocíclicos, y son aquellos analizados anteriormente, tal como DTPA o, más preferiblemente, DOTA que todavía representa el criterio de referencia para una serie de isótopos como ¹¹¹ln, 177Lu, ^86/90Y, ²²⁵Ac y 44/47Sc y que se ha utilizado ampliamente con ^67/68Ga, aunque más recientemente se reemplazó con NOTA y DOTA más estables, o sus derivados.

Otros ejemplos adecuados de ligandos quelantes para radionúclidos se pueden seleccionar entre quelantes lineales, macrocíclicos de terpidina, y N3S, N2S2, N2S3, N2S4, N3S3 o N4 que incluyen, por ejemplo, los ligandos descritos en los documentos US 5.367.080, US 5.364.613, US 5.021.556, US 5.075.099 y US 5.886.142, y otros ligandos quelantes conocidos en la técnica como, aunque sin limitarse a ello, ácido 6-hidrazinopiridina-3-carboxílico (HYNIC), o ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N",Nm-tetraacético (TETA); y quelantes bis-amino bis-tiol (BAT) tales como, por ejemplo, aquellos descritos en el documento US 5.720.934, o fosfoderivados de compuestos poliazamacrocílicos, tales como aquellos descritos en el documento WO2005/062828.

Los ligandos quelantes N4 también se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.608.110, US 5.665.329, US 5.656.254 y US 5.688.487. Ciertos quelantes de N3S o N2S2 se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.659.041, US 5.574.140, US 5.780.006, US 5.662.885 y US 5.976.495. Los quelantes también pueden incluir derivados del ligando quelante mercapto-acetil-acetil-glicil-glicina (MAG3), que contiene un sistema N3S y N2S2 tal como MAMA (monoamidamonoaminaditioles), DADS (N2S diaminaditioles), CODADS, y similares. Estos sistemas de ligandos y una variedad de otros se describen en Liu and Edwards, Chem Rev, 1999, 99, 2235-2268 y referencias allí citadas.

El quelante puede además incluir complejos que contienen átomos de ligandos que no son donados al metal en una matriz tetradentada. Estos incluyen aductos de ácido borónico de dioximas de tecnecio y renio, por ejemplo, descritos en los documentos US 5.183.653, US 5.387.409 y US 5.118.797.

En otra realización, los enlaces disulfuro de la proteína de fusión o polipéptido de la invención se usan como ligandos para quelación de un radionúclido tal como ⁹⁹mTc. De esta manera, el bucle del péptido se expande por introducción de Tc (péptido-S-S-péptido cambiado a péptido-S-Tc-S-péptido).

Los radionúclidos preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo: 99mTc, ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, 47Sc, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴¹Ce, ¹¹¹ln, ¹¹³ln, ¹⁶⁸Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴⁰La, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶D y, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹⁴Bi, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, 117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶¹Tb, ^{17 7}Lu, ¹⁹⁸Au, ¹¹¹Ag, ¹⁹⁹Au, ⁵¹Mn, 52mMn, ⁵²Fe, ⁶⁰Cu, ⁷²As, 94mTc o ¹¹⁰ln, ¹⁴²Pr, ¹⁵⁹Gd.

La elección del radionúclido se basará en la aplicación terapéutica o diagnóstica deseada. Por ejemplo, para los propósitos terapéuticos (p. ej., proporcionar radioterapia para tumores primarios y metástasis), los radionúclidos preferidos pueden incluir ⁶⁴Cu, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹ln, 117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁵Yb, 177Lu, ^186/188Re y ¹⁹⁹Au, en donde se prefieren particularmente ^186/188Re, 177Lu y ⁹⁰Y. Para propósitos diagnósticos (p. ej., localizar la inflamación y monitorear su desarrollo después de la terapia), los radionúclidos preferidos pueden incluir ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, 99mTc y ¹¹¹ln. Se prefiere particularmente 99mTc para aplicaciones diagnósticas debido a su bajo coste, disponibilidad, propiedades de adquisición de imágenes y actividad altamente específica. En particular, las propiedades nucleares y radiactivas de 99mTc hacen que este isótopo sea un agente de formación de imágenes escintigráficas ideal. Este isótopo, de hecho, tiene energía de fotón único de 140 keV y una semivida radiactiva de aproximadamente 6 horas, y está fácilmente disponible de un generador de ⁹⁹Mo-99mTc.

Los radionúclidos metálicos preferidos para uso en imágenes PET son iones de metales de emisión de positrones tales como, por ejemplo: ⁵¹Mn, ⁵²Fe, ⁶⁰CU, ⁶⁸Ga, ⁷²As, 94mTc o ¹¹⁰ln.

Los ligandos quelantes preferidos son ¹¹¹ln y lantánidos radiactivos tales como, por ejemplo, 177Lu, ⁹⁰Y, ¹⁵³Sm y ¹⁶⁶Ho o ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu o ⁶⁷Cu) seleccionados del grupo que consiste en:

En particular, para entidades metálicas que incluyen 111in y lantánidos radiactivos tales como, por ejemplo, 177Lu, 90Y, 153Sm y 166Ho, se prefieren particularmente los siguientes residuos de ligandos;

en donde en las fórmulas anteriores a) y b), R es alquilo, preferiblemente metilo.

Para 99mTc, 186Re, 188Re radiactivos, se prefieren particularmente los siguientes restos quelantes de d) a i);

Éstos y otros grupos quelantes de metales se describen, por ejemplo, en Ios documentos US 5.608.110, US 6.143.274, US 5.627.286, US 5.662.885, US 5.780.006 y US 5.976.495. Además, el grupo quelante anterior de fórmula c) se describe en el documento US 6.143.274; los grupos quelantes de las fórmulas anteriores h) y i) se describen en los documentos US 5.627.286 y US 6.093.382; y el grupo quelante de fórmula I) se describe en los documentos US 5.662.885, US 5.780.006 y US 5.976.495.

En las fórmulas h) y i), X es o bien CH² u O, Y es o bien alquilo C¹-C¹⁰ ramificado o no ramificado, Y es arilo, ariloxi, arilamino, arilaminoacilo; Y es arilquilo en donde el grupo o los grupos alquilo unidos al resto arilo son grupos alquilo C¹-C¹⁰ ramificados o no ramificados, grupos hidroxi o polihidroxialquilo C¹-C¹⁰ ramificados o no ramificados o grupos polialcoxialquilo ^o polihidroxi-polialcoxialquilo, J es >C(=0), -0C(=0)-, -SO2-, >NC(=0)-, >NC(=S)-, -N(Y)-, -NC(=NCH3)-, -NC(=NH)-, -N=N-, homopoliamidas o heteropoliaminas derivadas de aminoácidos sintéticos o naturales; todo en donde n es 1-100. Los derivados de folato de estas estructuras se describen, por ejemplo, en el documento US 6.093.382.

Se prefiere más para escintigrafía los agentes de contraste de radioimágenes que comprenden uno de los residuos de ligandos anteriores de a) a I) etiquetados con 99mTc como resto detectable de imágenes.

Imágenes PET con azúcares etiquetados

Incluso en otra realización de la invención, la proteína de fusión se enlaza a un resto azúcar etiquetado para uso en imágenes PET.

Preferiblemente, el resto azúcar se etiqueta por halogenación con radionúclidos tales como, por ejemplo: 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br, 76Br y 18F; 18F como particularmente preferido.

Imágenes ópticas

En algunas realizaciones, un agente de imágenes ópticas se conjuga a la proteína quimérica de la invención. Entre los agentes de imágenes ópticas, los tintes fluorescentes para aplicaciones de imágenes in vivo, ex vivo e in vitro se conocen entre los expertos en la técnica, y se ha desarrollado una amplia gama de fluorocromos que son óptimos para las imágenes de fluorescencia in vivo, y además se comercializan. Estos reactivos maximizan hasta diferentes grados la profundidad de penetración en el tejido, la dispersión de luz y las propiedades de emisión de fluorescencia de los cromóforos fluorescentes, para proporcionar relaciones óptimas de señal a fondo. En general, la absorción y dispersión de luz disminuyen con el aumento de la longitud de onda; debajo de aproximadamente 700 nm, estos efectos producen profundidades de penetración superficiales de pocos milímetros, mientras que encima de 900 nm de absorción de agua pueden interferir con la relación señal a fondo. Por consiguiente, los fluorocromos con excitación/emisión en la región del infrarrojo cercano (NIR) (700-900 nm) han sido principalmente explotados hasta el momento para imágenes in vivo en animales pequeños y, potencialmente, en seres humanos.

Entre éstos, los más utilizados son: verde indocianina, derivados de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5 y Cy5.5, Cy7 (tintes cianina y derivados disponibles, por ejemplo, de GE Healthcare), LS-287, LS-^{2 8 8} , IRDye®800CW, IR-820, IR®-806, IR-786, IRDye® 800RS, IRDye®750, IRDye®650 (IRDye®s disponibles de Li-Cor Bioscience), Alexa Fluor®647, Alexa Fluor®350, Alexa Fluor®405, Alexa Fluor®430, Alexa Fluor®488, Alexa Fluor®514, Alexa Fluor®532, Alexa Fluor®546, Alexa Fluor®568, Alexa Fluor®594, Alexa Fluor®680, Alexa Fluor®750 (tintes Alexa Fluor® disponibles, por ejemplo, de Invitrogen), sus combinaciones y otros, cuyas estructuras químicas se han descrito, por ejemplo, en el documento W02014/191467. La estructura de la mayoría de los compuestos para cirugía guiada por imágenes y su disponibilidad comercial se han descrito, por ejemplo, en Gibbs S.L. Quant Imaging Med Surg2012, 2(3): 177-187. Se prefieren particularmente los tintes de cianina y sus derivados químicos desarrollados para imágenes NIR, como: Cy5.5, IRDye®800CW, IRDye® 800RS y IRDye®750.

Usos

Los agentes diagnósticos dirigidos descritos anteriormente son particularmente útiles para imágenes in vivo y ex vivo. La proteína dirigida quimérica de la invención puede además utilizarse para fines terapéuticos, que incluyen cualquier método para el tratamiento de una enfermedad en un paciente en donde se usa la proteína dirigida quimérica de la invención, opcionalmente en asociación con un agente de obtención de imágenes, para administrar ex-vivo y/o in vivo, un compuesto terapéutico, es decir, una molécula capaz de ejercer o ser responsable de ejercer un efecto biológico a células, tejido u órganos que expresan selectina.

Típicamente, este uso implica la conjugación de la proteína quimérica de la invención con un agente/resto/molécula dotado de actividad biológica, como una citocina, agente citostático (tal como doxorrubicina, metotrexato, cisplatino, vinblastina, vincristina, etc.) toxina, agente antiinflamatorio, inmunomodulador tal como un inhibidor de citocinas, antiagregante, corticoesteroide, anticuerpo monoclonal, factor de crecimiento y los agentes radioterápicos anteriormente descritos que comprenden restos quelantes de metales que portan un radionúclido, y se efectúa para dirigir el resto biológicamente activo hacia el tejido/célula/órgano que expresa selectina, en donde se observa o detecta una inflamación.

La afección inflamatoria patológica, o bien para propósitos diagnósticos y/o terapéuticos, se debe caracterizar por niveles de expresión de selectina por encima de los fisiológicos; la selectina es preferiblemente E-selectina y/o P-selectina, más preferiblemente P-selectina. En particular, los agentes de obtención de imágenes de la invención son útiles para detectar afecciones inflamatorias del endotelio vascular, tales como las que se mencionan a continuación.

Más preferiblemente, la afección inflamatoria patológica se selecciona entre las siguientes, caracterizadas por niveles de expresión de selectina por encima de los fisiológicos: síndrome coronario agudo (ACS), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, neo-angiogénesis asociada con tumores, artritis reumatoidea, lesión por reperfusión isquémica, rechazo de injerto o, más en general, de cualquier órgano o tejido que exprese P-selectina y/o E-selectina por encima de los niveles fisiológicos.

Más preferiblemente, la proteína quimérica de la invención es un agente dirigido útil para IBD, ACS, detección de tumores y rechazo de injertos.

Asimismo, los agentes de adquisición de imágenes dirigidos de acuerdo con la invención se emplean como una herramienta de diagnóstico eficiente durante el tratamiento (o la terapia) de un paciente que padece una enfermedad o patología inflamatoria, en donde "durante" incluye cualquier momento antes del comienzo del tratamiento, en el curso de dicho tratamiento y/o al final de dicho tratamiento, para controlarlo y evaluarlo. Por ejemplo, los agentes de adquisición de imágenes dirigidos de la invención se pueden emplear ventajosamente en el monitoreo y/o el seguimiento de un tratamiento antiinflamatorio (p. ej., de cualquiera de las enfermedades o patologías anteriormente mencionadas), p. ej., para determinar los efectos de la administración de un fármaco antiinflamatorio o inhibidor de la inflamación sobre la enfermedad o patología.

Por ejemplo, en IBD, los agentes de obtención de imágenes dirigidos de la invención se pueden usar para hacer un seguimiento de la respuesta al tratamiento terapéutico con, por ejemplo, mesalamina, corticoesteroides, metotrexato o infliximab, y para estratificar a los pacientes según su respuesta al tratamiento terapéutico o para controlar la terapia de mantenimiento en remisión. Preferiblemente, la técnica de adquisición de imágenes se basa en microburbujas dirigidas a proteínas solubles quiméricas para detección por ultrasonido.

En una realización preferida, durante un tratamiento, una región de interés del paciente se somete al sistema de detección de imágenes de elección tras la administración de los agentes de obtención de imágenes dirigidos de la invención, por ejemplo en intervalos regulares de tiempo, en un intervalo de tiempo predeterminado después de cada administración del fármaco o intervención terapéutica y/o después de una cantidad seleccionada de administraciones del fármaco o tratamientos; se realiza luego preferiblemente la toma de imágenes final de la región de interés en la finalización o conclusión del tratamiento.

Los agentes de adquisición de imágenes dirigidos de la invención pueden además usarse en técnicas relacionadas con ultrasonido, es decir, en imágenes asociadas a terapias, en donde se asocian ventajosamente con una destrucción localizada controlada de las microvesículas rellenas de gas, p. ej., mediante ondas de ultrasonido a alta presión acústica (típicamente superior a la empleada generalmente en métodos de imágenes diagnósticas no destructivos). Esta destrucción controlada se puede usar, por ejemplo, para el tratamiento de coágulos de sangre (una técnica también conocida como sonotrombólisis), opcionalmente en combinación con la liberación de un compuesto terapéutico adecuado asociado con el agente de contraste. De manera alternativa, dichas imágenes asociadas con terapia pueden incluir la administración de un agente terapéutico a las células, como resultado de una permeabilización de membrana transitoria en el nivel celular inducida por la explosión o activación localizada de las microvesículas. Esta técnica se puede usar, por ejemplo, para una administración eficaz de material genético a las células; alternativamente, el fármaco puede administrarse en forma local, opcionalmente en combinación con material genético, permitiendo así una terapia genética/farmacéutica combinada del paciente (p. ej., en caso de tratamiento de tumores). El agente terapéutico se puede asociar con la microvesícula rellena de gas de acuerdo con métodos convencionales, o se puede administrar como un compuesto separado de la composición. Además, el agente dirigido se podría utilizar para facilitar la administración del agente terapéutico al tejido cerebral por abertura transitoria de la barrera hematoencefálica después de la exposición a ultrasonido.

Típicamente, se administra una cantidad eficaz del agente diagnóstico dirigido (p. ej., por inyección) a un paciente que lo necesita, y la parte del cuerpo o tejido del paciente que se va a someter a adquisición de imágenes o tratamiento ("región de interés") se somete al método de adquisición de imágenes deseado. Preferiblemente, el agente de contraste se administra por vía intravenosa. El término paciente incluye a cualquier sujeto (humano o animal) que se someta a la administración del agente de contraste, o bien para propósitos diagnósticos/terapéuticos o para propósitos experimentales (incluido, por ejemplo, el uso de un agente de contraste en animales de laboratorio, p. ej., para seguimiento de un tratamiento terapéutico experimental).

De acuerdo con una realización preferida, se administra a un paciente una cantidad eficaz de microvesículas dirigidas, típicamente por inyección de su suspensión. Las imágenes de la región de interés se potenciarán entonces por la presencia de las microvesículas ligadas a la diana en la región de interés.

Se puede emplear una diversidad de técnicas de adquisición de imágenes en aplicaciones de ultrasonido, por ejemplo, que incluyen imágenes en modo B fundamentales y no lineales (p. ej., harmónicas), imágenes por pulsos o inversión de fases e imágenes Doppler fundamentales y no lineales; si se desea, se pueden emplear técnicas en tres o cuatro dimensiones. Asimismo, también se contemplan las técnicas diagnósticas que implican la destrucción de microvesículas rellenas de gas (p. ej., mediante ondas de ultrasonido a alta presión acústica) que son métodos de detección altamente sensibles.

Las miorovesíoulas de acuerdo con la invención se pueden administrar típicamente en una concentración entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 5,0 pl de gas (atrapado dentro de las microvesículas) por kg del paciente, dependiendo, p. ej,, de su respectiva composición, el tejido o el órgano del cual se tomarán las imágenes y/o de la técnica de adquisición de imágenes elegida. Este intervalo de concentración general puede por supuesto variar, dependiendo de las aplicaciones de adquisición de imágenes específicas, p. ej., cuando las señales se pueden observar en dosis muy bajas tales como en Doppler color o inversión de pulsos de potencia. Otras aplicaciones posibles de adquisición de imágenes diagnósticas incluyen escintigrafía, imágenes ópticas, imágenes foto-acústicas, imágenes de resonancia magnética e imágenes de rayos X, como imágenes de contraste de fases de rayos X.

Los métodos de adquisición de imágenes por ultrasonido se pueden utilizar convenientemente en asociación con RMN, como se mencionó anteriormente para métodos de obtención de imágenes combinados (o de fusión) a fin de lograr un mejor mapeo de la lesión afectada.

Composiciones farmacéuticas

La invención comprende además composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína quimérica anteriormente descrita, o bien conjugada o modificada de acuerdo con los usos contemplados, que se pueden administrar tópica o parenteralmente, como por administración intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraarticular o intralesional. Habitualmente se prefiere la administración intravenosa (i.v.), intraarterial, intraarticular o intracardíaca.

Las moléculas de la presente invención, como el ingrediente activo, se disuelven, dispersan o mezclan en un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y compatible con el ingrediente activo, como se conoce en la técnica. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato (PBS), dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de éstos. Otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. A su vez, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, estabilizantes y/o agentes tampón del pH.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar, p. ej., mediante procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, trituración, pulverización, formación de comprimidos, molienda, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para uso según la presente invención se pueden formular, por consiguiente, usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación correcta depende de la ruta de administración elegida.

Para inyección, los compuestos de la invención se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o tampón de disolución salina fisiológica que comprende excipientes adecuados o compuestos estabilizantes.

La administración oral se puede lograr con composiciones líquidas o sólidas. Entre estas últimas, los núcleos de comprimidos se proveen con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar disoluciones concentradas de azúcar que pueden opcionalmente contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir tintes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o pastillas para identificación o para caracterizar distintas combinaciones de las dosis del compuesto activo. Las composiciones sólidas administradas oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, además de cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben ser en dosis adecuadas para la ruta de administración elegida. Para administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

En una realización de acuerdo con la presente invención, los péptidos se administran oralmente (p. ej., como un jarabe, cápsula o comprimido). En determinadas realizaciones, la administración del péptido se puede potenciar mediante el uso de excipientes protectores. Esto típicamente se logra formando complejo entre el péptido y una composición para tornarlo resistente a la hidrólisis ácida y enzimática o empaquetando el péptido en un vehículo apropiadamente resistente tal como un liposoma. Los medios para proteger péptidos para administración oral se conocen en la técnica.

Los comprimidos se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el péptido(s) activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, (p. ej., povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (p. ej., glicolato almidón de sodio, povidona retieulada, oarboximetiloelulosa sódica retieulada}, agente dispersante o activo superficial. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del péptido(s) en polvo humectado con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden opcionalmente recubrirse o marcarse, y se pueden formular como para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variables para proveer el perfil de liberación deseado.

El jarabe puede prepararse añadiendo el péptido(s) activo a una disolución acuosa concentrada de azúcar, por ejemplo, sacarosa, a la que se le puede añadir cualquier ingrediente necesario. Dichos ingredientes accesorios pueden incluir saporíferos, un agente para retrasar la cristalización del azúcar o un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como un alcohol polihídrico, por ejemplo, glicerol o sorbitol. Para administración por inhalación, las variantes para uso de acuerdo con la presente invención convenientemente se administran en la forma de una presentación en spray en aerosol desde un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorofluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para uso en un inhalador o en insufladores se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del péptido y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los ingredientes activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los vehículos naturales o sintéticos adecuados se conocen en la técnica. La suspensión puede también contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos o la estabilidad de la proteína quimérica o el grupo conjugado, para permitir la preparación de disoluciones concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua apirógena, estéril, antes del uso.

Los compuestos de la presente invención también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, p. ej., bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Se puede mantener una semivida en suero elevada mediante el uso de proteína de liberación sostenida o lípidos como sistemas de "empaquetamiento". Los expertos en la técnica conocen dichos sistemas de liberación controlada y pueden comprender la formulación de la proteína quimérica como tal o en forma conjugada en nanoesferas, nanovesículas o liposomas.

Las formulaciones y métodos de administración anteriores están destinados a ser ilustrativos y no limitativos. Se ha de apreciar que, usando las descripciones provistas en este documento, se pueden diseñar fácilmente otras formulaciones y modos de administración adecuados.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito que se tiene como fin. Más concretamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto eficaz para prevenir, demorar, mitigar, o aliviar los síntomas de una enfermedad del sujeto que se esté tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica de acuerdo con, por ejemplo, Goodman & Gilman, 9a ed, JG Hardman, A. Gilman, LE Limbird, Capítulo I "Pharmacokinetics", pág. 3­ 27.

Por consiguiente, la presente invención comprende además métodos para administración de la proteína quimérica anteriormente mencionada o bien como tal o preferiblemente como un conjugado a personas que lo necesitan, para propósitos terapéuticos, preferiblemente, diagnósticos.

Para fines diagnósticos, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden pre-administrar en una dosis adecuada, dependiendo de la ruta de administración y sensibilidad del método diagnóstico, y luego la adquisición de imágenes se puede llevar a cabo mediante la técnica más adecuada.

PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1: Preparación y expresión de proteínas de fusión recombinantes marcadas

Se preparó una serie de constructos de ADN:

PSGL Variante 1: la secuencia codifica los aminoácidos 1-47 de la proteína PSGL-1 madura, la región bisagra IgGi , el dominio cremallera de leucina de NRL, un espaciador de glicina (G4SG4) y una secuencia FLAG para reconocimiento de afinidad. Se usó el péptido de señalización IgH de ratón para segregación. La proteína quimérica de la Variante 1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQIDNO:2.

PSGL Variante 2: codifica Ios aminoácidos 1 -47 de la proteína PSGL-1 madura, una región bisagra igG1, una región lgG1CH3 con reemplazaos de secuencias K->A. Se usó el péptido de señalización IgH de ratón para segregación. Se usó una secuencia FLAG (SEQIDNO:35) en el término C para propósitos de purificación. La proteína quimérica tiene SEQIDNO:4.

PSGL Variante 3: codifica los aminoácidos 1-47 de la proteína PSGL-1 madura, covalentemente enlazada a la región bisagra IgG1, a la región 275-290 de la proteína PSGL-1 madura y una secuencia FLAG (SEQIDNO:35) en el término C, utilizada para fines de identificación y purificación. El péptido de señalización IgH de ratón se usó para segregación. La proteína quimérica tiene SEQIDNO:6.

PSGL Variante 4 codifica los aminoácidos 1-47 de la proteína PSGL-1 madura, covalentemente enlazada a la región bisagra IgG 1 y aa 1-15 de la región IgG 1 Fc humana. Se usó el péptido de señalización IgH de ratón para segregación. Se usó una secuencia FLAG (SEQIDNO:35) en el término C para fines de purificación. La proteína quimérica tiene SEQIDNO:8.

PSGL Variante 5 codifica los aminoácidos 1-88 de la proteína PSGL-1 (de acuerdo con GI:2498904) con la señal endógena y la secuencia de propéptidos covalentemente enlazadas a la región bisagra IgG1 aa 1-15 de la región IgG1 Fc humana. Se usó una secuencia FLAG (SEQIDNO:35) en el término C para reconocimiento de afinidad, para fines de purificación. La proteína quimérica tiene SEQIDNO:10.

Transfección transitoria a pequeña escala

CHO-S, una línea celular de ovario de hámster chino (Freedom™ CHO-S™ Kit, GIBCO ThermoFisher Scientific) se cultivó de acuerdo con la instrucción del fabricante (julio 2015) en una incubadora al 5% de CO² humidificada a 37°C en medio químicamente definido CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad CA, Catálogo # 12490-025, Lote # 1149771) enriquecido con L-glutamina (Cellgro, Catálogo # 61-030-RO, Lote # 61030158). No se usó suero ni ningún otro producto derivado de animal en el cultivo de las células CHO-S. 24 horas antes de la transfección, las células se sembraron en un matraz agitado y se desarrollaron usando medio definido químicamente libre de suero. Los constructos de expresión de las Variantes 1-5 (250 pg de cada plásmido) se transfectaron transitoriamente en 0,05 litros de suspensión de células CHO por electroporación. En síntesis: se transfectaron 250 x 106 células CHO usando un Electroporador Maxcyte con 50% tampón EP y cubeta QC400. Las células se desarrollaron usando medio libre de suero durante siete días antes de cosechar.

Un análisis Western blot realizado en la cosecha demostró expresión relativa de las variantes de PSGL-1. El análisis Western blot específico para la etiqueta FLAG en medio acondicionado bajo condiciones no reductoras confirmó la dimerización de la proteína. La Variante 1 en el medio acondicionado demostró, bajo condiciones reductoras, el peso molecular esperado de ~22 kDa (Figura 1, Carril 2). Formó correctamente un dímero bajo condiciones no reductoras (Figura 1, Carril 7). Las bandas de alto peso molecular halladas en las bandas 1 -5 son más probablemente moléculas unidas no específicamente al anticuerpo anti-FLAG (anticuerpo anti-FLAG monoclonal IgG1 de ratón, Sigma-Aldrich, catálogo # F1804).

En el caso del carril 3 (Variante 2), las bandas de peso molecular inferior podrían ser un producto de degradación.

El análisis western blot en el medio acondicionado se llevó a cabo con un anticuerpo que reconoce el epítopo Flag dispuesto en el término C de todas las variantes y es por lo tanto indicativo de la cantidad relativa de los distintos constructos de la proteína quimérica segregada en el medio.

Purificación de variantes marcadas (FLAGGED)

La purificación se llevó a cabo por intercambio iónico y purificación de afinidad anti-FLAG. Para cada una de las cinco variantes, después de la clarificación por filtración de 0,2 pM, el medio acondicionado se ajustó hasta pH 6 por adición de HCl 1 M, y el volumen se duplicó con agua destilada. Luego se cargó el CM en una columna de cromatografía de intercambio aniónico de 1 ml (columna Q, GE) y se eluyó en Tris 20 mM pH 7,5, HCl 1 M. La fracción de elución se aplicó a 0,5 ml de resina M2 de afinidad anti-FLAG y se sacudió a temperatura ambiente durante 5 horas. La resina se lavó con 10 ml de disolución salina tamponada con Tris. La proteína se eluyó con cinco volúmenes de columnas de 100 pg/ml de péptido FLAG en disolución salina tamponada con Tris. Para PSGL Variante 1, se reincubó el flujo con resina anti-FLAG M2 durante la noche a 4°C, y se logró la elución usando ácido acético al 0,25%, pH 3,5.

Los análisis SDS-PAGE de tinte plata y OD²²⁰ de la PSGL purificada, Variantes 1-5, sugieren que la Variante 1 tiene la más alta pureza y nivel de expresión entre los cinco constructos.

La concentración de proteína en OD²²⁰, calculada creando una curva estándar con dilución serial de albúmina de suero bovino y ajustando los datos de las variantes de PSGL a esa curva se expone a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3: recuperación de proteína Variantes 1-5 después del intercambio iónico y la purificación por afinidad

Entre Ios cinco oonstruotos, PSGL Variante 1 tuvo Ios mejores rendimientos; el mayor nivel de expresión y la pureza resultante por al menos un logaritmo en comparación con las otras variantes. Ambos análisis western blot y SDS-PAGE de tinción de plata, bajo condiciones reductoras y no reductoras, sugirieron que PSGL Variante 1 se dimerizó correctamente.

Ejemplo 2: Expresión y purificación de la Variante 1A (sin FLAG).

Transformantes estables de células CHO-S, que co-expresan la secuencia de ADN que codifica el núcleo 2 beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa (C2GnT-M), FTVII (fucosil-transferasa VII) (Fugang Li et al. J. BíoI. Chem, 1996, 271 ;3255-3264) y la proteína quimérica que abarca aa 1-118 de SEQIDNO;1 sin la secuencia FLAG, se produjeron luego de acuerdo con el Manual del kit Freedom™ CHO-S™ (Cat.N A13696-01 Lifescience Thermofisher Scientific, julio 2015).

Se permitió que se desarrollaran clones de CHO-S durante por lo menos 7 días, usualmente hasta 14 días, usando medio OptiCHO™ (se utilizaron otros medios definidos químicamente libres de suero en forma exitosa, p. ej., ActiCHO™, CD FortiCHO™ y similares) y en ausencia de presión de selección. Glutamina (o el análogo GlutMax) se enriqueció a 1-10 mM, preferiblemente 4-8 mM.

Se recogieron 100 ml del sobrenadante de una mezcla de 6 clones de CHO estables, se filtraron en una membrana PES de 0,2 gm y se cargaron en una columna de intercambio aniónico fuerte Capto Q (GE 17-5316-02, 1.6 x 6 cm, 12 ml) previamente equilibrada con TRIS 20 mM-HCI pH 7,5.

Las proteínas ligadas se eluyeron con un gradiente lineal de hasta NaCI 1 M en volúmenes de 8 columnas. Las fracciones eluidas que contenían la proteína diana, como se muestra con el análisis SDS-PAGE, se usaron para una segunda etapa de purificación por cromatografía de interacción hidrófila con fenilo.

La columna se lavó con NaOH 1 M, luego se equilibró y se almacenó a 4°C en 20% EtOH.

Se disolvió NaCI en las fracciones combinadas hasta una concentración de 4 M. Esta mezcla luego se cargó en una columna HIC de 1 ml (HiTrap Phenil HP™, GE Healthcare Life Sciences, Catálogo # 17-1351-01) previamente equilibrada con TRIS 20 mM-HCI pH 7,5, NaCI 4 M, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para una cromatografía de interacción hidrófoba. La elución se logró disminuyendo linealmente la concentración de cloruro de sodio hasta cero en volúmenes de 10 columnas. Las fracciones que contenían la proteína diana como se muestra mediante análisis SDS-PAGE se combinaron entre sí para una tercera etapa de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). La columna SEC (HiLoad 16/600 Superdex 200™ pg, GE Healthcare Life Sciences, Catálogo # 28-9893-35) se pre-equilibró con Tris 20 mM-HCI pH 7,5, NaCI 150 mM, que se usó como la fase móvil. Las fracciones que contenían la PSGL quimérica, Variante 1, como se muestra con el análisis SDS-PAGE, se combinaron y concentraron (Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit, EMD Millipore).

Como una alternativa más sensible a SDS-PAGE, se efectuó el análisis Western Blot con Phast-System (GE) como se describe en el manual de instrucciones. La membrana de nitrocelulosa se saturó con PBS 1% BSA (1 h a temperatura ambiente). La membrana se incubó 1 h a temperatura ambiente con PBS 0,5% Tritón X-100 1% BSA que contenía anticuerpo anti-P-Selectina Glucoproteína Ligando 11 ;1000 (anticuerpo anti-P-Selectina Glucoproteína Ligando 1, clon KPL-1, EMD Millipore, cod. MAB4092).

Después de 3 lavados con PBS 0,5% Tritón X-100, la membrana se incubó con IgG antirratón - HRP como anticuerpo secundario.

Después de 3 lavados, la señal de HRP se desarrolló con ECL, mostrando el reconocimiento del anticuerpo anti-PSGL-1 positivo.

La PSGL quimérica, Variante 1A, de diferentes subclones apareció como una banda simple a aproximadamente 60 kDa, que se desplazó a aproximadamente 30 kDa bajó condiciones reductoras, según lo esperado. No se observaron bandas adiciónales ni productos de degradación en Ios geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie del producto purificado.

Se seleccionó un clon para posterior subclonación, desarrollado a escala media y purificación en una escala media de 2 l de cultivó.

Ejemplo 3: Caracterización de la Variante 1A purificada

La proteína recombinante PSGL Variante 1A es muy heterogénea debido a las diferentes modificaciones post­ traducción, incluida la sulfatación y la N- y O-glucosilación. Para su caracterización plena y correcta cuantificación, se usó un conjunto de cuantificación correcta de métodos analíticos que incluían UPLC, MS y procedimientos de mapeo de péptidos con enzimas específicas. Las características estructurales de la PSGL Variante 1A, esenciales para su bioactividad, también se vigilaron cautelosamente.

3.1. UPLC-UV

Se utilizó cromatografía de fase inversa para determinar el contenido de la proteína diana y para cuantificar posibles impurezas o productos de degradación. Para experimentos de cromatografía de fase inversa, se usó una columna Acquity UPLC BEH300 (2,1x100 mm, 1,7 gm) a 50 °C en modo gradiente. Las fases móviles fueron (A) 0,1% TFA en agua y (B) 0,1% TFA en acetonitrilo. Se efectuó detección UV a 216 nm. El uso de la tecnología UPLC combinada con una columna de 2 gm sub dedicada permitió la resolución mejorada, sensibilidad superior, excelente forma del pico y significativa reducción en tiempos de análisis. El método UPLC-UV demostró que la pureza de la PSGL Variante 1A lograda por el proceso de purificación fue superior a 90%.

3.2. SEC-UV

Se usó la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), también llamada cromatografía de permeación de gel (GPC), acoplada a detección UV, que permite la separación de proteínas en base a su tamaño o forma eficaz (radio hidrodinámica). En este caso, el método se usó para medir posibles agregados y otras Variantes de tamaño. Para experimentos de cromatografía por exclusión de tamaño, se usó, TSK gel súper SW mAb HTP 4,6x150 mm (Tosoh), columna de 4 gm a 30°C en modo isocrático. La fase móvil fue NaH² PO⁴⁰50 mM, Na²HPO⁴50 mM, Na2SO⁴100 mM, y la detección UV se realizó a 216 nm. El uso de instrumentación UPLC optimizado para reducir el ancho de la banda de columna extra permitió una columna de gran eficiencia y mayor sensibilidad.

Se aplicó el método SEC-UV para el análisis de PSGL variante A-1: no se observó agregación.

3.3. Contenido de ácido siálico

Se conoce la sialilación como una característica crítica para biodisponibilidad, estabilidad, metabolismo e inmunogenicidad de productos farmacéuticos. Con este fin, se desarrolló un método HPLC MS para la determinación del ácido siálico de la proteína quimérica, Variante 1A.

El análisis se basó en la combinación del método de hidrólisis química acoplado con una cromatografía de líquidos libre de derivatización interconectada con espectrometría de masas en tándem por ionización con electropulverización (LC-MS/MS). Se liberó primero ácido siálico (ácido N-Acetil neuramínico, NANA) de la PSGL Variante 1A por hidrólisis ácida bajo condiciones moderadas. Una vez liberado el ácido siálico, se llevó a cabo su cuantificación gracias al uso del método LC-MS/MS. La cantidad de ácido siálico se determinó comparando la respuesta en la muestra con una curva de calibración estándar de referencia. En experimentos llevados a cabo con proteína purificada de otros subclones de CHO, la sialilación se halló típicamente comprendida entre 9,6 y 17,9 % p/p.

3.4. MALDI-TOF-MS

Los análisis de espectroscopia de masas de tiempo de vuelo con desorción y ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) se efectuaron para determinar el peso molecular de la PSGL, Variante 1A. Esta técnica implica mezclar la muestra con una matriz, que luego se recubre en una placa o sonda, y se somete a un haz de láser concentrado colimado, causando la ionización y desorción. MALDI tiene la ventaja de producir grandes iones de masas, con gran sensibilidad y poca fragmentación. Los experimentos MALDI-TOF se realizaron en PSGL Variante 1A, bajo formas intactas y reducidas. Según lo determinado por los experimentos MALDI, el peso molecular promedio de PSGL Variante 1A se midió en alrededor de 35,4 kDa. La reducción con DTT condujo a una reducción doble de la masa de PSGL Variante 1A, lo que indica la naturaleza dimérica de la proteína purificada.

3.5. Mapeo de péptidos (digestión enzimática)

Se usó mapeo enzimático (PMAP) para elucidar las modificaciones post-traducción (PTM) de la glucoproteína quimérica, incluida la sulfatación y la N- y O- glucosilación. Con este fin, se aplicaron tanto quimotripsina como Asp-N para digestión de proteínas, seguido de espectrometría de masas-cromatografía de líquidos LC-MS.

3.5.1. Fragmentación con quimotripsina

La fragmentación con quimotripsina se realizó siguiendo el protocolo provisto por el fabricante (Quimotripsina Endoproteinasa MS Grado, Cat. N. 90056, Thermo Scientific). Se reconstituyó un vial de quimotripsina seca en 25 gl de HCI 0,1 M y se conservó a -18 °C antes del uso como 2 gl alícuotas en tubos eppendorf de 500 gl. Para preparar el tampón de digestión, que consistía en Tris 100 miM-HCI pH (⁸ , CaCb 10 mM, 3,03 g de Base Tris (M 121,4 g/mol) y 368 mg CaCl² (M 147,02 g/mol) se disolvieron en agua. El pH se ajustó hasta 8,0 usando HCl 1,2 M y el volumen se completó hasta 250 ml.

Se añadieron 50 pl de una disolución stock de PSGL-1 Variante 1A (0,5-1,0 mg/ml) a 2 pl de quimotripsina y 48 pl de tampón de digestión. La disolución se incubó durante 18 horas a 37 °C antes de la inyección en LC-MS.

3.5.2. Fragmentación con endoproteinasa Asp-N

Se realizó la fragmentación de endoproteinasa Asp-N siguiendo el protocolo provisto por el fabricante (grado de secuenciación Asp N Roche, Cat. N. 11054589001). Se reconstituyó un vial de Asp-N seco en 50 pl de agua y se conservó a -18 °C antes del uso como 5 pl alícuotas en tubos Eppendorf de 500 pl. Para preparar el tampón de digestión, que consistía en fosfato de sodio 50 mM, se disolvieron 1,5 g de Na²HPÜ⁴ (M 119,98 g/mol) en agua. El pH se ajustó hasta 8,0 usando NaOH 1 M y el volumen se completó hasta 250 ml.

Se añadieron 10 pl de una disolución stock de PSGL-1 Variante 1A (0,5-1,0 mg/ml) a 5 pl de quimotripsina y 35 pl de tampón de digestión. La disolución se incubó durante 18 horas a 37 °C antes de la inyección en LC-MS.

Se usaron análisis LC-MS similares para la caracterización de Asp-N y digestos de quimiotripsina. Estos experimentos se efectuaron utilizando el sistema de UPLC Waters Acquity® que consistía en un administrador de muestras controlado por temperatura, un administrador de disolvente binario y un compartimiento de columnas calentado. La salida de la columna se conectó directamente al espectrómetro de masas. La columna analítica fue Poroshell® 120 EC-C182,1 x 150 mm i.d., tamaño de partícula 2,7 pm de Agilent® a 400C. La elución de los compuestos de la columna se llevó a cabo en el modo gradiente usando una fase móvil que consistía en agua ultrapura con 0,1% TFA y acetonitrilo con ⁰ ,¹ % de TFA. El caudal y el volumen de inyección se fijaron a 0,3 ml/min y ¹⁰ pl, respectivamente. La detección se realizó en un espectrómetro de masas de cuadrupolo en tándem Waters Xevo TQ-S equipado con una fuente de ionización por electropulverización en el modo de ionización positivo y negativo de acuerdo con el compuesto. Se emplearon nitrógeno y argón como gases nebulizantes y de colisión, respectivamente. Los análisis se efectuaron en el modo de barrido. La adquisición y el procesamiento de los datos se realizaron con la ayuda de un paquete de software MassLynx.

Todos los ensayos anteriormente mencionados permitieron las siguientes conclusiones:

• la estructura del término N de la glucoproteína PSGL-1 Variante 1A es dominada por la forma piroglutámica pQATEYEYL.

• el carácter dimérico de la PSGL Variante 1A se confirmó por la presencia de (M+2H⁾⁺² = 728,5 atribuido a la secuencia (⁵⁰TCPPCPL⁵⁶)². Los iones correspondientes a la forma monomérica de este péptido no se detectaron, lo que sugiere que la PSGL Variante 1A está completamente en la forma dimérica.

• se confirmó la estructura de los residuos O-glicano en Thr16: de hecho, se identificó el motivo Sialil-Lewis-X, una estructura de Núcleo 2 que comprende N-Acetilgalactosamina, N-Acetilglucosamina, galactosa, fucosa y ácido siálico.

• la sulfatación de las Tirosinas 5, 7 y 10 también se demostró por espectrometría de masas en el modo de barrido negativo.

La mayoría de las modificaciones post-traducción (PTM) se han descrito en SEQIDNO:38.

Ejemplo 4: Unión de afinidad en P-selectina por resonancia de plasmones de superficie (SPR)

Los experimentos se llevaron a cabo con la proteína purificada Fr1 como se describe en el Ejemplo 2 del documento W02012/020030 y la Variante 1A como se describió en el Ejemplo 2 anterior.

La fuerza de unión de PSGL Variante 1A se evaluó por resonancia de plasmones de superficie (SPR) usando Biacore X100 de GE Healthcare Bio-Sciences AB (General Electric, Piscataway, NJ). La tecnología SPR permite el monitoreo del proceso de unión entre las biomoléculas en tiempo real y sin etiquetas. Si bien se acopló P-selectina (ligando diana) a una superficie con chip sensor, las proteínas de interés fluyeron en la disolución sobre la superficie usando un sistema microfluido para asegurar la administración de la muestra reproducible y el bajo consumo de la muestra. SPR detecta eventos de unión como cambios en masa en la superficie del chip. En consecuencia, se genera un sensograma generado por el trazado de la respuesta de la SPR contra el tiempo.

En primer lugar, se efectuó internamente la biotinilación de P-selectina/Fc (R&D Systems Europe Ltd). Luego se llevó a cabo la inmovilización de P-selectina/Fc en el sensor de trabajo (Fc2) de SA Chip (chipo de estreptavidina, GE Healthcare Bio-Sciences) de la siguiente manera: un volumen del tampón 10x HBS-N (GE Healthcare Bio-Sciences AB) (50 ml) se diluyó con 9 volúmenes de Milli-Q water (450 ml). Se añadieron 500 microlitros de CaCl²1,5 M (Fluka), pH aproximadamente 5,6 al tampón diluido (1,5 mM final) y se filtraron a través de un filtro PES de 0,2 pm. El tampón de corrida se preparó con 48,75 ml de tampón HBS-N, CaCl² 1,5 mM y 1,250 ml de tensioactivo P20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) en un tubo Falcon de 50 ml. El tampón HBS-N y CaCl² 1,5 mM no se usaron inmediatamente y se conservaron a 4⁰C.

Cada muestra a ensayar se diluyó en tampón de corrida para lograr la concentración indicada de 125 nM. Se inició una pasada manual en el sensor de referencia (Fc1) y Fc2 con un caudal de 30 pl/min. Se seleccionó la sustracción de referencia 2-1. Ni bien la línea de base estuvo estable, se inyectó el analito durante 30 seg o más, si no se alcanzó el equilibrio de unión. Para comparar directamente la unión de diferentes analitos o diferentes concentraciones del mismo analito, fue necesario programar los mismos parámetros del ciclo para cada muestra, por ejemplo;

Espera 120 seg.

Inyección 30 seg.

Espera 300 seg.

Cuando la pasada manual finalizó, se abrió el software Biacore X100 Evaluation, versión 1.0, para crear una superposición de cada ciclo.

En base a los experimentos de SPR, se midió la afinidad de unión hacia P-selectina, y se halló que la fuerza de unión de las proteínas quiméricas a la diana era equivalente o mejor que la unión a Fr1. La Figura 2 muestra el resultado de la pasada Biacore, en donde la proteína quimérica de la presente invención (línea sombreada) demostró una mejor unión al ligando de P-selectina con respecto a Fr.1.

También se empleó SPR para la titulación de la Variante 1A en el sobrenadante celular, de acuerdo con el método descrito en Chou T-H. et al. Cytokine 51, 2010, 107-111. El chip sensor se superpuso con la estreptavidina y un anticuerpo a-PSGL-1 de ratón (KPL-1, Abcam, cat. N. ab78188) biotinilado en Bracco, utilizado para cuantificar la Variante 1A en el sobrenadante.

Ejemplo 5: Preparación de la Variante 1A-SMCC para conjugación de fosfolípidos

El proceso se llevó a cabo según el ejemplo 9 del documento W02012/020030.

En síntesis, la Variante 1 (65 nmoles) del ejemplo 2 se disolvió en 1 ml de tampón de fosfato 0,2 M, pH 7,5 con EDTA 1 mM. Se preparó una disolución de Sulfo-SMCC (Sulfo-SMCC; sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato) (Pierce) (55 mg/ml - 125 mM) en dimetilsulfóxido anhidro (DMS0, Fluka) y 52 pl de la disolución se añadió a la disolución de la Variante 1. La disolución se incubó a temperatura ambiente durante 45'. Luego la disolución se centrifugó en una columna de centrifugación (columna de centrifugación Zeba, 5 ml, Pierce # 89890) equilibrada en tampón de fosfato 20 mM pH ⁶. Se añadió isopropanol a la disolución para obtener una disolución que contenía 35 % isopropanol.

Ejemplo 6: Preparación del conjugado DSPE-PEG-SH

Se preparó DSPE-PEG2000-SH (DSPE; diestearoil fosfatidil-etanolamina modificada con PEG2000) a partir de DSPE-PEG2000-PDP (1,2 Diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato (polietilenglicol)-2000] sal de amonio) de acuerdo con el ejemplo 10 del documento W 02012/020030. La disolución final de DSPE-PEG2000-SH se diluyó con Isopropanol para obtener una disolución que contenía 35 % Isopropanol.

Ejemplo 7: Preparación del conjugado DSPE-PEG-SH/Variante 1A-SMCC

Se añadieron 1,7 ml de disolución de la Variante 1A-SMCC (65 nmoles) obtenida en el ejemplo 5 a una disolución de DSPE-PEG2000-SH (325 nmoles - 5 equivalentes) obtenida en el ejemplo ⁶. La disolución se incubó durante tres horas a temperatura ambiente con agitación (rueda giratoria).

La disolución después se purificó por cromatografía de intercambio aniónico con un gel ANX Sepharose (GE Healthcare). La disolución que contenía el conjugado de la Variante 1 purificado se centrifugó en una columna de centrifugación (columna de centrifugación Zeba de 10 ml, Pierce #89893) equilibrada en tampón TRIS 20 mM pH 7,5.

Ejemplo 8: Preparación de microvesículas con los conjugados del Ejemplo 7

Se disolvieron 10 mg de una mezcla de DSPC (DSPC; Diestearoilfosfatidilcolina) y ácido palmítico (relación molar 80/20) en ciclooctano (^{0 , 8} ml) a 70 °C. Por separado, la disolución del conjugado DSPE-PEG-SH/Variante ¹ -SMCC preparada de acuerdo con el ejemplo 7 (28 nmoles - 1,3 ml) se añadió a 8,7 ml de disolución de PEG4000 al 10% en agua destilada. Se añadió una disolución de DPPE-PEG5000 (DPPE; dipalmitoilfosfatidiletanolamina), (0,85 mg en 85 pl de agua) a esta fase acuosa.

Las disoluciones orgánicas y acuosas anteriormente preparadas se mezclaron usando un homogeneizador de alta velocidad (Polytron PT3000) para obtener una emulsión. La emulsión resultante se calentó agitando a 60 °C durante una hora, luego se enfrió hasta temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C).

La emulsión obtenida se diluyó dos veces con una disolución de PEG4000 10 % en agua destilada y se tomaron muestras en viales DIN⁸ R (0,5 ml emulsión/vial). Los viales se congelaron a -50 °C durante 1 hora (liofilizador Lyobeta 35 - TELSTAR), luego se liofilizo a -20 °C y 0,2 mbar durante 12 h. El producto liofilizado se expuso luego a una atmósfera de mezcla de perfluoro-n-butano y nitrógeno (35/65 v/v) y los viales se sellaron.

El producto se dispersó en un volumen de disolución salina 150 mM (1 ml/vial) mezclando manualmente en forma moderada.

E jem p lo 9: A c tiv id a d d e un ió n in vitrod e las m ic ro v e s íc u la s d ir ig id a s en un e n to rn o d e c á m a ra d e flu jo

Para ensayar la unión eficaz, las microvesículas dirigidas preparadas como se describe en el documento W02012/020030 (Ejemplo ⁶ ) y aquellas preparadas de acuerdo con la presente invención (ejemplo ⁸ ) se inyectaron en una cámara de flujo que comprendía un recubrimiento de Fc P-Selectina de ratón (catálogo número 737-^p S , R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) o Fc P y E selectinas humanas (R&D catálogos números 137-PS 50 y 724 ES 100) a 4 pg/ml. Las microvesículas (en número equivalente a 80x106/400 pl TBS++) se inyectaron a través de la cámara de flujo (FCS2, Bioptech, EE. UU.) en un modo tipo bolo, y su adhesión a la capa de recubrimiento de P-selectina de ratón (o P- o E-selectina humana) se evaluó en un período de 10 min a un caudal de 1,0 ml/min (velocidad de cizalladura de 714 s-1) en presencia de 50% (v:v) plasma humano (Stehelin & Cie AG) en TBS. Se efectuó un análisis cuantitativo de acumulación de microvesículas contando el número de microvesículas que se adherían en el área observada en intervalos de ² min en una infusión total de ¹⁰ min, usando el programa de procesamiento de imágenes Analysis FIVE (SIS, Alemania). Después de 10 min, se tomaron cinco fotografías aleatoriamente, se midió el número de microvesículas ligadas, y se expresó como el número de burbujas ligadas (NBB) en 10 min. Cada área observada fue de 183 x 137 pm, según lo medido con la ayuda de un micrómetro con rango. La medición se efectuó entre la mitad y la salida de la cámara.

De modo similar, suspensiones de microvesículas dirigidas preparadas de acuerdo con el ejemplo ⁸ (Variante 1A como ligando dirigido) se inyectaron en una cámara de flujo como se describió anteriormente, y su actividad de unión se determinó de acuerdo con el procedimiento anterior.

El experimento se repitió en los recubrimientos de E-selectina humana y P-selectina de ratón en la misma concentración que anteriormente (4 pg/ml). Los resultados se exponen en la Tabla 4.

T a b la 4: Número de microvesículas ligadas en 10 min (NBM 10 min)

Como se puede inferir a partir de los resultados anteriores, la conducta de unión de MB-PSGL-1 Variante 1A recién preparada es similar a la microburbuja que porta Fr 1: exhiben unión firme sin agregación en plasma y se unen a P-selectina humana y de ratón, así como también a E-selectina humana.

E je m p lo 10: e x p e rim e n to s in vivo d e m ic ro v e s íc u la s con el F ra g m e n to 1 (c o m p a ra tiv o ) y la V a r ia n te 1A

Las microvesículas con la Variante 1A preparadas de acuerdo con el ejemplo ⁸ anterior y aquellas que portan el Fragmento 1 (Fr-1) preparadas de acuerdo con el documento W02012/020030, ejemplo ⁶ , se compararon en un modelo de rata inflamatorio. La inflamación se indujo en la extremidad trasera de la rata por inyección de lipopolisacárido (LPS, 0.26:B6 Sigma L-8274, 2,1 mg/kg). La unión eficaz de las microvesículas dirigidas se evaluó por imágenes de ultrasonido con contraste 24 h después de la inducción del proceso inflamatorio. Se efectuaron imágenes mejoradas por ultrasonido con contraste usando el escáner de ultrasonido Logiq E9 (General Electric Healthcare, Fairfield, Connecticut, EE. UU.) equipado con el transductor lineal 9L (frecuencia de transmisión, 4,0 MHz (Res); rango dinámico, 48 dB; profundidad, 20 mm; compensación ganancia de tiempo (TGC), lineal) operando en modo contraste. Se registró una imagen por segundo a bajo índice mecánico (MI=0,06) durante 30 s y luego una imagen cada 15 segundos hasta diez minutos. Diez minutos después de una inyección monodosis, se adquirió la señal potenciada por contraste durante 10 segundos en una velocidad secuencial de 4Hz. Las imágenes potenciadas por contraste se registraron como archivos Dicom y se analizaron usando un software dedicado desarrollado internamente (VueBox, Bracco Suisse SA, Ginebra, Suiza). Este software permite un análisis cuantitativo de la señal ecográfica después de la linealización de las secuencias de video comprimidas por logaritmos a nivel de píxeles y proporciona amplitud de eco-potencia de contraste (expresada como unidad arbitraria, A.U.) dentro de un área de interés (AOI). Se aplicaron el algoritmo de imágenes de burbujas fijas (FBI) integrado en el software desarrollado en Bracco (kit comercial VueBox y) y ayuda para detectar burbujas ligadas en los marcos registrados en 10 minutos. El procesamiento de FBI depende de una función de proyección de intensidad mínima aplicada en un subconjunto de imágenes que depende de la longitud de la ventana (40 marcos). Las imágenes resultantes (Figura 3) mostraron que las microburbujas que porta la Variante 1A son capaces de visualizar la inflamación en la extremidad inflamada de la rata, y la señal observada es muy similar a aquella observada con las microburbujas que portan Fr-1.

Ejemplo 11: preparación de liposomas fluorescentes con los conjugados del Ejemplo 7

Se disolvió colesterol (28.25 mg - Merck #3672) en 1 ml de cloroformo. DSPE-PEG2000 (13,9 mg - Genzyme #LP-R4-039) en 1 ml de cloroformo. Se disolvió DiR (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindotricarbocianina Yoduro - Molecular Probes #D12731) en etanol para obtener una disolución de 10 mg/ml.

Se pesó DSPC (79,7 mg - 101 gmoles - Genzyme #LP-04-013) en un globo redondo de 100 ml y se disolvió en 30 ml de mezcla de cloroformo/metanol (2/1 v/v). Las muestras de la disolución de colesterol (575 gl - 42 gmoles), de la disolución de DSPEPEG2000 (290 gl - 1,5 gmol) y la disolución DiR (100 gl - 1 gmol) se añadieron a la disolución de DSPC. La disolución obtenida se agitó a 65°C durante 10 min, y los disolventes se eliminaron a presión reducida para obtener una mezcla de lípidos. Esta mezcla se secó a 65°C bajo 20 mmHg, luego durante la noche a 25°C bajo 0,2 mBar.

La mezcla de lípido seco se redispersó en 10 ml de tampón Tris 20 mM (pH 7,4) a 70°C bajo agitación (evaporador rotatorio) durante 20 min. La suspensión obtenida se extrusó luego a 70 °C varias veces en filtros Nuclepore (1x1 gm, 1x0,6 gm y 4x0,4 gm). Esta etapa de extrusión podría adaptarse para obtener varios tamaños de liposomas. La suspensión liposomal se enfrió luego hasta temperatura ambiente y se conservó a 4°C en la oscuridad.

La incorporación del conjugado de la variante se llevó a cabo por un procedimiento de post-inserción. En síntesis, se mezclaron 500 gl de suspensión de liposomas con 1 ml de la disolución del conjugado de la Variante 1A preparada en el ejemplo 7 (22 nmoles) a temperatura ambiente durante 16 horas en la oscuridad. La suspensión de liposomas obtenida se usó sin purificación para experimentos in vivo.

Los liposomas Fr-1 se obtuvieron usando el mismo procedimiento descrito anteriormente, reemplazando los conjugados de la Variante 1A por los conjugados Fr-1 (preparados como se describe en el documento W02012/020030, Ejemplo ⁶ ). Las características de las dos suspensiones de liposomas se compararon en la Tabla ⁶.

El tamaño y el potencial zeta de los liposomas se determinaron usando un Nanosizer ZetaZSP (Malvern instruments). La densidad de ligando por liposoma se determinó después de lavar los liposomas (centrifugación 20000 g/30 min) por determinación de ácido siálico (según ejemplo 3.3)

Tabla 5 - Características de control, liposomas Variante 1A y Fr-1

Ejemplo 12. Experimentos para adquisición de imágenes ópticas que usan liposomas con el Fragmento 1 (comparativo) y la Variante 1A en el modelo de LPS de ratón.

Los liposomas que portan la Variante 1A se compararon con los liposomas con el Fragmento 1 en dos grupos de animales con inflamación de la extremidad trasera. La inflamación se indujo en la extremidad trasera del ratón por inyección intramuscular de lipopolisacárido (LPS, 0.26:B6 Sigma L-8274). Se tomaron imágenes ópticas usando el sistema preclínico Fluobeam 700. El cabezal óptico se dispuso encima del animal de modo tal que sus extremidades traseras quedaran dispuestas en el centro del campo de visión de la cámara (distancia entre el ratón y la cámara de 15 cm). Veinticuatro horas después de la inducción del proceso inflamatorio, se inyectaron los liposomas dirigidos y se siguió la señal fluorescente con el transcurso del tiempo (hasta 24 h). La inyección y la fase temprana se registraron como una secuencia con una imagen cada 5 segundos durante 16 minutos (con tiempo de exposición fijo), seguido de imágenes individuales a 20, 30, 45 min, 1, 2 y 4 horas. Las imágenes se analizaron usando el software Image J. En todos los marcos de captura, se dibujó el mismo área de interés (AOI) para delinear las extremidades inflamadas y contralaterales. La intensidad de fluorescencia media por milisegundo se calculó en el AOI de cada imagen. Las imágenes fluorescentes se presentan en la Figura 4 y los resultados de cuantificación que se expresan como la relación (extremidad inflamada por extremidad contralateral) se presentan en la Tabla 7. Las imágenes fluorescentes registradas 2 horas después de la inyección de Variante 1A-liposomas-DIR demostraron una señal superior en la extremidad inflamada en comparación con la señal en la extremidad contralateral. En caso del animal 3, la señal observada en la extremidad inflamada es baja probablemente debido a la baja inflamación inducida por LPS en este ratón. Por lo contrario, el animal ⁶ presenta una alta señal indicada de gran inflamación. La relación calculada extremidad inflamada/extremidad contralateral es mayor para la Variante 1A comparada con el Fragmento-1 (Fr-1), indicativa de una buena especificidad del agente.

Tabla 6: Relación de extremidad inflamada a extremidad contralateral en el modelo de ratón inflamatorio LPS, 2h después de la inyección o bien de Variante AI-liposomas-DIR o Fr-1-liposomea-DIR

Ejemplo 13. Optimización de las condiciones de purificación por cromatografía HA (negativa o positiva)

Purificación por AE/HI y HA (negativa)

Se filtraron 600 ml de medio acondicionado en una membrana de 0,22 pm y se cargaron en una columna AEX (Capto Q™, GE, 2,6 x 7 cm, 37 ml) equilibrada con TRIS 20 mM pH 7,5. Las proteínas ligadas se eluyeron con elución en 2 etapas a 30% y ^{1 00} % de T ^{r i} S ²⁰ mM, NaCI ¹ M, pH 7,5. La proteína diana se eluyó en el ^{1 00} % de la fracción. La columna se limpió con NaOH 1M y se conservó a 4°C en 20% EtOH. La conductividad del medio acondicionado estuvo debajo de 10 mS/cm.

Se añadió NaCI sólido a la mezcla de la etapa de elución 100% de la purificación AEX hasta una concentración final de 4 M. La muestra se dividió en dos partes con el fin de no sobrecargar la columna. Luego se cargó en una columna cromatográfica de interacción hidrófoba (Phenil Sepharose™, GE, 1,6 x 9 cm, 18 ml volumen) previamente equilibrada con TRIS 20 mM, NaCI 4 M, pH 7,5. Las proteínas ligadas se eluyeron con 2 etapas a 50% y 100% de TRIS 20 mM pH 7,5. La proteína diana se eluyó en el 50% de la fracción.

Después de la segunda pasada, la columna se lavó con NaOH 0,2 M y se almacenó a 4°C en 20% EtOH.

Las mezclas de la primera etapa de elución en las dos pasadas HIC se combinaron, y las concentraciones de fosfato/CaCl² combinadas se ajustaron hasta 10 y 0,3 mM, respectivamente, por adición de fosfato 500 mM pH ^{6 , 8} y CaCl² 1 M. La mezcla luego se diafiltró contra fosfato 10 mM, CaCl²0,3 mM, pH ^{6 , 8} en una célula agitada por ultrafiltración Amicon™ (Merck, ensamblada con membrana YM10, con valor de corte de peso molecular nominal 10 kDa). Después la mezcla diafiltrada se cargó en una columna de hidroxiapatita (BioRad, 2,2 x 5 cm, volumen de 19

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína dimérica que comprende dos proteínas quiméricas recombinantes del ligando 1 de la gluooproteína P-selectina (PSGL-1), en donde la proteína quimérica recombinante PSGL-1 comprende por lo menos: un dominio de unión a selectina capaz de unirse específicamente a una proteína selectiva y que comprende por lo menos aa 5-16 de SEQIDNO:11 (secuencia PSGL-1 madura), un dominio de unión a la cremallera de leucina capaz de formar una a hélice del lado derecho, promoviendo así la dimerización a través de la interacción proteína-proteína, y que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 187-208 de la SEQIDNO:12 (cremallera de leucina específica de retina neural) y una región promotora de enlaces disulfuro que comprende por lo menos una cisteína disponible para formar un enlace disulfuro con otra cisteína en una contrapartida de proteína quimérica monomérica, de modo tal que los dos monómeros de proteína dimérica están covalentemente enlazados entre sí por al menos un enlace disulfuro.

2. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a selectina comprende por lo menos aa 1 -47 de SEQINO:11 (secuencia PSGL-1).

3. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 1), en donde dicha cremallera de leucina comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 181-215 de SEQIDNO:12.

4. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1)-3) en donde dicha región promotora de enlaces disulfuro comprende una secuencia de aminoácidos definida por la siguiente fórmula:

(X1)n-C(X2)m-(X3)

en donde:

- X¹, X² representa cualquier aminoácido o secuencia de aminoácidos con la exclusión de cisteína (Cys), - C es Cys

- X³ es cualquier aminoácido y

- n, m son números enteros comprendidos entre 1-6.

5. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 4) en donde:

- X¹ preferiblemente comprende una Prolina, Histidina o Treonina;

- n es como máximo 5 y

- X² comprende por lo menos una Prolina

6. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 5) en donde:

- X² es Pro-Pro;

- X³ comprende una Cisteína y por lo menos una Prolina.

7. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 6) en donde dicha región que promueve dichos enlaces disulfuro es una región bisagra IgG1 (SEQIDNO:20).

8. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1)-7), en donde la proteína PSGL-1 quimérica recombinante monomérica comprende además un espaciador de poliglicina que comprende por lo menos una lisina (Lys o K) o una cisteína (Cys o C).

9. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 8) en donde dicho espaciador es SEQIDNO: 17.

10. La proteína dimérica según la reivindicación 1 -9) que es un homodímero.

11. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína PSGL-1 quimérica recombinante monomérica comprende además una secuencia de péptidos de señalización adecuada para segregación y para ser escindida antes de la segregación.

12. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según la reivindicación 11 en donde dicho péptido de señalización se selecciona del grupo que consiste en: SEQIDNO:18 y SEQIDNO 21-34.

13. La proteína dimérica que comprende dos proteínas PSGL-1 quiméricas recombinantes según una cualquiera de las reivindicaciones 11 )-12), en donde dicho péptido de señalización es el péptido de señalización IgH de ratón (SEQINO:18)

14. Una secuencia de ADN que codifica la proteína PSGL-1 quimérica recombinante monomérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9) y 11 )-13), en donde la proteína PSGL-1 quimérica recombinante monomérica comprende un dominio de unión capaz de unirse específicamente a una proteína selectina y que comprende por lo menos aa 5-16 de SEQIDNO:11 (secuencia PSGL-1 madura), un dominio de cremallera de leucina capaz de formar una a hélice del lado derecho, promoviendo así la dimerización a través de la interacción proteína-proteína y que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% homóloga o idéntica a aa 187-208 de SEQIDNO:12 (Cremallera de leucina específica de la retina neural) y regiones promotoras de enlaces disulfuro que comprenden por lo menos una cisteína disponible para formar un enlace disulfuro con otra cisteína en una contrapartida de proteína quimérica monomérica.

15. Un vector de expresión eucariota que comprende la secuencia de ADN según la reivindicación 14).

16. Una célula mamífera transformada con el ADN o el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 14)-15).

17. Una proteína dimérica aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 )-13).

18. La proteína dimérica aislada según la reivindicación 17), que es homodimérica, O-enlazada glucosilada por lo menos en Thr en la posición 16 y sulfatada por lo menos en Tyr en las posiciones 5, 7 y 10 de SEQIDNO:11.

19. Un compuesto conjugado que comprende la proteína recombinante dimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1)-13) o 17)-18) y un resto diagnóstico o terapéutico.

20. El conjugado según la reivindicación 19), en donde el resto diagnósticamente útil se selecciona del grupo que consiste en: una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, un compuesto quelante de metales, una microvesícula de lípidos rellena de gas y una combinación de los restos diagnósticamente activos.

21. El conjugado según la reivindicación 20) en donde la microvesícula rellana de gas es un fosfolípido.

22. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 19)-21) para uso en un método de adquisición de imágenes seleccionado del grupo que consiste en: resonancia magnética por ultrasonido, escintigrafía acústica, tomografía computada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía por emisión de positrones (PET), rayos X, radiofrecuencia acústica y óptica.

23. Composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína quimérica recombinante dimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 )-13) o 17)-18) o los conjugados según las reivindicaciones 19)-22).

24. Proceso para preparar la proteína recombinante dimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 )-13) o 17)-18), que comprende transformar una célula eucariota con la secuencia de ADN de la reivindicación 14) o el vector de la reivindicación 15) para lograr un sistema recombinante que expresa establemente la proteína quimérica monomérica, cosechando el medio de cultivo y purificando la proteína recombinante dimérica de dicho medio de cultivo.