ES2905498T3 - Medicamento con afinidad encapsulado en liposoma - Google Patents

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Abstract

Una composición antifolato liposomal que comprende: un liposoma que incluye un espacio interior; un agente antifolato bioactivo dispuesto dentro de dicho espacio interior; un PEG unido al exterior del liposoma; una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, estando dicha proteína unida a al menos uno de entre el PEG y el exterior del liposoma; y en la que el liposoma tiene un potencial zeta que es menor o igual a cero y el liposoma es aniónico o neutro.

Description

DESCRIPCIÓN
Medicamento con afinidad encapsulado en liposoma
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de solicitud provisional US n° 62/037.597, presentada el 14 de agosto de 2014, la solicitud provisional US n° 62/130.493, presentada el 9 de marzo de 2015 y la solicitud provisional US n° 62/133.265, presentada el 13 de marzo de 2015.
Antecedentes
El cáncer es una enfermedad muy difícil de tratar debido a la diversidad del tipo de cáncer, los mecanismos implicados en la progresión de la enfermedad y la variabilidad de los pacientes asociada a la composición genética subyacente del paciente. Los primeros esfuerzos para tratar el cáncer han implicado el uso de agentes citotóxicos, incluidos los antifolatos. Los antifolatos se refieren a una clase de moléculas que antagonizan (es decir, bloquean) las acciones del ácido fólico (vitamina B9). La función principal del ácido fólico en el organismo es servir de cofactor a varias metiltransferasas que participan en la biosíntesis de la serina, la metionina, la timidina y la purina. En consecuencia, los antifolatos inhiben la división celular, la síntesis y reparación del ADN/ARN y la síntesis de proteínas.
La justificación de la introducción de los antifolatos como agentes anticancerígenos se basó en que los folatos son importantes para la supervivencia de todas las células en división, ya que los folatos son ingredientes esenciales para la síntesis del ADN (ácido nucleico) durante la replicación celular. La absorción de folatos por cualquier célula, normal o cancerosa, está mediada principalmente por los transportadores de folatos reducidos (RFC), que es un abundante transportador de membrana cruzada con baja afinidad por los folatos.
Debido a que las células cancerosas son células de rápido crecimiento y por lo tanto tienen una alta demanda de precursores de ADN en forma de folatos, son susceptibles a los efectos de los antifolatos. Las células normales de crecimiento rápido, como las células que recubren el tracto gastrointestinal y las células de la médula ósea, también se dividen rápidamente utilizando los folatos suministrados principalmente a través de los RFC. Por lo tanto, las células normales también son susceptibles a los antifolatos, ya que los mecanismos de transporte mediados por el RFC que los antifolatos emplean para infiltrarse y eliminar las células cancerosas también tienen el potencial de provocar un efecto colateral de eliminación de las células normales de crecimiento rápido, lo que provoca toxicidades no deseadas relacionadas con los antifolatos.
Los antifolatos actúan interfiriendo con la acción de los folatos, privando a las células cancerosas de los precursores del ADN que necesitan para proliferar o crecer. Los antifolatos como clase se utilizan por su efecto antiproliferativo en el tratamiento del cáncer para inhibir el crecimiento y la división celular, lo que provoca la muerte de las células cancerosas. El hecho de que las células cancerosas se reproduzcan rápidamente y requieran una mayor cantidad de folatos en comparación con la mayoría de las células normales llevó al desarrollo clínico de los antifolatos como agentes anticancerígenos hace casi 70 años. Sin embargo, aunque la terapia basada en los antifolatos ha demostrado ser eficaz para el tratamiento del cáncer, su desarrollo clínico se ha visto a menudo desbaratado debido a un imperioso dilema clínico. Este dilema se deriva de dos dinámicas clínicas contrapuestas. Por un lado, los antifolatos están diseñados como moléculas que imitan al folato y la mayoría de ellos pretenden llegar a las células cancerosas utilizando RFC como mecanismo preferente de transporte a través de las membranas. Por otro lado, los tejidos normales de rápida renovación en el cuerpo como, por ejemplo, la médula ósea o las células del tejido de la vía intestinal son, al igual que las células cancerosas, también altamente dependientes del folato y utilizan también los RFC como mecanismo primario de suministro celular de folato a través de la membrana. El resultado neto de estas dos dinámicas clínicas es que las células de la médula ósea y del tracto gastrointestinal (GI), por ejemplo, han sido típicamente un sitio muy prevalente de las toxicidades relacionadas con los antifolatos que amenazan la vida de los pacientes. Algunas de estas toxicidades han sido mucositis, diarrea, anemia, neutropenia y recuentos bajos de glóbulos blancos. La consecuencia de estos efectos secundarios intratables relacionados con los antifolatos en los pacientes ha sido que los antifolatos que presentan propiedades citotóxicas o anticancerosas muy eficaces han fracasado normalmente durante su desarrollo o tienen, hasta la fecha, un uso limitado en la práctica clínica porque estos antifolatos también tienden a tener efectos secundarios debilitantes en forma de toxicidades inaceptables en las células normales.
Los antifolatos como clase siguen siendo una modalidad de tratamiento prometedora para el cáncer, a pesar del riesgo asociado de toxicidades graves e incluso mortales para los pacientes. El reto ha sido encontrar una forma de administrar eficazmente los antifolatos de manera que se reduzca y/o evite el daño a las células normales. Recientemente, debido a la disponibilidad de nuevas terapias alternativas para el cáncer, los antifolatos han perdido favor en comparación con dichas terapias, a pesar de la excepcional eficacia de los antifolatos para eliminar las células cancerosas. En este contexto, el documento US2014120157 es relevante.
Breve sumario
Un inmunoliposoma neutro o aniónico con afinidad y especificidad por el receptor o los receptores de folato que contiene un agente bioactivo acuoso como un agente anticancerígeno (antineoplásico) es sorprendentemente eficaz contra las células que presentan receptores de folato en su superficie celular.
En una realización, se proporciona una composición antifolato liposomal según la reivindicación 1. La composición antifolato liposomal comprende: un liposoma que incluye un espacio interior; un agente antifolato bioactivo dispuesto dentro de dicho espacio interior; un PEG unido a un exterior del liposoma; y una fracción dirigida a diana que comprende una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha fracción dirigida a diana unida a al menos uno de los PEG y al exterior del liposoma. Para la composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, el liposoma tiene un potencial zeta que es menor o igual a cero y el liposoma es aniónico o neutro. El PEG puede tener un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
De acuerdo con la invención, también se proporciona una composición antifolato liposomal según la reivindicación 21. El ejemplo de composición antifolato liposomal comprende un medio que comprende un liposoma que incluye un espacio interior; un agente antifolato bioactivo acuoso dispuesto dentro de dicho espacio interior; una fracción dirigida a diana que comprende una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha fracción dirigida a diana dispuesta en el exterior del liposoma. El medio de esta composición puede ser una solución acuosa. La solución acuosa puede comprender al menos un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en manitol; trehalosa; sorbitol; y sacarosa. La composición antifolato liposomal puede comprender además un estabilizador estérico unido al exterior del liposoma, en el que la fracción de unión a diana está unida a al menos uno de los estabilizadores estéricos y al exterior del liposoma. El estabilizador estérico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA); poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidil poliglicerol; poli[N-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico. El PEG puede tener un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
En cualquiera de las composiciones, liposomas, productos, kits y procedimientos ejemplar, se pueden incorporar las características adicionales de los siguientes párrafos.
La composición antifolato liposomal puede comprender además al menos uno de los agentes inmunoestimuladores y un marcador detectable dispuestos en al menos uno de los PEG y un exterior del liposoma. La composición antifolato liposomal puede tener una característica en la que el al menos uno de los agentes inmunoestimulantes y un marcador detectable está unido covalentemente a al menos uno de los PEG y al exterior del liposoma. El agente inmunoestimulante puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un agente inmunoestimulante de proteínas; un agente inmunoestimulante de ácidos nucleicos; un agente inmunoestimulante químico; un hapteno; y un adyuvante. Por ejemplo, el agente inmunoestimulante puede ser isotiocianato de fluoresceína (FITC). Como otro ejemplo, el agente inmunoestimulante es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: fluoresceína; DNP; beta glucano; beta-1,3-glucano; y beta-1,6-glucano. El marcador detectable puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en fluoresceína e isotiocianato de fluoresceína (FITC). A modo ejemplar, el agente inmunoestimulador y el marcador detectable es el mismo, por ejemplo, puede ser isotiocianato de fluoresceína (FITC).
La composición antifolato liposomal puede tener un diámetro en el intervalo de 30-150 nm, como, por ejemplo, en el intervalo de 40-70 nm. Como otra característica, el liposoma puede ser un liposoma aniónico o un liposoma neutro. El potencial zeta del liposoma es menor o igual a cero; por ejemplo, en el intervalo de 0 a -150 mV o en el intervalo de -30 a -50 mV.
La composición antifolato liposomal comprende liposomas. Los liposomas pueden estar formados por cualquier componente liposomal. Por ejemplo, el componente liposomal puede comprender al menos uno de entre un lípido aniónico y un lípido neutro. Como otro ejemplo, el componente liposomal es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-PEG-maleimida; Hs Pc ; HSpC-PEG; colesterol; colesterol-PEG; y colesterolmaleimida. Como otro ejemplo, los componentes liposomales comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-PEG-FITC; DSPE-PEG-maleimida; colesterol; y HSPC.
Como se ha comentado, el liposoma puede encerrar una solución acuosa. Por ejemplo, el liposoma puede encerrar un agente antifolato bioactivo y un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender trehalosa como, por ejemplo, del 5% al 20% en peso de trehalosa. El vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, puede comprender un tampón de citrato en una concentración de entre 5 y 200 mM y un pH de entre 2,8 y 6. Independientemente de otros ingredientes, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender una concentración total de acetato de sodio y acetato de calcio de entre 50 mM y 500 mM.
El agente antifolato bioactivo puede ser soluble en agua. Como ejemplo, la composición antifolato liposomal puede tener un liposoma y parte del liposoma puede comprender menos de 200.000 moléculas del agente antifolato bioactivo. Por ejemplo, el liposoma puede comprender entre 10.000 y 100.000 moléculas del agente antifolato bioactivo.
El agente antifolato bioactivo puede comprender Pemetrexed. En otra realización ejemplar, el agente antifolato bioactivo puede comprender lometrexol. En otra realización ejemplar, el agente antifolato bioactivo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en metotrexato; ralitrexed; aminopterina; pralatrexato; lometrexol; análogo de tiofeno del lometrexol; análogo de furano del lometrexol; trimetrexed; LY309887; y GW 1843U89. Alternativamente, o además, el agente antifolato bioactivo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en proguanil; pirimetamina; trimetoprima y la clase de inhibidores de GARFT de pirrolo y tión[2,3-d]pirrolopirimidina. Los análogos del lometrexol se describen, por ejemplo, en Habeck et al., Cancer Research, v. 54, página 1021-1026, 15 de febrero de 1994.
El agente antifolato bioactivo o cualquier agente bioactivo puede estar a un pH de 5-8 en la composición antifolato liposomal. Alternativamente, la composición antifolato liposomal puede comprender el agente antifolato bioactivo a un pH de 2-6.
Cualquiera de las fracciones, como la fracción de unión a diana, la etiqueta detectable, el agente inmunoestimulador, el estabilizador estérico y cualquier otra fracción y agente opcional pueden unirse al liposoma o al componente liposomal directa o indirectamente. La unión indirecta puede incluir la unión a través de un estabilizador estérico (por ejemplo, PEG), un grupo funcional como la maleimida, un enlace iónico (avidina, estreptavidina, biotina y similares), o un par de unión (NTA-níquel y similares). También se prevén combinaciones de estos mecanismos de unión indirecta como, por ejemplo, PEG- maleimida.
En la composición antifolato liposomal u otra composición, la fracción dirigida a diana puede estar unida a través de un grupo funcional maleimida a al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un componente liposomal y una molécula de PEG. La fracción de unión a diana puede tener afinidad específica por al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta. Por ejemplo, la fracción dirigida a diana tiene afinidad específica por al menos dos seleccionados del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta. Como ejemplo adicional, la fracción dirigida a diana puede tener afinidad específica por los tres receptores de folato alfa, beta y delta.
En una realización ejemplar, la fracción dirigida a diana tiene afinidad específica por un epítopo en un antígeno de la superficie de la célula tumoral que está presente en una célula tumoral pero ausente o inaccesible en una célula no tumoral. La célula tumoral puede ser, por ejemplo, una célula maligna. El antígeno de superficie de la célula tumoral puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta. En una muestra de medición de afinidad, la fracción dirigida a diana puede unirse al receptor de folato con una afinidad que es al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 100 veces, 500 veces o 5000 veces más fuerte que la afinidad de unión a un vehículo de folato reducido.
En las realizaciones ejemplares que implican una fracción dirigida a diana, la fracción dirigida a diana puede ser una proteína que comprenda una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo. La secuencia de unión al antígeno de un anticuerpo comprende una o más regiones complementarias determinantes del origen del anticuerpo. La proteína puede comprender un anticuerpo. En una realización ejemplar, la fracción dirigida a diana es al menos una seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo; un anticuerpo humanizado; un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo; un anticuerpo de cadena única; un anticuerpo de dominio único; un anticuerpo biespecífico; un anticuerpo sintético; un anticuerpo pegilado; y un anticuerpo multimérico.
Los liposomas de la composición antifolato liposomal o de la composición liposomal pueden comprender hasta 200 o hasta 250 fracciones diana por liposoma. A modo ejemplar, el liposoma puede comprender de 30 a 200 fracciones diana.
Un aspecto también está dirigido a un procedimiento de administración de un agente antifolato bioactivo a un tumor que expresa el receptor de folato en su superficie, el procedimiento comprende: administrar cualquiera de las composiciones como la composición antifolato liposomal en una cantidad para administrar una dosis terapéuticamente efectiva del agente antifolato bioactivo al tumor. La administración puede ser seleccionada del grupo que consiste en: infusión; inyección; administración parenteral; y administración tópica. El sujeto puede ser cualquier animal o mamífero. En la presente divulgación se enumeran ejemplos de animales adecuados. Por ejemplo, el sujeto puede ser un humano.
Las composiciones pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado. Se proporcionan procedimientos para preparar una composición antifolato liposomal o una composición liposomal según la reivindicación 19 y la reivindicación 37. Los procedimientos comprenden los pasos de: formar una mezcla que comprende: (1) componentes liposomales; (2) el agente antifolato bioactivo en solución acuosa; (3) la fracción dirigida a diana que, opcionalmente, puede estar ya unida o enlazada a un componente liposomal. Los siguientes pasos implican la homogeneización de la mezcla para formar liposomas en dicha solución acuosa; y la extrusión de la mezcla a través de una membrana para formar liposomas que encierren el agente antifolato bioactivo en una solución acuosa. El procedimiento puede comprender un paso opcional de eliminación del exceso de agente antifolato bioactivo en solución acuosa fuera de los liposomas después de dicho paso de extrusión. El procedimiento puede comprender además un paso opcional de liofilización de dicha composición después de dicho paso de eliminación para formar una composición liofilizada. El procedimiento puede incluir otro paso opcional. El paso consiste en reconstituir dicha composición liofilizante disolviendo dicha composición liofilizante en un disolvente después de dicho paso de liofilización.
La mezcla puede comprender al menos uno seleccionado del grupo que consiste en manitol; trehalosa; sorbitol; y sacarosa. El uno o más componentes liposomales comprende además un estabilizador estérico. El estabilizador estérico puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA) poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidil poliglicerol; poli[N-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico. El PEG puede tener un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons. En el procedimiento de elaboración de una composición, el disolvente puede ser un disolvente acuoso.
Se proporciona una composición liposomal dirigida a diana que se dirige selectivamente a los receptores de folato según la reivindicación 39. El ejemplo de composición liposomal dirigida a diana comprende un liposoma que incluye un espacio interior; un agente bioactivo dispuesto dentro de dicho espacio interior; una molécula estabilizadora estérica unida a un exterior del liposoma; y una fracción dirigida a diana que comprende una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha fracción dirigida a diana unida a al menos uno de los estabilizadores estéricos y al exterior del liposoma. El estabilizador estérico puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA) poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidil poliglicerol; poli[N-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico. Por ejemplo, el PeG puede tener un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons. En esta composición liposomal dirigida a diana, el agente bioactivo comprende al menos uno del grupo que consiste en ellipticina; paclitaxel; Pemetrexed; metotrexato; ralitrexed; aminopterina; pralatrexato; lometrexol; análogo de tiofeno del lometrexol; análogo de furano del lometrexol; trimetrexed; LY309887; GW 1843U89; proguanil; pirimetamina; trimetoprima y la clase de inhibidores de GARFT de pirrolo y tión[2,3-d]pirrolopirimidina sustituidos.
La composición se realiza por un procedimiento según la reivindicación 41, formando una mezcla que comprende: (1) los componentes liposomales; (2) el agente bioactivo en solución acuosa; (3) la fracción de unión a diana. Los siguientes pasos implican la homogeneización de la mezcla para formar liposomas en dicha solución acuosa; y la extrusión de la mezcla a través de una membrana para formar liposomas que encierren el agente antifolato bioactivo en una solución acuosa. Un paso opcional puede implicar la eliminación del exceso de agente antifolato bioactivo en solución acuosa fuera de los liposomas después de dicho paso de extrusión. Otro paso opcional consiste en liofilizar dicha composición después de dicho paso de eliminación para formar una composición liofilizada. Otro paso opcional consiste en reconstituir dicha composición liofilizante disolviendo dicha composición liofilizante en un disolvente después de dicho paso de liofilización. Los otros componentes y pasos pueden ser compartidos del otro procedimiento de fabricación, como se explica en la presente memoria.
También se proporciona un kit para proporcionar cualquier composición liposomal, incluyendo la composición antifolato liposomal según la reivindicación 43. El kit comprende los componentes liposomales, una instrucción para utilizar la composición para encapsular un agente bioactivo y, opcionalmente, en un recipiente separado, el agente bioactivo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es un esquema que ilustra el tejido normal.
La Figura 1B es un esquema que ilustra el tejido canceroso.
La Figura 2 es un esquema que ilustra una realización ejemplar y su mecanismo de unión.
La Figura 3 es un esquema que ilustra la unión de un anticuerpo conjugado con fluorocromo a un receptor de folato en una superficie celular.
La Figura 4 es un esquema que muestra un ejemplo de liposoma que se une e internaliza en una célula que expresa el receptor de folato alfa.
La Figura 5 es un esquema que ilustra el efecto de la internalización de un ejemplo de composición liposomal sobre la proliferación celular utilizando las vías de la proteína quinasa p38.
La Figura 6 representa los datos del análisis por citometría de flujo de las células KB utilizando flurocromo.
La Figura 7 representa los datos del análisis por citometría de flujo de las células OVCAR-3 (ovario) utilizando flurocromo.
La Figura 8 representa los datos del análisis de citometría de flujo de las células NCIH2452 (mesotelioma) utilizando flurocromo.
La Figura 9 representa los datos del análisis de citometría de flujo de las células CCD841 (colon normal) utilizando flurocromo.
La Figura 10 representa los datos del análisis de citometría de flujo de las células SL0003 (pulmón) utilizando flurocromo.
La Figura 11 representa los datos del análisis de citometría de flujo de las células CCD841 (colon normal) utilizando flurocromo.
La Figura 12 es un gráfico de barras que representa los niveles de superficie de un ejemplo de composición liposomal en células normales o cancerosas.
La Figura 13 representa los datos del análisis de citometría de flujo de células de cáncer de ovario utilizando RhodoRed.
La Figura 14 representa los datos del análisis de citometría de flujo de las células con alto nivel de receptores de folato KB utilizando RhodoRed.
La Figura 15 representa los datos del análisis de citometría de flujo de células mamarias normales utilizando RhodoRed.
La Figura 16 representa los datos del análisis por citometría de flujo de células de colon normales utilizando RhodoRed.
La Figura 17 representa un gráfico de barras que muestra la detección dependiente de la concentración de liposomas frente a la detección dependiente de la concentración de liposomas sin objetivo. La Figura 18Arepresenta los datos del análisis de citometría de flujo de las células no tratadas.
La Figura 18Brepresenta los datos del análisis de citometría de flujo de células tratadas con una composición liposomal ejemplar según una realización ejemplar.
La Figura 19 representa las células de cáncer de pulmón expuestas a varios reactivos según la lista.
La Figura 20 es un gráfico de líneas que ilustra la correlación entre la inhibición del crecimiento y la expresión del receptor de folato alfa.
La Figura 21 es un gráfico de barras que resume los resultados y demuestra que una composición liposomal ejemplar de una realización ejemplar inhibe el crecimiento de las células cancerosas.
La Figura 22Aes un esquema que representa el ciclo celular de una célula normal.
La Figura 22Bes un gráfico que muestra la cuantificación de yoduro de propidio de las células en varias pasos del ciclo celular.
La Figura 23Arepresenta los datos de la cuantificación del yoduro de propidio de las células no tratadas.
La Figura 23Brepresenta los datos de la cuantificación del yoduro de propidio de las células tratadas con Pemetrexed.
La Figura 24 es un gráfico de barras que muestra la estasis del ciclo celular mediante una realización ejemplar de una composición liposomal.
La Figura 25 representa el análisis de las células para Mac-1 para determinar la maduración de los neutrófilos. La Figura 26Arepresenta los datos de citometría de flujo de las células normales.
La Figura 26Brepresenta los datos de citometría de flujo de las células tratadas con Pemetrexed.
La Figura 27 es un gráfico de barras que representa el número de neutrófilos diferenciados en las muestras tratadas con Pemetrexed y en las muestras tratadas con una variante.
Descripción detallada
Los medicamentos antifolatos, como se ha comentado anteriormente, se diseñaron como moléculas miméticas del folato que funcionan interfiriendo con la acción de los folatos una vez dentro de la célula, privando a las células de los precursores del ADN que necesitan para replicarse y proliferar. Dado que las células cancerosas son células de crecimiento rápido con una gran demanda de precursores del ADN en forma de folatos, absorben los medicamentos antifolatos de la misma manera que los folatos y, en consecuencia, son susceptibles a los efectos de los antifolatos. Sin embargo, las células normales de crecimiento rápido, como las células que recubren el tracto gastrointestinal (GI) y las células de la médula ósea como, por ejemplo, los neutrófilos, también se dividen rápidamente utilizando los folatos suministrados principalmente a través de los RFC. Por lo tanto, las células normales también son susceptibles a los efectos tóxicos de los antifolatos, ya que el mecanismo de transporte mediado por los RFCs que la mayoría de los antifolatos están diseñados para infiltrarse y eliminar las células cancerosas es el mismo mecanismo que las células normales utilizan para abastecerse de folatos. En consecuencia, el tratamiento de los cánceres con antifolatos muy prometedores y eficaces ha sido un reto difícil en la atención clínica de los pacientes debido a la alta probabilidad de que el tratamiento cause daños colaterales a las células normales de crecimiento rápido, lo que provoca toxicidades graves y potencialmente mortales relacionadas con los antifolatos.
Como se ha comentado anteriormente, los antifolatos como clase se utilizan por su efecto antiproliferativo en el tratamiento del cáncer para inhibir el crecimiento y la división celular, lo que provoca la muerte de las células cancerosas. Las células cancerosas que se replican rápidamente requieren una mayor cantidad de folatos en comparación con la mayoría de las células normales. Esto condujo al desarrollo clínico de los antifolatos como agentes anticancerígenos hace casi 70 años. Sin embargo, aunque las terapias basadas en antifolatos mostraron ser eficaces para el tratamiento del cáncer, el desarrollo clínico de los antifolatos ha sido problemático y a menudo descarrilado en vista de un dilema clínico imperioso. Este dilema se deriva de dos dinámicas clínicas contrapuestas. Por un lado, los antifolatos están diseñados como moléculas que imitan al folato y la mayoría de ellos están destinados a llegar a las células cancerosas utilizando las RFC como mecanismo de transporte transversal preferente. Por otra parte, los tejidos de renovación rápida del organismo, como la médula ósea o las células del tejido de la vía intestinal, son, al igual que las células cancerosas, muy dependientes del folato y utilizan también los RFC como mecanismo principal de suministro de folato a las células a través de las membranas. El resultado neto de estas dos dinámicas clínicas es que las células de la médula ósea y del tracto gastrointestinal (GI) han sido los sitios más prevalentes de las toxicidades relacionadas con los antifolatos que ponen en peligro la vida de los pacientes. Algunas de estas toxicidades han sido mucositis, diarrea, anemia, neutropenia y recuentos bajos de glóbulos blancos. Dichas toxicidades, solas o combinadas, fueron en varios casos la causa de la muerte de pacientes por el tratamiento con antifolatos. La consecuencia es que, hasta la fecha, muchos antifoliares prometedores y eficaces siguen fracasando durante su desarrollo, no por falta de eficacia contra las células cancerosas, sino por cuestiones de seguridad de los pacientes. Los pocos que han conseguido llegar a la fase de convertirse en medicamentos tienen de nuevo un uso limitado en la práctica clínica debido a los problemas de seguridad.
Los antifolatos como clase siguen siendo una modalidad de tratamiento prometedora para el cáncer a pesar del riesgo asociado de toxicidades graves e incluso mortales para los pacientes. El reto consiste en encontrar una forma de administrar estos antifolatos tan eficaces de manera que se evite dañar las células normales.
Los esfuerzos anteriores se han centrado generalmente en el uso de RFCs para administrar un agente anticancerígeno. Sin embargo, los presentes inventores explotan otra vía que es especialmente prevalente en las células cancerosas y que implica a los receptores de folato, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, el receptor de folato alfa, el receptor de folato beta y/o el receptor de folato delta. Se ha observado en la biología del cáncer que las células cancerosas expresan preferentemente el receptor de folatos alfa, en contraste con las células normales, con el fin de captar eficazmente los folatos para mantener sus necesidades de replicación y proliferación rápidas. Las células cancerosas son muy eficientes a la hora de abastecerse de los folatos contenidos en el torrente sanguíneo en comparación con las células normales. Una de las formas en que las células cancerosas hacen esto es mediante su sobreexpresión de receptores de folato, como, por ejemplo, el receptor de folato alfa. A medida que el cáncer progresa, los niveles del receptor de folato alfa en la superficie de las células tumorales tienden a aumentar, muy probablemente debido a las crecientes necesidades de suministro de folato.
Debido a su alta afinidad con el receptor de folato alfa, el ácido fólico se investigó convencionalmente como una fracción de focalización para la administración de moléculas anticancerosas o citotóxicas a las células cancerosas con la intención de administrar preferentemente un medicamento citotóxico a las células cancerosas, ya sea conjugado a un liposoma que contiene el medicamento citotóxico o conjugado con el propio medicamento citotóxico. Este enfoque no ha conducido a la mejora de la seguridad de los pacientes en gran parte porque, como reconocen los inventores, este enfoque no aprecia una diferencia biológica clave en la explotación de las vías del folato como un enfoque para administrar un citotóxico a las células cancerosas al tiempo que reduce y/o minimiza la exposición de las células normales al medicamento citotóxico; con el ácido fólico como ligando dirigido a diana, las células normales no se salvaban de la toxicidad ya que dicho medicamento dirigido a diana seguía siendo captado por las células normales a través de los RFC. En otras palabras, un medicamento dirigido a diana que utiliza el ácido fólico como unidad diana no es biológicamente diferente de un antifolato normal no dirigido, porque un medicamento de este tipo se une tanto al receptor de folato alfa como a los RFC, al igual que cualquier otra molécula ficticia de folato que es absorbida indistintamente por las células cancerosas y normales. Por lo tanto, el uso de ácido fólico como unidad diana no proporciona la administración selectiva de agentes citotóxicos a las células cancerosas mientras se evitan las células normales. Por lo tanto, con el ácido fólico como unidad de destino, la toxicidad relacionada con el medicamento seguía siendo una preocupación en el cuidado de los pacientes. Como resultado, los principales expertos sugirieron que tratar de explotar los receptores de folato como un medio para la orientación selectiva de la célula cancerosa puede ser ineficaz, guiando los esfuerzos de los expertos en la materia lejos de intentar explotar los receptores de folato.
La dirección de un antifolato a un receptor de folato con una fracción dirigida a diana no se ha intentado hasta la fecha. Dado que los antifolatos imitan a los folatos, no se consideraría la posibilidad de explotar las vías del folato para administrar un antifolato dirigido a diana. Se consideraría redundante ya que el transportador de folato reducido ya transporta el folato a las células. A partir de esta comprensión, era intrínsecamente lógico concluir que, dado que un antifolato imita a un folato, un medicamento antifolato será captado eficazmente por un receptor de folato por una célula y no sería necesaria una ayuda adicional utilizando, por ejemplo, un anticuerpo. Los actuales inventores adoptaron un enfoque contrario a la intuición. Dado que era importante evitar que los antifolatos fueran absorbidos por las células normales a través de los RFC para reducir o prevenir la toxicidad relacionada con los antifolatos, los inventores descubrieron que este objetivo podía lograrse, entre otras cosas, explotando una morfología específica del cáncer que no se ha apreciado como útil para el campo de la investigación de los antifolatos: la pérdida de polaridad de las células del tejido tumoral.
La alteración de la polaridad celular y la desorganización del tejido es un sello distintivo de los tumores epiteliales avanzados. Como se ilustra en la Figura 1A, el epitelio simple normal comprende generalmente una monocapa de células individuales que muestran una polaridad apical- basal distinta. Las células están fuertemente empaquetadas y conectadas entre sí por los complejos de unión apical (Figura 1A-101), que separan los dominios de membrana apical y basolateral. En los tejidos normales en los que se conserva la polaridad, el receptor de folatos alfa se une a la superficie apical de las células situadas lejos y fuera del contacto directo con los folatos en la circulación sanguínea (Figura 1A-102). La Figura 1B ilustra cómo las células de los tumores epiteliales de alto grado muestran una pérdida de la polaridad apical-basal y una desorganización general del tejido, lo que pone al receptor de folato alfa en contacto directo con los folatos en la circulación sanguínea (1B-103). Los inventores consideraron que esta característica de las células del tejido tumoral tenía mayor importancia para las terapias basadas en los antifolatos de lo que el pensamiento convencional había apreciado. Los inventores descubrieron que esto tenía un potencial significativo para rehabilitar los antifolatos como terapias contra el cáncer, reduciendo y/o incluso minimizando las toxicidades graves y a veces mortales asociadas a los antifolatos.
A este respecto, los inventores diseñaron una entidad química para administrar un agente antifolato de manera que se dirija selectivamente a los receptores de folato que se expresan altamente en las células cancerosas, como, por ejemplo, los receptores de folato alfa, beta y delta, al tiempo que se evitan los RFC (la vía del folato utilizada por las células normales), para exponer selectivamente el antifolato a las células del tejido tumoral al tiempo que se reduce o evita la exposición de los antifolatos a las células normales. Esto es posible al reconocer que, tras la pérdida de polaridad, las células de los tejidos tumorales no sólo sobreexpresan y exponen los receptores de folato, como el receptor de folato alfa, sino también que los receptores de folato de las células cancerosas están en contacto directo con la circulación sanguínea, algo que no ocurre en los tejidos normales. Este enfoque también puede extenderse a otros receptores de folato de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de folato beta, el receptor de folato delta, etc.) debido a sus similitudes estructurales y funcionales con el receptor de folato alfa.
La divulgación se refiere, en general, a composiciones liposomales útiles para suministrar una variedad de agentes bioactivos, como, por ejemplo, antifolatos, procedimientos para hacer las composiciones liposomales y procedimientos para tratar a los pacientes utilizando las composiciones liposomales. Resulta especialmente útil proporcionar un liposoma encapsulador de antifolatos que se dirija a los receptores de folatos pero que no se dirija específicamente a los vehículoes de folatos reducidos.
Más específicamente, la divulgación se basa en el descubrimiento de que un liposoma neutro o aniónico (es decir, un liposoma no catiónico) con afinidad y especificidad por un receptor de folato o más de un receptor de folato que contiene uno o más agentes bioactivos como, por ejemplo, un agente anticancerígeno (antineoplásico) es sorprendentemente eficaz contra las células que presentan y expresan receptores de folato en su superficie celular. En una realización ejemplar, se proporciona una composición antifolato liposomal. La composición antifolato liposomal puede comprender un liposoma que incluye un espacio interior; un agente antifolato bioactivo dispuesto dentro del espacio interior; una molécula de PEG unida a un exterior del liposoma; y una fracción dirigida a diana que comprende una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, la fracción dirigida a diana unida a al menos uno de los PEG y al exterior del liposoma.
El término adjuntar o unido se refiere, por ejemplo, a cualquier tipo de unión como la unión covalente, la unión iónica (por ejemplo, avidina-biotina) la unión por interacciones hidrófobas, y la unión a través de grupos funcionales como la maleimida, o enlazadores como el PEG. Por ejemplo, un marcador detectable, un estabilizador estérico, un liposoma, un componente liposomal, un agente inmunoestimulante pueden estar unidos entre sí directamente, por un grupo funcional maleimida, o por un grupo PEG-malemida.
Los liposomas en algunas realizaciones ejemplar incluyen un estabilizador estérico que pueda aumentar su longevidad en la circulación. El concepto básico es que uno o más estabilizadores estéricos como un polímero hidrófilo (polietilenglicol (PEG)), un glicolípido (monosialogangliósido (GM1)) u otros ocupan el espacio inmediatamente adyacente a la superficie del liposoma y excluyen a otras macromoléculas de este espacio. En consecuencia, se dificulta el acceso y la unión de las opsoninas del plasma sanguíneo a la superficie del liposoma y, por tanto, se inhiben las interacciones de los macrófagos con dichos liposomas, o cualquier otro mecanismo de limpieza, y se aumenta la longevidad del liposoma en la circulación. En realizaciones ejemplar, el estabilizador estérico o la población de estabilizadores estéricos puede ser un PEG o una combinación que comprenda PEG. En una realización ejemplar, el estabilizador estérico puede ser un PEG con un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons. Estos PEG pueden tener cualquier estructura, como la lineal, la ramificada, la de estrella o la de peine, y están disponibles en el mercado.
Los liposomas contenidos en la composición liposomal de varias realizaciones ejemplares pueden ser cualquier liposoma conocido o descubierto posteriormente en la técnica. En general, los liposomas de las realizaciones ejemplar pueden tener cualquier estructura liposomal, por ejemplo, estructuras que tengan un espacio interior secuestrado del medio exterior por una o más bicapas lipídicas, o cualquier microcápsula que tenga una membrana semipermeable con una parte central lipofílica donde la membrana secuestra un interior. Una bicapa lipídica puede ser cualquier disposición de moléculas anfifílicas caracterizadas por una parte hidrófila (fracción hidrófila) y una parte hidrófoba (fracción hidrófoba). Por lo general, las moléculas anfifílicas de una bicapa se organizan en hojas bidimensionales en las que los elementos hidrofóbicos se orientan hacia el interior de la hoja, mientras que los elementos hidrófilos se orientan hacia el exterior. Las moléculas anfifílicas que forman los liposomas de las realizaciones ejemplar pueden ser cualquier molécula anfifílica conocida o descubierta posteriormente, por ejemplo, lípidos de origen sintético o natural o lípidos biocompatibles. Los liposomas de las realizaciones ejemplar también pueden estar formados por polímeros anfifílicos y tensioactivos, por ejemplo, polimerosomas y niosomas. A efectos de la presente divulgación, sin limitación, estos materiales formadores de liposomas también se denominan "lípidos". La composición liposomal puede ser un líquido o puede ser seca, como, por ejemplo, en forma de un polvo seco o una torta seca. El polvo seco o la torta seca pueden haber sido sometidos a un secado primario bajo, por ejemplo, condiciones de liofilización u opcionalmente, pueden haber sido sometidos a un secado primario solamente o a un secado primario y secundario. En la forma seca, el polvo o la torta pueden tener, por ejemplo, entre el 1% y el 6% de humedad, como por ejemplo entre el 2% y el 5% de humedad o entre el 2% y el 4% de humedad. Un procedimiento de secado, por ejemplo, es la liofilización (también llamada liofilización, o ciproducción). Cualquiera de las composiciones y procedimientos de la divulgación puede incluir los liposomas, liposomas liofilizados o liposomas reconstituidos a partir de liposomas liofilizados. En la liofilización, pueden utilizarse lioprotectores o crioprotectores, moléculas que protegen el material liofilizado. Estas moléculas son típicamente compuestos polihídricos como los azúcares (mono, di y polisacáridos), los polialcoholes y sus derivados, el glicerol o el polietilenglicol, la trehalosa, la maltosa, la sacarosa, la glucosa, la lactosa, el dextrano, el glicerol y los aminoglucósidos. Los lipoprotectores o crioprotectores pueden, por ejemplo, comprender hasta un 10% o hasta un 20% de una solución fuera del liposoma o dentro del liposoma o ambos fuera y dentro del liposoma.
Los liposomas de las realizaciones ejemplar pueden, por ejemplo, tener un diámetro del orden de 30-150 nm (nanómetro). En otras realizaciones ejemplar, el liposoma puede, por ejemplo, tener un diámetro en el intervalo de 40-70 nm.
Los liposomas de las realizaciones ejemplar son aniónicos o neutros. Es decir, el liposoma no debe ser catiónico. La determinación de la carga (es decir, aniónica, neutra o catiónica) puede hacerse midiendo el potencial zeta del liposoma. En una realización según la invención, el potencial zeta del liposoma es menor o igual a cero. En otra realización ejemplar, el potencial zeta del liposoma está en un intervalo de 0 a -150 mV. En otra realización ejemplar, el potencial zeta debe estar en el intervalo de -30 a -50 mV.
Las propiedades de los liposomas están influenciadas por la naturaleza de los lípidos utilizados para hacerlos. Se ha utilizado una gran variedad de lípidos para fabricar liposomas. Entre ellos se encuentran los lípidos catiónicos, aniónicos y neutros. Los lípidos catiónicos se utilizan para fabricar liposomas catiónicos que se suelen utilizar como agentes de transfección de genes. La carga positiva de los liposomas catiónicos permite la interacción con la carga negativa de las superficies celulares. Tras la unión de los liposomas catiónicos a la célula, el liposoma es transportado al interior de la misma mediante endocitosis. Sin embargo, los liposomas catiónicos se unen tanto a las células normales como a las tumorales. Debido a que las realizaciones ejemplares pretenden dirigirse de forma específica y selectiva a las células tumorales mientras se preservan sustancialmente las células normales, no se prefiere el uso de lípidos catiónicos. El uso de una mezcla de, por ejemplo, lípidos neutros como e1HSPC y lípidos aniónicos como el PEG-DSPE da lugar a la formación de liposomas aniónicos que tienen menos probabilidades de unirse de forma no específica a las células normales. La unión específica a las células tumorales puede lograrse mediante el uso de un anticuerpo dirigido al tumor como, por ejemplo, un anticuerpo del receptor de folato, incluyendo, por ejemplo, el anticuerpo del receptor de folato alfa, el anticuerpo del receptor de folato beta y/o el anticuerpo del receptor de folato delta.
Como ejemplo, al menos uno (o algunos) de los lípidos es/son lípidos anfipáticos, definidos como que tienen una porción hidrófila y otra hidrófoba (típicamente una cabeza hidrófila y una cola hidrófoba). La porción hidrófoba se orienta típicamente hacia una fase hidrófoba (por ejemplo, dentro de la bicapa), mientras que la porción hidrófila se orienta típicamente hacia la fase acuosa (por ejemplo, fuera de la bicapa). La porción hidrófila puede comprender grupos polares o cargados, como carbohidratos, fosfatos, carboxílicos, sulfatos, aminos, sulfhidrilos, nitro, hidroxi y otros grupos similares. La porción hidrófoba puede comprender grupos apolares que incluyen, sin limitación, grupos de hidrocarburos alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y grupos sustituidos por uno o más grupos aromáticos, cicloalifáticos o heterocíclicos. Los ejemplos de compuestos anfipáticos incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos, aminolípidos y esfingolípidos.
Típicamente, por ejemplo, los lípidos son fosfolípidos. Los fosfolípidos incluyen, sin limitación, la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el fosfatidilglicerol, el fosfatidilinositol, la fosfatidilserina y similares. Se entiende que pueden utilizarse otros componentes lipídicos de la membrana, como el colesterol, la esfingomielina, la cardiolipina, etc.
En una realización ejemplar, los lípidos pueden ser lípidos aniónicos y neutros (incluyendo zwitteriónicos y polares) incluyendo fosfolípidos aniónicos y neutros. Los lípidos neutros existen en una forma zwitteriónica no cargada o neutra a un pH seleccionado. A pH fisiológico, estos lípidos incluyen, por ejemplo, el dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), la diacilfosfatidilcholina, la diacilfosfatidilethanolaminae, la ceramida, la esfingomielina, la cefalina, el colesterol, los cerebrósidos y los diacilgliceroless. Los ejemplos de lípidos zwitteriónicos incluyen, sin limitación, la dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), la dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y la dioleoilfosfatidilserina (DOPS). Un lípido aniónico es un lípido con carga negativa a pH fisiológico. Estos lípidos incluyen, sin limitación, el fosfatidilglicerol, la cardiolipina, la diacilfosfatidilserina, el ácido diacilfosfatídico, las fosfatidiletanolaminas de N-dode- canoilo, las fosfatidiletanolaminas de N-succinilo, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lisilfosfatidilgliceroles, palmitoiloleiolfosatidilglicerol (POPG), y otros grupos modificadores aniónicos unidos a lípidos neutros.
En conjunto, los lípidos aniónicos y neutros se denominan en la presente memoria lípidos no catiónicos. Estos lípidos pueden contener fósforo, pero no están tan limitados. Algunos ejemplos de lípidos no catiónicos son la lecitina, la lisolecitina, la fosfatidiletanolamina, la lisofosfatidiletanolamina, la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), la dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), la dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidi 1-etanolamina (DSPE), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE) palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), fosfatidilcolina de huevo (EPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), palmitoilolfosfatidilglicerol (POPG), 16-0-monometil PE, 16-0- dimetil PE, 18-1-trans PE, palmitoileol-fosfatidiletanolamina (POPE), 1-estearoil-2-oleoilfosfatidietanolamina (SOPE), fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicotilfosfato y colesterol.
Los liposomas de las realizaciones ejemplares pueden ensamblarse utilizando cualquier procedimiento de ensamblaje liposomal que utilice componentes liposomales (también denominados componentes liposomales). Los componentes liposomales incluyen, por ejemplo, lípidos como el DSPE, el HSPC, el colesterol y los derivados de estos componentes. Otros lípidos adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama, Estados Unidos). Una lista parcial de los lípidos disponibles con carga negativa o neutra adecuados para hacer liposomas aniónicos, puede ser, por ejemplo, al menos uno de los siguientes: DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, DMPE, DPPE, DOPE, DMPA-Na, DPPA-Na, DOPA-Na, DMPG-Na, DPPG-Na, DOPG-Na, DMPS-Na, DPPS-Na, DOPS-Na, DOPE-Glutaryl-(Na)2, Tetramyristoyl Cardiolipin-(Na)2, DSPE-mPEG-2000-Na, DSPE-mPEG-5000-Na, y DSPE-Maleimide PEG-2000-Na.
Los derivados de estos lípidos pueden, por ejemplo, incluir, al menos, la unión (preferentemente covalente) de uno o más estabilizadores estéricos y/o grupos funcionales al componente liposomal, tras lo cual los estabilizadores estéricos y/o grupos funcionales deben considerarse parte de los componentes liposomales. Los grupos funcionales comprenden grupos que pueden utilizarse para unir un componente liposomal a otra fracción, como una proteína. Tales grupos funcionales incluyen, al menos, la maleimida. Estos estabilizadores estéricos incluyen al menos uno del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA) poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidil poliglicerol; poli[N-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico.
Dado que los componentes liposomales pueden incluir cualquier molécula(s) (es decir, sustancia química/reactivo/proteína) que esté unida a ella, los componentes liposomales pueden, por ejemplo, incluir, al menos, DSPE, DSPE-PEG, DSPE-maleimida, HSPC; HSPC-PEG; HSPC-maleimida; colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida. En una realización preferida, los componentes liposomales que forman el liposoma comprenden DSPE; DSPE-FITC; DSPE-maleimida; colesterol; y HSPC.
En una realización ejemplar, al menos un componente de la bicapa lipídica es funcionalizado (o reactivo). Tal como se utiliza en el presente documento, un componente funcionalizado es un componente que comprende un grupo reactivo que puede utilizarse para reticular reactivos y elementos con el lípido. Si el lípido está funcionalizado, cualquier liposoma que forme también estará funcionalizado.
En las realizaciones ejemplares, el grupo reactivo es uno que reaccionará con un reticulador (u otra fracción) para formar reticulaciones. El grupo reactivo puede estar situado en cualquier parte del lípido que le permita entrar en contacto con un reticulador y ser reticulado a otra fracción (es decir, estabilizador estérico, fracción de unión a diana, etc.). En algunas realizaciones, se encuentra en el grupo de cabeza del lípido, incluyendo por ejemplo un fosfolípido. Un ejemplo de grupo reactivo es un grupo maleimida. Los grupos de maleimida pueden reticularse entre sí en presencia de reticuladores de ditiol como, por ejemplo, el ditioltrietol (DTT).
Debe entenderse que las realizaciones ejemplares contemplan el uso de otros lípidos funcionalizados, otros grupos reactivos y otros reticulantes. Además de los grupos maleimida, otros ejemplos de grupos reactivos incluyen, pero no se limitan a, otros grupos reactivos tiol, grupos amino como aminas primarias y secundarias, grupos carboxilo, grupos hidroxilo, grupos aldehído, grupos alquino, grupos azida, carbonilos, grupos haloacetilo (por ejemplo, yodoacetilo), grupos imidoéster, ésteres de N-hidroxisuccinimida, grupos sulfhidrilo, grupos disulfuro de piridilo y similares.
Los lípidos funcionalizados y no funcionalizados están disponibles en varias fuentes comerciales, incluyendo Avanti Polar 5 Lipids (Alabaster, Ala.).
Los liposomas de las realizaciones ejemplares pueden comprender además un agente inmunoestimulador, un marcador detectable o ambos dispuestos en su exterior. Por ejemplo, el agente inmunoestimulante o el marcador detectable pueden estar unidos iónica o covalentemente a un exterior del liposoma, incluyendo, por ejemplo, opcionalmente al estabilizador estérico.
Los agentes inmunoestimulantes, también conocidos como inmunoestimulantes, inmunoestimuladores, haptenos y adyuvantes, son sustancias que estimulan el sistema inmunitario induciendo la activación o aumentando la actividad de cualquiera de sus componentes.
Estos agentes inmunoestimulantes pueden incluir uno o más de un hapteno, un adyuvante, un agente inmunoestimulante proteico, un agente inmunoestimulante de ácido nucleico y un agente inmunoestimulante químico. Muchos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para estimular la respuesta inmunitaria, como el lípido A, la Bortadella pertussis o las proteínas derivadas de la Mycobacterium tuberculosis. Algunos adyuvantes están disponibles comercialmente como, por ejemplo, Freund's Incomplete Adjuvant y Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc, Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Filadelfia, Pa.); sales de aluminio como el gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o el fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivados catiónica o aniónicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradables; lípido monofosforilico A y quil A. Las citoquinas, como el GM-CSF, la interleucina-2, -7, -12 y otros factores de crecimiento similares, también pueden utilizarse como adyuvantes. En una realización preferida, el inmunoestimulante puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en fluoresceína, DNP, beta glucano, beta-1,3-glucano, beta-1,6-glucano.
Un marcador detectable puede, por ejemplo, incluir, al menos, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelador de metales, una enzima, un tinte, una tinta, un compuesto magnético, un biocatalizador o un pigmento que sea detectable por cualquier medio adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, imágenes de resonancia magnética (MRI), imágenes ópticas, imágenes fluorescentes/luminiscentes o técnicas de imágenes nucleares.
El agente inmunoestimulador y/o el marcador detectable pueden fijarse al exterior mediante la coincubación con el liposoma. Por ejemplo, el agente inmunoestimulador y/o el marcador detectable pueden asociarse con la membrana liposomal mediante interacciones hidrófobas o mediante un enlace iónico como un enlace avidina/biotina o un enlace de quelación metálica (por ejemplo, Ni-NTA). Alternativamente, el agente inmunoestimulador o el marcador detectable puede estar unido covalentemente al exterior del liposoma como, por ejemplo, estando unido covalentemente a un componente liposomal o al estabilizador estérico que es el PEG.
Un ejemplo de reactivo es el isotiocianato de fluoresceína (FITC) que, según nuestros experimentos, puede servir sorprendentemente como inmunoestimulante y como marcador detectable.
Las realizaciones ejemplares también proporcionan un liposoma que engloba un espacio interior. En una realización ejemplar, el espacio interior puede comprender, pero no está limitado a, una solución acuosa. El espacio interior puede comprender un agente bioactivo, como, por ejemplo, un agente antifolato y un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender, por ejemplo, trehalosa. En una realización ejemplar, la trehalosa puede, por ejemplo, estar presente en un porcentaje en peso de aproximadamente 5% a 20% de trehalosa o cualquier combinación de uno o más lioprotectores o crioprotectores en una concentración total de 5% a 20%. El espacio interior puede, por ejemplo, comprender un tampón de citrato a una concentración de entre 5 y 200 mM. El tampón de citrato puede amortiguar el espacio interior a un pH de entre 2,8 y 6. Independientemente de la concentración de trehalosa o citrato, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender una concentración total de acetato de sodio y acetato de calcio de entre 50 mM y 500 mM En una realización ejemplar, el agente antifolato bioactivo puede, por ejemplo, ser un agente bioactivo soluble en agua. Es decir, el agente bioactivo puede formar una solución acuosa. Según realizaciones ejemplares, cada liposoma puede comprender un espacio interior que contenga menos de 200.000 moléculas del agente bioactivo. Por ejemplo, en una realización ejemplar, el liposoma puede comprender entre 10.000 y 100.000 de un agente antifolato bioactivo.
En una realización ejemplar, el agente bioactivo puede ser al menos uno del grupo que consiste en Pemetrexed, lometrexol, metotrexato, ralitrexed, aminopterina, pralatrexato, análogos de lometrexol de los mismos, análogo de tiofeno de lometrexol, análogo de furano de lometrexol, trimetrexed, LY309887; y GW 1843U89. En otra realización, el agente bioactivo puede ser al menos uno del grupo que consiste en proguanil, pirimetamina, trimetoprima y la clase de inhibidores de GARFT Pirrolo y Thieon[2,3-d]pirropirimidina. En una realización preferida, el agente antifolato bioactivo es el Pemetrexed. En otra realización ejemplar, el agente antifolato bioactivo es el lometrexol. El pH de una solución que comprende el agente bioactivo puede, por ejemplo, fijarse entre 5 y 8 o entre 2 y 6.
Según las realizaciones ejemplares, los liposomas contenidos en la composición liposomal de los ejemplos también pueden ser liposomas diana, por ejemplo, liposomas que incluyen una o más partes diana o modificadores de biodistribución en la superficie de los liposomas. Las realizaciones ejemplares de liposomas dirigidos a diana pueden, por ejemplo, denominarse inmunoliposomas. Una fracción dirigida a diana puede ser cualquier agente capaz de unirse o interactuar específicamente con una diana deseada. En una realización ejemplar, una fracción dirigida a diana puede ser una fracción que se une con especificidad y afinidad a un receptor de folato, como, por ejemplo, el receptor de folato alfa, el receptor de folato beta y/o el receptor de folato delta. Los receptores de folato son distintos y diferentes de los vehículos de folato reducidos y explotan diferentes vías hacia el interior de las células. La fracción dirigida a diana, según las realizaciones ejemplares, se une específica y preferentemente a y/o se internaliza en una célula diana en la que la entidad atrapada en el liposoma ejerce su efecto deseado. Una célula objetivo puede ser, por ejemplo, una célula cancerosa, una célula tumoral y/o una célula metastásica. En una realización ejemplar, el liposoma que lleva una fracción dirigida a diana es internalizado por una célula objetivo. En cualquiera de las realizaciones ejemplares de la presente divulgación, la fracción dirigida a diana puede ser una proteína que una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo. En una realización ejemplar, la proteína puede, por ejemplo, tener una estructura tridimensional de, al menos, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un ejemplo de tal proteína como fracción de focalización es un anticuerpo. Sin embargo, no es necesario un anticuerpo completo. Por ejemplo, una proteína que es una fracción dirigida a diana de cualquiera de las realizaciones ejemplares puede comprender una o más regiones determinantes complementarias (CDR) de origen de anticuerpos. Entre los ejemplos de proteínas adecuadas que pueden servir como fracciones diana se incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo sintético, un anticuerpo pegilado y un anticuerpo multimérico. Un anticuerpo puede tener una combinación de estas características. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de unión a antígeno y puede estar pegilado y multimerizado también. Los anticuerpos contra el receptor de folato alfa están disponibles en el mercado.
Un ejemplo de anticuerpo que puede emplearse es un anticuerpo murino contra el receptor de folato alfa. La secuencia se describe en la patente US US5646253. Por ejemplo, basándose en las secuencias divulgadas, se sintetizó el gen y se colocó en un vector de expresión transitoria y se produjo el anticuerpo en el sistema de expresión transitoria HEK-293. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, un Fab, o cualquiera de las diversas variaciones de anticuerpos discutidas.
Cada uno de los liposomas puede comprender, por ejemplo, de 30 a 250 fracciones diana, como, por ejemplo, de 30 a 200 fracciones diana. Alternativamente, cada uno de los liposomas puede comprender menos de 220 moléculas de focalización como, por ejemplo, menos de 200 moléculas. Las moléculas de focalización pueden estar unidas, por ejemplo, mediante una unión covalente al exterior del liposoma. Las moléculas que están en el exterior del liposoma pueden, por ejemplo, comprender, al menos, un lípido, un estabilizador estérico, una maleimida, un colesterol y similares. En una realización ejemplar, la fracción dirigida a diana puede estar unida covalentemente a través de un grupo funcional maleimida a al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un componente liposomal y un estabilizador estérico como una molécula de PEG. Es posible que todas las fracciones diana estén unidas a un componente como el PEG. También es posible que las moléculas de destino estén unidas a diferentes componentes. Por ejemplo, algunas fracciones diana pueden estar unidas a los componentes lipídicos o al colesterol, algunas fracciones diana pueden estar unidas al estabilizador estérico (por ejemplo, PEG) y otras fracciones diana pueden estar unidas a un marcador detectable o a otra fracción de unión a diana.
En una realización ejemplar, la fracción dirigida a diana tiene afinidad y especificidad por al menos uno o más antígenos, donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste en el receptor de folato alfa, el receptor de folato beta y el receptor de folato delta. En una realización ejemplar, la fracción dirigida a diana tiene afinidad específica (es decir, afinidad y especificidad) por al menos dos antígenos seleccionados del grupo que consiste en el receptor de folato alfa, el receptor de folato beta y el receptor de folato delta. En otra realización ejemplar, la fracción dirigida a diana tiene afinidad específica por tres antígenos que son, por ejemplo, el receptor de folato alfa; el receptor de folato beta; y el receptor de folato delta. La fracción dirigida a diana puede tener afinidad y especificidad por un epítopo del antígeno, ya que a veces una fracción dirigida a diana no se une a todo el antígeno, sino sólo a un epítopo de muchos epítopos de un antígeno. En una realización ejemplar, la fracción dirigida a diana tiene afinidad específica por un epítopo de un antígeno de la superficie de la célula tumoral que está presente en una célula tumoral pero ausente o inaccesible en una célula no tumoral. Por ejemplo, en algunas situaciones, el antígeno tumoral puede estar en la superficie tanto de las células normales como de las células cancerosas malignas, pero el epítopo tumoral puede estar expuesto sólo en una célula cancerosa. Como ejemplo adicional, un antígeno tumoral puede experimentar un cambio de confirmación en el cáncer causando la presencia de epítopos específicos de las células cancerosas. Una fracción de unión a diana con afinidad específica a los epítopos descritos anteriormente es útil y está prevista en las realizaciones ejemplares. En estas realizaciones, la célula tumoral con epítopos específicos de células cancerosas puede ser una célula cancerosa. Ejemplos de tales antígenos de la superficie de las células tumorales incluyen, al menos, el receptor de folato alfa, el receptor de folato beta y el receptor de folato delta.
Las realizaciones ejemplares se refieren a una composición antifolato liposomal que comprende: un medio que comprende un liposoma que incluye un espacio interior; un agente antifolato bioactivo acuoso dispuesto dentro de dicho espacio interior; una fracción dirigida a diana que comprende una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha fracción dirigida a diana dispuesta en el exterior del liposoma. En las realizaciones ejemplares, el medio es una solución acuosa. En una realización ejemplar, el espacio interior, el espacio exterior (es decir, el medio), o ambos, el espacio interior y el medio, contienen uno o más lyoprotectants o cryoprotectants que se enumeran más arriba. En una realización ejemplar, se prefieren los crioprotectores manitol, trehalosa, sorbitol y sacarosa.
Como se explicó anteriormente, los liposomas de las realizaciones ejemplares pueden comprender un estabilizador estérico que puede aumentar su longevidad en la circulación. El concepto básico es que uno o más estabilizadores estéricos como un polímero hidrófilo (polietilenglicol (PEG)), un glicolípido (monosialogangliósido (GM1)) u otros ocupan el espacio inmediatamente adyacente a la superficie del liposoma y excluyen a otras macromoléculas de este espacio. En consecuencia, se dificulta el acceso y la unión de las opsoninas del plasma sanguíneo a la superficie del liposoma y, por tanto, se inhiben las interacciones de los macrófagos con dichos liposomas, o cualquier otro mecanismo de limpieza, y se aumenta la longevidad del liposoma en la circulación.
Para cualquiera de las realizaciones ejemplares que incorporan un estabilizador estérico, el estabilizador estérico puede ser al menos uno del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), poli-L-lisina (PLL), monosialogangliósido (GM1), poli(vinilpirrolidona) (PVP) poli(acrilamida) (PAA), poli(2-metil-2-oxazolina), poli(2-etil-2-oxazolina), fosfatidil poliglicerol, poli[N-(2-hidroxipropil) metacrilamida], poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas, polímero a base de L-aminoácidos y alcohol polivinílico. En las realizaciones ejemplares, el estabilizador estérico o la población de estabilizadores estéricos es PEG. En una realización ejemplar, el estabilizador estérico es un PEG con un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons. Estos PEG pueden tener cualquier estructura, como la lineal, la ramificada, la de estrella o la de peine, y están disponibles en el mercado.
Según las realizaciones ejemplares, la composición liposomal puede proporcionarse como una composición farmacéutica que contiene la composición liposomal ejemplar de las realizaciones ejemplares y un vehículo, por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son la solución salina normal, la dextrosa isotónica, la sacarosa isotónica, la solución de Ringer y la solución de Hanks. Se puede añadir una sustancia tampón para proporcionar un pH óptimo para la estabilidad del almacenamiento. Por ejemplo, un pH entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,5, más preferentemente un pH de aproximadamente 6,5, es óptimo para la estabilidad de los lípidos de la membrana del liposoma, y proporciona una excelente retención de las entidades atrapadas. La histidina, el hidroxietilpiperazina-etilsulfonato (HEPES), el morfolipoetilsulfonato (MES), el succinato, el tartrato y el citrato, normalmente a una concentración de 2-20 mM, son sustancias tampón ejemplares. Otros vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución acuosa tamponada, NaCl al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Se pueden añadir estabilizadores de proteínas, carbohidratos o polímeros y ajustadores de tonicidad, por ejemplo, gelatina, albúmina, dextrano o polivinilpirrolidona. La tonicidad de la composición puede ajustarse al nivel fisiológico de 0,25-0,35 mol/kg con glucosa o un compuesto más inerte como la lactosa, la sacarosa, el manitol o la dextrina. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas, por ejemplo, por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse en condiciones asépticas y liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un medio acuoso estéril antes de su administración.
Las composiciones farmacéuticas de liposomas también pueden contener otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste del pH y de amortiguación, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Además, la suspensión de liposomas puede incluir agentes protectores de los lípidos que los protegen contra los daños causados por los radicales libres y la oxidación de los lípidos durante el almacenamiento. Son adecuados los quelantes lipofílicos de los radicales libres, como el alfa-tocoferol, y los quelantes específicos del hierro solubles en agua, como la ferrioxamina.
La concentración de los liposomas de las realizaciones ejemplares en las formulaciones farmacéuticas fluidas puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente un 0,05% generalmente, o al menos a un 2-10% hasta tanto como un 30 a 50% en peso y se seleccionará principalmente por los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Por ejemplo, la concentración puede aumentarse para reducir la carga de fluido asociada al tratamiento. Esto puede ser especialmente deseable en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva asociada a la aterosclerosis o con hipertensión grave. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas liposomales compuestas por lípidos irritantes pueden diluirse a bajas concentraciones para disminuir la inflamación en el lugar de administración.
Las realizaciones ejemplares se refieren a un procedimiento de administración de un agente bioactivo, como, por ejemplo, un antifolato, a un tumor que expresa el receptor de folato en su superficie. Un procedimiento a modo de ejemplo comprende el paso de administrar al menos una de las composiciones que comprenden un liposoma de la presente divulgación en una cantidad para administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente antifolato bioactivo al tumor.
La cantidad de composición farmacéutica liposomal administrada dependerá de la entidad terapéutica particular atrapada dentro de los liposomas, el estado de la enfermedad que se está tratando, el tipo de liposomas que se está utilizando y el juicio del clínico. Por lo general, la cantidad de composición farmacéutica liposomal administrada será suficiente para suministrar una dosis terapéuticamente eficaz de la entidad terapéutica particular.
La cantidad de composición farmacéutica liposomal necesaria para suministrar una dosis terapéuticamente eficaz puede determinarse mediante procedimientos rutinarios in vitro e in vivo, comunes en la técnica de ensayos de medicamentos. Véase, por ejemplo, D. B. Budman, A. H. Calvert, E. K. Rowinsky (editores). Handbook of Anticancer Drug Development, LWW, 2003. Las dosis terapéuticamente eficaces para diversas entidades terapéuticas son bien conocidas por los expertos en la materia; y según las realizaciones ejemplares, una entidad terapéutica administrada a través de la composición farmacéutica liposomal proporciona al menos la misma o mayor actividad que la obtenida al administrar la misma cantidad de la entidad terapéutica en su formulación rutinaria no liposomal. Típicamente, las dosis para la composición farmacéutica liposomal de las realizaciones ejemplares pueden, por ejemplo, oscilar entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 500 mg de la entidad terapéutica por kilogramo de peso corporal, más a menudo, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 mg de entidad terapéutica/kg de peso corporal.
Una cantidad efectiva es una dosis del agente suficiente para proporcionar un resultado médicamente deseable. La cantidad efectiva variará en función del resultado deseado, de la enfermedad concreta que se trate o prevenga, de la edad y el estado físico del sujeto que se trate, de la gravedad de la enfermedad, de la duración del tratamiento, de la naturaleza de la terapia concurrente o combinada (si la hay), de la vía específica de administración y de factores similares que estén dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Por lo general, se prefiere utilizar una dosis máxima, es decir, la mayor dosis segura según el buen criterio médico.
Por ejemplo, si el sujeto tiene un tumor, una cantidad efectiva puede ser aquella que reduce el volumen o la carga del tumor (como por ejemplo se determina por medio de imágenes del tumor). Las cantidades efectivas también pueden evaluarse por la presencia y/o la frecuencia de células cancerosas en la sangre u otro fluido corporal o tejido (por ejemplo, una biopsia). Si el tumor afecta al funcionamiento normal de un tejido u órgano, la cantidad efectiva puede evaluarse midiendo el funcionamiento normal del tejido u órgano. En algunos casos, la cantidad efectiva es la cantidad necesaria para disminuir o eliminar uno o más, y preferentemente todos los síntomas.
Las realizaciones ejemplares proporcionan composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas son composiciones estériles que comprenden un liposoma de muestra y preferentemente agente(s) antifolato, preferentemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede, por ejemplo, referirse a uno o más agentes de carga sólidos o líquidos compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que sean adecuados para la administración a un ser humano u otro sujeto contemplado por las realizaciones ejemplares.
El término "vehículo" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combinan las composiciones liposomales para facilitar la administración. Los componentes de las composiciones farmacéuticas se mezclan de manera que se excluye la interacción que podría perjudicar sustancialmente su eficacia farmacéutica deseada. Entre los agentes tampones adecuados se encuentran el ácido acético y una sal (1-2% p/v); el ácido cítrico y una sal (1-3% p/v); el ácido bórico y una sal (0,5-2,5% p/v); y el ácido fosfórico y una sal (0,8-2% p/v). Entre los conservantes adecuados están el cloruro de benzalconio (0,003-0,03% p/v); el clorobutanol (0,3-0,9% p/v); y los parabenos (0,01-0,25% p/v).
A menos que se indique lo contrario en el presente documento, se dispone de una variedad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del agente activo concreto seleccionado, de la afección particular que se trate y de la dosis requerida para la eficacia terapéutica. Los procedimientos proporcionados, en general, pueden practicarse utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, es decir, cualquier modo que produzca niveles efectivos de una respuesta deseada sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Las posibles vías de administración incluyen las inyecciones, por vía parenteral como la intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intraarticular, intraepidural, intratecal, intravenosa, intramuscular, inyección o infusión intraesternal u otras, así como la oral, nasal, mucosa, sublingual, intratraqueal, oftálmica, rectal, vaginal, ocular, tópica, transdérmica, pulmonar, inhalación.
En una realización ejemplar, la composición farmacéutica liposomal puede, por ejemplo, prepararse como una composición de infusión, una composición de inyección, una composición parenteral o una composición tópica, ya sea como solución líquida o suspensión. Sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La composición puede, por ejemplo, formularse también en un comprimido con recubrimiento entérico o en una cápsula de gel según procedimientos conocidos en la técnica.
Para la administración de medicamentos liposomales formulados según las realizaciones ejemplares, a los tumores del sistema nervioso central, una infusión intracraneal lenta y sostenida de los liposomas directamente en el tumor (una administración mejorada por convección, o CED) puede ser de particular ventaja. Véase Saito, et al., Cancer Research, vol. 64, p. 2572-2579, 2004 Mamot, et al., J. Neuro-Oncology, vol. 68, p. 1-9, 2004. Las composiciones pueden, por ejemplo, aplicarse directamente a las superficies de los tejidos. La liberación sostenida, la liberación dependiente del pH u otra administración de liberación mediada por condiciones químicas o ambientales específicas también se incluye específicamente en las realizaciones ejemplares, por ejemplo, por medios como inyecciones de depósito o implantes erosionables. A continuación se enumeran algunos ejemplos concretos a modo de ilustración. Para la administración oral, los compuestos pueden, por ejemplo, formularse fácilmente combinando las composiciones liposomales con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten la formulación en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, películas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un sujeto a tratar. Los excipientes adecuados pueden incluir, por ejemplo, cargas como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Opcionalmente, las formulaciones orales también pueden ser formuladas en solución salina o tampones para neutralizar las condiciones de acidez interna o pueden ser administradas sin ningún vehículo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse por vía oral incluyen cápsulas de gelatina con cierre a presión, así como cápsulas blandas y selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener la composición liposomal suspendida en líquidos adecuados, como soluciones acuosas, soluciones tamponadas, aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar en dosis adecuadas para dicha administración.
Para la administración oral, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, las composiciones pueden administrarse convenientemente en forma de presentación de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, iclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida.
Cuando sea deseable administrar las composiciones sistémicamente, pueden ser formuladas para la administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones inyectables pueden presentarse en forma de dosis unitarias, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis. Las formulaciones farmacéuticas parenterales incluyen soluciones acuosas de los ingredientes. Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como la carboximetilcelulosa sódica, el sorbitol o el dextrano. Alternativamente, las suspensiones de liposomas pueden prepararse como suspensiones a base de aceite. Entre los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados se encuentran los aceites grasos, como el aceite de sésamo, o los ésteres sintéticos de ácidos grasos, como el oleato de etilo o los triglicéridos.
Alternativamente, las composiciones liposomales pueden estar en forma de polvo o liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Las composiciones también pueden formularse en composiciones rectales o vaginales, como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contengan bases convencionales para supositorios, como manteca de cacao u otros glicéridos.
Las realizaciones ejemplares contemplan la administración de agentes a sujetos que tienen o corren el riesgo de desarrollar un cáncer, incluyendo por ejemplo un cáncer de tumor sólido, utilizando las composiciones y los liposomas de las realizaciones ejemplares. En una realización ejemplar, el cáncer puede, por ejemplo, distinguirse por la expresión de receptores de folato en su superficie celular. El receptor de folato puede, por ejemplo, incluir el receptor de folato alfa, el receptor de folato beta o el receptor de folato delta. Las realizaciones ejemplares contemplan que las composiciones sean capaces de suministrar mayores cantidades de los agentes bioactivos, solos o en combinación, a estos sujetos sin que se produzca un suministro excesivo a las células normales (es decir, a las células que no expresan receptores de folato).
Cualquier cáncer que exprese receptores de folato puede ser tratado. Hay que tener en cuenta que algunos cánceres pueden expresar receptores de folato en una fase temprana, mientras que la mayoría de los cánceres pueden expresar receptores de folato en fases tardías. El cáncer puede ser un carcinoma, un sarcoma o un melanoma. Los carcinomas incluyen, sin limitación, el carcinoma de células basales, el cáncer del tracto biliar, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de cuello uterino, el coriocarcinoma, el cáncer del sistema nervioso central, el cáncer de colon y recto, el cáncer de riñón o de células renales, el cáncer de laringe, el cáncer de hígado, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP, incluyendo el adenocarcinoma cáncer de cavidad oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel (incluido el cáncer de células basales y el cáncer de células escamosas), cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de recto, cáncer del sistema respiratorio y cáncer del sistema urinario. Los sarcomas son neoplasias mesenquimales que surgen en los huesos (osteosarcomas) y en los tejidos blandos (fibrosarcomas). Los sarcomas incluyen, entre otros, los liposarcomas (incluidos los liposarcomas mixoides y los liposarcomas pleiomórficos), los leiomiosarcomas, los rabdomiosarcomas, los tumores malignos de la vaina del nervio periférico (también denominados schwannomas malignos, neurofibrosarcomas o sarcomas neurogénicos), los tumores de Ewing (incluidos el sarcoma de Ewing óseo, el sarcoma de Ewing extraesquelético (es decir, sarcoma de Ewing (no óseo) y tumor neuroectodérmico primitivo), sarcoma sinovial, angiosarcomas, hemangiosarcomas, linfangiosarcomas, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, tumor desmoide (también llamado fibromatosis agresiva), dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP), histiocitoma fibroso maligno (HFM), hemangiopericitoma, mesenquimoma maligno, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma epitelioide, sarcoma de células claras, tumor desmoplásico de células pequeñas, tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y condrosarcoma.
Los melanomas son tumores que surgen del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Ejemplos de melanoma incluyen, sin limitación, el melanoma lentigomaligno, el melanoma de extensión superficial, el melanoma nodular y el melanoma lentiginoso acral.
El cáncer puede ser un linfoma de tumor sólido. Algunos ejemplos son el linfoma de Hodgkin, el linfoma no Hodgkin y el linfoma de células B.
El cáncer puede ser, sin limitación, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de tejido conectivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, neoplasia intraepitelial, neuroblastoma melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de próstata, retinoblastoma o rabdomiosarcoma.
Las realizaciones ejemplares pueden practicarse en cualquier sujeto que pueda beneficiarse de la administración de agentes como se contempla en el presente documento. Los sujetos humanos son los preferentes en las realizaciones ejemplares, pero los sujetos también pueden incluir animales como mascotas domésticas (por ejemplo, perros, gatos, conejos, hurones, etc.), ganado o animales de granja (por ejemplo, vacas, cerdos, ovejas, pollos y otras aves de corral), caballos como los de pura sangre, animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, etc.), mamíferos y similares. Los temas también incluyen peces y otras especies acuáticas.
Los sujetos a los que se administran los agentes pueden ser sujetos normales. También pueden tener o estar en riesgo de desarrollar una afección que puede ser diagnosticada o que puede beneficiarse de la administración de uno o más agentes particulares. En una realización ejemplar, tales condiciones incluyen el cáncer (por ejemplo, cánceres de tumores sólidos o cánceres no sólidos como las leucemias). En una realización más preferida, estas condiciones incluyen cánceres que implican células que expresan receptores de folato en su superficie celular. Las pruebas para diagnosticar las condiciones abarcadas por las realizaciones ejemplares son conocidas en la técnica y serán familiares para el médico general. La determinación de si un tipo de célula expresa receptores de folato puede realizarse utilizando anticuerpos disponibles en el mercado. Estas pruebas de laboratorio incluyen, sin limitación, análisis microscópicos, pruebas dependientes del cultivo (como los cultivos) y pruebas de detección de ácidos nucleicos. Entre ellas se encuentran los montajes húmedos, la microscopía con tinción, la microscopía inmunológica (por ejemplo, FISH), la microscopía de hibridación, la aglutinación de partículas, los ensayos inmunoenzimáticos, las pruebas de cribado de orina, la hibridación con sondas de ADN, las pruebas serológicas, etc. Por lo general, el médico también realizará una historia clínica completa y un examen físico completo, además de realizar las pruebas de laboratorio mencionadas anteriormente.
Un sujeto que tiene un cáncer puede, por ejemplo, ser un sujeto que tiene células cancerosas detectables. Un sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer puede ser, por ejemplo, un sujeto que tiene una probabilidad más alta de lo normal de desarrollar un cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anormalidad genética que ha demostrado estar asociada con una mayor probabilidad de desarrollar un cáncer, sujetos que tienen una disposición familiar al cáncer, sujetos expuestos a agentes causantes de cáncer (es decir, carcinógenos) como el tabaco, el amianto u otras toxinas químicas, y sujetos previamente tratados por cáncer y en aparente remisión. En una realización ejemplar, los procedimientos pueden administrar selectivamente una composición antifolato liposomal al tumor a una tasa que es mayor, por ejemplo, al menos dos veces mayor, que una célula que no expresa el receptor de folato.
Las realizaciones ejemplares se refieren a un procedimiento de fabricación de cualquiera de las composiciones de la presente divulgación. En una realización a modo de ejemplo, el procedimiento consiste en formar una mezcla que comprenda: (1) los componentes liposomales; (2) el agente antifolato bioactivo en solución acuosa; y (3) la fracción de unión a diana. La mezcla puede entonces ser homogeneizada para formar liposomas en dicha solución acuosa. Además, la mezcla puede ser extruida a través de una membrana para formar liposomas que encierren el agente antifolato bioactivo en una solución acuosa. Se entiende que los componentes liposomales comprenden cualquier lípido (incluido el colesterol) de la presente divulgación, incluidos los lípidos funcionalizados y los lípidos unidos a elementos diana, etiquetas detectables y estabilizadores estéricos, o cualquier subconjunto de todos ellos. Se observa además que el antifolato bioactivo en solución acuosa puede comprender cualquier reactivo y producto químico explicado para el interior o el exterior del liposoma incluyendo, por ejemplo, tampones, sales, crioprotectores y similares.
El procedimiento puede comprender además el paso opcional de liofilizar la composición después de dicho paso de eliminación para formar una composición liofilizada. Como se ha indicado anteriormente, el agente antifolato bioactivo en solución acuosa puede comprender crioprotectores que pueden ser cualquier crioprotector se enumeran en la presente divulgación. Si la composición va a ser liofilizada, puede ser preferente un crioprotector.
Además, después del paso de liofilización, el procedimiento puede comprender el paso opcional de reconstituir dicha composición liofilizada disolviendo la composición liofilizada en un disolvente después de dicho paso de liofilización. Los procedimientos de reconstitución son bien conocidos. Un disolvente preferente es el agua. Otros disolventes preferentes son las soluciones salinas y las soluciones tamponadas.
Aunque se explican ciertas realizaciones ejemplares, debe entenderse que los liposomas pueden hacerse por cualquier procedimiento conocido o que se conozca en la técnica. Véase, por ejemplo, G. Gregoriadis (editor), Liposome Technology, vol. 1-3, 1a edición, 19832a edición, 1993, CRC Press, 45 Boca Ratón, Fla. Los ejemplos de procedimientos adecuados para hacer la composición de liposomas incluyen la extrusión, la evaporación en fase inversa, la sonicación, la inyección de disolvente (por ejemplo, etanol), la microfluidización, la diálisis con detergente, la inyección de éter y la deshidratación/rehidratación. El tamaño de los liposomas puede controlarse mediante el control del tamaño de los poros de las membranas utilizadas para la extrusión a baja presión o la presión y el número de pases utilizados en la microfluidización o cualquier otro procedimiento adecuado.
En general, el agente antifolato bioactivo está contenido en el interior, es decir, en el espacio interior de los liposomas. En una realización ejemplar, el amonio sustituido se elimina parcial o sustancialmente del medio exterior que rodea a los liposomas. Dicha eliminación puede llevarse a cabo por cualquier medio adecuado conocido por un experto en la materia, por ejemplo, dilución, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis, ultrafiltración, precipitación, etc. Por lo tanto, un paso opcional puede comprender un paso de: eliminación del agente antifolato bioactivo en solución acuosa fuera de los liposomas después de dicho paso de extrusión.
Otra realización ejemplar se refiere a una composición liposomal dirigida a diana que se dirige selectivamente a los receptores de folato que comprende: un liposoma que incluye un espacio interior, un agente bioactivo dispuesto dentro de dicho espacio interior, una molécula estabilizadora estérica unida a un exterior del liposoma, y una fracción dirigida a diana que comprende una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha fracción dirigida a diana unida a al menos uno de los estabilizadores estéricos y al exterior del liposoma.
Los componentes de la presente realización ejemplar pueden ser los mismos que los descritos para otras realizaciones de la presente divulgación. Por ejemplo, el agente bioactivo, el estabilizador estérico que puede ser PEG, son como se describe en otras partes de la presente divulgación.
En la realización ejemplar, el agente bioactivo de la realización ejemplar puede ser ellipticina; paclitaxel o cualquier otro agente bioactivo enumerado en la presente divulgación. También se prevén agentes relacionados con la elipticina o el paclitaxel. Entre ellos se encuentran, al menos, taxanos como el docetaxel y el cabazitaxel.
Las realizaciones ejemplares contemplan además aplicaciones in vitro de las composiciones y procedimientos. El uso in vitro puede ser, por ejemplo, en el uso como el cultivo de células y la ingeniería de tejidos donde se desea el tratamiento selectivo de una subpoblación de células. Por ejemplo, durante el cultivo de células madre de un paciente normal o de un paciente que padece cáncer, las células pueden ser tratadas con una composición de muestra o liposoma de muestra como se ha comentado para tratar las subpoblaciones de células cancerosas. La subpoblación cancerosa puede surgir porque el donante tiene originalmente cáncer o porque las células se transforman espontáneamente durante los procedimientos in vitro.
Según realizaciones ejemplares, los liposomas y las composiciones de liposomas pueden proporcionarse en un kit que comprende un recipiente con los liposomas y, opcionalmente, un recipiente con la entidad y una instrucción, por ejemplo, procedimientos o información relacionados con el uso de la composición de liposomas en una o más aplicaciones. Dicha instrucción puede proporcionarse a través de cualquier medio, por ejemplo, una copia en papel, un medio electrónico o el acceso a una base de datos o sitio web que contenga la instrucción.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la invención de ninguna manera, ni explícita ni implícitamente. Aunque son típicos de los que podrían utilizarse, pueden emplearse alternativamente otros procedimientos, metodologías o técnicas conocidos por los expertos en la materia.
Utilizando los procedimientos de la presente divulgación, incluidos los procedimientos de la sección de Ejemplos, se construyen composiciones ejemplares y liposomas ejemplares, como la composición antifolato liposomal. Las composiciones ejemplares comprenden liposomas ejemplares. Tanto la composición ejemplar como el liposoma ejemplar se utilizan en los experimentos descritos en la sección de ejemplos y a lo largo de la presente divulgación son realizaciones específicas de la divulgación y no pretenden definir el ámbito total de la misma.
Ejemplo 1: Producción de liposomas dirigidos al receptor de folato alfa que contienen Pemetrexed y un Hapteno
Producción de liposomas de Pemetrexed
El heptahidrato de Pemetrexed disódico (ALIMTA) es altamente soluble en agua con una solubilidad de 100 mg/ml a pH neutro. El Pemetrexed se encapsula en liposomas mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se pesan los componentes lipídicos de la membrana del liposoma y se combinan como solución concentrada en etanol a una temperatura de unos 65°C. En este ejemplo, los lípidos utilizados son la fosfitidilcolina de soja hidrogenada, el colesterol, el DSPE-PEG-2000 (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]), el PEG-DSPE-malemida y el PEG-DSPE-FITC. La proporción molar de HSpC: El colesterol: PeG-DSpE es aproximadamente 55:40:5. A continuación, el Pemetrexed se disuelve en un tampón acuoso a una concentración de 100 mg/ml. La solución del medicamento se calienta a 65°C. La solución lipídica etanólica se inyecta en la solución de Pemetrexed utilizando una aguja de pequeño calibre. Durante este paso, la solución del medicamento se agita bien utilizando un agitador magnético. La mezcla se realiza a una temperatura elevada (63°C -72°C) para garantizar que los lípidos se encuentren en estado líquido cristalino (en contraposición al estado de gel que alcanzan a temperaturas inferiores a la temperatura de transición lipídica Tm = 51°C -54°C). Como resultado, los lípidos se hidratan y forman vesículas multicapa (multilamelares) (MLV) que contienen Pemetrexed en el núcleo acuoso.
Reducción del tamaño de las MLV mediante extrusión de filtros
Los MLV se fragmentan en vesículas unilamelares (de una sola bicapa) del tamaño deseado mediante extrusión a alta presión utilizando tres pases a través de membranas apiladas (de policarbonato grabado). Las membranas utilizadas en la primera pasada tienen un tamaño de poro de 200nm. Las membranas utilizadas durante la segunda pasada tienen un tamaño de poro de 100 nm, seguidas de membranas de 80 nm de tamaño de poro como última pasada. Durante la extrusión, la temperatura se mantiene por encima de la Tm para garantizar la plasticidad de las membranas lipídicas. Como resultado de la extrusión, las MLV grandes y heterogéneas en tamaño y lamelaridad se convierten en vesículas unilamelares (ULV) pequeñas y homogéneas (80-100 nm) que secuestran el medicamento en su interior. Se utilizó un instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Southborough, MA) con detector de retrodispersión (90°) para medir el tamaño hidrodinámico (diámetro) a 25°C en una microcubeta de cuarzo. Las muestras se diluyeron 50 veces en la matriz de formulación antes del análisis.
Los resultados de los inventores muestran que los liposomas reducidos de tamaño mediante la extrusión de filtros tenían un tamaño medio de partícula de 85 nM con una PDI de 0,007 y un potencial zeta de -43,7. Como alternativa a la extrusión de filtros, también puede utilizarse la microfluidización a alta presión para reducir el tamaño de los liposomas. Los inventores han podido producir liposomas con un tamaño a partir de 40 nm, como por ejemplo entre 30-150 nm (datos no mostrados) o incluso más pequeños que 30 nm, y en particular entre 40 nm y 120 nm utilizando procedimientos como la extrusión por filtro de alta presión o la microfluidización solos o en combinación.
Filtración de flujo tangencial (TFF) y formulación de medicamentos
Después de producir los ULV que contienen Pemetrexed, el Pemetrexed extraliposomal se elimina mediante diálisis o diafiltración de flujo tangencial contra un tampón adecuado. Aunque se puede utilizar cualquier solución tampón, en este ejemplo el tampón utilizado fue Citrato de Sodio 5 mM, Cloruro de Sodio 60mM, pH 6,1. Una vez finalizada la diálisis, filtrar con un filtro de 0,22 micrómetros.
Tiolación del anticuerpo anti-receptor de folato alfa
Para conjugar el anticuerpo con las moléculas de PEG-DSPE-malemida en el liposoma, el anticuerpo debe ser tiolado. En este ejemplo, la tiolación del anticuerpo se consigue utilizando el reactivo de Traut (Themo Fisher Scientific). El anticuerpo se añade al reactivo Trauts 14 mM recién preparado y al EDTA 5 mM en una solución salina tamponada con fosfato a un pH de 8,1. Tras la incubación con agitación suave durante 60 minutos, el anticuerpo tiolado se separa del exceso de reactivo Trauts mediante diálisis contra 200 volúmenes de HEPES 25 mM pH 7,0, 60 mM NaCl durante un mínimo de 4 horas.
Conjugación del anticuerpo tiolado con los liposomas de Pemetrexed
La cantidad de anticuerpo tiolado a utilizar se calcula en función del número deseado de anticuerpos por liposomas. Se añade un exceso de 2 veces de cada preparación de anticuerpo tiolado a liposomas estériles diafiltrados. El recipiente de reacción se cubre con gas nitrógeno y se incuba durante la noche con agitación lenta a temperatura ambiente de 4°C. La reacción de conjugación se detiene bloqueando los grupos maleimida no reaccionados mediante la adición de una solución acuosa 100mM de L-Cisteína-HCl hasta una concentración final de 15 mM en la mezcla de reacción. A continuación, el anticuerpo tiolado libre se separa de los liposomas conjugados con el anticuerpo mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Ejemplo 2: Líneas celulares utilizadas para los experimentos
Las líneas celulares utilizadas en los experimentos están disponibles comercialmente en fuentes como la ATCC (American Type Culture Collection de Manassas, Virginia, EE.UU.). A continuación se indican las líneas celulares, sus números de acceso ATCC y las condiciones de crecimiento.
Calu-3 (ATCC HTB-55); EMEM (Cat. no. 30-2003); 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
KB; EMEM (Cat. no. 30-2003); 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
CCD841 (ATCC CRL-1790); EMEM (Cat. no. 30-2003); 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
Hs578Bst (ATCC HTB-125); Hybri-Care Medium pH 7.0 (Cat.no. 46-X); 30 ng/ml de EGF de ratón; 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
NCI-H2087 (ATCC CRL-5922); RPMI-1640 (Cat. no. 30-2001); 5% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
NCI-H2452 (ATCC CRL-5946); RPMI-1640 (Cat. no. 30-2001); 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
OVCAR-3 (ATCC HTB-161); RPMI-1640 (Cat. no. 30-2001); 20% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
SKBR3; Medio McCoy 5A; 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
SL0003 (ATCC PTA-6231); medio F-12K; 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
A549 (ATCC CCL-185); medio F-12K; 10% FBS HI; 1% Pen/Strep; 1% L-Glutamina.
Ejemplo 3 Determinación de la especificidad de unión de una construcción de muestra
El nivel del receptor de folato alfa en la superficie celular se midió por citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal conjugado con un fluorocromo. Un desplazamiento hacia la derecha después de la unión de un anticuerpo (véase, por ejemplo, la Figura 6, línea 606) en comparación con la línea anterior al tratamiento con anticuerpos (véase, por ejemplo, la Figura 6, líneas 602 y 604) indica la detección del receptor por citometría de flujo. Cuanto más se desplace el histograma (por ejemplo, Figura 6, línea 606) hacia la derecha en relación con las células no tratadas (véase, por ejemplo, Figura 6, línea 602 y 604), mayores serán los niveles de receptores en la superficie celular. Los gráficos demuestran altos niveles de receptor de folato alfa en las células cancerosas, pero niveles casi indetectables en las células normales.
El liposoma ejemplar, que forma parte del ejemplo de composición liposomal construida, se une a la superficie celular a las células que son receptores de folato alfa positivos, pero no a las células que son receptores de folato alfa negativos. El liposoma ejemplar contiene anticuerpos contra el receptor de folato alfa. Cuando el liposoma ejemplar se incuba durante un corto período (30 minutos) con células alfa+ receptoras de folato, puede detectar el liposoma ejemplar en la superficie celular midiendo el nivel de FITC integrado en el liposoma mediante citometría de flujo. Un desplazamiento del pico del histograma indica que el liposoma ejemplar se detecta en la superficie celular. Cuanto más se desplace el pico hacia la derecha, más ejemplo de liposoma se detecta en las células.
En este experimento los inventores determinaron la unión del liposoma ejemplar a las células para acceder a su afinidad y especificidad. Brevemente, el liposoma ejemplar que comprende una etiqueta detectable, fue coincubado con células y las células fueron analizadas por citometría de flujo. Los siguientes datos muestran que el liposoma ejemplar se une a las células cancerosas con receptores de folato alfa positivos, pero no a las células normales con receptores de folato negativos.
La Figura 3 es un esquema que representa la medición del receptor de folato alfa en la superficie celular.
La Figura 6 es un histograma representativo de líneas celulares de cáncer KB que expresan altos niveles de superficie del receptor de folato alfa, medidos por citometría de flujo. En la Figura 6, etiqueta 602 = sin anticuerpo; etiqueta 604 = control de isotipo; etiqueta 606 = APC anti-receptor de folato alfa.
La Figura 7 es un histograma representativo de la línea celular de cáncer OVCAR-3 que expresa altos niveles de superficie del receptor de folato alfa, medidos por citometría de flujo. En la Figura 7, etiqueta 702 = sin anticuerpo; etiqueta 704 = APC anti-receptor de folato alfa.
La Figura 8 es un histograma representativo de la línea celular de cáncer NCIH2452 que expresa altos niveles de superficie del receptor de folato alfa, medidos por citometría de flujo. En la Figura 8, etiqueta 802 = sin anticuerpo; etiqueta 804 = control de isotipo; etiqueta 806 = APC anti-receptor de folato alfa.
La Figura 9 es un histograma representativo de una línea celular normal derivada de epitelios de colon que expresan bajos niveles de superficie del receptor de folato alfa. En la Figura 9, etiqueta 902 = sin anticuerpo; etiqueta 904 = control de isotipo; 906 = APC anti-receptor de folato alfa.
La Figura 2 es un esquema que representa un ejemplo de unión de liposomas a la superficie celular.
La Figura 10 es un histograma representativo de la línea celular SL0003 (pulmón). La línea celular de cáncer de pulmón se une a altos niveles del liposoma ejemplar. Etiqueta 1002 = células no tratadas. Etiqueta 1004 = el ejemplo de células tratadas con liposomas.
La Figura 11 es un histograma representativo de la línea celular CCD841 (colon normal). La línea celular con receptor de folato alfa negativo se une poco al liposoma ejemplar. Etiqueta 1102 = células no tratadas. Etiqueta 1104 = ejemplo de células tratadas con liposomas.
La Figura 12 muestra datos compuestos derivados de células de pulmón (SL0003) y de ovario (OVCAR-3) que demuestran altos niveles de unión de liposomas ejemplar en la superficie celular en comparación con las células normales derivadas de colon (CCD841) y de mama (Hs578), P<0,05. Se muestran los niveles de superficie del liposoma ejemplar detectados a los 30 minutos o a las 4 horas de incubación a 37°C.
En estos experimentos, los ensayos se realizaron de la siguiente manera:
Las células se recogieron y se lavaron en albúmina de suero bovino al 0,2% en PBS (tampón FACS) Las células se resuspendieron en un volumen de 100 |j1 en tampón FACS. se añadieron 5 j l de monoclonal anti-receptor de folato alfa conjugado con APC (cat no FAB5646A; R&D Systems). Las células se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a 4°C. se añadieron 100 j l de tampón FACs para lavar las células y luego se evaluaron las células por citometría de flujo (FL4). Para medir el ejemplo del liposoma en la superficie de la célula. Las células se recogieron, se contaron y se lavaron en albúmina de suero bovino al 0,2% en PBS (tampón FACS). se resuspendieron 20.000 células en un volumen de 100 j l en tampón FACS. se añadieron 2 j l del liposoma ejemplar a las células. Las células se incubaron a 37°C durante 30 minutos, se lavaron con tampón FACS y se evaluaron por citometría de flujo.
Ejemplo 4 Experimento de RhodoRed sobre composiciones de muestras y liposomas de muestras
La Figura 4 muestra un esquema del liposoma en la célula. El liposoma de la muestra se marcó con pH-RhodoRed, que es fluorescente en presencia de un pH reducido, como en el endolisosoma de la célula. La internalización se ve como un desplazamiento a la derecha del pico en relación con las células no tratadas.
La Figura 13 muestra que las células marcadas con RhodoRed del liposoma ejemplar son internalizadas por las células de cáncer de ovario. Esto es evidente porque el pico 1504 (células tratadas con la composición ejemplar/liposoma ejemplar) se desplaza a la derecha del pico no tratado 1502. De manera similar, en la Figura 14, vemos que en relación con el pico 1502 sin tratar, el pico tratado con cantidades crecientes de liposomas ejemplar, comienzan a desplazarse hacia la derecha como se aprecia en los picos 1504, 1506, 1508, 1510 y 1512 que se refieren a 10 jl, 20 jl, 30 jl, 40 j l y 50 j l respectivamente (ver Figura 17). Los mismos datos se representan en un gráfico de barras en la Figura 17. En la Figura 17 se evaluó, a modo de comparación, un liposoma de control marcado con pH-RhodoRed que carecía del receptor de folato a (FOLR1). Los liposomas que carecen de anti-FOLRl no fueron internalizados por las células KB. En cambio, el liposoma de muestra marcado con pH-RhodoRed fue internalizado por las células KB. Estos datos en la Figura 17, como se muestra, son el resultado de 18 horas de incubación a 37°C, respuesta a la dosis, también cuantificada en la Figura 14. Las líneas celulares normales receptoras de folato negativas (célula de mama; panel izquierdo y colon; panel derecho) no internalizaron el liposoma de muestra marcado con pH-RhodoRed. La Figura 15 muestra que la internalización es mínima en las células mamarias normales. El pico 1704 sólo está ligeramente desplazado con respecto al pico 1702. La Figura 16 muestra que la internalización es mínima en las células de colon normales, ya que los picos 1802 y 1804 no se desplazaron sustancialmente.
Para evaluar aún más la internalización, se evaluaron los niveles de activación de la MAP quinasa en las células de cáncer de pulmón SL0003 mediante PhosFlow. En la Figura 5 se muestra un esquema de la muestra del liposoma dentro de la célula que activa las quinasas. La Figura 18A y la Figura 18B muestran el efecto del Pemetrexed en la reducción de los niveles basales de fosforilación de p38 a los 30 minutos del tratamiento. La Figura 18A muestra células no tratadas con un 52,5% de p38 fosforilada. Cuando las células fueron tratadas con la composición ejemplar que comprende el liposoma ejemplar de la Figura 18B, este porcentaje se reduce al 8,95%. La Figura 19 muestra la cuantificación de los niveles de fosforilación de p38 en las células cancerosas y en las normales a los 30 minutos del tratamiento. La composición de la muestra y el liposoma de la muestra, etiquetado como "Liposoma dirigido a diana", afecta a la activación de p38 en las células de cáncer de pulmón SL0003.
Los inventores interpretaron los datos de la siguiente manera: Los liposomas de la muestra entran en las células que son FOLR1 positivas. Los liposomas de la muestra fueron marcados con un colorante (RhodoRed) que sólo puede ser detectado por citometría de flujo si entra en la célula. Se incubaron varias células con diferentes cantidades de liposomas de muestra marcados con RhodoRed y se midió el nivel de fluorescencia por citometría de flujo (FL2.) Los liposomas de muestra marcados con RhodoRed entran en las células cancerosas que expresan FOLR1, pero no en las células normales que son negativas para FOLR1. Se muestran células de cáncer de ovario con el pico desplazado a la derecha indicando que el medicamento ha entrado en la célula (Figura 13). El mismo experimento se realizó con células KB de alto contenido en FOLR1 con cantidades tituladas de liposomas de muestra marcados con RhodoRed (Figura 14). Estos datos se cuantifican en la Figura 17. Los liposomas de la muestra entraron en las células KB cuando se trataron con altas concentraciones, pero los liposomas de control que carecían de anticuerpos anti-FOLRl no pudieron entrar en la célula.
Una segunda medida de la entrada del liposoma de la muestra en la célula son las vías de activación intracelular. Las células responden a los ligandos que se unen a sus receptores activando las quinasas, en este caso la p38. Las quinasas activadas pueden medirse por citometría de flujo. Las células se incuban con el liposoma de la muestra durante 30 minutos y luego se lisan con un detergente suave. La quinasa p38 activada se detecta con un anticuerpo por citometría de flujo. Un desplazamiento por debajo de la puerta de la línea roja indica un mayor nivel de p38 fosforilada (Véanse las Figura 18A y 18BG). Las células cancerosas pueden tener un nivel basal más alto de quinasas activadas. En este caso, el Pemetrexed reduce la activación de p38 de forma similar al liposoma de muestra, lo que demuestra que el Pemetrexed dentro del liposoma de muestra es activo (Figura 19).
Las condiciones experimentales son las siguientes:
Para las Figuras 4, 13, 14, 15, 16 y 17: Medición de la captación del liposoma de muestra marcado con RhodoRed. Las células (OvCAR-3, KB, colon normal y mama normal) se sembraron a 7.000 células/pocillo la noche anterior al experimento. Al día siguiente, las células fueron tratadas con lo siguiente: 1) Sin medicamento 2) Antibdy monoclonal anti-FOLRl marcado con RhodoRed (MABFRAH H/L) Ab -(1ul); 3) Liposoma de muestra (Liposoma FOLR1 Ab conjugado -(5ul); 4) Liposoma con pH no dirigido -(5ul)/ Liposomas sin anti-FOLRl. Las células se incubaron a 37°C durante 18 horas y 24 horas. se añadieron 100 j l de tampón FACS frío y las células se evaluaron por citometría de flujo (FL2).
Además, para la Figura 17, la medición de la fosforilación de p38 (PhosFlow) SL0003, las células de colon normales y las células de mama normales se sembraron a 10.000 células/pocillo. Las células fueron tratadas con: Pemetrexed fresco (50 jM, 10 jM), LEAF-001 (Liposoma 070715 MPF; 5traut/50 Mab, 15traut/50Mab, 45traut/50Mab) (dilución 13,33X) , anti-receptor de folato alfa (MABFRA H/L 1,01 mg/ml) (dilución 13,33X) para determinar el efecto del anticuerpo en el liposoma de muestra, o ningún tratamiento. Las células se mezclaron suavemente y se colocaron rápidamente en la incubadora. En cada punto de tiempo (30 minutos- 4 horas), las placas se retiraron de la incubadora y se fijaron inmediatamente con formaldehído para una concentración final del 2%. Las placas se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. se retiraron 25 j l de medio. se añadieron 25 j l de tampón FACS. se añadieron 100 j l de tampón de lisis celular (tampón FACS, 0,2% de Triton X-100, 0,3% de formaldehído). Las células se recogieron en tubos de centrífuga de 1,5 ml y se agitaron en vórtex durante 3 minutos para lisarlas. Se añadió el anticuerpo anti-P38 conjugado con PE (BD Pharmingen) o el control de isotipo conjugado con PE y se incubaron las células durante 30 minutos en la oscuridad a 4oC. se añadieron 200 j l de tampón FACS para el lavado. Los tubos se centrifugaron y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Las células se leyeron en el citómetro de flujo (en FL2).
Ejemplo 5 Ensayo MTS
El ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) es un ensayo colorimétrico bien conocido para evaluar la actividad metabólica celular. Las líneas celulares se utilizaron para los ensayos y sus condiciones de crecimiento son las siguientes:
(a) Calu-3: EMEM, 10% HI FBS, 1% Pen/Strep, 1X L-glutamina;
(b) KB: EMEM, 10% HI FBS, 1% Pen/Strep, 1X L-glutamina;
(c) NCI-H2087: RPMI, 5% FBS HI, 1% Pen/Strep, 1X L-glutamina;
(d) NCI-H2452: RPMI, 10% FBS HI, 1% Pen/Strep, 1X L-glutamina;
(e) SKBR3: McCoy's, 10% FBS HI, 1% Pen/Strep, 1X L-glutamina;
(f) CHO: FreeStyle CHO, 5% HI FBS, 1%Pen/Strep, 1X L-glutamina;
(g) A549: F-12K, 10% HI FBS, 1%Pen/Strep, 1X L-glutamina; y
(h) SL0003: F-12K, 10% FBS HI, 1%Pen/Strep, 1X L-glutamina.
La noche anterior, las células son sembradas de acuerdo a la cantidad de células requeridas para cada línea celular en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. El volumen final en cada pocillo es de 100 j l (véase la tabla de líneas celulares como referencia; todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC). La línea celular utilizada y las condiciones de ensayo son las siguientes:
(1) Calu-3: 10000 células por pocillo. La materia prima es de 3,1x105/ml: se diluyen 3,55mL de células en 7,45mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo ( jl se refiere a microlitro).
(2) KB: 3000 células por pocillo. La materia prima es de 2,0*105/ml: se diluyen 1,65mL de células en 9,35mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo.
(3) NCI-H2087: 3000 células por pocillo. La materia prima es de 3,7*105/ml: se diluyen 892 j l de células en 10,1mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo.
(4) NCI-H2452: 5000 células por pocillo. La reserva es de 5,0*104/ml: no es necesario diluirla
(5) SKBR3: 4000 células por pocillo. La reserva es de 5,5*105/ml: se diluyen 800 j l de células en 10,2mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo.
(6) CHO: 3000 células por pocillo. La materia prima es de 3,6*105/ml: se diluye 1mL de células en 11 mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo.
(7) A549: 3000 células por pocillo. La materia prima es de 2,3*105/ml: se diluyen 1,43mL de células en 9,57mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo.
(8) SL0003: 3000 células por pocillo. La materia prima es de 2,3*105/ml: se diluyen 1,43mL de células en 9,57mL de medio completo. Transferir 100 j l a cada pocillo.
Las células sembradas se incuban a 37°C y 5% de CO2 durante la noche. Al día siguiente, se prepararon los medicamentos en el medio de cultivo celular específico y se añadieron a las células concentraciones diluidas a 2 veces. Los preparativos son los siguientes:
Pemetrexed heptahidratado (materia prima de 5 mM). Dilución máxima 10uM: Añadir 2 j l de materia prima a 998 j l de medio completo.
Ejemplo liposoma/Liposoma FOLR-1 Ab (0,4mg/ml = 666,67 jjM ). Dilución superior 10 jM: Añadir 9 j l de materia prima a 591 j l de medio completo.
Lote de liposomas 0707F (la materia prima es de 2mM). Dilución superior 10 jiM: Añadir 3 |jl de materia prima a 597 |j| de medio completo.
En el día 4, el efecto sobre la proliferación celular se midió con el ensayo MTS. se añadieron 10 j l de reactivo (Celltiter 96® Aqueous One Solution) a cada pocillo. Se trata de un ensayo colormétrico que adquiere un color púrpura intenso cuando hay una amplia proliferación celular. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C y se midió la absorbancia a 490nm. El porcentaje de inhibición del crecimiento celular se calculó utilizando los valores de absorbancia de las células no tratadas fijados en el 100% para cada línea celular.
Ejemplo 6 Muestra del efecto de los liposomas en la proliferación celular
La Figura 20 muestra que los niveles de superficie del receptor de folato alfa en las células cancerosas se correlacionan con la susceptibilidad a la inhibición del crecimiento de los liposomas de la muestra. Se muestran los niveles de inhibición en A; p=0,05. Para evaluar aún más el efecto del liposoma de muestra en el ciclo celular, las células SL0003 (cáncer de pulmón) se trataron con Pemetrexed o con el liposoma de muestra durante 4 días.
La Figura 21 es un gráfico que muestra líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de pulmón o de mama que fueron tratadas con concentraciones tituladas de Pemetrexed o del liposoma ejemplar. Las células se incubaron durante 90 horas a 37°C y se evaluó la viabilidad y el número de células mediante MTS. Se muestran los resultados de 10 mM de Pemetrexed en comparación con el liposoma de muestra con 10 mM de Pemetrexed estimado. El liposoma de muestra demuestra una eficacia similar a la del Pemetrexed.
Las células se lisaron y el ADN se marcó con idodina de propidio para cuantificar el ciclo celular (Figura 23A) El tratamiento con Pemetrexed induce a las células a acumularse en la fase S (Figura 23B) Los datos compuestos que demuestran que el liposoma de muestra induce el mismo efecto en el ciclo celular que el Pemetrexed con una acumulación de células en la fase S se muestran en la Figura 24.
Estos datos muestran que el Pemetrexed es una quimioterapia eficaz al impedir que las células cancerosas se dividan. Probamos si el Pemetrexed contenido en el liposoma de la muestra era eficaz para inhibir la división de las células. Varias líneas celulares de cáncer fueron tratadas con Pemetrexed 10 mM o con un liposoma de muestra con una concentración equivalente estimada de Pemetrexed durante 4 días. A continuación, se evaluó el número de células que se dividieron. Los datos muestran que el liposoma de muestra y el Pemetrexed tienen efectos similares en cada una de las líneas celulares.
La expresión de FOLR1 en la superficie celular (véase la Figura 20) se correlaciona con la susceptibilidad al liposoma de la muestra. Utilizamos una segunda medida de los efectos del Pemetrexed sobre la capacidad de división de las células. Las células tratadas con Pemetrexed no pueden producir nuevo ADN y quedan atrapadas en la fase S del ciclo celular. El liposoma de muestra tiene el mismo efecto que el Pemetrexed.
Ejemplo 7 Evaluación del efecto del liposoma de muestra en el ciclo celular
Las células SL0003 (cáncer de pulmón) se prepararon como se describe en el Ejemplo que describe los ensayos MTS (Ejemplo 5).
Para este ensayo, las células se cultivaron durante 4 o 5 días (se muestra el día 5). Más concretamente, se sembraron células SC0003 (adenocarcinoma de pulmón) en placas de 96 pocillos y se trataron al día siguiente con concentraciones tituladas de LEAF-001 o Pemetrexed. En el día 5, las células se lisaron con tampón FACS, 0,2% de Triton X-100, 0,3% de formaldehído. El ADN se tiñó con Idodina de Propidio durante 30 minutos se marcó con yoduro de Propidio para evaluar el ciclo celular
Las células fueron lavadas y evaluadas por citometría de flujo (FL2). La Figura 22A muestra un esquema del ciclo celular. Los resultados experimentales se muestran en la Figura 22B. Al inhibir la formación de los nucleótidos precursores de la purina y la pirimidina, el Pemetrexed impide la formación de ADN y ARN, necesarios para el crecimiento y la supervivencia tanto de las células normales como de las cancerosas.
Ejemplo 8 La muestra de liposomas reduce la toxicidad del Pemetrexed en los neutrófilos derivados de la médula ósea.
Las células CD34+ fueron inducidas a diferenciarse en neutrófilos con IL-3, factor de células madre y G-CSF. Para el día 2, hay un aumento dramático de neutrófilos maduros representados en el óvalo (Figura 26A). En presencia de Pemetrexed (2-50 mM), se inhibe la diferenciación de neutrófilos Figura 26B; n=4 donantes).
La expresión de Mac-1 en los neutrófilos en los círculos dibujados en la Figura 25A y la Figura 25B se muestra en la Figura 25. Como puede verse en la Figura 27, el liposoma de la muestra (a 10 mM de Pemetrexed) reduce la toxicidad del Pemetrexed sobre la diferenciación de los neutrófilos (n=3 donantes.) Las células se trataron con una estimación calculada del liposoma de muestra a 10 mM de Pemetrexed durante dos días. El número de neutrófilos diferenciados se evaluó por citometría de flujo como se muestra en la Figura 26A y 26B. El círculo denota neutrófilos maduros que expresan Mac-1 y CD15.
Uno de los efectos secundarios del tratamiento con Pemetrexed fue la reducción de neutrófilos en el torrente sanguíneo. Esto fue el resultado de que las células madre CD34+ no se diferencien, o se desarrollen, en neutrófilos maduros en la médula ósea. Medimos el efecto del liposoma de la muestra en la diferenciación de los neutrófilos en comparación con la misma dosis de Pemetrexed (10mM.) Se compraron células madre de 4 donantes y se trataron con un panel de factores de crecimiento para inducir la diferenciación de neutrófilos. Las células CD34+ que también fueron tratadas con Pemetrexed no se convirtieron en neutrófilos maduros.
El nivel de una molécula llamada Mac-1 es elevado en los neutrófilos más maduros. Esta molécula se eleva en las celdas de los círculos dibujados en los gráficos. Un desplazamiento hacia el rojo indica un aumento de los niveles en las células.
Por el contrario, el liposoma de muestra fue capaz de reducir esta toxicidad al permitir que más células se convirtieran en neutrófilos. Véase, por ejemplo, la Figura 27.
Los experimentos se realizaron de la siguiente manera: Las células madre CD34+ se obtuvieron de ATCC. Las células CD34+ se descongelaron a 37°C durante 1 minuto. Mientras estaban en hielo, las células se transfirieron a un medio de células madre frío ("StemSpan SFEM" - Stem Cell Tech. cat 9650), 10% de suero fetal bovino activado por calor (HI FBS.) Cada vial contenía aproximadamente 5x105 células/ml. Las células se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos ~ 35.000 células/pocillo.
Los medios de cultivo de neutrófilos contenían 100 ng/ml de factor de células madre humano (SCF-Sigma H8416, lote no MKBT8036V), 20 ng/ml de factor de estimulación de colonias de granulocitos, humano (G-CSF- Sigma H5541, lote no SLBC9602V), 10 ng/ml de IL3 recombinante humana (Sigma SRP3090, lote no1008AFC13) en los medios StemSpam como se indica anteriormente.
Las células también fueron tratadas de la siguiente manera: 1) medio StemSpam solo sin citoquinas de crecimiento; 2) medio StemSpam citoquinas de crecimiento, 3) 50, 10 o 2 pM de Pemetrexed, 4) liposoma de muestra (equivalente a 10 pM de Pemetrexed), o 5) anti-folato alfa Ab (1,01 mg/ml) - 5ug/ml
Las células se incubaron durante 1-5 días y se analizaron en cada punto de tiempo para detectar neutrófilos maduros mediante citometría de flujo con anticuerpos contra CD15, Mac-1 y CD34. Las células mostradas en el círculo de los gráficos son neutrófilos en maduración que expresan Mac-1 y CD34.
Ejemplo 9 Resultados y análisis
La expresión del receptor de folato alfa está restringida a órganos específicos más allá del paso fetal/embrionaria en humanos en estados no cancerosos. Como se muestra en la Figura 1A, en el entorno de la polaridad normal, el epitelio simple normal comprende una monocapa de células individuales que muestran una polaridad apical- basal distinta. Las células están fuertemente empaquetadas y conectadas entre sí por los complejos de unión apical, que separan los dominios de membrana apical y basolateral (Figura 1A etiqueta 101). En los tejidos normales en los que se conserva la polaridad, el receptor de folatos alfa se une a la superficie apical de las células situadas lejos y fuera del contacto directo con los folatos en la circulación sanguínea (Figura 1A etiqueta 102). Por el contrario, la alteración de la polaridad celular y la desorganización de los tejidos es un sello distintivo de los tumores epiteliales avanzados. La Figura 1B muestra cómo las células de los tumores epiteliales de alto grado muestran una pérdida de polaridad apical-basal y una desorganización general del tejido, lo que pone al receptor de folato alfa en contacto directo con los folatos en la circulación sanguínea (Figura 1B, etiqueta 103). Además, las células del tejido tumoral en general expresan niveles más altos de receptor de folato alfa que las células normales que casualmente expresan este receptor. Esta característica diferenciadora de las células del tejido tumoral con respecto a las células epiteliales normales es el núcleo del diseño de la nueva entidad química destinada a rehabilitar los antifolatos como terapias anticancerígenas, minimizando al mismo tiempo las toxicidades asociadas, graves y a veces mortales. Dicha entidad química suministra un agente antifolato de manera que se dirige selectivamente al receptor de folato alfa, no con ácido fólico, sino con una fracción específica del receptor de folato alfa para evitar los RFC. Este enfoque limita la exposición del antifolato a las células del tejido tumoral sólo por la pérdida de polaridad celular, ya que estas células del tejido tumoral sobreexpresan el receptor de folato alfa durante el tiempo que este receptor está en contacto directo con la circulación sanguínea. Este no es el caso de los tejidos normales limitados en los que se expresa el receptor de folato alfa, porque el receptor no está en contacto directo con la sangre circulante.
A partir de este punto, el receptor de folato alfa también puede utilizarse indistintamente con el receptor de folato alfa que describe el gen que codifica la proteína del receptor de folato alfa. Ambos términos se utilizan indistintamente para describir la proteína del receptor de folato alfa. Además, la nueva entidad química se denominará, a efectos ilustrativos, liposoma ejemplar (también denominado liposoma de destino). Los procedimientos para hacer las composiciones ejemplares y los liposomas ejemplares se divulgan a lo largo de la especificación y al menos en el Ejemplo 1. La discusión que sigue se refiere a algunos experimentos realizados con algunas composiciones ejemplar y algunos liposomas ejemplares. No se pretende definir todos los posibles ejemplos de composiciones y todos los posibles ejemplos de liposomas.
La Figura 2 ilustra el ejemplo de liposoma y cómo se une a una célula que expresa el receptor de folato alfa. Además de ser un hapteno, el FTIC sirve como agente de imagen que permite visualizar la unión del liposoma ejemplar al receptor de folato alfa en la superficie de una célula que expresa el receptor de folato alfa, mientras que la Figura 3 ilustra la construcción diseñada, por un lado, para documentar la unión al receptor de folato alfa y, por otro, para cuantificar el número de receptores de folato alfa expuestos en la superficie celular.
La Figura 4 ilustra la internalización del liposoma ejemplar en una célula que expresa el receptor de folato alfa utilizando RhodoRed. El ejercicio consiste en demostrar que el liposoma ejemplar se internaliza independientemente de la carga del agente bioactivo. La Figura 5 ilustra aún más el efecto de la internalización del liposoma ejemplar sobre la proliferación celular utilizando las vías de la proteína quinasa p38 como lectura de la respuesta celular al estrés.
La siguiente serie de ilustraciones (Figuras 6-11) describe los experimentos y los resultados que muestran, en primer lugar, que el anticuerpo dirigido al receptor de folato alfa utilizado se une preferentemente al receptor de folato alfa. En estos experimentos, el nivel del receptor de folato alfa en la superficie celular se midió por citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal conjugado con un fluorocromo. Un desplazamiento hacia la derecha indica la detección del receptor por citometría de flujo. Cuanto más se desplace el histograma hacia la derecha, mayores serán los niveles de receptores en la superficie celular. Los gráficos demuestran altos niveles de receptor de folato alfa en las células cancerosas (Figuras 6-8), pero niveles casi indetectables en las células normales (Figura 9).
El liposoma ejemplar puede tener un anticuerpo dirigido preferentemente al receptor de folato alfa. Cuando el liposoma ejemplar se incuba durante un periodo corto (30 minutos) con células positivas al receptor de folato, se puede detectar el liposoma ejemplar en la superficie celular midiendo el nivel de FITC integrado en el liposoma ejemplar mediante citometría de flujo. Un desplazamiento de la línea del histograma hacia la derecha indica que el liposoma ejemplar se detecta en la superficie celular. Cuanto más se desplace el histograma hacia la derecha, más se detectará el medicamento liposomal ejemplar en las células. Los experimentos muestran que el liposoma ejemplar se une a las células de cáncer de pulmón que expresan el receptor de folato alfa (Figura 10), pero no a las células epiteliales de colon normales (Figura 11).
Los experimentos de unión de liposomas ejemplar descritos anteriormente se repitieron utilizando múltiples líneas celulares de cáncer que sobreexpresan el receptor de folato alfa (pulmón-SL0003 y ovario-OVCAR-3) y células normales derivadas de tejidos de colon (CCD841) y de mama (Hs578). La Figura 12 muestra que los datos compuestos derivados de células cancerosas de pulmón (SL0003) y de ovario (OVCAR-3), que tienen altos niveles de receptor de folato alfa en la superficie celular, demuestran niveles significativamente más altos de la unión del liposoma ejemplar en la superficie celular en comparación con las células normales derivadas de colon (CCD841) y de mama (Hs578) (con un valor p <0,05). Los datos mostrados en la Figura 12 comprenden los niveles de superficie del liposoma ejemplar detectados a los 30 minutos y a las 4 horas de incubación a 37 grados Celsius.
Se llevó a cabo otra serie de experimentos para mostrar que al unirse a las células que expresan el receptor de folato alfa, el liposoma ejemplar se introduce en las células (se internaliza). Esto se evaluó de dos maneras:
En primer lugar, los liposomas ejemplares se marcaron con un colorante (RhodoRed) que sólo puede detectarse por citometría de flujo si entra en la célula (Figura 4). Se incubaron varias células con diferentes cantidades de liposomas ejemplares marcados con RhodoRed y se midió el nivel de fluorescencia mediante citometría de flujo (FL2). En la Figura 13 se muestran células de cáncer de ovario con un desplazamiento hacia la derecha que indica que el liposoma ejemplar ha entrado en la célula. El liposoma ejemplar marcado con RhodoRed entra en las células cancerosas que expresan el receptor de folato alfa (Figura 13-14), pero no en las células normales que son receptor de folato alfa negativo (Figura 15-16).
El mismo experimento se llevó a cabo específicamente en células KB con alta expresión del receptor de folato alfa, esta vez con cantidades tituladas de RhodoRed-etiquetado en el liposoma ejemplar. Como se muestra en la Figura 17, el liposoma ejemplar entró en las células KB cuando se trató con altas concentraciones, pero los liposomas de control que carecían de anticuerpos contra el receptor de folato alfa no pudieron entrar en la célula.
Tomados en conjunto, estos resultados de los experimentos con RhodoRed proporcionan evidencia de que la tecnología utilizada en la construcción de diseño del liposoma ejemplar es tal que el liposoma ejemplar como sistema de administración, armado con una fracción dirigida a diana del receptor de folato distinta del ácido fólico o sus análogos, entra en las células cancerosas de expresión del receptor de folato alfa independientemente de su carga útil de agente bioactivo del liposoma. Además, los mismos experimentos demuestran que el liposoma ejemplar se dirige preferentemente a las células cancerosas que expresan el receptor de folato alfa, limitando al mismo tiempo la exposición de las células normales a la carga útil del agente bioactivo.
Una segunda medida de la entrada del liposoma ejemplar en la célula se basó en la evaluación de las vías de activación intracelular. Las células responden al estrés provocado por los ligandos que se unen a sus receptores o por la internalización activando las vías de la proteína quinasa p38 (Figura 20). Las quinasas activadas pueden medirse por citometría de flujo. Las células se incubaron con el liposoma ejemplar durante 30 minutos y luego se lisaron con un detergente suave. La quinasa p38 activada se detectó con un anticuerpo por citometría de flujo. Las células cancerosas pueden tener un mayor nivel basal de quinasas activadas (Figura 18A). Un desplazamiento por debajo de la puerta de la línea de control indica un mayor nivel de p38 fosforilado. En este caso, el Pemetrexed reduce la activación de p38 de forma similar a dos concentraciones diferentes (10 j M y 50 j M). El liposoma ejemplar reduce la p38 fosforilada de forma más sustancial, demostrando que el Pemetrexed dentro del liposoma ejemplar es activo (Figura 19).
Se realizó otra serie de experimentos para demostrar que el liposoma ejemplar inhibe la proliferación celular en grado similar al pemetrex libre a concentraciones emparejadas, ya que el Pemetrexed es una quimioterapia eficaz para detener la división de las células cancerosas. Al inhibir la formación de los nucleótidos precursores de la purina y la pirimidina, el Pemetrexed impide la formación de ADN y ARN, necesarios para el crecimiento y la supervivencia tanto de las células normales como de las cancerosas. Esto se hizo de dos maneras:
En primer lugar, los inventores comprobaron que si el Pemetrexed contenido en el liposoma ejemplar era eficaz para inhibir la división de las células, también denominada proliferación celular. Varias líneas celulares de cáncer fueron tratadas con 10 mM de Pemetrexed o con el liposoma ejemplar con una concentración equivalente estimada de Pemetrexed durante cuatro días. A continuación, se evaluó el número de células que se dividieron. Los resultados demostraron que existe una correlación entre la inhibición del crecimiento celular y la expresión del receptor de folato alfa en la superficie de las células cancerosas (Figura 20). Los resultados mostraron además que no sólo había una susceptibilidad de las células cancerosas que expresan el receptor de folato alfa al liposoma ejemplar, sino también que el liposoma ejemplar y el Pemetrexed tienen efectos similares en cada una de las líneas celulares (Figura 21).
Para evaluar aún más el efecto del liposoma ejemplar en el ciclo celular, se utilizó un segundo enfoque para medir los efectos del Pemetrexed en la capacidad de las células para dividirse. La justificación fue que las células tratadas con Pemetrexed no pueden producir nuevo ADN y quedan atrapadas en la fase S del ciclo celular (Figuras 22a y 22b). Las líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de pulmón o de mama fueron tratadas con concentraciones tituladas de Pemetrexed o del liposoma ejemplar. Las células se incubaron durante 90 horas a 37 grados Celsius y se evaluó la viabilidad y el número de células mediante MTS. Las células se lisaron y el ADN se marcó con yodo de propidio para cuantificar el ciclo celular (Figura 23a). Los datos mostraron que el tratamiento con Pemetrexed induce a las células a acumularse en la fase S (Figura 23b). Además, se sembraron células SC0003 (adenocarcinoma de pulmón) en placas de 96 pocillos y se trataron al día siguiente con concentraciones tituladas de liposomas ejemplares o Pemetrexed. El día 5, las células se fijaron y lisaron y el ADN se marcó con yoduro de propidio para evaluar el ciclo celular. Los resultados demostraron que el liposoma ejemplar induce el mismo efecto sobre el ciclo celular que el Pemetrexed en cada una de las líneas celulares, medido por la acumulación de células en fase S (Figura 24).
Se realizó otro experimento para evaluar el impacto del liposoma ejemplar en las células de la médula ósea. La razón es que uno de los efectos secundarios de un tratamiento con antifolatos, como el que contiene Pemetrexed, es la reducción de los neutrófilos en el torrente sanguíneo, lo que provoca infecciones graves y a veces mortales. Esto se debe a que las células madre CD34+ no se diferencian, o no se desarrollan, en neutrófilos maduros en la médula ósea. Se midió el efecto del liposoma ejemplar en la diferenciación de neutrófilos en comparación con la misma dosis de Pemetrexed (10 mM) Se compraron células madre de cuatro donantes humanos y se trataron con un panel de factores de crecimiento para inducir la diferenciación de neutrófilos. Más concretamente, se indujo a las células madre CD34+ a diferenciarse en neutrófilos con IL-3, factor de células madre y G-CSF. Las células se trataron con 10 mM de Pemetrexed durante dos días o con una estimación calculada del liposoma ejemplar a 10 mM de Pemetrexed durante dos días. El número de neutrófilos diferenciados se evaluó mediante citometría de flujo.
Los resultados mostraron que en ausencia de Pemetrexed, hay un aumento dramático de neutrófilos maduros para el día 2, como se representa en el área ovalada de la Figura 25 y la Figura 26A. Sin embargo, en presencia de Pemetrexed (2-50 mM), se inhibe la diferenciación de los neutrófilos (Figura 26B; n=4 donantes), lo que demuestra que las células madre CD34+ tratadas con Pemetrexed no se convirtieron en neutrófilos maduros. En contraste con el Premetrexed libre, el liposoma ejemplar fue capaz de reducir esta toxicidad al permitir que más células madre CD34+ se desarrollaran y maduraran en neutrófilos diferenciados en comparación con el Pemetrexed a una concentración similar de Pemetrexed (Figura 27).
En conjunto, estos resultados de los experimentos realizados proporcionan evidencia de que la tecnología utilizada en la construcción de diseño del liposoma ejemplar es tal que el liposoma ejemplar como sistema de administración de un agente bioactivo/carga útil, armado con una fracción de unión a diana del receptor de folato distinta del ácido fólico o sus análogos, entra en las células tumorales que expresan el receptor de folato alfa las células independientemente de su carga útil del agente bioactivo del liposoma, preserva la eficacia del agente bioactivo en las células cancerosas que expresan el receptor de folato alfa y minimiza la exposición de las células normales a los efectos tóxicos de una carga útil de un agente antifolato, como una carga útil de Pemetrexed, ofreciendo así la oportunidad de reintroducir en el entorno clínico agentes que de otro modo serían muy eficaces pero tóxicos, como los antifolatos como clase, sin las toxicidades graves y a veces mortales típicamente asociadas.

Claims (43)

REIVINDICACIONES
1. Una composición antifolato liposomal que comprende:
un liposoma que incluye un espacio interior;
un agente antifolato bioactivo dispuesto dentro de dicho espacio interior;
un PEG unido al exterior del liposoma;
una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, estando dicha proteína unida a al menos uno de entre el PEG y el exterior del liposoma; y
en la que el liposoma tiene un potencial zeta que es menor o igual a cero y el liposoma es aniónico o neutro.
2. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que dicho PEG tiene un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
3. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, que comprende además al menos uno de un agente inmunoestimulador y una maleimida dispuestos en al menos uno de entre el PEG y un exterior del liposoma, en la que el al menos un agente inmunoestimulador :
está unido covalentemente a al menos uno de entre el PEG y el exterior del liposoma;
se selecciona entre un hapteno y un adyuvante;
isotiocianato de fluoresceína (FITC); o
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: fluoresceína; DNP; beta glucano; beta-1,3-glucano; y beta-1,6-glucano.
4. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el liposoma tiene un diámetro en el intervalo de 30-150 nm, preferentemente 40-70 nm.
5. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el potencial zeta del liposoma está en un intervalo de 0 a -150 mV o en la que el potencial zeta del liposoma está en un intervalo de -30 a -50 mV.
6. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el liposoma está formado por componentes liposomales que comprenden:
al menos uno de entre un lípido aniónico y un lípido neutro;
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-PEG-maleimida; HSPC; HSPC-PEG; colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida; o
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-PEG-FITC; DSPE-PEG-maleimida; colesterol; y HSPC.
7. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el liposoma engloba una solución acuosa. 8. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el liposoma engloba un agente antifolato bioactivo y un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable;
opcionalmente, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende trehalosa; opcionalmente, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende de un 5% a un 20% en peso de trehalosa;
opcionalmente, cuando el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende un tampón de citrato en una concentración de entre 5 y 200 mM y un pH de entre 2,
8 y 6; u opcionalmente, cuando el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una concentración total de acetato de sodio y acetato de calcio de entre 50 mM y 500 mM.
9. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el agente antifolato bioactivo es soluble en agua.
10. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que cada liposoma comprende menos de 200.000 moléculas del agente antifolato bioactivo; o entre 10.000 y 100.000 moléculas del agente antifolato bioactivo.
11. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el agente antifolato bioactivo es: Pemetrexed:
lometrexol;
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en metotrexato; ralitrexed;
aminopterina; pralatrexato; lometrexol; análogo tiofénico del lometrexol; furano
análogo del lometrexol; trimetrexed; LY309887; y GW 1843U89; o
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en proguanil; pirimetamina; trimetoprima; y pirrolo 6-sustituido y un miembro de la clase Thieon[2,3-d]pirrolopirimidina de los inhibidores de GARFT.
12. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que el agente antifolato bioactivo está a un pH de 5-8; o a un pH de 2-6.
13. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que la proteína está unida covalentemente mediante un grupo funcional maleimida a una molécula de PEG.
14. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene afinidad específica por al menos uno, al menos dos, o los tres seleccionados del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta.
15. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene afinidad específica por un epítopo de un antígeno de la superficie de la célula tumoral que está presente en una célula tumoral pero ausente o inaccesible en una célula no tumoral;
opcionalmente, en la que dicha célula tumoral es una célula maligna; u
opcionalmente, en la que el antígeno de superficie de la célula tumoral es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta.
16. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que la proteína comprende una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo;
opcionalmente, en la que la secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad de origen del anticuerpo; o
opcionalmente, en la que la proteína es al menos una seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo; un anticuerpo humanizado; un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo; un anticuerpo de cadena sencilla; un anticuerpo de dominio único; un anticuerpo biespecífico; un anticuerpo sintético; un anticuerpo pegilado; y un anticuerpo multimérico.
17. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 1, en la que cada liposoma comprende hasta 200 de las proteínas; opcionalmente de 30 a 200 de las proteínas.
18. La composición antifolato liposomal de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para su uso en el tratamiento del cáncer.
19. Un procedimiento de preparación de una composición de la reivindicación 6 que comprende:
formar una mezcla que comprende:
componentes liposomales que comprenden al menos uno de: DSPE; DSPE-PEG-maleimida; HSPC; HSPC-PEG; colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida; o al menos uno de: DSPE; DSPE-PEG-FITC; DSPE-PEG-maleimida; colesterol; y HSPC;
el agente antifolato bioactivo en solución acuosa;
la proteína;
homogeneizar la mezcla para formar liposomas en dicha solución acuosa;
extruir la mezcla a través de una membrana para formar liposomas que encierren el agente antifolato bioactivo en una solución acuosa;
opcionalmente eliminar el exceso de agente antifolato bioactivo en solución acuosa fuera de los liposomas después de dicho paso de extrusión, además opcionalmente liofilizar dicha composición después de dicho paso de eliminación para formar una composición liofilizada, además opcionalmente reconstituir dicha composición liofilizada al disolver dicha composición liofilizada en un disolvente después de dicho paso de liofilización, y además opcionalmente en la que dicho disolvente es un disolvente acuoso; y
opcionalmente, en la que la mezcla comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en manitol; trehalosa; sorbitol; y sacarosa.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el liposoma comprende además un estabilizador estérico; en el que el estabilizador estérico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (pAa ); poli(2-metil-2-oxazolina) poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidil poliglicerol; poli/A/-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico; y opcionalmente en el que el al menos un estabilizador es PEG, y el PEG tiene un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
21. Una composición antifolato liposomal que comprende:
un medio que comprende un liposoma que incluye un espacio interior;
un agente antifolato bioactivo acuoso dispuesto dentro de dicho espacio interior;
una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha proteína dispuesta en el exterior del liposoma;
en la que el liposoma tiene un potencial zeta menor o igual a cero y el liposoma es aniónico o neutro; opcionalmente, en la que el medio es una solución acuosa; opcionalmente, en la que la solución acuosa comprende al menos un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en manitol; trehalosa; sorbitol; y sacarosa;
opcionalmente, en la que la composición antifolato liposomal comprende además un estabilizador estérico unido al exterior del liposoma, en la que la proteína está unida a al menos uno de los estabilizadores estéricos y al exterior del liposoma,-y opcionalmente, en la que el estabilizador estérico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1) poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA); poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidilpoliglicerol; poli/A-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico; y además, opcionalmente, en la que el estabilizador estérico es PEG y el PEG tiene un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
22. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21 que comprende además al menos uno de entre un agente inmunoestimulador y una maleimida dispuestos en al menos uno de entre el estabilizador estérico y un exterior del liposoma; en la que el al menos un agente inmunoestimulador está unido covalentemente a al menos uno de entre el estabilizador estérico y el exterior del liposoma; y el al menos un agente inmunoestimulador se selecciona de entre un hapteno y un adyuvante; isotiocianato de fluoresceína (FITC); o al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: fluoresceína; DNP; beta glucano; beta-1,3-glucano; y beta-1,6-glucano.
23. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el liposoma tiene un diámetro en el intervalo de 30-150 nm; preferentemente en el intervalo de 40-70 nm.
24. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el potencial zeta del liposoma está en un intervalo de 0 a -150 mV o en la que el potencial zeta del liposoma está en un intervalo de -30 a -50 mV.
25. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el liposoma está formado por componentes liposomales que comprenden:
al menos uno de entre un lípido aniónico y un lípido neutro;
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-PEG; DSPE-maleimida; HSPC; HSPC-PEG; HSPC-maleimida; colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida; o
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-FITC; DSPE-maleimida; colesterol; y HSPC.
26. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el liposoma engloba una solución acuosa;
opcionalmente, en la que el liposoma contiene un agente antifolato bioactivo y un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende trehalosa, y opcionalmente además, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende del 5% al 20% en peso de trehalosa;
opcionalmente, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende un tampón de citrato en una concentración de entre 5 y 200 mM y un pH de entre 2,8 y 6; y opcionalmente, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una concentración total de acetato de sodio y acetato de calcio de entre 50 mM y 500 mM.
27. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el agente antifolato bioactivo es soluble en agua.
28. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que cada liposoma comprende menos de 200.000 moléculas del agente antifolato bioactivo; o entre 10.000 y 100.000 del agente antifolato bioactivo.
29. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el agente antifolato bioactivo es Pemetrexed;
lometrexol;
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en metotrexato; ralitrexed;
aminopterina; pralatrexato; lometrexol; análogo tiofénico del lometrexol; furano
análogo del lometrexol; trimetrexed; LY309887; y GW 1843U89; o
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en proguanil; pirimetamina; trimetoprima; y pirrolo 6-sustituido y un miembro de la clase Thieon[2,3-d]pirrolopirimidina de los inhibidores de GARFT.
30. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que el agente antifolato bioactivo está a un pH de 5-8 o a un pH de 2-6.
31. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que la proteína está unida covalentemente a través de un grupo funcional maleimida a una molécula estabilizadora estérica.
32. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que la proteína tiene afinidad específica por al menos uno, al menos dos, o los tres seleccionados del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta.
33. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que la proteína tiene afinidad específica por un epítopo de un antígeno de la superficie de la célula tumoral que está presente en una célula tumoral pero ausente o inaccesible en una célula no tumoral;
opcionalmente, en la que dicha célula tumoral es una célula maligna; u
opcionalmente, en la que el antígeno de superficie de la célula tumoral es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: receptor de folato alfa; receptor de folato beta; y receptor de folato delta.
34. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que la proteína comprende una secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo;
opcionalmente, en la que la secuencia de unión a antígeno de un anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad de origen del anticuerpo; u
opcionalmente, en la que la proteína es al menos una seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo; un anticuerpo humanizado; un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo; un anticuerpo de cadena única; un anticuerpo de dominio único; un anticuerpo biespecífico; un anticuerpo sintético; un anticuerpo pegilado; y un anticuerpo multimérico.
35. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21, en la que cada liposoma comprende hasta 200 unidades diana; opcionalmente, cada liposoma comprende de 30 a 200 unidades diana.
36. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 21 para su uso en el tratamiento del cáncer.
37. Un procedimiento de preparación de una composición de la reivindicación 25 que comprende: formar una mezcla que comprende:
componentes liposomales que comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en:
DSPE; DSPE-PEG; DSPE-maleimida; HSPC; HSPC-PEG; HSPC-maleimida;
colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida; y
al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-FITC; DSPE-maleimida; colesterol; y HSPC;
el agente antifolato bioactivo en solución acuosa;
la proteína;
homogeneizar la mezcla para formar liposomas en dicha solución acuosa; y
extrusión de la mezcla a través de una membrana para formar liposomas que encierren el agente antifolato bioactivo en una solución acuosa;
opcionalmente eliminar el exceso de agente antifolato bioactivo en solución acuosa fuera de los liposomas después de dicho paso de extrusión, además opcionalmente liofilizar dicha composición después de dicho paso de eliminación para formar una composición liofilizada, y además opcionalmente reconstituir dicha composición liofilizada disolviendo dicha composición liofilizada en un disolvente después de dicho paso de liofilización, y además opcionalmente en el que dicho disolvente es un disolvente acuoso; y opcionalmente, en el que la mezcla comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en manitol; trehalosa; sorbitol; y sacarosa.
38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que los liposomas formados comprenden además un estabilizador estérico, en el que el estabilizador estérico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA); poli(2-metil-2-oxazolina) poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidil poliglicerol; poli/W-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico; y opcionalmente en el que el al menos un estabilizador es PEG y dicho PEG tiene un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
39. Una composición liposomal dirigida a diana que se dirige selectivamente a los receptores de folato que comprende:
un liposoma que incluye un espacio interior;
un agente bioactivo dispuesto dentro de dicho espacio interior;
una molécula estabilizadora estérica unida a un exterior del liposoma; y
una proteína con afinidad específica por al menos un receptor de folato, dicha proteína unida a al menos uno de los estabilizadores estéricos y al exterior del liposoma;
en la que el liposoma tiene un potencial zeta menor o igual a cero y el liposoma es aniónico o neutro; opcionalmente, en la que el estabilizador estérico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA); poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina) fosfatidil poliglicerol; poli/N-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico, opcionalmente cuando el estabilizador estérico es PEG y el PEG tiene un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons; y
opcionalmente, en la que el agente bioactivo comprende al menos uno del grupo que consiste en ellipticina; paclitaxel; Pemetrexed; metotrexato; ralitrexed; aminopterina; pralatrexato lometrexol; trimetrexed; LY309887; GW 1843U89; proguanil; pirimetamina; trimetoprima y los inhibidores de la clase GARFT de pirrolo y tieón[2,3-d]pirropirimidina 6-sustituidos.
40. La composición antifolato liposomal de la reivindicación 39 para su uso en el tratamiento del cáncer.
41. Un procedimiento de preparación de una composición de la reivindicación 39 en el que dicho liposoma se forma comprendiendo los pasos de: formar una mezcla que comprende:
componentes liposomales que comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-PEG; DSPE-maleimida; hSpC; HSPC-PEG; HSPC-maleimida; colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida; y al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-FITC; DSPE-maleimida; colesterol; y HSPC;
el agente bioactivo en solución acuosa;
la proteína;
homogeneizar la mezcla para formar liposomas en dicha solución acuosa; y
extruir la mezcla a través de una membrana para formar liposomas que encierren el agente antifolato bioactivo en una solución acuosa;
opcionalmente eliminar el exceso de agente antifolato bioactivo en solución acuosa fuera de los liposomas después de dicho paso de extrusión, además opcionalmente liofilizar dicha composición después de dicho paso de eliminación para formar una composición liofilizada, y además opcionalmente reconstituir dicha composición liofilizada disolver dicha composición liofilizada en un disolvente después de dicho paso de liofilización, y además opcionalmente en el que dicho disolvente es un disolvente acuoso; y opcionalmente, en el que la mezcla comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en manitol; trehalosa; sorbitol; y sacarosa.
42. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que los liposomas formados comprenden además un estabilizador estérico; en el que el estabilizador estérico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliósido (GM1); poli(vinilpirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA); poli(2-metil-2-oxazolina) poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidilpoliglicerol; poli/N-(2-hidroxipropil) metacrilamida]; poli-N-vinilpirrolidonas anfifílicas; polímero a base de L-aminoácidos; y alcohol polivinílico; y opcionalmente en el que el al menos un estabilizador es PEG y el PEG tiene un peso molecular medio en número (Mn) de 200 a 5000 daltons.
43. Un kit para proporcionar una composición de la reivindicación 25, que comprende:
componentes liposomales que comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en:
DSPE; DSPE-PEG; DSPE-maleimida; HSPC; HSPC-PEG; HSPC-maleimida;
colesterol; colesterol-PEG; y colesterol-maleimida; y al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: DSPE; DSPE-FITC; DSPE-maleimida; colesterol;
y HSPC,
una instrucción para utilizar la composición para encapsular un agente bioactivo, y
opcionalmente, en un recipiente separado, el agente bioactivo.
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