ES2901575A1

ES2901575A1 - Polynucleotide for physiological expression in T cells (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2901575A1
Application number: ES202030955A
Authority: ES
Inventors: Molina Francisco Martín; Manzano María Tristán; Pérez Noelia Maldonado; Lirio Pedro Justicia
Original assignee: Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Current assignee: Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-03-22

Abstract

Polynucleotide for physiological expression in T cells. Improved system for generating immunotherapeutic T cells comprising a chimeric antigen receptor (CAR). (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Polinucleótido para expresión fisiológica en células TPolynucleotide for physiological expression in T cells

CAMPO DE LA INVENCIONFIELD OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a una nueva tecnología para generar células T inmunoterapéuticas. En particular, la invención proporciona un sistema mejorado para generar células T inmunoterapéuticas que comprenden un receptor de antígeno quimérico (CAR).The present invention relates to a new technology for generating immunotherapeutic T cells. In particular, the invention provides an improved system for generating immunotherapeutic T cells comprising a chimeric antigen receptor (CAR).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIONBACKGROUND OF THE INVENTION

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas de antígeno autólogo generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T utilizadas para la inmunoterapia adoptiva se pueden generar mediante la expansión de las células T específicas de antígeno o la redirección de las células T mediante ingeniería genética. La transferencia de células T específicas de antígenos virales es un procedimiento bien establecido que se utiliza para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y neoplasias malignas raras relacionadas con virus. Del mismo modo, se ha demostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor tienen éxito en el tratamiento del melanoma.Adoptive immunotherapy, which involves the transfer of autologous antigen-specific T cells generated ex vivo, is a promising strategy for treating viral infections and cancer. T cells used for adoptive immunotherapy can be generated by expansion of antigen-specific T cells or redirection of T cells by genetic engineering. Transfer of viral antigen-specific T cells is a well-established procedure used for the treatment of transplant-associated viral infections and rare virus-associated malignancies. Similarly, isolation and transfer of tumor-specific T cells have been shown to be successful in treating melanoma.

Se han generado con éxito nuevas especificidades en las células T mediante la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una sola molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende la luz 25 y fragmentos variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un conector flexible. Los restos de unión basados en dominios de receptor o ligando también se han usado con éxito. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas gamma del receptor CD3zeta o Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de células T, sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada y 30 actividad antitumoral in vivo. Los dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) se han agregado solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas con CAR2. Los CAR han permitido redirigir con éxito las células T contra los antígenos expresados en la superficie de las células tumorales de diversas neoplasias, incluidos linfomas y tumores sólidos. CD19 se ha presentado como un objetivo atractivo para la inmunoterapia porque la gran mayoría de la leucemia linfoblástica aguda B (ALL-B) 5 expresa de manera uniforme CD19, mientras que la expresión está ausente en las células no hematopoyéticas, así como en las células mieloides, eritroides, T y hueso células madre de médula. Los ensayos clínicos dirigidos a CD19 en tumores malignos de células B están en marcha con respuestas antitumorales alentadoras. La mayoría infunde las células T genéticamente modificadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) con especificidad derivada de la región scFv de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD19 FMC63. Sin embargo, todavía existe la necesidad de mejorar la construcción de CAR que muestre una mejor compatibilidad con la proliferación de células T, a fin de permitir que las células que expresan tales CAR alcancen un nivel significativo ventaja clínica. En este sentido y, a pesar del claro beneficio para los pacientes tratados con CAR-T, las tecnologías reales que utilizan 15 promotores fuertes para expresar CAR vienen con un lado negativo. Se han reportado efectos secundarios graves, incluyendo muertes de pacientes. Principalmente debido a un síndrome de liberación de citoquinas (SRC) asociado con la hiperactividad de las células CAR-T en los primeros días después de la infusión. Además, un porcentaje significativo de pacientes que respondieron inicialmente, recayeron como consecuencia de reducir la longevidad (y eficacia) de las células CAR-T administradas. Eyquem, Mansilla-Soto y col. 20 ya han demostrado que la expresión de tipo TCR mejora la actividad antileucémica de las células CAR-T utilizando sistemas de edición del genoma para expresar transgenes a través del promotor del locus TRAC. Sin embargo, las estrategias de edición del genoma utilizan tecnologías muy sofisticadas difíciles de implementar en la práctica clínica.New specificities in T cells have been successfully generated by genetic transfer of transgenic T cell receptors or chimeric antigen receptors (CAR). CARs are synthetic receptors that consist of a targeting moiety that is associated with one or more signaling domains in a single fusion molecule. In general, the binding moiety of a CAR consists of an antigen-binding domain of a single-chain antibody (scFv), comprising the lumen and variable fragments of a monoclonal antibody joined by a flexible linker. Binding moieties based on receptor or ligand domains have also been used successfully. The signaling domains for first-generation CARs are derived from the cytoplasmic region of the CD3zeta or Fc receptor gamma chains. First generation CARs have been shown to successfully redirect T cell cytotoxicity, however, they failed to provide prolonged expansion and antitumor activity in vivo. Signaling domains of costimulatory molecules including CD28, OX-40 (CD134), and 4-1BB (CD137) have been added alone (second generation) or in combination (third generation) to improve survival and increase proliferation of T cells modified with CAR2. CARs have successfully redirected T cells against antigens expressed on the surface of tumor cells from various neoplasms, including lymphomas and solid tumors. CD19 has been presented as an attractive target for immunotherapy because the vast majority of B acute lymphoblastic leukemia (ALL-B) 5 uniformly express CD19, whereas expression is absent in non-hematopoietic cells as well as in hematopoietic cells. myeloid, erythroid, T and bone marrow stem cells. Clinical trials targeting CD19 in B-cell malignancies are underway with encouraging antitumor responses. Most infuse T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) with specificity derived from the scFv region of a mouse monoclonal antibody specific for CD19 FMC63. However, there is still a need to improve the CAR construct that exhibits better compatibility with T cell proliferation, in order to allow cells expressing such CARs to achieve significant clinical advantage. In this regard, and despite the clear benefit for patients treated with CAR-T, actual technologies that use 15 strong promoters to express CAR come with a downside. Serious side effects, including patient deaths, have been reported. Mainly due to a cytokine release syndrome (CRS) associated with hyperactivity of CAR-T cells in the first days after infusion. In addition, a significant percentage of patients who initially responded relapsed as a consequence of reduced longevity (and efficacy) of the administered CAR-T cells. Eyquem, Mansilla-Soto et al. 20 have already shown that TCR-type expression enhances the antileukemic activity of CAR-T cells using genome editing systems to express transgenes through the promoter of the TRAC locus. However, genome editing strategies use very sophisticated technologies that are difficult to implement in clinical practice.

Por lo tanto, es necesario desarrollar polinucleótidos que imiten el patrón de expresión de TCR de una manera muy precisa, que reduzcan de 3 a 4 veces la expresión del transgén 8-24 h después de la activación de las células T, y que vuelvan a recuperar su expresión a las 48-72 h.Therefore, it is necessary to develop polynucleotides that mimic the expression pattern of TCR in a very precise way, that reduce the expression of the transgene by 3 to 4 times 8-24 h after the activation of T cells, and that revert to TCR expression. recover its expression at 48-72 h.

DESCRIPCION DE LAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES

Fig. 1. LV que expresan eGFP a través de dos promotores B2M sintéticos. A) Se diseñaron dos promotores B2M combinando diferentes regiones reguladoras del locus B2M humano como se muestra en la figura. Se muestran las secuencias completas de ambos promotores sintéticos. Como se puede observar, la principal diferencia entre ambas construcciones es la inserción del potenciador B2M en el 3 '(B2M2) o en el 5' (B2M1) del TSS. B) Esquema de los LV que expresan eGFP a través de los promotores sintéticos B2M1 y B2M2. C) Control de LV que expresa eGFP a través del promotor EF1-alfa. LTR: repeticiones terminales largas; eGFP: proteína fluorescente verde mejorada; WPRE: virus de la hepatitis de la marmota (WHP) Elemento regulador postranscripcional. Fig. 1. LV expressing eGFP through two synthetic B2M promoters. A) Two B2M promoters were designed by combining different regulatory regions of the locus Human B2M as shown in the figure. The complete sequences of both synthetic promoters are shown. As can be seen, the main difference between both constructions is the insertion of the B2M enhancer at the 3' (B2M2) or at the 5' (B2M1) of the TSS. B) Diagram of the LVs that express eGFP through the synthetic promoters B2M1 and B2M2. C) LV control expressing eGFP through the EF1-alpha promoter. LTR: long terminal repeats; eGFP: enhanced green fluorescent protein; WPRE: woodchuck hepatitis virus (WHP) Post-transcriptional regulatory element.

Fig. 2. La expresión de la proteína CD3 / TCR disminuye en respuesta a estímulos anti-CD3 / CD28 en células T primarias. A) Se aisló una población pura de células T primarias humanas y se estimuló con anti-CD3 / CD28 (TransAct, Miltenyi) a las 0h y se determinó la expresión de CD3 (componente esencial del receptor de células T, TCR) mediante FACS y análisis de ARNm en la indicada veces. B) La expresión de pliegues indicó la relación relativa entre la mediana de la intensidad de fluorescencia de CD3 en la población de CD3 en comparación con el MeFI de CD3 en la población de CD3 dividido por esa expresión a las 0 h. Relación relativa = [CD3MeFI de puerta CD3 / CD3 MeFI de CD3- puerta en TIME] / CD3 MeFI de CD3 puerta / CD3 MeFI de CD3- puerta a 0h]. C) La expresión de pliegue se refiere a la relación relativa entre el ARNm de CD3 en comparación con el ARNm de GAPDH (utilizado como control interno) dividido a esa expresión a las 0 h. Relación relativa = [expresión de CD3 / expresión de GAPDH a la HORA] / [expresión de CD3 / expresión de GAPDH a las 0 h]. Fig. 2. CD3/TCR protein expression is decreased in response to anti-CD3/CD28 stimuli in primary T cells. A) A pure population of human primary T cells was isolated and stimulated with anti-CD3/CD28 (TransAct, Miltenyi) at 0h and CD3 (essential component of T cell receptor, TCR) expression was determined by FACS and mRNA analysis at the indicated times. B) The fold expression indicated the relative relationship between the median CD3 fluorescence intensity in the CD3 population compared to the MeFI of CD3 in the CD3 population divided by that expression at 0 h. Relative ratio = [CD3MeFI of CD3 gate / CD3 MeFI of CD3- gate at TIME] / CD3 MeFI of CD3 gate / CD3 MeFI of CD3- gate at 0h]. C) Fold expression refers to the relative ratio of CD3 mRNA compared to GAPDH mRNA (used as internal control) fold at that expression at 0 h. Relative ratio = [CD3 expression / GAPDH expression at HR] / [CD3 expression / GAPDH expression at 0 h].

Fig. 3. La expresión dirigida por GFP por el promotor quimérico B2M imitó el patrón fisiológico CD3 / TCR después de la activación en contraste con el promotor EF1-alfa. A) Se aislaron y activaron células T primarias humanas para la transducción con los vectores lentivirales (LV) para obtener niveles similares de expresión (~ 30-50%). Las células se dejaron reposar durante 10 días y luego se estimularon con anti-CD3 / CD28 para imitar una estimulación fisiológica del complejo de superficie TCR / CD3. La expresión de CD3 y eGFP se evaluó simultáneamente en los momentos indicados tanto a nivel de proteína (FACS) como de ARNm. ( población no transducida) dividida en esa expresión a las 0 h). C) El eje Y izquierdo indica la proporción relativa de ARNm de CD3 y el eje Y derecho se refiere a la proporción relativa de expresión de ARNm de GFP. Relación relativa = [expresión de GFP / expresión de GAPDH en el TIEMPO] / [expresión de GFP / expresión de GAPDH a las 0 h]. Fig. 3. GFP-driven expression by the B2M chimeric promoter mimicked the physiological CD3/TCR pattern after activation in contrast to the EF1-alpha promoter. A) Primary human T cells were isolated and activated for transduction with the lentiviral vectors (LVs) to obtain similar levels of expression (~30-50%). Cells were left undisturbed for 10 days and then stimulated with anti-CD3/CD28 to mimic a physiological stimulation of the TCR/CD3 surface complex. The expression of CD3 and eGFP was simultaneously evaluated at the indicated times both at the protein (FACS) and mRNA levels. (non-transduced population) split on that expression at 0 h). C) The left Y-axis indicates the relative proportion of CD3 mRNA and the right Y-axis refers to the relative proportion of GFP mRNA expression. Relative ratio = [GFP expression / GAPDH expression at TIME] / [GFP expression / GAPDH expression at 0 h].

DESCRIPCION DE LA INVENCIONDESCRIPTION OF THE INVENTION

Los autores de la presente invención han desarrollado un sistema que permite la expresión de CAR siguiendo el patrón de expresión de TCR, evitando los altos niveles de expresión en la superficie de las células T ,que se han asociado con una terapia ineficiente a largo plazo o con efectos secundarios peligrosos que amenazan la vida, como la tormenta de citoquinas. Los autores de la invención han seleccionado LV como el mejor sistema para lograr una expresión estable y las regiones reguladoras del locus B2M como un buen candidato para expresar los CAR que imitan el patrón de expresión de TCR después de la estimulación de CD3 / CD28, tanto a niveles de proteína como de ARNm.The authors of the present invention have developed a system that allows the expression of CAR following the pattern of expression of TCR, avoiding the high levels of expression on the surface of T cells, which have been associated with inefficient long-term therapy or with dangerous life-threatening side effects such as cytokine storm. The authors of the invention have selected LV as the best system to achieve stable expression and the regulatory regions of the B2M locus as a good candidate to express CARs that mimic the expression pattern of TCR after CD3/CD28 stimulation, both at protein and mRNA levels.

En base a las regiones reguladoras de B2M, los autores de la invención han creado dos promotores sintéticos que incluyen la mayoría de las regiones reguladoras de locus B2M en un tamaño reducido que nos permite insertarlo en un esqueleto LV. Based on the regulatory regions of B2M, the authors of the invention have created two synthetic promoters that include most of the regulatory regions of the B2M locus in a reduced size that allows us to insert it into an LV backbone.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido, de ahora en adelante polinucleótido de la invención, de secuencia SEQ ID NO: 1, o que presente una identidad con la SEQ ID NO: 1 de al menos:Therefore, a first aspect of the invention refers to a polynucleotide, hereinafter polynucleotide of the invention, of sequence SEQ ID NO: 1, or that has an identity with SEQ ID NO: 1 of at least:

a. Un 80%a. 80%

b. Un 85%b. 85%

c. Un 90%c. 90%

d. Un 95%d. 95%

e. Un 99%and. 99%

SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1

1161 bp 1161bp

aattcggcatgcttatcgatttggtccttccttacttgcccctttcggcggggagcaggggaggggtctgggggaggcgtcg cccgggaaagcctgtctgctgcagcctaaccagggcttttgcgggagcgcatggcttttggctgtaattcgtgcatttttaac aaaaacgcctgccttctgcgtgagattctccagagcaaactgggcggcatgggccctgtggtcttttcgtacacacggctt cctctttggctctttgcctggttgtttccaacatgtactgtgcctcttactttcggttttgaaaacatgagggggttgggcgtggta gcttacgcctgtaatcccagcacttagggaggccgaggcgggaggatggcttgaggtccgtagttgagaccagcctgg gctgctccggtggctgaggcgggaggatctcttgagcttaggcttttgagcagaaagagaaaagaaaagaaagaaag aagtgtgaatacaatctcacaaaatcttgccgccttccctcaatcattttcaataatcccaacactttgggaggccaaggca ggctgatcactctcaggaactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaat tgctatgtgtcctcactgttcctcttacaaaagatctgtggactccaccaccacgaaatggcggcaccttatttatggtcaca gaatgatgtacctagagggcgctggaagctctaaagccctagcagttactgcttttactattagtggtcgtttttttctcccccc cgccccccgacaaatcaacagaacaaagaaaattacctaaacacttcttaaacatcacgagactctaagaaaaggaa actgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggagacggtccctgcgggcct tgtcctgattggctgggccgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggc cgagtgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgagagactctccta ccctcccgctggcgcgcccggaattcggcatgcttatcgatttggtccttccttacttgcccctttcggcggggagcaggggaggggtctgggggaggcgtcg cccgggaaagcctgtctgctgcagcctaaccagggcttttgcgggagcgcatggcttttggctgtaattcgtgcatttttaac aaaaacgcctgccttctgcgtgagattctccagagcaaactgggcggcatgggccctgtggtcttttcgtacacacggctt cctctttggctctttgcctggttgtttccaacatgtactgtgcctcttactttcggttttgaaaacatgagggggttgggcgtggta gcttacgcctgtaatcccagcacttagggaggccgaggcgggaggatggcttgaggtccgtagttgagaccagcctgg gctgctccggtggctgaggcgggaggatctcttgagcttaggcttttgagcagaaagagaaaagaaaagaaagaaag aagtgtgaatacaatctcacaaaatcttgccgccttccctcaatcattttcaataatcccaacactttgggaggccaaggca ggctgatcactctcaggaactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaat tgctatgtgtcctcactgttcctcttacaaaagatctgtggactccaccaccacgaaatggcggcaccttatttatggtcaca gaatgatgtacctagagggcgctggaagctctaaagccctagcagttactgcttttactattagtggtcgtttttttctcccccc cgccccccgacaaatcaacagaacaaagaaaattacctaaacacttcttaaacatcacgagactctaagaaaaggaa actgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggagacggtccctgcgggcct tgtcctgattggctgggccgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggc cgagtgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgagagactctccta ccctcccgctggcgcgcccgg

En concreto, el polinucleótido de la invención, también llamado B2M_EWP1, es una secuencia de 1161 nucleótidos que contiene fragmentos de B2 microglobulina (B2M). Specifically, the polynucleotide of the invention, also called B2M_EWP1, is a sequence of 1161 nucleotides that contains fragments of B2 microglobulin (B2M).

El polinucleótido se incluyen en vectores lentivirales en vista de expresarse de forma estable en las células.The polynucleotide is included in lentiviral vectors in view of being stably expressed in cells.

Para dirigir el polipéptido transmembrana hacia la vía secretora de una célula huésped, una secuencia de señal (también conocida como secuencia líder, prepro secuencia o pre secuencia) puede ser proporcionada en la secuencia de polinucleótidos o secuencia de vector de la invención. La secuencia señal secretora está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se colocan para dirigir el nuevo polipéptido sintetizado en la vía secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en 5 'con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden colocarse en cualquier otra parte de la secuencia de ácido nucleico de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., Patente de EE.UU. 5,037,743; Holland et al., Patente de Estados Unidos N° 5.143.830). Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, una considerable variación de secuencia es posible entre estas moléculas de polinucleótidos. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención tiene codones optimizados para la expresión en células de mamífero, preferiblemente para expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de tales especies, tales codones codificando los aminoácidos como los codones que se intercambian. To direct the transmembrane polypeptide into the secretory pathway of a host cell, a signal sequence (also known as a leader sequence, prepro sequence, or pre sequence) may be provided in the polynucleotide sequence or vector sequence of the invention. The secretory signal sequence is operably linked to the transmembrane nucleic acid sequence, that is, the two sequences are joined in the correct reading frame and positioned to direct the newly synthesized polypeptide into the secretory pathway of the host cell. Secretory signal sequences are commonly positioned 5' to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide of interest, although certain secretory signal sequences may be positioned elsewhere on the nucleic acid sequence of interest (see, for example, Welch et al., US Patent 5,037,743; Holland et al., US Patent No. 5,143,830). Those skilled in the art will recognize that, in view of the degeneracy of the genetic code, considerable sequence variation is possible between these polynucleotide molecules. Preferably, the nucleic acid sequences of the present invention are codon optimized for expression in mammalian cells, preferably for expression in human cells. Codon optimization refers to the swapping in a sequence of interest of codons that are generally rare in highly expressed genes of a given species with codons that are generally frequent in highly expressed genes of such species, such codons encoding the amino acids as the codons that Are exchanged.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención. Preferiblemente, la construcción genética de la invención es un vector viral, y más preferiblemente un vector lentiviral.Therefore, another aspect of the invention relates to a genetic construct, hereinafter genetic construct of the invention, comprising the polynucleotide of the invention. Preferably, the genetic construct of the invention is a viral vector, and more preferably a lentiviral vector.

Más preferiblemente, la construcción genética de la invención se encuentra operativamente unido a CAR para impulsar su expresión, y en donde, preferiblemente, que CAR, comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular.More preferably, the genetic construct of the invention is operably linked to CAR to drive its expression, and where, preferably, that CAR comprises at least one extracellular ligand-binding domain, a transmembrane domain, and at least one signaling domain. intracellular.

CÉLULAS DE LA INVENCIÓNCELLS OF THE INVENTION

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula, de ahora en adelante célula de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención, o la construcción genética de la invención. En una realización preferida de este aspecto, la célula de la invención es una célula inmune. Más preferiblemente, se prefieren poblaciones de células de la invención.Another aspect of the invention relates to a cell, hereinafter cell of the invention, comprising the polynucleotide of the invention, or the genetic construct of the invention. In a preferred embodiment of this aspect, the cell of the invention is an immune cell. More preferably, cell populations of the invention are preferred.

En una realización particular abarcada, la invención se refiere a un método de preparación células inmunes para inmunoterapia que comprenden la introducción en dichas células inmunitarias del polinucleótido, construcción genética o vector según la presente invención, y expandir dichas células. En una realización particular, la invención se refiere a un método de ingeniería de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula y expresar en la superficie de dicha célula al menos un CAR como se ha descrito arriba. En una realización particular, el método comprende transformar o transducir la célula con al menos un polinucleótido o vector que codifica CAR como se describe anteriormente, y expresar dichos polinucleótidos en dicha célula.In a particular covered embodiment, the invention refers to a method of preparing immune cells for immunotherapy comprising the introduction into said immune cells of the polynucleotide, genetic construction or vector according to the present invention, and expanding said cells. In a particular embodiment, the invention relates to a method of engineering an immune cell comprising providing a cell and expressing at least one CAR on the surface of said cell as described above. In a particular embodiment, the method comprises transforming or transducing the cell with at least one CAR-encoding polynucleotide or vector as described above, and expressing said polynucleotides in said cell.

En otra realización, dicho método comprende además una etapa de modificar genéticamente dicha celular inactivando al menos un gen que expresa un componente del TCR, una diana para un agente inmunosupresor, el gen HLA y/o un gen de punto de control inmunológico como PD1 o CTLA-4. En una realización preferida, dicho gen se selecciona del grupo que consiste en TCRalpha, TCRbeta, CD52, GR, PD1 y CTLA-4. En una realización preferida dicho método comprende, además, introducir en dichas células T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante la escisión del ADN dichos genes. En una realización más preferida, dicha endonucleasa de corte raro TALE-nucleasa o endonucleasa Cas9. In another embodiment, said method further comprises a step of genetically modifying said cell by inactivating at least one gene that expresses a TCR component, a target for an immunosuppressive agent, the HLA gene and/or an immune checkpoint gene such as PD1 or CTLA-4. In a preferred embodiment, said gene is selected from the group consisting of TCRalpha, TCRbeta, CD52, GR, PD1 and CTLA-4. In a preferred embodiment, said method further comprises introducing into said T cells a rare-cutting endonuclease capable of selectively inactivating said genes by excising the DNA. In a more preferred embodiment, said rare-cutting endonuclease TALE-nuclease or Cas9 endonuclease.

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la introducción de CAR en una célula utilizando vectores de expresión. Como ejemplo no limitativo, dicho CAR puede introducirse como transgenes codificado por un vector lentiviral.The different methods described above involve the introduction of CAR into a cell using expression vectors. As a non-limiting example, said CAR can be introduced as transgenes encoded by a lentiviral vector.

Células inmunesimmune cells

La presente invención también se refiere a células o líneas celulares aisladas susceptibles de ser obtenidas por dicho método para diseñar células. En particular, dicha célula aislada comprende al menos un CAR y un promotor de B2 microglobulina, preferiblemente el polinucleótido de la invención, en particular de SEQ ID NO 1, operablemente unido al CAR para impulsar su expresión. En otra realización, dicha célula aislada comprende una población de CAR y promotores del locus B2 microglobulina, en particular de SEQ ID NO 1, operativamente enlazada a los CAR para impulsar su expresión, cada uno comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelular. Células inmunes de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión del antígeno.The present invention also relates to isolated cells or cell lines that can be obtained by said method for engineering cells. In particular, said isolated cell comprises at least one CAR and a B2 microglobulin promoter, preferably the polynucleotide of the invention, in particular SEQ ID NO 1, operably linked to the CAR to drive its expression. In another embodiment, said isolated cell comprises a population of CARs and promoters from the microglobulin B2 locus, in particular of SEQ ID NO 1, operatively linked to the CARs to drive their expression, each comprising different extracellular ligand-binding domains. Immune cells of the present invention are activated and proliferate independently of antigen binding mechanisms.

En el alcance de la presente invención también se incluye una célula inmunitaria aislada, preferiblemente una célula T obtenida según cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Dicha célula inmune se refiere a una célula de origen hematopoyético involucrada funcionalmente en la iniciación y/o ejecución de una respuesta inmune innata y/o adaptativa. Dicha célula inmune según la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de cordón umbilica, células progenitoras, células madre de la médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34 . Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica asesina, un mastocito, una célula NK, una célula B o célula T. En una realización preferida es una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realización, dicha célula puede derivar del grupo que consiste en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 . Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, se puede obtener una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos. Las células se pueden obtener de una serie de fuentes no limitantes, incluidas las células mononucleares de sangre periféricas, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas realizaciones de la presente invención, se pueden emplear cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otra realización, dicha célula se puede derivar de un donante sano, de un paciente con diagnóstico de cáncer o de un paciente con diagnóstico de infección. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también está abarcada una línea celular obtenida de una célula T transformada de acuerdo con el método descrito previamente. Células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de ser obtenidas por el método anterior se engloban en el alcance de la presente invención.An isolated immune cell, preferably a T cell obtained according to any of the methods described above, is also included in the scope of the present invention. Said immune cell refers to a cell of hematopoietic origin functionally involved in the initiation and/or execution of an innate and/or adaptive immune response. Said immune cell according to the present invention may be derived from a stem cell. The stem cells can be adult stem cells, non-human embryonic stem cells, more particularly non-human stem cells, umbilical cord stem cells, progenitor cells, bone marrow stem cells, induced pluripotent stem cells, totipotent stem cells or hematopoietic stem cells. . Representative human cells are CD34 cells. Said isolated cell can also be a dendritic cell, a killer dendritic cell, a mast cell, an NK cell, a B cell or a T cell. In a preferred embodiment it is a T cell selected from the group consisting of inflammatory T lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes , regulatory T cells or helper T cells. In another embodiment, said cell may be derived from the group consisting of CD4 T cells and CD8 T cells. Prior to expansion and genetic modification of the cells of the invention, a source of cells may be obtained from a subject through a variety of methods. Cells can be obtained from a number of non-limiting sources, including peripheral blood mononuclear cells, bone marrow, lymph node tissue, umbilical cord blood, thymus tissue, tissue from a site of infection, ascites, pleural effusion , spleen tissue and tumors. in certain In embodiments of the present invention, any number of available T cell lines known to those of skill in the art may be employed. In another embodiment, said cell may be derived from a healthy donor, from a patient diagnosed with cancer or from a patient diagnosed with infection. In another embodiment, said cell is part of a mixed population of cells that have different phenotypic characteristics. Also encompassed within the scope of the present invention is a cell line derived from a T cell transformed according to the method previously described. Modified cells resistant to immunosuppressive treatment and capable of being obtained by the above method fall within the scope of the present invention.

Activación y expansión de células TT cell activation and expansion

Ya sea antes o después de la generación de las células T transformadas o transducidas, incluso si las células inmunes modificadas de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión al antígeno, las células inmunes, en particular las células T de la presente invención se puede activar y expandir adicionalmente generalmente usando métodos como el descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 6.352.694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7.067.318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. núm. 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro o in vivo. Generalmente, las células T de la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo CD3/TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para las células T. Por ejemplo, productos químicos como el ionóforo de calcio A23187, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), o lectinas mitogénicas como fitohemaglutinina (PHA) se pueden utilizar para crear una señal de activación para la célula T.Whether before or after the generation of the transformed or transduced T cells, even if the modified immune cells of the present invention are activated and proliferate independently of antigen-binding mechanisms, the immune cells, in particular the T cells of the The present invention may be further activated and expanded generally using methods as described, for example, in US Patents 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; and US patent application publication no. 20060121005. T cells can be expanded in vitro or in vivo. Generally, the T cells of the invention are expanded by contact with an agent that stimulates a CD3/TCR complex and costimulatory molecule on the surface of the T cells to create an activation signal for the T cells. For example, chemicals such as the calcium ionophore A23187, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), or mitogenic lectins such as phytohemagglutinin (PHA) can be used to create an activation signal for the T cell.

Como ejemplos no limitantes, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro, por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medios Esenciales Mínimos o Medio RPMI1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que pueden contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluido el suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGF y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de las células. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores como N-acetilcisteína y 2- mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementado con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocinas suficiente para el crecimiento y expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37 ° C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO2). Células T que han sido expuestas a diversos tiempos de estimulación pueden presentar diferentes características.As non-limiting examples, T cell populations can be stimulated in vitro, by contact with an anti-CD3 antibody, or an antigen-binding fragment thereof, or an anti-CD2 antibody immobilized on a surface, or by contact with an anti-CD3 antibody. protein kinase C activator (eg, bryostatin) together with a calcium ionophore. For costimulation of an accessory molecule on the surface of T cells, a ligand that binds to the accessory molecule is used. For example, a population of T cells can be contacted with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, under appropriate conditions to stimulate T cell proliferation. Appropriate conditions for T cell culture include medium (e.g., Minimal Essential Media or RPMI1640 Medium or, X-vivo 5, (Lonza)) that may contain factors necessary for proliferation and viability, including serum (e.g., fetal bovine or human serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGF and TNF- or any other cell growth additives. Other cell growth additives include, but are not limited to, surfactant, plasmanate, and reducing agents such as N-acetylcysteine and 2-mercaptoethanol. Media may include RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 and X-Vivo 20, Optimizer, with added amino acids, sodium pyruvate and vitamins, either without serum or supplemented with an adequate amount of serum (or plasma) or a defined set of hormones, and/or an amount of cytokines sufficient for T-cell growth and expansion. Antibiotics, eg, penicillin and streptomycin, are included only in experimental cultures, not cell cultures to be infused into a subject. Target cells are maintained under conditions necessary to support growth, eg, a suitable temperature (eg, 37 °C) and atmosphere (eg, air plus 5% CO2). T cells that have been exposed to various times of stimulation may exhibit different characteristics.

En otra realización particular, dichas células pueden expandirse mediante co-cultivo con tejido o células. Dichas células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula en el sujeto.In another particular embodiment, said cells can be expanded by co-culture with tissue or cells. Said cells may also be expanded in vivo, for example, in the blood of the subject after administering said cell to the subject.

COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓNCOMPOSITIONS OF THE INVENTION

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, o la célula de la invención. En una realización preferida, la composición de la invención comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición de la invención es una composición farmacéutica. En otra realización preferida, la composición de la invención comprende uno o más principios activos adicionales. Another aspect of the invention relates to a composition, hereinafter composition of the invention, comprising a polynucleotide of the invention, the genetic construct of the invention, or the cell of the invention. In a preferred embodiment, the composition of the invention also comprises a pharmaceutically acceptable vehicle. In another preferred embodiment, the composition of the invention is a pharmaceutical composition. In another preferred embodiment, the composition of the invention comprises one or more additional active ingredients.

Otro aspecto de la invención se refiere al polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, para su uso en terapia.Another aspect of the invention relates to the polynucleotide of the invention, the genetic construct of the invention, the cell of the invention, or the composition of the invention, for use in therapy.

Otro aspecto de la invención se refiere al polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida, el cáncer se selecciona de la lista que consiste en neoplasias, neoplasias de células B, linfoma, leucemia y/o mieloma.Another aspect of the invention relates to the polynucleotide of the invention, the genetic construct of the invention, the cell of the invention, or the composition of the invention, for the treatment of cancer. In a preferred embodiment, the cancer is selected from the list consisting of neoplasms, B-cell neoplasms, lymphoma, leukemia, and/or myeloma.

Las células aisladas obtenidas por los diferentes métodos o la línea celular derivada de dicha célula aislada como se describió previamente, pueden usarse como un medicamento. En otra realización, dicho medicamento se puede utilizar para tratar el cáncer, particularmente para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia en un paciente que lo necesite. En otra realización, dicha célula aislada según la invención o línea celular derivada de dicha célula aislada se puede utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita.The isolated cells obtained by the different methods or the cell line derived from said isolated cell as previously described can be used as a medicine. In another embodiment, said medicament can be used to treat cancer, particularly for the treatment of B-cell lymphomas and leukemia in a patient in need thereof. In another embodiment, said isolated cell according to the invention or cell line derived from said isolated cell can be used in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer in a patient in need thereof.

En otro aspecto, la presente invención se basa en métodos para tratar a pacientes que necesitan del mismo, comprendiendo dicho método al menos uno de los siguientes pasos:In another aspect, the present invention is based on methods for treating patients in need thereof, said method comprising at least one of the following steps:

(a) proporcionar un polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, y preferiblmente una célula inmunitaria obtenible mediante cualquiera de los métodos anteriormente descrito;(a) providing a polynucleotide of the invention, the genetic construct of the invention, the cell of the invention, or the composition of the invention, and preferably an immune cell obtainable by any of the methods described above;

(b) Administrar el polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, o más preferiblemente dichas células inmunes transformadas, a dicho paciente.(b) Administering the polynucleotide of the invention, the genetic construct of the invention, the cell of the invention, or the composition of the invention, or more preferably said transformed immune cells, to said patient.

En una realización, dichas células T de la invención pueden experimentar una expansión sólida de células T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo prolongado.In one embodiment, said T cells of the invention may undergo robust T cell expansion in vivo and may persist for an extended period of time.

Dicho tratamiento puede ser paliativo, curativo o profiláctico. Puede ser parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogas, significa que las células, la línea celular o la población de células utilizadas para tratar pacientes son procedente de dicho paciente. Por alogénico se entiende que las células o población de células utilizadas para el tratamiento de pacientes no se originan en dicho paciente, sino en un donante.Said treatment may be palliative, curative or prophylactic. It can be part of an autologous immunotherapy or part of an allogeneic immunotherapy treatment. By autologous, it is meant that the cells, cell line or population of cells used to treat patients are derived from said patient. Allogeneic means that the cells or population of cells used to treat patients do not originate from said patient, but from a donor.

Las células que se pueden usar con los métodos descritos se describen en la sección anterior. El tratamiento se puede utilizar para tratar a pacientes diagnosticados con cáncer. Los cánceres que pueden tratarse puede comprender tumores no sólidos (como tumores hematológicos, que incluyen, entre otros, LLA pre-B (indicación pedriática), LLA del adulto, linfoma de células del manto, células B grandes difusas linfoma y similares). Tipos de cánceres a tratar con los CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, ciertas leucemias o neoplasias linfoides. También se incluyen tumores/cánceres en adultos y tumores/cánceres pediátricos. Puede ser un tratamiento en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia de anticuerpos, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia de células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.Cells that can be used with the methods described are described in the previous section. The treatment can be used to treat patients diagnosed with cancer. Cancers that can be treated may comprise non-solid tumors (such as hematologic tumors, including, but not limited to, pre-B ALL (pediatric indication), adult ALL, mantle cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, and the like). Types of cancers to be treated with the CARs of the invention include, but are not limited to, certain leukemias or lymphoid neoplasms. Also included are adult tumors/cancers and pediatric tumors/cancers. It may be a treatment in combination with one or more anticancer therapies selected from the group of antibody therapy, chemotherapy, cytokine therapy, dendritic cell therapy, gene therapy, hormonal therapy, laser light therapy, and radiation therapy.

Según una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse en pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención preferiblemente se basa en células o población de células, que se han hecho resistentes al menos a un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para tal agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debe ayudar a la selección y expansión de las células T según la invención dentro del paciente.According to a preferred embodiment of the invention, said treatment can be administered to patients undergoing immunosuppressive treatment. In fact, the present invention preferably relies on cells or population of cells, which have been rendered resistant to at least one immunosuppressive agent due to inactivation of a gene encoding a receptor for such immunosuppressive agent. In this aspect, the immunosuppressive treatment must help the selection and expansion of the T cells according to the invention within the patient.

La administración de células o población de células según la presente invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluso mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en este documento puede administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, por vía intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática, o intraperitonealmente. En una realización, las composiciones celulares de la presente invención son preferiblemente administrado por inyección intravenosa.Administration of cells or population of cells according to the present invention can be carried out in any convenient manner, including by aerosol inhalation, injection, ingestion, transfusion, implantation, or transplantation. The compositions described herein can be administered to a patient subcutaneously, intradermally, intratumorally, intranodally, intramedullary, intramuscularly, by intravenous or intralymphatic injection, or intraperitoneally. In one embodiment, the cell compositions of the present invention are preferably administered by intravenous injection.

La administración de las células o población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los números enteros valores de números de celda dentro de esos rangos. Las células o población de células pueden ser administradas en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad efectiva de células se administran como dosis única. En otra realización, dicha cantidad efectiva de células se administran como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración es dentro del juicio del médico responsable y depende de la condición clínica del paciente. Las células o la población de células se pueden obtener de cualquier fuente, como sangre, bancos o un donante, incluyendo el propio paciente. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los rangos óptimos de cantidades eficaces de un tipo de célula dado para una enfermedad o afecciones particulares, se encuentra dentro del conocimiento de la técnica.Administration of the cells or population of cells may consist of the administration of 104-109 cells per kg of body weight, preferably 105 to 106 cells/kg of body weight, including all integer values of cell numbers within those ranges. ranges. The cells or population of cells may be administered in one or more doses. In another embodiment, said effective amount of cells is administered as a single dose. In another embodiment, said effective amount of cells is administered as more than one dose over a period of time. The Timing of administration is within the judgment of the responsible physician and depends on the clinical condition of the patient. The cells or population of cells can be obtained from any source, such as blood, banks, or a donor, including the patient himself. While individual needs vary, determination of optimal ranges of effective amounts of a given cell type for a particular disease or condition is within the skill of the art.

Una cantidad eficaz o efectiva significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.An effective or effective amount means an amount that provides a therapeutic or prophylactic benefit.

La dosis administrada dependerá de la edad, salud y peso del paciente destinatario, tipo de tratamiento concurrente, si lo hubiera, frecuencia del tratamiento y naturaleza del efecto deseado. En otra realización, dicha cantidad efectiva de células o composición que comprenden esas células se administran por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.The dose administered will depend on the age, health, and weight of the recipient patient, type of concurrent treatment, if any, frequency of treatment, and nature of effect desired. In another embodiment, said effective amount of cells or composition comprising those cells is administered parenterally. Said administration may be an intravenous administration. Such administration can be done directly by injection into a tumor.

En ciertas realizaciones de la presente invención, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento, que incluyen, entre otros, el tratamiento con agentes como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o nataliziimab, tratamiento para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En otras realizaciones, las células T de la invención pueden ser utilizado en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente del calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhibir la quinasa p70S6 que es importante para el crecimiento señalización inducida por factores (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander y col. 1993). En una realización adicional, las composiciones de células de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o a continuación de) un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando quimioterapia agentes como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En otra forma de realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de células B, como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a tratamiento estándar con quimioterapia de dosis alta seguida de un transplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.In certain embodiments of the present invention, the cells are administered to a patient in conjunction with (eg, before, simultaneously with, or after) any number of treatment modalities, including, but not limited to, treatment with agents such as antiviral therapy, cidofovir and interleukin-2, cytarabine (also known as ARA-C), or natalizimab, treatment for patients with MS or treatment with efaliztimab for patients with psoriasis, or other treatments for patients with PML. In other embodiments, the T cells of the invention can be used in combination with chemotherapy, radiation, immunosuppressive agents, such as cyclosporine, azathioprine, methotrexate, mycophenolate, and FK506, antibodies or other immunoablative agents such as CAM PATH, anti-CD3 antibodies, or other therapies. with antibodies, cytotoxin, fludaribine, cyclosporine, FK506, rapamycin, mycoplienolic acid, steroids, FR901228, cytokines, and irradiation. These drugs inhibit the calcium-dependent calcineurin phosphatase (cyclosporine and FK506) or inhibit the p70S6 kinase that is important for growth factor-induced signaling (rapamycin) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer , Hollander et al. 1993). In a further embodiment, the cell compositions of the present invention are administered to a patient in conjunction with (eg, before, simultaneously with, or following) a bone marrow transplant, T-cell ablative therapy using chemotherapy agents such as fludarabine, radiotherapy of external beam (XRT), cyclophosphamide, or antibodies such as OKT3 or CAMPATH. In another embodiment, the cellular compositions of the present invention are administered after ablative B-cell therapy, such as agents that react with CD20, eg, Rituxan. For example, in one embodiment, subjects may undergo standard treatment with high-dose chemotherapy followed by peripheral blood stem cell transplantation. In certain embodiments, after transplantation, subjects receive an infusion of the expanded immune cells of the present invention. In a further embodiment, the expanded cells are administered before or after surgery.

Otras definicionesOther definitions

- A menos que se especifique lo contrario, "un", "uno", "el," y "al menos uno" se utilizan indistintamente y significa uno o más de uno.- Unless otherwise specified, "a," "one," "the," and "at least one" are used interchangeably and mean one or more than one.

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica son designado aquí según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de glutamina, R significa Arg o residuo de arginina y D significa Asp o residuo de ácido aspártico.- Amino acid residues in a polypeptide sequence are designated here by one-letter code, where, for example, Q means Gln or glutamine residue, R means Arg or arginine residue, and D means Asp or aspartic acid residue. .

- Sustitución de aminoácidos significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo, el reemplazo de un residuo de arginina con un residuo de glutamina en la secuencia de un péptido es una sustitución de aminoácidos.- "Amino acid substitution" means the substitution of one amino acid residue for another, eg, the replacement of an arginine residue with a glutamine residue in a peptide sequence is an amino acid substitution.

- Los nucleótidos se designan como sigue: se utiliza el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g ó a (nucleótidos de purina), k representa g ó t, s representa g ó c, w representa a ó t, m representa a ó c, y representa t ó c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a ó t, v representa g, a ó c, b representa g, t ó c, h representa a, t ó c, yn representa g, a, t ó c.Nucleotides are designated as follows: The one-letter code is used to designate the base of a nucleoside: a is adenine, t is thymine, c is cytosine, and g is guanine. For degenerate nucleotides, r represents g or a (purine nucleotides), k represents g or t, s represents g or c, w represents a or t, m represents a or c, and represents t or c (pyrimidine nucleotides). , d represents g, a or t, v represents g, a or c, b represents g, t or c, h represents a, t or c, and n represents g, a, t or c.

"Como se usa en este documento," ácido nucleico "o" polinucleótidos "se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados por ligación, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se encuentran en la naturaleza (como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos naturales (p. ej., formas enantioméricas de nucleótidos naturales) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de azúcar y/o en la base de pirimidina o purina. Las modificaciones del azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o azúcares pueden ser funcionalizados como éteres o ésteres. Además, toda la fracción de azúcar se puede reemplazar con estructuras estérica y electrónicamente similares, como azúcares aza y análogos de azúcar carbocíclico. Ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas alquiladas y pirimidinas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico se pueden unir mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces.Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios."As used herein, "nucleic acid" or "polynucleotides" refers to nucleotides and/or polynucleotides, such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), oligonucleotides, fragments generated by the polymerase chain reaction (PCR), and fragments generated by ligation, cleavage, endonuclease action, and exonuclease action Nucleic acid molecules can be composed of monomers that are naturally occurring nucleotides (such as DNA and RNA) or natural nucleotide analogs (e.g., enantiomeric forms of naturally occurring nucleotides) or a combination of both Modified nucleotides may have alterations in the sugar moieties and/or in the pyrimidine or purine base Sugar modifications include, for example, the replacement of one or more hydroxyl groups with halogens, alkyl groups, amines, and azido groups, or Sugars can be functionalized as ethers or esters. Furthermore, the entire sugar moiety can be replaced with sterically and electronically similar structures, such as aza sugars and carbocyclic sugar analogs. Examples of modifications to a base moiety include alkylated purines and pyrimidines, acylated purines or pyrimidines, or other well-known heterocyclic substituents. Nucleic acid monomers can be joined by phosphodiester bonds or analogs of such bonds. Nucleic acids can be single-stranded or double-stranded.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) se entiende moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un receptor de células T que activa el receptor intracelular dominio para generar una proteína quimérica que exhibe una inmunidad celular específica antitarget. Generalmente, CAR consiste en un anticuerpo extracelular monocatenario (scFv) fusionado aldominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo del receptor de antígeno de células T (scFv) y tienen la capacidad, cuando se expresan en células T, de redirigir el reconocimiento de antígenos en función de la especificidad del anticuerpo monoclonal.- By chimeric antigen receptor (CAR) is meant molecules that combine a binding domain against a component present on the target cell, eg, an antibody-based specificity for a desired antigen (eg, tumor antigen) with a receptor for T cells that activate the intracellular receptor domain to generate a chimeric protein that exhibits antitarget-specific cell-mediated immunity. Generally, CARs consist of a single-chain extracellular antibody (scFv) fused to the intracellular signaling domain of the zeta chain of the T-cell antigen receptor complex (scFv) and have the ability, when expressed on T cells, to redirect recognition of antigens depending on the specificity of the monoclonal antibody.

- Por "vector de entrega" o "vectores de entrega" se entiende cualquier vector de entrega que pueda ser utilizado en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, "contactar") o liberar dentro de las células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducir") agentes/sustancias químicas y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero no se limita a, vectores liposomales de liberación, vectores de liberación viral, vectores de liberación de fármacos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipoplexes, polyplexes, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonido), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de liberación permiten el suministro de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores como plásmidos, péptidos. En estos casos, los vectores de administración son portadores de moléculas. Por "vector de liberación" o "vectores de liberación" también se entiende los métodos de liberación destinados a realizar la transfección.- By "delivery vector" or "delivery vectors" is meant any delivery vector that can be used in the present invention to bring into cell contact (i.e., "contact") or release within cells or subcellular compartments ( i.e. "introduce") chemical agents/substances and molecules (proteins or nucleic acids) needed in the present invention. Includes, but is not limited to, liposomal delivery vectors, viral delivery vectors, drug delivery vectors, chemical carriers, polymeric carriers, lipoplexes, polyplexes, dendrimers, microbubbles (ultrasound contrast agents), nanoparticles, emulsions, or others. appropriate transfer vectors. These delivery vectors allow the delivery of molecules, chemicals, macromolecules (genes, proteins) or other vectors such as plasmids, peptides. In these cases, the delivery vectors are carrier molecules. By "delivery vector" or "delivery vectors" is also meant delivery methods intended to effect transfection.

- Los términos "vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un "vector" en la presente invención incluye, pero no se limita a, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula lineal o circular de ADN o ARN que puede constar de una molécula cromosómica, no cromosómica, semisintética o ácidos nucleicos sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/ o expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y comercialmente disponibles.- The terms "vector" or "vectors" refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. A "vector" in the present invention includes, but is not limited to, a viral vector, a plasmid, an RNA vector, or a linear or circular DNA or RNA molecule which may consist of a molecule chromosomal, non-chromosomal, semi-synthetic or synthetic nucleic acids. Preferred vectors are those capable of autonomous replication (episomal vector) and/or expression of nucleic acids to which they are linked (expression vectors). A large number of suitable and commercially available vectors are known to those skilled in the art.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (p. Ej. Virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa como ortomixovirus (p. ej., virus de la influenza), rabdovirus (p. Ej., Rabia y virus de la estomatitis vesicular), paramixovirus (p. Ej. Sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva como picornavirus y alfavirus, y Virus de ADN de doble cadena que incluyen adenovirus, herpesvirus (p. Ej., Virus del herpes simple tipo 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (p. ej., vaccinia, viruela aviar y canarypox). Otros virus incluyen virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C de mamíferos, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo HTLVBLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: Los virus y sus replicación, In Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).Viral vectors include retroviruses, adenoviruses, parvoviruses (eg, adeno-associated viruses), coronaviruses, negative-strand RNA viruses such as orthomyxoviruses (eg, influenza viruses), rhabdoviruses (eg, rabies, and influenza viruses). of vesicular stomatitis), paramyxoviruses (eg measles and Sendai), positive-stranded RNA viruses such as picornaviruses and alphaviruses, and double-stranded DNA viruses including adenoviruses, herpesviruses (eg herpes simplex virus types 1 and 2, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus) and poxviruses (eg, vaccinia, fowlpox, and canarypox). Other viruses include Norwalk virus, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, and hepatitis virus, for example. Examples of retroviruses include: avian leukosis-sarcoma, mammalian type C viruses, type B viruses, type D viruses, HTLVBLV group, lentiviruses, spumaviruses (Coffin, J. M., Retroviridae: Viruses and their Replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

- Por "vector lentiviral" se entiende vectores lentivirales basados en el VIH que son muy prometedores para liberación debido a su capacidad de envasado relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficiencia una amplia gama de diferentes tipos de células. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envolvente y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas de superficie viral con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN viral se somete a una transcripción inversa, que está mediada por el complejo viral de transcriptasa inversa. El producto de la transcripción inversa es una doble hebra de ADN viral lineal, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de células infectadas. Por "vectores lentivirales integradores (o LV)", se entiende vectores tales como por ejemplo, pero sin limitarse, aquellos que son capaces de integrar el genoma de una célula diana. Por el contrario, como "vectores lentivirales no integrativos (o NILV)" se refiere a vectores de suministro de genes eficientes que no se integran el genoma de una célula diana mediante la acción del virus integrasa. - By "lentiviral vector" is meant HIV-based lentiviral vectors that are very promising for delivery due to their relatively large packaging capacity, reduced immunogenicity, and their ability to stably transduce with high efficiency a wide range of different cell types . Lentiviral vectors are generally generated after transient transfection of three (packaging, envelope, and transfer) or more plasmids into producer cells. Like HIV, lentiviral vectors enter the target cell through the interaction of viral surface glycoproteins with receptors on the cell surface. Upon entry, the viral RNA undergoes reverse transcription, which is mediated by the viral reverse transcriptase complex. The product of reverse transcription is a double-stranded linear viral DNA, which is the substrate for viral integration into the DNA of infected cells. By "integrating lentiviral vectors (or LVs)", we mean vectors such as, but not limited to, those that are capable of integrating the genome of a target cell. In contrast, by "non-integrative lentiviral (or NILV) vectors" it refers to efficient gene delivery vectors that are not integrated into the genome of a target cell by the action of integrase virus.

- Los vectores y vectores de liberación se pueden asociar o combinar con cualquier técnica de permeabilización celular, como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.- The vectors and release vectors can be associated or combined with any cell permeabilization technique, such as sonoporation or electroporation or derivatives of these techniques.

- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivados de estos organismos para cultivos in vitro. - By cell or cells is meant any living eukaryotic cell, primary cell and cell line derived from these organisms for in vitro cultures.

- Por "célula primaria" o "células primarias" se entiende las células extraídas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para crecimiento in vitro, que han sufrido muy pocas duplicaciones de población y, por lo tanto, son más representativas de los principales componentes y características de los tejidos de los que se derivan, en comparación a líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente.- "Primary cell" or "primary cells" means cells taken directly from living tissue (i.e. biopsy material) and established for growth in vitro, which have undergone very few population doublings and are therefore more representative of the main components and characteristics of the tissues from which they are derived, compared to continuous or artificially immortalized tumorigenic cell lines.

Como ejemplos no limitantes, se pueden seleccionar líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; Células HEK293; Células Caco2; Células U2-OS; Células NIH 3T3; Células NSO; Células SP2; Células CHO-S; Células DG44; Células K-562, células U-937; Células MRC5; Células IMR90; Células Jurkat; Células HepG2; Células HeLa; Células HT-1080; Células HCT-116; Células Hu-h7; Células Huvec; Células Muda 4.As non-limiting examples, cell lines may be selected from the group consisting of CHO-K1 cells; HEK293 cells; Caco2 cells; U2-OS cells; NIH 3T3 cells; NSO cells; SP2 cells; CHO-S cells; DG44 cells; K-562 cells, U-937 cells; MRC5 cells; IMR90 cells; Jurkat cells; HepG2 cells; HeLa cells; HT-1080 cells; HCT-116 cells; Hu-h7 cells; Huvec cells; Dumb cells 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de línea celular para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también se pueden utilizar para seleccionar moléculas biológicamente activas de interés en la investigación y producción y diversos campos como químico, biocombustibles, terapéutica y agronomía, como ejemplos no limitativos.All of these cell lines can be modified by the method of the present invention to provide cell line models for producing, expressing, quantifying, detecting, studying a gene or protein of interest; these models can also be used to select biologically active molecules of interest in research and production and various fields such as chemistry, biofuels, therapeutics and agronomy, as non-limiting examples.

- por "mutación" se entiende la sustitución, supresión, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/ aminoácidos en un polinucleótido (cDNA, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar la estructura de la secuencia genómica o la estructura / estabilidad del ARNm codificado.- "mutation" means the substitution, deletion, insertion of up to one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, twenty, twenty-five, thirty , forty, fifty or more nucleotides/amino acids in a polynucleotide (cDNA, gene) or polypeptide sequence. The mutation can affect the coding sequence of a gene or its regulatory sequence. It can also affect the structure of the genomic sequence or the structure/stability of the encoded mRNA.

- por "variante (s)", se entiende una variante repetida, una variante, una variante de unión al ADN, una variante TALEnucleasa, una variante polipeptídica obtenida por mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula madre. - by "variant(s)", we mean a repeat variant, a variant, a DNA-binding variant, a TALEnuclease variant, a polypeptide variant obtained by mutation or replacement of at least one residue in the amino acid sequence of the molecule mother.

- por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o dominio de una proteína; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína o dominio de proteína original o propiedades adicionales, o mayor o menor actividad.- "functional variant" means a catalytically active mutant of a protein or domain of a protein; said mutant may have the same activity compared to its original protein or protein domain or additional properties, or greater or lesser activity.

- "identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar mediante la comparación de una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácidos nucléicos o aminoácidos es una función del número de nucleótodos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Se pueden usar varios algoritmos de alineación y/ o programas para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.) Y se puede utilizar con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, polipéptidos que tienen al menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con los polipéptidos descritos en este documento y que preferiblemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como el polinucleótido que codifica dichos polipéptidos, se contemplan.- "identity" refers to the sequence identity between two nucleic acid molecules or polypeptides. Identity can be determined by comparing a position in each sequence that can be aligned for comparison purposes. When a position in the compared sequence is occupied by the same base, then the molecules are identical at that position. A degree of similarity or identity between nucleic acid or amino acid sequences is a function of the number of identical or matching nucleotides at positions shared by the nucleic acid sequences. Various alignment algorithms and/or programs can be used to calculate the identity between two sequences, including FASTA or BLAST, which are available as part of the GCG Sequence Analysis Package (University of Wisconsin, Madison, Wis.) and can be used with, for example, the default settings. For example, polypeptides that have at least 70%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% identity to the polypeptides described herein and preferably exhibit substantially the same functions, as well as the polynucleotide encoding said polypeptides, are contemplated.

- "similitud" describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. BLASTP también puede usarse para identificar una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia utilizando una matriz de similitud como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique lo contrario, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se utiliza BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de BLASTP positivos y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades BLASTP. "Identidades" de BLASTP muestra el número y fracción de residuos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y "Positivos" BLASTP muestra el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y son similares entre sí. Secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o de similitud con las secuencias de aminoácidos descritas en este documento, se contemplan y están abarcadas por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares son deducidos utilizando el código genético y pueden obtenerse por medios convencionales. El polinucleótido que codifica una variante funcional de este tipo se produciría mediante traducción inversa de su secuencia de aminoácidos utilizando el código genético.- "similarity" describes the relationship between the amino acid sequences of two or more polypeptides. BLASTP can also be used to identify an amino acid sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% sequence similarity to a reference amino acid sequence using a similarity matrix such as BLOSUM45, BLOSUM62, or BLOSUM80. Unless otherwise stated, a similarity score will be based on the use of BLOSUM62. When BLASTP is used, the percentage similarity is based on the score of positive BLASTPs and the percentage of sequence identity is based on the score of BLASTP identities. BLASTP "Identities" shows the number and fraction of total residues in high-scoring sequence pairs that are identical; and "Positive" BLASTP displays the number and fraction of residues for which the alignment scores have positive values and are similar to each other. Amino acid sequences having these degrees of identity or similarity, or any intermediate degree of identity or similarity, to the amino acid sequences described herein, are contemplated and encompassed by this disclosure. The polynucleotide sequences of similar polypeptides are deduced using the genetic code and can be obtained by means of conventional. The polynucleotide encoding such a functional variant would be produced by reverse translation of its amino acid sequence using the genetic code.

- "dominio transductor de señal" o "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígenos que se une específicamente a una molécula coestimuladora análoga en una célula T, que proporciona una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, mediante la vinculación de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de célula T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de proliferación, diferenciación y similares. El ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), mólecula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, tales como, pero no limitado a, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, linfocitos antígeno 1 asociado a la función (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.- "signal transducer domain" or "costimulatory ligand" refers to a molecule on an antigen-presenting cell that specifically binds to an analogous costimulatory molecule on a T cell, providing a signal that, in addition to the primary signal provided, for example, by binding a TCR/CD3 complex to a peptide-loaded MHC molecule, it mediates a T cell response, including, but not limited to, activation of proliferation, differentiation, and the like. The costimulatory ligand may include but is not limited to CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, inducible costimulatory ligand (ICOS-L), intercellular adhesion (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, lymphotoxin receptor beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, an agonist or antibody that binds to the Toll ligand receptor, and a ligand that specifically binds with B7-H3 A costimulatory ligand also encompasses, but is not limited to, an antibody that specifically binds to a costimulatory molecule present on a T cell, such as, but not limited to, CD27, CD28, 4-IBB , OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, a ligand that specifically binds CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en una célula T que específicamente se une a un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora de la célula, tales como, pero no limitado a la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limittan, a una molécula de MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando de Toll.A "costimulatory molecule" refers to the cognate binding partner on a T cell that specifically binds a costimulatory ligand, thereby mediating a costimulatory response of the cell, such as, but not limited to proliferation. Costimulatory molecules include, but are not limited to, an MHC class I molecule, BTLA, and Toll ligand receptor.

Una "señal coestimuladora" como se usa en este documento se refiere a una señal, que en combinación con la señal primaria, como la ligadura de TCR / CD3, conduce a la proliferación de células T y/o regulación positiva o regulación a la baja de moléculas clave.A "costimulatory signal" as used herein refers to a signal, which in combination with the primary signal, such as TCR/CD3 binding, leads to T cell proliferation and/or up-regulation or down-regulation. of key molecules.

-El término "dominio de unión a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio será capaz de interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede ser elegido para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado de enfermedad particular. Así ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con virus, bacterias e infecciones parasitarias, enfermedades autoinmunes y células cancerosas.-The term "extracellular ligand binding domain" as used herein is defined as an oligo or polypeptide that is capable of binding a ligand. Preferably, the domain will be capable of interacting with a cell surface molecule. For example, the extracellular ligand-binding domain can be chosen to recognize a ligand that acts as a cell surface marker on target cells associated with a particular disease state. Thus examples of cell surface markers that can act as ligands include the associated with viruses, bacteria and parasitic infections, autoimmune diseases and cancer cells.

El término "sujeto" o "paciente" como se usa en este documento incluye a todos los miembros del reino animal, incluidos primates no humanos y humanos.The term "subject" or "patient" as used herein includes all members of the animal kingdom, including non-human primates and humans.

La descripción anterior de la invención permite que cualquier persona experta en esta técnica pueda hacer y usar la invención, en particular para el objeto de las reivindicaciones adjuntas, que forman parte de la descripción original.The foregoing description of the invention enables any person skilled in the art to make and use the invention, particularly for the purpose of the appended claims, which form a part of the original description.

Cuando se indica aquí un límite o rango numérico, se incluyen los puntos finales. Además, todos los valores y los subintervalos dentro de un límite o rango numérico se incluyen específicamente como si se hubieran escrito específicamente.When a numerical limit or range is indicated here, endpoints are included. Also, all values and subranges within a numeric limit or range are specifically included as if specifically typed.

Varias modificaciones a las realizaciones preferidas serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y los principios genéricos definidos en este documento se pueden aplicar a otras realizaciones y aplicaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, esta invención no está destinada a limitarse a las realizaciones mostradas, sino que debe concederse el alcance más amplio de acuerdo con los principios y características aquí descritos.Various modifications to the preferred embodiments will be readily apparent to those skilled in the art, and the generic principles defined herein may be applied to other embodiments and applications without departing from the spirit and scope of the invention. Therefore, this invention is not intended to be limited to the embodiments shown, but is to be accorded the widest scope in accordance with the principles and features described herein.

Habiendo descrito en general esta invención, se puede obtener una mayor comprensión mediante referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proporcionan en este documento con fines ilustrativos únicamente, y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique lo contrario. Having generally described this invention, a further understanding can be obtained by reference to certain specific examples, which are provided herein for illustrative purposes only, and are not intended to be limiting unless otherwise specified.

A menos que se defina específicamente en este documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado como comúnmente lo entiende un experto en los campos de la terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular. Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, con métodos y materiales adecuados que se describen en este documento. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí son incorporadas por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluidas las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no son pretende ser limitante, a menos que se especifique lo contrario. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrooket a I, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No.Unless specifically defined herein, all technical and scientific terms used have the same meaning as is commonly understood by one skilled in the fields of gene therapy, biochemistry, genetics, and molecular biology. All methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, with suitable methods and materials described herein. All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict, this specification, including definitions, shall control. Furthermore, the materials, methods, and examples are illustrative only and are not intended to be limiting, unless otherwise specified. The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of cell biology, cell culture, molecular biology, transgenic biology, microbiology, recombinant DNA, and immunology, which are within the skill of the art. Such techniques are fully explained in the literature. See, eg, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrooket I, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al. US Pat. Do not.

4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames& S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I .Freshney, Alan R. Liss, I nc., 1987); I mmobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M . Simon, eds. -in-chief, Academic Press, I nc., New York), específicamente, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M . P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor La boratory); Immunochemical Methods I n Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental I mmunology, Volumes I -IV (D. M . Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (BD Harries & SJ Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (BD Hames & SJ Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (JH Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and CC Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986).

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓNEXAMPLES OF THE INVENTION

ESQUEMASCHEME

1. Generación in sílico de promotores quiméricos de las diferentes moléculas implicadas en la ruta de señalización del TCR.1. In silico generation of chimeric promoters of the different molecules involved in the TCR signaling pathway.

a. Selección de las moléculas implicadas en la ruta de señalización del TCR.a. Selection of the molecules involved in the TCR signaling pathway.

b. Búsqueda en bases de datos de elementos reguladores implicados en la expresión y función promotora de las moléculas seleccionadas.b. Search in databases of regulatory elements involved in the expression and promoter function of the selected molecules.

c. Diseño de las construcciones definitivas in sílico. c. Design of the final constructions in silico.

2. Generación de células T eGFP+, dónde eGFP se exprese bajo el control de los diferentes promotores quiméricos.2. Generation of eGFP+ T cells, where eGFP is expressed under the control of the different chimeric promoters.

a. Clonaje de las secuencias promotoras en un vector lentiviral con GFP.a. Cloning of the promoter sequences in a lentiviral vector with GFP.

b. Producción de vectores lentivirales con las diferentes construcciones.b. Production of lentiviral vectors with the different constructions.

c. Transducción celular con los vectores virales, y estudio de la cinética de expresión de GFP, tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína.c. Cellular transduction with viral vectors, and study of the kinetics of GFP expression, both at the mRNA level and at the protein level.

3. Generación de células T-CAR-CD19, dónde el CAR se exprese bajo el control de los diferentes promotores quiméricos.3. Generation of T-CAR-CD19 cells, where the CAR is expressed under the control of the different chimeric promoters.

a. Clonaje de las secuencias promotoras en un esqueleto lentiviral que contenga el CAR.a. Cloning of the promoter sequences in a lentiviral backbone containing the CAR.

c. Transducción celular con los vectores virales, y estudio de la cinética de expresión del CAR, tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína.c. Cellular transduction with viral vectors, and study of the kinetics of CAR expression, both at the mRNA level and at the protein level.

Materiales y métodosMaterials and methods

1. Diseño de los promotores quiméricos 1. Design of chimeric promoters

Se ha generado una construcción (B2M) que contiene un promotor definido por Genecopoeia (chr15:45002449-45003706). También se añadió un promotor definido por EPD (chr15:45003666-45003725) aguas abajo, y el promotor 3 definido por Switchgear. Estos dos últimos solapan parcialmente con el exón 1 de la B2M. Aguas abajo se ha colocado una región definida por Ensembl como enhancer (chr15:45004699-45004998), y en la región 3’, otro promotor definido por Switchgear que solapa con el exón 2. La construcción B2M TetO es idéntica, pero colocando la secuencia TetO aguas abajo del TSS, mientras que en la construcción B2M Enh5’, cambiamos la posición del enhancer definida por Ensembl de la región 3’ a la 5’ A construct (B2M) containing a promoter defined by Genecopoeia (chr15:45002449-45003706) has been generated. An EPD-defined promoter (chr15:45003666-45003725) was also added downstream, and the Switchgear-defined 3 promoter. These last two partially overlap with exon 1 of B2M. Downstream, a region defined by Ensembl has been placed as an enhancer (chr15:45004699-45004998), and in the 3' region, another promoter defined by Switchgear that overlaps with exon 2. The B2M TetO construct is identical, but placing the sequence TetO downstream of the TSS, while in the B2M Enh5' construct, we changed the position of the enhancer defined by Ensembl from the 3' to the 5' region

2. Clonaje molecular de los vectores2. Molecular cloning of vectors

Las construcciones se reconstituyeron en 20 ^L de agua de agua ultrapura en condiciones de esterilidad.Constructs were reconstituted in 20 ^L ultrapure water under sterile conditions.

a. Plásmido SEWP con los promotores quiméricosa. SEWP plasmid with chimeric promoters

SEWP es un plásmido que permite la expresión de eGFP bajo el control del promotor viral SFFV (del inglés spleen focus-forming virus). Se modificó este plásmido (disponible en el laboratorio) para sustituir el promotor por las construcciones quiméricas. Se realizaron las digestiones combinadas de todas las construcciones con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (New England Biolabs) usando el buffer 2.1 (New England Biolabs) durante 1 hora y media a 37°C. Se realizó la electroforesis en gel de agarosa ultrapura, y se aislaron las bandas mediante el kit QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). Paralelamente, se digirió el esqueleto SEWP con las mismas enzimas para obtener el fragmento sin promotor. Se realizó la ligación de los promotores con los fragmentos de SEWP utilizando la DNA ligasa T4 (New England Biolabs) en una proporción inserto:vector de 7:1. La reacción se llevó a cabo durante toda la noche a 16°C. Se transformaron bacterias competentes E. coli Stbl3 (Life Technologies) con el producto de ligación, y se comprobaron las colonias positivas por PCR de colonias, con el siguiente programa: 1x (95°C, 10 min); 35x (95°C, 30 seg / 62°C, 30 seg / 72°C, 30 seg); 1x (72°C, 10 min), mediante el kit KAPA Taq PCR (Kapa Biosystems) y los siguientes cebadores (Sigma): Fw-cPPT (5’-ACAGCAGAGATCCAGTTTGG-3’) y Rv-eGFP (5’-TCACTCTCGGCATGGACG-3’) (Fig. 5). Se realizó una miniprep usando el kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) de las colonias positivas para la ligación, y el ADN plasmídico se chequeó por patrón de HindlII y por secuenciación. SEWP is a plasmid that allows the expression of eGFP under the control of the SFFV (spleen focus-forming virus) viral promoter. This plasmid (available in the laboratory) was modified to substitute the promoter for the chimeric constructs. Pooled digestions of all constructs were performed with restriction enzymes BamHI and EcoRI ( New England Biolabs) using buffer 2.1 ( New England Biolabs) for 1.5 hours at 37°C. Ultrapure agarose gel electrophoresis was performed, and bands were isolated using the QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). In parallel, the SEWP backbone was digested with the same enzymes to obtain the promoterless fragment. Ligation of promoters to SEWP fragments was performed using T4 DNA ligase ( New England Biolabs) in an insert:vector ratio of 7:1. The reaction was carried out overnight at 16°C. Competent bacteria E. coli Stbl3 (Life Technologies) were transformed with the ligation product, and positive colonies were checked by colony PCR, with the following program: 1x (95°C, 10 min); 35x (95°C, 30 sec / 62°C, 30 sec / 72°C, 30 sec); 1x (72°C, 10 min), using the KAPA Taq PCR kit (Kapa Biosystems) and the following primers (Sigma): Fw-cPPT (5'-ACAGCAGAGATCCAGTTTGG-3') and Rv-eGFP (5'-TCACTCTCGGCATGGACG- 3') (Fig. 5). Ligation-positive colonies were miniprepped using the Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega), and plasmid DNA was checked by HindlII patterning and sequencing.

b. CAR 3G con los promotores quiméricosb. CAR 3G with chimeric promoters

Para generar los plásmidos de interés, se partió de un CAR de tercera generación frente a CD19 (Creative Biolabs) que presenta el promotor EF1-a (factor de elongación 1 a, del inglés Elongation Factor 1 a). Se clonaron 4 construcciones: CD247, LCK, B2M y CD4 P1 en el esqueleto lentiviral del CAR. Para ello, se realizaron las digestiones con las enzimas Clal y EcoRI y el buffer 3.1 (New England Biolabs) en el plásmido original del CAR para liberar el promotor, y en las construcciones en pUC57 para obtener los promotores quiméricos, a 37°C durante 1 hora y media. Se aislaron las bandas de un gel de agarosa ultrapura y se realizó la ligación de igual manera. Se transformaron bacterias competentes y se volvió a chequear colonias positivas por PCR de colonias, con los cebadores Fw cPPT-clínico (5’-GTGCAGGGGAAAGAATAGTAG-3’) y Rv CD19 (5’-TACAGGACTTTCTTTCTGCC-3’). Se realizaron minipreps de las colonias positivas con el mismo kit, y se chequearon por patrón Hindlll (Fig. 8) y por secuenciación.To generate the plasmids of interest, we started with a third-generation CAR against CD19 (Creative Biolabs) that has the EF1-a promoter (elongation factor 1a ). Four constructs were cloned: CD247, LCK, B2M and CD4 P1 in the CAR lentiviral backbone. To do this, digestions were performed with the enzymes Clal and EcoRI and buffer 3.1 ( New England Biolabs) in the original CAR plasmid to release the promoter, and in the pUC57 constructs to obtain the chimeric promoters, at 37°C for 1 hour and a half. Bands were isolated from an ultrapure agarose gel and ligation was performed in the same way. Competent bacteria were transformed and positive colonies were rechecked by colony PCR, with the primers Fw cPPT-clinical (5'-GTGCAGGGGAAAGAATAGTAG-3') and Rv CD19 (5'-TACAGGACTTTCTTTCTGCC-3'). Minipreps of positive colonies were made with the same kit, and checked by Hindll pattern (Fig. 8) and by sequencing.

3. Cultivo celular3. Cell culture

a. Cultivo de líneas celularesa. Cell line culture

Se realizó el cultivo de 4 líneas celulares. La línea celular utilizada para la producción de vectores lentivirales fue la HEK-293T (células embrionarias procedentes de riñón humano, ATCC® CRL-11268™). Son células adherentes que se cultivaron en frascos T175 con medio DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco, del inglés Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Biowest) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S; 0,5% de cada uno) (Biowest). La línea BxPC-3 (células de adenocarcinoma pancreático humano, ATCC® CRL-1687™) es también una línea celular adherente que se cultivó en frascos T25 con medio RPMI-1640 (del inglés Roswell Park Memorial Institute) (Biowest) suplementado con un 10% de FBS y un 1% de P/S. Las líneas Jurkat (de leucemia de células T aguda, ATCC® TIB-152™) y Namalwa (de linfoma de Burkitt, ATCC® CRL-1432™) son células en suspensión que se cultivan también con medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de P/S, ambas cultivadas en frascos T25. Culture of 4 cell lines was performed. The cell line used for the production of lentiviral vectors was HEK-293T (embryonic cells from human kidney, ATCC® CRL-11268™). They are adherent cells that were cultured in T175 flasks with DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Biowest) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco) and 1% penicillin/streptomycin (P/S; 0.5% each) (Biowest). The BxPC-3 line (human pancreatic adenocarcinoma cells, ATCC® CRL-1687™) is also an adherent cell line that was cultured in T25 flasks with RPMI-1640 medium (from the English Roswell Park Memorial Institute) (Biowest) supplemented with a 10% FBS and 1% P/S. The Jurkat (for acute T-cell leukemia, ATCC® TIB-152™) and Namalwa (for Burkitt's lymphoma, ATCC® CRL-1432™) lines are cells in suspension that are also cultured with RPMI-1640 medium supplemented with 10 % FBS and 1% P/S, both cultured in T25 flasks.

Las cuatro líneas celulares se mantuvieron en incubadores con una temperatura de 37°C. Las HEK-293T se mantuvieron en una atmósfera al 10% de dióxido de carbono (CO2), mientas All four cell lines were maintained in 37°C incubators. HEK-293Ts were kept in a 10% carbon dioxide (CO2) atmosphere while

que las 3 líneas restantes se mantuvieron con una atmósfera al 5% de CO2. Las células fueron pasadas 3 veces por semana, manteniendo una densidad celular aproximada de 1*106 células/mL.that the remaining 3 lines were kept in a 5% CO2 atmosphere. Cells were passaged 3 times per week, maintaining an approximate cell density of 1*106 cells/mL.

b. Cultivo de células T primariasb. Primary T cell culture

Las células T primarias se obtuvieron a partir sangre periférica movilizada de un donante sano. Partiendo de la sangre periférica, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, del inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells) por centrifugación por gradiente de densidad, utilizando para ello Lymphosep (Biowest), un medio específico para separar linfocitos. La centrifugación se llevó a cabo con una duración de 30 minutos a 400g sin freno ni aceleración. Se realizaron sucesivos lavados, y se aislaron los linfocitos T de todo el cóctel celular usando el kit MACSxpress® Pan T Cell Isolation (Miltenyi Biotec), que consta de una mezcla de anticuerpos frente a la mayoría de marcadores de superficie de PBMCs a excepción de CD3, conjugados con microesferas magnéticas, por lo que constituye un método de separación magnética basado en la depleción negativa de todos los tipos celulares a excepción de las células T (CD3+). Las células T aisladas se cultivaron con medio TexMACSTM (Miltenyi Biotec), un medio específico de células T, suplementado con un 5% de suero humano AB (Biowest), un 1% de P/S y 20 UI/mL de interleuquina-2 (IL-2) (Miltenyi Biotec), mantenidas en un incubador a 37°C y 5% de CO2. Para favorecer el crecimiento celular, estas se estimularon vía TCR con T Cell TransAct™ (Miltenyi Biotec), una nanomatriz polimérica anti-CD3/anti-CD28. Las células se pasaron entre 2 y 3 veces por semana, manteniendo una densidad celular de 1*106 células/mL.Primary T cells were obtained from mobilized peripheral blood from a healthy donor. Starting from peripheral blood, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gradient centrifugation, using Lymphosep (Biowest), a specific medium for separating lymphocytes. Centrifugation was carried out for 30 minutes at 400g without brake or acceleration. Successive washes were performed, and T lymphocytes were isolated from the entire cell cocktail using the MACSxpress® Pan T Cell Isolation kit ( Miltenyi Biotec), which consists of a mixture of antibodies against most PBMC surface markers except for CD3, conjugated with magnetic microspheres, thus constituting a magnetic separation method based on the negative depletion of all cell types except T cells (CD3+). Isolated T cells were cultured in TexMACSTM medium (Miltenyi Biotec), a T cell-specific medium, supplemented with 5% human serum AB (Biowest), 1% P/S, and 20 IU/mL interleukin-2. (IL-2) (Miltenyi Biotec), kept in an incubator at 37°C and 5% CO2. To promote cell growth, they were stimulated via TCR with T Cell TransAct™ (Miltenyi Biotec), an anti-CD3/anti-CD28 polymeric nanomatrix. Cells were passaged 2-3 times per week, maintaining a cell density of 1*106 cells/mL.

4. Producción de vectores lentivirales4. Production of lentiviral vectors

La producción de vectores se realizó utilizando las células HEK-293T como células empaquetadoras. Se sembraron las células en placas de 6 pocillos (Life Sciences) presentando una confluencia mayor del 90%.Vector production was performed using HEK-293T cells as packaging cells. Cells were seeded in 6-well plates ( Life Sciences) showing greater than 90% confluency.

a. Transfeccióna. transfection

Se utilizó un sistema de empaquetamiento de segunda generación, lo que implica la utilización de 3 plásmidos derivados del genoma lentiviral: 1) Plásmido de transferencia (B2M-SEWP y B2M-CAR); 2) Plásmido empaquetador (pCMV8.9) del virus del VIH, y 3) Plásmido de envuelta (pMD2.G) VSV-G, que presenta el mayor rango de infectividad. Se mantuvo entre ellos la proporción 10:7:3 respectivamente. El agente transfectante elegido fue la LipoD293TM (SigmaGen Laboratories). La transfección se realizó en DMEM sin suero y, 5 horas post-transfección, se realizó un cambio de medio con Optimen (Gibco) para eliminar la toxicidad a largo plazo de VSV-G y facilitar la posterior concentración.A second generation packaging system was used, which implies the use of 3 plasmids derived from the lentiviral genome: 1) Transfer plasmid (B2M-SEWP and B2M-CAR); 2) Packaging plasmid (pCMV8.9) of the HIV virus, and 3) Envelope plasmid (pMD2.G) VSV-G, which has the highest range of infectivity. The ratio 10:7:3 was maintained between them, respectively. The transfectant agent chosen was LipoD293TM (SigmaGen Laboratories). The transfection was carried out in DMEM without serum and, 5 hours post-transfection, a medium exchange with Optimen (Gibco) to eliminate the long-term toxicity of VSV-G and facilitate subsequent concentration.

b. Recogida del sobrenadante viral y concentraciónb. Collection of viral supernatant and concentration

Se realizaron 3 recogidas, la primera se realizó 24 horas después de la transfección, la segunda 48 horas después y la tercera, 72 horas después. Las partículas virales presentes en el sobrenadante se recogieron utilizando jeringas estériles de 5 mL (Terumo), y se filtró utilizando filtros con un tamaño de poro de 0,45 ^m (Life Sciences). La concentración de las partículas virales se llevó a cabo utilizando filtros Amicon Ultra - 15 de 100 kD (Milipore), mediante centrifugación a 1800g a 4°C. Los vectores se almacenaron a -80°C.Three harvests were made, the first 24 hours after transfection, the second 48 hours later and the third 72 hours later. Viral particles present in the supernatant were collected using 5 mL sterile syringes (Terumo), and filtered using 0.45 µm pore size filters (Life Sciences). The concentration of the viral particles was carried out using 100 kD Amicon Ultra-15 filters (Milipore), by means of centrifugation at 1800g at 4°C. Vectors were stored at -80°C.

c. Titulaciónc. Title

La titulación de los vectores (unidades de transducción/mililitro; UT/mL) se realizó por cálculo de partículas eficientes mediante citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences).The titration of the vectors (transduction units/milliliter; TU/mL) was performed by calculating efficient particles by flow cytometry (FACS Canto II, BD Biosciences).

5. Transducción celular5. Cellular transduction

En el caso de los vectores GFP, realizó la transducción de 5 tipos celulares: Jurkat, Namalwa, HEK-293T, BxPC-3 y células T primarias. Respecto a las células Jurkat y Namalwa, se plaqueron 100.000 células por pocillo, en placas de 48 pocillos y se añadieron los vectores virales. Para mejorar la eficacia de transducción, las células se espinocularon. La espinoculación es un proceso de centrifugación a 800g, 32°C durante 1 hora para favorecer el contacto célula - vector. En el caso de las células 293T, se plaquearon también 100.000 células. Respecto a las células BxPC-3, se plaqueron 50.000 células por pocillo una placa de 24 pocillos. Finalmente, en el caso de las células T, se plaquearon 200.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y, previo a la transducción, se activaron vía TCR utilizando T Cell TransAct™ durante 24h. La transducción se realizó mediante espinoculación. En todos los casos, 5 horas post - transducción se realizó un cambio de medio y, 3 días después, se determinó el porcentaje de células transducidas mediante citometría de flujo.In the case of GFP vectors, it transduced 5 cell types: Jurkat, Namalwa, HEK-293T, BxPC-3 and primary T cells. Regarding the Jurkat and Namalwa cells, 100,000 cells per well were plated in 48-well plates and the viral vectors were added. To improve transduction efficiency, cells were spinoculated. Spinoculation is a centrifugation process at 800g, 32°C for 1 hour to favor cell-vector contact. In the case of 293T cells, 100,000 cells were also plated. Regarding BxPC-3 cells, 50,000 cells per well were plated in a 24-well plate. Finally, in the case of T cells, 200,000 cells per well were plated in 96-well plates and, prior to transduction, they were activated via TCR using T Cell TransAct™ for 24h. Transduction was performed by spinoculation. In all cases, 5 hours post-transduction, a medium change was performed and, 3 days later, the percentage of transduced cells was determined by flow cytometry.

En el caso de los vectores CAR, la transducción se llevó a cabo en células Jurkat y en células T primarias, siguiendo el mismo procedimiento.In the case of CAR vectors, transduction was carried out in Jurkat cells and in primary T cells, following the same procedure.

6. RT-PCR 6. RT-PCR

Para realizar esta técnica, se partió de aproximadamente 700.000 células T de las cual se extrajo ARN mensajero con Trizol (Ambion). Una vez obtenido el ARN mensajero, se llevó a cabo la retrotranscripción del mismo, poniendo la misma cantidad de ARNm en todas las muestras. Tras esto, se diluyó el ADN complementario (ADNc), y se llevó a cabo la PCR en tiempo real de todas las muestras por duplicado, utilizando los cebadores adjuntados en la Tabla 1.To carry out this technique, we started with approximately 700,000 T cells from which messenger RNA was extracted with Trizol (Ambion). Once the messenger RNA was obtained, its reverse transcription was carried out, placing the same amount of mRNA in all the samples. After this, the complementary DNA (cDNA) was diluted, and real-time PCR was carried out on all samples in duplicate, using the primers attached in Table 1.

7. Citometría de flujo7. Flow cytometry

Para los experimentos de citometría de flujo, se tiñeron entre 20.000 y 50.000 células con diferentes anticuerpos, que se adjuntan en la Tabla 2.For the flow cytometry experiments, between 20,000 and 50,000 cells were stained with different antibodies, which are attached in Table 2.

Tabla 2 | Anticuerpos utilizados previo a la lect ^t ura por citometría de flujo.Table 2 | Antibodies used prior to reading by flow ^cytometry .

8. Análisis estadístico de datos8. Statistical data analysis

El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo utilizando GraphPad Prism 6, utilizando la media, la desviación estándar asociada a la media (SEM), y el test T de Student para datos no pareados, con dos colas y con una significancia *** para p<0,001.Statistical analysis of the data was carried out using GraphPad Prism 6, using the mean, the standard deviation associated with the mean (SEM), and the Student's t-test for unpaired data, with two tails and with a significance ** * for p<0.001.

ResultadosResults

Diseño in sílico de los promotores quiméricos In silico design of chimeric promoters

El primer paso para la consecución de este trabajo fue diseñar los promotores que utilizaríamos posteriormente para regular la expresión de eGFP y del CAR.The first step to achieve this work was to design the promoters that we would later use to regulate the expression of eGFP and CAR.

P-2 microglobulina (B2M), se ha visto que puede presentar un patrón de expresión similar al del TCR. B2M es una proteína estructural del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I, presente en todas las células nucleadas. Su presencia es fundamental para la estabilidad de la unión antigénica a este complejo, mientras que su ausencia hace que no se puedan desarrollar las células T CD8+. P-2 microglobulin (B2M), it has been seen that it can present an expression pattern similar to that of the TCR. B2M is a major histocompatibility complex (MHC) class I structural protein, present in all nucleated cells. Its presence is essential for the stability of antigenic binding to this complex, while its absence means that CD8+ T cells cannot develop.

Los promotores derivados de B2M se diferencian en la presencia o ausencia de la región TetO, así como en la posición del enhancer definido por Ensembl.B2M-derived promoters differ in the presence or absence of the TetO region, as well as in the position of the enhancer defined by Ensembl.

Tras esto, clonamos los promotores en esqueletos lentivirales GFP y seleccionamos las construcciones para clonarlos en esqueletos lentivirales que contienen el CAR (Fig. 1A).Following this, we cloned the promoters into GFP lentiviral backbones and selected constructs to clone into lentiviral backbones containing the CAR (Fig. 1A).

Generación de células T GFP+ con los promotores quiméricosGeneration of GFP+ T cells with chimeric promoters

Una vez tenemos nuestros promotores clonados en un esqueleto lentiviral GFP+, generamos vectores lentivirales para poder transducir células T primarias, lo que nos permitirá generar células T que expresen nuestro gen reportero eGFP bajo cada uno de los promotores previamente diseñados.Once we have our promoters cloned in a GFP+ lentiviral backbone, we generate lentiviral vectors to be able to transduce primary T cells, which will allow us to generate T cells that express our eGFP reporter gene under each of the previously designed promoters.

Generamos los vectores lentivirales siguiendo el procedimiento explicado con anterioridad y, paso previo a transducir células T, se calculó el título de nuestros vectores. Una vez titulados nuestros vectores virales, seguimos el mismo proceso para transducir células T primarias previamente aisladas, partiendo de una población de células T (CD3+) mayor del 70%.We generated the lentiviral vectors following the procedure explained above and, prior to transducing T cells, the titer of our vectors was calculated. Once our viral vectors have been titrated, we follow the same process to transduce previously isolated primary T cells, starting from a population of T cells (CD3+) greater than 70%.

B2M mimetiza el patrón de expresión del TCRB2M mimics the expression pattern of the TCR

Para estudiar la expresión de GFP bajo el control de los promotores derivados de B2M, se estudiaron tanto la proteína como el ARN mensajero. Así, generamos las cinéticas de proteína y de mensajero de GFP y CD3.To study GFP expression under the control of B2M-derived promoters, both protein and messenger RNA were studied. Thus, we generated the protein and messenger kinetics of GFP and CD3.

Los datos se analizaron a partir de la mediana de fluorescencia tanto de GFP como del fluorocromo conjugado con el anticuerpo que va dirigido frente a CD3 en los diferentes puntos temporalesThe data was analyzed from the median fluorescence of both GFP and the fluorochrome conjugated with the antibody that is directed against CD3 at the different time points.

Respecto a los promotores derivados de B2M, a nivel de proteína, podemos observar en la que en B2M Enh5’, la expresión de GFP replica fielmente la expresión fisiológica de CD3. En el caso de B2M, GFP aumenta su expresión en el intervalo de 0 a 8 horas, al contrario que en el caso de CD3. Curiosamente, los vectores B2M TetO, donde la única diferencia con B2M es la inserción del operón TetO a 10 pb del sitio de inicio de transcripción, el patrón de expresión de GFP es más similar al de CD3, al observarse ese incremento de expresión a las 8 horas.Regarding the promoters derived from B2M, at the protein level, we can observe that in B2M Enh5', the expression of GFP faithfully replicates the physiological expression of CD3. In the case of B2M, GFP increases its expression in the interval from 0 to 8 hours, unlike in the case of CD3. Curiously, the B2M TetO vectors, where the only difference with B2M is the insertion of the TetO operon 10 bp from the transcription start site, the expression pattern of GFP is more similar to that of CD3, as this increase in expression is observed at 8 hours.

A nivel de ARN mensajero se observa un patrón muy parecido al de proteína, siendo el vector B2M Enh5’ el que mejor mimetiza el patrón de CD3, seguido del promotor B2M TetO. Aunque en ambos casos, la bajada de expresión de eGFP a las 8 horas es más pronunciada que la observada en CD3. A partir de las 8 horas, el patrón entre eGFP y CD3 es prácticamente idéntico.At the messenger RNA level, a pattern very similar to that of protein is observed, with the B2M Enh5' vector being the one that best mimics the CD3 pattern, followed by the B2M TetO promoter. Although in both cases, the decrease in eGFP expression at 8 hours is more pronounced than that observed in CD3. After 8 hours, the pattern between eGFP and CD3 is practically identical.

El fenotipo de las células T GFP+ cambia con el tiempo hacia un estado de mayor diferenciación.The phenotype of GFP+ T cells changes over time to a more differentiated state.

De manera paralela al estudio de la cinética de expresión de GFP bajo el control de los promotores quiméricos en las células T, se realizó un estudio de la evolución temporal del fenotipo celular, utilizando para ello dos anticuerpos, uno frente a CD62L, y otro frente a CD45RA, una isoforma de CD45 que conserva los 3 exones, por lo que presenta el mayor peso molecular de todas las isoformas. La expresión selectiva en membrana de estos marcadores nos permite distinguir 4 fenotipos propios de células T: células T troncales memoria, células T memoria central, células T efectoras y células T efectoras memoria.Parallel to the study of the expression kinetics of GFP under the control of chimeric promoters in T cells, a study of the temporal evolution of the cell phenotype was carried out, using two antibodies, one against CD62L, and another against CD62L. to CD45RA, an isoform of CD45 that preserves the 3 exons, which is why it has the highest molecular weight of all the isoforms. The selective expression of these markers in the membrane allows us to distinguish 4 typical T cell phenotypes: memory stem T cells, central memory T cells, effector T cells and memory effector T cells.

En el caso del promotor B2M la población celular a 7 días sigue siendo en gran medida troncal memoria.In the case of the B2M promoter, the cell population at 7 days is still largely memory trunk.

Generación de células T CAR+ con el promotor quimérico B2M.Generation of CAR+ T cells with the B2M chimeric promoter.

Una vez obtenidos los resultados utilizando GFP como transgén, clonamos el promotor BM2 en el vector CAR. Una vez clonado el promotor en el esqueleto lentiviral del CAR de tercera generación, y generados los vectores lentivirales tal y como se detalla en la sección materiales y métodos, se transdujeron las células T con los vectores CAR. Once the results were obtained using GFP as a transgene, we cloned the BM2 promoter in the CAR vector. Once the promoter had been cloned in the lentiviral backbone of the third generation CAR, and the lentiviral vectors had been generated as detailed in the materials and methods section, the T cells were transduced with the CAR vectors.

En esta construcción (Fig. 1 y Fig. 2), los LTRs permiten la integración. EGFRt codifica para el receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado, que permite deplecionar las células CAR+ en caso de ser necesario (utilizando un anticuerpo monoclonal, cetuximab) y permite la detección indirecta del CAR utilizando un anticuerpo frente a este EGFRt conjugado con un fluorocromo. T2A es un péptido de autoescisión, que permite cortar un péptido largo en dos péptidos cortos (pues el CAR y EGFRt se codifican juntos como una proteína recombinante, y se separan gracias a este mecanismo). WPRE es un elemento de regulación post-transcripcional que potencia tanto el título del vector viral como la expresión del transgén.In this construct (Fig. 1 and Fig. 2), the LTRs allow integration. EGFRt encodes for the truncated epidermal growth factor receptor, which allows CAR+ cells to be depleted if necessary (using a monoclonal antibody, cetuximab) and allows indirect detection of CAR using an antibody against this EGFRt conjugated with a fluorochrome. T2A is a self-cleaving peptide, which allows a long peptide to be cut into two short peptides (because CAR and EGFRt are encoded together as a recombinant protein, and are separated by this mechanism). WPRE is a post-transcriptional regulatory element that enhances both viral vector titer and transgene expression.

Se utilizaron células T frescas, procesadas por inmunoselección magnética negativa a partir de sangre periférica movilizada de un donante sano. La transducción se llevó a cabo mediante espinoculación, utilizando 50 ^L de vector en 100.000 células T. La expresión del CAR se determinó 72 horas post - transducción. Con el promotor B2M, se observó un porcentaje de expresión del CAR del 18%. Se utilizó CAR3G (el vector lentiviral original en el que el CAR se expresa bajo el control del promotor EF1-a) como control positivo de tinción y de transducción. Las células NTD se utilizaron como control negativo. Fresh T cells processed by negative magnetic immunoselection from mobilized peripheral blood from a healthy donor were used. Transduction was carried out by spinoculation, using 50 ^L of vector in 100,000 T cells. CAR expression was determined 72 hours post-transduction. With the B2M promoter, a percentage of CAR expression of 18% was observed. CAR3G (the original lentiviral vector in which CAR is expressed under the control of the EF1-a promoter) was used as a positive control for staining and transduction. NTD cells were used as a negative control.

Claims

1. A polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 1, or that has an identity with SEQ ID NO: 1 of at least:

a. 80%

b. 85%

c. 90%

d. 95%

and. 99%

2. A genetic construct (B2MEWP_1) comprising the polynucleotide according to claim 1.

3. The genetic construct according to claim 2 which is a viral vector.

4. The genetic construct according to any of claims 2-3, which is a lentiviral vector.

5. The genetic construction or the vector according to any of claims 2 4, wherein the promoter, with a nucleotide sequence as described in claim 1, is operatively linked to CAR to drive its expression, and in which CAR comprises the at least one extracellular ligand-binding domain, one transmembrane domain, and at least one intracellular signaling domain

6. A cell comprising a polynucleotide according to claim 1, or a genetic construct according to any of claims 2-5.

7. The cell according to claim 6, which is an immune cell.

8. A cell or the immune cell according to any of claims 6-7, which expresses on the cell surface membrane a CAR comprising at least one extracellular ligand-binding domain and at least one intracellular signaling domain, wherein said immune cell is transduced with the genetic construct or the vector according to any of claims 2-4.

9. The immune cell according to claim 8 derived from inflammatory lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T lymphocytes or helper lymphocytes.

10. The cell according to any of claims 7 to 9, wherein the cells are recovered from donors.

11. The polynucleotide according to claim 1, the genetic construct according to any of claims 2-4, or the cell according to any of claims 5-10, for use in therapy.

12. The polynucleotide according to claim 1, the genetic construct according to any of claims 2-4, or the cell according to any of claims 5-10, for use in the treatment of cancer.

13. The polynucleotide, genetic construct, or cell for use according to claim 12, wherein the cancer is selected from the list consisting of neoplasms, B-cell neoplasms, lymphoma, leukemia, and/or myeloma.