ES2890500T3 - Dendrímeros para la liberación sostenida de compuestos - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende un polímero de poliamidoamina escala nanométrica(PAMAM) ramificado dendrimérico a escala nanométrica con un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores, a un agente biológicamente activo para la entrega selectiva del polímero de poliamidoamina a escala nanométrica (PAMAM) ramificado dendrimérico a un sitio de neuroinflamación y/o inflamación del ojo para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación, y/o inflamación del ojo, en la que el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios y antioxidantes.
Description
DESCRIPCIÓN
Dendrímeros para la liberación sostenida de compuestos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones basadas en dendrímeros para su uso en la administración de composiciones farmacéuticas a células y tejidos diana para el tratamiento de neuroinflamación y/o inflamación del ojo, incluida la degeneración macular.
Antecedentes
Una vía común en muchos estados patológicos humanos es la inflamación mediada por microglía. La microglía es un macrófago residente en los tejidos que se encuentra en la retina y el sistema nervioso central. Las células microgliales constituyen entre el diez y el veinte por ciento de las células del cerebro adulto. En condiciones normales, estas células están constitutivamente suprimidas por el cortisol endógeno. Las células se activan en forma de fagocitos y células citotóxicas en presencia de diversos estímulos. Entre estos estímulos se encuentran traumatismos, infecciones, inflamación, isquemia, los lipopolisacáridos, las especies reactivas del oxígeno y las membranas celulares dañadas. Una vez que la microglía se activa, puede migrar y reclutar a otras microglías en el lugar original del daño. Las células defectuosas pueden ser eliminadas por la liberación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), especies reactivas de oxígeno (ROS) y proteasas. Los residuos celulares resultantes son fagocitados por las células de la microglía.
El daño celular secundario se produce en un proceso que se denomina lisis del espectador: las células sanas cercanas se destruyen en el medio extracelular tóxico creado por la microglía activada. Esto amplifica el daño celular más allá de las células afectadas por el evento patológico subyacente, y convierte el remedio -las células microgliales activadas- en un sistema patológico por derecho propio.
El patrón en cascada de la patología primaria, la respuesta de las células microgliales y la posterior patología secundaria se ha observado en una amplia gama de enfermedades humanas, incluidas las enfermedades del ojo. Un elemento esencial de la vista es una retina que funcione. La retina puede compararse con la "película" del ojo. Convierte los rayos de luz en señales eléctricas y las envía al cerebro a través del nervio óptico. Los lados de la retina son responsables de la visión periférica. La zona central, llamada mácula, se utiliza para la visión central fina y la visión del color. En la retina es donde se producen muchos problemas que conducen a la pérdida de visión. Tres de las principales causas de ceguera por daños en la retina asociados a la neuroinflamación son la retinosis pigmentaria, la degeneración macular y la retinopatía diabética. La principal causa de ceguera en los afroamericanos es el glaucoma, un proceso degenerativo del nervio óptico y la retina que implica la neuroinflamación y la activación de las células microgliales en el nervio óptico, que conecta la retina con el cerebro. Otras importantes enfermedades de la retina asociadas a la neuroinflamación son la uveítis, las degeneraciones autoinmunes de los fotorreceptores y las infecciones.
Desde una perspectiva clínica, la retinosis pigmentaria, la degeneración retiniana de inicio tardío y la degeneración macular relacionada con la edad tienen un impacto significativo en la salud humana y en la calidad de vida. Nueve millones de estadounidenses sufren una pérdida de visión progresiva debido a enfermedades neurodegenerativas de la retina. La retinosis pigmentaria afecta a uno de cada cuatro mil individuos. Es la cuarta causa de discapacidad visual en Estados Unidos, después de la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad y el glaucoma.
La degeneración macular asociada a la edad (ARMD) es una enfermedad neurodegenerativa y neuroinflamatoria de la mácula, responsable de la pérdida de visión central. La ARMD es la principal causa de pérdida de visión en personas mayores de 65 años. Ocho millones de personas son legalmente ciegas por degeneración macular en todo el mundo, y a medida que la población envejece se espera que esta cifra aumente La patogénesis de la degeneración macular asociada a la edad implica una neuroinflamación crónica en la coroides (una capa de vasos sanguíneos bajo la retina), el epitelio pigmentario de la retina (RPE), una capa celular bajo la retina neurosensorial, la membrana de Bruch y la propia retina neurosensorial. La enfermedad se manifiesta primero como una forma seca que implica la acumulación de drusas, es decir, residuos celulares y materiales inflamatorios que forman pequeñas masas dentro del RPE y la membrana de Bruch. Las drusas contienen membranas celulares rotas y otros fragmentos celulares y son altamente antigénicas, activando una respuesta inflamatoria localizada mediada por microglia y macrófagos dentro de la retina. Con el tiempo, los mediadores tóxicos asociados a esta inflamación descomponen la membrana de Bruch y el RPE y pueden conducir directamente a la pérdida de visión o pueden provocar la fuga del factor de crecimiento derivado del endotelio vascular desde la circulación coroidea al espacio subretiniano. Esto, a su vez, puede conducir a la formación de vasos sanguíneos anormales, llamados neovascularización coroidea. Dado que estos vasos sanguíneos son anormales, suelen tener fugas de suero, lo que provoca exudados en la retina y a veces pueden sangrar. Al tratarse de líquido, se denomina degeneración macular asociada a la edad "húmeda". Las formas "húmeda" y "seca" de la degeneración macular asociada a la edad pueden coexistir, y ambas implican una neuroinflamación.
La patología mediada por la microglía es también común a una variedad de enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington y el traumatismo agudo de la médula espinal. Las lesiones cerebrales son otra causa de discapacidad de por vida. Por ejemplo, las lesiones cerebrales en el periodo perinatal pueden provocar parálisis cerebral, en la que también intervienen las células microgliales en la leucomalacia peri-ventricular que sigue a la lesión.
Existe una fuerte e inmediata necesidad en la técnica de tratamientos clínicamente efectivos para todas estas enfermedades, y la inhibición de la vía común de destrucción de tejidos mediada por la microglía, como se proporciona en la presente divulgación, satisface esta necesidad.
El documento WO03/080121 describe una composición y el uso de la composición que exhibe actividad antiinflamatoria que comprende un polímero macromolecular momodisperso tal como un dendrímero que tiene una pluralidad de grupos terminales o tales moléculas unidas/formadoras de complejos con fragmentos de fármacos que tienen actividad antiinflamatoria o que ayudan a la actividad antiinflamatoria y su uso en la formulación farmacéutica para tratar enfermedades o estados patológicos asociados con la inflamación.
Sumario de la invención
Se proporciona una composición que comprende un polímero de poliamidoamina escala nanométrica(PAMAM) ramificado dendrimérico a escala nanométrica con un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores a un agente biológicamente activo para la entrega selectiva del polímero de poliamidoamina (PAMAM) ramificado en dendrimérico a escala nanométrica a un sitio de neuroinflamación y/o inflamación del ojo para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación y/o inflamación del ojo, en el que el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios y antioxidantes.. El componente biológicamente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en esteroides naturales como Progestinas Pregnenolona, 17-hidroxiprenolona Progesterona, 17-hidroxiprogesterona, Andrógenos, Androstenediona, 4-hidroxi-Androstenediona11p-hidroxiandrostenediona, Androstanediol, Androsterona, Epiandrosterona, Adrenosterona, Dehidroepiandrosterona, Sulfato de Dehidroepiandrosterona, Testosterona, Epitestosterona, 5a-dihidrotestosterona, 5p-dihidrotestosterona, 1 1p-hidroxitestosterona, 11-cetotestosterona, Estrógenos, Estrona, Estradiol, Corticosteroides, Corticosterona, Desoxicorticosterona, Cortisol, 11-Deoxicortisol, Cortisona, 18-hidroxicorticosterona, 1a-hidroxicorticosterona, Aldosterona, esteroides sintéticos y otros agentes antiinflamatorios. El compuesto biológicamente activo puede ser acetónido de fluocinolona, ranibizumab, minociclina, rapamicina, metil prednisona, dexametasona, vitamina A, vitamina C, vitamina E y un antioxidante, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En la composición, el tamaño de la nanopartícula es igual o inferior a unos 1000 nm, menos de unos 500 nm, menos de unos 200 nm, menos de unos 150 nm, menos de unos 100 nm, menos de unos 90 nm, menos de unos 80 nm, menos de unos 70 nm, menos de unos 60 nm, menos de unos 50 nm, menos de unos 40 nm, menos de unos 30 nm, menos de unos 20 nm, menos de unos 19 nm, menos de unos 18 nm, menos de unos 17 nm, menos de unos 16 nm, menos de unos 15 nm, menos de unos 14 nm, menos de unos 13 nm, menos de unos 12 nm, menos de unos 11 nm, menos de unos 10 nm, menos de unos 5 nm, menos de unos 4 nm, menos de unos 3 nm, menos de unos 2 nm, menos de unos 1 nm, o cualquier valor intermedio o inferior.
La nanopartícula de la composición es un polímero de poliamidoamina (PAMAM) ramificado dendrimérico a escala nanométrica con un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores, con un agente biológicamente activo. La nanopartícula blanda puede tener un diámetro de 1,5 nanómetros a 14,5 nanómetros. El espaciador puede consistir en un péptido, ácido glutárico o PEG para unir el fármaco y el polímero La nanopartícula del fármaco puede incorporarse en una entidad a mayor escala que incorpore el polímero hiperramificado del fármaco, en la que la entidad a mayor escala consiste en una matriz polimérica, una micropartícula, una nanopartícula, un liposoma, una microcápsula, una nanocápsula o un implante de liberación controlada.
El nanoconjugado dendrímero-fármaco puede administrarse solo o incorporarse a una preparación tópica, a un recubrimiento de un dispositivo implantado, a un sistema de administración de fármacos implantado, a un hidrogel inyectable o implantable o puede incorporarse a una lente de contacto. Puede inyectarse en la circulación sistémica, puede administrarse en la superficie del ojo en forma de lente de contacto, aplicarse en forma de gota o introducirse en el estroma corneal. Puede aplicarse en el espacio subconjuntival, en el espacio subtenoniano, en el espacio epiescleral o intrascleralmente. Puede administrarse en la coroides, el espacio supracoroideo, el espacio subretiniano, el espacio epirretiniano, el espacio intravítreo o la cámara anterior.
La formulación de polímero hiperramificado a escala nanométrica puede aplicarse como revestimiento en un dispositivo implantable.
La composición puede proporcionar una liberación sostenida del compuesto activo durante un período de tiempo. La liberación puede producirse en un periodo de minutos, horas, días, meses o años.
La composición puede proporcionar un suministro sostenido del compuesto a un sitio objetivo en un paciente. El lugar de destino puede ser el vítreo del ojo, y la administración sostenida puede durar segundos, minutos, horas, días, semanas o meses.
La composición puede comprender al menos un compuesto antiinflamatorio conjugado con un dendrímero, en el que la composición está encapsulada en una partícula biodegradable seleccionada del grupo que consiste en una nanopartícula de PLA o una micropartícula de PGLA. El dendrímero puede ser PAMAM-G4-OH y el compuesto antiinflamatorio puede seleccionarse del grupo que consiste en esteroides naturales o sintéticos, como acetónido de fluocinolona, metil prednisona o dexametasona, un antioxidante, un antibiótico como la minociclina, un inmunomodulador o un inmunosupresor.
La composición se utiliza en el tratamiento de la neuroinflamación, y/o la inflamación del ojo. La neuroinflamación, y/o la inflamación del ojo pueden ser causadas por una o más de las siguientes: retinitis pigmentosa, degeneración macular asociada a la edad, neuritis óptica de parálisis cerebral, lesiones contundentes y penetrantes, infecciones, sarcoide, anemia de células falciformes, desprendimiento de retina arteritis temporal, isquemia retiniana, retinopatía arterioesclerótica, retinopatía hipertensiva, obstrucción de la arteria retiniana, obstrucción de la vena retiniana, hipotensión, retinopatía diabética, edema macular, accidente cerebrovascular, uveítis, degeneración de los fotorreceptores, retinopatía autoinmune, degeneración hereditaria de los fotorreceptores, degeneración miope de la retina, degeneración del epitelio pigmentario de la retina, retinopatía diabética, retinopatía serosa central, retinopatía oculta zonal externa aguda, epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal aguda, síndrome del punto blanco evanescente múltiple, retinopatía asociada al cáncer, vasculitis retiniana, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, traumatismos cerebrales o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos convulsivos, alcoholismo, envejecimiento y pérdida neuronal.
Las composiciones también pueden utilizarse para tratar la pérdida de visión progresiva en un ser humano. La pérdida de visión progresiva puede estar asociada con al menos una afección seleccionada del grupo que consiste en uveítis, degeneración macular asociada a la edad, retinopatía diabética y retinitis pigmentaria. Las composiciones también pueden utilizarse para tratar la neuroinflamación ocular. La composición para estos usos puede administrarse una vez, o dos o más veces durante un período de días, semanas o meses.
También se describe en el presente documento un dispositivo médico que comprende una formulación de nanopartículas a escala nanométrica, en la que la formulación comprende al menos un compuesto biológicamente activo, e instrucciones para administrar la composición.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La figura 1 muestra la captación de dendrímeros por parte de las células microgliales mediante citometría de flujo. Se indican las células de control y se comparan con la captación celular de dendrímeros con diferentes grupos funcionales (COOH, NH2 y OH).
Figura 2. La figura 2A-F es una serie de fotografías que muestran la biodistribución retiniana de FITC libre y FITC conjugado con dendrímero (D-FITC) en ratas Sprague-Dawley (SD) sanas y en ratas modelo de degeneración retiniana del Royal College of Surgeons (RCS) con neuroinflamación activa. La histología de epifluorescencia de las criosecciones de la retina realizadas 24 horas y 10 días después de la inyección intravítrea muestra (A) la distribución de D-FITC en ratas SD normales a las 24 horas; (B) la distribución de D-FITC en el modelo de neurodegeneración de la retina RCS a las 24 horas; (C) D-FITC retenido dentro de las áreas de neuroinflamación a los 10 días; (D) distribución de D-FITC libre en SD a las 24 horas; (E) D-FITC libre distribuido uniformemente en la retina de ratas RCS a las 24 horas; y (F) D-FITC libre eliminado de la retina en ratas RCS a los 10 días después de la inyección.
Figura 3. Las figuras 3A y B son gráficos de barras. (A) Amplitudes medias de la onda b del ERG en ratas RCS de 9 semanas de edad, cuatro semanas después de una única inyección de 1 jl en el ojo derecho de 1 |jg o 3 |jg de dendrímero-FA (D-FA) o de FA libre no conjugado. Existe una preservación significativa de la amplitud del ERG con el tratamiento con dendrímeros-FA en comparación con el tratamiento con FA solo o con las ratas de control no tratadas. (B) Densidades celulares de la capa nuclear externa en las mismas ratas RCS de 9 semanas con datos de los IDDI de 0,2 jg/día y 0,5 jg/día.
Figura 4. La figura 4 muestra la biodistribución del complejo G4OH-64Cu en ratones. Los dendrímeros G4NH2 y G4OH formaron complejos con 64Cu y fueron inyectados en ratones adultos para determinar la biodistribución de los dendrímeros con diferente carga superficial. Se trazaron regiones de interés para varios órganos y la radiactividad normalizada a la dosis inyectada y al peso del animal se expresó como valor de captación estándar (SUV) para cada uno de los órganos. Los ratones adultos fueron inyectados con 50uCi de dendrímero-64Cu complejo IV. El SUV se representa en el tiempo para diferentes órganos. Figura 5. La figura 5A-D muestra una histología de 24 horas después de la inyección de FITC. (A) Distribución del dendrímero-FITC (D-FITC) en la retina de Sprague-Dawley (SD); (B) Distribución del D
FITC en la retina de ratas RCS; (C) Distribución del FITC no conjugado en SD; (D) Microesferas de PLGA-D-FITC en SD.
Figura 6. La figura 6 muestra un esquema de la síntesis del dendrímero PAMAM-G4-OH-acetónido de fluocinolona. El espaciador de ácido glutárico alivia el obstáculo estérico en la superficie del dendrímero, permitiendo la liberación intracelular del fármaco. El conjugado de fluocinolona resultante es soluble en agua, aunque el fármaco no sea soluble en agua a concentraciones comparables
Figura 7. La figura 7 es un gráfico de barras que muestra los recuentos de microglía dentro de la zona externa de residuos celulares en la retina de ratas de control de nueve semanas de edad y de ratas a las que se les administraron diferentes dosis de acetónido de fluocinolona.
Figura 8. La figura 8 muestra una disminución de la [11C] PK11195 desde los primeros diez minutos hasta los últimos (similar a las crías de control) se observa en la cría del día 5 postnatal expuesta a la endotoxina in útero que fue tratada con minociclina 15mg/kg durante tres días, lo que sugiere una disminución de las células microgliales activadas. Un aumento de laPK11195en la cría expuesta a la endotoxina sin tratar en los últimos diez minutos en comparación con los primeros diez minutos, lo que sugiere la presencia continua de células microgliales activadas en las crías no tratadas con endotoxina. Esto indica que el tratamiento con minociclina ha dado lugar a la inhibición de las células microgliales activadas en la cría expuesta a la endotoxina.
Figura 9. Las figuras 9A y B son gráficos de barras que muestran (A) las amplitudes medias de la onda b del ERG en ratas RCS tratadas con dosis sostenidas de 0,2 pg/día y 0,5 pg/día de AF durante cuatro semanas en el ojo derecho, en comparación con los grupos no quirúrgicos y de implantes inactivos de fármacos, y (B) la densidad media de células nucleares externas en los mismos cuatro grupos de ratas RCS, según el cuadrante de la retina.
Figura 10. La figura 10(A-F) muestra la biodistribución retiniana del FITC libre y del FITC conjugado con dendrímero (D-FITC) en ratas Sprague-Dawley (SD) sanas y del modelo de degeneración retiniana del Royal College of Surgeons (RCS) con neuroinflamación activa. (A) Distribución de D-FITC en ratas SD normales a las 24 horas. (B) Distribución de D-FITC en el modelo de neurodegeneración de la retina RCS a las 24 horas. (C), D-FITC (RCS) a los diez días; (D), Free-FITC (SD) a las 24 horas; (E), Free-FITC (RCS) a las 24 horas; y (F), Free-FITC (RCS) a los diez días.
Figura 11. La figura 11(A-D) muestra la captación microglial de D-FITC. (A) Etiquetado inmunohistoquímico con ED-1 de las células microgliales de la retina interna; (B) captación de D-FITc dentro de la microglía de la retina interna (60x); (C) microglía activada marcada con ED-1 en la retina externa; y (D) captación de D-FITC dentro de la microglía activada.
Figura 12. La figura 12A muestra la inmunotinción de la proteína fibrilar glial ácida (GFAP) de los astrocitos retinales activados. La figura 12B muestra la captación del dendrímero-FITC por parte de los astrocitos de la retina activados.
Figura 13. La Figura 13A muestra el etiquetado de GFAP de las células de Mueller de la retina activadas en ratas RCS de 5 semanas (vista lateral). La figura 13B muestra la captación de D-FITC por parte de las células de Mueller de la retina activadas (mismo campo que en A). La flecha muestra la captación de D-FITC en el capilar de la retina. La Figura 13C muestra el etiquetado GFAP de las células de Mueller de la retina (vista axial) en la capa nuclear interna. La figura 13D muestra la captación de D-FITC por las células de Mueller de la retina (vista axial).
Figura 14. La figura 14 es una fotografía que muestra la captación de D-FITC por parte de los fotorreceptores de la retina en ratas RCS de 5 semanas.
Figura 15. La figura 15(A y B) muestra la captación de D-FITC por los capilares de la retina. (A) vista lateral y (B) vista lateral con vista de la sección transversal del vaso.
Figura 16. La Figura 16(A y B) son fotografías que muestran la biodistribución de las nanopartículas en la retina interna de ratas S334-ter-4, setenta y dos horas después de la inyección intravítrea. Verde: Nanopartículas de PS marcadas con FITC, Rojo: Rodamina GFAP. (A) Se observan nanopartículas de FITC de 50 nm dentro de los somatos de los astrocitos. B) Las nanopartículas de FITC de 200 nm permanecen confinadas en el vítreo prerretiniano y no parecen ser tomadas por las células que captan el dendrímero.
Descripción detallada de la invención
A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención.
Introducción. Muchos productos farmacéuticos y fármacos eficaces no alcanzan el tejido diana, o no permanecen en la zona diana, durante el tiempo suficiente para lograr la eficacia clínica. Un ejemplo es el corticoide sintético acetónido de fluocinolona para la uveítis grave. La uveítis se refiere a la inflamación o hinchazón de las estructuras del ojo responsables de su riego sanguíneo. Estas estructuras se conocen colectivamente como el tracto uveal, e incluyen el iris, el cuerpo ciliar y la coroides. La uveítis se clasifica en función de las estructuras a las que afecta, la causa subyacente y si es crónica (más de seis semanas) o aguda.
Los implantes para la administración intravítrea sostenida de acetónido de fluocinolona están aprobados por la FDA para pacientes con uveítis. Sin embargo, los inconvenientes de estos implantes incluyen múltiples procedimientos de incisión para la implantación quirúrgica, una incidencia del cincuenta por ciento de glaucoma y el carácter no erosionable de los implantes. Otro fármaco ejemplar es el agente antiinflamatorio minocila, que tiene potencial para tratar la neuroinflamación en la retina y el cerebro.
Un objetivo subyacente de la presente divulgación es proporcionar nuevos materiales y métodos para reducir la activación de la microglía y la glía a un fenotipo citotóxico y/o fagocítico asociado a la neuroinflamación. Dicha activación es común a una variedad de enfermedades y, al reducirla, se puede disminuir o eliminar la destrucción asociada del tejido normal transeúnte. Al hacerlo, las manifestaciones patológicas del daño tisular pueden reducirse significativamente, lo que lleva a una reducción de la gravedad clínica de la enfermedad y a una mejora de la salud y la calidad de vida. Cualquier enfermedad en la que la microglía activada, la glía o la infiltración de macrófagos sistémicos desempeñen un papel es susceptible de ser tratada como se describe en el presente documento. Además, la presente invención puede abordar el papel que desempeñan los vasos sanguíneos en las enfermedades neuroinflamatorias. Los ejemplos de enfermedades descritos en este documento no pretenden ser limitativos, como tampoco lo son los medicamentos y las composiciones farmacéuticas.
Una enfermedad adecuada es la degeneración macular relacionada con la edad (ARMD). La ARMD se clasifica como húmeda (neovascular) o seca (no neovascular). Alrededor del 10% de los pacientes que sufren degeneración macular tienen ARMD húmeda. Este tipo se produce cuando se forman nuevos vasos para mejorar el suministro de sangre al tejido retiniano privado de oxígeno. Sin embargo, los nuevos vasos son muy delicados y se rompen con facilidad, provocando hemorragias y daños en el tejido circundante. El tipo seco es mucho más común y se caracteriza por drusas y pérdida de pigmento en la retina. Las drusas son pequeños depósitos amarillentos que se forman en las capas de la retina. Estos contienen material antigénico que puede activar la neuroinflamación de la retina.
Otra enfermedad es la retinopatía diabética, que se refiere al efecto de la diabetes en el ojo. Las personas con diabetes pueden desarrollar problemas oculares como cataratas y glaucoma, pero el efecto de la enfermedad sobre la retina es la principal causa de pérdida de visión. Con el tiempo, la diabetes afecta al sistema circulatorio de la retina. La fase más temprana de la enfermedad se conoce como retinopatía diabética de fondo. En esta fase, las arterias de la retina se debilitan y tienen fugas, formando pequeñas hemorragias en forma de puntos. Estas fugas de los vasos sanguíneos pueden dar lugar a una inflamación o edema en la retina, causando una disminución de la visión.
Puede seguir la retinopatía diabética proliferativa, en la que los problemas circulatorios hacen que las zonas de la retina se queden sin oxígeno o se vuelvan isquémicas. Se desarrollan nuevos y frágiles vasos a medida que el sistema circulatorio intenta mantener niveles adecuados de oxígeno dentro de la retina. Esta fase se denomina neovascularización y se caracteriza por la presencia de vasos delicados que sangran con facilidad. La sangre puede filtrarse en la retina y el vítreo, provocando manchas o moscas volantes, además de una disminución de la visión. A medida que la enfermedad avanza, el continuo crecimiento anormal de los vasos y el tejido cicatricial pueden causar problemas que empeoran, como el desprendimiento de retina y el glaucoma. Por lo tanto, es importante controlar y prevenir la neovascularización y así eliminar la fuga de sangre. En virtud de su biodistribución, los dendrímeros pueden dirigirse a los cambios neuroinflamatorios en los vasos sanguíneos y tratarlos mediante el suministro de moléculas terapéuticas.
La retinosis pigmentaria (RP) es una enfermedad rara y hereditaria que hace que los fotorreceptores de la retina sufran una degeneración gradual. La enfermedad puede ser un rasgo ligado al cromosoma X (se transmite de la madre al hijo), autosómico recesivo (se requieren genes de ambos padres) o autosómico dominante (se requieren genes de uno de los padres). Como suele ser una enfermedad ligada al sexo, la retinosis pigmentaria afecta más a los hombres que a las mujeres. El curso de la RP varía. Para algunas personas, el efecto sobre la visión puede ser leve. En otros, la enfermedad puede progresar hasta la ceguera.
Para ayudar a describir los presentes métodos de tratamiento, se utilizan los siguientes términos asociados a la estructura y función del ojo. La "retina" es un tejido sensorial de varias capas que recubre el fondo del ojo. Contiene millones de fotorreceptores que captan los rayos de luz y los convierten en impulsos eléctricos. Estos impulsos viajan por el nervio óptico hasta el cerebro, donde se convierten en imágenes. En la retina hay dos tipos de fotorreceptores: los bastones y los conos. La retina contiene aproximadamente seis millones de conos. Los conos están contenidos en la mácula, la porción de la retina responsable de la visión central. Se encuentran más densamente en la fóvea, la parte central de la mácula. Los conos funcionan mejor con luz brillante y permiten reconocer los colores.
El "vitreo" es una sustancia espesa y transparente que llena el centro del ojo. Se compone principalmente de agua y comprende alrededor de dos tercios del volumen del ojo, lo que le da forma y figura. Las propiedades viscosas del vítreo permiten que el ojo vuelva a su forma normal si se comprime. En los niños, el vítreo tiene una consistencia similar a la de una clara de huevo. Con la edad se adelgaza gradualmente y se vuelve más líquida. El vítreo está firmemente unido a ciertas zonas de la retina. A medida que el vítreo se adelgaza, se separa de la retina, provocando a menudo moscas volantes.
El vítreo se encuentra dentro del segmento posterior del ojo, y es una vía para la administración de fármacos que se dirigen al crecimiento anormal de los vasos sanguíneos que caracterizan a varias de las enfermedades aquí tratadas. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo (ranibizumab) dirigido al factor de crecimiento endotelial vascular humano A (VEGF-A) se inyecta en la porción vítrea una vez al mes. Sin embargo, el procedimiento de inyección en sí mismo puede causar efectos adversos graves, como inflamación del interior del ojo, desprendimiento de retina, desgarro de retina y otros problemas. Por lo tanto, un tratamiento que requiera menos inyecciones o procedimientos de administración probablemente disminuirá los efectos adversos no deseados y traumáticos.
El "cuerpo ciliar" está situado cerca de la parte delantera del ojo, por encima y por debajo del cristalino. Es el objetivo de los fármacos para el tratamiento del glaucoma. Produce humor acuoso, por lo que reducir la producción de humor acuoso provoca una disminución de la presión intraocular.
Así, dependiendo de la localización del evento patológico, como la sobreproducción de humor acuoso, el crecimiento de vasos sanguíneos anormales o la activación no deseada de células neuroinflamatorias en la retina, la administración de fármacos según los presentes métodos y composiciones puede adaptarse para dirigirse a las células y tejidos específicos. Se han estudiado y descrito las vías de administración al ojo, por ejemplo en el documento Lee, T. W. et al., J. Ocular Pharm. 20:43-53 y 55-64 (2004). Dichas vías de administración estarán dentro de la habilidad de los profesionales médicos por los que se practicarán los presentes métodos y composiciones. Otras afecciones y/o enfermedades relacionadas en las que se trata la neuroinflamación, y/o la inflamación del ojo con las composiciones de uso aquí divulgadas incluyen la retinosis pigmentaria, la degeneración macular, la parálisis cerebral, la neuritis óptica, las lesiones contundentes y penetrantes, las infecciones, el sarcoide, la anemia falciforme, el desprendimiento de retina, la arteritis temporal, la isquemia retiniana retinopatía arteriosclerótica, retinopatía hipertensiva, obstrucción de la arteria retiniana, obstrucción de la vena retiniana, hipotensión, retinopatía diabética, edema macular, accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, traumatismo cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos convulsivos, alcoholismo, envejecimiento y pérdida neuronal.
Microglía. Las microglías son miembros residentes del sistema inmunitario dendrítico dentro de la retina y el sistema nervioso central (CNS) y se activan por muchos estímulos, incluidos los lipopolisacáridos de la pared celular bacteriana y los gangliósidos dentro de las membranas lipídicas dañadas. (Jou, I. et al., The American Journal of Pathology 2006; 168:1619-1630 Min, K.J. et al., Glia 2004; 48:197-206 Pyo, H. et al., The Journal of Biological Chemistry 1999; 274:34584-34589.)
En el caso de la enfermedad ocular, las membranas de las células fotorreceptoras dañadas proporcionan un estímulo antigénico para la activación microglial. Tras su activación, la microglía asume un fenotipo fagocítico, migra hacia los fotorreceptores en degeneración y elimina los residuos celulares. Además, la microglía activada orquesta el reclutamiento y la activación de otras microglías a través de citoquinas quimiotácticas como CCL-5 (RANTES), proteínas inflamatorias de los macrófagos (MIP-1a y MIP-1p), proteínas quimioatrayentes de los macrófagos MCP-1 y MCP-3.
Tras asumir el fenotipo activado, la microglía libera radicales libres citotóxicos como el NO y el anión superóxido, así como citoquinas proinflamatorias como el TNF-a, la IL-1 y la IL-6, lo que provoca un mayor daño a las células fotorreceptoras (lisis de transeúntes). Si no se amortigua, se induce un ciclo de retroalimentación positiva de la muerte de las células fotorreceptoras mediada por la microglía que, a su vez, exacerba la lisis de los fotorreceptores adicionales por parte de los transeúntes, con lo que se acopla la apoptosis y la necrosis de los fotorreceptores, acelerando la progresión de la enfermedad.
Las células microgliales constituyen alrededor del 10-20% de las células del cerebro adulto y forman parte de los sistemas normales de vigilancia del sistema nervioso central. Se sabe que las células microgliales se activan ante estímulos como el traumatismo, la infección, la inflamación y la isquemia. Como resultado de estos estímulos, se produce la regulación al alza de una serie de marcadores de adhesión celular junto con la secreción de mediadores proinflamatorios, la generación de especies reactivas de oxígeno y de peroxinitros que pueden conducir a un mayor daño neuronal. (Zeng, H.Y. et al., Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 46:2992-2999, 2005 Bell, M.J. et al., J. Neurosci. Res.
70:570-579, 2002.)
Un objetivo para tratar las enfermedades neuroinflamatorias del ojo es dirigir los fármacos al segmento posterior del ojo. Con el envejecimiento, el epitelio pigmentario de la retina (RPE) puede perder a veces su capacidad de procesar los productos de desecho producidos por las células fotorreceptoras. Los depósitos de estos residuos, denominados
drusas, pueden distorsionar y dañar la retina, lo que provoca una enfermedad ocular denominada degeneración macular seca. Otros lugares potenciales para dirigir fármacos en el ojo son los vasos sanguíneos, las células neuroinflamatorias, el epitelio pigmentario de la retina, el nervio óptico, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo ciliar.
La continua persistencia de la enfermedad ocular asociada a la activación microglial es una prueba de la necesidad de nuevos tratamientos, y un parámetro importante para introducir un nuevo tratamiento es su comparación con las terapias existentes. Ha habido intentos de introducir fármacos mediante formulaciones de liberación sostenida, pero ninguno ha logrado un éxito generalizado.
En el caso de las nanopartículas, el tamaño de la partícula afecta a la cinética intravítrea. Se observaron micro y nanoesferas de poliestireno marcadas con fluorescencia (2 pm, 200 nm y 50 nm de diámetro) en la cavidad vítrea de conejos durante más de un mes (Eiji Sakurai, H.O. et al., Ophthalmic Research 33:31-36 (2001)). Los estudios histológicos realizados con un microscopio de fluorescencia revelaron que se observaron partículas de 2 pm de diámetro en la cavidad vítrea y en la malla trabecular, mientras que también se observaron nanoesferas con un diámetro inferior a 200 nm en la retina y en los tejidos (Eiji Sakurai, H.O. et al., Ophthalmic Research 33:31-36 (2001)).
Bourges et a l. informaron de estudios de administración de fármacos oculares dirigidos a la retina y al epitelio pigmentario de la retina utilizando nanopartículas (NP) de polilactida (PLA) (Jean-Louis Bourges, S. E. G. et al., Investigative Opthalmology & Visual Science 44:3562-3569 (2003)). Se estudió la cinética y la localización de la nanopartícula de polilactida (PLA) en los tejidos intraoculares. Se realizó una única inyección intravítrea (5 pl) de la suspensión de NP (2,2 mg/ml) que encapsulaba Rh-6G (molécula fluorescente) en ratas Lewis. Las NP de PLA no causaron efectos adversos de toxicidad, y se localizaron preferentemente en las células del RPE. El Rh-6G encapsulado se difunde desde las NP y tiñe la neurorretina y las células del RPE. Esto sugirió que es factible la focalización específica de estos tejidos. Las NP se encontraron dentro de las células del RPE durante cuatro meses después de una única inyección (Jean-Louis Bourges, S. E. G. et al., Investigative Opthalmology & Visual Science 44(8):3562-3569 (2003)). Este resultado demuestra que se puede conseguir un suministro estable y continuo de fármacos a las células del RPE. Si el tamaño de las NP es pequeño (“ < 200nm), pueden ser captadas por los RPE, y si el tamaño es “ > 2 pm, entonces pueden permanecer en la cámara vítrea en gran medida.
En la actualidad, no existen tratamientos eficaces para la RP y la ARMD atrófica (seca). Los estudios clínicos han identificado que el antioxidante oral, palmitato de vitamina A 15.000 Ul/d, retrasa la progresión de la pérdida de ERG en pacientes con retinosis pigmentaria (Berson, E.L. et al. Arch Ophthalmol 111(11): 1456-9 (1993)). El Age-Related Eye Disease Study identificó además que el betacaroteno, la vitamina E, la vitamina C, el zinc y el cobre tomados por vía oral, reducían el riesgo de los pacientes con características de alto riesgo de ARMD atrófica de progresar a la forma neovascular en aproximadamente un 25% (AREDS Study Group, 2001). Además, se ha informado de un ensayo clínico de fase II del factor neurotrófico derivado de la ciliación. Esta molécula tiene fuertes efectos antiapoptóticos. En los modelos animales de RP que recibieron el fármaco, se ralentizó la degeneración de los fotorreceptores, pero no se conservaron las amplitudes del ERG (Liang, F.Q. et al. Mol Ther 4(5):461-72 (2001) Tao, W. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 43(10):3292-8 (2002) Sieving, P.A. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(10):3896-901 (2006) Tao, W., Expert Opin Biol Ther 6(7):717-26 (2006) Zeiss, C.J. et al., Exp Eye Res 82(3):395-404 (2006)).
Se ha demostrado que los esteroides, incluidos los glucocorticoides naturales y sintéticos, presentan propiedades neuroprotectoras a través de varios mecanismos: 1) se intercalan dentro de las membranas lipídicas, estabilizándolas mecánicamente (Ignarro, L.J., J Pharmacol Exp Ther 182(1):179-88 (1972) Horwitz, L.D. et a/., Free Radic Biol Med 21(6):743-53 (1996) Wang, Y. et al., J Pharmacol Exp Ther 277(2):714-20 (1996)); 2) como antioxidantes, inhiben la peroxidación lipídica (Eversole, R. R., et al. Circ Shock 40(2):125-31 (1993) Horwitz, L.D., et al. Free Radic Biol Med 21(6):743-53 (1996) Letteron, P., et al. Am J Physiol 272(5 Pt 1):G1141-50 (1997)); 3) inhiben la AP-1 (una molécula de señalización pro-apoptótica) (González, M. V., et al. J Cell Biol 150(5): 1199-208 (2000) Wenzel, A., et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 42(7):1653-9 (2001)); y 4) mediante sus potentes efectos antiinflamatorios, suprimen la activación microglial y su capacidad de producir antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), NO y TNF-alfa (Kiefer, R., et al., J Neuroimmunol 34(2-3):99-108 (1991); Hall 1993 Lehmann, C., et al. Crit Care Med 27(6):1164-7 (1999)Chang, J., et al. Nuerochem Res 25(7):903-8 (2000) Drew, P. D. et al., Brain Res Bull 52(5):391-6 (2000) Dinkel, K. et al., J Neurochem 84(4):705-16 (2003) Lieb, K. et al., Neurochem Int 42(2):131-7 (2003) Glezer, I. et al., Neuroscientist 10(6):538-52 (2004)).
Los efectos neuroprotectores y antiapoptóticos de los antioxidantes se han demostrado en los fotorreceptores en varios estudios (Carmody, R. J. et al., Exp Cell Res 248(2):520-30 (1999) Sanvicens, N. et al., J Biol Chem 279(38) :39268-78 (2004) Tanito, M. et al. J Neurosci 25(9) :2396-404 (2005)). Algunos esteroides glucocorticoides y no glucocorticoides ejercen efectos antioxidantes y son neuroprotectores en modelos de neurodegeneración retiniana aguda y crónica (Behl, C. et al., Mol Pharmacol 51(4):535-41 (1997) Wenzel, A. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 42(7):1653-9 (2001) Dykens, J. A. et al., Biochem Pharmacol 68(10) :1971 -84 (2004)). Se ha demostrado que los estrógenos son neuroprotectores contra los factores de estrés oxidativo in vitro e in vivo en modelos animales transgénicos de RP (Dykens, J. A. et al., Biochem Pharmacol 68(10) :1971 -84 (2004) Sanvicens, N. et al., J Biol Chem 279(38) :39268-78 (2004)).
Se comprobó que los glucocorticoides inhiben el Fas, que es un mediador principal de la apoptosis en las células inmunológicas circulantes, como los linfocitos T y los neutrófilos, mediante la regulación específica de la expresión del gen Fas (Cox, G. J. Immunol. 154(9):4719-25.1995 Yang, Y. et al., J. Exp. Med. 181:1673-82, 1995 Chang, L.C. et al., J. Endocrinol. 183:569-83.2004). La capacidad de los esteroides para unirse a los radicales libres se demostró en la degeneración de las células neuronales de la médula espinal asociada a un traumatismo en los seres humanos (Hall 1993) y en el tejido uveal dañado por el estrés oxidativo en un modelo de rata Wistar de uveítis crónica (Augustin, A.J. et al., Br J Ophthalmol 80(5):451-7, 1996). Inyecciones intravítreas de triamcinolona en conejos albinos (Dierks, Lei et al., Arch. Ophthalmol. 123(11 ):1563-92005) mejoraron los umbrales del ERG y se asociaron a una mejor morfología de la retina.
Los receptores de glucocorticoides también se localizaron en las células fotorreceptoras apoptóticas de la retina degenerada del ratón y pueden activarse en respuesta a la inyección intraocular de dexametasona. Una vez activadas, inhiben una proteína activadora (AP)-1 y reducen las reacciones apoptóticas. En los ojos tratados con dexametasona, se observó una preservación morfológica de la capa celular nuclear externa de la retina (Wenzel, A. et al., Invest Ophthalmol Vis. Sci. 42(7):1653-9 (2001)).
Los informes mencionados anteriormente confirman la necesidad de tratamientos más eficaces para estas enfermedades y afecciones. Dichos tratamientos son proporcionados por las composiciones y métodos aquí divulgados.
Nanodispositivos y nanosistemas. En el presente documento, "nanodispositivos" y/o "nanosistemas" pueden utilizarse indistintamente, y pueden referirse a micropartículas o nanopartículas que comprenden dendrímeros y al menos otro agente terapéutico.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "micropartícula" o "sistema de micropartículas" se refiere generalmente a micropartículas o microcápsulas que tienen un diámetro de aproximadamente menos de 1 nm a aproximadamente 2.000 nm, con un diámetro preferentemente de entre 100-500 nm. Además, las "nanopartículas" suelen tener un rango de diámetro de menos de 1 nm a 1000 nm. Como se proporciona en este documento, la presente invención se refiere a una serie de formulaciones de nanopartículas biocompatibles en forma de nanodispositivos que pueden utilizarse, por ejemplo, como vehículos de administración de fármacos que han sido diseñados para retener y/o administrar fármacos u otros agentes terapéuticos durante un período de tiempo prolongado. Estas formulaciones permiten la modificación a un tamaño deseable, proporcionan una resistencia mecánica adecuada y presentan una permeabilidad y unas características superficiales excepcionales. Así, las formulaciones pueden contener matrices poliméricas, liposomas, microcápsulas, nanocápsulas, implantes de liberación controlada y similares. Una nanopartícula preferida es una nanopartícula blanda.
Los nanodispositivos descritos en el presente documento pueden permitir una dosis única del agente terapéutico al sujeto, o múltiples dosis administradas a un sujeto, preferiblemente durante un período de tiempo prolongado. Los nanodispositivos pueden permitir una liberación controlada de al menos un agente terapéutico durante un periodo de al menos varias horas, al menos varios días, al menos varias semanas o al menos varios meses.
Una ventaja conferida por la presente invención se relaciona con el control mejorado de la permeabilidad de las partículas y la tasa de liberación del fármaco conjugado o adsorbido a la periferia de la nanopartícula. Los nanodispositivos comprenden polímeros de poliamidoamina (PAMAM) ramificados dendriméricos con un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores, con un agente biológicamente activo.
Antes de utilizar las nanopartículas (que comprenden dendrímeros), las partículas pueden ser crioprotegidas o liofilizadas para extender la vida terapéutica de la nanopartícula. La crioprotección de las nanopartículas, con la estabilización concomitante, se realiza mediante la liofilización. A continuación, las partículas lavadas se suspenden en una solución crioprotectora y la liofilización de la suspensión se realiza en un aparato de liofilización adecuado. Dendrímeros. Según la presente divulgación, la composición que comprende un polímero de poliamidoamina (PAMAM) ramificado dendrimérico a escala nanométrica con un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores, con un agente biológicamente activo. Los dendrímeros de poli (amidoamina) con núcleo de etilendiamina (denominados "PAMAM") representan una clase de arquitectura macromolecular denominada polímeros en "estrella densa". El dendrímero puede ser un dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) de generación 4 o 5 (G4 o G5, respectivamente) parcialmente acetilado.
A diferencia de los polímeros clásicos, estos dendrímeros se fabrican en una serie de pasos repetitivos que comienzan con un núcleo iniciador central. Cada paso de crecimiento posterior representa una nueva "generación" de polímero con un diámetro molecular mayor, el doble de sitios superficiales reactivos y aproximadamente el doble de peso molecular que la generación anterior. Los nanodispositivos de dendrímero-fármaco pueden empaquetarse a su vez para mejorar la liberación sostenida. Por ejemplo, pueden encapsularse en microesferas biodegradables de poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) como se describe con más detalle en el presente documento y en los Ejemplos.
Típicamente, las moléculas de dendrímero pueden tener diámetros que van de 1,5 nanómetros a 14,5 nanómetros, como por ejemplo de 3 a 10 nanómetros, que es comparable al tamaño de las proteínas pequeñas. Tienen una arquitectura tridimensional muy ramificada, con alta funcionalidad y muy baja polidispersidad (definida como la distribución de los pesos moleculares individuales en un lote de polímeros). En vista de estas características, son capaces de transportar muchas moléculas, como agentes farmacéuticos, y de poseer un tamaño homogéneo, lo que las hace adecuadas para modos de administración específicos, como el intraocular.
El agente farmacéutico de interés se une al dendrímero a través de un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores. La columna vertebral del dendrímero también puede tener sitios funcionales para incorporar fragmentos de focalización que faciliten la entrega al sitio biológico deseado. Los sitios funcionales también pueden permitir la modificación de la columna vertebral del dendrímero, por ejemplo para aumentar la hidrofilia y la solubilidad en medios acuosos, o para aumentar la solubilidad en regiones lipídicas.
Las ventajas de los dendrímeros incluyen el mantenimiento de los niveles del fármaco en rangos terapéuticamente deseables; la reducción o minimización de los efectos secundarios no deseados; la disminución de la cantidad de fármaco que tiene que ser administrado; la disminución del número de dosis, y en el caso de la administración ocular, formas menos invasivas de dosificación; y la mejora de la administración de fármacos que tienen vidas medias cortas. Algunas o todas estas ventajas entran en juego en las diversas composiciones y métodos aquí divulgados.
Los dendrímeros se preparan según métodos conocidos. Por ejemplo, La patente estadounidense n° 5.714.166proporciona métodos para preparar dendrímeros que tienen una variedad de tamaños y composiciones. Yang, H. et al., J. Biomater. Sci. Polímero Edn. 17:3-19 (2006) revisaron los métodos para asociar agentes terapéuticos con dendrímeros de las composiciones PAMAM. El agente puede quedar atrapado dentro de la "caja" dendrítica que consiste en una cáscara densamente empaquetada en la superficie del dendrímero. Los dendrímeros con PEG son útiles para mantener los agentes en un núcleo hidrofóbico y aumentar la solubilidad en agua de los agentes hidrofóbicos. Se pueden preparar conjugados de dendrímero-fármaco en los que el fármaco se conjuga con la superficie del dendrímero, o con el PEG que a su vez se une a la superficie del dendrímero.
En los Ejemplos aquí descritos, los dendrímeros PAMAM-G4-OH se conjugaron con acetónido de fluocinolona (FA) para su inyección en el ojo. La administración del dendrímero del fármaco ofrecía ventajas sobre el fármaco solo. Una dosis total de AF seis veces menor proporcionó una mayor eficacia funcional y neuroprotectora que el AF de liberación sostenida por sí solo, lo que confirma que es posible administrar menos fármaco cuando se conjuga con el dendrímero y, sin embargo, lograr los mismos o mayores efectos terapéuticos. Una vez que el dendrímero-FA fue tomado por las células, no estaba disponible para entrar en la circulación sistémica a corto plazo, ofreciendo otra ventaja sobre el fármaco libre. Los efectos cruzados entre ojos fueron menores en los ojos tratados con dendrímeros-FA que con el AF libre, lo que también se atribuyó a la mayor captación celular de los conjugados dendrímeros-FA.
Los dendrímeros adecuados para los presentes métodos y composiciones están disponibles comercialmente. Por ejemplo, existen dendrímeros PAMAM (Aldrich) con peso molecular, diámetro y grupos superficiales específicos, según la generación. En algunos Ejemplos del presente documento, los PAMAM-G4-OH (dendrímeros de cuarta generación con grupos terminales -OH) se obtuvieron de Aldrich. La elección de los dendrímeros dependerá de varios factores, entre ellos: la vía de administración, el tejido objetivo, el tipo de fármaco utilizado, la enfermedad o condición a tratar, la salud general del sujeto, la formulación del fármaco y otros.
"Asociado con" significa que el fármaco o el agente farmacéutico, o el agente de formación de imágenes o de focalización (denominados colectivamente como "agente") puede estar físicamente encapsulado o atrapado dentro del núcleo del dendrímero, dispersado parcial o totalmente en el dendrímero, o unido o vinculado al dendrímero o cualquier combinación de los mismos, por lo que la unión o el enlace es por medio de enlace covalente, enlace de hidrógeno, adsorción, absorción, enlace metálico, fuerzas de van der Waals o enlace iónico, o cualquier combinación de los mismos.
La asociación del agente y el dendrímero puede emplear opcionalmente enlazadores, conectores y/o espaciadores para facilitar la preparación o el uso de los conjugados de dendrímero. Los grupos de conexión adecuados son grupos que enlazan un director de focalización con el dendrímero sin perjudicar significativamente la eficacia del director o la eficacia de cualquier otro agente presente en el conjugado de dendrímero. Estos grupos de conexión pueden ser escindibles o no escindibles y se utilizan típicamente para evitar el impedimento estérico entre el director objetivo y el dendrímero. Dado que el tamaño, la forma y la densidad de los grupos funcionales de los dendrímeros pueden controlarse rigurosamente, hay muchas formas de asociar el material transportado con el dendrímero.
Por ejemplo, (a) puede haber una asociación de tipo covalente, coulómbica, hidrofóbica o de quelación entre el/los agente/s y entidades, típicamente grupos funcionales, localizados en o cerca de la superficie del dendrímero; (b) puede haber una asociación covalente, coulómbica, hidrofóbica o de tipo quelación entre el agente o agentes y los fragmentos en el interior del dendrímero; (c) el dendrímero puede prepararse con un interior predominantemente hueco, que permita el atrapamiento (por ejemplo., físicamente en el interior o por asociación con los fragmentos
interiores del dendrímero) del agente o agentes en el interior (volumen vacío), (por ejemplo, núcleos o dominios magnéticos o paramagnéticos creados por la quelación y reducción de iones metálicos al estado de valencia cero dentro del dendrímero).
Los dendrímeros que contienen interiores magnéticos pueden utilizarse para recoger diversas entidades bioactivas que pueden formar complejos con diversas superficies de dendrímeros mediante el uso de imanes y similares, en los que la liberación del material transportado puede controlarse opcionalmente congestionando la superficie del dendrímero con fragmentos que controlan la difusión; o (d) pueden emplearse diversas combinaciones de las opciones mencionadas. Los dendrímeros útiles en los presentes métodos y composiciones incluyen los polímeros de estrella densa descritos en las patentes de EE.UU. Pat. N° 4.507.466, 4.558.120, 4.568.737 o 4.587.329.
Los agentes farmacéuticos que son adecuados para su uso en los conjugados de dendrímeros se seleccionan del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios y antioxidantes, por ejemplo, pero sin limitarse a acetónido de fluocinolona, minociclina y una citoquina. El experto apreciará que los factores proactivos pueden ser contrarrestados por factores antiactivos (como ARNsi, microARN, antisentido, anticuerpos inhibidores, etc.).
Para el tratamiento de la forma húmeda de la degeneración macular, cualquiera de los agentes terapéuticos actualmente disponibles es susceptible de ser administrado utilizando los conjugados de dendrímero aquí presentes, incluyendo Macugen® (inyección de pegaptanib sódico); ranibizumab, bevacizumab, VEGF-trap, Retaane® (acetato de anecortave); y el profármaco Combretastatina A4. También es posible la combinación con otras formas de tratamiento de la ARMD, como uno de los tratamientos anteriores en combinación con una terapia activada por luz (por ejemplo, fotocoagulación o terapia fotodinámica), como con Visudyne®, vitaminas (en particular, vitamina A, vitamina C, vitamina E u otras), minerales (en particular, zinc). Los dendrímeros también pueden combinarse con la radioterapia, la terapia térmica, la cirugía, etc.
La carga superficial de los dendrímeros puede tener un impacto significativo en el transporte intracelular y la liberación de fármacos de los dendrímeros (Kannan, S. et al., J of Biomaterials Science: Edición de Polímeros. 2004; 15(3):311 Khandare, J. et al., Bioconjugate Chem. 2005; 60:330-337 Perumal et al., Biomaterials.2008; 29:3469-3476). El uso de dichos dendrímeros para administrar y prolongar la presencia local de fármacos se ve respaldado por el reconocimiento de que los dendrímeros fueron absorbidos preferentemente por las células microgliales tanto in vitro como in vivo, como se describe en detalle en el Ejemplo 1 del presente documento. Los dendrímeros de la generación 4 de PAMAM con grupos terminales -OH (pAmAM-G4-OH) fueron eficaces para la captación de células microgliales y la liberación intracelular de fármacos, según se midió en un modelo de rata.
In vitro, las células microgliales fueron tratadas con o sin dendrímeros PAMAM-G4 marcados con FITC que tenían diferentes grupos funcionales, y la captación se determinó utilizando un citómetro de flujo. Los dendrímeros con grupos funcionales -OH mostraron una mayor captación que los dendrímeros con grupos funcionales -NH2 o -COOH. Los dendrímeros -OH fueron rápidamente endocitados por las células microgliales.
También se han sugerido dendrímeros de aminoácidos. Por ejemplo, Marano et al. investigaron la capacidad de los dendrímeros de aminoácidos lipofílicos para administrar el oligonucleótido del factor de crecimiento endotelial vascular (ODN-1) en ojos de rata para inhibir la neovasularización coroidea (CNV) inducida por láser. (Marano, R.J. et al., Nature Gene Therapy 12:1544-1550 (2005)) El nanodispositivo no mostró efectos adversos y fue tolerado a largo plazo. Se observó que el conjugado dendrímero-ODN-1 penetraba en las capas celulares de la retina hasta alcanzar el epitelio pigmentario de la misma. El conjugado mostró una eficacia apreciable en comparación con el nucleótido libre durante un periodo de cuatro a seis meses. El conjugado mostró una eficacia significativa y estuvo presente en los RPE en niveles elevados después de los dos primeros meses. En el caso de la administración de ODN-1, la eficacia terapéutica fue comparable a la de otros métodos de administración que requerían una inyección cada veintiocho días. Sin embargo, estos tratamientos tienen desventajas, como lo demuestra el hecho de que no hayan sido aceptados por la profesión ni utilizados ampliamente por los pacientes.
Las composiciones de dendrímero-fármaco son, por tanto, preferibles para el tratamiento de enfermedades oculares en las que se desea la captación del fármaco en las células. El fármaco se elige en función de la enfermedad a tratar, entre otros factores. El tamaño y la composición del dendrímero no se limitan a los probados aquí. Los tamaños de dendrímeros adecuados para la inyección ocular incluyen menos de unos 500 nm, menos de unos 200 nm, menos de unos 150 nm, menos de unos 100 nm, menos de unos 90 nm, menos de unos 80 nm, menos de unos 70 nm, menos de unos 60 nm, menos de unos 50 nm, menos de unos 40 nm, menos de unos 30 nm, menos de unos 20 nm, menos de unos 19 nm, menos de unos 18 nm, menos de unos 17 nm, menos de unos 16 nm, menos de unos 15 nm, menos de unos 14 nm, menos de unos 13 nm, menos de unos 12 nm, menos de unos 11 nm, menos de unos 10 nm, menos de unos 5 nm, menos de unos 4 nm, menos de unos 3 nm, menos de unos 2 nm, menos de unos 1 nm, o cualquier valor intermedio o inferior.
Los dendrímeros para uso ocular pueden estar compuestos por micelas poliméricas que incorporan un fármaco. Dichas micelas poliméricas pueden tener la forma de una nanopartícula que comprende una cadena polimérica hidrofílica como cubierta y una cadena polimérica hidrofóbica como núcleo. El término "escala nanométrica" se utiliza aquí para denotar toda la gama de tamaños por debajo del rango de "micropartículas", o por debajo de una micra (un micrómetro) de diámetro. No se limita a un corte de tamaño específico, y los rangos de tamaño proporcionados aquí
son ejemplares. Los tamaños de las partículas de la micela incluyen menos de unos 500 nm, menos de unos 200 nm, menos de unos 150 nm, menos de unos 100 nm, menos de unos 90 nm, menos de unos 80 nm, menos de unos 70 nm, menos de unos 60 nm, menos de unos 50 nm, menos de unos 40 nm, menos de unos 30 nm, menos de unos 20 nm, menos de unos 10 nm, menos de unos 5 nm, menos de unos 4 nm, menos de unos 3 nm, menos de unos 2 nm, menos de unos 1 nm, o cualquier valor intermedio o inferior.
Algunos ejemplos no limitantes de polímeros hidrofílicos que pueden utilizarse incluyen un óxido de polialquileno como el polioxietileno, el polietilenglicol, el ácido polimálico, el ácido poliaspártico y similares. Entre los ejemplos del polímero hidrofóbico que puede utilizarse se encuentran la polilactona, el poliaminoácido hidrofóbico, el poliestireno, el éster de polimetacrilato y similares. Puede formarse un copolímero en bloque entre la cadena polimérica hidrofílica y la cadena polimérica hidrofóbica. Para formar el núcleo hidrofóbico puede utilizarse un polímero cargado aniónico o catiónico, como un polipéptido (como el ácido poliaspártico), una poliamina o un ácido policarboxílico. También puede utilizarse un complejo de polión de tipo núcleo-caparazón que tenga un núcleo que comprenda la cadena polimérica cargada y un electrolito polimérico como un polipéptido, aminoácido o un polipéptido.
Generalmente, se pueden utilizar polímeros no biodegradables o biodegradables para formar las micropartículas. Las micropartículas pueden estar formadas por un polímero biodegradable. Los polímeros no biodegradables pueden utilizarse para la administración oral. En general, se prefieren los polímeros sintéticos, aunque pueden utilizarse polímeros naturales que tienen propiedades equivalentes o incluso mejores, especialmente algunos de los biopolímeros naturales que se degradan por hidrólisis, como algunos de los polihidroxialcanoatos. Los polímeros sintéticos representativos son poli(hidroxiácidos) como el poli(ácido láctico), el poli(ácido glicólico) y el poli(ácido láctico-co-glicólico), la poli(lactida), la poli(glicolida), la poli(lactida-co-glicolida), los polianhídridos, los poliortoésteres, las poliamidas, los policarbonatos, polialquilenos como el polietileno y el polipropileno, polialquilenglicoles como el poli(etilenglicol), óxidos de polialquileno como el poli(óxido de etileno), tereftalatos de polialquileno como el poli(tereftalato de etileno) alcoholes de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo como el poli(cloruro de vinilo), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poli(alcoholes de vinilo), poli(acetato de vinilo), poliestireno, los poliuretanos y sus copolímeros, las celulosas derivadas, como la alquilcelulosa, las hidroxialquilcelulosas, los éteres de celulosa, los ésteres de celulosa, las nitrocelulosas, la metilcelulosa, la etilcelulosa, la hidroxipropilcelulosa hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, y sal sódica de sulfato de celulosa (denominados conjuntamente en el presente documento "celulosas sintéticas"), polímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico o copolímeros de los mismos, incluidos los ésteres, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo) poli(butilmetacrilato), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo) poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo) (denominados conjuntamente en el presente documento "ácidos poliacrílicos"), poli(ácido butírico), poli(ácido valérico) y poli(lactida-co-caprolactona), copolímeros y mezclas de los mismos. Tal y como se utiliza en este documento, los "derivados" incluyen polímeros con sustituciones, adiciones de grupos químicos y otras modificaciones realizadas habitualmente por los expertos en la materia.
Los ejemplos de polímeros naturales preferidos incluyen proteínas como la albúmina, el colágeno, la gelatina y las prolaminas, por ejemplo, la zeína, y polisacáridos como el alginato, la celulosa y los polihidroxialcanoatos, por ejemplo, el polihidroxibutirato. La estabilidad in vivo de las micropartículas puede ajustarse durante la producción utilizando polímeros como el poli(lactida-co-glicolida) copolimerizado con polietilenglicol (PEG). Si el PEG está expuesto en la superficie externa, puede aumentar el tiempo de circulación de estos materiales debido a la hidrofilia del PEG.
Los dispositivos de suministro de dendrímeros están diseñados para liberar las moléculas que se encapsulan o adhieren durante un período de días a semanas. Los factores que afectan a la duración de la liberación son el pH del medio circundante (mayor tasa de liberación a pH 5 e inferior debido a la hidrólisis catalizada por el ácido del PLGA) y la composición del polímero. Los poliésteres lipofílicos difieren en su hidrofobicidad y eso, a su vez, afecta a la velocidad de degradación. En concreto, el poli (ácido láctico) hidrofóbico (PLA), el poli (ácido glicólico) PGA más hidrofílico y sus copolímeros, el poli (lactida-co-glicolida) (PLGA) tienen diversas tasas de liberación. La tasa de degradación de estos polímeros, y a menudo la correspondiente tasa de liberación del fármaco, puede variar desde días (PGA) hasta meses (PLA) y es fácilmente manipulable variando la proporción de PLA y PGA.
Modelos animales. Entre las enfermedades susceptibles de ser tratadas aquí se encuentran la degeneración macular asociada a la edad (ARMD) y la retinosis pigmentaria (RP), que comparten una patología subyacente común que puede ser estudiada en animales antes de los ensayos clínicos. Ambas enfermedades presentan anormalidades bioquímicas que dañan los fotorreceptores directa y/o indirectamente como consecuencia del deterioro de la función del epitelio pigmentario de la retina. El daño de los fotorreceptores se produce en última instancia a nivel de las membranas celulares o mitocondriales. Cuando las membranas externas de las mitocondrias se dañan a través de la peroxidación de lípidos (normalmente como consecuencia del estrés oxidativo en la retina enferma), puede producirse una afluencia excesiva de calcio y aniones superóxido en la matriz mitocondrial (Marchetti, P., et al. J Exp Med 184(3):1155-60 (1996) Green, D.R., et al. Science 305(5684):626-9 (2004) Spierings, D., et al. Science 310(5745):66-7 (2005)). En respuesta a esta sobrecarga de superóxido y/o calcio (apoptosis
inducida por calpaína), las mitocondrias liberan citocromo c al citosol, donde interactúa con APAF-1 y la caspasa-9 para formar el apoptosoma. Este proceso apoptótico conduce a la terminación de la reparación, replicación y transducción del ADN y a la muerte celular. En consecuencia, los antioxidantes y los fármacos que estabilizan las membranas externas de las mitocondrias son neuroprotectores por su capacidad para antagonizar la muerte celular apoptótica.
Cuando la superficie de los fotorreceptores u otras membranas de la superficie celular dentro de la retina se dañan, las células microgliales que forman parte del sistema inmunitario mediado por células dendríticas de la retina, y que normalmente son quiescentes en condiciones saludables, pueden activarse para matar y fagocitar las células dañadas. La microglía activada, mediadora de la neuroinflamación retiniana, libera proteínas citotóxicas como el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), especies reactivas de oxígeno como el óxido nítrico (NO), citocinas, quimiocinas, proteasas y complemento. Todo ello puede provocar daños en las células fotorreceptoras de la retina externa.
El modelo neurodegenerativo de rata del Royal College of Surgeons (RCS) es adecuado para probar los tratamientos para la ARMD y los mecanismos de la enfermedad de la RP, como se ha comentado anteriormente. El modelo demuestra una significativa apoptosis (Tso, M. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 35(6):2693-9 (1994) Katai, N. et al., Invest Opthalmol Vis Sci 40(8): 1802-7 (1999)) y la muerte celular necrótica como consecuencia de la activación de la microglía (Thanos, S., Brain Res 588(l)-21-8 (1992) Thanos, S. et al., Int J Dev Neurosci 11(5):671 -80 (1993); de Kozak, Y. et al., Ocul Immunol Inflamm 5(2) :85-94 (1997) Akaishi, K. et al. Jpn J Ophthalmol 42(5) :357-62 (1998) Srinivasan, B. et al., Science 310(5745):66-7 (2004) Zeng, H.Y. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 46(8) :2992-9 (2005)). La retina neurosensorial de la rata RCS es bioquímicamente normal. Estas ratas poseen una mutación de la tirosina quinasa MERTK que reside en el RPE. Se ha identificado que esto causa RP en humanos (Gal, A. et al., Nat Genet 26(3):270-1 (2000)).
La mutación MERTK afecta a la capacidad del RPE para fagocitar los segmentos externos de los fotorreceptores de varilla desprendidos. La acumulación resultante de membranas celulares envejecidas, peroxidadas y dañadas dentro del espacio subretiniano (denominada zona de residuos celulares externos) es bioquímicamente similar a las drusas en pacientes con ARMD y actúa como un potente estímulo para la activación microglial de la retina. Los receptores toll-like microgliales se unen a las membranas lipídicas dañadas y se produce la activación microglial. En el modelo, los fotorreceptores sanos mueren o sufren daños en las membranas como espectadores inocentes cuando se exponen a las proteínas citotóxicas, el NO, las proteasas y el complemento liberados por la microglía activada. Estos fotorreceptores dañados o moribundos estimulan la activación adicional de las células microgliales en un proceso de amplificación neuroinflamatoria que conduce a la degeneración masiva de los fotorreceptores, a la pérdida de visión y a la extinción del electrorretinograma (ERG). Se ha caracterizado inmunohistoquímicamente la microglía activada fagocítica que contiene rodopsina en las retinas postmortem de pacientes con RP y ARMD (Gupta, N. et al., Exp Eye Res 76(4):463-71 (2003)).
El modelo de rata RCS descrito anteriormente es, por lo tanto, un modelo animal adecuado para los fines de la presente divulgación, y puede utilizarse para ensayar formulaciones de dendrímeros y nanodispositivos y microdispositivos híbridos que comprenden conjugados de dendrímeros y nanopartículas o micropartículas que encapsulan los conjugados. Un experto en la materia estará familiarizado con el uso de los controles apropiados, aunque también se proporcionan orientaciones en los Ejemplos del presente documento.
Para probar el efecto in vivo, ratas sanas y ratas con neuroinflamación activa (modelo de degeneración de la retina) fueron tratadas con FITC libre y FITC conjugado con dendrímero. En el modelo de la enfermedad, el dendrímero-FITC mostró una mayor captación en la retina externa, especialmente en y entre la capa nuclear externa (ONL), la microglía activada y la zona externa de residuos celulares. Este patrón de captación no se observó en las retinas sanas. Estos datos apoyan una ventaja de los presentes nanodispositivos de dendrímeros-fármacos: los conjugados de dendrímeros-fármacos demuestran una mayor captación en las sublaminas de la retina que sufren procesos neuroinflamatorios activos y otros procesos neurodegenerativos.
Los resultados de este experimento también mostraron que los conjugados de dendrímero no fueron eliminados de la retina tan rápidamente como el FITC libre. Este resultado respalda una segunda ventaja de los nanodispositivos aquí divulgados: los conjugados dendrímero-fármaco fueron capaces de prolongar el tiempo de residencia de los fármacos en zonas de neuroinflamación activa como la glía, la microglía, el epitelio pigmentario de la retina y los vasos sanguíneos, mejorando la eficacia farmacodinámica, dirigiéndose a sublaminas retinianas específicas, reduciendo la cantidad total que debe administrarse y reduciendo potencialmente los efectos secundarios del fármaco.
El FITC fue una molécula de prueba para determinar los parámetros de entrega del dendrímero. Los fármacos clínicos, como el AF y la minociclina, se utilizan para probar la entrega de una molécula biológicamente activa, y el tratamiento con minociclina condujo a la supresión de la activación de las células microgliales in vivo. Brevemente, el tratamiento postnatal con minociclina disminuyó el curso temporal de la activación microglial, tal y como se determinó mediante imágenes microPET utilizando el ligando específico microglial [11C] PK11195. (Ejemplo 6.)
Fármacos y agentes terapéuticos ejemplares. La elección del fármaco o de la composición farmacéutica dependerá principalmente de la enfermedad a tratar o de la afección a prevenir. Por ejemplo, el corticosteroide sintético acetónido de fluocinolona (FA) está aprobado por la FDA para su administración intravítrea crónica como parte de un sistema de liberación sostenida para pacientes con uveítis grave (Jaffe, G.J. et al., Ophthalmology 2000;107:2024-2033 Jaffe, G.J. et al., Ophthalmology 2006;113:1020-1027 Jaffe, G.J. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 2000;41:3569-3575). La Minociclina es conocida por sus propiedades antiinflamatorias y se utiliza para tratar las afecciones neuroinflamatorias.
Se ha demostrado que la minociclina y la doxiciclina reducen la inflamación después de una lesión cerebral. De acuerdo con los métodos basados en dendrímeros aquí expuestos, la entrega de agentes antiinflamatorios como la minociclina específicamente a las células microgliales conduce a una disminución de la neuroinflamación y por lo tanto disminuye la lesión. El ejemplo 6 muestra que la minociclina disminuye la neuroinflamación al reducir la activación de las células de la microglía.
Los Ejemplos fueron diseñados para demostrar que los nanodispositivos pueden proporcionar una entrega mejorada de fármacos, debido a su captación celular preferencial por las células microgliales, y una liberación intracelular sostenida de fármacos que resulta en una mejora significativa de la eficacia terapéutica. Los experimentos se realizaron in vivo en el modelo de rata de degeneración macular descrito anteriormente. Los resultados son significativos y tienen utilidad y aplicabilidad industrial porque los nanodispositivos basados en dendrímeros pueden desarrollarse ahora como una potente plataforma en el tratamiento de la neuroinflamación en diversas patologías oculares.
Un sistema adecuado de administración de fármacos, como el enfoque aquí divulgado, puede mejorar y mantener la eficacia de estos fármacos, así como de otros desarrollados para el tratamiento de enfermedades mediadas por la microglía y otras enfermedades inflamatorias del ojo. Los resultados de los Ejemplos aquí expuestos muestran que los conjugados dendrímeros-fármacos muestran una mejor eficacia terapéutica en la neuroprotección de la retina en comparación con el fármaco libre solo o con los implantes de fármacos de liberación sostenida. Como ejemplo de esta vía de tratamiento mejorada, se utilizó el modelo de degeneración de la retina en ratas para comparar los nanodispositivos de acetónido de dendrímero-fluocinolona (D-FA) inyectados con las inyecciones de FA libre y los implantes de liberación sostenida de fármacos intravítreos (IDDI) que liberan FA libre a un ritmo diario sostenido. El AF está actualmente aprobado para la administración ocular, por ejemplo como un implante estéril. El implante está diseñado para liberar FA localmente en el segmento posterior del ojo a una tasa inicial nominal de 0,6 pg/día, disminuyendo durante el primer mes hasta un estado estable entre 0,3-0,4 pg/día durante aproximadamente 30 meses. Las presentes composiciones mejoran el tratamiento existente, eliminando la necesidad de implantación y sustituyéndola por una inyección menos invasiva de un conjugado dendrímero-FA.
Hubo una preservación significativa de la amplitud del ERG con el tratamiento con dendrímeros-FA en comparación con el tratamiento con FA solo o con las ratas de control no tratadas. Las densidades de las células de la capa nuclear externa en ratas RCS de 9 semanas se compararon con los datos de los IDDI de 0,2 pg/día y 0,5 pg/día. Las mayores densidades celulares observadas en las ratas tratadas con D-FA indican una neuroprotección significativamente mayor en los ojos con D-FA frente a todas las formas de D-FA libre (p<0,001 para 1 pg y 3 pg de D-FA), incluidos los iDDI. Los efectos de cruce de los ojos del compañero fueron menores en los animales tratados con D-FA en comparación con todos los animales que recibieron AF no conjugado, incluidos los IDDI.
Sin estar atado a un mecanismo, esto parece deberse a la mayor captación celular de los nanodispositivos de D-FITC en las ratas RCS. Cuando la D-FA se introduce en las células, no está disponible para su redistribución en la circulación sistémica, a diferencia de lo que se observa con los fármacos no conjugados. En consecuencia, los efectos farmacodinámicos se potencian a dosis más bajas. Las inyecciones de D-FA dieron lugar a una mayor eficacia funcional (ERG) y neuroprotectora (recuentos de ONL) con una dosis total de FA seis veces menor.
Otra cuestión importante en la introducción de un nuevo tratamiento es la capacidad de obtener imágenes de la captación y distribución del fármaco o dispositivo dirigido. En el presente caso de los nanodispositivos de dendrímero, la captación de dendrímero por parte de las células microgliales puede ser visualizada en tiempo real mediante imágenes de microPET. Para demostrarlo, se examinó la biodistribución del complejo G4OH-64Cu en ratones. (Figura 4.) Los dendrímeros G4NH2 y G4OH formaron complejos con 64Cu y fueron inyectados en ratones adultos para determinar la biodistribución de los dendrímeros con diferente carga superficial. Se trazaron regiones de interés para varios órganos y la radiactividad normalizada a la dosis inyectada y al peso del animal se expresó como valor de captación estándar (SUV) para cada uno de los órganos. Los ratones adultos fueron inyectados con 50uCi de dendrímero-64Cu complejo IV. Los dendrímeros G4-OH mostraron una mejor captación cerebral que los dendrímeros G4-NH2. Esto demuestra que la imagen en tiempo real mediante micro-PET puede utilizarse para cuantificar la captación de complejos dendrímero-minociclina 64Cu por parte de las células microgliales en el cerebro. Las composiciones de dendrímeros-conjugados pueden contener opcionalmente otros ingredientes activos, aditivos y/o diluyentes. Las composiciones inyectables pueden estar en forma de suspensión o de solución. En forma de solución, el complejo se disuelve en un portador fisiológicamente aceptable. Dichos portadores comprenden un disolvente adecuado, conservantes como el alcohol bencílico, si es necesario, y tampones. Los disolventes útiles
incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes acuosos, glicoles y ésteres de fosfonato o carbonato. El conjugado del fármaco dendrímero puede incorporarse en vesículas o liposomas.
El conjugado puede encapsularse en un sistema huésped polimérico que puede ser degradable (es decir, copolímeros de ácido láctico-glicólico o un polímero de polianhídrido) o no degradable (copolímero de etilenovinilacetato). El conjugado puede incorporarse a una matriz de hidrogel que comprende poli(hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol).
Los ejemplos 7 y 11 del presente documento proporcionan y divulgan micropartículas para encapsular conjugados de dendrímero-fármaco. De acuerdo con el ejemplo 7, las microesferas de PLGA (poli(ácido láctico-co-glicólico) encapsularon conjugados de dendrímero-FITC. Los métodos para fabricar un dendrímero PAMAM con un núcleo protegido son conocidos en la técnica. La presente invención no se limita a ningún dendrímero particular de generaciones específicas. Por ejemplo, pueden utilizarse dendrímeros de G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10 0 superiores. El peso molecular y el número de grupos terminales aumentan exponencialmente en función de la generación (el número de capas) del polímero. Se pueden sintetizar diferentes tipos de dendrímeros en función de la estructura del núcleo que inicia el proceso de polimerización. Los dendrímeros pueden comprender dendrímeros G4. Las estructuras del núcleo del dendrímero dictan varias características de la molécula, como la forma general, la densidad y la funcionalidad de la superficie (Tomalia et al., Chem. Int. Ed. Engl. 29:5305 (1990)). Los dendrímeros esféricos pueden tener amoníaco como núcleo iniciador trivalente o etilendiamina (EDA) como núcleo iniciador tetravalente. Los dendrímeros con forma de barra descritos recientemente (Yin et al., J. Am. Chem. Soc. 120:2678 (1998)) utilizan núcleos lineales de polietilenoimina de longitudes variables; cuanto más largo es el núcleo, más larga es la varilla. Las macromoléculas dendríticas están disponibles comercialmente en cantidades de un kilogramo y se producen bajo los actuales buenos procesos de fabricación (GMP) para aplicaciones biotecnológicas.
Los dendrímeros pueden caracterizarse mediante una serie de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, la espectroscopia de masas de ionización por electrospray, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear de 13C, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear de 1H, la cromatografía líquida de alto rendimiento, la cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz láser multiángulo, el espectrofotómetro ultravioleta, la electroforesis capilar y la electroforesis en gel.
Se puede emplear una variedad de sistemas de recubrimiento entérico para ayudar a que el conjugado farmacológico de dendrímero pase por el estómago. El conjugado de dendrímeros puede formularse en un comprimido utilizando aglutinantes conocidos por los expertos en la materia. Estas formas farmacéuticas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Entre los comprimidos adecuados se encuentran los comprimidos, los comprimidos recubiertos de azúcar, los comprimidos recubiertos de película, los comprimidos entéricos, los comprimidos múltiples, los comprimidos de liberación controlada y otros similares.
Para tratar el crecimiento anormal o no deseado de los vasos sanguíneos, el agente terapéutico puede ser un agente antiangiogénico. Algunos ejemplos son el acetato de anecortave, el aptámero anti-VEGF, la AMD-FAB o el inhibidor de la proteína quinasa c. Pueden utilizarse otros agentes antiangiogénicos conocidos en la técnica. Así, otros agentes antiangiogénicos que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, esteroides y esteroides angiostáticos, inhibidores de la metaloproteinasa e interferones.
En un régimen de tratamiento no limitante, los dendrímeros PAMAM-G4-OH se conjugan con FA y se inyectan en el vítreo de un paciente al que se le ha diagnosticado ARMD en fase inicial. La concentración específica y/o la formulación de las nanopartículas y/o los dendrímeros aquí divulgados pueden variar en función de cualquier enfermedad o afección particular que deba tratarse. Por ejemplo, las formulaciones pueden administrarse diariamente, semanalmente, mensualmente o según sea necesario, a una dosis del fármaco que va desde al menos 1 ng, al menos 1,5ng, al menos 2,0 ng, y así sucesivamente hasta 2000 microgramos, al menos alrededor de 2,0jm, al menos alrededor de 2,5jm, al menos alrededor de 3,0jm, al menos alrededor de 5,0jm, al menos alrededor de 8.0|jm, al menos 10jm, al menos 12jm, al menos 15jm, al menos 20jm, al menos 25jm, al menos 30jm, al menos 35|jm, al menos 40jm, al menos 45jm, al menos 50jm, al menos 60jm, al menos unos 70jm, al menos unos 80jm, al menos unos 100jm, al menos unos 250jm, al menos unos 500jm, al menos unos 750jm, al menos unos 1000jm, al menos unos 1500jm, al menos unos 1800jm, al menos unos 2000jm, o cualquier valor intermedio. La eficacia del tratamiento puede evaluarse de acuerdo con las mediciones convencionales basadas en los estándares de la industria, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la evaluación mediante morfología macroscópica, histología, microbiología, patología, biología molecular (incluyendo el análisis de ADN, ARN o proteínas obtenidas del sujeto en tratamiento), así como la información relativa a los síntomas proporcionada por el sujeto, si es posible. el conjugado dendrímero-FA puede encapsularse en una nanopartícula de PLGA y administrarse al sujeto por vía intravenosa, oral, bucal, intraperitoneal, en un espacio articular, rectal, tópica, transdérmica (en particular para las preparaciones de liberación lenta), subcutánea por vía intramuscular, intranasal, intravítrea, supracoroidal, subretiniana, epiescleral, subtenoniana, intraescleral, epirretiniana, por inyección, por aerosol o de otras formas, dependiendo de la afección o enfermedad específica que deba tratarse, del órgano que deba tratarse o de otros factores. Preferentemente, las nanopartículas que comprenden los dendrímeros aquí divulgados se administran al
ojo en forma de gotas oculares, mediante la deposición de un gránulo en el ojo o alrededor de él, mediante la inyección en cualquier cámara dentro del ojo, por infusión directa a través del ojo, y similares. Las nanopartículas inventivas que comprenden los dendrímeros aquí divulgados pueden utilizarse para administrar el agente biológico al sistema nervioso de un sujeto, preferentemente el sistema nervioso central. Las células objetivo pueden incluir neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, células gliales u otras células o componentes asociados con el sistema nervioso del sujeto.
Las formulaciones alternativas de nanopartículas incluyen: nanopolvos, nanoclusters, nanocristales, nanoesferas, nanorods, nanocupas y otras partículas microscópicas con al menos una dimensión inferior a 100 nm.
Los Ejemplos que se presentan a continuación se incluyen únicamente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la gama de técnicas y protocolos en los que las composiciones de dendrímeros de la presente invención pueden encontrar utilidad, como podrá apreciar un experto en la materia, y pueden implementarse fácilmente.
Ejemplos
Ejemplo 1
Captación de dendrímeros por las células microgliales in vitro e in vivo
Se ha informado del papel de la carga superficial de los dendrímeros en el transporte intracelular y la liberación de fármacos desde los dendrímeros (Kannan, S. et al., J. Biomaterials Science: Edición de Polímeros. 2004; 15:311 Khandare, J. et al., Bioconjugate Chem. 2005; 60:330-337), pero no se ha informado previamente en relación con las células microgliales, un objetivo de los presentes esfuerzos terapéuticos.
Para estudiar el efecto del grupo superficial del dendrímero en la captación de las células microgliales, se trataron células microgliales (5x105 células/ml) con o sin (Ctrl) 10|jg de dendrímeros PAMAM-G4 marcados con FITC con diferentes grupos funcionales (-OH, -NH2 y -COOH) a 37°C durante 1 hora. La absorción de los dendrímeros se estimó utilizando un flujómetro Beckton Dickinson. Un aumento significativo de las intensidades de fluorescencia con las células de control indicó que los tres dendrímeros entraron rápidamente en las células, mostrando los dendrímeros PANAN-G4-OH una mayor captación que los otros dos. Los resultados se muestran en la Figura 1, e indican que los dendrímeros -OH fueron rápidamente endocitados por las células microgliales.
Se estudió la biodistribución retiniana del FITC libre y del FITC conjugado con dendrímero (D-FITC) en ratas Sprague-Dawley (SD) sanas y en ratas del modelo de degeneración retiniana del Royal College of Surgeons (RCS) con neuroinflamación activa. La histología de epifluorescencia de las criosecciones de la retina realizadas 24 horas y diez días después de la inyección intravítrea se muestra en la Figura 2A-F como sigue. (A) Distribución de D-FITC en ratas SD normales a las 24 horas; (B) Distribución de D-FITC en el modelo de neurodegeneración de la retina RCS a las 24 horas; la concentración de D-FITC dentro de la capa nuclear externa se denota con *, y se muestra una zona de residuos celulares, donde está presente la neuroinflamación activa; (C) El D-FITC se retiene dentro de las zonas de neuroinflamación a los diez días; (D) Distribución del D-FITC libre en la SD a las 24 horas; (E) El D-FITC libre se distribuye uniformemente en la retina de la rata RCS a las 24 horas; (F) El D-FITC libre se ha eliminado de la retina en las ratas RCS diez días después de la inyección, como se muestra en la Figura 2.
Como se evidencia en la retina de rata RCS en la Figura 2B, el D-FITC demostró una mayor captación en la retina externa, localizada precisamente en y entre la ONL, la microglía activada y la zona externa de residuos celulares. Este patrón de captación no se observó en ninguna de las retinas SD sanas (Figuras 2A, D). El rojo de las imágenes se debe a la autofluorescencia del filtro TRITC. El epitelio pigmentario de la retina (RPE) muestra una mayor fluorescencia de FITC en las retinas que recibieron inyecciones que contienen D-FITC. No se observó fluorescencia de FITC en el RPE de los ojos que recibieron inyecciones de FITC gratuitas. Este patrón fue cualitativamente similar a los diez días posteriores a la inyección. La señal de FITC presente en la Figura 2F es la autofluorescencia de la zona externa de residuos celulares. El RPE se había separado de la retina en esta imagen y no era visible.
Estos datos sugieren que las células que tienen altas tasas de endocitosis, como la microglía activada y el epitelio pigmentario de la retina, demuestran una mayor captación de conjugados de D-FITC. En consecuencia, los resultados apoyan la conclusión de que los conjugados de dendrímero-fármaco demostraron una mayor captación en las sublaminas de la retina sometidas a procesos neuroinflamatorios activos y otros procesos neurodegenerativos. Además, la Figura 2C demuestra que los conjugados de dendrímero no se eliminaron de la retina tan rápidamente como el FITC libre, Figura 2F.
Este ejemplo muestra que los conjugados de dendrímero-fármaco son capaces de prolongar el tiempo de residencia de los fármacos en áreas de neuroinflamación activa, mejorando así la eficacia farmacodinámica, dirigiéndose a sublaminas retinianas específicas, y reduciendo la cantidad total que debe administrarse, así como reduciendo potencialmente los efectos secundarios del fármaco.
Ejemplo 2
Conjugados de PAM-G4-oh-fluocinolona (D-FA) (nanodispositivos) comparados con implantes de liberación sostenida
La preparación y caracterización de los conjugados D-FA (nanodispositivo) se realizó como sigue. Se eligieron los dendrímeros PAMAM-G4-OH para la preparación de nanodispositivos. Jayanth Khandare, P.K. et al.. (2005) P. Kolhe, J.K. et al., Biomaterials 27:660-669 (2006). Los dendrímeros se obtuvieron de Aldrich y se dializaron para eliminar las pequeñas impurezas de baja generación que pudieran estar presentes. PAMAM-G4-OH (Mol. P = 14.217 Da, 64-OH grupos finales, tamaño- 5 nm) se conjugó utilizando una reacción de acoplamiento de diciclohexil carbodiimida (DCC) en dos pasos (Figura 6). La mezcla de reacción se agitó durante tres días y se filtró para eliminar el DCU.
El filtrado se dializó con DMSO durante tres días sustituyendo el DMSO después de cada día (corte de la membrana de diálisis 1000 Da) para eliminar los compuestos que no habían reaccionado. El producto dializado se secó al vacío para obtener el conjugado. Se utilizó RMN-1Hpara caracterizar el conjugado. La relación de conjugación fue de 4,5 moléculas de AF por molécula de dendrímero y son solubles en agua, según se determinó por el método de integración de protones. Esto sugiere un peso molecular del nanodispositivo de 16.700 Da.
Estos nanodispositivos se caracterizaron además por espectrometría de masas MALDI-TOF, que sugirió un peso molecular de 17.000 Da, lo que concuerda bien con los datos de RMN. La estabilidad del conjugado en DMSO se comprobó monitorizando la liberación del fármaco a través de una membrana de diálisis. El análisis por HPLC de las muestras que pasan al exterior de la membrana recogidas durante un periodo de 24 horas indicó que se liberó una fracción insignificante de fármaco del conjugado. Esto sugiere que el conjugado es muy estable, y que el AF libre (es decir, no conjugado) en el conjugado era mínimo después de la purificación.
Los efectos neuroprotectores de los nanodispositivos de dendrímero-FA (D-FA) se determinaron como sigue. Se compararon los efectos neuroprotectores de los nanodispositivos de D-FA inyectados por vía intravítrea con las inyecciones de D-FA libre y los IDDI que liberan D-FA libre a un ritmo diario sostenido. La figura 3B muestra las densidades celulares de la ONL para las inyecciones de 1 |jg y 3 |jg de D-FA y FA libre, además de los mismos datos para los IDDI mostrados en la figura (9). Aquí los 1jg y 3jg se refieren al contenido de AF en D-FA. Las densidades celulares de la ONL fueron mayores para la D-FA que las medidas para los IDDI y las inyecciones de AF libre. Las densidades de las hendiduras de la ONL fueron significativamente mayores en los grupos de inyección de D-FA de 1 jg y 3 jg que en los de D-FA libre de 1 jg (p<0,001 para D-FA de 1 jg y 3 jg). Los efectos cruzados entre ojos, descritos en el Ejemplo 6 para los IDDI y los observados con las inyecciones de 1 jg y 3 jg de D-FA en la Figura 3B, fueron menos pronunciados para los ojos inyectados con D-FA.
Sin estar ligado a un mecanismo específico, esto se debe probablemente a la mayor captación celular de los nanodispositivos de D-FITC en las ratas RCS, como se demuestra en la Figura 5. Cuando la D-FA se introduce en las células, no está disponible para su redistribución en la circulación sistémica, como se observa con los fármacos no conjugados. En consecuencia, los efectos farmacodinámicos se potencian a dosis más bajas. Las inyecciones de D-FA dieron lugar a una mayor eficacia funcional (ERG) y neuroprotectora (recuentos de ONL) con una dosis total de AF seis veces menor.
Ejemplo 3
El acetónido de fluocinolona fue neuroprotector en ratas RCS
De acuerdo con este Ejemplo, el esteroide acetónido de fluocinolona (FA) fue altamente neuroprotector en la ralentización de la degeneración de la retina de las ratas RCS cuando se administró a través de implantes de liberación sostenida de fármacos intravítreos (IDDI). La Figura 9B muestra las densidades de las células de la capa nuclear externa (cuerpo celular de los fotorreceptores) entre cuatro grupos de ratas RCS de nueve semanas que recibieron FA 0,2 jg/día, FA 0,5jg/día, implantes inactivos de administración de fármacos (en los ojos derechos) y controles no quirúrgicos durante el período de estudio de cuatro semanas. El análisis histológico cuantitativo mostró que las densidades celulares de la ONL en los ojos tratados con FA 0,2jg/día eran 2,38±0,12 veces mayores que en los controles no quirúrgicos (p<0,001) y 4,85±0,24 veces mayores que en el grupo de IDDI inactivo (p<0,001). En los ojos tratados con FA 0,5jg/día, los recuentos de ONL fueron 1,78±0,21 veces mayores que los ojos de control no quirúrgico (valor p con la prueba de Kruskal-Wallis=0,02) y 3,56±0,17 veces mayores que los ojos que recibieron los IDDI inactivos (p<0,001). No se observaron diferencias significativas en el recuento de células de la capa nuclear interna entre los grupos.
En otros experimentos, el acetónido de fluocinolona preservó las amplitudes de la onda b del electrorretinograma en los ojos tratados. Los datos de la ONL eran coherentes con los hallazgos del ERG en los mismos animales (Figura 9A). La comparación entre los grupos mostró que las amplitudes medias de las ondas b del ERG registradas en los ojos tratados con 0,2 jg/día y 0,5 jg/día eran significativamente mayores que las de los ojos de control no operados y tratados con placebo (p<0,001). Los ERG apoyaron la observación hecha en los datos del recuento de células de la ONL de que el grupo de dosis diaria más baja demostró una mayor eficacia neuroprotectora y funcional. Aunque los valores medios de la amplitud de la onda b en los ojos tratados con FA 0,5 jg/día fueron cuantitativamente
inferiores a los valores de los ojos tratados con FA 0,2 pg/día, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ellos (p=0,113).
Los IDDI demostraron un efecto cruzado relacionado con la dosis en ratas RCS. Cuantitativamente, las amplitudes de la onda b del ojo izquierdo del grupo tratado con FA 0,2pg/día en el punto de tiempo de cuatro semanas fueron mayores que las de los ojos derecho e izquierdo de control y del grupo de placebo. Las amplitudes medias de la onda b del ERG de los ojos izquierdos del grupo de FA 0,5 pg/día fueron significativamente diferentes de las de los ojos derecho e izquierdo de los animales de control no operados (p<0,03, con una potencia de análisis de 0,050:0,810, Kruskal-Wallis p=0,006). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las amplitudes medias de las ondas b del ERG de los ojos izquierdos del grupo tratado con FA 0,2pg/día frente a los ojos derechos o izquierdos del grupo tratado con placebo o los ojos derechos o izquierdos de los animales de control. Los efectos en el ojo del compañero se atribuyeron al cruce de fármacos. Esto se ve comúnmente en pequeños mamíferos en los que el volumen de distribución es pequeño. La observación de una respuesta al tratamiento en el ojo contralateral relacionada con la dosis indica que es probable que el fármaco libre abandone el ojo a través de los sistemas venosos epiescleral y/o vortex y se distribuya sistémicamente, tras lo cual presenta efectos farmacodinámicos en el ojo contralateral.
El FA suprimió la neuroinflamación en ratas RCS. Al examinar el mecanismo de acción de la AF en la preservación de la ONL y el ERG en la rata RCS, se realizó un análisis histológico cuantitativo de las células microgliales de la retina activadas utilizando el inmunomarcaje ED-1. La capa de fotorreceptores y la zona externa de residuos celulares de las ratas RCS contienen membranas lipídicas dañadas que amplifican el daño de los fotorreceptores al activar la microglía para que se convierta en fagocitadora y libere sustancias tóxicas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Las densidades de células microgliales activadas en la capa de residuos celulares de los ojos tratados con FA 0,2pg/día mostraron una disminución de cinco veces en comparación con los ojos de control no quirúrgico (p<0,001) y de nueve veces en comparación con los ojos que recibieron los IDDI inactivos (p<0,001). En los ojos tratados con FA 0,5pg/día, la densidad microglial activada en la zona de residuos celulares fue cuatro veces menor que en los ojos de control no quirúrgico (p<0,001) y siete veces menor que en los ojos que recibieron los IDDI inactivos (p<0,001).
Ejemplo 4
Los dendrímeros PAM-G4-OH muestran una mayor captación en la capa nuclear externa de las ratas RCS degeneradas, pero no en las ratas SD normales
La figura 5 muestra la histología de epifluorescencia de criosecciones de retina en ratas Sprague-Dawley (SD) y RCS. Se realizaron veinticuatro horas después de la inyección intravítrea con FITC libre no conjugado, FITC conjugado con dendrímero (D-FITC) y D-FITC encapsulado en microesferas de PLGA (PLGA-(D-FITC). Al examinar la retina de rata RCS en la Figura 5B, es evidente que el D-FITC demostró una mayor captación en la retina externa, localizada precisamente en y entre la ONL, la microglía activada y la zona externa de residuos celulares. Este patrón de captación no se observó en ninguna de las retinas SD sanas (Figuras 5A, C, D). El rojo de las imágenes se debe a la autofluorescencia del filtro TRITC.
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) demuestra una mayor fluorescencia de FITC en las retinas que recibieron inyecciones que contienen D-FITC. No se observó fluorescencia de FITC en el RPE de los ojos que recibieron inyecciones de FITC gratuitas. Este patrón fue cualitativamente similar a los 10 días después de la inyección. Estos datos sugieren que las células que tienen altas tasas de endocitosis, como la microglía activada y el epitelio pigmentario de la retina, demuestran una mayor captación de conjugados de D-FITC. En consecuencia, los conjugados de dendrímeros-FA (D-FA) probablemente demuestran una mayor captación en las sublaminas de la retina que sufren procesos neuroinflamatorios activos y otros procesos neurodegenerativos.
Ejemplo 5
Micropartículas de PLGA preparadas con conjugados dendrímeros-FITC encapsulados
Se prepararon micropartículas de PLGA con conjugados de dendrímero-FITC encapsulados de la siguiente manera. El método agua-en-aceite-en-agua (w/o/w) es adecuado para encapsular nanodispositivos solubles en agua como los conjugados dendrímeros-fármacos, a diferencia del método o/w que es ideal para fármacos insolubles en agua como el AF. (Jayanth Panyam, M. M. D. et al., Journal of Controlled Release 92:173-187 (2003) Jayanth Panyam, S. K. S. et al., International Journal of Pharmaceutics 262:1-11 (2003)). Cantidades adecuadas de PLGA (Mol. Wt.
90.000-125.000 Da; 75% PLA/25% PGA) se disolvieron en cloroformo. Por separado, se preparó una solución de PVA al 2,5% en agua destilada fría, saturada de cloroformo.
Se añadió una solución acuosa de conjugados de dendrímero-fármaco (10% P/V), en dos porciones, a la solución de PLGA con vortex durante un minuto después de cada adición. A continuación, se colocó en un baño de hielo durante cinco minutos y luego se emulsionó utilizando el sonicador FS 20 Bath (44-48 KHz, Fisher scientific) durante un minuto para obtener una emulsión de agua en aceite. A continuación, se añadió la emulsión primaria en dos porciones a 8 ml de la solución de PVA con vórtex intermitente para obtener la emulsión múltiple w/o/w.
La emulsión se colocó en un baño de hielo durante cinco minutos y luego se sonicó durante tres minutos. La emulsión se agitó durante la noche en una placa de agitación magnética para permitir la evaporación del cloroformo y la formación de las nanopartículas. La suspensión se transfirió a tubos de centrífuga ultra transparentes y se centrifugó a 14.000 rpm durante treinta minutos a 4° C en una ultracentrífuga. El pellet se resuspendió en agua destilada y se sonicó durante treinta segundos en un baño de hielo para dispersar los agregados. Se repitió la centrifugación dos veces más a 14.000 rpm, treinta minutos para eliminar el PVA y los conjugados no encapsulados de la formulación. Para evaluar el tamaño de las partículas se utilizó el microscopio electrónico de barrido (SEM) y el analizador de tamaño de partículas. A pesar de que el tamaño medio de las partículas era —5-10 pm, había cierta polidispersidad. La microscopía de fluorescencia sugirió que el conjugado D-FITC estaba "uniformemente" encapsulado.
La liberación del fármaco a partir de las microesferas de PLGA se estudió como sigue. Se analizó la cinética de liberación del fármaco para el acetónido de fluocinolona libre en las mismas microesferas de PLGA. Para — 5 -10 pm de microesferas (con un 5% en masa de AF), la liberación fue —0.5 pg/día (promedio) durante los primeros treinta días, con una liberación acumulada de —30% en un mes. Hubo una explosión inicial del 3% en los tres primeros días. En el caso de los conjugados dendrímeros-FA, la ráfaga inicial puede ser capaz de eliminarse debido a su tamaño relativamente mayor.
Ejemplo 6
El tratamiento con minociclina condujo a la supresión de la activación de las células microgliales in vivo De acuerdo con este Ejemplo, el tratamiento postnatal con minociclina disminuyó el curso temporal de la activación microglial, tal y como se determinó mediante imágenes microPET utilizando el ligando específico microglial [11C] PK11195. Para demostrar la inhibición microglial con el tratamiento con minociclina, se utilizó [11C] PK11195 en cachorros en el día 5 postnatal con y sin tratamiento de minociclina se determinó mediante imágenes PET.
Como se muestra en la Figura 8, una disminución de la [11C] PK11195 desde los primeros diez minutos hasta los últimos diez minutos (similar a las crías de control) se observó en la cría del día cinco postnatal expuesta a endotoxina en el útero que fue tratada con minociclina 15mg/kg durante tres días, lo que sugiere una disminución de las células microgliales activadas. Un aumento de la PK11195 en la cría expuesta a la endotoxina sin tratar en los últimos diez minutos en comparación con los primeros diez minutos, lo que sugiere la presencia continua de células microgliales activadas en las crías no tratadas con endotoxina. Esto indica que el tratamiento con minociclina produjo una inhibición de las células microgliales activadas en la cría expuesta a la endotoxina.
El tratamiento postnatal con minociclina mejoró el resultado neuroconductual en el octavo día postnatal, como se evidenció en las pruebas neuroconductuales de las crías de conejo en el octavo día postnatal. Se observaron los siguientes animales: (A) cachorro de control, (B) cachorro expuesto a endotoxina 20pg/kg in utero tratado con PBS; y (C) cachorro de endotoxina 20pg/kg tratado con 15mg/kg de minociclina, al octavo día de vida. Las crías expuestas a la endotoxina eran más tambaleantes, con mayor tono y menor equilibrio en comparación con las crías de control. Los miembros posteriores se abdujeron con un rango completo de movimiento en el cachorro de control A y en el cachorro tratado con 15mg/kg de minociclina (C) pero no en el cachorro no tratado (B). El tono de las extremidades posteriores era mayor en la cría (B), lo que provocaba una locomoción descoordinada y una disminución del equilibrio.
Una respuesta a la dosis de minociclina libre en este modelo mostró que 15 mg/kg de minociclina demostraron una mayor mejora en los déficits motores en comparación con 5 mg/kg. La disminución de la lesión de la sustancia blanca, que daría lugar a la mejora de los déficits motores debido a la supresión de la activación microglial, se confirmó mediante imágenes de tensor de difusión (DTI) e inmunohistoquímica. Como conclusión de este ejemplo, la minociclina tiene un efecto específico y clínicamente relevante al reducir la activación de las células microgliales asociada a la endotoxina en las crías de conejo in utero. Este fármaco y otros con efectos similares son adecuados para dirigirse a las células microgliales utilizando las composiciones de dendrímeros aquí divulgadas.
Ejemplo 7
Modelo de rata para la degeneración macular
Se estudia el rango de dosis de minociclina para la neuroprotección de los fotorreceptores y la supresión de la neuroinflamación retiniana. El objetivo de este ejemplo es determinar la eficacia de los nanodispositivos de dendrímero-minociclina (D-Mino). Basándose en la eficacia observada al conjugar acetónido de fluocinolona con dendrímeros, este Ejemplo está diseñado para evaluar la eficacia de los conjugados de D-Mino en la supresión de la neuroinflamación de la retina asociada al modelo de neurodegeneración de la rata RCS. La minociclina se utiliza porque es altamente neuroprotectora y suprime la microglía en la retina de la rata RCS. Chang, C. J. et al., Ophthalmic Res. 2005;37:202-13 Hughes, E. H. et al., Exp Eye Res. 2004; 78(6): 1077-84 Shimazawa, M. et al., Brain Res. 2005;1053:185-94 Zhang, C. et a/,. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:2753-9.
Se realiza un estudio de rango de dosis para identificar la dosis más eficaz de minociclina no conjugada (Free-Mino) inyectada intravítreamente para la neuroprotección de la retina en la rata RCS. Las dosis de D-Mino se determinan en función de las dosis óptimas de Free-Mino y de los datos de FA. Se utiliza el mismo modelo de rata RCS homocigótica recesiva de cinco semanas de duración utilizado en el Ejemplo 8.
Se establecen cuatro grupos de cinco animales. Estos incluyen grupos de inyección intravítrea que reciben 1|jg de Free-Mino, 10jg de Free-Mino, un grupo de inyección de fosfato-salina (PBS) y un grupo de control de inyección de PBS. El grupo PBS-(dendrímero libre) se utiliza para descartar cualquier efecto neuroprotector de los dendrímeros solos. Los animales se someten a inyecciones intravítreas bilaterales, según los métodos establecidos. Los animales son eutanasiados al mes para realizar un análisis histológico cuantitativo de los recuentos de células fotorreceptoras y microgliales en las sublaminas de la retina. Brevemente, los fotorreceptores se cuentan a partir de secciones de retina de 6 jm de H&E. La microglía retiniana se cuenta a partir de cortes de retina marcados con IBA-1 y ED-1 y de montajes completos.
Las amplitudes de la onda b del ERG en ratas RCS se registran como una medida de la función de los fotorreceptores, una vez cada dos semanas, según métodos bien establecidos. Se realiza un segundo estudio de cuatro semanas de duración con Free-Mino, basado en los resultados del primer estudio para mejorar la medición de la dosis óptima.
Posteriormente, se realiza un estudio de rango de dosis de cuatro grupos para D-Mino, utilizando los mismos métodos. Las dosis iniciales se basan en la potencia relativa de D-Mino a Free-Mino, según los datos de FA del Ejemplo 2. La dosis de D-Mino se afina aún más en un segundo estudio, basándose en el grado de neuroprotección y en el grado de supresión microglial observado en los estudios con minociclina, en comparación con los resultados de FA y Free-Mino,
Los datos de biodistribución de FITC en la Figura 2 demuestran la mejor localización (Figura 2B) y tiempo de residencia (Figura 2F) que la conjugación de dendrímeros confiere a los fármacos. El intervalo óptimo de dosificación de D-Mino se mide realizando un estudio de tres meses, similar a los descritos en este ejemplo, pero volviendo a dosificar D-Mino, basándose en una disminución del 10% de la amplitud del ERG (medida una vez cada dos semanas). De este modo, se utiliza una medida de la función retiniana para establecer el primer punto de tiempo de dos semanas en el que la inyección previa de D-Mino muestra una pérdida de eficacia. Al volver a dosificar, basándose en la función de la retina, se debería restablecer la estabilización del ERG. En el transcurso del estudio de tres meses, el intervalo de dosis que evite la pérdida progresiva de la amplitud del ERG será también el óptimo. Además, esto determinará la duración de la acción de una sola inyección de D-Mino.
Ejemplo 8
Biodistribución y tiempo de residencia de la FITC libre y de la D-FITC
El objetivo de este Ejemplo es identificar los requisitos de dosificación del dendrímero-fluocinolona (D-FA) para la neuroprotección retiniana sostenida utilizando inyecciones intravítreas de FITC libre y D-FITC. Los experimentos se realizan en ratas RCS albinas homocigóticas recesivas de ambos sexos, de cinco semanas de edad, con un peso de 150-180 gramos. Se establecen dos grupos de animales. El grupo de FITC libre consta de seis animales que reciben cada uno inyecciones bilaterales de FITC libre, 1jg. Otro grupo de diez animales recibe inyecciones intravítreas de D-FITC.
Antes de la inyección, los animales son anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) mediante inyección IP. Un volumen de 1 j l de 1jg de FITC disuelto en una pequeña cantidad de DMSO se inyecta mediante una jeringa Hamilton en la cavidad vítrea de cada ojo. Los animales inyectados con FITC libre son eutanasiados a los 10 días, al mes y a los dos meses. Los ojos se enuclean, se bisecan y los medios globos se incrustan en Tissue-Tek OCT Medium (Sakura Finetek, U.S.A., Torrance, Ca.) y luego se congelan rápidamente en nitrógeno líquido. Las secciones (14j) se cortan en un criostato (Leica Instruments, GmbH, Nussloch, Alemania), se montan (aún congeladas) en portaobjetos con Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, Ca.) y se examinan mediante imágenes digitales de epifluorescencia utilizando cubos de filtro FITC y TRITC separados.
Las imágenes se toman con una cámara digital MagnaFire (Olympus America, Melville, N.Y.). Las imágenes se evalúan en busca de las sublaminas de la retina que están etiquetadas para cada punto de tiempo. Además, se compara la cantidad relativa de intensidad de fluorescencia entre los cortes, con imágenes en cada punto de tiempo después de que el iluminador y la configuración de la cámara se hayan ajustado a los valores predeterminados de brillo y exposición. La configuración de la iluminación de epifluorescencia se ajusta de acuerdo con el valor de la intensidad de la imagen del CCD medido en la apertura de la cámara y los ajustes de exposición predeterminados, utilizando una concentración baja estandarizada de FITC. Este proceso de calibración de la señal FITC permite comparar la intensidad relativa del FITC dentro de cada sublamina de la retina como una medida relativa de la persistencia tisular del FITC. El mismo procedimiento se realiza en los animales que reciben un volumen de 1 jl de 1jg de D-FITC. De este modo, se comparan las diferencias relativas en la biodistribución del FITC libre y del D-FITC y la persistencia en el tejido, ya que la cámara CCD tiene una salida altamente lineal.
El grupo D-FITC consiste en diez animales a los que se les practica la eutanasia y se enuclean para obtener imágenes de epifluorescencia por criosección a los l0 días, al mes, a los dos meses, a los cuatro meses y a los seis meses. Para ambos grupos experimentales, el ojo compañero de cada animal que también ha sido sometido a la inyección intravítrea de FITC libre o D-FITC se utiliza para el ensayo fluorofotométrico de la fluorescencia vítrea y para la fluorescencia FITC de los homogeneizados de tejido. Esto permite determinar la cantidad relativa de FITC libre o D-FITC dentro del vítreo y el tejido de cada ojo en cada punto de tiempo. Se incluye un tercer grupo de animales, simultáneamente para examinar la biodistribución y la persistencia tisular del PLGA-(D-FITC). Un cuarto grupo de control, formado por un animal por punto temporal, sirve de control bilateral inyectado con vehículo para establecer los niveles de referencia de la autofluorescencia tisular.
La estimación de la D-FITC en el ojo se realiza como sigue. Para el estudio de biodistribución, a intervalos mensuales, se recoge el globo ocular y se homogeneiza el tejido y se disuelve en NaOH. Utilizando una combinación de extracción con disolvente con metanol (el D-FITC es soluble en metanol), y la posterior resuspensión en PBS, se extrae el D-FITC. El contenido de D-FITC se cuantifica, utilizando una curva de calibración UV/Vis y de fluorescencia previamente preparada a varias concentraciones de D-FITC.
La evaluación de la duración del efecto farmacodinámico de las inyecciones únicas de 0,2|jg y 1|jg de D-FA, así como el intervalo de dosis necesario para mantener la función retiniana de las ratas RCS, in vivo , se realiza como sigue. Uno de los objetivos es aislar la eficacia de los nanodispositivos D-FA, de la forma más específica posible, con los controles adecuados. Este experimento se realiza para examinar la duración de la acción de las inyecciones intravítreas únicas de 0,2jg y 1jg de D-FA en ratas RCS homocigóticas recesivas de ambos sexos, de cinco semanas de edad, con un peso de 150-180 gramos. Aquí, 0,2jg y 1jg se refieren al contenido de AF en las inyecciones de D-FA.
Se establecen cuatro grupos de diez animales. Estos incluyen un grupo de inyección intravítrea que recibe 1jg de D-FA, un grupo que recibe 0,2jg de D-FA, un grupo que recibe una solución p Bs que contiene (2% de DMSO con 1jg de D-FA libre y dendrímero libre) en cantidades equivalentes al grupo de 1jg de D-FA, y un grupo de control no quirúrgico. El grupo PBS-(free-FA, free-dendrimer) se utiliza para aislar la eficacia de la FA conjugado con dendrímero (D-FA). Los animales se someten a inyecciones intravítreas bilaterales, según los métodos descritos anteriormente. Cinco animales de cada grupo son eutanasiados al mes y a los tres meses para realizar un análisis histológico cuantitativo del recuento de células fotorreceptoras y de células microgliales en la sublamina de la retina. Estos se realizan con los métodos que se describen a continuación.
Las amplitudes de la onda b del ERG se registran en ratas RCS como una medida de la función de los fotorreceptores, una vez cada dos semanas, de acuerdo con los métodos siguientes. El intervalo de tiempo entre la inyección actual y la anterior se utiliza como un dato para determinar el intervalo de dosificación adecuado y la duración de la acción para las dos dosis de D-FA, 0,2jg y 1jg cuando se administran como inyecciones intravítreas en bolo único. Además, el grupo de inyección de control se reinyecta en los mismos puntos de tiempo que el grupo de D-FA 1jg. Esto asegurará que el grupo de control reciba el mismo número de inyecciones que el grupo de D-Fa i jg .
La electrorretinografía se realiza de la siguiente manera, utilizando rutinas de estimulación, registro y análisis de datos desarrolladas con el software Labview (National Instruments, Austin Texas). Los animales se adaptan a la oscuridad durante 12 horas durante la noche. Antes de las pruebas, los animales son anestesiados con una inyección intraperitoneal de Ketamina 67mg/kg y Xylazine 10mg/kg. Se induce midriasis farmacológica, bilateralmente con Tropicamida al 1% y Fenilefrina al 2,5%. Se aplica periódicamente solución salina al 0,9% en las córneas para evitar la deshidratación. Las respuestas del ERG se registran utilizando electrodos corneales de bucle de alambre de platino, de ambos ojos simultáneamente. Se colocan electrodos de aguja de platino de referencia en los oídos. Para la estimulación del flash se emplean LED blancos transparentes CMD204 (UWC Serie T-1), con una intensidad luminosa de 1000mcd. Se envían quince destellos de 1 milisegundo a ambos ojos simultáneamente con intervalos constantes de 10 segundos entre estímulos. Las respuestas del ERG se amplifican con una ganancia de 5000, con paso de banda entre 10 y 100 Hz.
Se promedian los ERG y se determina la amplitud media de la onda b para cada animal en cada punto de tiempo. Si la amplitud de la onda b del ERG ha disminuido en un 10% con respecto a la media de las dos sesiones de registro anteriores, se realiza una nueva dosis de inyección intravítrea según los métodos descritos anteriormente.
Para la histología, los ojos se enuclean y se colocan en el fijador de Karnovski durante la noche, a 4°C. Tras un período de inmersión de 18 horas, los ojos se enjuagan con una solución tampón de fosfato 0,01 M. Los ojos se preparan para la sección, haciendo un corte transversal a lo largo del meridiano horizontal. Después de la extracción, los ojos se deshidratan en diluciones seriadas de alcohol, se limpian con Pro-Par (sustituto del xileno, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) y se incrustan en parafina con DMSO (Fisher). Se obtienen secciones seriadas de 6 jm de grosor de todo el ojo. Las secciones de parafina se montan en portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina y se tiñen con hematoxilina y eosina de Harris.
La tinción de la microglía en la retina montada en su totalidad se realiza como sigue. Los ojos de las ratas se enuclean y se fijan brevemente en formalina tamponada al diez por ciento. A continuación, se seccionan y la sección
nasal se fija durante otras 4 horas a 4°C. La sección temporal se incrusta en un compuesto OCT (Sakura Finetek, USA Inc., Torrance, CA) y se congela en nitrógeno líquido para su criosección. La orientación se conserva para cada sección.
Después de la fijación, como se ha detallado anteriormente, las retinas se retiran cuidadosamente y se colocan en PBS que contiene 1% de Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las retinas se incuban durante toda la noche a 4°C en un cóctel de anticuerpos Iba-1 (Wako Chemicals USA Inc, Richmond ,VA) a una dilución de 1:200 y de anticuerpos ED-1 (Serotec Ltd. Oxford, Reino Unido) a una dilución de 1:100, en PBS con un 0,1% de Triton X-100 y un cuatro por ciento de suero normal de cabra. Tras varios lavados, las retinas se incuban en la solución de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante dos horas a temperatura ambiente, se montan con la cara de la MLI hacia abajo en portaobjetos de vidrio y se cubren con Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
La tinción de la microglía en secciones transversales de la retina se realiza como sigue. Las secciones (de 10 micras) se cortan en un criostato (Leica Instruments GmbH., Nussloch, Alemania), se recuperan en portaobjetos recubiertos de Vectabond (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se fijan durante un minuto en acetona. Los portaobjetos se dejan secar al aire y se almacenan a 4°C hasta su utilización. A continuación, se rehidratan las secciones en solución salina tamponada con Tris (pH 7,4) y se bloquea la tinción inespecífica con suero normal de cabra al 5%. Las secciones se incuban en solución de anticuerpos Iba-1 y e D-1, como se ha detallado anteriormente, y se revelan para microscopía de fluorescencia utilizando los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia adecuados.
Para cada ojo, las formas de onda ERG se promedian en quince trazos para cada sesión de grabación. La amplitud de la onda b se define como la amplitud pico a pico de la pendiente positiva principal (desde el punto más bajo de la onda a hasta el punto más alto de la onda b). Se mide a partir de cada una de las formas de onda ERG promediadas. La media y la desviación estándar de la amplitud de la onda b se miden para cada ojo de cada animal para cada punto de tiempo. También se calculan las medias de los grupos y las desviaciones estándar para los ojos derecho e izquierdo en cada momento. Con estos datos se realizan análisis estadísticos paramétricos y no paramétricos.
Para el análisis histológico del recuento de células, se toman fotomicrografías de la retina de los ojos derecho e izquierdo, utilizando un microscopio Olympus B-MAX 50 (Japón), con una cámara digital Olympus Magnafire PM30/PM20, con un aumento de 40x. En todos los ojos, se toman cinco fotomicrografías en cada uno de los cuatro cuadrantes de la retina (es decir, veinte fotomicrografías por ojo): 1) temporal superior; 2) nasal superior; 3) temporal inferior; 4) nasal inferior. Se tiene cuidado de correlacionar con precisión estas regiones entre los ojos.
Cada fotomicrografía se analiza utilizando un método de recuento de cuadrículas. Un observador enmascarado cuenta el número de células de la capa nuclear externa (ONL) y de la capa nuclear interna (INL) en cada una de las dos regiones cuadriculadas definidas por fotomicrografía. Los recuentos se promedian para la ONL y la INL en cada región de la retina analizada para los ojos derecho e izquierdo de cada grupo.
Para el análisis del recuento de células microgliales, se cuentan las células microgliales teñidas positivamente utilizando un microscopio Olympus B-MAX 50 (Japón) con los juegos de filtros adecuados. En las preparaciones de la retina en su totalidad, los recuentos se realizan en seis campos estandarizados en tres niveles definidos dentro de la retina: una capa a nivel de la membrana limitante interna (capa ILM), una capa a nivel de la capa plexiforme interna (capa MID) y una capa a nivel de los fotorreceptores de la retina (capa PHR). En las secciones transversales de la retina, se cuentan las microglías activadas en la zona de residuos celulares de fotorreceptores en dos campos retinianos superiores y dos inferiores.
Se realiza un ANOVA de una vía con una prueba t pareada concomitante, cuando es válida, tanto para los datos del ERG postoperatorio de 4 semanas como para los datos promediados del recuento de células de la ONL y la INL en los ojos tratados y no tratados en todos los grupos. Los valores medidos del recuento de células microgliales se promedian para calcular las medias y las desviaciones estándar de cada capa de células microgliales entre los grupos experimentales. Los datos analizados se grafican. Aunque el poder de análisis estableció que cinco animales por grupo son adecuados para realizar comparaciones estadísticas paramétricas, se puede realizar un análisis no paramétrico (Kruskal-Wallis o Mann-Whitney) cada vez que se aplica un ANOVA de una vía.
Ejemplo 9
Evaluación de la eficacia sostenida de la D-FA intravítrea in vivo
El presente Ejemplo está diseñado para estudiar la administración sostenida de D-FA a través de inyecciones intravítreas repetidas, en la dosis y el intervalo de dosificación apropiados para la neuroprotección sostenida de los fotorreceptores de la retina y la preservación de las amplitudes de la onda b del ERG en ratas RCS. Mediante inyecciones de 0,2 |jg o 1|jg de D-FA (en base a la droga), las ratas RCS se dividen en dos grupos de quince animales. Los animales de un grupo se someten a una inyección intravítrea de D-FA, mientras que el otro grupo recibe PBS que contiene (2% DMSO con D-FA libre y dendrímero libre). Las grabaciones de ERG se realizan una
vez al mes. La reinyección de D-FA y de control se realiza cuando las amplitudes de las ondas b del ERG en el grupo de D-FA han disminuido en un 10% en comparación con la media de los dos registros anteriores del ERG. Cinco animales por grupo son eutanasiados a los tres, siete y nueve meses para el análisis histológico cuantitativo del recuento de células fotorreceptoras, la microglía total y la localización de la microglía, así como el número de microglías activadas. Sumando el total de D-FA necesario para mantener las amplitudes del ERG, y dividiendo este número por la duración de la neuroprotección, se estima la tasa de liberación de D-FA necesaria para mantener las amplitudes del ERG a partir del PLGA-(D-FA) de liberación sostenida.
A partir de este Ejemplo, se puede determinar la dosis y el intervalo para mantener la función de la retina, ya que sólo se permite una reducción del 10% del ERG. El control permite determinar el efecto del nanodispositivo. Se pueden determinar los tiempos de permanencia de los dendrímeros en el vítreo, así como la distribución celular en las sublaminas de la retina. Si los dendrímeros se encuentran en la retina externa más allá de al menos dos o tres semanas, la eficacia de los nanodispositivos podría durar bastante más de un mes y proporcionar un tratamiento a largo plazo. Por lo tanto, este Ejemplo proporciona datos adicionales para evaluar la eficacia clínica a largo plazo de los dispositivos aquí divulgados.
Ejemplo 10
Plataforma inyectable de liberación sostenida de fármacos intravítreos basada en microesferas híbridas [PLGA-(D-FA) nanodispositivo].
Este Ejemplo se realiza para determinar la biodistribución y el tiempo de residencia de las microesferas de PLGA-(D-FITC). Se añade un grupo de diez animales al estudio de biodistribución del Ejemplo 9, y estos animales se someten a una inyección intravítrea bilateral de micropartículas de PLGA-(D-FITC). Estos animales son eutanasiados a los 10 días, al mes, a los dos meses, a los cuatro meses y a los seis meses.
Las microesferas de PLGA-D-FA se preparan con la intención de lograr una entrega sostenida de -0.03 pg/día de AF en D-FA durante 180 días. Una inyección intravítrea de 1,0 pg de D-FA es eficaz durante un mes (0,03 pg/día). Por lo tanto, se estima que el conjugado dendrímero-FA se elimina de la cámara vítrea en pocos días. Una parte importante de ellos parece ser absorbida por el ONL, donde el fármaco se libera durante un período de tiempo, de manera que sugiere que el efecto farmacodinámico dura aproximadamente un mes. Por lo tanto, una microesfera de PLGA adecuadamente diseñada para encapsular el D-FA proporcionará una liberación controlada del D-FA, que entrará en las células de la retina y liberará el fármaco.
El tamaño y el peso molecular de los conjugados D-FA ( - 7 nm, - 20 kDa) son comparables a las proteínas pequeñas. En PBS (pH=7,4), el enlace de éster entre el fármaco y el dendrímero es estable. La hidrólisis de este enlace se produce probablemente durante un periodo de tiempo en el pH ácido de los lisosomas. Por lo tanto, no se prevé una liberación apreciable del fármaco desde el dendrímero dentro de la microesfera de PLGA, especialmente con un 75% de PLA. (DD 1990; P. Kolhe 2006).
Se ha demostrado previamente que las microesferas de PLA pueden durar hasta sesenta días en tampón PBS de 7,4 pH. Microesferas de PLGA de tamaño -10 pm y de composición de copolímero 90% PLA y 10% PGA (PLGA (90:10)) también resisten la degradación durante períodos prolongados (DD 1990). Este tamaño de la microesfera también mejora significativamente el tiempo de residencia intravítrea. El PLGA (75:25) se utiliza para la administración sostenida del fármaco en el ojo. Basándose en los coeficientes de difusión de las moléculas más grandes ( - 10'13 cm2/seg) de las microesferas de PLGA, se espera que la difusión del D-FA tenga lugar durante un periodo de meses, proporcionando así una administración sostenida del fármaco durante un periodo de seis meses. (Sandora 2001)
Las micropartículas de PLGA (composición: 75% PLA/25%PGA, peso molecular -90-125 kDa) que contienen dendrímero-FITC (para estudios de biodistribución) y dendrímero-FA (para estudios de liberación y de eficacia in vivo), se preparan utilizando un método de agua en aceite en agua (w/o/w) como se describe en los Ejemplos. (Sanjeeb K Sahoo, J. P. et al., Journal of Controlled Release 82:105-114 (2002) Jayanth Panyam 2003). La solución de partículas se filtra para producir un tamaño de partícula en el rango de -5 -10 pm. El tamaño de las partículas se caracteriza por medio de SEM y un medidor de partículas Malvern. La presencia y distribución del nanodispositivo dentro de la micropartícula se evalúa con un nanodispositivo de D-FITC encapsulado, mediante fluorescencia y microscopía confocal.
Para los estudios de liberación in vitro, las microesferas de PLGA-dendrímero-FA se colocan en un tubo de microcentrífuga que contiene 250 pl de tampón fosfato 0,1M (PBS pH 7,4) a 37°C en un agitador girado a 100 rev/min. Inicialmente, la solución tampón se recoge cada día para el análisis de la droga, y se sustituye por una nueva solución tampón. Después de siete días, la muestra se recoge cada día alterno, y la frecuencia disminuye a cada cinco días en los momentos más largos. Las muestras recogidas se mantienen bajo la campana durante la noche para expulsar la solución tampón.
La cuantificación del dendrímero-FA (D-FA) se realiza utilizando una columna de HPLC basada en sílice C5 (250mmx4,6 mm, 300 A). (Mohammad T. Islam, X. S. et al., Anal. Chem. 77:2063-2070 (2005)) La fase móvil para la elución de D-FA es un gradiente lineal que comienza con 90:10 de agua/acetonitrilo (ACN) a un flujo de 1 ml/min, alcanzando 50:50 después de 30 minutos. El ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración del 0,14% en peso, tanto en agua como en ACN, se utiliza como contra-ión para hacer que las superficies del dendrímero-conjugado sean hidrofóbicas. (Mohammad T. Islam, X. S. et al., Anal. Chem. 77:2063-2070 (2005))
Los conjugados se disuelven en la fase móvil (90:10 agua/ACN). La detección de D-FA en las muestras eluidas se realiza a 210 y 238 nm, los Amax de PAMAM-G4-OH y FA respectivamente. La curva de calibración se prepara en base a 238 nm para el AF en la forma conjugada. El tiempo de elución del D-FA en este sistema se espera que sea de ocho minutos. Para cuantificar la posible presencia de AF libre, se utiliza una columna de simetría de fase inversa C-18 de Waters (columna de 3,9 x 150 mm, 5 pm; W20881A). (Glenn J. Jaffe 2000; Glenn J. Jaffe 2000) Se utiliza una mezcla 1:1 de acetonitrilo y acetato de sodio al 0,02% (pH 4,0) como fase móvil. La muestra se inyecta a 1 ml/min y el fármaco FA eluye a unos 3,0 minutos. La detección de las muestras eluidas se realiza a 238 nm (Amax de FA), con una curva de calibración adecuadamente preparada.
Ejemplo 11
Eficacia farmacodinámica de las microesferas híbridas [PLGA-(D-FA)] en el mantenimiento de las amplitudes ERG y los fotorreceptores en la rata RCS
Después de recopilar y analizar seis meses de datos de experimentos como los descritos en el Ejemplo 10, este Ejemplo se realiza para examinar la eficacia farmacodinámica de las inyecciones únicas de PLGA-(D-FA) en el mantenimiento de las amplitudes de la onda b del ERG y la preservación de los recuentos de células fotorreceptoras en ratas RCS envejecidas. Para este estudio, se construyen microesferas de PLGA-(D-FA) que liberan D-FA a la velocidad de liberación que se valida experimentalmente como eficaz según el Ejemplo 10.
Utilizando los mismos protocolos descritos anteriormente para las inyecciones intravítreas, un grupo de ratas RCS de cinco semanas se somete a la inyección intravítrea de microesferas de PLGA-(D-FA) y otro grupo recibirá la inyección intravítrea de PBS que contiene D-FA y micropartículas de PLGA libre. Se establecen dos grupos experimentales de quince animales por grupo. Las grabaciones de ERG se realizan una vez al mes. La reinyección de la microesfera PLGA-(D-FA) y D-FA+ PLGA libre se realiza cuando las amplitudes de la onda b del e Rg han disminuido un 10% en comparación con la media de los dos registros anteriores del ERG. Cinco animales por grupo son eutanasiados a los tres, seis y nueve meses para el análisis histológico cuantitativo del recuento de células fotorreceptoras, la microglía total y la localización de la microglía, así como el número de microglías activadas. Se diseñan microesferas de PLGA (75%PLA/25%PGA) destinadas a liberar D-FA durante un período de cuatro a seis meses, de modo que la eficacia pueda mantenerse durante al menos un período de seis meses. Se espera una fase de liberación lenta durante un período de sesenta a setenta días, y una liberación algo más rápida en momentos posteriores, cuando la partícula se erosiona apreciablemente. Se espera un perfil de liberación sostenida significativamente más lento para el nanodispositivo. Se espera una explosión inicial muy pequeña para el D-FA (17 kDa). En cuanto a la biodistribución, en comparación con el D-FITC, se espera que el PLGA-D-FITC muestre una fluorescencia intravítrea significativamente mayor, y una fluorescencia retiniana externa significativamente menor en tiempos comparables. Se espera que el D-FITC esté presente en la retina externa durante mucho más tiempo. Si los estudios in vitro muestran que la D-FA se libera a un ritmo más rápido de lo deseado, entonces la composición del PLGA puede cambiarse a 90%PLA/ 10%PGA, o a PLA puro.
Ejemplo 12
Hallazgos electrorretinográficos asociados a las inyecciones intravítreas de acetónido de fluocinolona conjugado y no conjugado en ratas RCS
En este Ejemplo, la eficacia de los nanodispositivos de D-FA se comparó con el fármaco libre y con dosis comparables de fármaco. La eficacia se analizó mediante electrorretinografía (ERG) e histología. Los resultados indican que una sola inyección intravítrea del nanodispositivo de dendrímero a la dosis más baja administrada, no sólo evita la reducción del ERG, sino que mejora los niveles de ERG sustancialmente.
Treinta ratas RCS albinas de cinco semanas de edad fueron divididas en seis grupos iguales. Los experimentos se terminaron a las nueve semanas. Así pues, la eficacia se evaluó durante el período máximo de cuatro semanas de degeneración de la retina en las ratas RCS. Los grupos eran: 123
1. inyección intravítrea de 3,0 pg de acetónido de fluocinolona (FA) conjugado con dendrímero en 1,0 pl de solución amortiguadora de fosfatos (PBS);
2. inyección intravítrea de 1,0 pg de AF conjugado con dendrímero en 1,0 pl de PBS;
3. inyección intravítrea de 3,0 pg de AF en 1,0 pl de PBS;
4. inyección intravítrea de 1,0 |jg de AF en 1,0 |jl de PBS;
5. inyección intravítrea de 1 j l de PBS (control del vehículo);
6. controles no operados expuestos a la luz.
La comparación de las amplitudes de la onda a del ERG inicial (a las cinco semanas de edad) no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales (p>1,0). La comparación de las amplitudes de la onda a del ERG en el punto final (a las nueve semanas de edad) mostró diferencias estadísticamente significativas entre los ojos derecho e izquierdo de los animales tratados con D-FA. Así, la D-FA preservó las amplitudes de respuesta de los fotorreceptores de forma dependiente de la dosis. Esto no ocurrió con los ojos inyectados con PBS o con FA libre.
La conjugación del dendrímero potenció los efectos neuroprotectores del FA sobre el fármaco no conjugado. Este fenómeno también se observó en las amplitudes de la onda b del ERG. Todos los animales tratados con FA demostraron la mayor estabilización de las amplitudes de la onda b-a del ERG. Los tiempos implícitos del ERG fueron significativamente menores en los animales tratados con D-FA en comparación con los tratados con FA, los de control o los no tratados. Esto es coherente con el hallazgo de que la conjugación con dendrímeros del AF mejora su eficacia farmacológica.
La tabla siguiente muestra el cambio de la amplitud de las ondas a y b del ERG (media ± error estándar) entre los seis grupos experimentales al final del estudio, en comparación con las amplitudes del ERG al principio del estudio (expresado como porcentaje de pérdida (-)/ganancia (+) de la amplitud inicial).
Los datos divulgados en este Ejemplo proporcionan evidencia adicional de los beneficios de la conjugación de dendrímeros, como se muestra en la Tabla anterior. Por primera vez, las amplitudes de las ondas a aumentan durante el periodo de tiempo en el que se observó una reducción de las amplitudes superior al 75%.
Ejemplo 13
Biodistribución y eficacia de los dendrímeros y biodistribución y eficacia de las nanopartículas
De acuerdo con este Ejemplo, los dendrímeros PAMAM-G4-OH mostraron una mayor captación en la capa nuclear externa de ratas RCS con degeneración, pero no en ratas SD normales, lo que sugiere que pueden ser utilizados para atacar la neuroinflamación. Se estudió la biodistribución retiniana del FITC libre y del FITC conjugado con dendrímeros (D-FITC) en ratas Sprague-Dawley (SD) sanas y en ratas del modelo de degeneración retiniana del Royal College of Surgeons (RCS) con neuroinflamación activa.
El primer conjunto de resultados se muestra en la Figura 10, histología de epifluorescencia de criosecciones de retina realizadas veinticuatro horas y diez días después de la inyección intravítrea, mostrando (A) la distribución de D-FITC en ratas SD normales a las veinticuatro horas, y (B) la distribución de D-FITC en el modelo de neurodegeneración de retina RCS a las veinticuatro horas. La concentración de D-FITC en la capa nuclear externa (señalada con un *) y en la zona de residuos celulares son hallazgos significativos.
Al examinar la retina de rata RCS en la Figura 10B, es evidente que el D-FITC demostró una mayor captación en la retina externa, precisamente localizada en y entre la ONL, la microglía activada y la zona externa de residuos celulares. Este patrón de captación no se observó en ninguna de las retinas SD sanas (Figuras 10A, D). El rojo de
las imágenes se debe a la autofluorescencia del filtro TRITC. El epitelio pigmentario de la retina (RPE) muestra una mayor fluorescencia de FITC en las retinas que recibieron inyecciones que contienen D-FITC. No se observó fluorescencia de FITC en el RPE de los ojos que recibieron inyecciones de FITC gratuitas. Este patrón fue cualitativamente similar a los diez días posteriores a la inyección. La señal de FITC presente en la Figura 10F es la autofluorescencia de la zona externa de residuos celulares. El RPE se ha separado de la retina en esta imagen y no es visible.
Estos datos sugieren que las células que tienen altas tasas de endocitosis, como la microglía activada y el epitelio pigmentario de la retina, demuestran una mayor captación de conjugados de D-FITC. En consecuencia, los resultados muestran que los conjugados de dendrímero-fármaco probablemente demostraron una mayor captación en las sublaminas de la retina sometidas a procesos neuroinflamatorios activos y otros procesos neurodegenerativos. Además, la Figura 10C demuestra que los conjugados de dendrímeros no se eliminan de la retina tan rápidamente como el FITC libre, Figura 10F. Así, los conjugados dendrímeros-fármacos son capaces de prolongar el tiempo de residencia de los fármacos en las zonas de neuroinflamación activa, mejorando la eficacia farmacodinámica, dirigiéndose a sublaminas retinianas específicas, reduciendo la cantidad total que debe administrarse y reduciendo potencialmente los efectos secundarios.
La localización de D-FITC en la retina externa se analizó además mediante el etiquetado inmunohistoquímico de las células microgliales activadas, los astrocitos y las células de Mueller y los fotorreceptores (como se muestra en las Figuras 11-15). Los resultados sugieren que los dendrímeros se localizan selectivamente en estas células asociadas a procesos neuroinflamatorios. La acumulación en las demás células de la retina interna y externa fue mínima. La figura 11 muestra la captación de D-FITC por parte de la microglía. (A) Etiquetado inmunohistoquímico con ED-1 de las células microgliales de la retina interna; (B) captación de D-FITC dentro de la microglía de la retina interna (60x); (C) microglía activada marcada con ED-1 en la retina externa; y (D) captación de D-FITC dentro de la microglía activada.
La figura 12 proporciona otros resultados. (A) Inmunotinción de la proteína fibrilar glial-ácida (GFAP) de los astrocitos retinales activados; y (B) Captación de dendrímeros-FITC por los astrocitos retinales activados.
La figura 13 muestra que el D-FITC es captado por las células gliales de la retina activadas. La figura 13A muestra el etiquetado de GFAP de las células de Mueller de la retina activadas en ratas RCS de cinco semanas (vista lateral); (B) muestra la captación de D-FITC por las células de Mueller de la retina activadas (el mismo campo que en A), y la captación de D-FITC dentro del capilar de la retina (flecha); (C) muestra el etiquetado de GFAP de las células de Mueller de la retina (vista axial) en la capa nuclear interna. Los cuerpos celulares del INL son particularmente notables (delineados por los procesos de las células de Mueller); y (D) muestra la captación de D-FITC por las células de Mueller de la retina (vista axial).
La tinción de GFAP en estas células era específica del fenotipo activado (Figura 12A). La imagen de la epifluorescencia FITC (Figura 12B) en el mismo campo micrográfico muestra una captación significativa de D-FITC. Además, se observa que un pequeño capilar intra-retiniano también capta D-FITC (Figura 13B, marcada con una flecha). También se observó la co-localización de GFAP y D-FITC en las células de Mueller cuando sus procesos pasan la capa nuclear externa (Figura 13 C y D). En la Figura 14, los fotorreceptores están marcados por la captación de D-FITC.
La vasculatura retiniana demostró un alto grado de captación de D-FITC (Figura 15), dentro de las paredes de los vasos. Esto era cierto tanto para la circulación interna de la retina como para los capilares finos mucho más profundos dentro del parénquima retiniano.
También se investigó la biodistribución de las nanopartículas. Para estudiar el papel del tamaño de las partículas y la dureza, se utilizaron nanopartículas de PS marcadas con FITC monodispersas, de tamaño 50 nm y 200 nm. Los resultados se muestran en la Figura 16, que muestra la biodistribución de las nanopartículas en la retina interna de ratas S334-ter-4, setenta y dos horas después de la inyección intravítrea. Verde: Nanopartículas de PS marcadas con FITC, Rojo: Rodamina GFAP. (A) Se observan nanopartículas de FITC de 50 nm dentro de los somatos de los astrocitos. (B) Las nanopartículas de FITC de 200 nm permanecieron confinadas en el vítreo prerretiniano, y no parecieron ser tomadas por las células que captan el dendrímero.
Los resultados discutidos en los ejemplos anteriores muestran que: (1) Tras la inyección intravítrea, los dendrímeros se localizan selectivamente en las células asociadas principalmente a la neuroinflamación, como las células microgliales activadas, las células de Mueller, los astrocitos y los macrófagos; (2) los dendrímeros parecen estar presentes en estas células, incluso después de semanas; (3) el conjugado dendrímero-fármaco libera los fármacos conjugados a lo largo de un mes; (4) la eficacia in vivo de una inyección del nanodispositivo de dendrímero en la cámara vítrea es significativamente mejor que la del fármaco libre y la de un implante de liberación controlada, a lo largo de un mes. De hecho, las mediciones de electrorretinografía (ERG) sugieren que el nanodispositivo de dendrímero no sólo evita una mayor degeneración, sino que puede mejorar la salud de la retina.
Claims (15)
1. Una composición que comprende un polímero de poliamidoamina escala nanométrica(PAMAM) ramificado dendrimérico a escala nanométrica con un grupo terminal hidroxilo (-OH) conjugado directamente, o indirectamente a través de uno o más espaciadores, a un agente biológicamente activo para la entrega selectiva del polímero de poliamidoamina a escala nanométrica (PAMAM) ramificado dendrimérico a un sitio de neuroinflamación y/o inflamación del ojo para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación, y/o inflamación del ojo, en la que el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios y antioxidantes.
2. Una composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el polímero ramificado de poliamidoamina (PAMAM) ramificado dendrimérico a escala nanométrica se incorpora a una entidad a mayor escala seleccionada del grupo que consiste en una matriz polimérica, una micropartícula, una nanopartícula, un liposoma, una microcápsula, una nanocápsula o un implante de liberación controlada.
3. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo está en una cantidad eficaz para reducir las manifestaciones patológicas del daño tisular resultante de la neuroinflamación y/o la inflamación del ojo, preferentemente en el que la neuroinflamación y/o la inflamación del ojo es inflamación ocular.
4. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo es un antioxidante.
5. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en esteroides naturales y sintéticos.
6. La composición para su uso según la reivindicación 5, en la que el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en acetónido de fluocinolona, metil prednisona y dexametasona.
7. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en glucocorticoides naturales y sintéticos y esteroides no glucocorticoides.
8. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente biológicamente activo es acetónido de fluocinolona o minociclina o palmitato de vitamina A.
9. La composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el uno o más espaciadores se seleccionan del grupo que consiste en un péptido, un ácido glutárico y polietilenglicol (PEG).
10. La composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) se selecciona del grupo que consiste en PAMAM generación 1 (G1), PAMAM generación 2 (G2), PAMAM generación 3 (G3), PAMAM generación 4 (G4), PAMAM generación 5 (G5), PAMAM generación 6 (G6), PAMAM generación 7 (G7), PAMAM generación 8 (G8), PAMAM generación 9 (G9) y PAMAM generación 10 (G10), preferentemente en la que el dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) es PAMAM generación 4 (G4) o PAmAM generación 5 (G5).
11. La composición para su uso según la reivindicación 1, en el que la neuroinflamación y/o la inflamación del ojo está causada por uno o más de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en retinosis pigmentaria, degeneración macular, neuritis óptica de parálisis cerebral, lesiones contundentes y penetrantes, infecciones, sarcoide, anemia falciforme, desprendimiento de retina, arteritis temporal, isquemia retiniana, retinopatía arteriosclerótica, retinopatía hipertensiva, obstrucción de la arteria retiniana, obstrucción de la vena retiniana, hipotensión, retinopatía diabética, edema macular, accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, traumatismo cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos convulsivos, alcoholismo, envejecimiento y pérdida neuronal.
12. La composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la composición está encapsulada en una partícula biodegradable seleccionada del grupo que consiste en una nanopartícula de polilactida (PLA) y una micropartícula de PGLA.
13. La composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la composición se formula como un recubrimiento sobre un dispositivo implantable.
14. La composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en el que la composición es para ser administrada por vía intravítrea.
15. La composición para su uso según cualquier reivindicación anterior, en el que la composición suministra el agente biológicamente activo durante un período de varias horas, varios días, varias semanas o varios meses.
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