ES2887595T3 - Dispositivo y método de discriminación de espermatozoides - Google Patents

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Abstract

Dispositivo para discriminar espermatozoides (SP) etiquetados con al menos un fluorocromo, cuyo dispositivo comprende un canal de transporte (100), por el que puede circular una solución que contiene dichos espermatozoides etiquetados (SP) en una dirección de transporte predefinida (Y), un medio de excitación (4; 4') que permite la estimulación de la emisión de fluorescencia de los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en dicho canal de transporte (100), un medio (5) para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en dicho canal de transporte (100), y un medio de procesamiento electrónico (7) para discriminar los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en el canal de transporte de la fluorescencia detectada por medio de la detección de fluorescencia (5), dicho dispositivo comprende una y/u otra de las siguientes características técnicas (a), (b): (a) dicho canal de transporte comprende un plano principal de simetría (P1) paralelo a la dirección de transporte (Y), y una sección transversal en un plano (X, Z) perpendicular a la dirección de transporte (Y), que es simétrico, que se caracteriza por un eje de simetría principal (A) y tiene una dimensión de sección transversal máxima (H), medida a lo largo de este eje de simetría principal (A), y una dimensión de sección transversal mínima (E), menor que la dimensión de sección transversal máxima (H), y medida a lo largo de un eje de sección transversal secundario (B) perpendicular al eje principal de simetría (A), el medio de detección de fluorescencia (5) que comprende al menos los primeros medios de detección (50; 51), que son capaces de detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides (SP) en una dirección sustancialmente perpendicular al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte, y más particularmente al menos en una dirección perpendicular al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte, (b) dicho dispositivo que comprende medios para transportar los espermatozoides (SP) uno detrás de otro en el canal de transporte (100) con sustancialmente la misma orientación espacial de cada espermatozoide, el medio de detección de fluorescencia (5) que comprende al menos los primeros medios de detección (50; 51) que están orientados en la dirección de una de las dos caras principales (F) que tiene la mayor superficie de cada espermatozoide (SP) que pasa sucesivamente en el canal de transporte (100) frente a dichos medios de detección y que se orienta espacialmente, y el dispositivo que se caracteriza porque los medios de procesamiento electrónico (7) son capaces de discriminar automáticamente los espermatozoides (SP) utilizando al menos la duración (D) de cada firma de fluorescencia (PICO) que es característica de un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia (50a) generada por los primeros medios de detección (50; 51).

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo y método de discriminación de espermatozoides
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la discriminación in vitro de espermatozoides en base a su cromosoma X o Y, en particular espermatozoides, etiquetados por medio de al menos un fluorocromo.
Técnica anterior
Un espermatozoide es una célula de tipo haploide, que generalmente contiene solo una copia de cada cromosoma, por ejemplo, un cromosoma X o Y cuya motilidad está asegurada por un flagelo.
En el campo de la reproducción animal, hasta la fecha se han desarrollado diversas soluciones de sexaje que permiten discriminar y clasificar automáticamente los espermatozoides en base a su cromosoma X o Y, que se basan en la citometría de flujo.
En general, estas soluciones técnicas para el sexaje por citometría de flujo se basan en el hecho de que los espermatozoides X contienen aproximadamente un 4 % más de ADN que los espermatozoides Y, especialmente en las especies bovinas. Por lo tanto, en estas tecnologías de sexaje:
(a) los espermatozoides están etiquetados con un intercalador de ADN fluorescente, comúnmente denominado fluorocromo; los espermatozoides X, que se supone que contienen una mayor cantidad de ADN, absorben una mayor cantidad de fluorocromo que los espermatozoides Y;
(b) se inyecta una solución que contiene los espermatozoides etiquetados en un canal de transporte y, si es necesario, se somete a un enfoque hidrodinámico para alinearlos y hacerlos circular en este canal de transporte,
(c) los espermatozoides etiquetados se excitan con la radiación adecuada para que emitan radiación de luz fluorescente,
(d) los espermatozoides se discriminan sobre la base del cromosoma X o Y detectando la intensidad de la radiación de luz fluorescente (intensidad de fluorescencia), y
(e) cada espermatozoide X o Y se clasifica automáticamente de acuerdo con esta intensidad de fluorescencia detectada.
Un primer método de clasificación conocido (paso (e) anterior) consiste en someter la solución que contiene los espermatozoides etiquetados a vibraciones por medio de un transductor piezoeléctrico, para formar microgotas, que en la medida de lo posible contienen cada una solo un solo espermatozoide, luego cargar eléctricamente cada gota sobre la base de la intensidad fluorescente detectada, y finalmente pasar sucesivamente las microgotas cargadas eléctricamente en un campo eléctrico para separar las gotas cargadas que contienen un espermatozoide X de las gotas cargadas que contienen un espermatozoide Y. Este método de clasificación se describe, por ejemplo, en las siguientes solicitudes de patente internacional: WO2004/104178, WO2004/017041, WO2009/014643, WO2009/151624.
La solicitud de patente internacional WO2010/001254 propone otra solución en la que la clasificación de los espermatozoides se realiza por medio de radiación electromagnética de rayo láser, seleccionada, en base a la intensidad de fluorescencia que se detecta, para alterar selectivamente los espermatozoides que son etiquetados y transportados uno detrás del otro en un canal de transporte.
Los estudios también han demostrado que la intensidad máxima de la radiación de luz emitida por la fluorescencia de los espermatozoides etiquetados era un parámetro que, hasta cierto punto, podría usarse para discriminar entre espermatozoides sobre la base del cromosoma X o Y. Sin embargo, en la práctica, resulta que este parámetro no es muy confiable ya que la discriminación depende en gran medida, en particular, de la calidad del semen y del protocolo de etiquetado. Además, el rendimiento de la detección puede ser bajo debido a que en la práctica sólo una fracción de los espermatozoides puede discriminarse con fiabilidad.
En la solicitud de patente de Estados Unidos US2010/0167336, se ha propuesto recientemente un método para discriminar espermatozoides X/Y basado en una medición de la longitud del núcleo de los espermatozoides. En esta publicación, los espermatozoides etiquetados se transportan en un canal de transporte de sección circular y se mide la longitud del núcleo de cada espermatozoide a medida que pasa a través de un rayo láser. Sin embargo, parece que la fiabilidad de los resultados de este método y su reproducibilidad no están probadas. En la solicitud de patente de Estados Unidos US2014/273059 se ha propuesto la determinación de la orientación espacial de los espermatozoides en un canal de flujo por medio de la duración de un pulso de fluorescencia.
Actualmente existe la necesidad de encontrar tecnología para la discriminación de espermatozoides de mamíferos, en particular de espermatozoides de animales, que sea eficaz y que supere los inconvenientes antes mencionados de las soluciones de la técnica anterior.
Propósito de la invención
El objeto de la presente invención es proponer una nueva solución técnica para discriminar espermatozoides etiquetados con al menos un fluorocromo, en base a su cromosoma X o Y, que supere notablemente los inconvenientes antes mencionados de las soluciones de la técnica anterior.
Resumen de la invención
De acuerdo con un primer aspecto, la invención se refiere a un dispositivo para discriminar espermatozoides etiquetados por medio de al menos un fluorocromo, dicho dispositivo comprende un canal de transporte, en donde una solución que contiene dichos espermatozoides etiquetados puede circular en una dirección de transporte predefinida (Y), medios de excitación para excitar la emisión de fluorescencia de los espermatozoides etiquetados que circulan en dicho canal de transporte, medios para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides etiquetados que circulan en dicho canal de transporte, y medios de procesamiento electrónico para discriminar los espermatozoides etiquetados que circulan en el canal de transporte de la fluorescencia detectada por los medios de detección de fluorescencia: dicho canal de transporte comprende un plano principal de simetría (P1) paralelo a la dirección de transporte (Y), y una sección transversal, en un plano (X, Z) perpendicular a la dirección de transporte (Y), que es simétrico, que se caracteriza por un eje principal de simetría (A) y tiene una dimensión de sección transversal máxima (H), medida a lo largo de este eje principal de simetría (A), y una dimensión de sección transversal mínima (E), menor que la dimensión de sección transversal máxima (H), y medida a lo largo de un eje de sección transversal secundario (B) que es perpendicular al eje principal de simetría (A); los medios de detección de fluorescencia comprenden al menos un primer medio de detección, que es capaz de detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides en una dirección sustancialmente perpendicular al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte, y más particularmente al menos en una dirección perpendicular al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte, y los medios de procesamiento electrónico son capaces de discriminar automáticamente los espermatozoides utilizando al menos la duración de cada firma de fluorescencia que caracteriza a un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia generada por el primer medio de detección.
De acuerdo con un segundo aspecto, la invención también se refiere a un dispositivo para discriminar espermatozoides etiquetados por medio de al menos un fluorocromo, dicho dispositivo comprende un canal de transporte, en el cual una solución que contiene dichos espermatozoides etiquetados puede circular en una dirección de transporte predefinida (Y), medios de excitación para excitar la emisión de fluorescencia de los espermatozoides etiquetados que circulan en dicho canal de transporte, medios para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides etiquetados que circulan en dicho canal de transporte, y medios de procesamiento electrónico para discriminar los espermatozoides etiquetados que circulan en el canal de transporte de la fluorescencia detectada por los medios de detección de fluorescencia, dicho dispositivo comprende medios para transportar los espermatozoides uno detrás del otro en el canal de transporte con sustancialmente la misma orientación espacial de cada espermatozoide; los medios de detección de fluorescencia comprenden al menos primeros medios que están orientados en la dirección de una de las dos caras principales que tienen la superficie más grande de cada espermatozoide que pasa sucesivamente en el canal de transporte frente a dichos medios de detección orientados espacialmente; los medios de procesamiento electrónico son capaces de discriminar automáticamente los espermatozoides usando al menos la duración de cada firma de fluorescencia que caracteriza a un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia emitida por los primeros medios de detección.
Más particularmente, de acuerdo con dicho primer o segundo aspecto, el dispositivo de la invención puede incluir las siguientes características adicionales y opcionales, tomadas por sí solas o en combinación entre sí y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12.
La invención también se refiere a un uso del dispositivo mencionado anteriormente para la discriminación automática y, si procede, la selección automática in vitro o la clasificación automática de espermatozoides.
La invención también se refiere a un método de discriminación in vitro de espermatozoides en el que se inyecta una solución que contiene los espermatozoides etiquetados con al menos un fluorocromo en el canal de transporte del dispositivo antes mencionado, dichos espermatozoides circulan en el canal de transporte uno detrás del otro, espacialmente orientándolos con la misma orientación espacial y detectar automáticamente el tipo de cromosoma de cada espermatozoide que circula en el canal de transporte, utilizar al menos la duración (D) de la fluorescencia característica que caracteriza a un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia emitida por el primer medio de detección del dispositivo.
La invención también se refiere a un método de producción de semen que es sexado mediante selección o clasificación in vitro de espermatozoides utilizando el dispositivo mencionado anteriormente, durante el cual se inyecta una solución en el canal de transporte del dispositivo, que contiene los espermatozoides etiquetados con al menos un fluorocromo, dichos espermatozoides circulan en el canal de transporte uno detrás del otro orientados espacialmente con la misma orientación espacial, se detecta automáticamente el tipo de cromosoma de cada espermatozoide que circula en el canal de transporte y, en particular, si el espermatozoide es de tipo X o Y, utilizar al menos la duración (D) de cada firma de fluorescencia que caracteriza a un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia emitida por el primer medio de detección del dispositivo, y selecciona los espermatozoides de un tipo determinado, en particular alterando los espermatozoides del otro tipo, o los espermatozoides se clasifican en base a su tipo, y en particular su tipo X o Y, en particular separar los espermatozoides de un tipo determinado de los espermatozoides del otro tipo.
Breve descripción de los dibujos
Las características y ventajas de la invención resultarán evidentes al leer la siguiente descripción detallada de varias modalidades particulares de la invención, cuyas descripciones se dan como ejemplos no limitativos y no exhaustivos de la invención, y con referencia a los dibujos adjuntos en los cuales:
- La Figura 1 es una representación esquemática de una primera modalidad de un dispositivo de selección de la invención, el chip de microfluidos de este dispositivo de selección se muestra en una vista superior;
- La Figura 2 es una vista en sección transversal del chip de microfluidos de este dispositivo de selección, en el plano de sección M-M de la Figura 1;
- La Figura 3 es una vista en sección transversal de este dispositivo de clasificación en el plano de sección III-III de la Figura 1;
- La Figura 4 es una vista en sección transversal de este dispositivo de clasificación, en el plano de sección IV-IV de la Figura 3;
- La Figura 5 es una vista en sección transversal de este dispositivo de clasificación, en el plano de sección V-V de la Figura 1;
- La Figura 6 es una vista en sección transversal de este dispositivo de clasificación, en el plano de sección VI­ VI de la Figura 1;
- La Figura 7 es una vista en sección transversal de este dispositivo de clasificación en el plano de sección VII-VII de la Figura 1;
- La Figura 8 es una vista en sección transversal de este dispositivo de clasificación, en el plano de sección VIII-VIII de la Figura 7;
- La Figura 9 es una vista en sección transversal de una segunda variante de un dispositivo de selección; - La Figura 10 es una vista en sección transversal del canal de transporte en el que se han ilustrado dos conos de detección de fluorescencia C1 y C2;
- La Figura 11 representa dos cronogramas ilustrativos de dos señales de detección de fluorescencia de un dispositivo de la invención;
- La Figura 12 muestra esquemáticamente un ejemplo de una firma de fluorescencia (PICO) en una señal de detección de fluorescencia;
- La Figura 13 es un ejemplo de un histograma del máximo de la intensidad de fluorescencia detectada en el fondo del canal de transporte en un dispositivo similar al de la Figura 1;
- La Figura 14 es un ejemplo de un histograma de las duraciones (D) de las firmas de fluorescencia detectadas lateralmente en un dispositivo similar al de la Figura 1;
- La Figura 15 es un ejemplo de un histograma de las duraciones (D) de las firmas de fluorescencia detectadas en el fondo del canal de transporte en un dispositivo similar al de la Figura 1;
- La Figura 16 muestra tres ejemplos de cronogramas respectivamente de las dos señales de detección de fluorescencia y de la señal para controlar los medios de selección del dispositivo de la Figura 1 que se genera automáticamente a partir de estas dos señales de detección de fluorescencia.
Descripción detallada
La Figura 1 muestra una primera modalidad de un dispositivo para discriminar y seleccionar espermatozoides en base a su cromosoma X o Y.
Este dispositivo de la invención puede usarse in vitro para seleccionar espermatozoides X o Y, y más particularmente puede usarse en el campo de la reproducción animal para seleccionar in vitro cualquier tipo de espermatozoides X o Y, y, de manera no limitante y no exhaustiva, espermatozoides de bovinos, porcinos, ovinos, equinos, caprinos, conejos.
Este dispositivo comprende:
- un chip de microfluidos 1 que comprende un canal principal de transporte de microfluidos 100,
- medios de inyección 2 que permiten la inyección en el canal principal de transporte de microfluidos 100, una solución S que contiene una muestra de espermatozoides SP a discriminar y seleccionar,
- medios de enfoque hidrodinámico (3, 101) para inyectar en el canal principal de transporte de microfluidos 100, el líquido L (fluido de compresión) para obtener un enfoque hidrodinámico de los espermatozoides en el canal principal de transporte de microfluidos 100,
- medios 4 para excitar la fluorescencia de los espermatozoides SP que circulan en el canal principal de microfluidos 100,
- medios 5 para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides que circulan en el canal principal de transporte de microfluidos 100,
- medios de selección 6, que comprenden una fuente de radiación electromagnética 60, y que permiten la alteración selectiva de los espermatozoides que circulan en el canal principal de transporte de microfluidos 100, por medio de la radiación electromagnética emitida por la fuente 60,
- medios de procesamiento electrónico 7 que pueden discriminar automáticamente los espermatozoides en base a su cromosoma X o Y, de la detección de fluorescencia realizada por los medios de detección 5, que en esta modalidad particular también permiten controlar automáticamente dicha fuente de radiación electromagnética 60,
- medios de recogida 8 que permiten recoger todos los espermatozoides en la salida del canal principal de transporte de microfluidos 100.
Chip de microfluidos 1- Canal principal de transporte de microfluidos 100
Con referencia a la Figura 2, el chip de microfluidos 1 comprende un sustrato rígido 10 que tiene una cara delantera 10a y una cara trasera 10b, y una placa 11 asegurada contra la cara delantera 10a del sustrato 10.
Con referencia a la Figura 1, en esta modalidad particular, el canal principal de transporte de microfluidos 100 es rectilíneo y se extiende en la dirección longitudinal Y correspondiente a la dirección de movimiento de los espermatozoides en el canal de microfluidos 100. Este canal de microfluidos 100 pasa directamente a través del sustrato 10 y tiene una abertura de entrada 100a y una abertura de salida 100b.
En otra variante, todo o parte de este canal principal de microfluidos 100 puede no ser rectilíneo.
Más particularmente, con referencia a la Figura 2, la sección transversal (en un plano (X, Z)) del canal principal de transporte de microfluidos 100 es rectangular, de altura H medida en la dirección Z perpendicular a la cara superior plana 10a del sustrato 10, y ancho E medido en la dirección de la sección transversal X, paralela a la cara superior 10a del sustrato 10 y perpendicular a la dirección longitudinal Y del canal de microfluidos. La altura H del canal 100 es mayor que el ancho E del canal de microfluidos 100.
Preferentemente, el ancho E del canal es menor que 1 mm, y aún con mayor preferencia menor que 100 |_im. La altura H del canal también puede ser menor que 1 mm.
La estructura y la técnica de fabricación del chip de microfluidos 1 que comprende dicho canal de transporte de microfluidos 100 no son importantes y no establecen límites para la invención.
Sólo a modo de ejemplo, en la variante de modalidad de la Figura 2, el canal principal de microfluidos 100 está delimitado por una ranura en forma de U en sección transversal y realizada en la cara superior 10a del sustrato 10, y por la cara trasera 11b de la placa 11. La pared inferior 100c de la ranura forma la pared inferior del canal de microfluidos 100; las dos paredes 100d de la ranura que son paralelas, en sección transversal y más particularmente perpendiculares a la pared inferior 100c, forman las dos paredes longitudinales 100d del canal de microfluidos 100; la parte de la cara inferior 11b de la placa 11, localizada en línea con la ranura en forma de U, forma la pared superior 100e del canal de microfluidos 100.
Esta sección transversal rectangular del canal de microfluidos 100 permite contribuir a la orientación espacial de los espermatozoides en el canal 100, en particular en combinación con el enfoque hidrodinámico. En particular, dado que los espermatozoides tienen una forma aplanada y no esférica, la implementación de un canal de microfluidos 100 con una sección transversal rectangular contribuye a una orientación espacial de los espermatozoides con sus caras aplanadas F que tienen la superficie más grande orientada sustancialmente paralela al plano (Y, Z), es decir, sustancialmente paralelo al plano de las dos paredes longitudinales 100d del canal de microfluidos 100. Depende del experto en la técnica seleccionar juiciosamente, de una manera conocida per se, las dimensiones del canal de microfluidos 100, y en particular la relación H/E.
Sin embargo, se debe enfatizar que la invención no se limita a la implementación de un canal de transporte 100 que tiene una sección transversal rectangular, dicho canal de transporte 100 puede de una manera más generalizada tener una geometría de sección transversal diferente que contribuye a la orientación espacial antes mencionada de espermatozoide.
De manera más general, por lo tanto será posible implementar un canal de transporte 100 que tenga un plano principal de simetría P1 paralelo a la dirección de transporte Y, y que comprenda, en un plano X, Z perpendicular a la dirección de transporte, una sección transversal, que es simétrica, que se caracteriza por un eje principal de simetría A (Figura 2), y que tiene una dimensión transversal máxima H, medida a lo largo de este eje principal de simetría A, y una dimensión transversal mínima E, que es menor que la dimensión de la sección transversa1H, y medida a lo largo de un eje secundario de sección transversal B (Figura 2) perpendicular al eje principal de simetría A. Por ejemplo, y de manera no limitante y no exhaustiva, el canal de transporte 100 puede tener una forma ovalada, elíptica, etc. en sección transversal.
El sustrato 10 está hecho de un material químicamente inerte. Por ejemplo, pero no necesariamente, el material del sustrato 10 se elige para que pueda sufrir un grabado químico o físico, por ejemplo un grabado con plasma. Más particularmente, pero sin establecer una limitación para la invención, el sustrato es, por ejemplo, silicio o arseniuro de galio. En este caso, la ranura (100c, 100d) de altura H y ancho E se logra ventajosamente mediante grabado anisotrópico de la cara superior 10a del sustrato 10. El sustrato con la ranura (100c, 100d) también se puede producir mediante cualquier otro método de fabricación conocido y, por ejemplo, mediante impresión 3D o mediante la tecnología denominada "estampado en caliente". El sustrato también puede estar hecho de un material polimérico. La placa 11 es de un material que es químicamente inerte y puede ser opaco o transparente. La placa 11 es, por ejemplo, vidrio o plástico. Se fija al sustrato 10 por cualquier medio y, por ejemplo, mediante unión anódica o termocompresión.
Medios de inyección 2 de los espermatozoides en el canal de microfluidos
Los medios de inyección 2 se utilizan para inyectar, en el canal principal de microfluidos 100, una solución S que contiene una muestra de espermatozoides a seleccionar.
Más particularmente, en la variante de la Figura 1, estos medios de inyección 2 comprenden una jeringa 20 que se llena con una solución S que contiene la muestra SP de los espermatozoides a seleccionar, y que está asociada a un sistema de inyección automático 21, que puede ser, por ejemplo, de la bomba de jeringa o tipo bomba peristáltica. La salida de la jeringa 20 está acoplada a un tubo capilar 22, cuya porción distal 22a se ha insertado en el canal de microfluidos 100 a través de la abertura de entrada 100a de este canal 100. El tubo capilar 22 es un tubo flexible o rígido, cuya sección transversal se adapta preferentemente a la sección del canal de microfluidos 100. Estos medios de inyección particulares 2 anteriores pueden ser reemplazados por cualquier sistema de inyección equivalente para inyectar en el canal principal de microfluidos 100, con un flujo controlado, una solución S que contiene una muestra de espermatozoides a seleccionar.
Más particularmente, el tubo capilar 22 se une preferentemente al sustrato 10 por cualquier medio, y en particular mediante encolado.
Los espermatozoides SP se diluyen en la solución tampón S, que es biológicamente compatible con los espermatozoides, y por ejemplo, en una solución acuosa que comprende 30 g/L de TRIS (trishidroximetilaminometano), 17,25 g/L de ácido cítrico monohidrato y 12,5 g/l. L de fructosa en agua a un pH de aproximadamente 7. Se pueden utilizar muchas otras soluciones tampón S, conocidas por los expertos en la técnica. En este punto, se puede hacer referencia, por ejemplo, a la enseñanza de la solicitud de patente internacional WO2004/088283.
Más particularmente, el ADN de los espermatozoides SP contenido en la solución tampón S se marcó de una manera conocida per se, por medio de al menos un fluorocromo, que puede emitir fluorescencia cuando está asociado con el ADN. Entre los fluorocromos comúnmente utilizados para etiquetar espermatozoides, se pueden citar los siguientes ejemplos no limitantes y no exhaustivos: fluorocromos tipo bisbencimida, y en particular fluorocromos Hoechst (Hoechst 33342, Hoechst 33258, etc.), bromuro de etidio, SYBR fluorocromos como SYBR-14.
Se pueden usar muchos otros fluorocromos conocidos por los expertos en la técnica. En particular, para más detalles sobre la realización de una solución tampón S que comprende espermatozoides etiquetados con fluorocromos, se puede utilizar como referencia la enseñanza de la solicitud de patente internacional WO2004/088283.
En funcionamiento, el sistema de inyección 21 empuja la solución tampón S que contiene los espermatozoides SP, para hacerla salir a través de la abertura distal 22b del capilar 22, e inyectarla en el canal de microfluidos 100 con un flujo controlado de manera automática y preferentemente constante. Se ha comprobado que esta inyección de solución tampón S que contiene espermatozoides SP en el canal de microfluidos 100 no afectó a la fertilidad, y en particular a la motilidad de los espermatozoides.
Medios (3, 101) de enfoque hidrodinámico de espermatozoides
Para permitir la implementación de un enfoque hidrodinámico de los espermatozoides SP en el canal de microfluidos 100, el chip de microfluidos 1 comprende dos canales secundarios de microfluidos 101, que, de la forma habitual, se forman a cada lado del canal de transporte de microfluidos 100 (Figura 1). Cada canal secundario de microfluidos 101 tiene una abertura de entrada 101a y se abre, opuesto a la abertura de entrada 101a, lateralmente en el canal principal de microfluidos 100.
La salida del tubo capilar 22 se posiciona aguas arriba de la zona de unión entre los canales secundarios de microfluidos 101 y el canal de transporte de microfluidos 100, la porción distal 22a del tubo capilar 22 se puede insertar más o menos profundamente en el canal de transporte 100.
Más particularmente, y de forma similar a lo que se describió anteriormente para el canal principal de microfluidos 100, cada canal secundario de microfluidos 101 está definido en primer lugar por una ranura en forma de U grabada en la cara superior del sustrato 10, y por otro lado por la cara inferior 11b de la placa 11.
Los medios de enfoque hidrodinámico comprenden para cada canal secundario 101,un medio de inyección 3 en forma de jeringa 30, que se llena con una solución L, y que está asociado a un sistema de inyección automático 31, por ejemplo del tipo bomba de jeringa o bomba peristáltica o cualquier otro medio de accionamiento de líquido. La salida de la jeringa 30 está acoplada a un tubo capilar 32, cuya porción distal 32a se ha insertado en el canal de microfluidos 100 a través de la abertura de entrada 101a de un canal secundario 101. Cada tubo capilar 32 es un tubo flexible, cuya sección transversal se adapta preferentemente a la sección del canal secundario 101. Más particularmente, cada tubo capilar 32 se fija preferentemente al sustrato 10, por cualquier medio, y en particular por unión.
El líquido usado para las soluciones L es preferente, pero no necesariamente, idéntico al usado para la solución tampón S que contiene espermatozoides SP.
En funcionamiento, cada sistema de inyección 31 empuja cada solución L de modo que se inyecte en el canal secundario de microfluidos correspondiente 101 con un caudal que se controla de manera automática y preferentemente constante.
De manera conocida per se, los caudales de cada solución L y de la solución tampón S que contiene los espermatozoides SP se controlan automáticamente, de modo que se crean en el canal de microfluidos 100a, dos flujos laminares de alta velocidad FL formados por cada solución L, a ambos lados del flujo central más lento formado por la solución S que contiene espermatozoides SP. Estos flujos laminares FL permiten, de manera conocida, que los espermatozoides SP sean arrastrados hacia el canal principal de microfluidos 100 sometiéndolos a un enfoque hidrodinámico, de tipo 2D, que da como resultado sustancialmente la alineación de los espermatozoides SP, uno detrás del otro, con una alineación SP de los espermatozoides sustancialmente en un plano de enfoque hidrodinámico longitudinal que es paralelo al plano principal de simetría P1 del canal de transporte 100. Además, la sección rectangular o equivalente del canal de transporte 100 permite obtener una orientación espacial de los espermatozoides con su superficie aplanada que tiene la superficie más grande orientada sustancialmente paralela al plano principal de simetría P1 del canal de transporte 100, es decir, sustancialmente paralelo al plano de las dos paredes longitudinales 100d del canal de microfluidos 100 en la variante de la Figura 1 y la Figura 2.
La posición de este plano de enfoque hidrodinámico de los espermatozoides entre las dos paredes longitudinales 100d del canal 100 depende, en particular, de la diferencia en el caudal entre los dos flujos laminares FL de líquido L. Cuando estos caudales son iguales, el plano de enfoque hidrodinámico de los espermatozoides está sustancialmente centrado entre las dos paredes longitudinales 100d del canal 100 (Figura 2), es decir, corresponde sustancialmente al plano principal de simetría P1 del canal de transporte 100. En el contexto de la invención, el plano de enfoque hidrodinámico de los espermatozoides puede no obstante estar descentrado entre las dos paredes longitudinales 100d del canal 100, con respecto al plano principal de simetría P1.
La invención no se limita al enfoque hidrodinámico 2D de espermatozoides SP en el canal principal de microfluidos 100. También es posible en el contexto de la invención implementar un enfoque hidrodinámico 3D, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO2011/005776, para alinear sustancialmente los espermatozoides a lo largo de un eje de enfoque hidrodinámico longitudinal que es paralelo al eje Y del canal de microfluidos 100.
Los medios de inyección específicos antes mencionados 3 pueden ser sustituidos por cualquier sistema de inyección equivalente que permita inyectar, en el canal principal de microfluidos 100, con un flujo controlado, las soluciones L, para obtener, de forma conocida per se, dicho enfoque hidrodinámico 2D o 3D de los espermatozoides en el canal de transporte 100.
Medios de excitación de fluorescencia 4
Los medios de excitación de fluorescencia 4 comprenden una fuente 40 de radiación electromagnética, de tipo fuente láser, en la que la longitud de onda se adapta al etiquetador (fluorocromo) de los espermatozoides. Por ejemplo, y de manera no limitante para la invención, se utiliza una radiación electromagnética para excitación de fluorescencia que tiene una longitud de onda de entre 300 nm y 400 nm, por ejemplo, más particularmente, alrededor de 375 nm cuando los espermatozoides SP se han etiquetado con Hoechst.
El chip de microfluidos 1 tiene un primer paso 102, que desemboca en el canal principal de microfluidos 100 (Figura 1 y Figura 3) en una porción del canal principal de microfluidos 100 aguas abajo de la región de enfoque hidrodinámico (región de unión de los canales 100 y 101).
En la variante particular de la Figura 1, este paso 102 está formado a través de una de las paredes longitudinales 100d del canal de microfluidos 100.
En la variante ilustrada en la Figura 1 y la Figura 4, la distancia entre la salida 102b en el canal de transporte 100 del paso 102 y la pared 100d opuesta del canal de transporte 100 corresponde al ancho E del canal de transporte 100, y es preferentemente menor que 1 mm, con mayor preferencia menos de 100 |_im.
Este paso 102 está delimitado por una ranura en U grabada en la cara superior 10a del sustrato 10 y por la cara inferior 11b de la placa 11. En otra variante, el paso 101 podría perforarse a través del sustrato 10.
La salida de la fuente de radiación electromagnética 40 está acoplada a una fibra óptica 41 cuya porción distal 41a está insertada en este primer paso 102, de modo que el extremo transmisor 41b (Figura 4) de la fibra óptica 41 no sobresalga en el canal de microfluidos 100, para no perturbar el flujo de fluidos en el canal de microfluidos 100 y, por lo tanto, no perturbar el posicionamiento y la orientación espacial de los espermatozoides SP que circulan en el canal de microfluidos 100. Preferentemente, el extremo transmisor 41b de la fibra óptica 41 se posiciona más cerca de este canal de microfluidos 100, y preferentemente al ras con el canal de microfluidos 100.
En esta Figura 4, el revestimiento mecánico de la fibra óptica recibe la referencia 412, el revestimiento óptico de la fibra óptica recibe la referencia 410 y el núcleo de la fibra óptica recibe la referencia 411. En esta modalidad, el extremo distal del revestimiento óptico 410 y el núcleo 411 de la fibra óptica, a través del cual se emite radiación de excitación electromagnética, está desnudo. En otra modalidad, el extremo distal del revestimiento óptico 410 y el núcleo 411 de la fibra óptica podrían no estar desnudos y rodeados por el revestimiento mecánico 412 de la fibra óptica 41.
Más particularmente, en la modalidad de la Figura 4, el paso 102 está perfilado para incluir un hombro 102a, formando un tope de posicionamiento 102a para el extremo distal 412a del revestimiento mecánico 412 de la fibra óptica. Por lo tanto, es suficiente insertar la fibra óptica hasta que el extremo distal 412a del revestimiento mecánico 412 quede bloqueado por el tope de posicionamiento 102a, lo que permite ventajosamente un posicionamiento simple y preciso del extremo de transmisión distal de la fibra óptica 41 con respecto al canal de microfluidos 100. En funcionamiento, cuando el extremo transmisor de la fibra óptica 41 está alineado con el canal de transporte 100, la radiación de excitación electromagnética es emitida por la fibra óptica 41 directamente al canal de transporte 100. Cuando el extremo transmisor de la fibra óptica 41 se posiciona ligeramente rebajado en el paso 102, la radiación de excitación electromagnética se emite en este paso 102 y luego entra en el canal de transporte 100.
Esta inserción de la fibra óptica 41 en el chip de microfluidos 1, cerca del canal de microfluidos 100, permite favorablemente la radiación de excitación electromagnética lo más cerca posible de los espermatozoides SP que circulan en el canal de microfluidos, lo que contribuye a mejorar el rendimiento de la excitación de fluorescencia. Para mejorar también el rendimiento de la excitación de fluorescencia, se da muy poca preferencia a la distancia Di (Figura 4), entre la salida 102b en el canal de transporte 100 del primer paso 102 y el plano de enfoque hidrodinámico (2D enfoque hidrodinámico) o el eje de enfoque hidrodinámico (enfoque hidrodinámico 3D) de los espermatozoides SP en el canal de transporte 100. La longitud de la trayectoria de la radiación de excitación electromagnética también se reduce favorablemente al llegar a los espermatozoides SP, a través del líquido transportador de espermatozoides en el canal de transporte 100. Preferentemente, pero no necesariamente, esta distancia Di es menor que 1 mm, con mayor preferencia menos de 100 m, y aún con mayor preferencia menos de 50 micras.
La inserción de la fibra óptica 41 en el chip de microfluidos 1 también permite la prevención de riesgos de desalineación de la radiación de excitación electromagnética con respecto al canal de microfluidos 100 cuando se manipula el chip de microfluidos 1.
Sin embargo, la invención no se limita a la implementación de una fibra óptica 41 integrada en el chip y que se abre al canal de transporte 100. En otra modalidad, el medio de excitación de fluorescencia 4 puede comprender una fuente de excitación de luz (no necesariamente de fibra) que es externa al chip de microfluidos 1 y que permite la iluminación de los espermatozoides por medio de la radiación de excitación emitida fuera del chip de microfluidos y que atraviesa una pared del canal de transporte.
Medios 5 para la detección de fluorescencia
Los medios 5 para la detección de fluorescencia comprenden una primera fibra óptica 51 y un fotodetector 50, de tipo fotomultiplicador (PM), que está adaptado para detectar la longitud de onda de fluorescencia de los espermatozoides, específicamente, por ejemplo, una longitud de onda entre 400 nm y 500 nm, y, por ejemplo, alrededor de 460 nm cuando los espermatozoides están etiquetados con un fluorocromo de tipo Hoechst.
El chip de microfluidos 1 tiene un segundo paso 103, que desemboca en el canal principal de microfluidos 100 (Figura 1 y la Figura 5) opuesto al primer paso 103. En la modalidad particular de la Figura 1, este paso 103 se forma a través de la otra pared longitudinal 100d del canal de microfluidos 100.
La distancia entre la salida 103b en el canal de transporte 100 del paso 103 y la pared opuesta 100d del canal de transporte 100 corresponde al ancho E del canal de transporte 100, y es preferentemente menor que 1 mm, con mayor preferencia menor que 100 |_im.
En la Figura 5, el revestimiento mecánico de la fibra óptica recibe la referencia 512, el revestimiento óptico de la fibra óptica recibe la referencia 510 y el núcleo de la fibra óptica recibe la referencia 511.
De una manera idéntica a lo que se ha descrito anteriormente para la fibra óptica 41, la porción distal 51a de la fibra de detección óptica 51 se inserta en este segundo paso 103 de manera que el extremo distal de la fibra óptica 51 no sobresalga en el canal de microfluidos 100, y se posicione preferentemente más cerca de este canal de microfluidos 100.
Esta fibra óptica 51 puede detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides en una dirección sustancialmente perpendicular al plano principal de simetría P1 del canal de transporte 100.
Los términos "para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides en una dirección sustancialmente perpendicular al plano principal de simetría P1" significan que los medios de detección de fluorescencia, y en este caso en esta modalidad particular, la primera fibra óptica 51, permiten la detección de al menos una porción de la fluorescencia emitida por los espermatozoides SP dentro de al menos un cono de detección de como máximo 90°, con un eje perpendicular al plano principal de simetría P1 y cuyo vértice se orienta hacia el canal de transporte 100 (Figura 10/cono C1 de un ángulo a en el vértice de 90°).
Más particularmente, pero sin limitación para la invención, y en el caso de esta modalidad particular de la primera fibra óptica 51, estos medios de detección de fluorescencia pueden detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides SP al menos en una dirección perpendicular al plano principal de simetría P1.
Como resultado, cuando los espermatozoides SP son transportados uno detrás del otro en el canal de transporte 100, se orientan espacialmente de modo que sus caras principales F que tienen la superficie más grande sean sustancialmente paralelas al plano principal de simetría P1 del canal 100, los primeros medios para detectar la fluorescencia, y en el caso de esta variante de modalidad particular, el extremo distal de la primera fibra óptica 51, están orientados en la dirección de una de las dos caras principales F que tiene la mayor superficie de cada espermatozoide SP que pasa sucesivamente en el canal de transporte frente a dichos medios de detección.
El extremo de transmisión 51b de la fibra de detección 51 se posiciona opuesto al fotodetector 50, de modo que la luz (fluorescencia) que se emite en el canal de microfluidos 100 que es captada por la fibra 51, se detecta por el detector de luz 50. El detector de luz 50 emite una señal eléctrica 50a que caracteriza la intensidad luminosa detectada de la fluorescencia.
Esta inserción de la fibra de detección óptica 51 en el chip de microfluidos 1, cerca del canal de microfluidos 100, permite la mejora apropiada de la detección de fluorescencia y contribuye a una mejor discriminación entre un espermatozoide X y un espermatozoide Y.
Con el fin de mejorar también el rendimiento de la detección de fluorescencia, la distancia entre la salida 103b en el canal de transporte 100 del segundo paso 103 (Figura 1 abertura 103b de este paso 103 que desemboca en el canal de transporte 100) y el plano de enfoque hidrodinámico P (enfoque hidrodinámico 2D) o el eje de enfoque hidrodinámico (enfoque hidrodinámico 3D) de los espermatozoides en el canal de transporte 100 es preferentemente muy pequeño. La longitud de la trayectoria de la radiación de fluorescencia se reduce por lo tanto apropiadamente a través del líquido de transporte de esperma en el canal de transporte 100. Preferentemente, pero no necesariamente, esta distancia es menos de 1 mm, con mayor preferencia menos de 100 |_im, y aún con mayor preferencia menos de 50 |_im.
En particular, para captar una cantidad máxima de luz, la fibra de detección óptica 51 puede ser, por ejemplo, una fibra óptica de núcleo grande 511 (Figura 5) en contraste con la fibra óptica de excitación 41, el núcleo 411 (Figura 4) la cual es de menor diámetro para enfocar espacialmente la radiación electromagnética.
Con referencia a la Figura 1, los medios de detección de fluorescencia 5 también comprenden una segunda fibra óptica 52 asociada a un fotodetector 53, de tipo fotomultiplicador (PM), que está adaptado para detectar la longitud de onda de fluorescencia de los espermatozoides, es decir por ejemplo una longitud de onda entre 400 nm y 500 nm, y por ejemplo alrededor de 460 nm cuando los espermatozoides se etiquetaron con un fluorocromo de tipo Hoechst.
Con referencia a la Figura 6, el chip de microfluidos 1 comprende un tercer paso 104, que se forma a través de la pared inferior 100c del canal de microfluidos 100 que desemboca en el canal principal de microfluidos 100 en la misma zona que las fibras ópticas 41 y 51 mencionadas anteriormente.
En esta Figura 6, el revestimiento mecánico de la fibra óptica recibe la referencia 522, el revestimiento óptico de la fibra óptica recibe la referencia 520 y el núcleo de la fibra óptica recibe la referencia 521.
De manera idéntica a la descrita anteriormente para la fibra óptica 41, la porción distal 52a de la fibra de detección óptica 52 se inserta en este tercer paso 104 de manera que el extremo distal de la fibra óptica 52 no sobresalga en el canal de microfluidos 100, y preferentemente se posiciona más cerca de este canal de microfluidos 100.
El extremo de transmisión 52b (Figura 1) de la fibra de detección 52 se posiciona opuesto al fotodetector 53, de modo que la luz (fluorescencia) que se emite en el canal de microfluidos 100, y es captada por la fibra 52 en la parte inferior del canal de transporte, se detecta por el detector de luz 53. El detector de luz 53 emite una señal eléctrica 53a (Figura 1) que caracteriza la intensidad luminosa de la fluorescencia que se detecta.
Más particularmente, para recoger una cantidad máxima de luz, la fibra de detección óptica 52 puede ser, por ejemplo, una fibra óptica de núcleo grande 521 (Figura 6).
Preferentemente, esta segunda fibra de detección óptica 52 puede detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides, en una dirección sustancialmente perpendicular, y más particularmente, perpendicular al plano secundario P2 del canal de transporte que es perpendicular al plano principal de simetría P1.
Los términos "para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides en una dirección esencialmente perpendicular al plano secundario P2", indican que el medio para detectar la fluorescencia, y en este caso, en esta variante de modalidad particular, la primera fibra óptica 52, permite la detección de al menos una parte de la fluorescencia emitida por los espermatozoides SP al menos dentro de un cono de detección de como máximo 90°, con un eje perpendicular al plano secundario P2, y cuyo vértice se dirige hacia el canal de transporte 100 (Figura 10/cono C2 de ángulo p en el vértice de 90°).
Más particularmente, pero sin limitar la invención, en este caso, esta variante de modalidad particular de la segunda fibra óptica 52 permite que estos medios de detección de fluorescencia detecten la fluorescencia emitida por los espermatozoides SP al menos en una dirección perpendicular al plano secundario P2.
Como resultado, cuando los espermatozoides SP se transportan uno detrás del otro en el canal de transporte 100, exhiben una orientación espacial de modo que sus caras principales F tienen la mayor superficie al ser sustancialmente paralela al plano principal de simetría P1 del canal 100. Los segundos medios de detección de fluorescencia, y en el caso de esta variante de modalidad particular, el extremo distal de la primera fibra óptica 52, están orientados en la dirección de uno de los dos cortes T de menor grosor de los espermatozoides SP que pasan sucesivamente en el canal de transporte 100 frente a dichos medios de detección.
La invención no se limita al uso de fibras ópticas asociadas a fotodetectores, del tipo fotomultiplicador (PM), para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides, sino que las fibras ópticas 51 y 52 y los fotodetectores pueden ser sustituidos por cualquier otro medio de detección de fluorescencia.
Medios de selección 6
Los medios de selección 6 comprenden una fuente 60 de radiación electromagnética, por ejemplo, una fuente láser (pulsada o continua) y una fibra óptica 61. La salida de esta fuente de radiación electromagnética 61 está acoplada a la fibra óptica 61.
El chip de microfluidos 1 comprende un cuarto paso 105, que desemboca en el canal principal de microfluidos 100 (Figura 1 y Figura 7) en una porción del canal principal de microfluidos 100 localizado aguas abajo de la zona de detección de fluorescencia.
En la variante particular de la Figura 1, este paso 105 se realiza a través de una de las paredes longitudinales 100d del canal de microfluidos 100.
La distancia entre la salida 105b en el canal de transporte 100 del paso 105 y la pared opuesta 100d del canal de transporte 100 corresponde al ancho E del canal de transporte 100, y es preferentemente menor que 1 mm, con mayor preferencia menor que 100 |_im.
En la Figura 7, el revestimiento mecánico de la fibra óptica recibe la referencia 612, el revestimiento óptico de la fibra óptica recibe la referencia 610 y el núcleo de la fibra óptica recibe la referencia 611.
De la misma manera que se describió anteriormente para la fibra óptica 41, la porción distal 61a de la fibra óptica 61 se inserta en este cuarto paso 105, de modo que el extremo de transmisión distal 61b (Figura 7) de la fibra óptica 61 no se proyecta en el canal de microfluidos 100, y preferentemente se posiciona más cerca de este canal de microfluidos 100.
Cuando se excita, la fuente 60 emite una radiación de alteración electromagnética R en el canal de microfluidos 100, cuya función es alterar directa o indirectamente un espermatozoide SP que circula en el canal principal de microfluidos 100 y que atraviesa por esta radiación de alteración electromagnética, de modo que este espermatozoide ya no es fértil. El espermatozoide SP que atraviesa la radiación de alteración electromagnética se modifica, de manera que su viabilidad o motilidad se deteriora lo suficiente como para que el espermatozoide deje de ser fértil, independientemente del fenómeno físico y/o biológico y/o químico que provoque este deterioro.
Para obtener esta alteración, es posible utilizar una longitud de onda para la radiación de alteración electromagnética seleccionada de un amplio rango espectral. Más particularmente, pero no exclusivamente, la longitud de onda de la radiación de alteración electromagnética se seleccionará típicamente en un rango de longitudes de onda entre UV e IR.
La inserción de la fibra óptica 61 en el chip de microfluidos 1, cerca del canal de microfluidos 100, permite ventajosamente que la radiación electromagnética de alteración de los espermatozoides se acerque lo más cercano a los espermatozoides SP que circulan en el canal de microfluidos.
En funcionamiento, cuando el extremo de transmisión de la fibra óptica 61 está alineado con el canal de transporte 100, la radiación de alteración electromagnética es emitida por la fibra óptica 61 directamente al canal de transporte 100. Cuando el extremo transmisor de la fibra óptica 61 se posiciona ligeramente rebajado en el paso 105, la radiación de alteración electromagnética se emite en este paso 105 y luego entra en el canal de transporte 100. Debido a la integración de la porción distal 61a de la fibra óptica 61 en el chip de microfluidos, se evita el riesgo de desalineación de la radiación de alteración electromagnética con respecto al canal de microfluidos 100, especialmente cuando se manipula el chip de microfluidos 1.
Sin embargo, la invención no se limita a la implementación de una fibra óptica 61 integrada en el chip y que se abre al canal de transporte 100. En otra modalidad, los medios de selección pueden comprender, por ejemplo, una fuente de radiación que proporciona iluminación para la selección de los espermatozoides por medio de radiación emitida fuera del chip de microfluidos y que atraviesa una pared del canal de transporte.
Otras modalidades - Figura 9
En otra modalidad alternativa mostrada esquemáticamente en la Figura 9, los medios 4 para la excitación de la fluorescencia descritos anteriormente pueden sustituirse por los medios 4' para la excitación de la fluorescencia que comprenden una fuente 40' de radiación electromagnética, por ejemplo, del tipo láser de fuente que están adaptados para emitir una radiación de excitación electromagnética REF, cuya longitud de onda se adapta a la etiqueta (fluorocromo) de los espermatozoides. Esta radiación de excitación electromagnética REF se emite fuera del chip de microfluidos y atraviesa la pared superior 11 del canal de transporte hacia los espermatozoides SP que circulan por este canal de transporte.
Cuando los espermatozoides SP circulan en el canal de transporte 100, debido en particular a la geometría de la sección transversal del canal de transporte, cada espermatozoide SP se orienta espacialmente de modo que su cara principal F, que tiene la superficie más grande, es sustancialmente paralela al plano principal de simetría P1 del canal de transporte. En la variante de modalidad de la Figura 9, uno de los dos cortes T con menor grosor de espermatozoides que se orientan y circulan en el canal de transporte 100 está principalmente iluminado, en lugar de una de las dos caras F que tiene la mayor superficie de los espermatozoides, esto a diferencia de la variante antes mencionada que implementa la iluminación lateral (medio 4 de excitación de fluorescencia mencionado aquí arriba). Alternativamente, los medios de excitación de fluorescencia 4' también pueden adaptarse para emitir radiación de excitación electromagnética R fuera del chip de microfluidos y a través de la pared inferior 10 del canal de transporte. Alternativamente, esta iluminación también podría realizarse directamente en el canal de transporte por medio de una fibra óptica, que se integra en el chip de microfluidos que pasa a través de la pared superior 11 o la pared inferior 10 del canal de transporte.
De manera más general, para iluminar principalmente el corte T con menor grosor de espermatozoides que se orientan y circulan en el canal de transporte 100, se implementará una radiación de excitación electromagnética REF que se propaga al menos en una dirección sustancialmente paralela al plano principal de simetría P1 del canal de transporte.
Medios electrónicos de procesamiento y control 7
Los medios electrónicos de procesamiento y control 7 reciben las dos señales de detección de fluorescencia de entrada 50a, 53a emitidas respectivamente por los fotodetectores 50 y 53, y en la salida entregan una señal de control 7a para controlar automáticamente dicha fuente de radiación electromagnética 60, a partir de la detección de fluorescencia.
Los ensayos de detección de fluorescencia se realizaron con semen de ganado sexado etiquetado con Hoechst 33342 y se pasaron a través de un dispositivo de microfluidos de la invención. Las siguientes consideraciones y la invención no se limitan al semen bovino, sino que pueden generalizarse para el semen de cualquier tipo de mamífero que comprenda cromosomas X o Y, y en particular para espermatozoides de cerdos, ovejas, equinos, cabras, conejos.
En la Figura 11 se muestran dos ejemplos de señales de tiempo de detección de fluorescencia 50a (detección lateral) y 53a (detección de base de canal) cuando un espermatozoide de mamífero SP, en el caso de un bovino, atraviesa el canal de transporte frente a los extremos distales de las dos fibras ópticas 51 y 52.
También se muestra un ejemplo esquemático de una señal de tiempo de detección de fluorescencia 50a o 53a en la Figura 12 cuando un espermatozoide de mamífero SP, en el caso que nos ocupa un bovino, atraviesa el canal de transporte frente a los extremos distales de la fibra óptica 51 o 52. El paso de un espermatozoide frente al extremo distal de la fibra óptica 51 o 52 se traduce en una variación temporal de la intensidad de la señal de detección de fluorescencia 50a o 53a. Esta variación temporal de la intensidad de la señal de detección de fluorescencia 50a o 53a constituye una firma en la señal de detección de fluorescencia 50a o 53a, a la que se hace referencia como PICO en las figuras, durante la cual la intensidad de la señal de detección es constantemente mayor que un umbral de fluorescencia mínimo predefinido Smín, y preferentemente se puede configurar.
En la señal de detección de fluorescencia 50a o 53a de la Figura 12, la duración D de esta firma PICO se indicó por encima de dicho umbral de fluorescencia mínimo predeterminado Smín, que es una característica del paso de un espermatozoide frente al extremo distal de la fibra óptica 51 o 52. Este umbral mínimo Smín lo establecen los expertos en la técnica para filtrar el ruido en la señal de detección 50a o 53a y permitir una detección de la firma de fluorescencia PICO por el medio de procesamiento electrónico 7 y una medición de la duración D de esta firma PICO durante la cual la intensidad de fluorescencia está por encima de este umbral Smín. En esta Figura 12, la intensidad máxima de la firma de fluorescencia PICO se denomina "MÁX" y el área de la firma de fluorescencia PICO por encima del umbral mínimo Smín se denomina "Aire".
Un ejemplo de un histograma del máximo (MÁX) de la intensidad de fluorescencia en el detector 53 en el fondo del canal de transporte se representa en la Figura 13, que es la intensidad máxima de la señal de detección de fluorescencia 53a. Este histograma muestra dos curvas diferentes ligeramente desplazadas en términos de intensidad de fluorescencia, que se pueden usar para discriminar entre dos poblaciones diferentes de espermatozoides X y Y. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la discriminación de los espermatozoides X y Y basada en esta detección única no es óptima, ya que depende en gran medida de la calidad del semen, el protocolo de etiquetado y los fluidos de compresión utilizados para orientar los espermatozoides en el canal de transporte. Además, el rendimiento de la detección es bajo debido a que sólo una fracción de los espermatozoides puede discriminarse en la práctica con suficiente fiabilidad.
Un ejemplo de un histograma de las duraciones D de las firmas de fluorescencia detectadas lateralmente (señal 50a) por encima de dicho umbral de fluorescencia predefinido (Smín) se representa en la Figura 14. Esta figura muestra que las poblaciones X y Y tienen duraciones de emisión D significativamente diferentes, y que la duración D de la firma de fluorescencia, en el detector lateral 50 (señal 50a), es un parámetro que puede usarse para discriminar las poblaciones X y Y de espermatozoides, de forma más fiable y discriminatoria que la intensidad máxima (MÁX) de la fluorescencia detectada en el fondo del canal (señal 53a). Los ensayos realizados con diferentes especies bovinas mostraron una reproducibilidad del carácter discriminatorio de este parámetro D de duración.
Un ejemplo de un histograma de las duraciones D de las firmas de fluorescencia detectadas en el fondo del canal (señal 53a) por encima de dicho umbral predefinido (Smín) se representa en la Figura 15. Esta figura muestra que las poblaciones X y Y tienen duraciones de emisión sustancialmente idénticas y que la duración D de la firma de fluorescencia en el detector lateral 53 (señal 53a) no es un parámetro que pueda usarse de manera confiable para discriminar las poblaciones X y X de espermatozoides. Este histograma confirma la importancia de la orientación espacial de los espermatozoides en el canal de transporte con respecto a los medios de detección de fluorescencia para la fiabilidad de la duración D de la firma de fluorescencia PICO como medio para discriminar espermatozoides X/Y.
En una modalidad alternativa preferida, los medios electrónicos de procesamiento y control 7 están diseñados para procesar, en tiempo real, las dos señales de tiempo de detección de fluorescencia 50a y 53a y para entregar una señal 7a para controlar los medios de selección 6 en base a estas dos señales de tiempo de detección de fluorescencia 50a y 53a.
Ahora se detallará un ejemplo particular que muestra el procesamiento de estas dos señales de tiempo de detección de fluorescencia 50a y 53a para detectar automáticamente los espermatozoides Y, y controlar automáticamente los medios de selección 6 para alterar los otros espermatozoides que no fueron identificados como espermatozoides Y. El procesamiento de la señal de tiempo de detección de fluorescencia 50a (detección lateral) consiste en medir, para cada firma de fluorescencia PICO en la señal, al menos un parámetro que es la duración de emisión D de dicha fluorescencia detectada por dichos primeros medios de detección por encima del umbral mínimo predefinido (Smín) de la fluorescencia mencionada anteriormente (Figura 12).
Más particularmente, los medios de procesamiento electrónico 7 son capaces de detectar automáticamente, en la señal de tiempo de detección de fluorescencia 50a generada por los primeros medios de detección, el punto en el tiempo t0 (Figura 12) donde la señal de detección de fluorescencia 50a pasa por encima del umbral de fluorescencia predefinido (Smín) y el momento t1 (Figura 12) donde la señal de detección de fluorescencia (50a) vuelve por debajo del umbral de fluorescencia predefinido (Smín), y son capaces de medir dicha duración (D = t1- t0) de la firma de fluorescencia (PICO) como el intervalo de tiempo entre estos dos puntos detectados en el tiempo.
Los medios electrónicos de procesamiento y control 7 comparan automáticamente este parámetro (duración D) con un umbral máximo predefinido y preferentemente de forma configurable, que permite la discriminación entre espermatozoides X y Y. Cuando este parámetro está por debajo de este umbral máximo, los medios electrónicos de procesamiento y control 7 detectan automáticamente, por ejemplo, que se trata de un espermatozoide Y, y por lo tanto permiten la selección de un tipo de espermatozoide.
El procesamiento de la señal de detección de fluorescencia 53a (parte inferior del canal) consiste en medir, para cada firma de fluorescencia PICO, la intensidad máxima de fluorescencia MÁX y comparar esta intensidad máxima MÁX con un umbral máximo predefinido Imáx que se elige para eliminar las firmas de fluorescencia no conformes y en particular, pero no exclusivamente, para discriminar notablemente los espermatozoides unidos. De hecho, en el caso de los espermatozoides unidos entre sí, se ha demostrado que la intensidad máxima (MÁX) de la fluorescencia era anormalmente alta.
Cuando los medios electrónicos de procesamiento y control 7 detectan un espermatozoide Y (o respectivamente un espermatozoide X) en la señal de detección de fluorescencia 50a (detección lateral) y al mismo tiempo detectan que la intensidad máxima de fluorescencia MÁX en la señal de detección 53a (parte inferior del canal) es menor que el umbral máximo predefinido Imáx, disparan, por ejemplo, un pulso de control (señal de control 7a) para detener temporalmente el láser de selección 60 para no alterar los espermatozoides Y (o respectivamente los espermatozoides X) que se ha detectado cuando pasa por el canal de transporte frente al láser de selección.
A modo de ejemplo, la Figura 16 muestra un ejemplo específico de la señal de detección de fluorescencia 50a y 53 que comprende tres firmas de fluorescencia sucesivas denominadas respectivamente PICO1, PICO2, PICO3.
Solo las firmas PICO3 en las dos señales de detección de fluorescencia 50a y 53 permiten la detección de un espermatozoide Y y la generación de un pulso de control (IMP) para la parada temporal del láser de selección 60. Para las firmas anteriores, la firma PICO1 de la señal de detección 50a (detección lateral) tiene una duración D que es demasiado grande para caracterizar un espermatozoide Y, y la firma PICO2 de la señal de detección 53a (detección del fondo del canal) tiene una intensidad máxima que es demasiado alta (más alta que Imáx).
En otra variante simplificada de la invención, los medios electrónicos de procesamiento y control 7 podrían disponerse para realizar la detección únicamente a partir de la señal de detección 50a (detección lateral).
En las modalidades que se han descrito, la geometría de la sección transversal del canal de transporte 100 combinada con un enfoque hidrodinámico de los espermatozoides permite la orientación espacial de cada espermatozoide SP de modo que su cara principal F que muestra la superficie más grande es sustancialmente paralela al plano principal. de simetría P1 del canal de transporte 100. Sin embargo, la invención no se limita a la geometría particular del canal de transporte 100 ilustrado en las figuras adjuntas, sino que se extiende en particular a cualquier dispositivo en el que los espermatozoides puedan transportarse en un canal de transporte uno detrás del otro que tenga sustancialmente la misma orientación espacial. Por lo tanto, en otra modalidad, el canal de transporte podría tener por ejemplo una sección transversal circular y el dispositivo podría estar equipado, de manera conocida per se, con una boquilla que permitiera inyectar los espermatozoides en dicho canal de transporte confiriendo sustancialmente la misma orientación espacial en el canal de transporte.
En otra modalidad, los medios de selección descritos anteriormente 6 pueden reemplazarse por medios de clasificación que permitan separar el primer tipo de espermatozoides (SP) (por ejemplo, espermatozoides de tipo X) de un segundo tipo de espermatozoides (SP) (por ejemplo, espermatozoides Y), sin alterar necesariamente uno de los dos tipos de espermatozoides.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Dispositivo para discriminar espermatozoides (SP) etiquetados con al menos un fluorocromo, cuyo dispositivo comprende un canal de transporte (100), por el que puede circular una solución que contiene dichos espermatozoides etiquetados (SP) en una dirección de transporte predefinida (Y), un medio de excitación (4; 4') que permite la estimulación de la emisión de fluorescencia de los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en dicho canal de transporte (100), un medio (5) para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en dicho canal de transporte (100), y un medio de procesamiento electrónico (7) para discriminar los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en el canal de transporte de la fluorescencia detectada por medio de la detección de fluorescencia (5), dicho dispositivo comprende una y/u otra de las siguientes características técnicas (a), (b):
    (a) dicho canal de transporte comprende un plano principal de simetría (P1) paralelo a la dirección de transporte (Y), y una sección transversal en un plano (X, Z) perpendicular a la dirección de transporte (Y), que es simétrico, que se caracteriza por un eje de simetría principal (A) y tiene una dimensión de sección transversal máxima (H), medida a lo largo de este eje de simetría principal (A), y una dimensión de sección transversal mínima (E), menor que la dimensión de sección transversal máxima (H), y medida a lo largo de un eje de sección transversal secundario (B) perpendicular al eje principal de simetría (A), el medio de detección de fluorescencia (5) que comprende al menos los primeros medios de detección (50; 51), que son capaces de detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides (SP) en una dirección sustancialmente perpendicular al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte, y más particularmente al menos en una dirección perpendicular al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte,
    (b) dicho dispositivo que comprende medios para transportar los espermatozoides (SP) uno detrás de otro en el canal de transporte (100) con sustancialmente la misma orientación espacial de cada espermatozoide, el medio de detección de fluorescencia (5) que comprende al menos los primeros medios de detección (50; 51) que están orientados en la dirección de una de las dos caras principales (F) que tiene la mayor superficie de cada espermatozoide (SP) que pasa sucesivamente en el canal de transporte (100) frente a dichos medios de detección y que se orienta espacialmente,
    y el dispositivo que se caracteriza porque los medios de procesamiento electrónico (7) son capaces de discriminar automáticamente los espermatozoides (SP) utilizando al menos la duración (D) de cada firma de fluorescencia (PICO) que es característica de un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia (50a) generada por los primeros medios de detección (50; 51).
  2. 2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los medios de procesamiento electrónico (7) son capaces de medir automáticamente la duración (D) de cada firma de fluorescencia (PICO) por encima de un umbral de fluorescencia predefinido (Smín) y discriminar automáticamente los espermatozoides (SP) utilizando al menos dicha duración (D), y preferentemente en donde los medios de procesamiento electrónico (7) son capaces de detectar automáticamente en la señal de detección de fluorescencia (50a) generada por los primeros medios de detección (50; 51) el punto en el tiempo (t0) donde la señal de detección de fluorescencia (50a) pasa por encima del umbral de fluorescencia predefinido (Sm,n) y el punto en el tiempo (t1) donde la señal de detección de fluorescencia (50a) vuelve por debajo del umbral de fluorescencia predefinido (Sm,n), y son capaces de medir dicha duración (D = t1 - t0) de la firma de fluorescencia (PICO) como el intervalo de tiempo entre estos dos puntos detectados en el tiempo.
  3. 3. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los medios de detección de fluorescencia incluyen además los segundos medios de detección (52; 53) adaptados para detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides (SP), y en donde los medios de procesamiento electrónico (7) son capaces de discriminar automáticamente los espermatozoides (SP) que circulan en el canal de transporte, de la fluorescencia detectada por los segundos medios de detección (52; 53), y más particularmente de la intensidad máxima (MÁX) de la fluorescencia detectada por los segundos medios de detección (52; 53).
  4. 4. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los medios de procesamiento electrónico (7) son capaces de discriminar automáticamente los espermatozoides (SP) que circulan en el canal de transporte al menos a partir de la duración (D) de cada firma de fluorescencia (PICO) que caracteriza a los espermatozoides en la señal de detección de fluorescencia (50a) generada por los primeros medios de detección (50; 51) y al menos cuando la intensidad máxima (MÁX) de la fluorescencia detectada por los segundos medios de detección (52; 53) está por debajo de un umbral máximo predefinido (Imáx).
  5. 5. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los segundos medios de detección (52; 53) son capaces de detectar la fluorescencia emitida por los espermatozoides (SP) en una dirección sustancialmente perpendicular al plano secundario (P2) del canal de transporte que es perpendicular al plano principal de simetría (P1), y más particularmente al menos en una dirección perpendicular al plano secundario (P2) del canal de transporte.
  6. 6. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende medios (2) para inyectar una solución (S) que contiene espermatozoides (SP) etiquetados por medio de al menos un fluorocromo en dicho canal de transporte (100).
  7. 7. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende medios de enfoque hidrodinámico (3; 101) para inyectar un líquido (L) en dicho canal de transporte (100) para inducir los espermatozoides (SP) en el canal de transporte (100), posicionarlos sustancialmente en un plano de enfoque hidrodinámico y separarlos uno detrás de otro y preferentemente en donde los medios de enfoque hidrodinámico (3; 101), en combinación con el canal de transporte (100), permitan orientar espacialmente los espermatozoides transportados en el canal de transporte con la misma orientación espacial.
  8. 8. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los medios de excitación (4') son capaces de iluminar localmente los espermatozoides etiquetados (SP) que circulan en dicho canal de transporte (100) por medio de radiación de excitación de fluorescencia electromagnética (REF) que se propaga al menos en una dirección sustancialmente paralela al plano principal de simetría (P1) del canal de transporte.
  9. 9. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios de procesamiento electrónico permiten la discriminación entre un primer y segundo tipo de espermatozoides y en particular la discriminación entre espermatozoides X y espermatozoides Y, el dispositivo comprende medios de selección (6) para alterar selectivamente los espermatozoides (SP) de uno de los dos tipos que circulan en el canal de transporte (100), o comprende medios de clasificación para separar el primer tipo de espermatozoides (SP) del segundo tipo de espermatozoides (SP).
  10. 10. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los medios de selección (6) comprenden una fuente de radiación electromagnética (60) que puede controlarse automáticamente por los medios de procesamiento (7) para alterar selectivamente los espermatozoides (SP) que circulan en el canal de transporte (100), por medio de la radiación electromagnética (R) emitida por la fuente de radiación electromagnética (60).
  11. 11. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el canal de transporte (100) es un canal de microfluidos del que al menos una dimensión de la sección transversal es menor que 1 mm, y más particularmente menor que 100 |_im y/o en donde el canal de transporte (100) tiene una sección transversal rectangular.
  12. 12. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el ancho (E) del canal de transporte rectangular (100) es menor que 1 mm, y preferentemente menor que 100 |_im.
  13. 13. Uso del dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para discriminar automáticamente y, si procede, seleccionar automáticamente o clasificar automáticamente los espermatozoides in vitro.
  14. 14. Procedimiento de discriminación de esperma (SP) in vitro, en donde una solución de (S) que contiene los espermatozoides (SP) etiquetados por medio de al menos un fluorocromo se inyecta en el canal de transporte (100) del dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dichos espermatozoides (SP) circulan en el canal de transporte (100) uno detrás del otro orientándolos espacialmente con la misma orientación espacial, y en el que se detecta automáticamente el tipo de cromosoma de cada espermatozoide que circula en el canal de transporte (100) utilizando al menos la duración (D) de la firma de fluorescencia (PICO) que caracteriza a un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia (50a) emitida por los primeros medios de detección (50; 51) del dispositivo.
  15. 15. Un proceso para la producción de semen sexado mediante la selección o clasificación in vitro de espermatozoides (SP) por medio del dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, durante el cual una solución (S) que contiene los espermatozoides (SP) etiquetados con al menos un fluorocromo se inyecta en el canal de transporte (100) del dispositivo, dichos espermatozoides (SP) se hacen circular en el canal de transporte (100) uno detrás del otro, orientándolos espacialmente con la misma orientación espacial, el tipo de cromosoma de cada espermatozoide que circula en el canal de transporte (100) se detecta automáticamente, y en particular, si el espermatozoide es de tipo X o Y, utilizando al menos la duración (D) de la firma de fluorescencia (PICO) que caracteriza a un espermatozoide en la señal de detección de fluorescencia (50a) emitida por los primeros medios de detección (50; 51) del dispositivo, y la selección de un tipo dado de espermatozoides (SP), en particular mediante la alteración del otro tipo de espermatozoides (SP), o los espermatozoides (SP) se clasifican de acuerdo con su tipo, y en particular su tipo X o Y, en particular separando los espermatozoides (SP) de un tipo dado de los espermatozoides (SP) del otro tipo.
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