ES2881149B2 - Apparatus and methods for the diagnosis of colorectal cancer - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Aparatos y métodos para el diagnóstico de cáncer colorrectalApparatus and methods for the diagnosis of colorectal cancer
OBJETO DE LA INVENCIÓNOBJECT OF THE INVENTION
La presente invención está relacionada con métodos de diagnóstico y prevención del cáncer colorrectal (CCR). Más concretamente, la invención se refiere a aparatos y métodos de extracción y análisis preciso, simple, sensible y eficaz de compuestos orgánicos volátiles (COVs) para su aplicación como test de cribado no-invasivo del CCR.The present invention relates to methods of diagnosis and prevention of colorectal cancer (CRC). More specifically, the invention relates to apparatus and methods for the precise, simple, sensitive and efficient extraction and analysis of volatile organic compounds (VOCs) for their application as a non-invasive screening test for CRC.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
El cáncer colorrectal es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. Los métodos de detección de CCR que se utilizan actualmente pueden ser invasivos, como las colonoscopias, o no invasivos como el test de sangre oculta en heces (TSOH). Aunque estos test de cribado hayan ayudado a disminuir la mortalidad, su rendimiento no es óptimo. El TSOH presenta un número substancial de falsos negativos y como consecuencia un número importante de diagnósticos perdidos del CCR. Además, un porcentaje significativo de los participantes sanos sometidos a cribado poblacional reciben un resultado de falso positivo, lo que a su vez conlleva un uso innecesario de colonoscopias. Las colonoscopias son una técnica invasiva, con riesgo de complicaciones (sangrado o perforación), así como un elevado coste.Colorectal cancer is one of the leading causes of cancer death worldwide. Currently used CRC detection methods can be invasive, such as colonoscopies, or non-invasive, such as the fecal occult blood test (TSOH). Although these screening tests have helped to reduce mortality, their performance is not optimal. The TSOH presents a substantial number of false negatives and as a consequence a significant number of missed CRC diagnoses. Furthermore, a significant percentage of healthy participants undergoing population screening receive a false-positive result, which in turn leads to unnecessary use of colonoscopies. Colonoscopies are an invasive technique, with a risk of complications (bleeding or perforation), as well as a high cost.
Hoy en día existen dos tipos de técnicas centradas en el estudio de los compuestos orgánicos volátiles “volatoloma” para su futura aplicación en la detección del CCR; las técnicas analíticas y las tecnologías de reconocimiento de patrones. Las técnicas analíticas permiten detectar alteraciones en la presencia y concentración de moléculas específicas, mientras que las tecnologías de reconocimiento de patrones no son específicas, lo que significa que no son selectivos a un compuesto dado, sino a un grupo de compuestos.Today there are two types of techniques focused on the study of volatile organic compounds "volatoloma" for their future application in the detection of CRC; analytical techniques and pattern recognition technologies. Analytical techniques make it possible to detect alterations in the presence and concentration of specific molecules, while pattern recognition technologies are non-specific, which means that they are not selective for a given compound, but rather for a group of compounds.
Una de las técnicas analíticas utilizadas para la detección de COVs usadas en estudios de búsqueda de biomarcadores en pacientes con CCR es la microextracción en fase sólida (SPME) seguida de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) o seguida de tubo de selección de iones con flujo-espectrometría de Masas (SIFT-MS). One of the analytical techniques used for the detection of VOCs used in biomarker search studies in patients with CRC is solid phase microextraction (SPME) followed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) or followed by tube sampling. selection of ions with flow-mass spectrometry (SIFT-MS).
La técnica de microextracción en fase sólida (SPME), utiliza fibras para la detección de COVs. Las fibras actualmente utilizadas y comercializadas para SPME presentan ciertas desventajas; son frágiles, se rompen con facilidad; presentan una preferente absorción de materiales más pesados provocando un “desplazamiento”; inexistencia de buenos sorbentes para detectar materiales ligeros, y; tienen un coste elevado.The solid phase microextraction (SPME) technique uses fibers for the detection of VOCs. The fibers currently used and marketed for SPME have certain disadvantages; they are fragile, they break easily; they present a preferential absorption of heavier materials causing a "displacement"; lack of good sorbents to detect light materials, and; they have a high cost.
La determinación de COVs para la detección de CCR, otros cánceres e infecciones utilizando estas y otras técnicas analíticas ha sido divulgada en varias publicaciones y patentes.The determination of VOCs for the detection of CRC, other cancers and infections using these and other analytical techniques has been disclosed in several publications and patents.
La patente EP3210013 describe un sistema de diagnóstico del CCR mediante la detección de COVs, tales como benceno o tolueno en muestras de heces en forma gaseosa y mediante el uso de un conjunto de sensores de diferentes óxidos metálicos. Este tipo de sensores determinan perfiles de COVs específicos de pacientes para compararlos con un perfil de COVs de referencia y poder confirmar la presencia de CCR en el paciente. El método aquí descrito presenta la desventaja en tanto a que una combinación de diferentes sensores es necesaria para reaccionar e identificar las diferentes COVs y para poder así obtener un diagnostico o pronostico fiable.Patent EP3210013 describes a CRC diagnostic system by detecting VOCs, such as benzene or toluene in gaseous stool samples and by using a set of sensors for different metal oxides. These types of sensors determine specific VOC profiles of patients to compare them with a reference VOC profile and to be able to confirm the presence of CRC in the patient. The method described here presents the disadvantage in that a combination of different sensors is necessary to react and identify the different VOCs and thus be able to obtain a reliable diagnosis or prognosis.
Shusuke Toden et al. Nutrition and cancer, 51(1), 45-51, 27 Jan 2010, divulgaron la implicación de compuestos tales como, fenol y p-cresol, en carcinogénesis colorrectal. La concentración de dichos compuestos, medida por cromatografía líquida de alta resolución, aparecía elevada en heces y en orina, en sujetos que consumían una dieta alta en proteína animal, lo que les llevo a concluir que un alto nivel de p-cresol fecal en humanos podía estar relacionado con un incremento del riesgo de padecer cáncer de colon.Shusuke Toden et al. Nutrition and cancer, 51(1), 45-51, 27 Jan 2010, reported the involvement of compounds such as phenol and p-cresol in colorectal carcinogenesis. The concentration of these compounds, measured by high performance liquid chromatography, appeared elevated in feces and urine, in subjects who consumed a diet high in animal protein, which led them to conclude that a high level of fecal p-cresol in humans could be related to an increased risk of colon cancer.
Con posterioridad, Patel et al. Plos ONE, 14 (4), 1-15, 15 April 2019, estudiaron un grupo de biomarcadores volátiles fecales y su uso en el diagnóstico de clostridium difficile. Entre los marcadores relacionados con clostridium difficile que se identificaron en muestras de heces, se incluyen COVs tales como el p-cresol y el indol. La detección de los COVs se llevó a cabo mediante el método TD-GC-ToFMS (desorción térmica seguida de cromatografía de gases y de espectroscopia de masas). Las muestras de heces se depositaron en el aparato de desorción térmica (TD), en viales abiertos dentro de botellas de 100 ml de tamaño, sin presencia de sorbentes. La extracción de los COVs de la muestra se produjo mediante el uso de una corriente de aire, que arrastró los COVs hasta un tubo de desorción térmica. Sin embargo, los resultados obtenidos a partir de esta técnica y aparato no proporcionaron una especificidad adecuada, ya que muchos de los COVs, particularmente el p-cresol y también en el caso del indol, fueron detectados en las muestras de control, tales como en las muestras de aire de laboratorio (IAQ), en las muestras con la botella vacía y/o en las muestras estándar. De todas las muestras control ninguna contenía la presencia de COVs. En el caso de las muestras de IAQ y en las de la botella vacía, estas ni siquiera contenían la presencia de ningún otro componente. Consecuentemente, el aparato y la metodología utilizada no fueron adecuados para identificación de COVs o biomarcadores de clostridium difficile en muestras de heces, ni pudieron proporcionar un método con alta especificidad y sensibilidad adecuada.Subsequently, Patel et al. Plos ONE, 14 (4), 1-15, 15 April 2019, studied a group of fecal volatile biomarkers and their use in the diagnosis of clostridium difficile. Clostridium difficile-related markers that have been identified in stool samples include VOCs such as p-cresol and indole. VOC detection was carried out using the TD-GC-ToFMS method (thermal desorption followed by gas chromatography and mass spectroscopy). The stool samples were deposited in the thermal desorption (TD) apparatus, in open vials inside 100 ml bottles, without the presence of sorbents. The extraction of the VOCs from the sample was produced using the use of an air current, which dragged the VOCs into a thermal desorption tube. However, the results obtained from this technique and apparatus did not provide adequate specificity, since many of the VOCs, particularly p-cresol and also in the case of indole, were detected in control samples, such as in laboratory air samples (IAQ), in the samples with the empty bottle and/or in the standard samples. Of all the control samples, none contained the presence of VOCs. In the case of the IAQ samples and those of the empty bottle, these did not even contain the presence of any other component. Consequently, the apparatus and the methodology used were not suitable for identification of VOCs or Clostridium difficile biomarkers in stool samples, nor could they provide a method with high specificity and adequate sensitivity.
Con posterioridad Harrisham Kaur et al. Frontiers in microbiology, Nov 2017, Volume 8, Article 2166, realizaron un estudio del microbioma intestinal de pacientes con CCR. El estudio divulga la presencia de productos y subproductos generados por la putrefacción bacteriana, como los fenoles, p-cresol e 1H-indol analizados usando entre otros métodos secuenciado de ADN de microbioma. Dichos productos, serian inofensivos para el cuerpo humano cuando están presentes dentro de un cierto nivel; sin embargo, estos estarían implicados en la alteración de la homeostasis intestinal y también en la progresión tumoral colorrectal, especialmente en individuos con un sistema inmunitario comprometido y exposición previa a infecciones/enfermedades intestinales. Esta observación, en combinación con los conocimientos obtenidos en Harrisham Kaur et al. (que indica la probabilidad de producción de los productos mencionados en cantidades más altas en pacientes con CCR) sugiere la posible implicación de las vías de putrefacción en la patogénesis de la enfermedad. Asimismo, el análisis del microbioma intestinal de pacientes con CCR indicó una probable implicación de las vías de putrefacción seleccionadas en la etiología de la enfermedad de CCR.Subsequently, Harrisham Kaur et al. Frontiers in microbiology, Nov 2017, Volume 8, Article 2166, conducted a study of the gut microbiome of CRC patients. The study reports the presence of products and by-products generated by bacterial putrefaction, such as phenols, p-cresol and 1H-indole analyzed using, among other methods, microbiome DNA sequencing. These products would be harmless to the human body when they are present within a certain level; however, these would be implicated in the alteration of intestinal homeostasis and also in colorectal tumor progression, especially in individuals with a compromised immune system and previous exposure to intestinal infections/diseases. This observation, in combination with insights gained from Harrisham Kaur et al. (indicating the probability of production of the mentioned products in higher amounts in CRC patients) suggests the possible involvement of putrefactive pathways in the pathogenesis of the disease. Likewise, analysis of the gut microbiome of CRC patients indicated a probable involvement of selected putrefactive pathways in the etiology of CRC disease.
Todas estas publicaciones proporcionaron estudios que relacionan determinados biomarcadores, algunos de ellos COVs con la probabilidad de que un sujeto sufra de cáncer colorrectal a través de diferentes métodos, sin embargo, ninguna de ellas ha proporcionado hasta el momento un método, rápido, fiable, económico y con alta sensibilidad para detectar y cuantificar COVs que puedan ser útiles como biomarcadores y a la vez permita desarrollar un método de cribado que permita reducir o eliminar los falsos positivos y los falsos negativos en la detección de CCR. All these publications provided studies that relate certain biomarkers, some of them VOCs, with the probability that a subject suffers from colorectal cancer through different methods, however, none of them has so far provided a fast, reliable, economical method. and with high sensitivity to detect and quantify VOCs that can be useful as biomarkers and at the same time allows the development of a screening method that allows reducing or eliminating false positives and false negatives in the detection of CRC.
Por otro lado, Vidal et al. Analytica Chimica Acta 971 (2017) 40-47, divulgó el uso de un aparato de cromatografía de gases por desorción térmica y espectroscopia de masas, para la detección de COVs. El aparato divulgado se encuentra adaptado a sistema de extracción en fase sólida magnética. El conjunto, se usó para evaluar su aplicabilidad en la identificación de compuestos orgánicos volátiles de clorobenceno en muestras liquidas acuosas. El aparato del artículo proporcionó buenas eficiencias de extracción que a su vez proporcionaban buenos valores de límite de detección (LOD); sin embargo, los resultados en la determinación de estos COVs variaron dependiendo del tipo de estructura y peso molecular de compuesto volátil a determinar. El aparato y el método utilizado proporcionaron una sensibilidad diferente dependiendo del compuesto. Los compuestos de alto peso molecular porporcionaron una sensibilidad más baja mientras que los clorobencenos de bajo peso molecular mostraron menor eficiencia de extracciónOn the other hand, Vidal et al. Analytica Chimica Acta 971 (2017) 40-47, disclosed the use of a gas chromatography apparatus for thermal desorption and mass spectroscopy, for the detection of VOCs. The disclosed apparatus is adapted to a magnetic solid phase extraction system. The set was used to evaluate its applicability in the identification of volatile organic compounds of chlorobenzene in aqueous liquid samples. The article apparatus provided good extraction efficiencies which in turn provided good limit of detection (LOD) values; however, the results in the determination of these VOCs varied depending on the type of structure and molecular weight of the volatile compound to be determined. The apparatus and the method used provided a different sensitivity depending on the compound. High molecular weight compounds provided lower sensitivity while low molecular weight chlorobenzenes showed lower extraction efficiency.
Posteriormente, Dos Reis Cruz. L. et al. 2018 “Metodologías analíticas respetuosas con el medioambiente”, tesis doctoral de la Universidad de Alicante, divulgó metodologías analíticas para la determinación de microcontaminantes, tales como siloxanos, en muestras líquidas acuosas mediante la técnica de extracción en fase solida magnética (MSPE) seguida de cromatografía líquida o cromatografía de gases. El aparato de extracción en fase sólida magnética utilizado comprende una fase magnética compuesta por minerales de hierro, como magnetita (Fe 3 O 4 ) y una fase extractante que comprende materiales de grafeno, entre ellos el nanocomposite magnético de óxido de grafeno (GO)/Fe 3 O 4 . El aparato de extracción en fase sólida magnética no dispone de un espacio de cabeza sobre la muestra.Later, Dos Reis Cruz. L et al. 2018 "Environmentally friendly analytical methodologies", doctoral thesis from the University of Alicante, disclosed analytical methodologies for the determination of micropollutants, such as siloxanes, in aqueous liquid samples using the magnetic solid phase extraction (MSPE) technique followed by chromatography liquid or gas chromatography. The magnetic solid phase extraction apparatus used comprises a magnetic phase composed of iron minerals such as magnetite (Fe 3 O 4 ) and an extracting phase comprising graphene materials, including graphene oxide (GO)/magnetic nanocomposite. Faith 3 O 4 . The magnetic solid phase extraction apparatus does not have a headspace above the sample.
El aparato de extracción en fase sólida magnética de Dos Reis Cruz. L. presenta las siguientes desventajas: la extracción no se hace directamente sobre la muestra, ya que inicialmente se realiza una etapa de tratamiento de la muestra y el proceso en general se realiza en varias etapas. Después de mezclar la muestra con el sorbente, la separación de los COVs se realiza o bien por centrifugación o mediante un campo magnético externo, seguido de una posterior separación de fases manual, lo que supone una elevada manipulación que conlleva una pérdida de precisión y/o exactitud. Consecuentemente, el aparato no resultó ser adecuada para la extracción de COVs en muestras sólidas. The Dos Reis Cruz magnetic solid phase extraction apparatus. L. presents the following disadvantages: the extraction is not done directly on the sample, since initially a stage of sample treatment is carried out and the process is generally carried out in several stages. After mixing the sample with the sorbent, the separation of the VOCs is performed either by centrifugation or by an external magnetic field, followed by a subsequent manual phase separation, which involves high handling and leads to a loss of precision and/or or accuracy. Consequently, the apparatus was not found to be suitable for the extraction of VOCs from solid samples.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar aparatos y métodos de análisis de COVs con alta sensibilidad que puedan además cuantificar dichos COVs de muestras complejas como muestras sólidas, semisólidas o directamente de muestras de heces y que demás sean rápidos, fiables, sensibles y económicos. Preferiblemente estos COVs son biomarcadores relacionados con el cribado y diagnóstico de CCR en sujetos. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han desarrollado un aparato adaptado para el análisis cualitativo y cuantitativo de COVs. De manera particular para el análisis de biomarcadores relacionados con el CCR en muestras sólidas y/o semisólidas (6), preferiblemente en muestras de heces. Así mismo han desarrollado un método de diagnóstico y pronóstico de CCR ex vivo que comprende el análisis de COVs que son biomarcadores relacionados con el CCR en muestras sólidas y/o semisólidas, preferiblemente en heces. Dicho método es no invasivo, rápido, fiable, económico, con alta sensibilidad y de uso en un rango de pacientes muy amplio, de modo que se puede también eliminar o reducir el número de falsos positivos y los falsos negativos.Therefore, there is a need to develop high-sensitivity VOC analysis apparatus and methods that can also quantify such VOCs from complex samples such as solid, semi-solid samples or directly from stool samples and that are fast, reliable, sensitive and economical. . Preferably these VOCs are biomarkers related to the screening and diagnosis of CRC in subjects. Surprisingly, the inventors of the present invention have developed an apparatus adapted for the qualitative and quantitative analysis of VOCs. In particular, for the analysis of CRC-related biomarkers in solid and/or semisolid samples (6), preferably in stool samples. Likewise, they have developed an ex vivo CRC diagnostic and prognostic method that includes the analysis of VOCs that are CRC-related biomarkers in solid and/or semisolid samples, preferably in feces. Said method is non-invasive, fast, reliable, economical, with high sensitivity and for use in a very wide range of patients, so that the number of false positives and false negatives can also be eliminated or reduced.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
El primer aspecto de la presente invención está relacionado con un aparato adaptado para el análisis cualitativo y cuantitativo de COVs en muestras sólida y/o semisólidas (6), dicho aparato comprende los siguientes elementos:The first aspect of the present invention is related to an apparatus adapted for the qualitative and quantitative analysis of VOCs in solid and/or semisolid samples (6), said apparatus comprises the following elements:
a. un dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza (1); b. un aparato de cromatografía de gases (2);a. an adsorptive magnetic headspace extraction device (1); b. a gas chromatography apparatus (2);
c. un aparato de espectrometría de masas (3);c. a mass spectrometry apparatus (3);
donde el dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza (1) comprende un recipiente inerte (5) adecuado para depositar la muestra (6), donde el recipiente comprende:wherein the headspace adsorptive magnetic extraction device (1) comprises an inert container (5) suitable for depositing the sample (6), wherein the container comprises:
- una tapa (7);- a cover (7);
- un imán (8) situado en la parte inferior de la tapa, el cual comprende un sorbente magnético (9);- a magnet (8) located in the lower part of the lid, which comprises a magnetic sorbent (9);
- un imán (10) situado en la parte superior de la tapa sobre el recipiente;- a magnet (10) located in the upper part of the lid on the container;
estando el dispositivo de extracción (1) configurado para acoplarse al aparato de cromatografía de gases (GC) (2) y al aparato de espectrometría de masas (3). the extraction device (1) being configured to be coupled to the gas chromatography (GC) apparatus (2) and the mass spectrometry apparatus (3).
El aparato del primer aspecto de la invención también puede ser referido de forma indistinta como sistema del primer aspecto de la invención.The apparatus of the first aspect of the invention may also be referred to interchangeably as the system of the first aspect of the invention.
El aparato del primer aspecto permite extraer, identificar y cuantificar COVs de muestras sólidas y/o semisólidas (6), preferiblemente de heces. Específicamente, el aparato del primer aspecto permite extraer, identificar y cuantificar COVs que son conocidos como biomarcadores en sujetos que sufren de CCR, o en sujetos que están predispuestos a sufrir de CCR, para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto o para proporcionar un pronóstico negativo. Estos biomarcadores pueden ser seleccionados de la lista; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato. Hasta el momento la 3(4H)-dibenzofuranona, no había sido identificado como posible biomarcador relacionado con el CCR o como biomarcador en sujetos que sufren de CCR.The apparatus of the first aspect makes it possible to extract, identify and quantify VOCs from solid and/or semi-solid samples (6), preferably feces. Specifically, the apparatus of the first aspect allows one to extract, identify and quantify VOCs which are known as biomarkers in subjects suffering from CRC, or in subjects who are predisposed to suffering from CRC, to provide a prognosis of the subject's condition or to provide a negative prognosis. These biomarkers can be selected from the list; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate. Until now, 3(4H)-dibenzofuranone had not been identified as a possible CRC-related biomarker or as a biomarker in subjects suffering from CRC.
Por lo tanto, el aparato del primer aspecto permite un análisis de COVs fiable, reproducible, y rápido en muestras sólidas y/o semisólidas (6). También permite un análisis de biomarcadores del CCR reproducible, con buena sensibilidad, rápido y de una manera fiable para el diagnóstico del cáncer colorrectal (CCR) en sujetos que sufran de cáncer, o para la predisposición al mismo, o proporciona un pronóstico negativo de la condición del sujeto. El aparato del primer aspecto puede ser usado en un método de diagnóstico ex vivo de cáncer colorrectal (CCR) de manera rápida, eficaz, selectiva y no invasiva en número muy amplio de sujetos.Therefore, the apparatus of the first aspect allows a reliable, reproducible, and rapid analysis of VOCs in solid and/or semisolid samples (6). It also enables reproducible CRC biomarker analysis, with good sensitivity, fast and in a reliable manner for the diagnosis of colorectal cancer (CRC) in subjects suffering from, or for predisposition to, cancer, or provides a negative prognosis of cancer. subject condition. The apparatus of the first aspect can be used in a rapid, efficient, selective and non-invasive method of ex vivo diagnosis of colorectal cancer (CRC) in a very large number of subjects.
El segundo aspecto de la presente invención está relacionado con el uso del aparato del primer aspecto para extraer, identificar y cuantificar COVs en muestras sólidas y/o semisólida (6), preferiblemente en heces. En una realización preferida, los COVs son biomarcadores relevantes para diagnosticar a un sujeto que sufre de CCR, o que esta predispuesto a sufrir de CCR, o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto o un pronóstico negativo de la condición del sujeto. Los COVs pueden ser seleccionados de la lista; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato.The second aspect of the present invention is related to the use of the apparatus of the first aspect to extract, identify and quantify VOCs in solid and/or semisolid samples (6), preferably in faeces. In a preferred embodiment, VOCs are biomarkers relevant to diagnosing a subject as having CRC, or predisposed to having CRC, or for providing a prognostic of the subject's condition or a negative prognosis of the subject's condition. VOCs can be selected from the list; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate.
El tercer aspecto de la presente invención está relacionado con el uso del aparato del primer aspecto en el diagnóstico y el pronóstico ex vivo de cáncer colorrectal (CCR) en un sujeto.The third aspect of the present invention relates to the use of the apparatus of the first aspect in the ex vivo diagnosis and prognosis of colorectal cancer (CRC) in a subject.
El cuarto aspecto de la presente invención está relacionado con un método ex vivo para diagnosticar a un sujeto que sufre de cáncer colorrectal (también referido como CCR), o que esta predispuesto a sufrir de CCR, o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto, donde el método comprende las etapas:The fourth aspect of the present invention is related to an ex vivo method for diagnosing a subject suffering from colorectal cancer (also referred to as CRC), or who is predisposed to suffer from CRC, or to provide a prognosis of the subject's condition, where the method comprises the stages:
(I) Obtener una muestra corporal sólida y/o semisólida (6) del sujeto;(I) Obtain a solid and/or semi-solid body sample (6) from the subject;
(II) Extraer por lo menos un COV comprendido en la muestra (6) e identificar y cuantificar la concentración de dicho COV con el aparato según el primer aspecto de la invención;(II) Extracting at least one VOC included in the sample (6) and identifying and quantifying the concentration of said VOC with the apparatus according to the first aspect of the invention;
(III) Comparar la concentración de por lo menos un COV con la concentración de una referencia del compuesto característico en un individuo que no sufre de cáncer, donde el incremento o decremento de la concentración del biomarcador en comparación con la referencia, es indicativo que el sujeto está sufriendo de cáncer, o tiene una predisposición al mismo, o proporciona un pronóstico negativo de la condición del sujeto.(III) Compare the concentration of at least one VOC with the concentration of a reference of the characteristic compound in an individual who does not suffer from cancer, where the increase or decrease of the concentration of the biomarker in comparison with the reference, is indicative that the subject is suffering from, or has a predisposition to, cancer, or provides a negative prognosis of the subject's condition.
El método del cuarto aspecto se realiza in vitro y por lo tanto no es invasivo, ya que la muestra del paciente se ha obtenido previamente y en el momento de la ejecución del análisis de las etapas II) y III) no es necesaria la presencia del paciente. La recogida de una muestra sólidas y/o semisólida (6) y/o de muestras de heces puede ser realizada por el mismo paciente que, por ejemplo, pidiendo al médico, recibirá un contenedor, sin complicar el procedimiento utilizado actualmente para las pruebas (TSOH). El dispositivo permite obtener los resultados de la prueba rápidamente.The method of the fourth aspect is carried out in vitro and therefore it is not invasive, since the patient's sample has been obtained previously and at the time of the execution of the analysis of stages II) and III), the presence of the patient. The collection of a solid and/or semisolid sample (6) and/or stool samples can be carried out by the same patient who, for example, by asking the doctor, will receive a container, without complicating the procedure currently used for the tests ( TSOH). The device allows you to get test results quickly.
Se entiende por diagnóstico el procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier estado de salud o enfermedad. Se entiende por pronóstico de la enfermedad a la predicción acerca de la evolución de un enfermo y del resultado final de la enfermedad.Diagnosis is understood as the procedure by which a disease, nosological entity, syndrome, or any state of health or disease is identified. The disease prognosis is understood as the prediction about the evolution of a patient and the final result of the disease.
Por lo tanto, el método del cuarto aspecto permite un análisis de COVs que son biomarcadores del CCR en muestras sólidas y/o semisólidas (6) de una manera fiable, buena sensibilidad, reproducible, rápido y útil para disminuir el número de falsos negativos, para el diagnóstico del cáncer colorrectal (CCR) en un sujeto que sufra de cáncer, o para la predisposición al mismo, o proporciona un pronóstico de la condición del sujeto y/o de los biomarcadores del CCR o un pronóstico negativo de dicha condición. Therefore, the method of the fourth aspect allows an analysis of VOCs that are CRC biomarkers in solid and/or semisolid samples (6) in a reliable, good sensitivity, reproducible, fast and useful way to reduce the number of false negatives. for the diagnosis of colorectal cancer (CRC) in a subject suffering from, or predisposition to, cancer, or provides a prognostic of the subject's condition and/or CRC biomarkers or a negative prognosis of said condition.
El quinto aspecto de la invención esta relacionado con el COV, 3(4H)-dibenzofuranona, y su uso como biomarcador del CCR y/o como biomarcador en el pronóstico y diagnóstico del CCR.The fifth aspect of the invention is related to the VOC, 3(4H)-dibenzofuranone, and its use as a CRC biomarker and/or as a biomarker in the prognosis and diagnosis of CRC.
El sexto aspecto de la invención está relacionado con el uso de 3(4H)-dibenzofuranona, en un método ex vivo para diagnosticar a un sujeto que sufre de CCR, o que esta predispuesto a sufrir de CCR o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujetoThe sixth aspect of the invention is related to the use of 3(4H)-dibenzofuranone, in an ex vivo method to diagnose a subject suffering from CRC, or who is predisposed to suffering from CRC or to provide a prognosis of the condition. of the subject
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figura 1.- Es una vista esquemática del aparato y del dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza (1) del primer aspecto de la presente invención.Figure 1.- Is a schematic view of the headspace adsorptive magnetic extraction device and apparatus (1) of the first aspect of the present invention.
Figura 2.-. Es un cromatograma de una muestra de heces de un sujeto sano frente a un sujeto enfermo o que sufre de CCR.Figure 2.-. It is a chromatogram of a stool sample from a healthy subject versus a subject who is sick or suffering from CRC.
Figura 3.- Es un cromatograma de una muestra de heces de un sujeto sano frente a un sujeto enfermo o que sufre de CCR.Figure 3.- It is a chromatogram of a stool sample from a healthy subject versus a sick subject or one suffering from CRC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
El primer aspecto de la presente invención está relacionado con un aparato adaptado para el análisis cualitativo y cuantitativo de COVs en muestras sólidas y/o semisólidas (6), dicho aparato comprende los siguientes elementos:The first aspect of the present invention is related to an apparatus adapted for the qualitative and quantitative analysis of VOCs in solid and/or semisolid samples (6), said apparatus comprises the following elements:
a. un dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza (1); b. un aparato de cromatografía de gases (2);a. an adsorptive magnetic headspace extraction device (1); b. a gas chromatography apparatus (2);
c. un aparato de espectrometría de masas (3);c. a mass spectrometry apparatus (3);
donde el dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza (1) comprende un recipiente inerte (5) adecuado para depositar la muestra (6), donde el recipiente comprende:wherein the headspace adsorptive magnetic extraction device (1) comprises an inert container (5) suitable for depositing the sample (6), wherein the container comprises:
- una tapa (7);- a cover (7);
- un imán (8) situado en la parte inferior de la tapa, el cual comprende un sorbente magnético (9);- a magnet (8) located in the lower part of the lid, which comprises a magnetic sorbent (9);
- un imán (10) situado en la parte superior de la tapa sobre el recipiente; estando el dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza (1) configurado para acoplarse al aparato de cromatografía de gases (GC).- a magnet (10) located in the upper part of the lid on the container; the adsorptive magnetic headspace extraction device (1) being configured to be coupled to the gas chromatography (GC) apparatus.
El dispositivo de extracción magnética adsortiva de espacio de cabeza, permite la volatilización de los COVs de una muestra, sometida a una temperatura determinada. Los compuestos volátiles en el espacio de cabeza son retenidos posteriormente en una trampa adsorbente, que a continuación se somete a desorción y se inyecta para su separación por cromatografía de gases.The headspace adsorptive magnetic extraction device allows the volatilization of VOCs from a sample, subjected to a determined temperature. Volatiles in the headspace are subsequently retained in an adsorbent trap, which is then desorbed and injected for gas chromatographic separation.
El aparato del primer aspecto permite extraer, identificar y cuantificar COVs de muestras sólidas y/o semisólidas (6), muestras complejas, y COVs que son conocidos como biomarcadores en sujetos que sufren de CCR, o en sujetos que están predispuesto a sufrir de CCR, o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto. Los COVs pueden ser seleccionados de la lista; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato. Por lo tanto, aparato del primer aspecto permite extraer, identificar y cuantificar biomarcadores que se usaran en un método para cribar sujetos sanos de sujetos que sufran CCR.The apparatus of the first aspect allows to extract, identify and quantify VOCs from solid and/or semi-solid samples (6), complex samples, and VOCs that are known as biomarkers in subjects suffering from CRC, or in subjects who are predisposed to suffering from CRC. , or to provide a prognosis of the subject's condition. VOCs can be selected from the list; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate. Therefore, the apparatus of the first aspect allows extracting, identifying and quantifying biomarkers to be used in a method for screening healthy subjects from subjects suffering from CRC.
En una realización particular del primer aspecto el aparato de cromatografía de gases (2) es un aparato de desorción térmica de cromatografía de gases acoplado a un espectrómetro de masas (3). El aparato de cromatografía de gases (2) proporciona análisis cualitativo de los COVs, relacionando la posición de los picos y su tiempo de retención con la identificación del COVs y el análisis cuantitativo evaluando y calculando el área de cada pico. El aparato de espectrómetro de masas (3) proporciona análisis cualitativo y cuantitativo de los COVs en función de la relación masa/carga/de los COVs. En una realización preferida del aparato del primer aspecto los COVs son biomarcadores resultantes del metabolismo de un microorganismo asociado al CCR. Más preferiblemente, los COVs pueden ser seleccionados de la lista; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato. En una realización preferida del aparato del primer aspecto, la muestra sólida y/o semisólida (6) son heces.In a particular embodiment of the first aspect, the gas chromatography apparatus (2) is a gas chromatography thermal desorption apparatus coupled to a mass spectrometer (3). The gas chromatography apparatus (2) provides qualitative analysis of the VOCs, relating the position of the peaks and their retention time with the identification of the VOCs and the quantitative analysis evaluating and calculating the area of each peak. The mass spectrometer apparatus (3) provides qualitative and quantitative analysis of VOCs as a function of the mass/charge/VOC ratio. In a preferred embodiment of the apparatus of the first aspect, the VOCs are biomarkers resulting from the metabolism of a microorganism associated with CRC. More preferably, the VOCs can be selected from the list; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate. In a preferred embodiment of the apparatus of the first aspect, the solid and/or semi-solid sample (6) are faeces.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el aparato comprende un medio (4), que puede ser un aparato, configurado para proporcionar una temperatura determinada y agitación magnética a la muestra sólida y/o semisólida (6). El medio (4) puede ser un aparato que proporcione agitación magnética en un rango desde 200 RPM hasta 2000 RPM y que proporcione temperatura desde un rango de 25 °C hasta 200 °C. En una realización preferida, el aparato del primer aspecto comprende un medio (4) configurado para proporcionar una temperatura en un rango entre 40 °C hasta 80 °C y agitación magnética, a la muestra sólidas y/o semisólidas (6). De manera más preferida, el medio (4) está configurado para proporcionar una temperatura en un rango entre 50 °C hasta 70 °C. Esta configuración proporciona una mejora en la extracción de los COVs en la muestra sólida y/o semisólida o de la muestra de heces.In a preferred embodiment of the first aspect of the invention, the apparatus comprises a means (4), which can be an apparatus, configured to provide a determined temperature and magnetic agitation to the solid and/or semisolid sample (6). The means (4) can be an apparatus that provides magnetic stirring in a range from 200 RPM to 2000 RPM and that provides temperature from a range of 25 °C to 200 °C. In A preferred embodiment, the apparatus of the first aspect comprises a means (4) configured to provide a temperature in a range between 40 °C to 80 °C and magnetic stirring, to the solid and/or semi-solid samples (6). More preferably, the means (4) is configured to provide a temperature in a range between 50 °C to 70 °C. This configuration provides an improvement in the extraction of VOCs in the solid and/or semi-solid sample or from the stool sample.
El recipiente (5) se puede cerrar con la tapa (7) una vez introducida la muestra. La tapa (7) facilita un cierre seguro y mejora la extracción, disminuyendo la pedida de volátiles.The container (5) can be closed with the lid (7) once the sample has been inserted. The lid (7) facilitates a secure closure and improves extraction, reducing the amount of volatiles.
En una realización preferida, el aparato del primer aspecto comprende los imanes (8) y (11), donde dichos imanes tienen las mismas dimensiones. Preferiblemente, los imanes (8) y (11) son de neodimio. Los imanes de neodimio comprenden una aleación de neodimio, hierro y boro. Preferiblemente, los imanes (8) y (11) son circulares lo que proporciona una mejora de la extracción en fase solida de los COVs de la muestra sólida y/o semisólida o de la muestra de heces.In a preferred embodiment, the apparatus of the first aspect comprises magnets (8) and (11), where said magnets have the same dimensions. Preferably, the magnets (8) and (11) are neodymium. Neodymium magnets comprise an alloy of neodymium, iron, and boron. Preferably, the magnets (8) and (11) are circular, which provides an improvement in the solid phase extraction of VOCs from the solid and/or semi-solid sample or from the stool sample.
El sorbente (9) es un material adaptado para adsorber los COVs emitidos o evaporados de la muestra sólida y/o semisólida (6) y donde quedan retenidos, preferiblemente la muestra sólida y/o semisólida (6) es una muestra de heces. El sorbente (9) esta soportado en el imán (8). En una realización preferida, el sorbente (9) comprende un material que contiene óxido de grafeno y de óxido de hierro (Fe 3 O 4 ), preferiblemente un nanomaterial magnético que comprende nanopartículas de óxido de grafeno y de óxido de hierro (Fe 3 O 4 ). El óxido de grafeno tiene propiedades magnéticas por la presencia del óxido de hierro. Se entiende por nanomaterial como materiales con propiedades morfológicas más pequeñas que 1 pm en al menos una dimensión, más preferiblemente nanomaterial como materiales con propiedades morfológicas entre 0,2 nm y 100 nm. El uso del sorbente (9) aporta también la ventaja de que se puede usar con muestras sólidas y/o semisólidas (6) e incluso con muestras que contengan COVs con alto peso molecular y con mezclas de estos con los de bajo peso molecular, así como con muestras complejas, consiguiendo una muy buena y eficaz extracción y separación de los COVs en estas muestras.The sorbent (9) is a material adapted to adsorb the VOCs emitted or evaporated from the solid and/or semisolid sample (6) and where they are retained, preferably the solid and/or semisolid sample (6) is a feces sample. The sorbent (9) is supported on the magnet (8). In a preferred embodiment, the sorbent (9) comprises a material that contains graphene oxide and iron oxide (Fe 3 O 4 ), preferably a magnetic nanomaterial that comprises graphene oxide and iron oxide (Fe 3 O ) nanoparticles. 4 ). Graphene oxide has magnetic properties due to the presence of iron oxide. Nanomaterial is understood as materials with morphological properties smaller than 1 pm in at least one dimension, more preferably nanomaterial as materials with morphological properties between 0.2 nm and 100 nm. The use of the sorbent (9) also provides the advantage that it can be used with solid and/or semi-solid samples (6) and even with samples containing high molecular weight VOCs and with mixtures of these and low molecular weight ones, as well as with complex samples, achieving a very good and efficient extraction and separation of VOCs in these samples.
Sorprendentemente, el sorbente (9) proporciona una buena eficacia en la separación de los COVs y/o biomarcadores a pesar de que este no se disperse en la muestra sólida y/o semisólida, tal como ocurre si se usan muestras liquidas. Surprisingly, the sorbent (9) provides good efficiency in the separation of VOCs and/or biomarkers despite the fact that it does not disperse in the solid and/or semi-solid sample, as occurs when liquid samples are used.
En una realización preferida el aparato del primer aspecto comprende un recipiente inerte (5) que puede tener un volumen de entre 1 ml hasta 15 ml, más preferiblemente, el volumen del recipiente inerte (5) es entre 2 ml hasta 10 ml ya que proporciona una mejora y una muy buena extracción de los COVs, particularmente cuando estos están contenidos en muestras sólidas, y/o semisólidas y/o de heces. El recipiente inerte (5), con un volumen superior a 20 ml proporciona una peor extracción de los COVs en muestras sólidas y peor sensibilidad y fiabilidad en la detección y cuantificación COVs y/o biomarcadores del CCR.In a preferred embodiment, the apparatus of the first aspect comprises an inert container (5) that can have a volume of between 1 ml and 15 ml, more preferably, the volume of the inert container (5) is between 2 ml and 10 ml, since it provides an improvement and a very good extraction of VOCs, particularly when these are contained in solid, and/or semi-solid and/or feces samples. The inert container (5), with a volume greater than 20 ml, provides poorer extraction of VOCs in solid samples and poorer sensitivity and reliability in the detection and quantification of VOCs and/or CRC biomarkers.
En una realización preferida del aparato del primer aspecto, el recipiente (5) tiene forma circular o esencialmente circular y un diámetro de entre 0.5 a 3 cm, más preferiblemente el diámetro del recipiente (5) está entre 0.5 a 2 cm. De este modo se mejora la extracción de los COVs de la muestra sólida y/o semisólida o de la muestra de heces.In a preferred embodiment of the apparatus of the first aspect, the container (5) has a circular or essentially circular shape and a diameter of between 0.5 to 3 cm, more preferably the diameter of the container (5) is between 0.5 to 2 cm. In this way, the extraction of VOCs from the solid and/or semi-solid sample or from the stool sample is improved.
En una realización más preferida del aparato del primer aspecto, el recipiente (5) tiene forma circular o esencialmente circular, un diámetro de entre 0.5 a 3 cm y un volumen de entre 1 y 10 ml. Más preferiblemente, recipiente (5) tiene forma circular o esencialmente circular, un diámetro de entre 0.5 a 2 cm y un volumen de entre 1 y 10 ml. Esto lleva a una mejora en la extracción de COVs en muestras sólidas y/o semisólidas o en muestras de heces y a la obtención de una buena sensibilidad en la detección y cuantificación de los COVs en muestras solidas/semisólidas y/o en muestras de heces en el aparato del primer aspecto de la invención.In a more preferred embodiment of the apparatus of the first aspect, the container (5) has a circular or essentially circular shape, a diameter of between 0.5 to 3 cm and a volume of between 1 and 10 ml. More preferably, container (5) has a circular or essentially circular shape, a diameter between 0.5 and 2 cm and a volume between 1 and 10 ml. This leads to an improvement in the extraction of VOCs in solid and/or semisolid samples or in stool samples and to obtaining a good sensitivity in the detection and quantification of VOCs in solid/semisolid samples and/or in stool samples in the apparatus of the first aspect of the invention.
De forma general, el aparato del primer aspecto, el recipiente (5) puede ser de vidrio o de plástico. Preferiblemente el recipiente es de un solo uso, lo que ayuda a disminuir o eliminar contaminación cruzada y facilita la recogida de muestras.In general, the apparatus of the first aspect, the container (5) can be made of glass or plastic. Preferably the container is single-use, which helps reduce or eliminate cross-contamination and facilitates sample collection.
La figura 1 representa el dispositivo del primer aspecto de la invención.Figure 1 represents the device of the first aspect of the invention.
El aparato del primer aspecto de la invención proporciona muy buenos resultados usando cantidades bajas de sorbente (9), permitiendo a la vez obtener buenos resultados cuando se usan diferentes cantidades de muestra. El sorbente (9) puede estar presente en una cantidad de hasta 15 mg. En una realización preferida el sorbente (9) está presente en un rango entre 1 mg hasta 8 mg, más preferiblemente entre 2 mg hasta 6 mg, proporcionando una buena eficiencia en la extracción de COVs de la muestra, así como una buena sensibilidad y fiabilidad en la identificación y cuantificación de los COVs. El sorbente (9) puede ser reutilizado después de una etapa tras una adecuada limpieza lo que mejora su rentabilidad económica y su uso a nivel comercial, haciendo así un uso respetuoso con el medioambiente.The apparatus of the first aspect of the invention provides very good results using low amounts of sorbent (9), while allowing good results to be obtained when using different amounts of sample. The sorbent (9) may be present in an amount of up to 15 mg. In a preferred embodiment, the sorbent (9) is present in a range between 1 mg to 8 mg, more preferably between 2 mg to 6 mg, providing good efficiency in the extraction of VOCs from the sample, as well as good sensitivity and reliability. in the identification and quantification of VOCs. Sorbent (9) It can be reused after a stage after adequate cleaning, which improves its economic profitability and its use at a commercial level, thus making use respectful of the environment.
En una realización más preferida, el sorbente (9), es nanomaterial que comprende óxido de grafeno y óxido de hierro soportado sobre el imán (8) y más preferiblemente el imán (8) es de neodimio. El sorbente (9), los imanes (8) y (11) y la colocación del sorbente (9) referente al imán (8) facilita el manejo de los COVs, permitiendo una separación rápida y evitando etapas adicionales.In a more preferred embodiment, the sorbent (9) is a nanomaterial comprising graphene oxide and iron oxide supported on the magnet (8) and more preferably the magnet (8) is neodymium. The sorbent (9), the magnets (8) and (11) and the placement of the sorbent (9) relative to the magnet (8) facilitates the handling of VOCs, allowing rapid separation and avoiding additional steps.
Una vez los COVs han sido extraídos y adsorbidos en el sorbente (9) situado sobre el imán (8) este se desmonta y se coloca en un tubo (12) que se cierra por cada extremo con lana de vidrio (11). El tubo (12) se incorpora al aparato de cromatografía de gases, preferiblemente el aparato de cromatografía de gases es un aparato de cromatografía de gases por desorción térmica. Los elementos 11 y 12, son elementos que forman parte del aparato de cromatografía de gases.Once the VOCs have been extracted and adsorbed on the sorbent (9) located on the magnet (8), it is disassembled and placed in a tube (12) that is closed at each end with glass wool (11). The tube (12) is incorporated into the gas chromatography apparatus, preferably the gas chromatography apparatus is a thermal desorption gas chromatography apparatus. Elements 11 and 12 are elements that are part of the gas chromatography apparatus.
Los COVs pueden ser biomarcadores relevantes para diagnosticar a un sujeto que sufre de CCR, o que está predispuesto a sufrir de CCR, o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto Los COVs pueden ser seleccionados de la lista; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato.The VOCs may be relevant biomarkers for diagnosing a subject suffering from CRC, or predisposed to CRC, or for providing a prognosis of the subject's condition. The VOCs may be selected from the list; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate.
El segundo aspecto de la presente invención está relacionado con el uso del aparato del primer aspecto para extraer, identificar y cuantificar COVs en muestras sólidas y/o semisólida (6), preferiblemente en heces. En una realización preferida, los COVs son biomarcadores relevantes para diagnosticar a un sujeto que sufre de CCR, o que esta predispuesto a sufrir de CCR, o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto Los COVs pueden ser seleccionados de la lista; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato.The second aspect of the present invention is related to the use of the apparatus of the first aspect to extract, identify and quantify VOCs in solid and/or semisolid samples (6), preferably in faeces. In a preferred embodiment, the VOCs are relevant biomarkers for diagnosing a subject suffering from CRC, or predisposed to CRC, or for providing a prognosis of the subject's condition. The VOCs may be selected from the list; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate.
El tercer aspecto de la presente invención está relacionado con el uso del aparato del primer aspecto en el diagnóstico o pronostico ex vivo de cáncer colorrectal (CCR) en un sujeto. Preferiblemente, el uso del aparato del primer aspecto en el diagnóstico ex vivo de cáncer colorrectal (CCR) se realiza en muestras sólidas y/o semisólidas (6); más preferiblemente en muestras de heces. The third aspect of the present invention relates to the use of the apparatus of the first aspect in the ex vivo diagnosis or prognosis of colorectal cancer (CRC) in a subject. Preferably, the use of the apparatus of the first aspect in the ex vivo diagnosis of colorectal cancer (CRC) is carried out in solid and/or semi-solid samples (6); more preferably in stool samples.
El cuarto aspecto de la presente invención está relacionado con un método para diagnosticar ex vivo a un sujeto que sufre de CCR, o que esta predispuesto a sufrir de CCR, o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto, donde el método comprende las etapas:The fourth aspect of the present invention is related to a method for diagnosing ex vivo a subject suffering from CRC, or who is predisposed to suffering from CRC, or to provide a prognosis of the subject's condition, wherein the method comprises the steps :
(I) Obtener una muestra corporal sólida y/o semisólida (6) del sujeto;(I) Obtain a solid and/or semi-solid body sample (6) from the subject;
(II) Extraer por lo menos un COV comprendido en la muestra (6) e identificar y cuantificar la concentración de dicho COV con el aparato según el primer aspecto de la invención;(II) Extracting at least one VOC included in the sample (6) and identifying and quantifying the concentration of said VOC with the apparatus according to the first aspect of the invention;
(III) Comparar la concentración de por lo menos un COV con la concentración de una referencia del compuesto característico en un individuo que no sufre de cáncer, donde el incremento o decremento de la concentración del biomarcador en comparación con la referencia, es indicativo de que el sujeto está sufriendo de cáncer, o tiene una predisposición al mismo, o proporciona un pronóstico de la condición del sujeto o proporciona un pronóstico negativo de la condición del sujeto;(III) Compare the concentration of at least one VOC with the concentration of a reference of the characteristic compound in an individual who does not suffer from cancer, where the increase or decrease in the concentration of the biomarker compared to the reference is indicative that the subject is suffering from, or has a predisposition to, cancer, or provides a prognosis of the subject's condition, or provides a negative prognosis of the subject's condition;
donde el COV es un biomarcador resultante del metabolismo de un microorganismo asociado al CCR;where the VOC is a biomarker resulting from the metabolism of a CRC-associated microorganism;
donde la muestra corporal sólida y/o semisólida (6) es una muestra de heces.where the solid and/or semi-solid body sample (6) is a stool sample.
En una realización preferida del cuarto aspecto el COV es un biomarcador resultante del metabolismo de un microorganismo asociado al CCR que se selecciona de la lista que consiste en; P-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona o tetrahidrofolato. Por ejemplo, cuando el biomarcador es, 1H-indol, la concentración del biomarcador sufre un decremento en comparación con la referencia. Cuando el biomarcador es p-cresol, 3(4H)-dibenzofuranona, o tetrahidrofolato la concentración del biomarcador sufre un incremento en comparación con la referencia. Los investigadores han identificado por primera vez, la presencia de la 3(4H)-dibenzofuranona en heces como posible biomarcador para el pronóstico y diagnóstico del CCR.In a preferred embodiment of the fourth aspect, the VOC is a biomarker resulting from the metabolism of a CRC-associated microorganism that is selected from the list consisting of; P-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone or tetrahydrofolate. For example, when the biomarker is 1H-indole, the concentration of the biomarker is decreased compared to the reference. When the biomarker is p-cresol, 3(4H)-dibenzofuranone, or tetrahydrofolate the concentration of the biomarker is increased compared to the reference. Researchers have identified, for the first time, the presence of 3(4H)-dibenzofuranone in feces as a possible biomarker for the prognosis and diagnosis of CRC.
Por lo tanto, el quinto aspecto de la invención está relacionado con el uso del COV, 3(4H)-dibenzofuranona, como biomarcador del CCR y/o como biomarcador en el pronóstico y diagnóstico del CCR. Therefore, the fifth aspect of the invention is related to the use of the VOC, 3(4H)-dibenzofuranone, as a CRC biomarker and/or as a biomarker in the prognosis and diagnosis of CRC.
El sexto aspecto de la invención está relacionado con el uso de 3(4H)-dibenzofuranona, en un método ex vivo para diagnosticar a un sujeto que sufre de CCR, o que esta predispuesto a sufrir de CCR o para proporcionar un pronóstico de la condición del sujeto.The sixth aspect of the invention is related to the use of 3(4H)-dibenzofuranone, in an ex vivo method to diagnose a subject suffering from CRC, or who is predisposed to suffering from CRC or to provide a prognosis of the condition. of the subject.
En otra realización preferida del método del cuarto aspecto, se caracteriza por que los COVs son identificados en la etapa II por su tiempo de retención. Mas preferiblemente, cuando el COV es P-cresol el tiempo de retención es 7,92 min (± 0,076). Preferiblemente, cuando el COV es 1H-indol el tiempo de retención es 9,84min (± 0,062). Preferiblemente, cuando el COV es 3(4H)-dibenzofuranona el tiempo de retención es 13,77 min (± 0,13).In another preferred embodiment of the method of the fourth aspect, it is characterized in that the VOCs are identified in stage II by their retention time. More preferably, when the VOC is P-cresol the retention time is 7.92 min (±0.076). Preferably, when the VOC is 1H-indole the retention time is 9.84min (±0.062). Preferably, when the VOC is 3(4H)-dibenzofuranone the retention time is 13.77 min (±0.13).
Un cromatograma típico de una muestra ex vivo de un sujeto puede contener los 4 compuestos biomarcadores investigados, tanto en pacientes con CCR como en pacientes sanos de control. Un ejemplo de un cromatograma típico corresponde por ejemplo a los que se muestran en las figuras 2 y 3. El incremento de la concentración de estos 3 biomarcadores, 3(4H)-dibenzofuranona, p-cresol o tetrahidrofolato, en una muestra de un sujeto a valorar comparada con la muestra de un sujeto sano nos indica la presencia o el comienzo de la enfermedad o la probabilidad de que la padezca o proporciona un pronóstico negativo de la condición del sujeto. El decremento de la concentración del biomarcador 1H-indol en una muestra de un sujeto a valorar comparada con la muestra de un sujeto sano nos indica la presencia o el comienzo de la enfermedad o la probabilidad de que la padezca o proporciona un pronóstico negativo de la condición del sujeto.A typical chromatogram of an ex vivo sample from a subject may contain all 4 biomarker compounds investigated, both in CRC patients and in healthy control patients. An example of a typical chromatogram corresponds, for example, to those shown in figures 2 and 3. The increase in the concentration of these 3 biomarkers, 3(4H)-dibenzofuranone, p-cresol or tetrahydrofolate, in a sample from a subject to assess compared to the sample of a healthy subject indicates the presence or onset of the disease or the probability of suffering from it or provides a negative prognosis of the subject's condition. The decrease in the concentration of the 1H-indole biomarker in a sample of a subject to be assessed compared with the sample of a healthy subject indicates the presence or onset of the disease or the probability of suffering from it or provides a negative prognosis of the disease. subject condition.
Los detalles, las formas, las dimensiones y demás elementos accesorios, así como los materiales empleados en la fabricación del aparato del primer aspecto de la invención, podrán ser convenientemente sustituidos por otros que sean técnicamente equivalentes y no se aparten de la esencialidad de la invención ni del ámbito definido por las reivindicaciones que se incluyen a continuación.The details, shapes, dimensions and other accessory elements, as well as the materials used in the manufacture of the apparatus of the first aspect of the invention, may be conveniently replaced by others that are technically equivalent and do not deviate from the essential nature of the invention. nor within the scope defined by the claims that follow.
Ejemplo 1: Extracción y separación y análisis cuantitativo de COVs en muestras de heces.Example 1: Extraction and separation and quantitative analysis of VOCs in stool samples.
En un vial (recipiente inerte (5)), de 2 mL, se añaden 400-500 mg de heces (6) y se cierra el sistema para evitar la pérdida de COVs. Previamente, se prepara el imán (8) con 4.3 mg de un nanomaterial magnético de óxido de grafeno y óxido de hierro (sorbente (9)) (también referido como GO/Fe 3 O 4 o nano absorbente) el cual comprende nanopartículas de óxido de grafeno y óxido de hierro. El imán (8) es un imán de neodimio. El sorbente (9), GO/Fe 3 O 4 , se puede preparar tal como se describe en L. Vidal et al. Analytica Chimica Acta 971 (2017) 40 47. También se puede preparar mediante la simple interacción electrostática de las nanopartículas magnéticas de Fe 3 O 4 (con carga superficial positiva) con el material carbonoso (oxido de grafeno o GO), el cual posee una carga superficial negativa consecuencia de la ionización de grupos carboxílicos y fenólicos. La modificación del óxido de grafeno (GO) con nanomateriales de Fe 3 O 4 permite obtener sorbentes en los que se combinan sinérgicamente las excelentes propiedades extractantes del material carbonoso con las ventajas que proporciona el magnetismo para su manipulación. El nanosorbente (9) usado presenta una muy buena capacidad adsortiva.In a vial (inert container (5)), of 2 mL, 400-500 mg of feces (6) are added and the system is closed to avoid the loss of VOCs. Previously, the magnet (8) is prepared with 4.3 mg of a magnetic nanomaterial of graphene oxide and iron oxide (sorbent (9)) (also referred to as GO/Fe 3 O 4 or nanoabsorber) which comprises oxide nanoparticles. graphene and iron oxide. The magnet (8) is a neodymium magnet. The sorbent (9), GO/Fe 3 O 4 , is can be prepared as described in L. Vidal et al. Analytica Chimica Acta 971 (2017) 40 47. It can also be prepared by the simple electrostatic interaction of magnetic Fe 3 O 4 nanoparticles (with a positive surface charge) with the carbonaceous material (graphene oxide or GO), which has a negative surface charge consequence of the ionization of carboxylic and phenolic groups. The modification of graphene oxide (GO) with Fe 3 O 4 nanomaterials makes it possible to obtain sorbents in which the excellent extracting properties of carbonaceous material are synergistically combined with the advantages provided by magnetism for handling. The nanosorbent (9) used has a very good adsorptive capacity.
El vial con la muestra se calienta durante 30 minutos a 60°C. En estas condiciones la muestra se descongela y pasa a estar en estado líquido. A continuación, la muestra se agita a 1500 rpm durante 20 minutos en los cuales el sorbente (9) GO/Fe 3 O 4 adsorbe los COVs emitidos a la parte superior del vial donde se sitúa el imán de neodimio (8) y el sorbente (9). Las condiciones de extracción se controlan estrictamente para asegurar la reproducibilidad del análisis. Finalizada la extracción, el imán de neodimio (8) con el sorbente (9) se coloca en un tubo comercial de vidrio (12) el cual es colocado a continuación en el horno de desorción térmica acoplado a un aparato de cromatografía de gases (2) (también referido como (GC)) que está acoplado a continuación a un aparato de espectrometría de masas (3) (también referido como (MS)).The vial with the sample is heated for 30 minutes at 60°C. Under these conditions, the sample thaws and becomes liquid. Next, the sample is shaken at 1500 rpm for 20 minutes in which the GO/Fe 3 O 4 sorbent (9) adsorbs the VOCs emitted to the upper part of the vial where the neodymium magnet (8) and the sorbent are located. (9). Extraction conditions are strictly controlled to ensure reproducibility of the analysis. Once the extraction is complete, the neodymium magnet (8) with the sorbent (9) is placed in a commercial glass tube (12) which is then placed in the thermal desorption oven coupled to a gas chromatography apparatus (2 ) (also referred to as (GC)) which is then coupled to a mass spectrometry apparatus (3) (also referred to as (MS)).
En los aparatos de GC y MS es donde se realiza la desorción, separación y detección de los COVs. Los resultados obtenidos se analizaron con el programa "MSD ChemStation" de Agilent technologies. Dicho programa proporciona los tiempos de retención de los COVs a analizar. El tiempo de retención es medido en el máximo del pico. Los COVs de interés presentan los siguientes tiempos de retención: P-cresol 7,92 min (± 0,076), 1H-indol: 9,84min (± 0,062), y 3(4H)-dibenzofuranona 13,77 min (± 0,13).The desorption, separation, and detection of VOCs are performed in the GC and MS apparatus. The results obtained were analyzed with the "MSD ChemStation" program from Agilent technologies. Said program provides the retention times of the VOCs to be analyzed. The retention time is measured at the maximum of the peak. The VOCs of interest have the following retention times: P-cresol 7.92 min (± 0.076), 1H-indole: 9.84 min (± 0.062), and 3(4H)-dibenzofuranone 13.77 min (± 0. 13).
Método de diagnóstico de CCRCRC diagnostic method
Cromatogramas típicos de una muestra que contiene los compuestos investigados en un paciente con CCR y en un control sano corresponde por ejemplo a los que se muestran en las fig 2 y 3. El incremento de la concentración de estos biomarcadores (medidos usando el área del pico) en una muestra de un sujeto a valorar comparada con la muestra de un sujeto sano nos indica la presencia o el comienzo de la enfermedad o la probabilidad de que la padezca o proporciona un pronóstico negativo de la condición del sujeto. Typical chromatograms of a sample containing the investigated compounds in a CRC patient and in a healthy control correspond, for example, to those shown in Figs 2 and 3. The increase in the concentration of these biomarkers (measured using the peak area ) in a sample of a subject to be assessed compared to a sample of a healthy subject indicates the presence or onset of the disease or the probability of suffering from it or provides a negative prognosis of the subject's condition.
El análisis cromatográfico se lleva a cabo con un cromatógrafo de gases (modelo 7890) de la casa comercial Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) equipado con un inyector automático. Se utiliza una columna capilar HP-5 (5% fenil-95% dimetilpolisiloxano, 30 m * 0,32 mm I.D., 0,25 ^-m de grosor) de Scientific (Folsom, CA, USA). La temperatura del inyector se mantiene a 200°C y el volumen de inyección es de 1 ^L. La temperatura del horno (6890N de Agilent) inicialmente es de 40°C que incrementa su temperatura con un gradiente de 6°C por minuto hasta llegar a 100°C. El cromatógrafo de gases tiene acoplado un espectrómetro de masas (modelo 5973N) también de Agilent Technologies. La ionización se realiza mediante impacto de electrones con una energía ionizante de 70 eV.The chromatographic analysis is carried out with a gas chromatograph (model 7890) from Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) equipped with an automatic injector. An HP-5 capillary column (5% phenyl-95% dimethylpolysiloxane, 30 m * 0.32 mm I.D., 0.25 ^-m thick) from Scientific (Folsom, CA, USA) is used. The injector temperature is maintained at 200°C and the injection volume is 1 ^L. The oven temperature (Agilent 6890N) is initially 40°C, which increases its temperature with a gradient of 6°C per minute until it reaches 100°C. The gas chromatograph is attached to a mass spectrometer (model 5973N) also from Agilent Technologies. The ionization is carried out by means of the impact of electrons with an ionizing energy of 70 eV.
Las áreas de los picos obtenidos en los cromatogramas se analizaron utilizando la librería espectral de masas WILEY.275L, la cual identifica el COV correspondiente a cada pico y proporciona un valor de abundancia. El valor de la abundancia se obtiene mediante el cálculo del área debajo de la curva que representa cada pico (cada compuesto) al cual se le asocia un valor de abundancia en el sujeto.The areas of the peaks obtained in the chromatograms were analyzed using the WILEY.275L mass spectral library, which identifies the VOC corresponding to each peak and provides an abundance value. The abundance value is obtained by calculating the area under the curve that represents each peak (each compound) to which an abundance value is associated in the subject.
La abundancia de los biomarcadores como, p-cresol, 1H-indol, 3(4H)-dibenzofuranona y tetrahidrofolato, se comparó en pacientes con CCR frente a los pacientes sanos sin neoplasia (control). En el caso de, p-cresol, 3(4H)-dibenzofuranona y tetrahidrofolato la abundancia se encuentra aumentada en caso de sujetos con CCR frente al control. Por el contrario, en el caso del 1H-indol la abundancia se encuentra disminuida en sujetos con CCR frente al control.The abundance of biomarkers such as p-cresol, 1H-indole, 3(4H)-dibenzofuranone, and tetrahydrofolate, was compared in patients with CRC versus healthy patients without neoplasia (control). In the case of p-cresol, 3(4H)-dibenzofuranone and tetrahydrofolate, the abundance is increased in the case of subjects with CRC compared to the control. On the contrary, in the case of 1H-indole, the abundance is decreased in subjects with CRC compared to the control.
El análisis de datos se realizó mediante el paquete estadístico Statistical Package for the Social Sciences for Windows, SPSS versión 19.0 (SPSS® Statistical software, an IBM Company, Chicago, IL, USA). Las abundancias de cada compuesto se obtuvieron mediante la librería WILEY.275L la cual proporciona una correspondencia entre COVs y los picos obtenidos en el cromatograma. Las abundancias de los COVs detectadas en el grupo de CCR y controles se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney y el análisis de características del operador del receptor (ROC) se utilizó para estudiar su potencial como biomarcadores de enfermedad.Data analysis was performed using the statistical package Statistical Package for the Social Sciences for Windows, SPSS version 19.0 ( SPSS® Statistical software, an IBM Company, Chicago, IL, USA). The abundances of each compound were obtained using the WILEY.275L library, which provides a correspondence between VOCs and the peaks obtained in the chromatogram. The abundances of the VOCs detected in the CRC group and controls were compared by Mann-Whitney U test and receiver operator characteristic (ROC) analysis was used to study their potential as disease biomarkers.
En el caso del p-cresol, la mediana de la abundancia (P25-P75) en el grupo de pacientes con CCR fue de 13 x 108 (90.4 x 107- 26.5 x 108) y en los pacientes control de 35.7 x 107 (15.3 x 107- 70.9 x107); proporcionando una diferencia significativa, P= < 0.001. In the case of p-cresol, the median abundance (P25-P75) in the group of patients with CRC was 13 x 108 (90.4 x 107-26.5 x 108) and in control patients 35.7 x 107 (15.3 x 107- 70.9 x107); providing a significant difference, P= < 0.001.
En el caso del biomarcador, 3(4H)-dibenzofuranona ( 3(4H)-DBZ) , la mediana (P25-P75) de la abundancia en el grupo de CCR fue de 37.5 x 106 (17 x 106- 66.4 x 106) y en controles 12.4 x 106 (78.1 x 105- 23.2 x 106); proporcionando diferencias significativas, P= < 0.001.In the case of the biomarker, 3(4H)-dibenzofuranone ( 3 ( 4H)-DBZ) , the median (P25-P75) abundance in the CRC group was 37.5 x 106 (17 x 106-66.4 x 106). and in controls 12.4 x 106 (78.1 x 105- 23.2 x 106); providing significant differences, P= < 0.001.
El método presento muy buena especificidad y sensibilidad tal como se ve en la tabla 1. En el caso del p-cresol, presenta un área bajo la curva ROC (AUC) para predecir CCR de 0.81 (IC 95; 0.675-0.938) con una sensibilidad óptima del 83% y especificidad óptima del 80%, P< 0.001. EL metabolito 3(4H)-DBZ presenta un AUC para predecir CCR de 0.80 (IC 95; 0.675-0.930) con una sensibilidad del 83% y una especificidad del 74%, P< 0.001.The method presented very good specificity and sensitivity as seen in table 1. In the case of p-cresol, it presents an area under the ROC curve (AUC) to predict CCR of 0.81 (CI 95; 0.675-0.938) with a optimal sensitivity of 83% and optimal specificity of 80%, P<0.001. The metabolite 3(4H)-DBZ presents an AUC to predict CRC of 0.80 (CI 95; 0.675-0.930) with a sensitivity of 83% and a specificity of 74%, P<0.001.
Tabla 1: resultados de COV, biomarcadores del CCR, en el método de la presente invención Table 1: VOC results, CRC biomarkers, in the method of the present invention
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