ES2891701B2 - Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido - Google Patents

Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido Download PDF

Info

Publication number
ES2891701B2
ES2891701B2 ES202030756A ES202030756A ES2891701B2 ES 2891701 B2 ES2891701 B2 ES 2891701B2 ES 202030756 A ES202030756 A ES 202030756A ES 202030756 A ES202030756 A ES 202030756A ES 2891701 B2 ES2891701 B2 ES 2891701B2
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
chips
chip
nanoparticles
suspended
molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES202030756A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2891701A1 (es
Inventor
Plaza Jose Antonio Plaza
Antonoff Juan Pablo Agusil
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority to ES202030756A priority Critical patent/ES2891701B2/es
Priority to EP21758722.9A priority patent/EP4183740A1/en
Priority to PCT/ES2021/070539 priority patent/WO2022018314A1/es
Priority to US18/017,009 priority patent/US20230294087A1/en
Priority to JP2023504343A priority patent/JP2023534727A/ja
Publication of ES2891701A1 publication Critical patent/ES2891701A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2891701B2 publication Critical patent/ES2891701B2/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/0086—Preparation of sols by physical processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/20—After-treatment of capsule walls, e.g. hardening
    • B01J13/22—Coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03F—PHOTOMECHANICAL PRODUCTION OF TEXTURED OR PATTERNED SURFACES, e.g. FOR PRINTING, FOR PROCESSING OF SEMICONDUCTOR DEVICES; MATERIALS THEREFOR; ORIGINALS THEREFOR; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED THEREFOR
    • G03F7/00—Photomechanical, e.g. photolithographic, production of textured or patterned surfaces, e.g. printing surfaces; Materials therefor, e.g. comprising photoresists; Apparatus specially adapted therefor
    • G03F7/0005—Production of optical devices or components in so far as characterised by the lithographic processes or materials used therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso para la obtención de chips Janus, doble planares suspendidos de SU-8, dichos chips Janus, doble planares suspendidos de SU-8 v su arreglo suspendido
La invención trata de un proceso para la obtención de chips Janus, doble planares suspendidos de SU-8 mediante fotolitografía de SU-8 para crear una disposición de chips de SU-8 ordenados sobre un sustrato y litografía blanda para crear una disposición de plano impreso o un arreglo planar impreso sobre cada chip, que comprende etapas para formar una membrana solidificada que se despega y se disuelve en medio acuoso. Adicionalmente, la invención trata de los chips Janus, doble planares suspendidos de SU-8 y un arreglo suspendido de al menos dos chips Janus, doble planares suspendidos de SU-8 diferentes. Finalmente, la invención trata de chips de códigos de barras y a dispositivos sensores que comprenden dichos chips Janus, doble planares suspendidos de SU-8 o dicho arreglo suspendido.
ESTADO DEL ARTE
Las herramientas (bio)moleculares miniaturizadas avanzadas se han beneficiado de los mecanismos de diseño dinámico basados en la adaptación de sus anisotropías físicas y químicas seleccionadas. Principalmente, las micropartículas consolidan estos rasgos mediante la personalización anisotrópica. Su diseño determina la funcionalidad, pero su fabricación requiere un compromiso entre sus atributos físicos, la modificación química prevista, la biocompatibilidad y el rendimiento [Misra, A. C. y Lahann, J. Progress of Multicompartmental Partióles for Medical Applications. Adv. Healthc. Mater. 7, 1-9 (2018)].
Se han dedicado grandes esfuerzos a construir micropartículas no esféricas para aumentar el dominio anisotrópico físico que abarca el tamaño y la morfología a medida, la codificación de formas y la topografía en 3D compleja. Se han desarrollado métodos de fabricación secuencial como la litografía de gotas y flujo, microfluídica, centrifugación, electrohidrodinámica y litografía de dos fotones para fabricar micropartículas con características físicas seleccionadas. Sin embargo, la combinación de todos estos rasgos físicos o incluso de otras propiedades personalizadas en una sola micropartícula para aumentar la funcionalidad, se ve obstaculizada por la disponibilidad limitada de los métodos de fabricación para incorporar anisotropías físicas complementarias.
Alternativamente, la investigación también se ha centrado en la anisotropía química. Esta anisotropía extendida se puede implementar con la adición de subdivisiones durante la fabricación, aunque está limitada por el proceso, o con funcionalización posterior que puede ser obstruida por la naturaleza estocástica de las micropartículas suspendidas en una solución reactiva o limitada por los sitios de reacción química ortogonal disponibles presentes en la superficie de las micropartículas. Se han utilizado soluciones imaginativas para fabricar múltiples micropartículas o chips subdivididos, que ofrecen un enfoque atractivo en los campos de la codificación y la lucha contra la falsificación, pero su uso principal se ha centrado en aplicaciones biomédicas y de bioingeniería. Sin embargo, la combinación de propiedades personalizadas adicionales para aumentar la funcionalidad en una sola micropartícula está limitada por las vías reactivas disponibles para incorporar químicas ortogonales.
Aunque la consolidación de estas tecnologías ha demostrado grandes avances en el campo de las micropartículas, la constante compensación entre anisotropías físicas y entre anisotropías químicas y su combinación limita la extraordinaria biblioteca de posibles micropartículas personalizadas, agravada aún más con la miniaturización. Por tanto, es necesario desarrollar nuevos procesos para la obtención de micropartículas no esféricas con tamaño y morfología a medida y con propiedades/funcionalidad personalizadas.
DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN
El problema a resolver mediante el proceso de la invención es proporcionar un proceso versátil para la obtención de chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8 donde moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas, están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 por medio de un reticulante de silano específico. Dicho proceso permite la miniaturización controlada en dimensiones físicas (1 pm lateral, 0,5 pm vertical) y patrones moleculares por debajo de 1 pm2. Siguiendo el proceso de la presente invención, se puede lograr un dispositivo sensor miniaturizado con una forma y tamaño personalizados, junto con capacidades sensoras a microescala. Por tanto, dicho proceso es de interés para la fabricación de
• Dispositivos sensores, por ejemplo, detección de cambios de pH
• Dispositivos sensores, por ejemplo, reconocimiento codificado de ADN y reconocimiento selectivo de ADN
• Creación de bibliotecas de códigos de barras
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un proceso para la obtención de chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8 (en este documento el proceso de la invención) que comprende:
• una pluralidad de chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana,
• y moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas, donde dichas moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8, y donde
• las moléculas se seleccionan preferiblemente de la lista que consiste en cromóforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo y fluoróforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo,
• las biomoléculas se seleccionan preferiblemente de una lista que consiste en carbohidratos, proteínas, anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos, y
• las nanopartículas se seleccionan preferiblemente de entre nanopartículas basadas en carbono que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas metálicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas cerámicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas poliméricas que comprenden un grupo funcional amina y nanopartículas semiconductoras que comprenden un grupo funcional amina;
dicho proceso caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) definir la forma y el tamaño de los chips de SU-8 mediante fotolitografía de SU-8; formando así una disposición de chips de SU-8 ordenados sobre un sustrato, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana y donde la segunda superficie plana está en contacto directo con el sustrato;
b) funcionalizar, mediante litografía blanda, la primera superficie plana de cada chip SU-8 obtenido en la etapa (a) utilizando un reticulante de silano; formando así una primera superficie plana reactiva en cada chip de SU-8;
c) injertar moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas sobre la primera superficie plana reactiva de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (b) mediante litografía blanda;
d) verter un medio de montaje encima de los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (c) y dejar que solidifique, embebiendo así los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (c) en el medio de montaje y formando una membrana solidificada sobre el sustrato;
e) despegar la membrana solidificada obtenida en la etapa (d) (con los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (c) embebidos) del sustrato, desbloqueando así la segunda superficie plana de cada chip de SU-8;
f) funcionalizar, mediante litografía blanda, la segunda superficie plana desbloqueada de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (e) utilizando un reticulante de silano; formando así una segunda superficie reactiva en cada chip de SU-8;
g) injertar moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas sobre la segunda superficie reactiva de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (f) mediante litografía blanda;
h) disolver la membrana solidificada con los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (g) en un medio acuoso; y
i) recoger los chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8 obtenidos en la etapa (h) mediante centrifugación.
La etapa (a) del proceso de la invención se refiere a definir la forma y el tamaño de los chips de SU-8 mediante fotolitografía de SU-8; formando así una disposición de chips de SU-8 ordenados sobre un sustrato, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana, donde la segunda superficie plana está en contacto directo con el sustrato y donde el sustrato está bloqueando la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
El término "chip doble planar de SU-8" se refiere aquí a un chip de SU-8 que tiene una primera superficie plana (arriba) y una segunda superficie plana (abajo).
El término "fotolitografía de SU-8" se refiere a una técnica de litografía por exposición a UV para hacer patrones en una capa recubierta por centrifugación (de SU-8 con la finalidad de crear una disposición de chips de SU-8 ordenados sobre un sustrato.
El término "disposición de chips de SU-8 ordenados" se refiere a una disposición ordenada o conjunto ordenado de chips de SU-8 sobre un sustrato.
La fotolitografía de SU-8 permite la fabricación de chips de SU-8 con formas y tamaños hechos a medida en un campo dominado por micropartículas poliméricas esféricas, donde el único parámetro que se puede hacer a medida es el radio de las esferas. En la presente invención, se pueden transferir diseños con características tan pequeñas de hasta 1 pm.
En una realización preferida del proceso de la presente invención, la etapa (a) puede repetirse obteniendo así una disposición de chips de SU-8 ordenados de doble altura sobre el sustrato.
El término "disposición de chips de SU-8 ordenados de doble altura" se refiere aquí a chips de SU-8 que comprenden al menos dos capas de SU-8 superpuestas de diferente forma y tamaño (características físicas).
La etapa (b) del proceso de la invención se refiere a funcionalizar, mediante litografía blanda, la primera superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (a) utilizando un reticulante de silano; formando así una primera superficie plana reactiva en cada chip de SU-8, donde el reticulante de silano comprende dos grupos funcionales:
• un grupo funcional de silano y
• un grupo funcional seleccionado de la lista que consiste en aminas primarias o secundarias, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o grupos metacriloxi.
El término “litografía blanda” se refiere a técnicas para imprimir moléculas, biomoléculas, nanopartículas, etc. mediante el contacto de un sello elastomérico recubierto por dichas moléculas, biomoléculas, nanopartículas, etc. con una superficie. En la presente invención se utilizan técnicas de litografía blanda para imprimir moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas sobre la primera y la segunda superficie plana de chips doble planares de SU8. En la presente invención se prefieren técnicas de litografía blanda tales como la impresión por microcontacto o la litografía con pluma polimérica.
El término "reticulante de silano" se refiere aquí a una molécula heterobifuncional con dos grupos funcionales:
• un grupo funcional silano que reacciona espontáneamente para formar enlaces covalentes con la superficie de los chips de SU-8 y
• un grupo funcional seleccionado de la lista que comprende grupos aminas primarias o secundarias, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o metacriloxi que forman un enlace covalente con las moléculas, biomoléculas o nanopartículas.
La etapa (c) del proceso de la invención se refiere al injerto de moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas sobre la primera superficie plana reactiva de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (b) mediante litografía blanda.
El término "moléculas" se refiere aquí a cromóforos o fluoróforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo que pueden injertarse sobre una superficie reactiva por medio de un reticulante de silano. Mientras que el grupo funcional silano reacciona espontáneamente para formar enlaces covalentes con la superficie de los chips de SU-8, el grupo funcional seleccionado de la lista que comprende grupos aminas primarias o secundarias, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o metacriloxi, forma un enlace covalente con los grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo presentes en los cromóforos o fluoróforos modificados. De ese modo, las moléculas se unen covalentemente sobre la primera superficie plana reactiva de cada chip de SU-8. El injerto de fluoróforos es de interés como sensor químico, como, por ejemplo, cambiar la intensidad de emisión frente al pH, o para los códigos de barras utilizando los fluoróforos como bits, o para obtener imágenes como seguimiento de las partículas.
El término "biomoléculas" se refiere aquí a carbohidratos como azúcares y almidones, proteínas y anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos como ADN y ARN. Dichas biomoléculas se pueden injertar en una superficie reactiva que comprende mediante el reticulante de silano: Mientras que el grupo funcional silano reacciona espontáneamente para formar enlaces covalentes con la superficie de los chips de SU-8, el grupo funcional seleccionado de la lista que consiste grupos amino primario o secundario, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o metacriloxi, forman un enlace covalente con las aminas presentes en las biomoléculas o biomoléculas modificadas con amina, por ejemplo oligos modificados con amina. De ese modo, las biomoléculas se unen covalentemente a la primera superficie plana reactiva de cada chip de SU-8. El injerto de biomoléculas es de interés en ensayos de proteómica y genómica.
El término "nanopartículas" se refiere aquí a nanopartículas modificadas con amina. Ejemplos son nanopartículas basadas en carbono como fullerenos y nanotubos de carbono, nanopartículas metálicas hechas de precursores metálicos, nanopartículas cerámicas hechas de sólidos no metálicos, nanopartículas poliméricas y nanopartículas semiconductoras como puntos cuánticos (Quantum Dots), cada una de las cuales comprende un grupo funcional amina, que puede injertarse sobre una superficie reactiva mediante el reticulante de silano. Mientras que el grupo funcional silano reacciona espontáneamente para formar enlaces covalentes con la superficie de los chips de SU-8, el grupo funcional seleccionado de la lista que consiste en grupos de aminas primarias o secundarias, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o metacriloxi, forma un enlace covalente con la amina presente en la nanopartícula modificada con amina. De este modo, las nanopartículas se unen covalentemente sobre la primera superficie plana reactiva de cada chip de SU-8. El injerto de nanopartículas es de interés para la obtención de imágenes de diagnóstico, códigos de barras, para aumentar la reactividad superficial, la catálisis o la creación de sitios de nucleación.
Una ventaja del proceso de la invención es que la funcionalización y el injerto en la primera superficie plana del chip de SU-8 no interfiere con la funcionalización y el injerto de la segunda superficie plana del chip de SU-8. Aquí se evita la química ortogonal.
En una realización preferida del proceso de la invención se pueden repetir las etapas (b) y (c).
Además, los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (c) se pueden aclarar y lavar para eliminar el exceso de moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de los mismos sin perder la integridad de cada chip de SU-8.
Las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la primera superficie plana de cada chip SU-8 obtenido en la etapa (c) pueden formar
• una primera disposición de plano impreso
• oun primer arreglo planar
El término "primera disposición de plano impreso" se refiere a moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la primera superficie plana de cada chip de SU-8 que solo comprende un tipo de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la primera superficie plana de cada chip de SU-8.
El término "primer arreglo planar" se refiere a moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la primera superficie plana de cada chip de SU-8 que comprende la combinación de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la primera superficie plana de cada chip de SU-8.
En una realización preferida del proceso de la invención, las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (c) comprenden solo un tipo de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8; formando así una primera disposición de plano impreso.
En otra realización preferida del proceso de la invención, las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (c) comprenden la combinación de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8; formando así primer arreglo planar.
Es una ventaja para el proceso de la invención ya que la funcionalización de una superficie plana del chip de SU-8 mediante un reticulante de silano específico, como un reticulante de epoxisilano, podría resultar en el injerto de la combinación de, por ejemplo, proteínas, sondas de ADN y puntos cuánticos en una sola superficie plana de dicho chip de SU-8. La funcionalización posterior de la otra superficie plana del chip de SU-8 de la misma manera es, por lo tanto, químicamente independiente de las anteriores.
La litografía suave de las etapas (b) y (c) puede cubrir toda la primera superficie plana de cada chip de SU-8 a la vez. En una realización preferida de la presente invención, la litografía blanda de las etapas (b) y (c) se realiza en forma de patrones de líneas y/o puntos. La litografía suave de las etapas(b) y (c) permite la obtención de un patrón de línea y/o puntos preciso y reproducible, que es de interés en aplicaciones de códigos de barras y en multiplexado.
El término "código de barras " es un método de representar datos en una forma visual y legible por una máquina. Los códigos de barras que representan datos mediante la variación de los anchos y espacios de las líneas paralelas se denominan comúnmente lineales o unidimensionales (1D) y se pueden escanear mediante escáneres ópticos especiales, llamados lectores de códigos de barras. Las variantes bidimensionales (2D) que utilizan rectángulos, puntos, hexágonos y otros patrones geométricos se denominan códigos de matriz o códigos de barras 2D, aunque no utilizan barras como tales. Los códigos de barras 2D se pueden leer o deconstruir utilizando software de aplicación en dispositivos móviles con cámaras incorporadas, como teléfonos inteligentes.
La etapa (d) del proceso de la invención se refiere a verter un medio de montaje sobre la disposición de los chips de SU-8 ordenados injertados obtenidos en la etapa (c) y dejar que solidifique, embebiendo así los chips de SU-8 ordenados injertados obtenidos en la etapa (c) en el medio de montaje y formando una membrana solidificada sobre el sustrato.
El término "medio de montaje" se refiere aquí a una solución polimérica no reactiva en fase líquida que solidifica a temperatura ambiente y que posteriormente se puede disolver en medio acuoso sin dañar los chips funcionalizados químicamente. Un ejemplo de medio de montaje es Fluoromount (TM). Otro ejemplo es una solución de alcohol polivinílico al 10%, glicerol al 5% en tampón Tris 25 mM pH 8,7.
La etapa (e) del proceso de la invención se refiere a despegar la membrana solidificada obtenida en la etapa (d) del sustrato, desbloqueando así la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
La etapa (f) y la etapa (g) de la presente invención se refieren a la funcionalización y al injerto de la segunda superficie plana desbloqueada de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (e) de la misma manera que se realizó para la primera superficie de los chips de SU-8. El reticulante de silano y las moléculas, biomoléculas y nanopartículas preferidas son las mismas que las mencionadas anteriormente para la etapa (b).
La etapa (f) y la etapa (g) son independientes de la química de la superficie plana superior de los chips (la primera superficie plana de cada chip de SU-8) y la funcionalización química de la superficie plana inferior (segunda superficie plana de cada chip de SU-8) no daña la funcionalización anterior de la superficie plana superior.
En particular, la etapa (f) del proceso de la presente invención se refiere a funcionalizar, mediante litografía blanda, la segunda superficie plana desbloqueada de cada chip de SU-8 obtenida en la etapa (e) usando un reticulante de silano; formando así una segunda superficie reactiva en cada chip de SU-8 y la etapa (g) se refiere al injerto de moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas sobre la segunda superficie reactiva de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (f) mediante litografía blanda. Como se mencionó anteriormente, las moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas se unen covalentemente sobre la segunda superficie plana reactiva de cada chip de SU-8 de esta manera.
En una realización preferida de la presente invención se pueden repetir las etapas (f) y (g)-
Las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (g) pueden formar
• una segunda disposición de plano impreso
• o un segundo arreglo planar
El término "segunda disposición de plano impreso" se refiere a moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 que solo comprende un tipo de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
El término "segundo arreglo planar" se refiere a moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 que comprende la combinación de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
En una realización preferida del proceso de la invención, las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (g) comprenden solo un tipo de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8; formando así una segunda disposición de plano impreso.
En otra realización preferida del proceso de la invención, las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (g) comprende la combinación de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8; formando así un segundo arreglo planar.
En otra realización preferida del proceso de la invención, la litografía blanda de las etapas (f) y (g) se realiza en forma de patrones de líneas y/o puntos. Como se mencionó anteriormente, las etapas de litografía suave permiten obtener líneas precisas y y/o puntos reproducibles, que es de interés en las aplicaciones de códigos de barras.
La etapa (h) de la presente invención se refiere a disolver la membrana solidificada de los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (g) en un medio acuoso; obteniendo así chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8.
El término "medio acuoso" se refiere aquí a cualquier solución basada en agua. Algunos ejemplos son agua doblemente desionizada, medio fisiológico o medio de cultivo celular.
El término "chip Janus, doble planar de SU-8" se refiere en este documento a un chip doble planar de SU-8 que tiene una primera superficie plana (arriba) y una segunda superficie plana (abajo), donde moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
El término "chip Janus, doble planar y suspendido de SU-8" se refiere en el presente documento a una suspensión de chips Janus y doble planar de SU-8 en un medio acuoso. Como se mencionó anteriormente, el término "medio acuoso" se refiere aquí a cualquier solución basada en agua. Algunos ejemplos son agua doblemente desionizada, medio fisiológico o medio de cultivo celular.
En la etapa (d) del proceso de la presente invención se obtiene una membrana solidificada posicionada sobre el sustrato; dicha membrana solidificada se despega del sustrato en la etapa (e) y se disuelve en un medio acuoso en la etapa (h). De esta manera, se evita el riesgo de daño químico durante el injerto de la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
Además, los chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8 obtenidos en la etapa (h) se recogen mediante centrifugación en la etapa (i). Estas etapas de liberación protegen la integridad física de los chips SU-8 y previenen la creación de escombros.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a chips Janus de doble plano suspendidos (aquí los chips de la invención), obtenidos preferiblemente por el proceso de la invención mencionado anteriormente, y caracterizados por que comprenden:
• una pluralidad de chips Janus, doble planar de SU-8, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana,
• y moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas donde dichas moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
En una realización preferida de los chips de la invención, las moléculas se seleccionan de la lista que consiste en cromóforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo y fluoróforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo.
En otra realización preferida de los chips de la invención, las biomoléculas se seleccionan de la lista que consiste en carbohidratos, proteínas, anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos.
En otra realización preferida de los chips de la invención, las nanopartículas se seleccionan de entre nanopartículas basadas en carbono que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas metálicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas cerámicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas poliméricas que comprenden un grupo funcional amina y nanopartículas semiconductoras que comprenden un grupo funcional amina.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un arreglo planar suspendido (aquí el arreglo suspendido de la invención) caracterizada por que comprende una mezcla de al menos dos chips Janus, doble planares y suspendidos diferentes, donde cada chip Janus, doble planares y suspendidos (chips de la invención) comprende (como se definió anteriormente):
• una pluralidad de chips doble planares de SU-8, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana,
• y moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas, donde dichas moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al proceso para la obtención del arreglo suspendido de la invención caracterizado por que comprende una etapa de mezclar al menos dos chips Janus, doble planares y suspendidos diferentes, por ejemplo, mediante recolección de las poblaciones de chips suspendidos de su contenedor inicial y agregarlasjuntas al mismo contenedor.
Un quinto aspecto de la presente invención es un chip de código de barras caracterizado por que comprende los chips Janus, doble planares y suspendidos (chips de la invención) o el arreglo suspendido mencionado anteriormente (arreglo de la invención).
En una realización preferida del chip de código de barras, dicho chip de código de barras es un chip de código de barras en color donde al menos una nanopartícula está injertada en la primera o en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 en forma de patrones de línea y/o puntos y dicha nanopartícula es un punto cuántico.
El término "chips de códigos de barras de colores" se refiere en este documento a chips con líneas o puntos de un color único o de varios que definen un código.
La principal ventaja de usar puntos cuánticos modificados con amina es su larga estabilidad de emisión y reduce el fotoblanqueo (photobleaching).
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo sensor caracterizado por que comprende los chips Janus, doble planares y suspendidos (chips de la invención) o el arreglo suspendido mencionado anteriormente (arreglo suspendido de la invención).
En una realización preferida del dispositivo sensor, dicho dispositivo sensor es un dispositivo sensor de pH donde al menos una molécula está injertada en la primera o en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8, dicha molécula es un fluoróforo sensor de pH que comprende grupos N-hidroxisuccinimidilo éster o succinimidil éster.
El término "fluoróforo sensor de pH" se refiere aquí a cualquier molécula de fluoróforo sensible donde su intensidad de emisión de fluorescencia está dictada por el pH ambiental local.
En una realización preferida del dispositivo sensor, dicho dispositivo sensor es un dispositivo sensor de ADN donde al menos una sonda de ADN está injertada en la primera o en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8, dicha biomolécula es una sonda de ADN.
El término "sonda de ADN" se refiere aquí a tramos cortos de ADN monocatenario usados para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico complementarias mediante hibridación.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la en la materia a la que pertenece esta invención. En la práctica de la presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra “comprende” y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Los materia-objetos, las ventajas y las características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia durante el examen de la descripción o que se pueden aprender mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 Esquema de preparación del chip Janus, doble planar y suspendido de SU-8 con fluoróforos, sondas de ADN, proteínas y puntos cuánticos injertados.
FIG. 2. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de chips de SU-8 sobre el sustrato identificados por su anisotropía física hecha a medida: (a) marcador de inicio de lectura, (b) relación de aspecto con ancho:largo de 1:2, 1:3 y 1:4, (c) ramificación y (d) facetado.
FIG. 3. Esquema de la vista lateral de chips doble planares, de doble altura y suspendidos de SU-8 con fluoróforos, sondas de ADN, proteínas y puntos cuánticos injertados.
FIG. 4. Microscopía electrónica de barrido de un chip de doble altura de SU-8 que consiste en un chip con marcador de inicio de lectura inicial y un chip de ramificación secundario.
FIG. 5. Imagen de microscopía óptica de chips liberados suspendidos en agua.
FIG. 6. Imágenes de microscopía de fluorescencia de una disposición de chips de SU-8 con marca de inicio de lectura injertados con los fluoróforos emisores en rojo para definir a) manchas o b) líneas en la superficie plana superior de los chips y rellenados con un fluoróforo emisor de verde para fines de visualización. c) Toda la superficie plana superior de la disposición de chips injertados con un fluoróforo emisor en rojo, d) La superficie plana superior y las superficies laterales de la disposición de chips injertados con fluoróforo emisor en rojo.
FIG. 7. a) Imágenes de microscopía de fluorescencia de una disposición de chips de SU-8 ramificados sobre el sustrato e injertados con fluoróforo emisor en rojo, b) La disposición de los chips injertados se libera y se resuspende en agua.
FIG. 8. a) Imágenes de microscopía de fluorescencia de chips de SU-8 ramificados liberados con una superficie reactiva epoxi inicial e injertados con un oligo marcado con el cromóforo TexasRed. b) Imágenes de microscopía de fluorescencia de chips de SU-8 de relación de aspecto liberados con una superficie reactiva epoxi inicial e injertados con proteína verde fluorescente (Green flourescent protein -GFP-).
FIG. 9. a) Imagen de microscopía de fluorescencia de una disposición de chips de SU-8 de relación de aspecto injertados con punto cuántico con emisión en 545 nm (QD545). b) Imagen de microscopía de fluorescencia de una población de chips de SU-8 de relación de aspecto liberados injertados con QD545. c) Imagen de microscopía de fluorescencia de una disposición de chips de SU-8 con marca de inicio de lectura injertados con QD525. d) Imagen de microscopía de fluorescencia de una población de chips de SU-8 con marca de inicio de lectura liberados injertados con QD525.
FIG. 10. a) Imagen a través del canal rojo de un microscopio de fluorescencia de chips con una marca de inicio de lectura liberados e injertados con fluoróforo emisor de rojo en la superficie plana superior y fluoróforo emisor de verde en la superficie plana inferior, b) Los mismos chips suspendidos observados con el canal fluorescente verde, c) Imagen compuesta de las imágenes anteriores, d) Imagen de canal de microscopía fluorescente roja de chips de facetado liberados e injertados con QD655, emisor en rojo, en la superficie plana superior y fluoróforo emisor en verde en la superficie plana inferior.
FIG. 11.a) Imagen de microscopía óptica de chips de SU-8 de doble altura liberados y suspendidos, b) Imagen de microscopía de fluorescencia de los mismos chips SU-8 de doble altura injertados con QD655 en el lado de ramificación y QD545 en el lado con la marca de inicio de lectura.
FIG. 12. Imágenes de microscopía de fluorescencia de chips de SU-8 ramificados suspendidos injertados con fluoróforo rojo sensible al pH a diferentes pH: a) pH 4, b) pH 7, y c) PH 9.
FIG. 13. a) Imagen de canal de microscopía fluorescente roja de chips con marca de inicio de lectura liberados injertados con QD655 en la superficie plana superior y oligo de ADN emisor de verde hibridado con la sonda injertada en la superficie plana inferior, b) Los mismos chips suspendidos observados con el canal fluorescente verde, c) Imagen compuesta de las imágenes anteriores.
FIG. 14. Imagen compuesta de los canales fluorescentes rojo y verde de chips de SU-8 de relación de aspecto suspendidos con puntos de fluoróforo emisores de rojo y verde en la superficie superior y QD545 injertado en la superficie inferior.
EJEMPLOS
FIG. 1 muestra un esquema general de la preparación de un chip Janus doble planary suspendido con fluoróforo injertado, sonda de ADN y moléculas de proteína, y nanopartículas como puntos cuánticos.
a) El chip de SU-8 (2) forma parte de una disposición de chips ordenados fabricados directamente sobre un sustrato (1) mediante litografía de SU-8. La superficie plana superior del chip (3) está funcionalizada para obtener la superficie reactiva con reticulante seleccionados (4) mediante impresión por microcontacto.
b) La disposición de chips ordenados con la superficie reactiva con reticulante seleccionados se imprime con litografía suave como impresión de microcontacto para una cobertura completa del chip o con litografía con pluma polimérica para injertar un arreglo plano de las mismas moléculas o nanopartículas (5). Alternativamente, se pueden imprimir diferentes moléculas y nanopartículas de forma independiente con procesos sucesivos de litografía de pluma polimérica para injertar un arreglo plano con moléculas o nanopartículas seleccionadas en regiones discretas del chip (5.1, 5.2, 5.3).
c) El medio de montaje (6) se vierte sobre la disposición de chips de SU-8 ordenados con la superficie reactiva con reticulantes seleccionados tanto con la cobertura completa de las mismas moléculas y nanopartículas, o con el arreglo plano de las mismas moléculas y nanopartículas, o el arreglo plano de diferentes moléculas y nanopartículas, y se deja solidificar, incrustando los chips en su matriz.
d) El medio de montaje solidificado se despega del sustrato arrastrando los chips a lo largo de su matriz, dejando al descubierto la superficie plana inferior de los chips (7). El sustrato (1) se puede desechar.
e) La superficie plana inferior expuesta (7) de los chips se imprime posteriormente con litografía suave como impresión de microcontacto para obtener una superficie reactiva con reticulantes seleccionados (8).
f) La superficie reactiva con reticulantes seleccionados (8) de la superficie plana inferior (7) de los chips de SU-8 se puede imprimir con litografía blanda como impresión de microcontacto para injertar moléculas o nanopartículas (9).
g) El medio de montaje solidificado (6) se disuelve en un medio acuoso para obtener los chips doble planares como chips Janus suspendidos.
Fabricamos chips poliméricos de varios tamaños (3 a 12 pm), espesores (0,5 a 1,2 pm) y topografías, junto con dimensiones de facetado, marcas de inicio de lectura, relación de aspecto y ramificaciones. Luego, funcionalizamos selectivamente las superficies planas superior e inferior de los chips para generar patrones en 0D, 1D, 2D y 3D de moléculas como sondas fluorescentes, biomoléculas (proteínas y cadenas de ADN) y nanopartículas como puntos cuánticos (QD) con alto resolución espectral. Es importante destacar que la funcionalización permite el uso de estrategias de química múltiple para imprimir sondas con químicas de inmovilización diferentes o que interfieren, sin la necesidad de considerar la química ortogonal. Finalmente, demostramos las capacidades sensoras y de detección de los chips Janus, doble planares y suspendidos para detectar cambios de pH en el medio ambiente y el reconocimiento selectivo de ADN.
Materiales y métodos:
Todos los sellos de impresión, para impresión por microcontacto o litografía con pluma polimérico, se fabricaron utilizando elastómero Sylgard 184 PDMS (Dow Corning) y todos los chips con la fotoresina SU-82000.5 (MicroChem). Durante la microfabricación se utilizaron la fotoresina positiva HIPR 6512 (Fujifilm Electronic Materials, EE.UU.) y el removedor Sioetch® (Selectipur). Los silanos 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (epoxisilano) y (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) (Sigma-Aldrich) se utilizaron independientemente como reticulantes entre el SU-8 y la posterior la modificación de superficie. 1H,1H,2H,2H-perfluorooctiltriclorosilano (PFOTCS) se adquirió de Fluka. Otros reactivos incluyen etilendiamina (EDA), dimetilsulfóxido anhidro (DMSO), acetonitrilo, hidrogenofosfato disódico (Na2HP04), solución de montaje acuosa de Fluoromount™, medio de hibridación, tampón salino de citrato de sodio (SSC) 20x (Sigma-Aldrich) y etanol (Panreac). Todas las sondas fluorescentes eran o puntos cuánticos Qdot™ ITK™ Amino (PEG), fluoróforos DyLight NHS Ester o pHrodo™ Red, succinimidil éster (ThermoFisher Scientific). Las cadenas de oligonucleótidos modificadas tenían una modificación de anclaje y/o una sonda fluorescente (biomers.net).
• Fabricación de moldes para sellos PPL:
Se oxidó en húmedo una oblea de silicio tipo P <100> de 525 pm de espesor a 11000C para obtener una capa de SÍO2 de 1 pm de espesor. Luego, se revistió por rotación una capa de 1,2 pm de espesor de la fotorresistencia HIPR 6512 sobre la oblea oxidada y se expuso a luz UV a través de una fotomáscara usando un alineador de máscara MA56 (Karl Süss, Alemania). Después de revelar y hornear la capa protectora a 2000C durante 30 min, la capa de SÍO2 se grabó en seco usando una mezcla de C2F6/ CHF3 en un Drytek Quad 484 RIE (Drytek, EE. UU.). Posteriormente, el grabado anisotrópico con KOH al 40% a 75 0C durante 4 min atacó el Si expuesto para crear las pirámides invertidas. El SÍO2 restante se eliminó con Sioetch®. Por último, el molde se activó con plasma durante 30 s a 100 W y se expuso a una atmósfera saturada de PFOTCS durante 1 h. Después de hornear a 75 ° C durante 1 h, el molde se enjuagó con etanol y se secó bajo un flujo de N2.
• Fabricación de sellos PDMS:
Una mezcla de prepolímero-catalizador 10: 1 p/p se removió a fondo, se desgasificó y se vertió sobre una oblea de silicio prístina para obtener sellos planos, o sobre los moldes de silicio seleccionados con las características deseadas. Para evitar la contracción de los sellos de PDMS, se colocó un portaobjetos de vidrio activado por plasma sobre el PDMS sin curar y se dejó que se solidificará a 75 ° C durante 1 h hasta un grosor final de -100 pm.
• Fabricación de chips de SU-8:
Se utilizó fotolitografía de SU-8 estándar para definir la forma y el tamaño de los chips de SU-8. Una oblea de silicio prístina de 4 pulgadas se revistió por rotación con SU-8 2000.5 para obtener una capa homogénea de 500 nm de espesor, que posteriormente se horneó y se expuso a luz ultravioleta a través de una fotomáscara con una dosis de 445 mJ cm-2. Se realizó un último paso de horneado antes de revelar la resina no reticulada. La oblea se dividió en porciones d e l x1 cm2.
• Superficies reactivas con reticulantes seleccionados:
Se incubó un sello plano de PDMS en una solución etanólica de APTES al 2% v/v o en una solución etanólica de APTES al 2% v/v durante 15 min, y posteriormente se secó con N2. La disposición de los chips de SU-8 sobre el sustrato se activó bajo plasma de oxígeno a 500 W durante 30 s y se imprimió inmediatamente por contacto con el sello incubado durante 10 s. La disposición de los chips de SU-8 con la superficie reactiva se curaron posteriormente a 1000C durante 20 min en una atmósfera de nitrógeno y se llevaron a temperatura ambiente rápidamente para inducir un choque térmico en el límite del sustrato SU-8, para ayudar a la posterior liberación de los chips. Se siguió el mismo protocolo para funcionalizar la superficie inferior de los chips, que se realiza después de completar la modificación de la primera superficie (superior) del chip de SU-8 y el despegue del medio de montaje solidificado.
• Impresión de fluoróforos por microcontacto o con plumas poliméricas:
Los fluoróforos modificados con NHS éster reactivos hacia amina se diluyeron inicialmente en DMSO y posteriormente en una solución 4:3 v/v de acetonitrilo:Na2HP0430 mM hasta una concentración final de 100 pg mL'1. El sello de PDMS se activó con plasma y posteriormente se incubó con la solución. Después de 2 min de incubación, el sello se secó con N2 y se puso en contacto con la disposición modificada por APTES de chips de SU-8 durante 10 s. Después de la impresión, la tinta se dejó reaccionar durante 1 h en una cámara húmeda y oscura y se enjuagó a fondo con agua desionizada (DI) durante 30 s.
• Impresión por contacto de puntos cuánticos (QD):
Los QD con diferente emisión se diluyeron en una solución acuosa de Na2HP0430 mM hasta una concentración final de 0,8 pM. El sello entintado hizo contacto con la disposición de chips de SU-8 modificadas con epoxi durante 10s para transferir los QD a su superficie activada. La disposición de los chips de SU-8 se dejó reaccionar durante 1 h. Posteriormente, los grupos epoxi restantes sin reaccionar se bloquearon con una solución de EDA al 2% v/v en tampón Na2HP04 30 mM durante 1 h y finalmente se enjuagaron minuciosamente con agua DI durante 30 s.
• Impresión por contacto de cadenas de ADN:
Las siguientes cadenas de oligonucleótidos modificados se suspendieron en agua DI hasta una concentración inicial de 100 pM y posteriormente en la solución de Na2HP04 hasta una concentración final de10 pM:
TS314: 5’-[Aminolink C6]-CTT GGA GCG AAC GAC CTA C-3’
RP-TS314: 5’-[DY-485-XL]-GTA GGT CGT TCG CTC CAA G-3’
TS315: 5’-[Aminolink C6]-CAA CAC TCA ACC CTA TCT CG-[TxRd]
RP-TS315: 5’-[DY-490]-CGA GAT AGG GTT GAG TGT TG-3’
Posteriormente, se incubó un sello de PDMS con la solución de oligo durante 15 min, se enjuagó con agua destilada desionizada (DDI) y se imprimió en la disposición de chips de SU-8 modificada con epoxi durante 10 s. La disposición de los chips de SU-8 se dejó reaccionar en una atmósfera oscura y húmeda durante 1 h antes de bloquear con una solución de EDA al 2% v/v en tampón Na2HP04 30 mM durante 1 h. Para hibridar, la hebra complementaria se suspendió a una concentración final de 10 pM en el tampón de hibridación y se dejó reaccionar a 360C durante 2 h. Posteriormente, los chips se enjuagaron en SSC 2x durante 5 min, luego se enjuagaron en SSC 1x durante 5 min, seguido de enjuague durante 5 min en SSC 0.1x y finalmente se enjuagaron en agua DDI. Entre cada paso de enjuague, los chips se concentraron por centrifugación y el sobrenadante se recogió y eliminó.
• Liberación de chips impresos:
Se colocó una gota del medio de montaje sobre la disposición de chips de SU-8 sobre el sustrato y se dejó solidificar a temperatura ambiente. Posteriormente se utilizó una fuerza lateral manual para separar el medio solidificado del sustrato. El medio de montaje solidificado con los chips incrustados se disolvió en agua DI y los chips suspendidos se recogieron mediante centrifugación.
EJEMPLO 1 Caracterización de chips de SU-8 después de la etapa (a) donde se define la forma y el tamaño de los chips de SU-8
Comenzamos por establecer las propiedades físicas necesarias para obtener el chip de SU-8 deseado. La definición física dicta el tamaño y la forma de cada chip de SU-8, junto con dimensiones morfológicas como la topografía. A continuación, definimos el descriptor físico en una fotomáscara. Posteriormente se utilizó fotolitografía estándar para transcribir el diseño en SU-8 con un grosor definido (0,5-1,2 pm). La disposición de los chips de SU-8 ordenados sobre el sustrato se obtuvo después del revelar el SU-8. En la Fig. 1a, un solo chip (2) de la disposición de chips de SU-8 ordenados se representa sobre el sustrato (1), con su superficie plana superior expuesta (3).
FIG. 2 muestra la forma y el tamaño de las disposiciones de los chips de SU-8 sobre el sustrato utilizando microscopía electrónica de barrido. Cada disposición de chips de SU-8 contiene un rasgo físico específico: a) marca de inicio de lectura, b) relación de aspecto, c) ramificación y d) facetado.
Este enfoque permite la fabricación de chips de SU-8 con formas y tamaños personalizares en un campo dominado por micropartículas poliméricas esféricas, donde el único parámetro que se puede personalizar es el radio de las esferas. La etapa fotolitográfica permite transferir diseños con características tan pequeñas como 1 pm.
EJEMPLO 2 Caracterización de chips de SU-8 de doble altura: después de la etapa (a) de definir la forma y el tamaño de los chips de SU-8
Los chips de SU-8 de doble altura se fabrican siguiendo dos pasos de fotolitografía consecutivos, un primero para definir un chip de SU-8 inicial directamente sobre el sustrato y un segundo paso de fotolitografía para crear el segundo chip sobre el inicial, como se representa en la FIG. 3. Un chip de doble altura resultante se puede ver en la FIG. 4.
Inicialmente, se fabrica una disposición de chips de SU-8 ordenados mediante fotolitografía de SU-8 y se deja sobre el sustrato. Se realiza un segundo proceso de fotolitografía de SU-8 sobre la disposición inicial de chips de SU-8 ordenados obteniendo chips de SU-8 que incluyen características a una altura secundaria (10). Las moléculas y nanopartículas se injertan en la superficie plana superior (3) de los chips de SU-8 de doble altura como se describe en la Fig. 1a-b. Los chips de SU-8 de doble altura se liberan con el medio de montaje (6) como se describe en la Fig. 1c-d. Las moléculas y nanopartículas se injertan en la superficie plana inferior (7) de los chips de SU-8 de doble altura.
Este método de fabricación asegura la obtención de chips de SU-8 con dos superficies planas superior e inferior opuestas para su funcionalización química posterior. Además, los chips de doble altura pueden incorporar rasgos físicos de dos chips distintos en un solo dispositivo.
EJEMPLO 3 Caracterización de chips de SU-8 liberados.
La etapa de liberación es crucial para suspender los chips de SU-8 injertados, pero debe brindar protección a la funcionalización de la superficie. Algunos métodos de liberación requirieron la eliminación de una capa de sacrificio entre el sustrato y los chips utilizando métodos químicos agresivos, dañando así la funcionalización sensible de la superficie. Por el contrario, sumergiendo los chips en ultrasonido ayudó a liberarlos del sustrato de fabricación, aunque este método puede romper los chips y así como interferir con la estabilidad y funcionalidad de la modificación de la superficie. Alternativamente, la fuerza de cizallamiento también se ha utilizado para raspar los chips de SU-8 del sustrato, sin embargo, esto puede romperlos de manera desigual y generar escombros.
Por lo tanto, para liberar los chips de SU-8 injertados obtenidos siguiendo el proceso de la presente invención con las etapas del Ejemplo 1, su utiliza medio de montaje vertido sobre de los chips injertados, (6) en la FIG. 1c, y luego se deja solidificar a temperatura ambiente (t = 21 0C, HR 50%), incrustando los chips de SU-8 injertados en la matriz solidificada. La membrana solidificada resultante se despega posteriormente del sustrato arrastrando los chips de SU-8 injertados. Esta membrana con los chips de SU-8 se puede disolver en un medio acuoso para liberar la disposición de los chips y obtener chips suspendidos, evitando el riesgo de daño químico. Se puede observar una colección de chips de SU-8 suspendidos en la imagen de microscopía óptica en la FIG.
5.
Los chips se pueden recoger mediante centrifugación para su posterior caracterización o uso. Este método de liberación protege la integridad física de los chips de SU-8 y evita la creación de escombros.
EJEMPLO 4 Caracterización de chips los SU-8 injertados con fluoróforos en forma de patrones definidos en las superficies planas superiores de los chips.
Se usaron reticulantes heterobifuncionales para generar una zona reactiva en la superficie superior de cada chip de SU-8 fijo en el sustrato (4) en la FIG. 1a.
Desarrollamos protocolos de litografía suave y química húmeda para imprimir la superficie reactiva de los chips de SU-8 con tintas seleccionadas. La impresión por microcontacto (pCP) se usó para modelar todo el chip o para crear patrones de línea en la parte superior de los chips fijos con la misma molécula o nanopartícula, como se representa en (5) en la FIG. 1b. La litografía de pluma polimérica (PPL) injertó características micrométricas resolubles (puntos) en posiciones seleccionadas, acopladas con múltiples moléculas o nanopartículas con diferente emisión de luz, obteniendo las características injertadas (5.1, 5.2 y 5.3) representadas en la FIG. 1b. El tener múltiples puntos identificables por su posición sobre cada chip de SU-8, proporciona la base para crear chips multiplexados que tienen los puntos que emiten en el mismo color, eliminando las restricciones de los chips multiplexados basados en colores, limitados por el número de tintes resueltos espectralmente.
Se inmoviliza un reticulante que contiene un grupo funcional amina (APTES, ver Materiales y métodos) sobre la superficie plana superior de una disposición de chips de SU-8 fabricados en el Ejemplo 1 para crear una superficie reactiva con el reticulante seleccionado. Se injertaron dos fluoróforos modificados con NHS éster con emisiones rojas y verdes en la superficie reactiva mediante litografía blanda o química húmeda. En la Fig. 6a, el fluoróforo emisor de rojo se injertó usando litografía de pluma polimérica para crear puntos sobre la disposición de los chips inmovilizados. Alternativamente, se pueden injertar líneas de fluoróforo en las superficies superiores de la disposición de chips con impresión por microcontacto, como se demuestra en la FIG. 6b. Para visualizar mejor con microscopía de fluorescencia, la disposición de los chips y las puntos y líneas injertadas, se rellenó un fluoróforo emisor de verde para cubrir el resto de las superficies superiores de la disposición de los chips. La impresión por microcontacto se utiliza para injertar un fluoróforo sobre toda la superficie plana superior de la disposición de los chips, que se puede observar en la FIG. 6c. Alternativamente, se puede sumergir una disposición de chips en una solución del fluoróforo para injertar los fluoróforos mediante química húmeda en las superficies laterales y la superficie plana superior de los chips, como se muestra en la FIG. 6d.
Este método de injerto crea patrones personalizados en la superficie superior de la disposición de los chips. Además, la disposición de los chips se puede enjuagar y lavar después de cada proceso de modelado para eliminar el exceso de molécula o nanopartícula sin perder los chips de SU-8.
EJEMPLO 5 Caracterización de chips de SU-8 injertados con fluoróforos y su posterior liberación
Se han utilizado chips fluorescentes para crear dispositivos de etiquetado, identificado y códigos de barras en aplicaciones a la microescala. La superficie plana superior de la presente invención se puede injertar con fluoróforos seleccionados para lograr propósitos similares. Para lograr esto, la superficie plana superior de una disposición de chips de SU-8 ramificados se modifica primero para crear una superficie reactiva con un reticulante que contiene grupos funcionales amino. Seguidamente, la superficie plana superior se injerta con un fluoróforo modificado con NHS éster emisor en rojo mediante impresión por microcontacto. La emisión resultante de los fluoróforos injertados sobre la disposición de chips de SU-8 ramificados puede verse en la FIG. 7a. Los chips de SU-8 injertados se liberan utilizando el medio de montaje presentado en el Ejemplo 3 y se resuspenden en agua. La emisión fluorescente del fluoróforo emisor en rojo injertado en los chips se ve en la FIG. 7b.
La emisión de fluorescencia se detecta a través de los chips ya que la transmitancia óptica del material es <95% en las longitudes de onda seleccionadas, observándose la emisión tanto si la cara injertada está hacia arriba como hacia abajo, con autofluorescencia insignificante. Este enfoque permite la personalización de la superficie plana superior de la disposición de chips de SU-8 con reticulantes seleccionados con grupos funcionales específicos como amina, epoxi o tiol para crear una superficie reactiva donde el fluoróforo o nanopartícula puede unirse covalentemente.
EJEMPLO 6 Caracterización de chips de SU-8 injertados con ácidos nucleicos y proteínas y la posterior liberación de los chips de SU-8 injertados.
Alternativamente, la inmovilización covalente de ácidos nucleicos y proteínas en la disposición de chips de SU-8 proporciona una estabilidad favorable y accesibilidad a biomoléculas para biosensado, biocatálisis y diagnóstico inmediato. Los métodos de funcionalización actuales emplean química húmeda para revestir aleatoriamente los chips. Para dirigir la funcionalización hacia la posición elegida de la superficie de los chips, la superficie plana superior de la disposición de chips de SU-8 se funcionaliza inicialmente con un reticulante que contiene un grupo funcional epoxi creando una superficie reactiva, que reacciona espontáneamente con aminas secundarias presentes en oligos modificados y en proteínas.
Para lograr esto, se modificó una disposición de chips de SU-8 ramificados con una superficie plana superior inicialmente modificada con el reticulante epoxisilano (Materiales y métodos) mediante la impresión por microcontacto de un oligo modificado de amina marcado con TexasRed. De manera similar, se imprimió la superficie plana superior de una disposición de chips de SU-8 de relación de aspecto inicialmente modificada con el reticulante epoxisilano (materiales y métodos) y posteriormente se utilizó impresión por microcontacto para injertar proteína verde fluorescente (GFP). Después de que se injertaron los oligos y las proteínas, los chips se liberaron y se recogieron para la caracterización siguiendo el proceso del Ejemplo 3. Los chips de SU-8 injertados liberados resultantes se pueden caracterizar con microscopía fluorescente como se ve en la FIG. 8. La señal de fluorescencia en la FIG. 8a confirma la presencia del oligo marcado con rojo Texas presente en la superficie superior de los chips. De manera similar, la emisión de fluorescencia verde en la FIG. 8b confirma la GFP injertada sobre la superficie superior de los chips liberados.
El método de liberación protege la integridad de las biomoléculas injertadas para que sigan siendo funcionales y así dotando un mayor número de usos de los chips.
EJEMPLO 7 Caracterización de chips de SU-8 injertados con puntos cuánticos y la posterior liberación de los chips SU-8 de injertados.
La presente invención permite injertar puntos cuánticos (QD) en la superficie plana superior de disposiciones de chips de SU-8 de todas las formas y tamaños y la posterior liberación de los chips injertados. Las disposiciones de chips de SU-8 se fabricaron como se indica en el Ejemplo 1 y se funcionalizaron inicialmente con una superficie reactiva con un reticulante de epoxisilano seleccionado. Posteriormente, se injertaron QD modificados con un grupo amino y con una emisión de fluorescencia a 545 nm (QD545) en una disposición de chips de SU-8 de relación de aspecto (FIG. 9a) y se injertaron QD modificados con un grupo amino y con una emisión de fluorescencia a 525 nm (QD525) en una disposición de chips con marca de inicio de lectura de SU-8 (FIG. 9c). Ambos procesos de injerto se realizaron mediante impresión por microcontacto. Posteriormente, las disposiciones injertadas de chips se liberaron del sustrato con el medio de montaje siguiendo el proceso establecido en el Ejemplo 3.
La emisión de fluorescencia normalizada de los chips liberados suspendidos en un medio acuoso demuestra una cobertura de superficie con QD es uniforme, con una pequeña dispersión de emisión de fluorescencia e intensidades de emisión condensada, como se demuestra en la FIG. 9b y la FIG. 9d. La emisión de fluorescencia proporciona una señal individual que se puede utilizar para diferenciar entre subpoblaciones de chips de SU-8 liberados suspendidos, cada subpoblación injertada con un QD diferente. La eficiencia de la señal está vinculada a la capacidad de discriminar un chip de SU-8 injertado del otro. En conjunto, el potencial de la tecnología permite obtener patrones de QD precisos y reproducibles en todas las superficies superiores de los chips de SU-8 y el proceso de liberación suave demuestra la conservación de los rasgos físicos y químicos personalizados en la superficie superior de los chips de SU-8 liberados.
EJEMPLO 8 Caracterización de chips de SU-8 injertados en su superficie superior con moléculas o nanopartículas, posterior liberación de los chips de SU-8 injertados y segundo injerto de fluoróforo en la superficie inferior de los chips de SU-8.
La presente invención establece un camino para dotar de patrones con propiedades individuales a las superficies superiores de los chips de SU-8. Esto se puede ampliar aún más con la inclusión de la cobertura y la impresión selectiva de la superficie inferior de los chips para obtener chips Janus. Para fabricar estos chips, aprovechamos su incrustación ordenada y al ras en el medio de montaje solidificado después de la liberación establecida en el Ejemplo 3 y su posterior modificación de la superficie inferior recién expuesta.
En lugar de disolver la membrana, la parte inferior plana de los chips de SU-8 injertados (7 en la FIG. 1d) permite modificar las superficies planas inferiores expuestas para crear una superficie reactiva con reticulantes seleccionados (8 en la FIG. 1e) y su posterior impresión por microcontacto mientras está incrustado en el medio de montaje solidificado para injertar moléculas y nanopartículas seleccionadas (9 en la FIG. 1f), obteniendo así chips Janus suspendidos después de disolver la membrana (FIG. 1g).
Por lo tanto, fabricamos inicialmente chips Janus con dos fluoróforos en sus superficies opuestas (FIG. 10a-c). La superficie superior expuesta de una disposición de chips con marca de inicio de lectura se funcionalizó con APTES (Materiales y Métodos) para crear la superficie reactiva y se imprimió sucesivamente con el fluoróforo rojo modificado con NHS éster vía impresión de microcontacto. Después de liberar los chips siguiendo el proceso del Ejemplo 3, la superficie inferior también se modificó con grupos amino para crear una superficie reactiva en la superficie inferior de los chips y posteriormente se imprimió con el fluoróforo verde modificado con NHS éster vía impresión de microcontacto. Los canales de fluorescencia rojo y verde (FIG. 10a, b, respectivamente) muestran los chips resultantes con la contribución individual de cada fluoróforo después de disolver la membrana y resuspender los chips en un medio acuoso. La imagen compuesta formada por la combinación de las dos imágenes anteriores en la FIG. 10c describe claramente la posición de las emisiones fluorescentes rojas y verdes localizadas en las superficies superior e inferior de los chips suspendidos.
De manera similar, la estrategia permite el uso de diferentes mecanismos de enlace covalente para agregar rasgos específicos en las superficies superior e inferior de los chips. En la presente invención, se modificó una disposición de chips de SU-8 de facetado con un epoxisilano (Materiales y métodos) para crear una superficie reactiva en la superficie superior de los chips. A continuación, se injertó un QD modificado con amino con emisión de fluorescencia a 655 nm (QD655) vía impresión por microcontacto. Después de que se liberó la disposición de chips siguiendo las etapas que se muestran en el Ejemplo 3, la superficie plana inferior ahora expuesta de los chips se puede modificar con un reticulante que contiene aminas para crear una superficie reactiva para un patrón posterior de un fluoróforo modificado con NHS-éster reactivo contra aminas y con emisión en verde. La imagen roja fluorescente de la FIG. 10d muestra la emisión del QD655 y la emisión fluorescente verde en la FIG. 10e muestra la emisión del fluoróforo emisor en verde. La imagen compuesta (FIG. 10f) muestra la combinación de las dos emisiones de fluorescencia anteriores y demuestra la localización del QD655 y el fluoróforo emisor en verde en cada chip.
Este protocolo de química múltiple permite dirigir las reacciones químicas de enlace para obtener chips Janus con entidades químicamente interferentes.
EJEMPLO 9 Caracterización de chips de SU-8 de doble altura injertados en su superficie superior con nanopartículas, posterior liberación de los chips de SU-8 injertados y segundo injerto de nanopartículas en la superficie inferior de los chips de SU-8.
Los rasgos físicos presentes en los chips SU-8 de doble altura se pueden explotar para formar restricciones físicas en las áreas de superficie superior e inferior para patrones químicos adicionales. Como se mostró anteriormente en el Ejemplo 2, estos chips tienen una superficie superior con características en dos alturas distintivas, por lo que el patrón se produce solo sobre las características elevadas. Las moléculas (Ejemplo 5), las biomoléculas (Ejemplo 6) y las nanopartículas (Ejemplo 7) se pueden imprimir mediante litografía blanda, como la impresión por microcontacto o la litografía con pluma polimérica sobre esas áreas. Además, la presente invención establece los medios para liberar los chips de doble altura con patrones como se describe en el Ejemplo 3, y agregar grupos funcionales a la superficie plana inferior ahora expuesta, para formar una superficie reactiva con reticulantes seleccionados como se demuestra en el Ejemplo 8. Esta superficie reactiva plana inferior se puede imprimir con moléculas (Ejemplo 5), biomoléculas (Ejemplo 6) y nanopartículas (Ejemplo 7) con impresión por microcontacto.
En la FIG. 11a se muestra una imagen de microscopía óptica de las características de los chips de doble altura, fabricado con una capa inicial que consta de un arreglo de chips con marca de inicio de lectura de SU-8 y la segunda capa de chips de SU-8 de ramificación, siguiendo el procedimiento detallado en el Ejemplo 2. Luego, la superficie plana superior del arreglo de chips de doble altura se funcionalizó para dotar a una superficie reactiva de un epoxisilano (Materiales y métodos). Posteriormente se utilizó la impresión por microcontacto para injertar QD655 con modificados con grupos amino en la superficie plana superior reactiva de los chips de doble altura, como se detalla en el Ejemplo 7. Los chips de doble altura se liberaron con el medio de montaje siguiendo las etapas detalladas en el Ejemplo 3. Luego, la superficie plana inferior de los chips incrustados en la matriz del medio de montaje se modificó con un epoxi-silano para formar la superficie reactiva en la que posteriormente se imprimió el QD545 con modificados con un grupo amino vía impresión de microcontacto.
La imagen de microscopía de fluorescencia en la FIG. 11b produce una evaluación clara de los chips suspendidos con QD655 inicialmente impreso en el lado de ramificación del chip y una sucesiva modificación epoxi e impresión QD545 en la parte con la marca de inicio de lectura después de la liberación. La emisión de fluorescencia indica la forma y el tamaño correctos del patrón selectivo de QD inicialmente sobre la superficie superior y, posteriormente, sobre la superficie inferior expuesta de los chips después de la liberación.
En conjunto, se puede obtener una amplia gama de chips Janus con la presente invención. Simultáneamente, los chips se podrían modelar utilizando tintas (bio)químicas o basadas en nanopartículas para obtener anisotropías químicas de superficie dictadas por las propiedades físicas iniciales sin la necesidad de un sello personalizado. Además, excluyendo la necesidad de la química ortogonal para crear superficies multiplexadas, allana el camino para la funcionalización de múltiples productos químicos en un solo chip.
EJEMPLO 10 Aplicación de chips de SU-8 suspendidos injertados con un fluoróforo sensor de pH para la determinación del pH
Diseñamos un dispositivo sensor miniaturizado con una forma y tamaño personalizados y lo acoplamos con capacidades sensoras a microescala. Los dispositivos consistieron en una disposición de chips ramificados modificados con APTES (Materiales y Métodos) para formar la superficie superior reactiva. Posteriormente, se injertó rojo pHrodo™ modificado con un succinimidilo vía impresión de microcontacto sobre la superficie reactiva. Luego, los chips se liberaron como se indica en el Ejemplo 3 y luego se expusieron a ambientes a diferentes pH (FIG. 12). El fluoróforo rojo pHrodo sensible al pH aumenta su emisión a valores de pH bajos; en consecuencia, se observó un aumento de 4 veces en la fluorescencia a un pH bajo (FIG. 12a) en comparación con el ambiente neutro (FIG. 12b). Lo contrario ocurrió a un pH alto donde la fluorescencia era insignificante (FiG. 12c), por lo tanto, la fluorescencia de los chips no es visible.
La anisotropía física detallada para facilitar la identificación podría extrapolarse hacia estudios multiplexados utilizando la misma longitud de onda de emisión de fluorescencia en chips suspendidos con sus atributos físicos personalizados y, debido a su tamaño, en volúmenes extraordinariamente pequeños.
EJEMPLO 11 Aplicación de chips de SU-8 suspendidos injertados con una biomolécula sensora en la superficie superior y una etiqueta fluorescente en la superficie inferior
La presente invención demuestra la capacidad de detección realizando un bioensayo de un solo paso que consiste en un chip Janus con una cara sensora en la superficie superior del chip y una cara etiquetada complementaria en la superficie inferior del chip. El chip consta de una cara de detección de ADN y una señal única de QD en la otra cara (FIG. 13).
Primero se modificó una disposición de chips con marca de inicio de lectura con el epoxisilano (Materiales y métodos) para obtener una superficie superior reactiva. Posteriormente, se imprimieron oligos modificados con amina ('sonda 1') en la superficie superior vía impresión por microcontacto, siguiendo las etapas detalladas en el Ejemplo 6. Los chips injertados se liberaron posteriormente con el medio de montaje como se detalla en el Ejemplo 3 y se dotó la cara inferior de los chips mientras estaban incrustado en el medio de montaje con APTES (Materiales y métodos). Luego, se imprimió QD655 modificado con grupo amino sobre la superficie inferior reactiva vía impresión de microcontacto siguiendo las etapas del Ejemplo 9. El medio de montaje se disolvió, y más adelante, los chips suspendidos se incubaron con una sonda ('sonda 2') modificada con un fluoróforo con emisión en verde complementario a 'sonda 1' con una combinación perfecta de pares de bases para promover la hibridación. Los chips suspendidos con la 'sonda 2' hibridada se lavaron y finalmente se recogieron mediante centrifugación.
Los chips son visibles con el QD655 injertado en la superficie inferior y se usa como etiqueta para identificarlos (FIG. 13a).
El análisis del bioensayo con microscopía fluorescente muestra la orientación de "sonda 2" hacia la "sonda 1" impresa, lo que da como resultado una señal de emisión verde (FIG. 13b).
Esto podría ofrecer una gran ventaja en el reconocimiento codificado de ADN con dispositivos suspendidos en una subpoblación multiplexada. Este enfoque puede utilizar diferentes QD para crear señales fluorescentes independientes para una población de chips modificados con secuencias de ADN únicas y cadenas de ADNc, todas marcadas con el mismo fluoróforo, eliminando así los inconvenientes presentes con los fluoróforos limitados disponibles para el etiquetado de ADN.
EJEMPLO 12 Aplicación para la creación de bibliotecas de códigos de barras con chips de SU-8 suspendidos.
La presente invención demuestra chips Janus multiplexados que combinan diseños de patrones de superficie y química múltiple, junto con una marca de referencia para la lectura correcta del código, para códigos de barras en volúmenes extremadamente pequeños. Se modificó una disposición de chips de SU-8 de relación de aspecto con APTES (materiales y métodos) para dotar de un grupo reactivo a la superficie superior de los chips. A continuación, se injertaron fluoróforos modificados con NHS éster y reactivos contra aminas vía litografía de pluma polimérica creando puntos discretos que emiten fluorescencia en la superficie superior de la disposición de chips de SU-8. La emisión de color y la posición de los puntos crean los elementos de codificación del código de barras. La disposición de los chips se libera posteriormente con el medio de montaje como se explica en el Ejemplo 3 y la superficie inferior expuesta de las virutas incrustadas se modificó con un epoxisilano (Materiales y métodos) para crear una superficie reactiva. Luego, la impresión por microcontacto se utiliza para injertar QD655 modificado con amino en las superficies inferiores reactivas de los chips. En este caso, se imprimieron QD para facilitar la identificación de los chips, pero se pueden sustituir por cualquier molécula o nanopartícula sensora. El medio de montaje solidificado se disuelve posteriormente en un medio acuoso para obtener los chips suspendidos (FIG.
14).
Se puede asignar un valor numérico al área de codificación: un punto de fluoróforo rojo con el valor 2, el punto de fluoróforo verde con el valor 1 y un espacio vacío representa un 0 de un sistema de codificación ternario.
Los chips con códigos de barras de colores han demostrado 6 elementos de codificación (m) en un volumen total de ~ 0,63 * 106 pm3 con hasta 9 colores diferentes (n), con una densidad de codificación teórica calculada por n-m/V de ~0,8 códigos pm'3. Esta densidad se puede expandir aumentando el tamaño del chip para aumentar el número de elementos de codificación. Este enfoque se utiliza en otros chips informados que contienen 10 características de codificación en un volumen de ~4,8 * 106 pm3 junto con 8 colores diferentes, por lo que se calculan 223 códigos pm'3. El gran potencial de codificación de barras de estos chips está limitado en aplicaciones que requieran una miniaturización adicional, donde la presente invención podría presentar una alternativa válida. Curiosamente, el patrón paralelo junto con solo dos fluoróforos diferentes en 9 posibles puntos, los chips de relación de aspecto de 18 pm3 se podrían codificar para obtener una densidad de codificación calculada de 1.093 códigos pm'3 en un volumen pequeño. En consecuencia, estos chips Janus codificados amplían su alcance al agregar una capa inferior que no interfiere con el arreglo plano multiplexado y puede usarse posteriormente para expandir la funcionalidad o usarse para aumentar los códigos de barras.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la obtención de chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8 que comprende:
• una pluralidad de chips doble planares de SU-8, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana, • y moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas,
donde dichas moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8, y donde
• las moléculas se seleccionan preferiblemente de la lista que consiste en cromóforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo y fluoróforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo,
• las biomoléculas se seleccionan preferiblemente de la lista que consiste en carbohidratos, proteínas, anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos, y • las nanopartículas se seleccionan preferiblemente de entre nanopartículas basadas en carbono que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas metálicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas cerámicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas poliméricas que comprenden un grupo funcional amina y nanopartículas semiconductoras que comprenden un grupo funcional amina;
dicho proceso caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) definir la forma y el tamaño de los chips de SU-8 mediante fotolitografía de SU-8; formando así una disposición de chips de SU-8 ordenados sobre un sustrato, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana y donde la segunda superficie plana está en contacto directo con el sustrato; b) funcionalizar, mediante litografía blanda, la primera superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (a) utilizando un reticulante de silano; formando así una primera superficie plana reactiva en cada chip de SU-8, donde el reticulante de silano comprende dos grupos funcionales:
• un grupo funcional de silano y
• un grupo funcional seleccionado de la lista que consiste en aminas primarias o secundarias, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o grupos metacriloxi; c) injertar moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas sobre la primera superficie plana reactiva de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (b) mediante litografía blanda;
d) verter un medio de montaje sobre los chips de SU-8 obtenidos en el paso (c) y dejar que solidifique, embebiendo así los chips de SU-8 obtenidos en el paso (c) en el medio de montaje y formando así una membrana solidificada sobre el sustrato;
e) despegar la membrana solidificada obtenida en la etapa (d) del sustrato, desbloqueando así la segunda superficie plana de cada chip de SU-8;
f) funcionalizar, mediante litografía blanda, la segunda superficie plana desbloqueada de cada chip SU-8 obtenido en la etapa (e) utilizando un reticulante de silano, donde el reticulante de silano comprende dos grupos funcionales:
• un grupo funcional de silano y
• un grupo funcional seleccionado de la lista que consiste en aminas primarias o secundarias, epóxido, tiol, carboxilo, azida, vinilo, isocianato o grupos metacriloxi; formando así una segunda superficie reactiva en cada chip de SU-8;
g) injertar moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas sobre la segunda superficie reactiva de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (f) mediante litografía blanda; h) disolver la membrana solidificada de los chips de SU-8 obtenidos en la etapa (g) en un medio acuoso; y
i) recoger los chips Janus, doble planares y suspendidos de SU-8 obtenidos en el paso (h) mediante centrifugación.
2. El proceso según la reivindicación 1, donde la etapa (a) puede repetirse obteniendo así una disposición de doble altura de chips de SU-8 ordenados sobre el sustrato.
3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde las etapas (b) y (c) pueden repetirse.
4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (c) comprenden un solo tipo de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip SU-8; formando así una primera disposición de plano impreso.
5. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (c) comprende la combinación de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la primera superficie plana de cada chip de SU-8; formando así un primer arreglo planar.
6. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la litografía blanda de las etapas (b) y (c) se realiza en forma de patrones de líneas y/o puntos.
7. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde las etapas (f) y (g) pueden repetirse.
8. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (g) comprenden un solo tipo de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8; formando así una segunda disposición de plano impreso.
9. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 obtenido en la etapa (g) comprenden la combinación de moléculas, biomoléculas o nanopartículas injertadas sobre la segunda superficie plana de cada chip de SU-8; formando así un segundo arreglo planar.
10. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la litografía blanda de las etapas (f) y (g) se realiza en forma de patrones de líneas y/o puntos.
11. Chips Janus, doble planares y suspendidos, preferiblemente obtenidos por el proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizados por que comprenden:
• una pluralidad de chips doble planares de SU-8, donde cada chip de SU-8 tiene una primera superficie plana y una segunda superficie plana, • y moléculas, biomoléculas, nanopartículas o una combinación de las mismas,
donde dichas moléculas, biomoléculas, nanopartículas o la combinación de las mismas están injertadas en la primera y en la segunda superficie plana de cada chip de SU-8.
12. Chips Janus, doble planares y suspendidos según la reivindicación 11, donde las moléculas se seleccionan de la lista que consiste en cromóforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo y fluoróforos modificados que comprenden grupos éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo.
13. Chips Janus, doble planares y suspendidos según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, donde las biomoléculas se seleccionan de la lista que consiste en carbohidratos, proteínas, anticuerpos, enzimas y ácidos nucleicos.
14. Chips Janus, doble planares y suspendidos según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde las nanopartículas se seleccionan de entre nanopartículas basadas en carbono que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas metálicas que comprenden un grupo funcional amina, nanopartículas cerámicas que comprenden un grupo funcional amina, poliméricas nanopartículas que comprenden un grupo funcional amina y nanopartículas semiconductoras que comprenden un grupo funcional amina.
15. Arreglo suspendido caracterizado por que comprende al menos dos chips Janus, doble planares y suspendidos diferentes según cualquiera de las reivindicaciones 11 a14.
16. Un proceso para la obtención del arreglo suspendido según la reivindicación 15 caracterizado por que comprende una etapa de mezclar al menos dos chips Janus, doble planares y suspendidos diferentes.
17. Chip de código de barras caracterizado por que comprende los chips Janus, doble planares y suspendidos según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el arreglo suspendido según la reivindicación 15.
18. Chip de código de barras según la reivindicación 17, dicho chip de código de barras es un chip de código de barras de color, donde al menos una nanopartícula está injertada en la primera o la segunda superficie plana de cada chip de SU-8 en forma de patrones de línea y/o puntos y dicha nanopartícula es un punto cuántico modificado con amina.
19. Dispositivo sensor caracterizado por que comprende los chips Janus, doble planares y suspendidos según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o el arreglo suspendido según la reivindicación 15.
20. Dispositivo sensor según la reivindicación 19, dicho dispositivo sensor es un dispositivo sensor de pH, donde al menos una molécula está injertada en la primera o la segunda superficie plana de cada chip de SU-8, dicha molécula es un fluoróforo sensor de pH que comprende un grupo éster de N-hidroxisuccinimidilo o éster de succinimidilo.
21. Dispositivo sensor según la reivindicación 19, dicho dispositivo sensor es un dispositivo sensor de ADN, donde al menos una biomolécula está injertada en la primera o la segunda superficie plana de cada chip de SU-8, dicha biomolécula es una sonda de ADN.
ES202030756A 2020-07-20 2020-07-20 Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido Active ES2891701B2 (es)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202030756A ES2891701B2 (es) 2020-07-20 2020-07-20 Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido
EP21758722.9A EP4183740A1 (en) 2020-07-20 2021-07-20 Process for the obtainment of suspended double-flat su-8 janus chips, said suspended double-flat su-8 janus chips and suspended array thereof
PCT/ES2021/070539 WO2022018314A1 (es) 2020-07-20 2021-07-20 Proceso para la obtención de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido
US18/017,009 US20230294087A1 (en) 2020-07-20 2021-07-20 Process for the obtainment of suspended double-flat su-8 janus chips, said suspended double-flat su-8 janus chips and suspended array thereof
JP2023504343A JP2023534727A (ja) 2020-07-20 2021-07-20 懸濁ダブルフラットｓｕ－８ヤヌスチップの取得方法、当該懸濁ダブルフラットｓｕ－８ヤヌスチップ、およびそれらの懸濁アレイ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202030756A ES2891701B2 (es) 2020-07-20 2020-07-20 Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2891701A1 ES2891701A1 (es) 2022-01-28
ES2891701B2 true ES2891701B2 (es) 2022-05-30

Family

ID=77447925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES202030756A Active ES2891701B2 (es) 2020-07-20 2020-07-20 Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230294087A1 (es)
EP (1) EP4183740A1 (es)
JP (1) JP2023534727A (es)
ES (1) ES2891701B2 (es)
WO (1) WO2022018314A1 (es)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7517496B2 (en) * 2001-07-17 2009-04-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Latex based adsorbent chip
AU2002367582A1 (en) * 2001-07-17 2003-09-29 Ciphergen Biosystems, Inc. Latex based adsorbent chip
WO2009002580A2 (en) * 2007-04-02 2008-12-31 Boston Medical Center Corporation Method for bacterial lysis
US8778849B2 (en) * 2011-10-28 2014-07-15 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
TWI506068B (zh) * 2013-09-27 2015-11-01 Univ Nat Chiao Tung 異向性高分子體的製備方法
WO2016049210A1 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 Indiana University Research And Technology Corporation Artificial antigen-presenting cells and methods for producing and using the same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022018314A1 (es) 2022-01-27
US20230294087A1 (en) 2023-09-21
EP4183740A1 (en) 2023-05-24
JP2023534727A (ja) 2023-08-10
ES2891701A1 (es) 2022-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7867782B2 (en) Nanoscale moiety placement methods
ES2656987T3 (es) Micropartículas de polímero codificadas
EP1733229B1 (en) Patterning method for biosensor applications and devices comprising such patterns
AU2001293381B2 (en) A method of fabricating coded particles
JP2008146805A (ja) アフィニティー型自己集合システムならびにフォトニクスおよびエレクトロニクス用素子
Shamansky et al. Immobilization and detection of DNA on microfluidic chips
Hyun et al. Micropatterning biological molecules on a polymer surface using elastomeric microwells
Ganesan et al. Multicomponent protein patterning of material surfaces
US20030013109A1 (en) Hairpin sensors using quenchable fluorescing agents
ES2891701B2 (es) Proceso para la obtencion de chips janus, doble planares suspendidos de su-8, dichos chips janus, doble planares suspendidos de su-8 y su arreglo suspendido
KR101065078B1 (ko) 바이오칩용 기판 및 그 제조 방법
US20220155211A1 (en) Altering flow cell signals
US20030153092A1 (en) Method of fabricating coded particles
US11808763B2 (en) Method and apparatus for ordered nanoplasmonic sensor formation through microfluidic assembly
WO2011038158A2 (en) Methods, compositions, systems and apparatus for molecular array fabrication
Agusil et al. Multidimensional Anisotropic Architectures on Polymeric Microparticles
Lee et al. Holographic fabrication of microstructures with internal nanopatterns using microprism arrays
US10754250B2 (en) DNA double-write/double binding identity
Aveyard et al. Microfabricated magnetic bead polydimethylsiloxane microarrays
Dean et al. Biorecognition by DNA oligonucleotides after exposure to photoresists and resist removers
He Application of encoded microparticles fabricated by standard lithography on multiplexed bioassay
CN115867677A (zh) 掺入和成像混合物
CN117529661A (zh) 溶液相单分子捕获和相关技术
Huang Biomolecular nanopatterning and single molecule detection
Melvin et al. DNA, nanoparticles and photons-new approaches for clinical diagnostics

Legal Events

Date Code Title Description
BA2A Patent application published

Ref document number: 2891701

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: A1

Effective date: 20220128

FG2A Definitive protection

Ref document number: 2891701

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: B2

Effective date: 20220530