ES2885018T3 - Método para acumular hepatocitos - Google Patents

Abstract

Un método para crioconservar hepatocitos de múltiples fuentes que comprende las etapas de: A) descongelar hepatocitos de una pluralidad de fuentes conservadas en una solución de crioconservación que comprende DMSO; B) acumular de 300 a 1000 viales de hepatocitos de la pluralidad de fuentes en una solución de conservación, diluyendo así la concentración de DMSO; C) centrifugar los hepatocitos acumulados para provocar la sedimentación de hepatocitos viables y no viables; D) eliminar la solución de conservación; E) combinar los hepatocitos sedimentados viables y no viables con un crioconservante; F) distribuir los hepatocitos acumulados en viales G) crioconservar los hepatocitos en los viales

Description

DESCRIPCIÓN

Método para acumular hepatocitos

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la acumulación y la crioconservación de hepatocitos de múltiples donantes.

Antecedentes

Los hepatocitos constituyen aproximadamente el 80% de las células del hígado y son fundamentales tanto para la activación como para la desintoxicación final de muchos compuestos farmacológicos, toxinas o xenobióticos. El aumento de la demanda y la disponibilidad de nuevos fármacos, así como las pruebas reguladoras y de seguridad más estrictas antes de la aprobación del mercado, han convertido a los hepatocitos primarios aislados en un recurso valiosísimo para estudiar el metabolismo, la eficacia y la toxicidad de los fármacos en un entorno de laboratorio.

En los últimos años, se han realizado avances significativos en el aislamiento y la crioconservación de hepatocitos de donantes primarios, que pueden descongelarse rápidamente y utilizarse inmediatamente para la experimentación. Sin embargo, el estudio del metabolismo hepático en hepatocitos aislados de un hígado humano (donante individual) no refleja con precisión la función hepática de la población en general, ya que las variaciones en el sexo, la edad, la etnia, el estado de salud, los antecedentes genéticos y otros factores sesgan los resultados de las pruebas. Una medida más precisa del metabolismo hepático es utilizar una mezcla o “acumulación” de células de donantes individuales para crear una población heterogénea de hepatocitos.

Se han propuesto varios métodos para acumular hepatocitos. Estos protocolos a menudo emplean procedimientos prolongados en los que las células están expuestas a estrés físico y químico que reduce el número total de células viables. Por ejemplo, el método de la patente estadounidense 7.604.929 utiliza una etapa de centrifugación en gradiente de densidad antes de la etapa segunda o última de crioconservación. Esto somete a las células a estrés químico y mecánico que da lugar a la pérdida de células (Figuras 1A-B) o debilita las células de modo que mueren durante la crioconservación. Otro método divulgado en el documento WO 2014/045202 A2 mantiene los hepatocitos en una solución crioconservante durante todo el proceso de acumulación. Las soluciones crioconservantes contienen reactivos tóxicos, como dimetilsulfóxido (DMSO), que se sabe que provocan la muerte celular.

El sistema y el método propuestos buscan emplear técnicas para reducir la pérdida de células y, por lo tanto, aumentar el número total de células viables en todo el proceso.

Compendio

La solicitud busca aumentar el número de células viables resultantes de un proceso de acumulación de hepatocitos. Un método para crioconservar hepatocitos de múltiples fuentes comprende las etapas de:

A) descongelar hepatocitos de una pluralidad de fuentes conservadas en una solución de crioconservación que comprende DMSO;

B) acumular de 300 a 1000 viales de hepatocitos de la pluralidad de fuentes en una solución de conservación, diluyendo así la concentración de DMSO;

C) centrifugar los hepatocitos acumulados para provocar la sedimentación de hepatocitos viables y no viables;

D) eliminar la solución de conservación;

E) combinar los hepatocitos sedimentados viables y no viables con un crioconservante;

F) distribuir los hepatocitos acumulados en viales; y

G) crioconservación de los hepatocitos en los viales.

El método anterior puede utilizar diferentes tipos de hepatocitos, incluidos los seleccionados del grupo constituido por: hepatocitos humanos, hepatocitos porcinos, hepatocitos simiescos, hepatocitos caninos, hepatocitos felinos, hepatocitos bovinos, hepatocitos equinos, hepatocitos ovinos y hepatocitos de roedores.

Las fuentes individuales se pueden acumular según el sexo, la raza, la edad, el estado metabólico o el estado de salud. En algunos casos, las acumulaciones se pueden aleatorizar en función del conjunto de muestras que exista en ese momento.

Los tipos de solución de conservación que se pueden utilizar incluyen: solución de la Universidad de Wisconsin — HypoThermosol-Base o HypoThermosol-FRS—, así como otras soluciones de conservación similares que reducen la toxicidad del crioconservante y/o proporcionan nutrientes esenciales para los hepatocitos. Por ejemplo, la solución de conservación podría incluir suero fetal bovino.

La etapa de centrifugación carece de un gradiente de densidad para reducir el estrés físico y químico en las células. Esta etapa de centrifugación sedimenta hepatocitos tanto viables como no viables.

Los sedimentos se pueden combinar con un crioconservante antes de ser congelados. Al combinar el crioconservante y las células sedimentadas, pueden usarse la trituración con pipeta con movimiento ascendente y descendente, la agitación en vórtice, una sacudida del vial hacia adelante y hacia atrás, la aplicación de golpecitos en el vial o procesos similares para resuspender las células en la solución crioconservante.

Cuando se distribuyen los hepatocitos sedimentados en viales mediante alícuotas u otros métodos, las células acumuladas se pueden distribuir a una densidad que varía entre 8 y 15 millones de células/ml. En una realización, se utilizan 13,33 millones de células/ml.

Después de la descongelación final de los hepatocitos acumulados, un usuario puede realizar el fraccionamiento en gradiente de densidad para separar las células viables y no viables inmediatamente antes de realizar los experimentos. En algunos casos, la etapa de centrifugación en gradiente de densidad se realiza entre 50-200 FCR. El fraccionamiento en gradiente de densidad puede comprender la centrifugación en gradiente de densidad a través de partículas de sílice coloidal recubiertas con polivinilpirrolidona (Percoll).

Los hepatocitos utilizados en estos procesos pueden colocarse en placas o utilizarse en suspensión.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-B ilustran la producción de hepatocitos de rata viables después de una centrifugación secuencial con o sin un gradiente de Percoll.

La Figura 2 es un esquema de un método para acumular y crioconservar hepatocitos a partir de hepatocitos previamente crioconservados de donantes individuales.

La Figura 3 es un esquema de un método para separar células viables de células no viables a partir de la última etapa de crioconservación de la Figura 2.

Descripción detallada

En el presente documento se presenta una descripción de un sistema y un método mejorados para preparar una acumulación de células crioconservadas (por ejemplo, hepatocitos) a partir de hepatocitos previamente crioconservados obtenidos de donantes individuales. Este sistema y este método reducen el estrés físico y químico de los hepatocitos durante el proceso de acumulación a la vez que aumenta la recuperación de las células acumuladas viables durante una etapa de centrifugación posterior a la descongelación realizada por el usuario final. En general, este sistema y este método implican descongelar viales de hepatocitos de donantes individuales y acumularlos en una solución de conservación. A continuación, las células acumuladas se centrifugan brevemente para sedimentar tanto las células viables como las no viables, y luego se crioconservan a alta densidad en múltiples viales. El usuario final puede realizar una centrifugación en gradiente de densidad para separar las células viables de las no viables inmediatamente antes de su uso experimental. Algunas de las ventajas del método propuesto son la disminución de la exposición a factores ambientales mecánicos, químicos y otros que reducen el número de células viables antes de experimentar con los hepatocitos acumulados.

En una realización, los hepatocitos previamente aislados y crioconservados de donantes individuales se almacenan en fase de vapor de nitrógeno líquido a un mínimo de -150°C. Los viales de donantes individuales que han de acumularse pueden ser seleccionados al azar o en función de la actividad metabólica específica (por ejemplo, ECOD, citocromo P450, fase general I o fase II), edad, raza, sexo, etnia u otros determinantes fenotípicos. El número de viales descongelados depende del número de individuos incluidos en la población mixta y del tamaño de la acumulación que ha de generarse. Por ejemplo, el número de viales individuales usados para cada acumulación de hepatocitos puede ser de 2 a 50 individuos. Cada acumulación puede variar de 300 a 1000 viales. Por ejemplo, una acumulación de 10 donantes con 300 viales requeriría aproximadamente 30 viales de cada donante.

Los hepatocitos de donantes individuales se descongelan sumergiendo el vial en un baño de agua mantenido a 37°C durante aproximadamente 2 minutos o hasta que apenas sea visible un husillo de hielo y luego el contenido se decanta rápidamente en un recipiente que contiene una solución de conservación a 4°C. La solución de conservación se utiliza para diluir el DMSO (y/o cualquier otro reactivo tóxico para los hepatocitos) que se encuentra en el crioconservante. En algunos casos, la solución de conservación también proporciona nutrientes esenciales a los hepatocitos para promover su viabilidad durante el proceso de acumulación. El volumen de la solución de conservación depende del tamaño de la acumulación que se generará, pero puede estar compuesto, por ejemplo, por una relación 1:1 de solución de conservación por 1 ml de células crioconservadas. La solución de conservación puede estar compuesta por una solución de la Universidad de Wisconsin (lactobionato de potasio 10 mM, KH2PO425 mM, MgSO45 mM, rafinosa 30 mM, adenosina 5 mM, glutatión 3 mM, alopurinol 1 mM y almidón hidroxietílico 50 g/l), HypoThermosol-Base (HTS-Base), HypoThermosol-FRS (HTS-FRS) u otro medio similar con o sin la adición de suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés). Los hepatocitos se mantienen en la solución de conservación a 4°C mientras se descongelan y mezclan múltiples viales de hepatocitos en el mismo recipiente para crear una población “acumulada” de células de múltiples donantes. Los hepatocitos descongelados pueden permanecer en la solución de conservación de 2 a 10 horas, dependiendo de la cantidad de viales que se descongelen.

Después de que se hayan descongelado y acumulado múltiples viales de hepatocitos, las células se centrifugan en un intervalo de 50 - 200 de fuerza centrífuga relativa (FCR) durante 8 - 10 minutos para sedimentar células tanto viables como no viables. La solución de conservación se elimina de las células sedimentadas, por ejemplo, mediante aspiración. El uso de una etapa de centrifugación sin un gradiente de densidad en este punto del proceso reduce el estrés físico y químico en los hepatocitos antes de la segunda crioconservación. Las Figuras 1A-B ilustran el efecto que la centrifugación con gradiente de densidad (por ejemplo, Percoll) puede tener en los hepatocitos en comparación con la centrifugación sin gradiente de densidad. Con cada centrifugación posterior, el número total de células viables se redujo con el gradiente de densidad (Percoll) en relación con los hepatocitos centrifugados sin Percoll. Estos resultados indican que la centrifugación con una solución en gradiente de densidad reduce el número total de células viables.

Después de que las células sedimenten y se elimine la solución de conservación, se resuspenden inmediatamente en una solución crioprotectora que, por ejemplo, puede estar compuesta de CryoStor® CS10 que contiene DMSO al 10%. Los hepatocitos no viables y viables acumulados se distribuyen luego a razón de 10-15 millones de células/ml en alícuotas de 1 a 1,5 ml por vial. Cabe señalar que el recuento de células se puede realizar, por ejemplo, sin o con azul de tripano, naranja de acridina o yoduro de propidio a lo largo de cualquiera de las etapas del proceso.

El proceso de combinación o resuspensión puede comprender la adición de un crioconservante a los hepatocitos sedimentados. Los sedimentos combinados y el crioconservante pueden luego triturarse con pipeta con movimiento ascendente y descendente, agitarse en vórtice, agitarse en un vial hacia adelante y hacia atrás, recibir golpecitos en un vial o algún otro proceso similar para romper los sedimentos y dispersar los hepatocitos por todo el crioconservante.

Los viales que contienen hepatocitos acumulados se congelan utilizando un congelador de velocidad controlada y se mantienen en nitrógeno líquido a un mínimo de -150°C durante al menos 3 días y no más de 10 años antes del envío. Los viales pueden enviarse al usuario final en hielo seco o nitrógeno líquido en fase de vapor (por ejemplo, en Dewar) y almacenarse en nitrógeno líquido a un mínimo de -150°C. Inmediatamente antes de su uso, el usuario final puede descongelar los hepatocitos acumulados sumergiendo el vial en un baño de agua mantenido a 37°C durante aproximadamente 2 minutos o hasta que apenas sea visible un husillo de hielo.

Las células de hepatocitos viables y no viables acumuladas pueden ser aplicadas a una sílice coloidal al 20-30% recubierta con gradiente (Percoll) de polivinilpirrolidona y se centrifugan a 50-200 FCR durante 8-10 minutos para separar las células viables de las no viables. Por lo tanto, el número máximo de células viables se aísla inmediatamente antes de su uso sin exposición adicional al crioconservante u otro ciclo de congelación-descongelación. Este proceso permite 5 millones y hasta 8+ millones de células viables que se pueden recuperar y utilizar inmediatamente para la experimentación. La experimentación puede incluir, entre otros, ensayos de viabilidad, actividad metabólica, actividad transportadora, y absorción, metabolismo, eficacia y toxicidad de xenobióticos.

Ejemplo 1

El procedimiento para la preparación de hepatocitos acumulados a partir de hepatocitos crioconservados de donantes individuales se muestra en la Figura 2 y se expone en la siguiente operación:

1-A. Se descongelan viales de hepatocitos crioconservados de 10 donantes individuales durante aproximadamente 2 minutos en un baño de agua a 37°C hasta que apenas se ve un husillo de hielo. Cabe señalar que algunas acumulaciones pueden estar compuestas por entre 500 y 900 viales, o en este ejemplo de 50 a 90 viales por donante.

1-B. La suspensión de hepatocitos descongelada (1 ml) se pipetea en un vaso de precipitados de 1 l que contiene 500 ml de solución de conservación de HypoThermosol-FRS y se mantiene a 4°C para generar una acumulación de hepatocitos.

1 -C. Los hepatocitos acumulados se centrifugan a 100 G durante 10 minutos fuera de la solución conservante (FRS) para sedimentar tanto las células viables como las no viables.

1 -D. La solución de conservación se elimina por aspiración y las células se resuspenden con cuidado (por ejemplo, se sacuden de un lado a otro) en el medio crioprotector CryoStor® CS10. Las células se cuentan usando exclusión con azul de tripano para determinar la densidad de las células y se agrega una solución crioprotectora adicional, si es necesario, para lograr aproximadamente 13,3 x 106 células por ml.

1-E. Se colocan en viales individuales alícuotas de 1,5 mililitros o aproximadamente 20 millones de células.

1-F. Los viales de hepatocitos acumulados se crioconservan en un congelador de velocidad controlada y se almacenan en fase de vapor de nitrógeno líquido a un mínimo de -150°C.

El procedimiento para la separación de células viables de los hepatocitos acumulados realizado por el usuario final se muestra en la Figura 2 y se expone en la siguiente operación:

2-A. Se descongela un vial de hepatocitos acumulados durante aproximadamente 2 minutos en un baño de agua a 37°C hasta que apenas se ve un husillo de hielo.

2-B. La suspensión de hepatocitos se aplica cuidadosamente a un gradiente de densidad Percoll del 20-30%.

2-C. Las muestras se centrifugan a 200 FCR durante 10 minutos para separar las células viables de las no viables.

2-D. Se recuperan un mínimo de 5 millones de células viables y se utilizan inmediatamente para la experimentación.

Cabe señalar que la producción de células viables puede variar con las proporciones de la disolución y el tiempo de exposición durante el proceso de acumulación. Por ejemplo, en lotes más grandes a veces resulta prohibitivo o difícil (volumen del recipiente de acumulación) tener una proporción 1:1 de solución de conservación con respecto al crioconservante descongelado. Además, se requiere más tiempo para descongelar una gran cantidad de viales. Por tanto, las células están expuestas a concentraciones aumentadas de toxinas crioconservantes durante un período de tiempo más largo. A veces es más fácil hacer lotes más pequeños, en los que el crioconservante está más diluido y el tiempo de acumulación se reduce, lo que generalmente da como resultado producciones más altas de hepatocitos viables. Por ejemplo, la etapa 2-D podría producir 5 millones de células viables para un lote más grande, pero hasta de 8 millones de células viables y más en un lote más pequeño. En lotes más pequeños, la proporción puede ser de solución de conservación de 4:1 al crioconservante descongelado.

Los procesos del presente documento pueden aplicarse a hepatocitos usados en suspensión o en placa.

Aunque los ejemplos describen hepatocitos, el método y los procesos podrían aplicarse a otros tipos de células.

Estas realizaciones y las características ilustradas y descritas en el presente documento son ejemplares, pero no pretenden ser limitantes ni tampoco lo son las reivindicaciones enumeradas al final de esta solicitud. Se considera que múltiples combinaciones y componentes, intervalos y etapas equivalentes están dentro del alcance de esta solicitud.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para crioconservar hepatocitos de múltiples fuentes que comprende las etapas de:

A) descongelar hepatocitos de una pluralidad de fuentes conservadas en una solución de crioconservación que comprende DMSO;

B) acumular de 300 a 1000 viales de hepatocitos de la pluralidad de fuentes en una solución de conservación, diluyendo así la concentración de DMSO;

C) centrifugar los hepatocitos acumulados para provocar la sedimentación de hepatocitos viables y no viables; D) eliminar la solución de conservación;

E) combinar los hepatocitos sedimentados viables y no viables con un crioconservante;

F) distribuir los hepatocitos acumulados en viales

G) crioconservar los hepatocitos en los viales

2. El método de la reivindicación 1, en el que dichos hepatocitos se seleccionan del grupo constituido por: hepatocitos humanos, hepatocitos porcinos, hepatocitos simiescos, hepatocitos caninos, hepatocitos felinos, hepatocitos bovinos, hepatocitos equinos, hepatocitos ovinos y hepatocitos de roedores.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dichas fuentes múltiples están compuestas por un grupo aleatorio o preseleccionado en función del sexo, la raza, la edad, el estado metabólico o el estado de salud.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la solución de conservación está compuesta por una solución de la Universidad de Wisconsin: HyperThermosol-Base o HyperThermosol-FRS.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la solución de conservación se compone además de suero fetal bovino.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la distribución de las células acumuladas se realiza a una densidad superior a 10 millones de células/ml.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de centrifugación carece de gradiente de densidad.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de centrifugación se realiza para sedimentar células tanto viables como no viables.

9. El método de la reivindicación 1, que incluye, además, descongelar las células crioconservadas acumuladas y aplicar un proceso de fraccionamiento en gradiente de densidad.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la etapa de centrifugación en gradiente de densidad se realiza entre 50-200 FCR.

11. El método de la reivindicación 9, en el que dicho fraccionamiento por gradiente de densidad comprende la centrifugación por densidad a través de partículas de sílice coloidal recubiertas con polivinilpirrolidona.

12. El método de la reivindicación 2, en el que los hepatocitos se utilizan en suspensión o en placa.

13. El método de la reivindicación 1, en el que la combinación de hepatocitos sedimentados con crioconservante incluye además una o más de las siguientes etapas: triturar con pipeta con movimiento ascendente y descendente, agitar en vórtice, sacudir el vial de un lado a otro o dar golpecitos en el vial.

14. El método de la reivindicación 1, en el que los hepatocitos descongelados permanecen en la solución de conservación durante la acumulación en la etapa B durante 2 a 10 horas.