ES2878148T3

ES2878148T3 - Dispositivos y métodos para procesar una muestra biológica

Info

Publication number: ES2878148T3
Application number: ES14874631T
Authority: ES
Inventors: Brian David Warner; Liping Yu; Smita Ghanekar; Jianying Cao
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2021-11-18
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: EP3087194A1; CN106103732A; EP3087194A4; WO2015100028A1; EP3087194B1; US20150177111A1

Abstract

Un método para procesar una muestra biológica, el método que comprende: disrumpir una muestra biológica en un disruptor de muestras para producir una primera muestra biológica disrumpida; y separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la primera muestra biológica disrumpida en un separador acústico que comprende una entrada y una salida que están en comunicación de fluidos con el disruptor de muestras; caracterizado porque el método comprende además evaluar, mediante el monitoreo de retroalimentación, el grado de disrupción de los componentes más grandes y pequeños separados acústicamente con un detector en la salida del separador acústico que se configura para transportar los componentes más grandes separados acústicamente de regreso al disruptor de muestras en respuesta al monitoreo de retroalimentación.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivos y métodos para procesar una muestra biológica

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

De conformidad con 35 U.S.C. § 119 (e), esta solicitud reivindica prioridad a la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos con número de serie 61/920,394, presentada el 23 de diciembre de 2013.

Introducción

La citometría de flujo se usa cada vez más en el diagnóstico y monitoreo de enfermedades, tal como para el diagnóstico prenatal y neonatal de anomalías inmunológicas. Las células usadas en citometría de flujo a menudo deben lavarse y concentrarse antes de su uso. Esto generalmente conlleva una etapa manual que implica la centrifugación, la cual puede llevar mucho tiempo, dañar las células, o provocar la agregación de las células en la muestra. Además, debido a que las células a menudo se asientan durante períodos de tiempo prolongados, la probabilidad de que las células formen agregados es alta.

El procesamiento de una muestra biológica para obtener células individuales a partir de agregados celulares, tejidos u órganos es a menudo necesario para muchas pruebas de laboratorio. La desagregación de tejidos y la ruptura de grupos de células a menudo pueden requerir laboriosos protocolos de purificación y separación con el fin de separar las células desagregadas de los tejidos y otros materiales biológicos los cuales requieren un posterior procesamiento. Igualmente, el tiempo requerido para procesar ciertos tipos de muestras (por ejemplo, tejidos sanos) puede requerir un grado de desagregación diferente al de otros (por ejemplo, tejido canceroso o necrótico), lo que hace que la desagregación de muestras biológicas complejas sea difícil e ineficaz. Los períodos prolongados de desagregación mecánica o tratamiento enzimático pueden ser perjudiciales para la muestra biológica, con pérdidas de viabilidad celular por sobreprocesamiento.

El documento US 2013/0116459 A1 describe un método y un aparato para manipular acústicamente partículas biológicas, y describe específicamente la concentración de partículas biológicas en una suspensión líquida con enfoque acústico en un sistema de flujo continuo. El documento US 2013/0116459 A1 describe además un conducto de flujo continuo el cual aplica fuerzas acústicas a la muestra que fluye y se extraen y separan varios componentes. El documento WO 2008/147530 describe un dispositivo fluídico usando estaciones de clasificación para separar las especies objetivo de otras especies en una muestra, de manera que se usan fuerzas acústicas como fuerza de captura de partículas. El documento WO 2008/147530 describe además que mediante la aplicación de un campo de ondas acústicas, las partículas se pueden dirigir a los nodos de presión de la onda acústica estacionaria donde diferentes distribuciones de campo tienen efectos variables sobre las partículas, por ejemplo en base al tamaño y que esta fuerza puede usarse para separar componentes tales como por ejemplo mediante "manipulación de partículas en una trampa"

Resumen

La invención proporciona un método para procesar una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 1. Los métodos, en ciertos casos, también incluyen la separación acústica de las células de restos celulares y macromoléculas no celulares, así como separar magnéticamente fracciones etiquetadas magnéticamente de fracciones no etiquetada. La invención también proporciona un sistema para procesar una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 17.

Breve descripción de los dibujos

La invención puede entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos acompañantes. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

La Figura 1 ilustra un ejemplo, no cubierto mediante la presente invención, de la separación acústica de componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida.

La Figura 2 ilustra un ejemplo, no cubierto mediante la presente invención, de la separación acústica de las células de restos celulares y macromoléculas no celulares.

La Figura 3 ilustra la separación acústica de componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida configurada con un monitor de retroalimentación posicionado en una región de enfoque hidrodinámico de acuerdo con la invención.

La Figura 4 ilustra un ejemplo del agotamiento magnético de fracciones etiquetadas magnéticamente de acuerdo con ciertas modalidades.

La Figura 5 muestra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica de acuerdo con ciertas modalidades.

La Figura 6 ilustra un ejemplo de separación de células de restos celulares y macromoléculas no celulares usando un segundo dispositivo concentrador acústico de acuerdo con ciertas modalidades.

La Figura 7 ilustra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica que tiene un dispositivo separador magnético de acuerdo con ciertas modalidades.

La Figura 8 ilustra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica acoplada a un sistema de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para analizar y clasificar las células recolectadas de acuerdo con ciertas modalidades.

Las Figuras 9a-b muestran imágenes de separación de partículas de diferentes tamaños en un dispositivo concentrador acústico a bajos caudales de acuerdo con ciertas modalidades.

Las Figuras 10a-b ilustran el enfoque hidrodinámico en el dispositivo concentrador acústico de acuerdo con ciertas modalidades.

Descripción detallada

Antes de que la presente invención se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las modalidades particulares descritas, como tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente mediante las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado, se incluye dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se incluyen dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo declarado. Cuando el intervalo declarado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción también pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.

Se observa que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la exposición de elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa". Como se revisó anteriormente, la presente descripción proporciona métodos para procesar una muestra biológica. En la descripción adicional de modalidades de la descripción, los métodos para procesar una muestra biológica se describen primero con mayor detalle. A continuación, se describen los sistemas adecuados para practicar los métodos objeto para procesar una muestra biológica. También se proporcionan kits y sistemas controlados por ordenador.

Métodos para procesar una muestra biológica

Como se resumió anteriormente, la presente descripción incluye métodos para procesar una muestra biológica para recolectar células de la muestra biológica procesada. Por "recolectar células" se entiende el aislamiento de células libres de los otros componentes de la muestra biológica y puede incluir la separación de células de otros tipos de células no deseadas, la separación de células de restos celulares (por ejemplo, fragmentos celulares, membranas celulares fragmentadas, orgánulos, células muertas o lisadas) así como la separación de células de macromoléculas no celulares como tejido conectivo, lípidos libres, proteínas y fragmentos de ácido nucleico. Aislar células de una muestra biológica también incluye la ruptura de células aglomeradas o agregados celulares. En ciertas modalidades, los métodos incluyen la ruptura de un órgano, tejido o fragmento de tejido con el fin de recolectar las células las cuales forman colectivamente el órgano, tejido o fragmento de tejido.

En modalidades de la presente descripción, los métodos objeto proporcionan muestras de células que exhiben bajo arrastre. El arrastre es una medida del grado de agregación de los componentes (por ejemplo, células) en una muestra líquida, definida como la relación de la distribución observada del componente sobre la distribución esperada basada en una distribución de Poisson normal, por ejemplo, como se describe en Lindmo, y otros (1981) Citometría, 2, 151-154. En ciertos aspectos, el dispositivo objeto puede facilitar la producción de muestras con un factor de arrastre de 2,0 a 0,0, tal como aproximadamente 1,5 a 0,0, que incluye 1,0 a 0,0, 0,75 a 0,0, aproximadamente 0,5 a 0,0, 0,4 a 0,02 o 0,25 a 0,0.

Como se usa en la presente descripción, el término "muestra biológica" se usa en su sentido convencional para referirse a un organismo completo, planta, hongo o un subconjunto de tejidos animales, células o partes de componentes los cuales en ciertos casos pueden encontrarse en sangre, moco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebroespinal, saliva, lavado broncoalveolar, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen. Como tal, una "muestra biológica" se refiere tanto al organismo nativo o un subconjunto de sus tejidos así como a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir del organismo o un subconjunto de sus tejidos, que incluyen pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones de la piel, tractos respiratorio, gastrointestinal, cardiovascular, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células de sangre, tumores, órganos. Las muestras biológicas pueden ser cualquier tipo de tejido orgánico, que incluye ambos tejido sano y enfermo (por ejemplo, canceroso, maligno, necrótico, etc.)

En modalidades de la presente descripción, la muestra biológica contiene células. Las células adecuadas incluyen células eucariotas (por ejemplo, células de mamífero) y/o células procariotas (por ejemplo, células bacterianas o células arqueales). Las muestras se pueden obtener a partir de una fuente in vitro (por ejemplo, una suspensión de células a partir de las células de laboratorio desarrolladas en cultivo) o a partir de una fuente in vivo (por ejemplo, un sujeto mamífero, un sujeto humano, etc.). En algunas modalidades, la muestra celular se obtiene a partir de una fuente in vitro. Las fuentes in vitro incluyen, pero no se limitan a, cultivos de células procariotas (por ejemplo, bacterianas, arqueales), muestras ambientales que contienen células procariotas y/o eucariotas (por ejemplo, mamíferos, protista, hongos, etc.), cultivos de células eucariotas (por ejemplo, cultivos de líneas de células establecidas, cultivos de líneas de células conocidas o compradas, cultivos de líneas de células inmortalizadas, cultivos de células primarias, cultivos de levadura de laboratorio, etc.), cultivos de tejidos, y similares.

En algunas modalidades, la muestra se obtiene a partir de una fuente in vivo y puede incluir muestras obtenidas a partir de tejidos (por ejemplo, suspensión de células a partir de una biopsia de tejido, suspensión de células a partir de una muestra de tejido, etc.) y/o fluidos corporales (por ejemplo, sangre entera, sangre fraccionada, plasma, suero, saliva, fluido linfático, fluido intersticial, etc.). En algunos casos, las células, los fluidos o los tejidos derivados de un sujeto se cultivan, almacenan, o manipulan antes de la evaluación. Las fuentes in vivo incluyen organismos multicelulares vivos y pueden producir muestras celulares de diagnóstico o no diagnóstico.

En ciertas modalidades, la fuente de la muestra es un "mamífero" o "mamífero", donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos los cuales están dentro de la clase de mamíferos, que incluyen los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas, y ratas), y primates (por ejemplo, humanos, chimpancés, y monos). En algunos casos, los sujetos son humanos. Los métodos se pueden aplicar a muestras obtenidas de sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, neonatos, infantes, jóvenes, adolescentes, adultos), donde en ciertas modalidades el sujeto humano es un joven, adolescente o adulto. Mientras la presente invención se puede aplicar a muestras de un sujeto humano, debe entenderse que los métodos también se pueden llevar a cabo en muestras de otros sujetos animales (es decir, en "sujetos no humanos") tales como, pero sin limitarse a aves, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.

En ciertas modalidades, la muestra biológica es un espécimen que se ha precargado en un contenedor (por ejemplo, vaso mezclador, microtubo de vórtice, recipiente sonicador, etc.) configurado para su uso con el disruptor de muestras biológicas y se almacena en el contenedor por un período predeterminado de tiempo antes de que se disrumpa la muestra biológica. La cantidad de tiempo que se almacena la muestra biológica después de la precarga en el contenedor antes de la disrupción la muestra biológica puede variar, tal como 0,1 horas o más, tal como 0,5 horas o más, tal como 1 hora o más, tal como 2 horas o más, tal como 4 horas o más, tal como 8 horas o más, tal como 16 horas o más, tal como 24 horas o más, tal como 48 horas o más, tal como 72 horas o más, tal como 96 horas o más, tal como 120 horas o más, tal como 144 horas o más, tal como 168 horas o más y que incluye la precarga de la muestra biológica en el contenedor 240 horas o más antes de la disrupción de la muestra biológica o puede variar tal como desde 0,1 horas a 240 horas antes de la disrupción de la muestra biológica, tal como desde 0,5 horas a 216 horas, tal como desde 1 hora a 192 horas y que incluye de 5 horas a 168 horas antes de la disrupción de la muestra biológica. Por ejemplo, la muestra biológica puede precargarse en un contenedor (por ejemplo, vaso mezclador, microtubo de vórtice, recipiente sonicador, etc.) configurado para su uso con el disruptor de muestras biológicas en una ubicación remota (por ejemplo, en casa usando un kit casero o en el consultorio de un médico) y se envía a un laboratorio para su procesamiento de acuerdo con los métodos objeto. Por "ubicación remota" se entiende una ubicación diferente a la ubicación en la cual la muestra se contiene y precarga en el contenedor. Por ejemplo, una ubicación remota podría ser otra ubicación (por ejemplo, oficina, laboratorio, etc.) en la misma ciudad, otra ubicación en una ciudad diferente, otra ubicación en un estado diferente, otra ubicación en un país diferente, etc., en relación con la ubicación del dispositivo de procesamiento, por ejemplo, como se describe con mayor detalle a continuación. En algunos casos, dos ubicaciones están alejadas una de la otra si se separan entre sí por una distancia de 10 m o más, tales como 50 m o más, que incluyen 100 m o más, por ejemplo, 500 m o más, 1000 m o más, 10000 m o más, hasta, en algunos casos, 100000 m, etc.

Las muestras biológicas procesadas por los métodos objeto pueden exhibir un amplio intervalo de viscosidades. La viscosidad de un líquido puede depender de la temperatura. En ciertas modalidades, una muestra de fluido tiene una viscosidad sustancialmente igual a la del agua a la temperatura dada (por ejemplo, 1 cP a 20 °C, 0,65 cP a 40 °C). Las muestras de fluidos útiles en la presente descripción pueden exhibir un amplio intervalo de viscosidades, que oscila en algunos aspectos de 0,01 cP a 750 cP, que incluyen 0,1 cP a 100 cP, tales como 0,1 cP a 50 cP, 0,2 cP a 10 cP, 0,2 cP a 2,0 cP, 0,5 a 1,5 cP, o 0,75 cP a 1,5 cP.

Al practicar métodos de acuerdo con la invención, una muestra biológica se disrumpe para producir una muestra biológica disrumpida seguido de la separación acústica de componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida para recolectar células individuales de la muestra biológica. El término "disrumpido" se usa en su sentido convencional para referirse a la ruptura de la muestra biológica en sus componentes constituyentes, tales como en células, agregados de tejido, agregados celulares (por ejemplo, grupos de células), restos celulares (por ejemplo, fragmentos celulares, membranas celulares fragmentadas, orgánulos, células muertas o lisadas) así como macromoléculas no celulares tales como tejido conectivo, lípidos libres, proteínas y fragmentos de ácido nucleico. En algunas modalidades, la disrupción de la muestra biológica incluye la desagregación del tejido. En otras modalidades, la disrupción de la muestra biológica incluye la desagregación de células aglomeradas. En otras modalidades más, disrumpir la muestra biológica incluye la ruptura de agregados celulares y restos celulares. En otras modalidades más, disrumpir la muestra biológica incluye la ruptura de agregados celulares y macromoléculas no celulares. En otras modalidades más, los métodos incluyen una combinación de uno o más de agregación de tejido, desagregación de células aglomeradas, ruptura de agregados celulares y restos celulares y ruptura de agregados celulares y macromoléculas no celulares.

En dependencia del tipo de muestra biológica, la disrupción de la muestra biológica puede incluir, pero no se limita a desagregación mecánica de tejido, desagregación química de tejido, desagregación enzimática de tejido, desagregación, desagregación celular mecánica, desagregación celular ultrasónica, y combinaciones de los mismos, entre otros protocolos. Puede emplearse cualquier protocolo de disrupción adecuado siempre que sea suficiente para romper la muestra biológica en componentes individuales de la muestra biológica sin lisis o destrucción de las células. La disrupción de la muestra biológica puede incluir triturar, cizallar, batir, sacudir, así como el empleo de homogeneizadores mecánicos, homogeneizadores manuales, morteros, sonicadores, molinos mezcladores, agitadores de vórtice entre otros tipos de disruptores de muestras biológicas.

En ciertas modalidades, la disrupción de la muestra biológica incluye la desagregación del tejido. La desagregación del tejido se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier protocolo conveniente siempre que sea suficiente para romper el tejido en sus componentes constituyentes mientras se retiene la viabilidad de las células las cuales forman colectivamente el tejido. En algunas modalidades, la desagregación del tejido incluye la disociación mecánica del tejido, que incluye, pero no limitado a trocear, moler, picar o cortar con una cuchilla afilada (ya sea manual u operado por máquina), mezclar, triturar, raspar, homogeneizar, presionar a través de malla de nailon o acero, agitar con vórtice o por estrés de osmolalidad anormal. En ciertas modalidades, la desagregación del tejido incluye triturar el tejido. En otras modalidades, la desagregación del tejido incluye agitar el tejido con vórtice.

En algunas modalidades, disrumpir la muestra biológica incluye la desagregación de células aglomeradas, restos celulares y macromoléculas no celulares. En estas modalidades, los métodos incluyen la separación de células individuales de otras células, restos celulares (por ejemplo, membranas celulares fragmentadas, orgánulos libres) y de macromoléculas no celulares (por ejemplo, moléculas de adhesión, desmosomas, contaminantes y lípidos libres, proteínas y fragmentos de ácido nucleico). En algunos casos, una muestra biológica dada se considera disrumpida si, después de la etapa de disrupción, 1 o más, tal como 2 o más, por ejemplo, 5 o más, 10 o más, 25 o más, 50 o más, células las cuales originalmente se asociaron de manera estable entre sí ya no se asocian de manera estable entre sí, es decir, son libres de moverse en la muestra entre sí.

Los métodos para desagregar células aglomeradas, restos celulares y macromoléculas no celulares en la muestra biológica pueden incluir la disrupción de interacciones no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, interacciones polares o interacciones electrostáticas débiles o componentes adhesivos degradantes que conectan las células o unen los restos celulares o compuestos no celulares a las células individuales. La desagregación celular se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier protocolo conveniente siempre que sea suficiente para separar células entre sí, restos celulares extraños o macromoléculas no celulares en la muestra biológica sin disrumpir o destruir la viabilidad de las células. Los protocolos de interés para la desagregación celular pueden incluir, pero no se limitan a, agitación mecánica, vórtice, sonicación, mezcla, filtración y combinaciones de los mismos entre otros protocolos. En ciertas modalidades, los métodos incluyen disrumpir los agregados celulares agitando mecánicamente la muestra biológica, tal como con un agitador mecánico o un mezclador. En otras modalidades, los métodos incluyen la disrupción de los agregados celulares mediante la agitación con vórtice de la muestra biológica. En otras modalidades más, los métodos incluyen la disrupción de agregados celulares mediante sonicación.

En algunas modalidades, la disrupción de la muestra biológica incluye emplear un disruptor enzimático. Los disruptores enzimáticos de interés pueden incluir, pero no se limitan a, enzimas digestivas proteolíticas y biomoléculas capaces de digerir desmosomas, elementos estromales de tejido así como adherencias extracelulares e intercelulares. Por ejemplo, las enzimas proteolíticas de interés pueden incluir tripsina, pepsina, papaína, colagenasa, elastasa, hialuronidasa, pronasa, quimotripsina, catalasa, dispasa, así como DNasa. La cantidad de disruptor enzimático empleada variará en dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica, así como el grado de disrupción de la muestra biológica deseado y oscila de 0,001 mg/mL a 1000 mg/mL, tal como de 0,005 mg/mL a 500 mg/mL, tal como de 0,01 mg/mL a 250 mg/mL, tal como de 0,05 mg/mL a 100 mg/mL, tal como de 0,1 mg/mL a 90 mg/mL, tal como de 0,5 mg/mL a 75 mg/mL, tal como de 1 mg/mL a 50 mg/mL y que incluye de 5 mg/mL a 25 mg/mL.

El disruptor enzimático puede ponerse en contacto con la muestra biológica en intervalos discretos o puede aplicarse todo de una vez a la muestra biológica. Cuando el disruptor enzimático entra en contacto con la muestra biológica en intervalos discretos, la cantidad de disruptor enzimático en contacto con la muestra biológica durante cada intervalo puede variar, que oscila de 0,001 mg a 1000 mg, tal como de 0,005 mg a 750 mg, tal como de 0,01 mg a 500 mg, tal como de 0,05 mg a 400 mg, tal como de 0,1 mg a 250 mg, que incluye de 1 mg a 100 mg durante cada intervalo. En estas modalidades, el disruptor enzimático puede ponerse en contacto con la muestra biológica cada 0,1 minutos o más, tal como cada 0,5 minutos o más, tal como cada minuto o más, tal como cada 2 minutos o más, tal como cada 3 minutos o más, tal como cada 5 minutos o más, tal como cada 10 minutos o más y que incluye cada 30 minutos o más.

La disrupción de la muestra biológica también puede incluir el empleo de un disruptor químico. Los disruptores químicos de interés pueden incluir, pero no se limitan a, agentes quelantes, complejantes o secuestrantes capaces de disrumpir los desmosomas, el estroma tisular, así como la adhesión intercelular y la integridad de la superficie celular. En ciertas modalidades, los disruptores químicos se configuran para omitir o secuestrar iones de calcio o magnesio de una manera suficiente para interferir con la adhesión intercelular y la integridad de la superficie celular. Por ejemplo, los disruptores químicos de interés pueden incluir un agente quelante tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido tetraacético N,N,N',N' de etilenglicol-bis- (beta-aminoetil éter) (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanel- 1 -sulfónico (DMPS), y ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), fosfinas bidentadas tal como 2,2'-bis (difenilfosfino)-1,1'-binaftil (BINAP), bisfosfonatos y ácido cítrico. La cantidad de disruptor químico empleado también variará en dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica, así como el grado de desagregación deseado y oscila de 0,001 mg/mL a 1000 mg/mL, tal como de 0,005 mg/mL a 500 mg/mL, tal como de 0,01 mg/mL a 250 mg/mL, tal como de 0,05 mg/mL a 100 mg/mL, tal como de 0,1 mg/mL a 90 mg/mL, tal como de 0,5 mg/mL a 75 mg/mL, tal como de 1 mg/mL a 50 mg/mL y que incluye de 5 mg/mL a 25 mg/mL.

En dependencia del tamaño y tipo de muestra biológica, la duración de la disrupción de la muestra biológica puede variar, tal como 0,01 minutos o más, tal como 0,05 minutos o más, tal como 0,1 minutos o más, tal como 0,5 minutos o más, tal como 1 minuto o más, tal como 5 minutos o más, tal como 10 minutos o más, tal como 30 minutos o más, tal como 60 minutos o más y que incluye 120 minutos o más. Un límite superior para el tiempo que se disrumpe la muestra biológica puede ser, en ciertos casos, 500 minutos o menos, tal como 400 minutos o menos, tal como 300 minutos o menos, tal como 240 minutos o menos, tal como 180 minutos o menos. menos, tal como 120 minutos o menos, tal como 60 minutos o menos, tal como 30 minutos o menos y que incluye 10 minutos o menos. En ciertas modalidades, la duración de la disrupción de la muestra biológica oscila de 0,01 minutos a 120 minutos, tal como 0,05 minutos a 90 minutos, tal como 0,1 minutos a 60 minutos, tal como 0,5 minutos a 30 minutos, tal como 1 minuto a 15 minutos y que incluye disrumpir la muestra biológica por un tiempo el cual oscila de 5 minutos a 10 minutos.

En dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica, así como de la disrupción deseada, los protocolos para disrumpir la muestra biológica pueden ser pulsados o continuos. Por "pulsado" se entiende que la disrupción de la muestra biológica se puede realizar en intervalos discretos. La duración de cada intervalo puede variar y puede ser de 0,01 minutos o más, tal como 0,05 minutos o más, tal como 0,1 minutos o más, tal como 0,5 minutos o más, tal como 1 minuto o más, tal como 5 minutos o más y que incluye 10 minutos o más. Un límite superior para la duración de cada intervalo de disrupción es, en ciertos casos, 60 minutos o menos, tal como 45 minutos o menos, tal como 30 minutos o menos, tal como 15 minutos o menos, tal como 10 minutos o menos, tal como 5 minutos o menos y que incluye 1 minuto o menos.

La disrupción de la muestra biológica se puede llevar a cabo a cualquier temperatura adecuada siempre que la viabilidad de las células recolectadas se conserve según se desee. Como tal, la temperatura para disrumpir la muestra biológica puede variar, tal como de -80 °C a 100 °C, tal como de -75 °C a 75 °C, tal como de -50 °C a 50 °C, tal como de -25 °C a 25 °C, tal como de -10 °C a 10 °C, y que incluye de 0 °C a 25 °C.

Como se describió anteriormente, la invención incluye la separación acústica de componentes más grandes de componentes más pequeños para recolectar células individuales en la muestra biológica disrumpida. El término "separación acústica" se usa en su sentido convencional de manera amplia y genéricamente para referirse a un proceso en el cual la materia particulada (por ejemplo, células, restos celulares, materia tisular y compuestos no celulares) en una muestra biológica puede controlarse o manipularse mediante la aplicación de una onda estacionaria ultrasónica. En consecuencia, en ciertas modalidades, los métodos incluyen clasificar acústicamente componentes de la muestra biológica disrumpida. En otros casos, los métodos incluyen componentes de concentración acústica de la muestra biológica disrumpida.

En modalidades de la presente descripción, los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida incluyen tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares, mientras que los componentes más pequeños de la muestra biológica disrumpida incluyen células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares. Como tal, en ciertos casos, los métodos incluyen la separación acústica de tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares de células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares presentes en la muestra biológica disrumpida.

Los métodos para la separación acústica así como los dispositivos de interés pueden incluir, pero no se limitan a, los descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con número de serie 14/061,678 presentada el 23 de octubre de 2013, la Patente de los Estados Unidos con número 6,929,750; Laurell y otros (2007) Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 492-506; Petersson, y otros (2005) Química analítica 77: 1216-1221; y Augustsson, y otros (2009) Laboratorio en un chip 9: 810-81 8. Brevemente, un factor de contraste acústico (factor O) depende tanto de la densidad de una partícula (por ejemplo, agregado de tejido, agregado celular o célula individual) (pc) y su compresibilidad (pc) en relación con las propiedades correspondientes del medio circundante (pw, pw). Un factor de contraste acústico puede ser positivo o negativo, lo cual determina la dirección de la fuerza acústica y si una partícula particular se moverá hacia un nodo de onda de presión estacionaria o hacia el antinodo de presión.

La Figura 1 ilustra un ejemplo, no cubierto mediante la presente invención, de la separación acústica de los componentes más grandes de los componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida. Como se ilustra en la Figura 1, la muestra biológica disrumpida 101 se transporta a un canal del dispositivo concentrador acústico a través de una o más entradas mientras que el tampón de flujo de laminación 102 se transporta al canal a través de una entrada central. La separación de los componentes más grandes 106 tal como tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares de los componentes más pequeños tales como células individuales 107, restos celulares 108 y macromoléculas no celulares 109 se acciona acústicamente por una onda estacionaria ejercida por el transductor piezoeléctrico 103. De esta manera, los componentes más grandes se enfocan al centro del canal mientras que los componentes más pequeños permanecen a lo largo del lado del canal. Las salidas del dispositivo concentrador acústico transportan los componentes más grandes tales como tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares de regreso al disruptor de muestras 104, mientras que los componentes más pequeños se transportan 105 ya sea a un depósito de almacenamiento o a un segundo dispositivo concentrador acústico (como se describe con mayor detalle a continuación) para separar las células individuales de los componentes aún más pequeños tales como restos celulares y macromoléculas no celulares.

En ciertos aspectos, la separación acústica de los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños sigue el método de Lund, donde los compuestos de la muestra biológica disrumpida de diferentes tamaños se separan acústicamente en un microcanal de flujo laminar accionado ultrasónicamente usando un generador de campo acústico (por ejemplo, una cerámica piezoeléctrica). En ciertas modalidades, el ancho del canal corresponde a la mitad de la longitud de onda ultrasónica deseada, creando un resonador entre las paredes laterales del canal de flujo en el cual puede formarse una onda estacionaria. En estas modalidades, la onda estacionaria inducida se genera ortogonal al frente de onda ultrasónica incidente. Los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida con un factor O positivo se mueven durante el flujo a través del canal, por medio de la fuerza de radiación primaria axial (PRF), hacia el plano nodal de presión a lo largo del centro del canal, mientras que los componentes más pequeños de la muestra biológica disrumpida la muestra permanezca cerca de las paredes laterales. La separación de los componentes más grandes de los componentes más pequeños se completa, en ciertos casos, mediante una salida de canal dividido configurada para proporcionar los componentes más grandes separados a través de una salida central y los componentes más pequeños a través de una o más salidas laterales. En algunas modalidades, la onda estacionaria acústica se enfoca al centro del canal de flujo. En estas modalidades, la onda estacionaria acústica se configura para propagarse dentro del canal que aplica una presión de radiación acústica dentro del canal de flujo. En ciertos casos, la onda estacionaria acústica aplicada no se propaga fuera del canal de flujo. En ciertas modalidades, el campo acústico se aplica solo en una única dirección mediante el transductor de vibración. Como tal, en estas modalidades el transductor de vibración no aplica simultáneamente campos acústicos en dos o más direcciones diferentes.

En algunas modalidades, el flujo fluídico a través del dispositivo concentrador acústico es laminar. El término "flujo laminar" se usa en su sentido convencional para referirse a la dinámica del flujo donde el fluido fluye en una pluralidad de capas paralelas las cuales tienen poca o ninguna disrupción entre las capas. Por ejemplo, se puede laminar una corriente del tampón de vaina entre dos corrientes de muestra en el flujo a través del dispositivo concentrador acústico. En estas modalidades, cuando se aplica un campo acústico, las partículas de mayor densidad (por ejemplo, tejido, agregados celulares, etc.) se fuerzan a un nodo de la onda acústica estacionaria en un laminado del tampón de lavado que fluye. Los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida separada pueden salir del dispositivo concentrador acústico a través de una salida de muestra dedicada mientras que los componentes más pequeños en corrientes de muestra de laminación en paralelo pueden dirigirse a diferentes salidas.

La muestra biológica disrumpida se transporta al dispositivo separador acústico a través de una o más entradas. En ciertas modalidades, durante la separación la muestra biológica disrumpida se transporta a través del dispositivo separador acústico a lo largo de los lados de un conducto y un tampón de lavado de laminación fluye entre ellos. Como tal, el primer medio líquido (por ejemplo, la muestra biológica disrumpida) y el segundo medio líquido (por ejemplo, tampón que fluye) se combinan de una manera suficiente para producir un flujo laminar del primer y segundo medio, es decir, un flujo en el cual los dos medios fluyen en trayectorias de flujo distintas pero adyacentes y en contacto. Las densidades del primer y segundo medio difieren en algunos casos con el fin de facilitar la manipulación de un componente de un primer medio a un segundo medio, o viceversa. Por ejemplo, en algunos casos la diferencia de densidad entre el primer y el segundo medio es 0,01 % o mayor, tal como el 0,05 % o mayor, tal como el 0,1 % o mayor, tal como el 0,5 % o mayor, tal como el 1 % o mayor, tal como el 2 % o mayor, tal como el 5 % o mayor y que incluye el 10 % o mayor. Una diferencia de densidad límite superior entre el primer y el segundo medio en los métodos objeto puede, en ciertos casos ser del 25 % o menos, tal como el 20 % o menos, el 15 % o menos, tal como el 10 % o menos y que incluye el 5 % o menos.

Al practicar los métodos objeto, se activa un transductor (por ejemplo, un transductor piezoeléctrico) ubicado debajo del conducto para crear una onda estacionaria acústica en el canal. La onda estacionaria aplicada ejerce presión de radiación acústica sobre las partículas de un tamaño predeterminado contenidas en la muestra biológica disrumpida para mover estas partículas desde los lados del conducto hacia el nodo de presión formado en el centro del canal (por ejemplo, a una zona de enfoque en el tampón que fluye). En modalidades de la presente descripción, la onda acústica estacionaria aplicada es suficiente para separar los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños. Por ejemplo, los métodos incluyen concentrar los componentes más grandes en el nodo de la onda acústica estacionaria en el tampón de flujo mientras se retienen los componentes más pequeños en el flujo de la muestra biológica disrumpida a lo largo de los lados del conducto del separador acústico. En estas modalidades, los componentes más pequeños y los componentes más grandes presentes en la muestra biológica disrumpida se llevan a cabo del dispositivo separador acústico a través de diferentes salidas, separando de esta manera eficazmente los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños.

Como se discutió anteriormente, en dependencia del tipo de muestra biológica, en algunos casos los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida pueden ser uno o más de tejido, fragmentos de tejido o agregados celulares y los componentes más pequeños pueden ser una o más de células individuales, restos celulares o macromoléculas no celulares. En ciertos casos, los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida son agregados celulares y los componentes más pequeños son células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida. En consecuencia, en algunas modalidades, la separación acústica de los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños incluye la separación de tejido, fragmentos de tejido o agregados celulares, de células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida. En otras modalidades, la separación acústica de los componentes más grandes de los componentes más pequeños incluye separar agregados celulares de células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida. En otras modalidades más, separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños incluye separar células individuales de restos celulares y macromoléculas no celulares. En otras modalidades más, separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños incluye separar células individuales de los restos celulares. En otra modalidad, separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños incluye separar células individuales de macromoléculas no celulares.

La frecuencia de la onda acústica aplicada para separar acústicamente los componentes de la muestra biológica disrumpida varía en dependencia de la muestra biológica, el ancho del canal de separación, la composición de la solución tampón así la separación deseada de los componentes y puede ser de aproximadamente 1,5 MHz o más, tal como 2 MHz o más, tal como 2,5 MHz o más, tal como 3 MHz o más, tal como 3,5 MHz o más, tal como 4 MHz o más, tal como 4,5 MHz o más, tal como 5 MHz o más, tal como 5,5 MHz o más y que incluye aproximadamente 6 MHz o más. Por ejemplo, la frecuencia de la onda acústica aplicada puede oscilar de 1,0 MHz a 6 MHz, tal como de 1,5 a 5,5 MHz, tal como de 2 MHz a 5 MHz, tal como de 2,5 a 4,5 MHz y que incluye de 3 MHz a 4 MHz. Un límite superior para la frecuencia de la onda acústica aplicada puede, en ciertos casos, ser 10 MHz o menos, tal como 7,5 MHz o menos, y que incluye 5 MHz o menos. En ciertas modalidades, la frecuencia de la onda acústica que se aplica corresponde al modo de resonancia fundamental del transductor de vibración, tal como por ejemplo 2,0 MHz para ciertas placas de transductores piezoeléctricos. En otras modalidades, la frecuencia de la onda acústica aplicada corresponde a un armónico del transductor de vibración, tal como un primer armónico, un segundo armónico y similares.

En algunos casos, el dispositivo concentrador acústico se configura de tal manera que la posición de uno o más nodos acústicos se determina mediante la velocidad del sonido en la solución tampón empleada y el ancho del canal del concentrador acústico, dado por la ecuación n = c/A donde n es la frecuencia, c es la velocidad del sonido en el tampón empleado y A es el ancho del canal. Por ejemplo, cuando el tampón es 1x tampón fosfato salino (PBS) (la velocidad del sonido es de 1500 m/s en 1x PBS) en un dispositivo concentrador acústico que tiene un ancho de canal de 375 |jm, la frecuencia de resonancia es 4 MHz. En estas modalidades, se producirá un nodo en el centro del canal a la mitad de la frecuencia de resonancia (es decir, 2 MHz). En consecuencia, los múltiplos más altos de esta frecuencia producirán múltiples nodos en el canal, los cuales proporcionan una pluralidad de corrientes de enfoque. Por ejemplo, en estas modalidades, una frecuencia de 4 MHz produciría 2 corrientes, mientras que una frecuencia de 6 MHz produciría 3 corrientes.

La amplitud de la presión acústica de la onda acústica aplicada a componentes separados de la muestra biológica disrumpida también puede variar en dependencia de los componentes de la muestra biológica disrumpida, la velocidad del flujo de fluido durante la separación acústica y puede oscilar de 0,01 MPa a 1 MPa, tal como 0,05 MPa a 0,95 MPa, tal como de 0,1 MPa a 0,9 MPa, tal como de 0,2 MPa a 0,8 MPa y que incluye de 0,25 MPa a 0,75 MPa. En las modalidades, la amplitud de la presión acústica de la onda acústica aplicada es suficiente para separar acústicamente las células individuales de los agregados celulares, restos celulares o macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida.

En los métodos de la presente descripción, los componentes de la muestra biológica disrumpida pueden separarse selectivamente en base al tamaño. Por ejemplo, en dependencia de los componentes de la muestra biológica disrumpida, los métodos pueden incluir la aplicación de una presión de radiación acústica la cual sea suficiente para separar componentes los cuales tengan diámetros de 5 jm o mayor, tal como 10 jm o mayor, tal como 25 jm o mayor, tal como 50 jm o mayor y que incluye 100 jm o mayor, tal como de 10 a 25 jm , tal como de 25 a 50 jm, tal como de 50 a 75 jm y que incluye de 75 a 100 jm. En algunas modalidades, la presión acústica aplicada es suficiente para separar tejido, fragmentos de tejido o agregados celulares de células individuales, restos celulares o macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida. En otras modalidades, la presión acústica aplicada es suficiente para separar las células individuales de los agregados celulares, restos celulares o macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida.

El voltaje de activación que se aplica también puede variar. Por ejemplo, en ciertos aspectos, un voltaje de activación es de 0,1 Vpp a 100 Vpp o superior, tal como 0,1 Vpp a 1 Vpp, 1 Vpp a 10 Vpp, 10 Vpp a 20 Vpp, 20 Vpp a 30 Vpp, 30 Vpp a 40 Vpp, 40 Vpp a 50 Vpp, 50 Vpp a 75 Vpp, 75 Vpp a 100 Vpp, o 100 Vpp o superior.

En ciertas modalidades, la velocidad de separación acústica es de 1 jl/min o más. Por ejemplo, en ciertos aspectos la velocidad es de 10 jl/min o más, que incluyen 10 jl/min a 50 jl/min, 50 jl/min a 100 jl/min, 100 jl/min a 200 jl/min, 200 jl/min a 300 jl/min, 300 jl/min a 400 jl/min, 400 jl/min a 500 jl/min, 500 jl/min a 600 jl/min, 600 jl/min a 700 jl/min, 700 jl/min a 800 jl/min, 800 jl/min a 900 jl/min, 900 jl/min a 1 ml/min, 1 ml/min a 10 ml/min, 10 ml/min a 20 ml/min, 20 ml/min a 30 ml/min, 30 ml/min a 40 ml/min, 40 ml/min a 50 ml/min, 50 ml/min a 60 ml/min, 60 ml/min a 70 ml/min, 70 ml/min a 80 ml/min, 80 ml/min a 90 ml/min, 90 ml/min a 100 ml/min, 100 ml/min a 150 ml/min, 150 ml/min a 200 ml/min, 200 ml/min a 500 ml/min, o 500 ml/min a 1 L/min. En ciertos aspectos, el caudal durante la separación acústica de los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños se ajusta de manera que la salida sea óptima para el análisis subsecuente mediante un monitor de retroalimentación (descrito con mayor detalle a continuación), tal como de 20 a 150 jL/min, que incluye de 30 a 100 jL/min, tal como de 40-60 jL/min.

En ciertas modalidades, los métodos incluyen además la separación de restos celulares y macromoléculas no celulares a partir de células individuales. Al practicar los métodos objeto, los restos celulares y las macromoléculas no celulares (por ejemplo, proteínas, enzimas, fragmentos de ácido nucleico, lípidos, etc.) se separan de las células individuales en un segundo dispositivo concentrador acústico acoplado fluídicamente al primer dispositivo concentrador acústico usado para separar los componentes más grandes de los más pequeños en la muestra biológica disrumpida. Los componentes más pequeños (es decir, muestras de células) de la muestra biológica disrumpida recolectada del primer dispositivo concentrador acústico pueden transportarse al segundo dispositivo concentrador acústico (también puede denominarse dispositivo de lavado) a través de una o más entradas. En ciertas modalidades, los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan a lo largo de los lados del canal del segundo dispositivo concentrador acústico (dispositivo de lavado) mientras que las células individuales se enfocan al centro del canal, con el fluido que transporta los restos celulares y macromoléculas no celulares y el líquido que transporta las células que operan bajo flujo laminar.

Un transductor ubicado proximal al conducto se activa para crear una onda acústica estacionaria. En estas modalidades, la onda estacionaria aplicada ejerce una presión de radiación acústica a las células suficiente para mover las células hacia el nodo de presión formado en el centro del conducto (por ejemplo, a una zona de enfoque en el tampón que fluye) donde las células se transportan a un tampón de lavado el cual ocupa el centro del canal fluídico y el laminado entre las corrientes de muestra que fluyen a lo largo del lado del canal. En modalidades de la presente descripción, la onda estacionaria acústica aplicada es suficiente para separar las células individuales de los restos celulares y de las macromoléculas no celulares. Por ejemplo, los métodos pueden incluir concentrar las células en el nodo de la onda acústica estacionaria en el tampón de flujo mientras se retienen enzimas y macromoléculas no celulares (por ejemplo, disruptores enzimáticos) a lo largo de los lados del canal del dispositivo concentrador acústico. En estas modalidades, las células se llevan a cabo del segundo dispositivo concentrador acústico y se recolectan a través de una salida central. Los restos celulares separados y las macromoléculas no celulares se llevan a cabo del dispositivo de lavado acústico y se recolectan a través de dos o más salidas laterales.

La Figura 2 ilustra un ejemplo no cubierto mediante la presente invención de separar acústicamente células de restos celulares y macromoléculas no celulares de acuerdo con ciertas modalidades de la presente descripción. Como se ilustra en la Figura 2, la muestra 201 que contiene componentes más pequeños tales como células, restos celulares y macromoléculas no celulares emitidas del primer dispositivo concentrador acústico se transporta a un canal del segundo dispositivo concentrador acústico a través de una o más entradas mientras que el tampón de lavado de laminación 202 se transporta al canal a través de una entrada central. La separación de las células 206 de los restos celulares y las macromoléculas no celulares 207 se acciona acústicamente mediante una onda estacionaria ejercida mediante el transductor piezoeléctrico 203. De esta manera, las células se enfocan al centro del canal mientras que componentes más pequeños como restos celulares y macromoléculas no celulares fluyen a lo largo del lado del canal. Las salidas del dispositivo concentrador acústico transportan las células a un depósito de recolección o a un analizador (por ejemplo, un citómetro de flujo como se describe con mayor detalle a continuación) a través de una salida central 204 mientras que los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan a un depósito de desechos 205.

La densidad del tampón de lavado de laminación puede variar en dependencia del tipo de tampón de lavado de laminación, el tampón de la muestra biológica disrumpida así como la separación deseada de los componentes de la muestra biológica disrumpida. En ciertas modalidades, el tampón de lavado de laminación tiene una densidad mayor que el tampón de muestra que contiene los componentes de la muestra biológica disrumpida. Por ejemplo, la densidad del tampón de laminación puede tener una densidad la cual es del 5 % o mayor que la densidad del tampón de muestra, tal como el 10 % o mayor, tal como el 15 % o mayor, tal como el 20 % o mayor, tal como el 25 % o mayor, tal como el 30 % o mayor, tal como el 40 % o mayor y que incluye una densidad la cual es del 50 % o mayor que la densidad del tampón de muestra. En algunos casos, la densidad del tampón de laminación tiene una densidad la cual es mayor que la densidad del tampón de muestra en un intervalo del 1 % al 100 %, tal como del 5 % al 95 %, tal como del 10 % al 90 %, tal como del 15 % al 85 %, tal como del 20 % al 80 % y que incluye un tampón de laminación el cual tiene una densidad la cual es mayor que la densidad del tampón de muestra que oscila del 25 % al 75 %.

La frecuencia de la onda acústica aplicada para separar acústicamente las células individuales de los restos celulares y las macromoléculas no celulares en el segundo dispositivo concentrador acústico varía y puede ser de aproximadamente 1,5 MHz o más, tal como 2 MHz o más, tal como 2,5 MHz o más, tal como 3 MHz o más, tal como 3,5 MHz o más, tal como 4 MHz o más, tal como 4,5 MHz o más, tal como 5 MHz o más, tal como 5,5 MHz o más y que incluye 6 MHz o más. Por ejemplo, la frecuencia de la onda acústica aplicada puede oscilar de 1,0 MHz a 6 MHz, tal como de 1,5 a 5,5 MHz, tal como de 2 MHz a 5 MHz, tal como de 2,5 a 4,5 MHz y que incluye de 3 MHz a 4 MHz. Un límite superior para la frecuencia de la onda acústica aplicada puede, en ciertos casos, ser 10 MHz o menos, tal como 7,5 MHz o menos, y que incluye 5 MHz o menos. En ciertas modalidades, la frecuencia de la onda acústica que se aplica corresponde al modo de resonancia fundamental del transductor de vibración, tal como por ejemplo 2,0 MHz para ciertas placas de transductores piezoeléctricos. En otras modalidades, la frecuencia de la onda acústica aplicada corresponde a un armónico del transductor de vibración, tal como un primer armónico, un segundo armónico y similares. En las modalidades, la frecuencia de la onda acústica aplicada es suficiente para separar acústicamente las células individuales de los restos celulares y las macromoléculas no celulares.

La amplitud de la presión acústica de la onda acústica aplicada también puede variar y puede oscilar de 0,01 MPa a 1 MPa, tal como de 0,05 MPa a 0,95 MPa, tal como de 0,1 MPa a 0,9 MPa, tal como de 0,2 MPa a 0,8 MPa y que incluye de 0,25 MPa a 0,75 MPa. En las modalidades, la amplitud de la presión acústica de la onda acústica aplicada es suficiente para separar acústicamente las células individuales de los restos celulares y las macromoléculas no celulares.

El caudal cuando se separan acústicamente células individuales de restos celulares y macromoléculas no celulares puede variar y puede ser de 1 pl/min o más. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la velocidad es de 10 pl/min o más, que incluyen de 10 pl/min a 50 pl/min, 50 pl/min a 100 pl/min, 100 pl/min a 200 pl/min, 200 pl/min a 300 pl/min, 300 pl/min a 400 pl/min, 400 pl/min a 500 pl/min, 500 pl/min a 600 pl/min, 600 pl/min a 700 pl/min, 700 pl/min a 800 pl/min, 800 pl/min a 900 pl/min, 900 pl/min a 1 ml/min, 1 ml/min a 10 ml/min, 10 ml/min a 20 ml/min, 20 ml/min a 30 ml/min, 30 ml/min a 40 ml/min, 40 ml/min a 50 ml/min, 50 ml/min a 60 ml/min, 60 ml/min a 70 ml/min, 70 ml/min a 80 ml/min, 80 ml/min a 90 ml/min, 90 ml/min a 100 ml/min, 100 ml/min a 150 ml/min, 150 ml/min a 200 ml/min, 200 ml/min a 500 ml/min, o 500 ml/min a 1 L/min. En ciertos aspectos, el caudal se ajusta de manera que la salida sea óptima para el análisis subsecuente de las células concentradas, tales como de 20 a 150 pL/min que incluyen de 30 a 100 pL/min, tal como de 40 a 60 pL/min. El flujo se puede ajustar de manera que la salida de las células individuales concentradas sea óptima para el análisis posterior mediante un dispositivo particular, tal como un clasificador de células.

Los métodos ejemplares no cubiertos mediante la presente invención incluyen el monitoreo de la desagregación de la muestra biológica. El monitoreo de la desagregación incluye evaluar (ya sea por un humano o con la ayuda de un ordenador, si se usa un proceso automatizado por ordenador configurado inicialmente bajo la dirección humana) la muestra biológica procesada para medir el grado de agregación exhibido por la muestra biológica procesada después de uno o más intervalos de los métodos objeto. La determinación del grado de desagregación puede incluir evaluar la cantidad de agregados celulares que permanecen en la muestra biológica procesada o medir el número de células individuales recolectadas o una combinación de las mismas.

El monitoreo incluye la recolección de datos en tiempo real, tal como mediante el empleo de un detector (por ejemplo, detector de dispersión láser, detector de absorción óptica) para evaluar la desagregación en la muestra biológica procesada. Por ejemplo, monitorear la desagregación de la muestra biológica procesada puede incluir posicionar un detector de dispersión láser cerca de la salida central del dispositivo concentrador acústico en una región de enfoque hidrodinámico para monitorear la cantidad de agregados celulares que permanecen en la muestra biológica procesada. Se describen ejemplos del uso de un láser y un detector de dispersión láser para evaluar la agregación de tejido en Citometría de flujo práctica, 4a edición, John Wiley & Sons, Inc.; Hoboken, Nueva Jersey (2003), cuya descripción se incorpora en la presente descripción como referencia. La Figura 3 ilustra un ejemplo de separación acústica de componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida configurada con un monitor de retroalimentación posicionado en una región de enfoque hidrodinámico para monitorear la cantidad de agregados celulares que permanecen en la biología procesada, de acuerdo con la invención. Como se ilustra en la Figura 3, la muestra biológica disrumpida 301 se transporta a un canal del dispositivo concentrador acústico a través de una o más entradas mientras que el tampón de flujo de laminación 302 se transporta al canal a través de una entrada central. La separación los de componentes más grandes 307 tal como tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares de los componentes más pequeños como células individuales 308, restos celulares 309 y macromoléculas no celulares 310 se acciona acústicamente mediante una onda estacionaria ejercida mediante el transductor piezoeléctrico 303. Los componentes más grandes se enfocan al centro del canal, mientras que los componentes más pequeños permanecen a lo largo del lado del canal. El monitor de retroalimentación (por ejemplo, sensor de dispersión de luz) se posiciona para tomar medidas en la salida central del dispositivo concentrador acústico el cual transporta los componentes más grandes tales como tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares de regreso al disruptor de muestras 304, mientras que los componentes más pequeños se transportan 305 ya sea a un depósito de almacenamiento o a un segundo dispositivo concentrador acústico para separar las células individuales de los componentes aún más pequeños tales como restos celulares y macromoléculas no celulares.

En otras modalidades, el monitoreo incluye evaluar la desagregación en la muestra biológica procesada a intervalos regulares, tal como cada 1 minuto, cada 5 minutos, cada 10 minutos, cada 30 minutos, cada 60 minutos o algún otro intervalo. En otras modalidades más, el monitoreo incluye evaluar la desagregación en la muestra biológica procesada después de cada intervalo de procesamiento, después de cada 2 intervalos de procesamiento, después de cada 3 intervalos de procesamiento o después de algún otro número de intervalos.

La desagregación celular en la muestra biológica procesada puede evaluarse en cualquier fase durante los métodos del objeto. Los métodos de la invención incluyen evaluar la desagregación en la muestra biológica procesada después de separar acústicamente los componentes de la muestra biológica disrumpida. En estas modalidades, evaluar la desagregación puede incluir determinar la cantidad de agregados celulares que permanecen en la muestra biológica procesada o medir el número de células individuales recolectadas.

Los métodos de la presente descripción también pueden incluir una etapa de evaluación de la agregación en la muestra biológica procesada para identificar cualquier ajuste deseado al protocolo de procesamiento. En otras palabras, los métodos incluyen proporcionar retroalimentación basada en el monitoreo de la muestra biológica procesada, donde los ajustes al protocolo de procesamiento pueden variar en términos del objetivo, donde en algunos casos el ajuste deseado son ajustes que finalmente resultan en una mejor calidad de la muestra biológica procesada o un aumento en la cantidad de células individuales recolectadas. En ciertas modalidades, donde la retroalimentación proporcionada mediante el monitoreo de la muestra biológica procesada indica que un solo intervalo de procesamiento no es suficiente para proporcionar la cantidad deseada de células individuales recolectadas o para reducir los agregados celulares en la muestra biológica a una cantidad deseada, los métodos pueden incluir llevar a cabo uno o más intervalos de procesamiento adicionales. En otras palabras, los métodos objeto pueden, en ciertos casos, incluir múltiples intervalos de procesamiento. Por "múltiples intervalos de procesamiento" se entiende que los protocolos descritos en la presente descripción para procesar la muestra biológica se repiten una o más veces de manera secuencial. Al practicar los métodos objeto, múltiples protocolos de intervalo pueden incluir dos o más intervalos de procesamiento, tales como tres o más intervalos de procesamiento, tales como cuatro o más intervalos de procesamiento, tales como cinco o más intervalos de procesamiento, que incluyen diez o más intervalos de procesamiento.

El número de intervalos de procesamiento en un protocolo de intervalo de procesamiento múltiple puede variar, en dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica, la eficiencia de desagregación durante cada intervalo de procesamiento así como la cantidad deseada de células recolectadas. En algunas modalidades, el número de intervalos de procesamiento depende de la cantidad medida de agregados celulares presentes en la muestra biológica procesada. Cuando la cantidad de agregados celulares está por encima de un umbral predeterminado, los métodos pueden incluir procesar la muestra biológica una o más veces adicionales hasta que se alcanza la cantidad deseada de agregados celulares en la muestra biológica procesada. Por ejemplo, los métodos pueden incluir llevar a cabo uno o más intervalos de procesamiento adicionales hasta que la cantidad de agregados celulares en la muestra biológica procesada esté por debajo de un umbral predeterminado, tal como el 50 % p/p o menos, tal como el 40 % p/p o menos, tal como el 30% p/p o menos, tal como el 20 % p/p o menos, tal como el 10 % p/p o menos y que incluye el 5 % p/p o menos.

En otras modalidades, el número de intervalos de procesamiento depende del número medido de células individuales recolectadas. Cuando se determina que el número medido de células individuales recolectadas está por debajo de un umbral predeterminado, los métodos pueden incluir procesar la muestra biológica una o más veces adicionales hasta que se recolecte la cantidad deseada de células. Por ejemplo, los métodos pueden incluir llevar a cabo uno o más intervalos de procesamiento adicionales hasta que el número medido de células individuales recolectadas esté por encima de un umbral predeterminado, tal como 103 células o más, tal como 104 células o más, tal como 105 células o más, tal como 106 células o más, tal como 107 células o más, tal como 108 células o más y que incluye 109 células o más.

La duración entre los intervalos de procesamiento puede variar en dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica y el número de intervalos de procesamiento en el protocolo de intervalo múltiple. Por ejemplo, el tiempo entre intervalos puede ser de 0,1 minutos o más, tal como 0,5 minutos o más, tal como 1 minuto o más, tal como 2 minutos o más, tal como 3 minutos o más, tal como 5 minutos o más y que incluye 10 minutos o más.

Como se observó anteriormente, los métodos pueden incluir el monitoreo de la muestra biológica procesada. En ciertas modalidades, donde la retroalimentación proporcionada mediante el monitoreo la muestra biológica procesada indica que un protocolo particular (por ejemplo, un protocolo de disrupción o un protocolo de separación acústica) no es efectivo para reducir los agregados celulares en la muestra biológica a una cantidad deseada o para proporcionar una cantidad deseada de células individuales recolectadas, los métodos pueden incluir cambiar una o más partes del protocolo de procesamiento (por ejemplo, disrupción de la muestra biológica, separación acústica de la muestra biológica disrumpida, separación magnética de la muestra biológica disrumpida). En un ejemplo, cuando la muestra biológica procesada contiene tejido sin disrumpir en una cantidad mayor que la deseada, los métodos pueden incluir cambiar el protocolo usado para disrumpir la muestra biológica. Por ejemplo, la disrupción de la muestra biológica se puede cambiar de agitación mecánica a mezclar con un triturador de tejidos. En otro ejemplo, cuando la muestra biológica procesada contiene restos celulares o macromoléculas no celulares en una cantidad mayor que la deseada, los métodos pueden incluir emplear un protocolo de separación magnética o aumentar el número de fracciones de unión magnética que se ponen en contacto con la muestra biológica disrumpida. En otro ejemplo más, cuando las células individuales recolectadas del separador acústico contienen agregados celulares extrañas, los métodos pueden incluir cambiar la amplitud de la onda acústica estacionaria.

En ciertas modalidades, los métodos también pueden incluir la separación de fracciones etiquetadas magnéticamente de fracciones no etiquetadas magnéticamente (por ejemplo, restos que no se asocian con una etiqueta magnética) en la muestra biológica disrumpida. Como se describe con mayor detalle a continuación, los compuestos de la muestra biológica disrumpida pueden separarse magnéticamente en un dispositivo separador magnético. En ciertos casos, los métodos incluyen separar las fracciones de interés etiquetadas magnéticamente de las fracciones que no son de interés (por ejemplo, fracciones que no se etiquetan magnéticamente) mediante la retención de las fracciones etiquetadas magnéticamente mientras no se retienen las fracciones que no son de interés. Como las fracciones de interés se etiquetan magnéticamente, los métodos objeto incluyen retener las fracciones etiquetadas magnéticamente mediante la atracción de las fracciones etiquetadas magnéticamente a una fuente del campo magnético. Alternativamente, los métodos pueden incluir separar las fracciones etiquetadas magnéticamente que no son de interés de las fracciones que sí lo son (por ejemplo, las fracciones de interés que no se etiquetan magnéticamente) mediante la retención de las fracciones etiquetadas magnéticamente que no son de interés mientras se recolectan las fracciones que son de interés. En estas modalidades, los métodos incluyen retener las fracciones etiquetadas magnéticamente que no son de interés mediante la atracción de las fracciones etiquetadas magnéticamente a una fuente del campo magnético.

En estas modalidades, los métodos incluyen unir una etiqueta magnética a una o más fracciones objeto en la muestra biológica disrumpida antes de realizar el ensayo de separación magnética (por ejemplo, antes de separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra biológica disrumpida). Como tal, el método incluye etiquetar magnéticamente una o más fracciones en la muestra biológica disrumpida antes de realizar el ensayo de separación magnética.

Los componentes de la muestra biológica disrumpida pueden etiquetarse magnéticamente usando cualquier etiqueta magnética conveniente que pueda asociarse de manera estable con una etiqueta magnética detectable mediante un dispositivo de separación magnética. Por "asociado de manera estable" se entiende que la etiqueta magnética y la fracción de interés mantienen su posición entre sí en el espacio bajo las condiciones de uso, por ejemplo, al separar componentes de la muestra biológica disrumpida. Como tal, la etiqueta magnética y la fracción de interés pueden asociarse de manera estable no covalente o covalentemente entre sí.

Las etiquetas magnéticas útiles en la práctica de ciertas modalidades son partículas magnéticas, tales como, pero sin limitarse a, partículas ferromagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas, antiferromagnéticas, o ferromagnéticas. En ciertos casos, las partículas magnéticas parecen "no magnéticas" (por ejemplo, tienen una magnetización remanente de sustancialmente cero) en ausencia de un campo magnético. Las partículas magnéticas con una magnetización remanente sustancialmente de cero pueden no aglomerarse sustancialmente entre sí en solución en ausencia de un campo magnético externo.

En algunos casos, las partículas magnéticas son biocompatibles, por ejemplo, solubles en agua y funcionalizadas para que puedan unirse fácilmente a biomoléculas de interés, tal como un anticuerpo que se une específicamente a un analito objetivo. Al asociar o unir partículas magnéticas con un anticuerpo específico, las partículas magnéticas pueden dirigirse a un analito específico a través de las interacciones de unión específicas entre el anticuerpo y el antígeno complementario. En algunos casos, la etiqueta magnética puede unirse a la proteína o al anticuerpo como se describió anteriormente a través de un enlace no covalente o covalente entre sí. Las asociaciones no covalentes adecuadas pueden incluir adsorción no específica, unión basada en electrostática (por ejemplo, iones, interacciones de pares de iones), interacciones hidrófobas, interacciones de enlaces de hidrógeno, unión específica a través de un miembro de un par de unión específica unido covalentemente a la superficie de la partícula magnética, y similares. Los ejemplos de unión covalente incluyen enlaces covalentes formados entre la biomolécula y un grupo funcional presente en la superficie de la partícula magnética, por ejemplo, -OH, donde el grupo funcional puede ser de origen natural o estar presente como miembro de un grupo de unión introducido. La etiqueta magnética se puede adsorber, fisisorbida, quimisorbida o unirse covalentemente a la superficie de la fracción de interés.

En ciertas modalidades, las partículas magnéticas son nanopartículas. Por "nanopartícula" se entiende una partícula que tiene un tamaño promedio (por ejemplo, diámetro medio) en el intervalo de 1 nm a 1000 nm. En ciertas modalidades, el tamaño promedio (por ejemplo, el diámetro medio) de las nanopartículas magnéticas es de tamaño submicrónico, por ejemplo, de 1 nm a 1000 nm, o de 1 nm a 500 nm, o de 5 nm a 250 nm, tal como de 5 nm a 150 nm, que incluye de 5 nm a 50 nm. Por ejemplo, nanopartículas magnéticas que tienen un diámetro medio de 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm, 150 nm, y 200 nm así como las nanopartículas que tienen diámetros medios en intervalos entre dos cualesquiera de estos valores, son adecuadas para su uso en la presente descripción. En ciertas modalidades, las partículas magnéticas tienen una forma sustancialmente uniforme. Por ejemplo, las partículas magnéticas pueden tener forma esférica. Además de una forma esférica, las nanopartículas magnéticas adecuadas para su uso en la presente descripción pueden tener forma de discos, varillas, bobinas, fibras, pirámides, y similares.

La etiqueta magnética puede asociarse de manera estable con la fracción (o fracciones) de interés a través de interacciones no covalentes o covalentes como se describió anteriormente. Por ejemplo, la etiqueta magnética puede asociarse con la fracción de interés a través de una interacción de unión entre un par de moléculas de unión. El par de moléculas de unión puede variar en dependencia de la interacción de unión de interés. Las interacciones de unión de interés incluyen cualquier interacción entre el par de moléculas de unión, donde la interacción de unión se produce con especificidad entre el par de moléculas de unión bajo las condiciones ambientales de la interacción de unión. Los ejemplos de interacciones de unión de interés incluyen, pero no se limitan a: interacciones de hibridación de ácido nucleico, interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-ácido nucleico, interacciones enzima-sustrato e interacciones receptor-ligando, por ejemplo, interacciones anticuerpo-antígeno y receptor-agonista o interacciones antagonistas.

Los ejemplos de moléculas que tienen interacciones de unión molecular de interés incluyen, pero no se limitan a: biopolímeros y moléculas pequeñas, las cuales pueden ser moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas. Un "biopolímero" es un polímero de uno o más tipos de unidades repetidas. Los biopolímeros pueden encontrarse en sistemas biológicos (aunque pueden hacerse sintéticamente) y pueden incluir péptidos, polinucleótidos, y polisacáridos, así como los compuestos conformados de o que contienen análogos de aminoácidos o grupos que no son aminoácidos, o análogos de nucleótidos o grupos no nucleótidos. Como tales, los biopolímeros incluyen polinucleótidos en los cuales el esqueleto convencional se ha reemplazado con un esqueleto sintético o de origen no natural, y ácidos nucleicos (o análogos sintéticos o de origen natural) en los cuales una o más de las bases convencionales se han reemplazado con un grupo (natural o sintético) capaz de participar en interacciones de enlace de hidrógeno tipo Watson-Crick. Por ejemplo, un "biopolímero" puede incluir ADN (que incluye ADNc), ARN, oligonucleótidos, PNA, otros polinucleótidos, y similares. Un "biomonómero" hace referencia a una sola unidad, la cual puede unirse con el mismo u otros biomonómeros para formar un biopolímero (por ejemplo, un único aminoácido o nucleótido con dos grupos de unión, uno o ambos de los cuales pueden tener grupos protectores removibles).

En algunos casos, el par de moléculas de unión son ligandos y receptores, donde un receptor o ligando dado puede ser o no un biopolímero. El término "ligando", como se usa en la presente descripción, se refiere a una fracción que es capaz de unirse covalente o químicamente de lo contrario a un compuesto de interés. Los ligandos pueden ser de origen natural o hecho por el hombre. Los ejemplos de ligandos incluyen, pero no se restringen a, agonistas y antagonistas para receptores de membrana celular, toxinas y venenos, epítopos virales, hormonas, opiáceos, esteroides, péptidos, sustratos enzimáticos, cofactores, fármacos, lectinas, azúcares, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos, proteínas, y similares. El término "receptor", como se usa en la presente descripción, es una fracción que tiene afinidad por un ligando. Los receptores pueden unirse, covalentemente o no covalentemente, a un miembro de unión, ya sea directamente o a través de una sustancia de unión específica. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se restringen a, anticuerpos, receptores de membrana celular, anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos, virus, células, fármacos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, péptidos, cofactores, lectinas, azúcares, polisacáridos, membranas celulares, orgánulos, y similares. Un "par de receptor de ligando" se forma cuando dos moléculas se han combinado a través de reconocimiento molecular para formar un complejo. Los métodos pueden, en ciertos casos, también incluir la detección de una interacción de unión entre un par de moléculas de unión. La interacción de unión puede incluir un miembro del par de moléculas de unión que se etiqueta con una etiqueta magnética como se describió en la presente descripción. Por ejemplo, un miembro del par de moléculas de unión puede etiquetarse magnéticamente y puede unirse a su miembro de par de unión complementario para formar un complejo de par de unión. El complejo de par de unión puede separarse de las fracciones que no son de interés en la muestra usando un dispositivo de separación magnética y métodos como se describió en la presente descripción. Después de realizar el ensayo de separación magnética, el complejo de par de unión puede detectarse usando cualquier método conveniente, tal como, pero no limitado a, citometría de flujo, detección de fluorescencia, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis, combinaciones de los mismos, y similares.

En ciertas modalidades, los métodos para la separación magnética así como los dispositivos de interés pueden incluir, pero no se limitan a, los descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con número de serie 14/061,678 presentada el 23 de octubre de 2013 y publicada como Estados Unidos 20140120570, Patentes de los Estados Unidos con números 5,945,281, 6,858,440; 6,645,777; 6,630,355; y 6,254,830; Solicitud de patente de los Estados Unidos con número PCT/US2012/032423 publicada como WO2012032423; y Hoeppener, y otros (2012) Recent Results Cancer Res. 195:43-58.

En modalidades de la presente descripción, separar fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra biológica disrumpida incluye aplicar un campo magnético que tiene un flujo magnético suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra. El campo magnético se puede aplicar continuamente a medida que la muestra fluye a través del conducto, o se puede aplicar discontinuamente en una aplicación pulsada. Por "pulsado" se entiende que el campo magnético se aplica a la muestra biológica disrumpida que fluye en intervalos discretos. En otras palabras, el campo magnético se aplica por una duración predeterminada, descontinuado por un período de tiempo seguido de la aplicación subsecuente del campo magnético. La duración del intervalo de aplicación del campo magnético a la muestra biológica disrumpida puede variar según se desee y puede ser de 0,01 minutos o más, tal como 0,05 minutos o más, tal como 0,1 minutos o más, tal como 0,5 minutos o más, tal como 1 minuto o más, tal como 5 minutos o más y que incluye 10 minutos o más. Un límite superior para la duración del intervalo de aplicación del campo magnético es, en ciertos casos, 60 minutos o menos, tal como 45 minutos o menos, tal como 30 minutos o menos, tal como 15 minutos o menos, tal como 10 minutos o menos, tal como 5 minutos o menos y que incluye 1 minuto o menos. Igualmente, la duración entre cada intervalo de aplicación del campo magnético puede variar, tal como 0,01 minutos o más, tal como 0,05 minutos o más, tal como 0,1 minutos o más, tal como 0,5 minutos o más, tal como 1 minuto o más, tal como 5 minutos o más y que incluye 10 minutos o más. Un límite superior para la duración entre cada intervalo de aplicación del campo magnético es, en ciertos casos, 60 minutos o menos, tal como 45 minutos o menos, tal como 30 minutos o menos, tal como 15 minutos o menos, tal como 10 minutos o menos, tal como 5 minutos o menos y que incluye 1 minuto o menos. Cada intervalo de aplicación del campo magnético a la muestra biológica disrumpida puede ser el mismo o diferente en dependencia de la muestra biológica. En ciertos casos, cada intervalo tiene la misma duración. En otros casos, cada intervalo tiene una duración diferente. En otros casos más, los protocolos incluyen algunos intervalos los cuales son de la misma duración y algunos intervalos de una duración diferente.

En ciertas modalidades, la fuente del campo magnético es un imán permanente (como se describe con mayor detalle a continuación) y el campo magnético se aplica continuamente a medida que la muestra biológica disrumpida fluye a través del conducto del dispositivo separador magnético.

El caudal durante la separación magnética puede variar, en ciertas modalidades, siendo la velocidad de 1 pl/min o más. Por ejemplo, en ciertos aspectos la velocidad es de 10 pl/min o más, que incluye 10 pl/min a 50 pl/min, 50 pl/min a 100 pl/min, 100 pl/min a 200 pl/min, 200 pl/min a 300 pl/min, 300 pl/min a 400 pl/min, 400 pl/min a 500 pl/min, 500 pl/min a 600 pl/min, 600 pl/min a 700 pl/min, 700 pl/min a 800 pl/min, 800 pl/min a 900 pl/min, 900 pl/min a 1 ml/min, 1 ml/min a 10 ml/min, 10 ml/min a 20 ml/min, 20 ml/min a 30 ml/min, 30 ml/min a 40 ml/min, 40 ml/min a 50 ml/min, 50 ml/min a 60 ml/min, 60 ml/min a 70 ml/min, 70 ml/min a 80 ml/min, 80 ml/min a 90 ml/min, 90 ml/min a 100 ml/min, 100 ml/min a 150 ml/min, 150 ml/min a 200 ml/min, 200 ml/min a 500 ml/min, o 500 ml/min a 1 L/min. En ciertos aspectos, el caudal durante la separación magnética se ajusta de manera que la salida sea óptima para el análisis subsecuente mediante un monitor de retroalimentación (descrito con mayor detalle a continuación), tal como 20 a 150 pL/min, que incluye 30 a 100 pL/min, tal como 40 a 60 pl/min.

En ciertas modalidades, los métodos incluyen el agotamiento magnético de los restos celulares de la muestra biológica disrumpida. En estas modalidades, los restos celulares tales como células muertas, fragmentos celulares, orgánulos libres, etc., se etiquetan mediante el contacto de la muestra biológica disrumpida con una etiqueta magnética (por ejemplo, anticuerpo conjugado magnéticamente) y se eliminan de la muestra biológica disrumpida aplicando un campo magnético a la muestra biológica disrumpida separando los restos celulares etiquetados de la muestra biológica disrumpida. Cuando los restos celulares se agotan magnéticamente de la muestra biológica disrumpida, los métodos de la presente descripción son, en ciertos casos, suficientes para eliminar el 75 % o más de los restos celulares de la muestra biológica disrumpida, tal como el 80 % o más, tal como 85 % o más, tal como el 90 % o más, tal como el 95 % o más, tal como el 97% o más y que incluye la eliminación del 99 % o más de los restos celulares de la muestra biológica disrumpida. La Figura 4 ilustra un ejemplo del agotamiento magnético de células no deseadas o muertas de acuerdo con una modalidad de la presente descripción. Las células muertas o no deseadas 403 se etiquetan magnéticamente, tal como con un anticuerpo conjugado magnéticamente y se separan de las células 402 aplicando un campo magnético con una fuente del campo magnético 401 a la muestra que fluye a través de un canal del dispositivo de separación magnética 400. Como se ilustra en la Figura 4, las células muertas o no deseadas 403 etiquetadas magnéticamente permanecen en el canal de flujo mientras que las células no etiquetadas 402, los agregados celulares 404, y las moléculas pequeñas 405 (por ejemplo, reactivos) fluyen y se recolectan en una salida del dispositivo de separación magnética.

En otras modalidades, los métodos incluyen el agotamiento magnético de macromoléculas no celulares no deseadas de la muestra biológica disrumpida. En estas modalidades, las macromoléculas no celulares no deseadas, tales como proteínas, lípidos, polisacáridos, contaminantes tisulares, etc., se etiquetan mediante el contacto de la muestra biológica disrumpida con una etiqueta magnética (por ejemplo, nanopartículas que tienen fracciones reactivas a proteínas, lípidos, polisacáridos, etc.) y se elimina de la muestra biológica disrumpida aplicando un campo magnético a la muestra biológica disrumpida separando las macromoléculas no celulares etiquetadas no deseadas de la muestra biológica disrumpida. Cuando las macromoléculas no celulares no deseadas se agotan magnéticamente de la muestra biológica disrumpida, los métodos de la presente descripción son, en ciertos casos, suficientes para eliminar el 75 % o más de las macromoléculas no celulares no deseadas de la muestra biológica disrumpida, tal como el 80 % o más, tal como el 85 % o más, tal como el 90 % o más, tal como el 95 % o más, tal como el 97 % o más y que incluye la eliminación del 99 % o más de las macromoléculas no celulares no deseadas de la muestra biológica disrumpida.

Los aspectos de la presente descripción pueden incluir además el análisis de las células recolectadas. En algunos casos, analizar las células recolectadas incluye clasificar las células. Por ejemplo, los métodos pueden incluir contar o clasificar las células recolectadas usando un citómetro de flujo. Los sistemas y métodos de citometría de flujo adecuados para analizar y clasificar muestras de células individuales arrastradas proporcionados mediante por los métodos objeto incluyen, pero no se limitan a los descritos en Ormerod (edición), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997); Jaroszeski y otros (ediciones), Protocolos de citometría de flujo, Métodos en biología molecular número 91, Prensa humana (1997); Citometría de flujo práctica, 3ra edición, Wiley-Liss (1995); Virgo, y otros (2012) Ann Clin Biochem. Enero; 49 (pt 1):17-28; Linden, y otros, Semin Throm Hemost. Octubre de 2004; 30(5):502-11; Alison, y otros J Pathol, diciembre de 2010; 222(4):335-344; y Herbig, y otros (2007) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.. 24(3):203-255. En ciertos casos, las células recolectadas se analizan usando un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™, un clasificador de células BD Biosciences Influx™, o similar.

En ciertas modalidades, las células obtenidas mediante los métodos objeto pueden usarse además en investigación como un espécimen de investigación, para pruebas de laboratorio de diagnóstico o para aplicaciones terapéuticas, según se desee, con o sin purificación adicional. Como se discutió anteriormente, la muestra biológica puede ser cualquier tipo de tejido orgánico o fluido biológico, tanto sano como enfermo (por ejemplo, canceroso, maligno, necrótico, etc.). En consecuencia, las células obtenidas de la muestra biológica procesada pueden emplearse en ciertos casos como un espécimen de investigación o diagnóstico para enfermedades tales como cánceres que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, anfrogalieponoisus cerebral, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, colangiocarcinoma, cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco del encéfalo, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de burkitt, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, bronquitis crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor demoplástico de célula redonda pequeña, enfisema, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, melanoma intraocular retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales: extracraneal, extragonadal, u ovario, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células pilosas cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (de hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de células renales, cáncer de laringe, leucemias, cáncer de esófago oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, linfomas, Macroglobulinemia, Waldenstrom, medullablastoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma, cáncer de próstata, blastema pleuropulmonar, cáncer de recto, rabdomiosarcoma, síndrome de glándulas no salivales, cáncer de glándulas salivales, melanoma, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer gastrointestinal, linfoma de células T, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de vagina.

En algunas modalidades, los métodos incluyen además cargar las células recolectadas en un contenedor y transportar las células a una ubicación remota. Por ejemplo, las células pueden cargarse en un contenedor configurado para análisis de diagnóstico médico o de laboratorio (por ejemplo, microtubo, tubo Eppendorf, tubo de ensayo, jeringa) y transportarse a una ubicación remota (por ejemplo, el laboratorio) para su posterior procesamiento o pruebas, según se desee. Por "ubicación remota" se entiende una ubicación distinta de la ubicación en la cual se recolectan las células de acuerdo con los métodos objeto. Por ejemplo, una ubicación remota podría ser otra ubicación (por ejemplo, Oficina, laboratorio, etc.) en la misma ciudad, otra ubicación en una ciudad diferente, otra ubicación en un estado diferente, otra ubicación en un país diferente, etc. Como tal, cuando se indica que un elemento está "alejado" de otro, lo que se entiende es que los dos elementos están al menos en edificios diferentes, y pueden estar al menos a una milla, diez millas o al menos cien millas de distancia, o como se describió anteriormente.

En otras modalidades más, las células obtenidas mediante los métodos objeto pueden usarse además en terapia, aplicándose mediante cualquier modo de administración conveniente. En dependencia del tipo de células obtenidas, la formulación del agente terapéutico puede variar. Los métodos para preparar formulaciones farmacéuticas pueden incluir los descritos en " Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a edición, Williams & Williams, (1995), la " Physician's Desk Reference", 52a edición, Medical Economics, Montvale, Nueva Jersey (1998), y Kibbe, AH, Manual de excipientes farmacéuticos, 3ra edición, Asociación Farmacéutica Estadounidense, Washington, DC, 2000.

Por ejemplo, las formulaciones que tienen las células recolectadas pueden tomar la forma de una inyección, por ejemplo, polvos o liofilados que se pueden reconstituir con un solvente antes de su uso, así como soluciones o suspensiones listas para inyección, composiciones secas insolubles para combinar con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para diluir antes de la administración. En modalidades donde las células recolectadas se formulan para inyección, los diluyentes pueden incluir, pero no se limitan a agua bacteriostática, dextrosa al 5 % en agua, tampón fosfato salino, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada, y cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, las células recolectadas pueden formularse para su uso en terapia en forma de una solución o suspensión líquida, jarabe, crema, pomada, tableta, cápsula, polvo, gel, matriz, supositorio, o cualquier combinación de los mismos.

Sistemas para procesar una muestra biológica

La presente descripción incluye además sistemas para practicar los métodos. El sistema de acuerdo con la invención se define mediante la reivindicación 17. En ciertos aspectos, los sistemas incluyen además un dispositivo de separación magnética, un segundo dispositivo concentrador acústico o cualquier combinación de los mismos. Como se resumió anteriormente, la presente descripción incluye procesar una muestra biológica para obtener células individuales a partir de la muestra biológica. Los sistemas objeto se configuran para facilitar la producción de muestras de células que exhiben un bajo arrastre. El arrastre es una medida del grado de agregación de los componentes (por ejemplo, células) en una muestra líquida, definida como la relación entre la distribución observada del componente y la distribución esperada basada en una distribución de Poisson normal. En ciertos aspectos, el dispositivo objeto puede facilitar la producción de muestras con un factor de arrastre de 2,0 a 0,0, tal como 1,5 a 0,0, que incluye 1,0 a 0,0, 0,75 a 0,0, 0,5 a 0,0, 0,4 a 0,02 o 0,25 a 0,0, donde un valor de 1,0 representa una distribución de Poisson normal, menos de uno es más ordenado de lo predicho mediante las estadísticas de Poisson y los valores mayores de 1 reflejan la agregación de la muestra.

Como tales, los sistemas de acuerdo con ciertas modalidades se configuran para romper un órgano, tejido, fragmento de tejido y agregados celulares para recolectar células del órgano, tejido, fragmento de tejido o agregados celulares. En ciertas modalidades, los sistemas de interés se configuran para separar las células de las no células, separar células de restos celulares (por ejemplo, fragmentos celulares, membranas celulares fragmentadas, orgánulos, células muertas o lisadas) así como para separar las células de las macromoléculas no celulares tal como tejido conectivo, lípidos, proteínas y fragmentos de ácido nucleico. Como se observó anteriormente, las muestras biológicas pueden ser cualquier tipo de tejido orgánico, que incluye ambos tejido sano y enfermo (por ejemplo, canceroso, maligno, necrótico, etc.) En ciertos casos, los sistemas se configuran para obtener células enfermas (por ejemplo, cancerosas) de una muestra de tejido o fluido biológico.

El dispositivo objeto se configura como un dispositivo de flujo continuo para analizar muestras líquidas. Por "flujo continuo" se entiende que una muestra líquida puede entrar en el dispositivo a través de una entrada, transportarse a través del dispositivo en una trayectoria de flujo, tal como un conducto, y entonces salir del dispositivo a través de una salida. El dispositivo puede configurarse para transportar una corriente continua de la muestra a través del dispositivo y separar continuamente las fracciones etiquetadas magnéticamente en la muestra a medida que la muestra fluye a través del dispositivo, y/o las partículas separadas continuamente (por ejemplo, células) en base a los factores de contraste acústico (también llamado factor O; descrito a continuación) de las partículas a medida que la muestra fluye a través de la porción del concentrador acústico del dispositivo. Cada disruptor, dispositivo de concentración acústica y dispositivo de separación magnética puede tener 1 o más entradas y salidas según se desee. Por ejemplo, cada disruptor, dispositivo de concentración acústica y dispositivo de separación magnética puede incluir individualmente 1 o más entradas, tal como 2 o más entradas, tal como 3 o más entradas y que incluye 5 o más entradas. En ciertas modalidades, cada disruptor, dispositivo de concentración acústica y dispositivo de separación magnética incluyen individualmente entre 1 y 5 entradas, tales como entre 2 y 4 entradas y que incluye 3 entradas. Igualmente, cada disruptor, dispositivo de concentración acústica y dispositivo de separación magnética puede incluir individualmente 1 o más salidas, tales como 2 o más salidas, tales como 3 o más salidas y que incluye 5 o más salidas. En ciertas modalidades, cada disruptor, dispositivo de concentración acústica y dispositivo de separación magnética incluyen individualmente entre 1 y 5 salidas, tales como entre 2 y 4 salidas y que incluye 3 salidas.

El número de entradas y salidas puede ser el mismo o diferente para cada elemento de los sistemas objeto. Por ejemplo, en un caso el dispositivo objeto incluye un disruptor el cual tiene 1 entrada y 1 salida y un dispositivo concentrador acústico el cual tiene 3 entradas y 3 salidas. En otra modalidad, el dispositivo objeto incluye un dispositivo de separación magnética el cual tiene 1 entrada y 2 salidas y un dispositivo concentrador acústico el cual tiene 2 entradas y 2 salidas.

Cada una de las entradas puede configurarse para introducir cualquier componente en los dispositivos objeto, tal como por ejemplo la muestra biológica, partículas magnéticas, reactivos, disolventes y tampones. Cuando el dispositivo incluye más de una entrada, cada entrada puede emplearse para introducir los mismos componentes o diferentes. Por ejemplo, se puede emplear una entrada para introducir una muestra fluídica mientras que se pueden emplear una o más entradas alternas para introducir un tampón de lavado o fluido de vaina. Cada componente deseado puede introducirse en la entrada manualmente (por ejemplo, mediante jeringa o bomba de jeringa) o mediante uno o más inyectores (por ejemplo, sistemas de inyección controlados por ordenador, sistemas de bomba peristáltica, etc.).

El caudal a través de cada parte del sistema objeto puede variar en dependencia de la separación, concentración o análisis subsecuente deseado en comunicación de fluidos con el sistema objeto, como se describe con mayor detalle a continuación. En ciertas modalidades, el sistema se configura para tener un caudal de 1 pL/min o más, tal como 10 pL/min o más, que incluye 30 pL/min o más, o 40 pL/min o más, o 50 pL/min o más, o 60 pL/min o más, o 80 pL/min o más, o 100 pL/min o más, o 200 pL/min o más, o 300 pL/min o más, o 400 pL/min o más, o 500 pL/min o más, o 750 pL/min o más, o 1 mL/min o más, o 2 mL/min o más, o 5 mL/min o más, o 10 mL/min o más, o de 100 ml/min a 1 l/min. En ciertos aspectos, cuando el sistema se acopla a un clasificador de células o citómetro de flujo, el caudal del sistema es tal que la salida del sistema es óptima para el análisis subsecuente usando el clasificador de células o citómetro de flujo, tal como 20 a 150 pL/min, que incluye 30 a 100 pL/min, tal como 40 a 60 pL/min.

En algunas modalidades, los sistemas objeto se configuran para proporcionar un caudal constante. Por "caudal constante" se entiende que la velocidad del fluido a través del sistema aumenta o disminuye en un 2 % o menos, tal como en un 1,5 % o menos, tal como en un 1 % o menos, tal como en un 0,5 % o menos, tal como el 0,5 % o menos y que incluye cambios del 0,1 % o menos. Cuando el sistema también incluye un dispositivo de separación magnética y un segundo dispositivo concentrador acústico, el sistema puede configurarse para proporcionar un caudal constante a través de uno o más del dispositivo concentrador acústico, el dispositivo de separación magnética y el segundo dispositivo concentrador acústico. Por ejemplo, el sistema puede configurarse para proporcionar un caudal constante sólo a través del primer dispositivo concentrador acústico. Alternativamente, el sistema puede configurarse para proporcionar un caudal constante a través de todas las partes del sistema.

El sistema de acuerdo con la invención incluye un disruptor de muestras para producir una muestra biológica disrumpida y un dispositivo concentrador acústico para separar los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida (por ejemplo, tejido, fragmentos de tejido, agregados celulares, etc.) de los componentes más pequeños (células individuales, restos celulares, macromoléculas no celulares) para producir una muestra biológica procesada. La Figura 5 muestra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica de acuerdo con ciertas modalidades de la presente descripción. El sistema 500 incluye un disruptor de muestras 502 para disrumpir una muestra biológica 501. La muestra biológica disrumpida 501a se hace fluir usando la bomba 503a a través del dispositivo concentrador acústico 504 que tiene un transductor piezoeléctrico 504a para separar los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños para producir la muestra biológica procesada 501b. La muestra biológica procesada 501b se evalúa con un monitor de retroalimentación que tiene una fuente de luz láser 505a y un detector de dispersión láser 505b para determinar el grado de agregación en la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada 501b se dirige subsecuentemente a través de una o más salidas del dispositivo concentrador acústico 504 donde los componentes más grandes los cuales requieren un posterior procesamiento (por ejemplo, tejido, fragmentos de tejido, agregados celulares, etc.) se retroalimentan al disruptor de muestras 502, mientras que los componentes más pequeños (por ejemplo, células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares) se recolectan en el depósito de almacenamiento 506 usando la bomba 503b. El sistema de acuerdo con la invención también incluye un monitoreo de retroalimentación.

Como se describe con mayor detalle a continuación, los sistemas también pueden incluir dispositivos adicionales para practicar los métodos objeto, tales como un dispositivo de separación magnética y un segundo dispositivo concentrador acústico. Además, los sistemas también pueden incluir componentes adicionales tales como, una o más válvulas (por ejemplo, válvulas de manguito, y similares), depósitos (por ejemplo, depósitos de muestras, depósitos de lavado, depósitos de desechos, y similares), bombas (por ejemplo, bombas de jeringa, bombas peristálticas, y similares), tubos de conexión (por ejemplo, tubos de silicona), carcasas, procesadores, y similares. Los componentes de los sistemas objeto se pueden conectar fluídicamente entre sí mediante uno o más conductos. En ciertos aspectos, el conducto se encierra, de manera que el conducto se define mediante las paredes exteriores que rodean una trayectoria del flujo central. La trayectoria del flujo central puede alinearse con un eje longitudinal del conducto. La trayectoria del flujo central puede tener cualquier forma conveniente, tal como, pero no se limita a una trayectoria de flujo con un perfil de sección transversal de un círculo, una elipse, un cuadrado, un rectángulo, un pentágono, un hexágono, un perfil de sección transversal irregular, combinaciones de los mismos, y similares. En ciertas modalidades, el conducto puede tener una altura (por ejemplo, para conductos que no tienen un perfil de sección transversal redonda) o un diámetro interior (por ejemplo, para conductos que tienen un perfil de sección transversal redonda) de 5 cm o menos, tales como 2 cm o menos, que incluyen 1 cm o menos, o 7 mm o menos, o 5 mm o menos, o 3 mm o menos, o 2 mm o menos, o 1 mm o menos. La longitud del conducto puede oscilar de 1 cm a 1000 cm, tal como de 2 cm a 750 cm, que incluyen de 5 cm a 500 cm, o de 5 cm a 250 cm, o de 10 cm a 100 cm, tal como de 10 cm a 50 cm, por ejemplo de 10 cm a 25 cm.

Los conductos de interés pueden incluir una o más trayectorias de flujo, según se desee. En dependencia del número de salidas y entradas en cada componente, los conductos pueden incluir 2 o más trayectorias de flujo, tal como 3 o más trayectorias de flujo y que incluyen 5 o más trayectorias de flujo. Por ejemplo, el conducto posicionado entre el disruptor de muestras y el dispositivo concentrador acústico puede incluir de 2 a 5 trayectorias de flujo, tales como 3 trayectorias de flujo.

Los sistemas pueden incluir generalmente los dispositivos fluídicos objeto como se describe en la presente descripción y un procesador configurado para controlar uno o más dispositivos fluídicos. Estos componentes pueden integrarse en el mismo artículo de fabricación como una sola unidad, o distribuirse entre dos o más unidades diferentes (por ejemplo, como un sistema) donde las dos o más unidades diferentes están en comunicación entre sí, por ejemplo, a través de un cable o protocolo de comunicación inalámbrica.

Los sistemas objeto pueden configurarse para practicar los métodos objeto a cualquier temperatura adecuada siempre que la viabilidad de las células recolectadas se conserve según se desee. Como tal, los sistemas pueden configurarse para proporcionar una temperatura la cual oscila, tal como de -80 °C a 100 °C, tal como de -75 °C a 75 °C, tal como de -50 °C a 50 °C, tal como de -25 °C a 25 °C, tal como de -10 °C a 10 °C, y que incluye de 0 °C a 25 °C.

Varios aspectos de las modalidades de cada componente de los sistemas objeto se describirán ahora con mayor detalle a continuación.

Disruptor de muestras biológicas

El sistema de acuerdo con la invención incluye uno o más disruptores de muestras biológicas. En modalidades de la presente descripción, los disruptores de muestras biológicas se configuran para romper o desagregar una muestra biológica de una manera suficiente para liberar las células presentes en la muestra biológica de manera que las células puedan separarse y recolectarse subsecuentemente. Puede emplearse cualquier protocolo de disrupción de muestras adecuado siempre que sea capaz de romper la muestra biológica para liberar las células sin lisar o destruir las células. Los disruptores de muestras adecuados pueden incluir trituradores, mezcladores, homogeneizadores mecánicos y manuales, sonicadores, agitadores de vórtice, molinos, morteros, así como disruptores de muestras que emplean protocolos de cizallamiento, batimiento o choques, entre otros tipos de disruptores de muestras.

En algunas modalidades, los disruptores de muestras biológicas incluyen un disruptor enzimático. Los disruptores enzimáticos de interés pueden incluir, pero no se limitan a, enzimas digestivas proteolíticas y biomoléculas capaces de digerir desmosomas, elementos estromales de tejido así como adherencias extracelulares e intercelulares. Por ejemplo, las enzimas proteolíticas de interés para desagregar tejido pueden incluir tripsina, pepsina, papaína, colagenasa, elastasa, hialuronidasa, pronasa, quimotripsina, catalasa, dispasa, así como DNasa. La cantidad de disruptor enzimático empleado también variará en dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica, así como el grado de desagregación deseado y oscila de 0,001 mg/mL a 1000 mg/mL, tal como de 0,005 mg/mL a 500 mg/mL, tal como de 0,01 mg/mL a 250 mg/mL, tal como de 0,05 mg/mL a 100 mg/mL, tal como de 0,1 mg/mL a 90 mg/mL, tal como de 0,5 mg/mL a 75 mg/mL, tal como de 1 mg/mL a 50 mg/mL y que incluye de 5 mg/mL a 25 mg/mL.

En otras modalidades, los disruptores de muestras biológicas incluyen un disruptor químico. Los disruptores químicos de interés pueden incluir, pero no se limitan a, agentes quelantes, complejantes o secuestrantes capaces de disrumpir los desmosomas, el estroma tisular, así como la adhesión intercelular y la integridad de la superficie celular. En ciertas modalidades, los disruptores químicos se configuran para omitir o secuestrar iones de calcio o magnesio de una manera suficiente para interferir con la adhesión intercelular y la integridad de la superficie celular. Por ejemplo, los disruptores químicos de interés pueden incluir un agente quelante tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido tetraacético N,N,N',N' de etilenglicol-bis- (beta-aminoetil éter) (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanel- 1 -sulfónico (DMPS), y ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), fosfinas bidentadas tal como 2,2'-bis (difenilfosfino)-1,1'-binaftil (BINAP), bisfosfonatos y ácido cítrico. La cantidad de disruptor químico empleado también variará en dependencia del tipo y tamaño de la muestra biológica, así como el grado de desagregación deseado y oscila de 0,001 mg/mL a 1000 mg/mL, tal como de 0,005 mg/mL a 500 mg/mL, tal como de 0,01 mg/mL a 250 mg/mL, tal como de 0,05 mg/mL a 100 mg/mL, tal como de 0,1 mg/mL a 90 mg/mL, tal como de 0,5 mg/mL a 75 mg/mL, tal como de 1 mg/mL a 50 mg/mL y que incluye de 5 mg/mL a 25 mg/mL.

En algunas modalidades, los sistemas incluyen un disruptor de tejido mecánico que se configura para descomponer un órgano, tejido o recolección de fragmentos de tejido. Como se discutió anteriormente, los disruptores de tejido mecánicos pueden ser cualquier dispositivo conveniente usado para descomponer el tejido y liberar las células presentes en el tejido. Por ejemplo, los disruptores mecánicos de tejidos incluyen trituradores, mezcladores, homogeneizadores y también cizallas y batidores de tejidos.

En otras modalidades, los sistemas incluyen un disruptor de agregados celulares configurado para romper las células aglomeradas en la muestra biológica. Los disruptores de agregados celulares pueden ser cualquier dispositivo conveniente el cual sea capaz de romper las células aglomeradas en una recolección de células individuales. Por ejemplo, en estas modalidades, los disruptores de agregados celulares de interés pueden incluir un molino, un agitador de vórtice o un sonicador.

En ciertas modalidades, el disruptor de muestras biológicas es un contenedor o aparato de contacto el cual permite que la muestra biológica entre en contacto con un disruptor químico o enzimático. Por ejemplo, en algunas modalidades, el aparato de contacto es una cámara de muestra (por ejemplo, cerrada, sellada, hermética, abierta, de placa, etc.). En otras modalidades, el aparato de contacto es un contenedor tal como por ejemplo, un tubo de ensayo, un tubo de centrífuga, un tubo de cultivo, un microtubo, una jeringa, una pipeta, una placa de Petri, un matraz, un vaso de precipitados, una cubeta, o una botella.

Los sistemas objeto pueden incluir cualquier número deseado de disruptores de muestras biológicas, que incluyen dos o más disruptores, tales como 3 o más y que incluyen 4 o más disruptores. Cada disruptor puede ser el mismo o diferente y puede disponerse en cualquier configuración conveniente, tal como en una configuración en serie, una configuración en paralelo, o una combinación de las dos.

Los disruptores de muestras biológicas de interés pueden, en ciertos casos, configurarse como un dispositivo de flujo continuo. El disruptor de muestras biológicas de flujo continuo puede configurarse para incluir una cámara para disrumpir la muestra biológica a medida que la muestra biológica fluye a través del dispositivo así como uno o más conductos para transportar la muestra biológica dentro y fuera del disruptor. El disruptor puede tener 1 o más entradas y salidas según se desee. Por ejemplo, el disruptor puede tener 1 o más entradas, tal como 2 o más entradas, tal como 3 o más entradas y que incluye 5 o más entradas. En ciertas modalidades, el disruptor incluye entre 1 y 5 entradas, tal como entre 2 y 4 entradas y que incluye 3 entradas. El disruptor también puede tener 1 o más salidas, tal como 2 o más salidas, tal como 3 o más salidas y que incluye 5 o más salidas. En ciertas modalidades, el disruptor incluye entre 1 y 5 salidas, tal como entre 2 y 4 salidas y que incluye 3 salidas. Cuando los sistemas incluyen más de un disruptor de muestras biológicas, el número de entradas y salidas puede ser el mismo o diferente para cada disruptor.

Dispositivo concentrador acústico

El sistema de acuerdo con la invención incluye uno o más dispositivos concentradores acústicos. Los dispositivos concentradores acústicos de interés se configuran como un dispositivo de flujo continuo. El concentrador acústico de flujo continuo puede configurarse para incluir uno o más canales para transportar la muestra biológica dentro y fuera del concentrador acústico. Los canales pueden tener cualquier configuración conveniente. Mientras la forma de la sección transversal puede variar, en algunos casos, las formas de la sección transversal de los canales de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilíneas, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, por ejemplo, una porción inferior parabólica acoplada a una porción superior plana, etc. Las dimensiones del canal en el concentrador acústico pueden variar, tal como de 100-550 pm x 50-250 pm x 20 100 mm, tal como 150-500 pm x 75-200 pm x 25-75 mm, tal como 200-400 pm x 100-200 pm x 30-60 mm.

El concentrador acústico puede tener 1 o más entradas y salidas según se desee. Por ejemplo, el disruptor puede tener 1 o más entradas, tal como 2 o más entradas, tal como 3 o más entradas y que incluye 5 o más entradas. En ciertas modalidades, el disruptor incluye entre 1 y 5 entradas, tal como entre 2 y 4 entradas y que incluye 3 entradas.

El disruptor también puede tener 1 o más salidas, tal como 2 o más salidas, tal como 3 o más salidas y que incluye 5 o más salidas. En ciertas modalidades, el disruptor incluye entre 1 y 5 salidas, tal como entre 2 y 4 salidas y que incluye 3 salidas.

En algunas modalidades, los dispositivos concentradores acústicos pueden incluir, pero no se limitan a, los descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con número de serie 14/061,678 presentada el 23 de octubre de 2013 y publicada como US20140120570, Patente de los Estados Unidos con número 6,929,750; Laurell, y otros (2007) Chem. Soc. Rev. 2007, 36, 492-506; Petersson, y otros (2005) Analytical Chemistry 77: 1216-1221; y Augustsson, y otros (2009) Lab on a Chip 9: 801-818. En estas modalidades, los dispositivos concentradores acústicos operan de acuerdo con el método de Lund, donde las partículas en la muestra biológica disrumpida de diferentes tamaños se separan acústicamente en un microcanal de flujo laminar accionado ultrasónicamente usando un generador de campo acústico (por ejemplo, una cerámica piezoeléctrica). En ciertas modalidades, el ancho del canal corresponde a la mitad de la longitud de onda ultrasónica deseada, creando un resonador entre las paredes laterales del canal de flujo en el cual puede formarse una onda estacionaria. En estas modalidades, la onda estacionaria inducida se genera ortogonal al frente de onda ultrasónica incidente. Los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida con un factor O positivo se mueven durante el flujo a través del canal, por medio de la fuerza de radiación primaria axial (PRF), hacia el plano nodal de presión a lo largo del centro del canal, mientras que los componentes más pequeños de la muestra biológica disrumpida la muestra permanezca cerca de las paredes laterales. La separación de los componentes más grandes de los componentes más pequeños se completa, en ciertos casos, mediante una salida de canal dividida configurada para recolectar los componentes más grandes separados a través de una salida central y los componentes más pequeños a través de una o más salidas laterales. En algunas modalidades, la onda estacionaria acústica se enfoca al centro del canal de flujo. En estas modalidades, la onda estacionaria acústica se configura para propagarse dentro del canal aplicando una presión de radiación acústica dentro del canal de flujo. En ciertos casos, la onda estacionaria acústica aplicada no se propaga fuera del canal de flujo. En ciertas modalidades, el campo acústico se aplica solo en una única dirección mediante el transductor de vibración. Como tal, en estas modalidades el transductor de vibración no aplica simultáneamente campos acústicos en dos o más direcciones diferentes.

En algunas modalidades, la muestra biológica disrumpida comienza fluyendo a lo largo de los lados del canal. Se puede inducir una onda acústica estacionaria en el canal (por ejemplo, usando un generador de campo acústico, tal como un transductor piezoeléctrico, colocado adyacente al canal). La onda estacionaria acústica crea un nodo de presión en el centro del canal. Se ejerce una fuerza de radiación acústica sobre los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida, tal como tejido, fragmentos de tejido y células aglomeradas, y estos componentes se mueven hacia el centro del canal (es decir, el nodo de la onda acústica estacionaria), donde estos componentes se transportan a través del canal mediante un flujo laminar de tampón de lavado. Los componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida, tales como las células individuales, los restos celulares y las macromoléculas no celulares se retienen a lo largo de las paredes del canal y se transportan mediante un flujo de laminación diferente del tampón. En estas modalidades, al aplicar la onda acústica estacionaria a la muestra biológica disrumpida, los componentes más grandes se separan de los componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida dentro del canal del dispositivo concentrador acústico.

Dado que en estas modalidades, el flujo fluídico a través del dispositivo concentrador acústico se configura para que sea laminar, cuando se aplica un campo acústico al tejido, los fragmentos de tejido, los agregados de tejido, los agregados celulares y otros componentes aglomerados de la muestra biológica disrumpida se fuerzan al centro del canal en un laminado de tampón de lavado que fluye (es decir, el nodo de la onda acústica estacionaria). Estos componentes salen del dispositivo concentrador acústico a través de una salida de la muestra dedicada mientras que las células de la muestra biológica disrumpida retenidas en las corrientes de la muestra de laminación paralelas a lo largo de la pared del canal pueden dirigirse a dos o más salidas de la muestra alternativas.

Los dispositivos concentradores acústicos pueden fabricarse a partir de cualquier material rígido conveniente. En ciertos aspectos, uno o más canales de flujo se hacen mediante el grabado (por ejemplo, grabado anisotrópicamente) un canal en silicio, acero, vidrio (por ejemplo, vidrio Pyrex), Poli (metacrilato de metilo), policarbonato, o cualquier otro material conveniente. El(Los) canal(es) se puede(n) sellar usando una membrana sellada encima del canal. Puede usarse cualquier tipo de membrana conveniente, tal como vidrio (por ejemplo, vidrio de boro sílice). En ciertas modalidades, el canal de flujo consiste en vidrio pyrex. En otras modalidades, el canal de flujo consiste en vidrio de boro sílice. En algunas modalidades, el canal de flujo no incluye ninguna superficie reflectante dentro o a lo largo de la superficie la cual puede configurarse para reflejar o alterar la propagación de la onda acústica. En otras modalidades, el canal de flujo no incluye ningún agente de captura o grabado superficial para atrapar partículas a lo largo de la superficie del canal de flujo.

En ciertos aspectos, un generador de campo acústico se une al fondo del canal. Los generadores de campo acústico de interés incluyen, pero no se limitan a, transductores piezoeléctricos tales como PZT. En ciertos aspectos, el transductor piezoeléctrico es del tipo multicapa, pero también puede usarse un elemento piezoeléctrico bimorfo así como cualquier otro tipo de elemento generador de ultrasonidos con dimensiones adecuadas. En algunas modalidades, el transductor de vibración y el canal de flujo pueden integrarse juntos en el dispositivo concentrador acústico. En estas modalidades, el transductor de vibración y el canal de flujo forman un dispositivo concentrador acústico de un solo componente.

El generador de campo acústico puede tener cualquier forma deseable, y en algunos casos puede ser un transductor piezoeléctrico en forma de cubo o barra. En ciertas modalidades, el generador de campo acústico es un transductor piezoeléctrico en forma de cubo o barra que tiene una cara sustancialmente plana posicionada proximal al conducto del dispositivo concentrador acústico. Por "tener una cara sustancialmente plana" se entiende que el generador de campo acústico no envuelve (total o parcialmente) el conducto del dispositivo concentrador acústico. Como tal, en estas modalidades, el generador de campo acústico tiene forma de barra o de cubo y tiene una de las caras del borde plano posicionada proximal al conducto. En ciertas modalidades, la frecuencia de la onda acústica que se aplica corresponde al modo de resonancia fundamental del transductor de vibración (por ejemplo, aproximadamente 2MHz para muchas placas PZT). La frecuencia puede, en algunas modalidades, corresponder en cambio a un armónico del transductor de vibración, tal como un primer armónico, un segundo armónico, y similares. En varios aspectos, la frecuencia aplicada puede ser de aproximadamente 1,5 MHz o más, tal como 2 MHz o más, tal como 2,5 MHz o más, tal como 3 MHz o más, tal como 3,5 MHz o más, tal como 4 MHz o más, tal como 4,5 MHz 0 más, tal como 5 MHz o más, tal como 5,5 MHz o más y que incluye aproximadamente 6 MHz o más. Por ejemplo, la frecuencia de la onda acústica aplicada puede oscilar de 1,0 MHz a 6 MHz, tal como de 1,5 a 5,5 MHz, tal como de 2 MHz a 5 MHz, tal como de 2,5 a 4,5 MHz y que incluye de 3 MHz a 4 MHz. Un límite superior para la frecuencia de la onda acústica aplicada puede, en ciertos casos, ser 10 MHz o menos, tal como 7,5 MHz o menos, y que incluye 5 MHz o menos.

En ciertas modalidades, la amplitud de la onda acústica permanece constante cuando se aplica al flujo de la muestra en el dispositivo concentrador acústico. Como tal, en estas modalidades, la amplitud de la onda acústica aplicada se configura para aumentar o disminuir en un 2 % o menos cuando se aplica al flujo de la muestra en el dispositivo concentrador acústico, tal como en un 1,5 % o menos, tal como en un 1 % o menos, tal como en un 0,5 % o menos, tal como en un 0,25 % o menos, tal como en un 0,1 % o menos, tal como en un 0,05 % o menos y que incluye 0,01 % o menos.

La amplitud de la presión acústica de la onda acústica aplicada puede variar en dependencia de la densidad y la velocidad de las partículas y el fluido que fluye a través del dispositivo concentrador acústico y puede oscilar de 0,01 MPa a 1 MPa, tal como de 0,05 MPa a 0,95 MPa, tal como de 0,1 MPa a 0,9 MPa, tal como de 0,2 MPa a 0,8 MPa y que incluye de 0,25 MPa a 0,75 MPa.

En ciertas modalidades, un dispositivo concentrador acústico se controla mediante un procesador configurado para controlar el generador de campo acústico. El procesador puede contenerse dentro de una unidad de control o caja de control. Por ejemplo, el procesador puede configurarse para controlar el generador del campo acústico mediante la alteración de una o más de la forma, frecuencia y potencia de la energía eléctrica suministrada al generador del campo acústico.

El caudal de un dispositivo concentrador acústico puede variar. En ciertas modalidades, el caudal del dispositivo concentrador acústico se ajusta de manera que la salida del dispositivo concentrador acústico sea óptima para el monitoreo de retroalimentación (como se describió anteriormente), tal como 20 a 150 pL/min, que incluye 30 a 100 pL/min, tal como 40 a 60 pl/min. El caudal del dispositivo concentrador acústico puede ajustarse de manera que la salida del dispositivo concentrador acústico sea óptima para el análisis subsecuente mediante un dispositivo particular, tal como un clasificador de células. En ciertos aspectos, el dispositivo concentrador acústico se usa para reducir el caudal de otro componente del sistema, tal como un separador magnético como se describe a continuación, de manera que la salida del dispositivo concentrador acústico sea óptima para el análisis subsecuente. En ciertos aspectos, el caudal de un dispositivo concentrador acústico puede controlarse mediante la modulación de una o más bombas (por ejemplo, una bomba de jeringa, tal como una WPI sp210iwz distribuida por Instrumentos de precisión mundial Inc., Sarasota, FL) o válvulas (por ejemplo, válvulas de manguito). El caudal puede, en ciertas modalidades, controlarse mediante un procesador, tal como un procesador descrito anteriormente.

En ciertos aspectos, la velocidad a la cual uno o más dispositivos concentradores acústicos separan los componentes más grandes de los más pequeños en la muestra biológica disrumpida es de 1 pl/min o más. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la velocidad es de 10 pl/min o más, que incluyen 10 pl/min a 50 pl/min, 50 pl/min a 100 pl/min, 100 pl/min a 200 pl/min, 200 pl/min a 300 pl/min, 300 pl/min a 400 pl/min, 400 pl/min a 500 pl/min, 500 pl/min a 600 pl/min, 600 pl/min a 700 pl/min, 700 pl/min a 800 pl/min, 800 pl/min a 900 pl/min, 900 pl/min a 1 ml/min, 1 ml/min a 10 ml/min, 10 ml/min a 20 ml/min, 20 ml/min a 30 ml/min, 30 ml/min a 40 ml/min, 40 ml/min a 50 ml/min, 50 ml/min a 60 ml/min, 60 ml/min a 70 ml/min, 70 ml/min a 80 ml/min, 80 ml/min a 90 ml/min, 90 ml/min a 100 ml/min, 100 ml/min a 150 ml/min, 150 ml/min a 200 ml/min, 200 ml/min a 500 ml/min, o 500 ml/min a 1 L/min.

En ciertas modalidades, los dispositivos concentradores acústicos objeto se configuran para separar componentes de la muestra biológica disrumpida basada en el tamaño. Por ejemplo, en dependencia de los componentes de la muestra biológica disrumpida, el dispositivo concentrador acústico puede configurarse para separar los componentes los cuales tienen diámetros de 5 pm o más, tal como 10 pm o más, tal como 25 pm o más, tal como 50 |jm o más y que incluye 100 pm o más, tal como de 10 a 25 pm, tal como de 25 a 50 pm, tal como de 50 a 75 pm y que incluye de 75 a l00 pm. En algunas modalidades, el concentrador acústico se configura para variar la frecuencia y amplitud de la onda acústica de una manera suficiente para separar tejido, fragmentos de tejido y agregados celulares de células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida. En otras modalidades, el concentrador acústico se configura para variar la frecuencia y amplitud de la onda acústica de una manera suficiente para separar las células individuales de los restos celulares y las macromoléculas no celulares en la muestra biológica disrumpida.

En algunos casos, para lograr un caudal deseado, puede usarse una pluralidad de canales de separación paralelos en el dispositivo concentrador acústico. Por ejemplo, en ciertas modalidades se usan dos o más canales de separación paralelos, que incluyen 3 o más, tal como 5 o más, 8 o más, 15 o más, 25 o más, 40 o más, 60 o más, 80 o más, 100 o más, 125 o más, 150 o más, 200 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más, o 1000 o más. Los canales de separación pueden contenerse en uno o más chips, tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 50 o más, o 100 o más. Además, puede usarse una pluralidad de transductores de vibración, tal como 2 o más, 5 o más, o 10 o más. En ciertas modalidades, el dispositivo concentrador acústico incluye un solo transductor, tal como un solo transductor piezoeléctrico.

En algunas modalidades, los sistemas objeto pueden contener dos o más dispositivos concentradores acústicos, tales como 3 o más, que incluyen 4 o más, 5 o más, 6 o más, o de 7 a 10. Cuando los sistemas incluyen 2 o más dispositivos concentradores acústicos, los dispositivos concentradores acústicos pueden disponerse en cualquier configuración conveniente, tal como en una configuración en serie, una configuración en paralelo, o una combinación de las dos. Además, cuando un dispositivo objeto contiene 2 o más dispositivos concentradores acústicos, los dispositivos concentradores acústicos pueden ser sustancialmente idénticos, idénticos, o heterogéneos (por ejemplo, diferir en una o más formas, tal como en las dimensiones del canal de flujo, el voltaje aplicado, la frecuencia de oscilación, etc.). Cuando los sistemas incluyen más de un dispositivo concentrador acústico, el número de entradas y salidas puede ser el mismo o diferente para cada concentrador acústico.

En ciertos casos, los sistemas objeto incluyen al menos dos dispositivos concentradores acústicos, donde un primer dispositivo concentrador acústico, como se describió anteriormente, se configura para separar los componentes más grandes (por ejemplo, tejido, agregados de tejido, agregados celulares) de los componentes más pequeños (células, restos celulares, macromoléculas no celulares) en la muestra biológica disrumpida y un segundo dispositivo concentrador acústico configurado para separar las células de los restos celulares y macromoléculas no celulares en muestras de células recolectadas del primer dispositivo concentrador acústico. Las muestras de células se transportan desde una salida del primer dispositivo concentrador acústico a una entrada del segundo dispositivo concentrador acústico a través de uno o más conductos. En ciertas modalidades, los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan a través del segundo dispositivo concentrador acústico a lo largo de los lados del canal mientras que las células se enfocan al centro del canal. El fluido que transporta los restos celulares y las macromoléculas no celulares y el fluido que transporta las células operan bajo flujo laminar.

Se posiciona un transductor proximal al conducto y se activa para crear una onda acústica estacionaria. En estas modalidades, la onda estacionaria aplicada ejerce una presión de radiación acústica a las células suficiente para mover las células hacia el nodo de presión formado en el centro del conducto (por ejemplo, a una zona de enfoque en el tampón que fluye). En modalidades de la presente descripción, la onda acústica estacionaria aplicada es suficiente para separar las células de los restos celulares tal como células muertas o lisadas, fragmentos celulares y orgánulos libres, así como de macromoléculas no celulares tal como enzimas, proteínas, lípidos y fragmentos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los métodos pueden incluir concentrar las células en el nodo de la onda acústica estacionaria en el tampón de flujo mientras se retienen las enzimas y moléculas no celulares usadas para disrumpir la muestra biológica (es decir, disruptores enzimáticos) a lo largo de los lados del conducto del dispositivo concentrador acústico. Entonces las células se llevan a cabo del segundo dispositivo concentrador acústico y se recolectan a través de una salida central. Los restos celulares separados y las macromoléculas no celulares llevan a cabo del segundo dispositivo concentrador acústico y se recolectan a través de dos o más salidas laterales. Un ejemplo de separación de células de restos celulares y macromoléculas no celulares usando un segundo dispositivo concentrador acústico según se ilustra en la Figura 6. En particular, la Figura 6 ilustra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica que tiene un dispositivo separador magnético, un primer dispositivo concentrador acústico y un segundo dispositivo concentrador acústico. El sistema 600 incluye un disruptor de muestras 602 para disrumpir una muestra biológica 601. La muestra biológica disrumpida se hace fluir usando la bomba 603a a través del dispositivo separador magnético 607 posicionado entre y en comunicación fluídica con el disruptor de muestras 602 y el primer dispositivo concentrador acústico 604 que tiene un transductor piezoeléctrico 604a para separar los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños para producir la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada 601b se evalúa con un monitor de retroalimentación que tiene una fuente de luz láser 605a y un detector de dispersión láser 605b para determinar el grado de agregación en la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada se dirige subsecuentemente a través de una o más salidas del dispositivo concentrador acústico 604 donde los componentes más grandes los cuales requieren un posterior procesamiento (por ejemplo, tejido, fragmentos de tejido, agregados celulares, etc.) se retroalimentan al disruptor de muestras 602, mientras que los componentes más pequeños (por ejemplo, células, restos celulares y macromoléculas no celulares) se transportan al segundo concentrador acústico 609 que tiene un segundo transductor piezoeléctrico 609a para separar las células de los restos celulares y macromoléculas no celulares. Las células separadas de los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan al depósito de almacenamiento 606 usando la bomba 603b mientras que los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan usando la bomba 603d al contenedor de desechos 610. El sistema 600 también incluye el tampón de desagregación 608 transportado usando la bomba 603c a través del primer dispositivo concentrador acústico para separar los componentes más grandes de los componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida y el tampón de lavado 611 transportado usando la bomba 603e a través del segundo dispositivo concentrador acústico para separar las células de los restos celulares y macromoléculas no celulares. Las células separadas transportadas al depósito de almacenamiento 606 pueden formarse imágenes usando el detector de imágenes 612.

Los dispositivos concentradores acústicos descritos anteriormente pueden contener también en algunos aspectos uno o más componentes adicionales. Los ejemplos de tales componentes incluyen, pero no se limitan a, una o más válvulas (por ejemplo, válvulas de manguito, y similares), depósitos (por ejemplo, depósitos de muestras, depósitos de lavado, depósitos de desechos, y similares), bombas (por ejemplo, bombas de jeringa, bombas peristálticas, y similares), tubos de conexión (por ejemplo, tubos de silicona), carcasas, procesadores, y similares.

Dispositivo de separación magnética

En ciertas modalidades, los sistemas incluyen además un dispositivo de separación magnética. Los dispositivos de separación magnética de interés se configuran para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente (por ejemplo, fracciones que no se asocian con una etiqueta magnética) en la muestra biológica disrumpida.

El flujo a través del dispositivo separador magnético puede, en ciertos casos, estar sustancialmente libre de flujo laminar. Por sustancialmente libre de flujo laminar se entiende que el flujo fluídico a través del conducto del dispositivo separador magnético se caracteriza por una única corriente de flujo y está ausente cualquier corriente de flujo de laminación. Como tal, en estas modalidades, la muestra fluídica se hace fluir a través del dispositivo de separación magnética en ausencia de fluidos de vaina de laminación. La dinámica de fluidos del flujo fluídico a través del dispositivo separador magnético puede caracterizarse por un flujo sustancialmente turbulento. El término "flujo turbulento" se usa en su sentido convencional para significar que el flujo de fluido es un flujo único el cual no incluye ningún flujo de laminación tal como el flujo del tampón de lavado laminar.

La Figura 7 ilustra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica que tiene un dispositivo separador magnético de acuerdo con ciertas modalidades de la presente descripción. El sistema 700 incluye un disruptor de muestras 702 para disrumpir una muestra biológica 701. La muestra biológica disrumpida se hace fluir usando la bomba 703a a través del dispositivo separador magnético 707 posicionado entre y en comunicación fluídica con el disruptor de muestras 702 y el dispositivo concentrador acústico 704 que tiene un transductor piezoeléctrico 704a para separar los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños para producir la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada se evalúa con un monitor de retroalimentación que tiene una fuente de luz láser 705a y un detector de dispersión láser 705b para determinar el grado de agregación en la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada se dirige subsecuentemente a través de una o más salidas del dispositivo concentrador acústico 704 donde los componentes más grandes los cuales requieren un posterior procesamiento (por ejemplo, tejido, fragmentos de tejido, agregados celulares, etc.) se retroalimentan al disruptor de muestras 702, mientras que los componentes más pequeños (por ejemplo, células individuales, restos celulares y macromoléculas no celulares) se recolectan en el depósito de almacenamiento 706 usando la bomba 703b. El sistema 700 también incluye el tampón de desagregación 708 para hacer fluir el tampón usando la bomba 703c a través del dispositivo concentrador acústico para separar los componentes más grandes de los componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida.

Los ejemplos de dispositivos de separación magnética de interés incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con número de serie 14/061,678 presentada el 23 de octubre de 2013 publicada como US20140120570, las Patentes de los Estados Unidos con números 5,945,281, 6,858,440; 6,645,777; 6,630,355; y6,254,830; la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con número PCT/US2012/032423 publicada como WO2012032423; yHoeppener, y otros (2012) Recent Results Cancer Res. 195:43-58.

Los dispositivos de separación magnética pueden incluir una o más fuentes del campo magnético configuradas para producir un campo magnético. En ciertos casos, la fuente del campo magnético produce un campo magnético no homogéneo. Por "no homogéneo" se entiende que el campo magnético tiene un gradiente del campo magnético, donde la intensidad del campo magnético es diferente en dependencia de la posición dentro del campo magnético. Por ejemplo, el campo magnético puede tener un gradiente del campo magnético, donde la intensidad del campo magnético es mayor en un área y disminuye gradualmente en posiciones más alejadas de esa área. Por lo tanto, la fuente del campo magnético puede configurarse para producir un campo magnético que tenga un gradiente del campo magnético.

En algunos casos, un dispositivo de separación magnética se configura para producir un campo magnético suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente en la muestra. La capacidad del campo magnético para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente en la muestra puede depender de varios parámetros, tales como la intensidad del campo magnético, el gradiente del campo magnético, el tipo de etiqueta magnética, el tamaño de la etiqueta magnética, la distancia entre las fracciones etiquetadas magnéticamente y la fuente del campo magnético, etc. En ciertos casos, la fuerza que el campo magnético es capaz de ejercer sobre una etiqueta magnética es proporcional a la intensidad del campo magnético y al gradiente del campo magnético. En algunos casos, la fuente del campo magnético se configura para producir un campo magnético que tiene una fuerza magnética suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra. Por ejemplo, la fuente del campo magnético puede configurarse para producir un campo magnético que tenga un gradiente del campo magnético de manera que el producto del campo magnético y el gradiente del campo magnético sea suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra.

La fuente del campo magnético puede tener cualquier forma que pueda facilitar la separación de las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra. Por ejemplo, la fuente del campo magnético puede alargarse, de manera que la fuente del campo magnético tenga una longitud mayor que el ancho transversal de la fuente del campo magnético.

En ciertas modalidades, puede configurarse un dispositivo de separación magnética para dirigir un flujo de la muestra a través del dispositivo de separación magnética de manera que el flujo de la muestra este proximal a la fuente del campo magnético. Minimizar la distancia entre la fuente del campo magnético y la muestra, y minimizar de esta manera la distancia entre la fuente del campo magnético y las fracciones etiquetadas magnéticamente en la muestra puede facilitar la retención de las fracciones etiquetadas magnéticamente en el dispositivo de separación magnética. En algunos casos, se configura un dispositivo de separación magnética para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo para maximizar la longitud de la trayectoria del flujo que está proximal a la fuente del campo magnético. Por ejemplo, el dispositivo puede configurarse para dirigir el flujo de la muestra a través de un dispositivo de separación magnética de manera que el flujo de la muestra sea sustancialmente paralelo al eje longitudinal de la fuente del campo magnético.

En ciertas modalidades, un dispositivo de separación magnética incluye una fuente del campo magnético. En algunos casos, la fuente del campo magnético se configura para producir un campo magnético suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra. Por ejemplo, la fuente del campo magnético puede configurarse para producir un campo magnético suficiente para retener las fracciones etiquetadas magnéticamente en el dispositivo. En modalidades que incluyen una fuente del campo magnético, se puede configurar un dispositivo de separación magnética para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo de manera que la muestra fluya a través de un área cercana a la fuente del campo magnético. En algunos casos, se configura un dispositivo de separación magnética para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo de manera que el flujo de la muestra sea sustancialmente paralelo a un eje longitudinal de la fuente del campo magnético. También se puede configurar un dispositivo de separación magnética para dirigir el flujo de la muestra a través de un área cercana a la fuente del campo magnético, donde el campo magnético y el gradiente del campo magnético producido por la fuente del campo magnético pueden ser más intensos.

En otras modalidades, un dispositivo de separación magnética incluye dos fuentes del campo magnético, aunque un dispositivo de separación magnética puede incluir cualquier número de fuentes del campo magnético, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 o más fuentes del campo magnético según se desee. Por ejemplo, un dispositivo de separación magnética puede incluir una primera fuente del campo magnético y una segunda fuente del campo magnético. En algunos casos, la primera fuente del campo magnético y la segunda fuente del campo magnético se configuran para producir un campo magnético no homogéneo (por ejemplo, un campo magnético que tiene un gradiente del campo magnético) suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente y formar las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra. La primera fuente del campo magnético y la segunda fuente del campo magnético pueden configurarse para producir un campo magnético suficiente para retener las fracciones etiquetadas magnéticamente en el dispositivo. En ciertas modalidades, la primera y segunda fuentes del campo magnético se disponen de manera que se produzca un campo magnético en un área entre las fuentes del campo magnético. Como tal, la primera y segunda fuentes del campo magnético pueden configurarse para producir un campo magnético suficiente para retener las fracciones etiquetadas magnéticamente en un área entre las fuentes del campo magnético.

En ciertas modalidades, la primera fuente del campo magnético tiene una superficie orientada hacia la segunda fuente del campo magnético, y la segunda fuente del campo magnético tiene una superficie orientada hacia la primera fuente del campo magnético, de manera que estas dos superficies se oponen entre sí. La superficie de la primera fuente del campo magnético orientada hacia la segunda fuente del campo magnético puede ser sustancialmente plana. De manera similar, la superficie de la segunda fuente del campo magnético orientada hacia a la primera fuente del campo magnético puede ser sustancialmente plana. En algunos casos, las superficies de la primera fuente del campo magnético y la segunda fuente del campo magnético orientadas entre sí son sustancialmente paralelas entre sí. En estos casos, las superficies opuestas de la primera y segunda fuentes del campo magnético pueden estar a una distancia sustancialmente uniforme entre sí. En otras modalidades, las superficies opuestas de la primera y segunda fuentes del campo magnético no son paralelas entre sí, de manera que un extremo de la primera fuente del campo magnético está más cerca de la segunda fuente del campo magnético que el extremo opuesto de la primera fuente del campo magnético. En algunos casos, la primera fuente del campo magnético y la segunda fuente del campo magnético se alargan. El eje longitudinal de la primera fuente del campo magnético puede ser sustancialmente paralelo al eje longitudinal de la segunda fuente del campo magnético.

En modalidades que incluyen una primera fuente del campo magnético y una segunda fuente del campo magnético, los vectores de magnetización de la primera fuente del campo magnético y la segunda fuente del campo magnético pueden alinearse sustancialmente en la misma dirección. En algunos casos, tener una primera fuente del campo magnético y una segunda fuente del campo magnético con vectores de magnetización alineados sustancialmente en la misma dirección facilita la formación de un campo magnético y un gradiente del campo magnético en un área entre la primera y segunda fuentes del campo magnético. En ciertas modalidades, el vector de magnetización de la primera fuente de campo magnético es sustancialmente perpendicular a la superficie que mira hacia la segunda fuente de campo magnético. En algunos casos, el vector de magnetización de la segunda fuente de campo magnético es sustancialmente perpendicular a la superficie que mira hacia la primera fuente de campo magnético. En ciertos casos, los vectores de magnetización de la primera y segunda fuentes de campo magnético son sustancialmente perpendiculares a las superficies de la primera y segunda fuentes de campo magnético que se enfrentan entre sí y están alineadas sustancialmente en la misma dirección.

En modalidades que incluyen fuentes de campo magnético primera y segunda, el dispositivo puede configurarse para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo de manera que la muestra fluya a través de un área entre la primera fuente de campo magnético y la segunda fuente de campo magnético. En algunos casos, como se describió anteriormente, la primera y segunda fuentes del campo magnético se alinean de manera que sus ejes longitudinales son sustancialmente paralelos. En estos casos, el dispositivo puede configurarse para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo de manera que el flujo de la muestra sea sustancialmente paralelo a los ejes longitudinales de la primera y segunda fuentes del campo magnético. El dispositivo también puede configurarse para dirigir el flujo de la muestra a través de un área entre la primera y segunda fuentes del campo magnético, donde el campo magnético y el gradiente del campo magnético producido por la primera y segunda fuentes del campo magnético pueden ser más intensos.

La fuente del campo magnético puede incluir un imán permanente, un electroimán, un imán superconductor, combinaciones de los mismos, y similares. En ciertas modalidades, la fuente del campo magnético incluye uno o más imanes permanentes. Un "imán permanente" es un material magnético que tiene un campo magnético persistente de manera que el campo magnético no disminuye sustancialmente con el tiempo. Por el contrario, el término "imán blando" se refiere a un material que puede magnetizarse en presencia de un campo magnético externo aplicado, pero cuyo magnetismo disminuye sustancialmente cuando se elimina el campo magnético externo. En modalidades donde la fuente del campo magnético incluye uno o más imanes permanentes, el uso de imanes permanentes puede facilitar la producción de un campo magnético sin la necesidad de una entrada de energía externa en el dispositivo para alimentar la fuente del campo magnético. En algunos casos, un imán permanente cuesta menos que un electroimán o un imán superconductor que produce un campo magnético con una intensidad y un gradiente del campo magnético sustancialmente similares. En estos casos, el uso de un imán permanente puede reducir el costo de la fuente del campo magnético, y por lo tanto reducir el costo total del dispositivo de separación magnética. En ciertos casos, cuando la fuente del campo magnético incluye uno o más imanes permanentes, el uso de un imán permanente puede facilitar la producción de un dispositivo de separación magnética que es menos complejo que un dispositivo de separación magnética que incluye un electroimán y/o un imán superconductor. Por ejemplo, las modalidades del dispositivo que incluyen un imán permanente pueden no necesitar incluir componentes asociados con un electroimán y/o un imán superconductor, tal como una fuente de alimentación, circuitos eléctricos asociados con la fuente del campo magnético, componentes de enfriamiento asociados con el electroimán y/o el imán superconductor, sensores de temperatura, y similares. En ciertas modalidades, el dispositivo de separación magnética objeto no incluye un electroimán o un imán superconductor.

En algunos casos, la fuente del campo magnético incluye dos o más imanes permanentes. Los imanes permanentes pueden tener cualquier forma deseable, y en algunos casos pueden ser imanes permanentes en forma de cubo o barra. En ciertas modalidades, el imán permanente es un imán en forma de cubo o barra que tiene una cara sustancialmente plana posicionada proximal al conducto del dispositivo de separación magnética. Por tener "una cara sustancialmente plana" se entiende que el imán permanente no se envuelve (total o parcialmente) alrededor del conducto del dispositivo de separación magnética. Como tal, en estas modalidades, el imán es un imán permanente en forma de barra o en forma de cubo que tiene una de las caras del borde plano del imán el cual se posiciona adyacente al conducto.

En ciertos casos, la fuente del campo magnético puede tener una longitud que oscila de 1 cm a 100 cm, tal como de 1 cm a 75 cm, que incluye de 1 cm a 50 cm, o de 1 cm a 25 cm, o de 1 cm a 10 cm, o de 5 cm a 10 cm, por ejemplo de 5 cm a 6 cm; un ancho que oscila de 0,1 cm a 100 cm, tal como de 0,1 cm a 75 cm, que incluye de 0,1 cm a 50 cm, o de 0,1 cm a 25 cm, o de 0,1 cm a 10 cm, o de 0,1 cm a 5 cm, o de 0,1 cm a 2 cm, o de 0,5 cm a 2 cm, por ejemplo de 1 cm a 1,5 cm; y una altura que oscila de 0,1 cm a 100 cm, tal como de 0,1 cm a 75 cm, que incluye de 0,1 cm a 50 cm, o de 0,1 cm a 25 cm, o de 0,1 cm a 10 cm, o de 0,1 cm a 5 cm, o de 0,1 cm a 2 cm, o de 0,5 cm a 2 cm, por ejemplo de 1 cm a 1,5 cm. En ciertas modalidades, la longitud de la fuente del campo magnético oscila de 3 cm a 5 cm.

La fuente del campo magnético puede ser un imán permanente, tal como un imán de tierras raras. Los imanes de tierras raras incluyen, pero no se limitan a, imanes de samario-cobalto (por ejemplo, SmCos), imanes de aleación de neodimio (NdFeB) (por ejemplo, Nd²Fe-MB), y similares.

En ciertas modalidades, la fuente del campo magnético produce un campo magnético que oscila de 0,01 T a 10 T, o de 0,01 T a 5 T, o de 0,01 T a 2 T, o de 0,1 T a 2 T, o de 0,1 T a 1,5 T, que incluye de 0,1 T a 1 T. En algunos casos, la fuente del campo magnético se configura para producir un campo magnético con un gradiente del campo magnético (por ejemplo, un gradiente del campo absoluto) que oscila de 0,1 T/mm a 10 T/mm, tal como de 0,1 T/mm a 7 T/mm, o de 0,1 T/mm a 5 T/mm, o de 0,1 T/mm a 3 T/mm, tal como de 0,1 T/mm a 2 T/mm, que incluye de 0,1 T/mm a 1 T/mm. En ciertos casos, la fuente del campo magnético produce un campo magnético que tiene un gradiente del campo magnético tal que el producto del campo magnético y el gradiente del campo magnético (por ejemplo, gradiente del campo absoluto) oscilan de 0,001 T2/mm a 100 T2/mm, tales como de 0,01 T2/mm a 75 T2/mm, que incluyen de 0,1 T2/mm a 50 T2/mm, o de 0,1 T2/mm a 25 T2/mm, o de 0,1 T2/mm a 10 T2/mm, o de 0,1 T2/mm a 5 T2/mm, o de 0,1 T2/mm a 3 T2/mm, tales como de 0,1 T2/mm a 2 T2/mm, que incluyen de 0,1 T2/mm a 1 T2/mm.

El dispositivo de separación magnética objeto también puede incluir una o más guías del campo magnético. La guía del campo magnético puede configurarse para dirigir el campo magnético desde la fuente del campo magnético a la trayectoria del flujo de la muestra. En ciertos casos, la guía del campo magnético se configura para enfocar el campo magnético producido por la fuente del campo magnético. La guía del campo magnético puede enfocar el campo magnético aumentando el flujo magnético de la fuente del campo magnético, donde el flujo magnético es la cantidad del campo magnético (por ejemplo, la densidad del campo magnético) que pasa a través de un área de superficie dada. El flujo magnético puede depender de la intensidad del campo magnético, el área de la superficie y el ángulo entre el campo magnético y la superficie. Por ejemplo, la guía del campo magnético puede enfocar el campo magnético, y por lo tanto aumentar el flujo magnético, dirigiendo el campo magnético a través de un área más pequeña. En algunos casos, dirigir el campo magnético a través de un área más pequeña aumenta la densidad del campo magnético, lo que resulta en un aumento del flujo magnético. Las guías del campo magnético se configuran para aumentar la densidad del campo magnético, en ciertas modalidades, en el 5 % o más en comparación con la densidad del campo magnético en ausencia de las guías del campo magnético, tal como el 10 % o más, tal como el 25 % o más, tal como el 50 % o más, tal como el 75 % o más, tal como el 90 % o más y que incluye el 95 % o más en comparación con la densidad del campo magnético en ausencia de las guías del campo magnético. Por ejemplo, en estos casos las guías del campo magnético pueden configurarse para aumentar la densidad del campo magnético del 5 % al 95 %, tal como del 10 % al 90 %, tal como del 15 % al 85 %, tal como del 20 % al 80 % y que incluye del 25 % al 75 %. En otras modalidades, las guías del campo magnético se configuran para aumentar la densidad del campo magnético en 2 veces o mayor en comparación con la densidad del campo magnético en ausencia de las guías del campo magnético, tal como 3 veces o mayor, tal como 4 veces o mayor, tal como 5 veces o mayor y que incluye 10 veces o mayor en comparación con la densidad del campo magnético en ausencia de las guías del campo magnético. Por ejemplo, en estos casos las guías del campo magnético pueden configurarse para aumentar la densidad del campo magnético de 2 a 10 veces, tal como de 3 a 9 veces, tal como de 4 a 8 veces y que incluye de 5 a 7 veces.

La fuente del campo magnético y la guía del campo magnético pueden configurarse para producir un flujo magnético suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en una muestra. En algunos casos, la guía del campo magnético se configura para producir un campo magnético que tiene una densidad de flujo magnético que oscila de 0,01 T a 10 T, o de 0,01 T a 5 T, o de 0,01 T a 2 T, tal como de 0,1 T a 2 T, que incluye de 0,5 T a 1,5 T.

En ciertos casos, la guía del campo magnético se configura para dirigir el campo magnético desde la fuente del campo magnético a la trayectoria del flujo de la muestra con una pérdida mínima de flujo magnético. En algunos casos, la guía del campo magnético se configura para dirigir el campo magnético desde la fuente del campo magnético a la trayectoria del flujo de la muestra sin sustancialmente ninguna pérdida de flujo magnético. Sin ninguna intención de limitarse por la teoría, la guía del campo magnético puede configurarse para minimizar la disminución del flujo magnético debido a los campos de autodesmagnetización presentes en un imán blando cerca de las superficies del imán blando. Por ejemplo, la guía del campo magnético puede configurarse para dirigir el campo magnético desde la fuente del campo magnético a la trayectoria del flujo de la muestra con una disminución en el flujo magnético del 50 % o menos del flujo magnético inicial, tal como del 40 % o menos, que incluye el 30 % o menos, o el 25 % o menos, o el 20 % o menos, o el 15 % o menos, o el 10 % o menos, o el 7 % o menos, o el 5 % o menos, por ejemplo el 3 % o menos, o el 2 % o menos, o el 1 % o menos del flujo magnético inicial.

En ciertas modalidades, la guía del campo magnético se configura para enfocar el campo magnético que tiene una porción con forma cónica y que dirige el campo magnético desde la fuente del campo magnético a través de la porción cónica de la guía del campo magnético. Por "cónica" se entiende que una porción de la guía del campo magnético tiene un extremo más ancho con un área de sección transversal más grande y el área de sección transversal de la porción de la guía del campo magnético se vuelve progresivamente más pequeña hacia un extremo opuesto más estrecho de la guía del campo magnético. Por ejemplo, la guía del campo magnético puede tener una porción en forma de cuña, donde la base de la porción en forma de cuña tiene un área. Las secciones transversales de la porción en forma de cuña tomadas paralelas a la base de la porción en forma de cuña tendrán áreas progresivamente más pequeñas hacia el extremo de la porción en forma de cuña opuesta a la base (es decir, hacia el borde del vértice de la porción en forma de cuña).

En algunos casos, la guía del campo magnético tiene una porción en forma de cuña y se configura para dirigir el campo magnético desde la base de la porción en forma de cuña al borde del vértice de la porción en forma de cuña. Dirigir el campo magnético desde la base de la porción en forma de cuña al borde del vértice de la porción en forma de cuña puede facilitar un aumento en el flujo magnético del campo magnético de la fuente del campo magnético, como se describió anteriormente. Un aumento en el flujo magnético en el borde del vértice de la porción en forma de cuña de la guía del campo magnético puede producir un campo magnético más alto y un gradiente del campo magnético más alto proximal al borde del vértice de la guía del campo magnético que estaría presente en ausencia de la guía del campo magnético. Son posibles otras formas cónicas para la guía del campo magnético, tales como, pero sin limitarse a, la pirámide, cono, tronco, combinaciones de las mismas, y similares.

En algunos casos, la guía del campo magnético incluye una porción que se estrecha hasta un punto o un borde (por ejemplo, el borde del vértice). Por ejemplo, un perfil en sección transversal de la guía del campo magnético puede estrecharse hasta un punto en el borde del vértice de la guía del campo magnético. En otras modalidades, el perfil en sección transversal de la guía del campo magnético se estrecha hasta un borde redondeado de manera que el borde del vértice tiene un perfil en sección transversal redondeado (por ejemplo, arqueado) en el borde del vértice. El término "en forma de cuña", como se usa en la presente descripción se entiende que incluye las modalidades de la guía del campo magnético que tienen un borde del vértice con un perfil de sección transversal que se estrecha hasta un punto en el borde del vértice. El término "en forma de cuña" también incluye modalidades de la guía del campo magnético que tienen un borde del vértice con un perfil en sección transversal que no se estrecha hasta un punto en el borde del vértice. Por ejemplo, el borde del vértice de la guía del campo magnético puede tener un perfil en sección transversal redondeado, truncado, desafilado, y similares. El borde del vértice de la guía del campo magnético puede tener un ancho que sea aproximadamente el mismo que el ancho (o diámetro) de un conducto posicionado adyacente al borde del vértice de la guía del campo magnético. En ciertas modalidades, el borde del vértice de la guía del campo magnético tiene un ancho que es menor que el ancho (o diámetro) del conducto. En algunos casos, el ancho del borde del vértice de la guía del campo magnético es de 5 mm o menos, tal como 4 mm o menos, o 3 mm o menos, o 2 mm o menos, o 1 mm o menos, o 0,5 mm o menos, o 0,1 mm o menos.

En ciertos casos, el borde del vértice de una porción en forma de cuña de la guía del campo magnético tiene un ángulo del vértice, donde el ángulo del vértice es el ángulo entre las dos caras de la guía del campo magnético que se encuentran en el borde del vértice. En algunos casos, el ángulo del vértice es de 150 grados o menos, o 135 grados o menos, tal como 120 grados o menos, o 105 grados o menos, que incluye 90 grados o menos, o 75 grados o menos, o 60 grados o menos, o 45 grados o menos, por ejemplo 30 grados o menos. En algunas modalidades, el ángulo del vértice es de 60 grados.

En ciertas modalidades, el borde del vértice de la guía del campo magnético puede ser sustancialmente paralelo a un eje longitudinal de la guía del campo magnético. Además, el borde del vértice de la guía del campo magnético puede ser sustancialmente paralelo a un eje longitudinal de la fuente del campo magnético. En modalidades con una fuente del campo magnético, la fuente del campo magnético puede tener una o más guías del campo magnético asociadas con la fuente del campo magnético. Por ejemplo, la fuente del campo magnético puede tener una primera guía del campo magnético y una segunda guía del campo magnético asociada con la fuente del campo magnético. En algunas modalidades, el dispositivo incluye una primera guía del campo magnético dispuesta sobre una primera superficie de la fuente del campo magnético, y una segunda guía del campo magnético dispuesta sobre una segunda superficie de la misma fuente del campo magnético. En algunos casos, las guías del campo magnético primera y segunda se disponen sobre superficies opuestas de la fuente del campo magnético. En ciertas modalidades, la primera guía del campo magnético tiene forma de cuña con un primer borde del vértice, la segunda guía del campo magnético tiene forma de cuña con un segundo borde del vértice, y el primer borde del vértice se alinea sustancialmente al frente y paralelo al segundo borde del vértice. El primer borde del vértice se puede posicionar a una distancia sustancialmente uniforme a lo largo de su longitud desde el segundo borde del vértice. En algunos casos, la fuente del campo magnético incluye un imán permanente, como se describió anteriormente, y la primera y segunda superficies de la fuente del campo magnético son los polos norte y sur de la fuente del campo magnético.

En modalidades con más de una fuente del campo magnético, cada fuente del campo magnético se le puede asociar una guía del campo magnético. Cada guía del campo magnético puede posicionarse de manera que el eje longitudinal de la guía del campo magnético sea sustancialmente paralelo al eje longitudinal de la fuente del campo magnético a la cual se asocia.

En ciertas modalidades, el borde del vértice de la guía del campo magnético tiene un perfil lineal. Por "lineal" se entiende que el borde del vértice de la guía del campo magnético es sustancialmente recto. En algunos casos, el borde del vértice de la guía del campo magnético tiene un perfil no lineal, tal como, pero no limitado a, un perfil de diente de sierra, sinusoidal, de onda cuadrada, de onda triangular, combinaciones de los mismos, y similares. Una guía del campo magnético que tiene un borde del vértice con un perfil no lineal puede facilitar un aumento local en el campo magnético y/o el gradiente del campo magnético cerca de las porciones no lineales del borde del vértice.

La guía del campo magnético puede ser proximal a la fuente del campo magnético. En ciertos casos, la guía del campo magnético entra en contacto con la fuente del campo magnético. Por ejemplo, la guía del campo magnético puede unirse a la fuente del campo magnético para facilitar el contacto entre la guía del campo magnético y la fuente del campo magnético. Como se describió anteriormente, un dispositivo de separación magnética puede incluir una fuente del campo magnético. En estas modalidades, la fuente del campo magnético puede incluir una porción en forma de cuña como se describió anteriormente. La fuente del campo magnético también puede incluir una porción extendida entre la porción en forma de cuña y la fuente del campo magnético. La porción extendida de la guía del campo magnético puede configurarse para posicionar la porción en forma de cuña a una distancia lejos de la superficie de la fuente del campo magnético. Por ejemplo, la porción extendida de la guía del campo magnético puede entrar en contacto con la fuente del campo magnético en una parte de una primera superficie de la porción extendida de la guía del campo magnético. La porción extendida de la guía del campo magnético puede extenderse una distancia por encima de la superficie superior de la fuente del campo magnético. La parte de la primera superficie de la porción extendida de la guía del campo magnético que se extiende por encima de la superficie superior de la fuente del campo magnético puede tener la porción en forma de cuña de la guía del campo magnético. En algunas modalidades, la porción extendida y la porción en forma de cuña de la guía del campo magnético son contiguas (por ejemplo, formadas a partir de la misma pieza de material). En otros casos, la porción extendida y la porción en forma de cuña de la guía del campo magnético son piezas separadas que se unen entre sí. Como se describió anteriormente, el dispositivo también puede incluir una segunda guía del campo magnético dispuesta sobre una superficie de la fuente del campo magnético opuesta a la primera guía del campo magnético. Similar a la primera guía del campo magnético descrita anteriormente, la segunda guía del campo magnético puede incluir una porción extendida y una porción en forma de cuña. Las primeras y segundas guías del campo magnético pueden configurarse de manera que el borde del vértice de la porción en forma de cuña de la primera guía del campo magnético esté proximal al borde del vértice de la porción en forma de cuña de la segunda guía del campo magnético. En algunos casos, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético es sustancialmente paralelo al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. El borde del vértice de la primera guía del campo magnético puede alinearse frente al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. Por ejemplo, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético puede alinearse sustancialmente de manera directa frente al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. En ciertas modalidades, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético se alinea sustancialmente frente al y sustancialmente paralelo al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. Durante el uso, la distancia entre el borde del vértice de la primera guía del campo magnético y el borde del vértice de la segunda guía del campo magnético puede ser de 5 cm o menos, tal como 2 cm o menos, que incluye 1 cm o menos, o 7 mm o menos, o 5 mm o menos, o 3 mm o menos, o 2 mm o menos, o 1 mm o menos.

En otras modalidades como se describió anteriormente, un dispositivo de separación magnética puede incluir dos fuentes de campo magnético, tales como una primera y segunda fuentes del campo magnético dispuestas proximales entre sí. En algunos casos, una primera guía del campo magnético se asocia con la primera fuente del campo magnético, y una segunda guía del campo magnético se asocia con la segunda fuente del campo magnético. La primera guía del campo magnético puede posicionarse sobre la primera fuente del campo magnético en la superficie de la primera fuente del campo magnético proximal a la segunda fuente del campo magnético. Por ejemplo, en modalidades donde las guías del campo magnético tienen forma de cuña, la primera guía del campo magnético puede disponerse sobre la primera fuente del campo magnético de manera que la base de la primera guía del campo magnético contacte con la superficie de la primera fuente magnética proximal a la segunda fuente magnética. De manera similar, la segunda guía del campo magnético se puede posicionar sobre la segunda fuente del campo magnético en la superficie de la segunda fuente del campo magnético proximal a la primera fuente del campo magnético. Por ejemplo, en modalidades donde las guías del campo magnético tienen forma de cuña, la segunda guía del campo magnético puede disponerse sobre la segunda fuente del campo magnético de manera que la base de la segunda guía del campo magnético contacte con la superficie de la segunda fuente magnética proximal a la primera fuente magnética. En este arreglo, las guías del campo magnético primera y segunda pueden posicionarse entre las fuentes del campo magnético primera y segunda. Además, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético puede estar proximal al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. En algunos casos, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético es sustancialmente paralelo al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. El borde del vértice de la primera guía del campo magnético puede alinearse frente al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. Por ejemplo, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético puede alinearse sustancialmente de manera directa frente al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. En ciertas modalidades, el borde del vértice de la primera guía del campo magnético se alinea sustancialmente frente al y sustancialmente paralelo al borde del vértice de la segunda guía del campo magnético. Durante el uso, la distancia entre el borde del vértice de la primera guía del campo magnético y el borde del vértice de la segunda guía del campo magnético puede ser de 5 cm o menos, tal como 2 cm o menos, que incluye 1 cm o menos, o 7 mm o menos, o 5 mm o menos, o 3 mm o menos, o 2 mm o menos, o 1 mm o menos. Como se describió anteriormente, las guías del campo magnético primera y segunda pueden configurarse para enfocar el campo magnético producido por la fuente del campo magnético. En ciertos casos, las guías del campo magnético primera y segunda enfocan el campo magnético a una región proximal a los bordes del vértice de las guías del campo magnético primera y segunda. Por ejemplo, la primera y segunda guías del campo magnético pueden enfocar el campo magnético en un área entre los bordes del vértice de las guías del campo magnético. Las guías del campo magnético primera y segunda pueden configurarse para producir un flujo magnético proximal a los bordes del vértice de las guías del campo magnético suficiente para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en una muestra. En algunos casos, las guías del campo magnético primera y segunda se configuran para producir un campo magnético proximal a los bordes del vértice de las guías del campo magnético que tienen una densidad de flujo magnético que oscila de 0,01 T a 10 T, o de 0,01 T a 5 T, o de 0,01 T a 2 T, tal como de 0,1 T a 2 T, que incluye de 0,5 T a 1,5 T.

En ciertas modalidades, la guía del campo magnético incluye un imán blando. El término "imán blando" se refiere a un material que puede magnetizarse en presencia de un campo magnético externo aplicado, pero cuyo magnetismo disminuye sustancialmente cuando se elimina el campo magnético externo. Los imanes blandos pueden incluir, pero no se limitan a, materiales ferromagnéticos, tales como hierro (por ejemplo, hierro recocido), acero inoxidable y níquel, materiales ferromagnéticos, tales como óxidos cerámicos de metales, combinaciones de los mismos, y similares.

En algunos casos, la guía del campo magnético puede tener una longitud que oscila de 1 cm a 100 cm, tal como de 1 cm a 75 cm, que incluye de 1 cm a 50 cm, o de 1 cm a 25 cm, o de 1 cm a 10 cm, o de 5 cm a 10 cm, por ejemplo de 5 cm a 6 cm; un ancho que oscila de 0,1 cm a 100 cm, tal como de 0,1 cm a 75 cm, que incluye de 0,1 cm a 50 cm, o de 0,1 cm a 25 cm, o de 0,1 cm a 10 cm, o de 0,1 cm a 5 cm, o de 0,1 cm a 2 cm, o de 0,5 cm a 2 cm, por ejemplo de 1 cm a 1,5 cm; y una altura de _0,1 cm a 100 cm, tal como de 0,1 cm a 75 cm, que incluye de 0,1 cm a 50 cm, o de 0,1 cm a 25 cm, o de 0,1 cm a 10 cm, o de 0,1 cm a 5 cm, o de 0,1 cm a 2 cm, o de 0,5 cm a 2 cm, por ejemplo de 1 cm a 1,5 cm.

En ciertas modalidades, un dispositivo de separación magnética incluye uno o más sumideros de flujo magnético. El sumidero de flujo magnético puede disponerse sobre una superficie de la fuente del campo magnético. En algunos casos, el sumidero de flujo magnético se dispone sobre una superficie de la fuente del campo magnético opuesta a la superficie de la fuente del campo magnético en contacto con la guía del campo magnético. En ciertos casos, el sumidero de flujo magnético se configura para aumentar el campo magnético de la fuente del campo magnético. El sumidero de flujo magnético puede configurarse para aumentar el campo magnético de la fuente del campo magnético disminuyendo el campo de autodesmagnetización de la fuente del campo magnético (por ejemplo, el campo de autodesmagnetización del imán permanente). En algunos casos, el sumidero de flujo magnético incluye un imán blando.

Monitor de retroalimentación

El sistema de la invención incluye además un monitor de retroalimentación configurado para evaluar la agregación de la muestra biológica durante los métodos objeto. Los monitores de retroalimentación de interés se configuran para medir tanto la calidad de la muestra biológica procesada (por ejemplo, la proporción entre las células recolectadas y los agregados celulares) como la cantidad de células recolectadas. Por ejemplo, en algunos casos, los monitores de retroalimentación se configuran para medir el factor de arrastre exhibido por la muestra biológica procesada. En otros casos, los monitores de retroalimentación se configuran para medir la concentración de agregados celulares presentes en la muestra biológica procesada. En otros casos más, los monitores de retroalimentación se configuran para medir el número de células individuales recolectadas de la muestra biológica procesada.

En algunas modalidades, los monitores de retroalimentación recolectan datos en tiempo real sobre la muestra biológica procesada. En otras modalidades, los monitores de retroalimentación se configuran para evaluar la agregación en la muestra biológica procesada a intervalos regulares, tales como cada 1 minuto, cada 5 minutos, cada 10 minutos, cada 30 minutos, cada 60 minutos o algún otro intervalo. En otras modalidades más, los monitores de retroalimentación se configuran para evaluar la agregación en la muestra biológica procesada después de cada intervalo de procesamiento, después de cada 2 intervalos de procesamiento, después de cada 3 intervalos de procesamiento o después de algún otro número de intervalos.

Los monitores de retroalimentación de interés pueden incluir cualquier dispositivo adecuado el cual se configura para medir la agregación de partículas en una muestra fluídica y puede incluir pero no se limita a sensores de dispersión óptica, sensores de dispersión láser, sensores de difracción láser, sensores de absorción óptica así como sensores de emisión. Los sistemas pueden incluir uno o más monitores de retroalimentación, según se desee, tales como dos o más, tales como tres o más, tales como cuatro o más y que incluyen cinco o más monitores de retroalimentación.

Los monitores de retroalimentación pueden posicionarse en cualquier lugar en los sistemas objeto el cual sea adecuado para evaluar la agregación en la muestra procesada. En algunas modalidades, se posiciona un monitor de retroalimentación adyacente a una salida del dispositivo concentrador acústico para evaluar la agregación en la muestra biológica procesada después de separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida.

En las modalidades de la presente descripción, los monitores de retroalimentación también pueden configurarse para evaluar la agregación en la muestra biológica e identificar cualquier ajuste deseado para procesar la muestra biológica, donde los ajustes pueden en ciertos casos mejorar la calidad de la muestra biológica procesada o aumentar la cantidad de células recolectadas. En algunas modalidades, los monitores de retroalimentación evalúan la agregación en la muestra biológica procesada y proporcionan datos a un usuario sobre la agregación en la muestra biológica procesada. Por ejemplo, en ciertos casos los monitores de retroalimentación proporcionan datos sobre el arrastre exhibido por la muestra biológica procesada.

En ciertas modalidades, el monitor de retroalimentación incluye un procesador el cual se configura para evaluar la agregación evaluada en la muestra biológica procesada e identificar si se necesitan ajustes deseados para procesar la muestra biológica. En algunas modalidades, los monitores de retroalimentación se configuran para evaluar la agregación evaluada y determinar si se requieren uno o más intervalos de procesamiento adicionales. En estas modalidades, la agregación evaluada puede evaluarse para determinar, por ejemplo, si se ha alcanzado un objetivo predeterminado, tal como lograr una concentración particular de agregados celulares en la muestra biológica procesada o una cantidad específica de células recolectadas. En otras modalidades, el monitor de retroalimentación se configura para evaluar la agregación evaluada y determinar si una o más de las disrupciones de la muestra biológica o la separación acústica requieren ajuste.

En ciertos aspectos, los monitores de retroalimentación se configuran para permitir que los sistemas objeto operen de manera en un circuito cerrado. Por ejemplo, en algunas modalidades, el monitor de retroalimentación puede evaluar uno o más parámetros de disrupción de la muestra, separación acústica, separación magnética, concentración de agregados celulares, concentración de fragmentos de tejido, valor de arrastre de la muestra, y similares. El sistema puede cambiar uno o más parámetros de los dispositivos de clasificación fluídicos objetos sustancialmente en tiempo real para obtener automáticamente resultados más eficientes o para optimizar las velocidades de procesamiento en dependencia de los requisitos del usuario. Por ejemplo, el sistema puede alterar uno o más la potencia del disruptor, la temperatura del disruptor, el caudal de un dispositivo de separación magnética, el caudal de un dispositivo de separación acústica, la frecuencia del generador del campo acústico de un dispositivo de concentración acústica, la potencia aplicada al generador del campo acústico, etc. En ciertos aspectos, tal sistema de circuito cerrado puede implicar la aplicación de uno o más algoritmos estadísticos o de máquina de aprendizaje, tales como algoritmos genéticos, redes neuronales, modelos de Markov ocultos, redes Bayesianas, y similares.

En ciertas modalidades, los sistemas se acoplan a uno o más dispositivos analíticos para analizar las células recolectadas. En algunos casos, el dispositivo analítico es un clasificador de células o citómetro de flujo para clasificar o analizar las células recolectadas. Los clasificadores de células y los sistemas de citometría de flujo adecuados pueden incluir, pero no se limitan a los descritos en Ormerod (edición), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997); Jaroszeski y otros (ediciones), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology 91, Humana Press (1997); Practical Flow Cytometry, 3ra edición, Wiley-Liss (1995); Virgo, y otros (2012) Ann Clin Biochem. Enero; 49 (pt 1): 17-28; Linden, y otros, Semin Throm Hemost. Octubre de 2004; 30(5): 502-11; Alison, y otros J Pathol, diciembre de 2010; 222(4):335-344; y Herbig, y otros (2007) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 24(3):203-255. En ciertos casos, el dispositivo analítico acoplado es un citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™, un clasificador de células BD Biosciences Influx™, o similar.

La Figura 8 ilustra un esquema de un sistema para procesar una muestra biológica acoplada a un clasificador de células activado por fluorescencia para analizar y clasificar las células recolectadas de acuerdo con ciertas modalidades de la presente descripción. El sistema 800 incluye un disruptor de muestras 802 para disrumpir una muestra biológica 801. La muestra biológica disrumpida se hace fluir usando la bomba 803a a través del dispositivo separador magnético 807 posicionado entre y en comunicación fluídica con el disruptor de muestras 802 y el primer dispositivo concentrador acústico 804 que tiene un transductor piezoeléctrico 804a para separar los componentes más grandes de la muestra biológica disrumpida de los componentes más pequeños para producir la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada se evalúa con un monitor de retroalimentación que tiene una fuente de luz láser 805a y un detector de dispersión láser 805b para determinar el grado de agregación en la muestra biológica procesada. La muestra biológica procesada se dirige subsecuentemente a través de una o más salidas del dispositivo concentrador acústico 804 donde los componentes más grandes los cuales requieren un posterior procesamiento (por ejemplo, tejido, fragmentos de tejido, agregados celulares, etc.) se retroalimentan al disruptor de muestras 802, mientras que los componentes más pequeños (por ejemplo, células, restos celulares y macromoléculas no celulares) se transportan al segundo concentrador acústico 809 que tiene un segundo transductor piezoeléctrico 809a para separar las células de los restos celulares y las macromoléculas no celulares. Las células separadas de los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan al sistema 806 de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) mientras que los restos celulares y las macromoléculas no celulares se transportan usando la bomba 803b al contenedor de desechos 810. El sistema FACS 806 incluye una célula de flujo clasificador de 842 y un depósito de vaina 844, óptica de excitación 846, placas deflectoras 849, detector(es) de dispersión frontal 847 y detector(es) de dispersión lateral y fluorescencia 848. Del sistema FACS 806, la muestra clasificada (por ejemplo, células enriquecidas y clasificadas) se recolecta en una placa de micropocillos 819 posicionada sobre una platina mecánica 820. El sistema 800 también incluye el tampón de desagregación 808 transportado usando la bomba 803c a través del primer dispositivo concentrador acústico para separar los componentes más grandes de los componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida y el tampón de lavado 811 transportado usando la bomba 803d a través del segundo dispositivo concentrador acústico para separar las células de los restos celulares y las macromoléculas no celulares.

Sistemas controlados por ordenador

Los aspectos de la presente descripción pueden incluir además sistemas controlados por ordenador para practicar los métodos objeto, donde los sistemas incluyen además uno o más ordenadores para la automatización o semiautomatización de un sistema para practicar los métodos descritos en la presente descripción. En ciertas modalidades, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático cuando se carga en el ordenador incluye un algoritmo para disrumpir una muestra biológica para producir una muestra biológica disrumpida; algoritmo para separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida; algoritmo para emplear un dispositivo de separación magnética para separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra biológica disrumpida; algoritmo para separar acústicamente células de restos celulares y macromoléculas no celulares en la muestra biológica procesada; algoritmo para monitorear una o más de la muestra biológica disrumpida, la muestra biológica procesada y las células recolectadas.

En modalidades, el sistema incluye un módulo de entrada, un módulo de procesamiento y un módulo de salida. En algunas modalidades, los sistemas objeto pueden incluir un módulo de entrada de manera que los parámetros o la información sobre cada muestra biológica, la frecuencia de la onda acústica aplicada en el dispositivo concentrador acústico, la amplitud de la onda acústica aplicada en el dispositivo concentrador acústico, el voltaje de activación del dispositivo concentrador acústico, intensidad del campo magnético, homogeneidad del campo magnético, caudal a través de cada componente de los sistemas objeto, datos de calibración de dispersión láser del monitor de retroalimentación, etc., pueden ingresarse en el ordenador. El módulo de procesamiento incluye una memoria que tiene una pluralidad de instrucciones para realizar las etapas de los métodos objeto, tales como disrumpir la muestra biológica para producir una muestra biológica disrumpida; separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida; separar magnéticamente las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra biológica disrumpida; separar acústicamente las células de los restos celulares y las macromoléculas no celulares en la muestra biológica procesada; y monitorear la muestra biológica procesada para evaluar la agregación en la muestra biológica procesada.

Después de que el módulo de procesamiento ha realizado una o más de las etapas de los métodos objeto, un módulo de salida comunica los resultados (por ejemplo, el número de células recolectadas o la cantidad de agregados celulares que permanecen en la muestra biológica procesada) al usuario, tal como mediante la visualización en un monitor o mediante la impresión de un informe.

Los sistemas objeto pueden incluir componentes tanto de hardware como de software, donde los componentes de hardware pueden tomar la forma de una o más plataformas, por ejemplo, en forma de servidores, de manera que los elementos funcionales, es decir, aquellos elementos del sistema que lleva a cabo funciones específicas (tales como gestionar la entrada y salida de información, procesar información, etc.) del sistema pueden llevarse a cabo mediante la ejecución de aplicaciones de software en y a través de una o más plataformas informáticas representadas del sistema.

Los sistemas pueden incluir una pantalla y un dispositivo de entrada del operador. Los dispositivos de entrada del operador pueden ser, por ejemplo, un teclado, un ratón o similares. El módulo de procesamiento incluye un procesador el cual tiene acceso a una memoria que tiene instrucciones almacenadas en el mismo para realizar las etapas de los métodos objeto, tales como disrumpir la muestra biológica para producir una muestra biológica disrumpida; separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida; separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra biológica disrumpida; separar acústicamente las células de los restos celulares y las macromoléculas no celulares en la muestra biológica procesada; y monitorear la muestra biológica procesada para evaluar la agregación en la muestra biológica procesada. El módulo de procesamiento puede incluir un sistema operativo, un controlador de interfaz gráfica de usuario (GUI), una memoria del sistema, dispositivos de almacenamiento de memoria, y controladores de entrada y salida, memoria caché, una unidad de respaldo de datos, y muchos otros dispositivos. El procesador puede ser un procesador disponible comercialmente o puede ser uno de otros procesadores que están o estarán disponibles. El procesador ejecuta el sistema operativo y el sistema operativo interactúa con el microprograma y el hardware de una manera bien conocida, y facilita al procesador en la coordinación y ejecución de las funciones de varios programas informáticos que pueden escribirse en una variedad de lenguajes de programación, tal como Java, Perl, C++, otros lenguajes de alto o bajo nivel, así como combinaciones de los mismos, como se conoce en la técnica. El sistema operativo, típicamente en cooperación con el procesador, coordina y ejecuta funciones de los otros componentes del ordenador. El sistema operativo también proporciona planificación, control de entrada-salida, gestión de archivos y datos, gestión de memoria, y control de comunicaciones y servicios relacionados, todo de acuerdo con técnicas conocidas.

La memoria del sistema puede ser cualquiera de una variedad de dispositivos de almacenamiento de memoria conocidos o futuros. Los ejemplos incluyen cualquier memoria de acceso aleatorio (RAM) comúnmente disponible, medio magnético tal como un disco duro o cinta residente, un medio óptico tal como un disco compacto de lectura y escritura, dispositivos de memoria flash, u otro dispositivo de almacenamiento de memoria. El dispositivo de almacenamiento de memoria puede ser cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos o futuros, que incluyen una unidad de disco compacto, una unidad de cinta, una unidad de disco duro removible, o una unidad de disquete. Tales tipos de dispositivos de almacenamiento de memoria típicamente leen desde, y/o escriben en, un medio de almacenamiento de programas (no mostrado) tal como, respectivamente, un disco compacto, cinta magnética, disco duro removible, o disquete. Cualquiera de estos medios de almacenamiento de programas, u otros ahora en uso o que puedan desarrollarse posteriormente, pueden considerarse un producto de programa informático. Como se apreciará, estos medios de almacenamiento de programas almacenan típicamente un programa de software de ordenador y/o datos. Los programas de software de ordenador, también llamados lógica de control del ordenador, típicamente se almacenan en la memoria del sistema y/o el dispositivo de almacenamiento de programas usado junto con el dispositivo de almacenamiento de memoria.

En algunas modalidades, se describe un producto de programa informático que comprende un medio usable por ordenador que tiene lógica de control (programa de software de ordenador, que incluye el código de programa) almacenada en el mismo. La lógica de control, cuando se ejecuta por el procesador del ordenador, provoca que el procesador realice las funciones descritas en la presente descripción. En otras modalidades, algunas funciones se implementan principalmente en el hardware usando, por ejemplo, una máquina de estado de hardware. La implementación de la máquina de estado de hardware para realizar las funciones descritas en la presente descripción será evidente para los expertos en las técnicas relevantes.

La memoria puede ser cualquier dispositivo adecuado en el cual el procesador pueda almacenar y recuperar datos, tales como dispositivos de almacenamiento magnéticos, ópticos, o de estado sólido (que incluyen discos magnéticos u ópticos o cinta o RAM, o cualquier otro dispositivo adecuado, ya sea fijo o portátil). El procesador puede incluir un microprocesador digital de propósito general programado adecuadamente desde un medio legible por ordenador que lleva el código del programa necesario. La programación se puede proporcionar remotamente al procesador a través de un canal de comunicación, o se puede guardar previamente en un producto de programa informático tal como la memoria o algún otro medio de almacenamiento portátil o fijo legible por ordenador usando cualquiera de esos dispositivos en conexión con la memoria. Por ejemplo, un disco magnético u óptico puede llevar la programación, y puede leerse por un lector/grabador de disco. Los sistemas de la invención también incluyen programación, por ejemplo, en forma de productos de programas informáticos, algoritmos para usar en la práctica de los métodos descritos anteriormente. La programación de acuerdo con la presente invención se puede grabar en un medio legible por ordenador, por ejemplo, cualquier medio que pueda leerse y accederse directamente por un ordenador. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnético, tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro, y cinta magnética; medios de almacenamiento óptico tal como el CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico tal como la RAM y la ROM; unidad flash portátil; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.

El procesador también puede tener acceso a un canal de comunicación para comunicarse con un usuario en una ubicación remota. Por ubicación remota se entiende que el usuario no está en contacto directo con el sistema y transmite información de entrada a un administrador de entrada desde un dispositivo externo, tal como un ordenador conectado a una red de área amplia ("WAN"), red telefónica, red satelital, o cualquier otro canal de comunicación adecuado, que incluye un teléfono móvil (por ejemplo, un teléfono inteligente). En estas modalidades, el administrador de entrada recibe información, por ejemplo, parámetros o información sobre cada muestra biológica, frecuencia de la onda acústica aplicada en el dispositivo concentrador acústico, amplitud de la onda acústica aplicada en el dispositivo concentrador acústico, voltaje de activación del dispositivo concentrador acústico, intensidad del campo magnético, homogeneidad del campo magnético, caudal a través de cada componente de los sistemas objeto, datos de calibración de dispersión láser del monitor de retroalimentación, etc. El administrador de entrada procesa y envía esta información al módulo de procesamiento. Estas funciones se realizan usando cualquier técnica conveniente.

Los controladores de salida pueden incluir controladores para cualquiera de una variedad de dispositivos de visualización conocidos para presentar información a un usuario, ya sea un humano o una máquina, ya sea local o remoto. Si uno de los dispositivos de visualización proporciona información visual, esta información típicamente puede organizarse lógica y/o físicamente como una serie de elementos de imagen. Un controlador de interfaz gráfica de usuario (GUI) puede incluir cualquiera de una variedad de programas de software conocidos o futuros para proporcionar interfaces gráficas de entrada y salida entre el sistema y un usuario, y para procesar las entradas del usuario. Los elementos funcionales del ordenador pueden comunicarse entre sí a través del bus del sistema. Algunas de estas comunicaciones pueden lograrse en modalidades alternativas usando la red u otros tipos de comunicaciones remotas. El administrador de salida también puede proporcionar información generada por el módulo de procesamiento a un usuario en una ubicación remota, por ejemplo, a través de Internet, teléfono o red satelital, de acuerdo con técnicas conocidas. La presentación de datos por el administrador de salida puede implementarse de acuerdo con una variedad de técnicas conocidas. Como algunos ejemplos, los datos pueden incluir documentos SQL, HTML o XML, correo electrónico u otros archivos, o datos en otras formas. Los datos pueden incluir direcciones URL de Internet para que un usuario pueda recuperar SQL, HTML, XML u otros documentos o datos adicionales de fuentes remotas. Una o más plataformas presentes en los sistemas objeto pueden ser cualquier tipo de plataforma informática conocida o un tipo que se desarrollará en el futuro, aunque típicamente serán de una clase de ordenador comúnmente denominada como servidores. Sin embargo, también pueden ser un ordenador principal, una estación de trabajo, u otro tipo de ordenador. Pueden conectarse a través de cualquier tipo de cableado conocido o futuro u otro sistema de comunicación que incluyen los sistemas inalámbricos, ya sea en red o lo contrario. Pueden coubicarse o pueden separarse físicamente. Pueden emplearse varios sistemas operativos en cualquiera de las plataformas informáticas, posiblemente en dependencia del tipo y/o marca de la plataforma informática elegida. Los sistemas operativos apropiados incluyen Windows NT®, Windows XP, Windows 7, Windows 8, iOS, Sun Solaris, Linux, OS/400, Compaq Tru64 Unix, SGI IRIX, Siemens Reliant Unix, y otros.

Kits

También se proporcionan ejemplos de kits no cubiertos mediante la presente invención, kits, para practicar una o más modalidades de los métodos descritos anteriormente. Los kits objeto pueden incluir varios componentes y reactivos. En algunos casos, los kits incluyen al menos reactivos que encuentran uso en los métodos (por ejemplo, como se describió anteriormente), tal como una solución de lavado o tampón para lavar un conducto reutilizable, jeringas vacías para suministrar la muestra biológica o tampón de lavado, jeringas vacías para recuperar células recolectadas, jeringas precargadas con tampón de lavado o muestra biológica, una o más etiquetas magnéticas para etiquetar las fracciones en una muestra de manera que las fracciones etiquetadas magnéticamente puedan separarse de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra. En otros casos los kits incluyen un medio legible por ordenador que tiene un programa informático almacenado en el mismo, en donde el programa informático, cuando se carga en un ordenador, opera el ordenador para realizar un ensayo de citometría de flujo como se describe en la presente descripción; y un sustrato físico que tiene una dirección desde la cual obtener el programa informático.

Además de los componentes anteriores, los kits objeto pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos. Estas instrucciones pueden presentarse en los kits objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden presentarse en el kit. Una forma en la cual estas instrucciones pueden presentarse es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja o hojas de papel en las cuales se imprime la información, en el empaque del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, CD, DVD, Blu-Ray, memoria flash, etc., en el cual se ha grabado la información. Otro medio más que puede presentarse es una dirección de sitio web la cual puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

Utilidad

Los dispositivos, sistemas, métodos, y kits objetos encuentran uso en una variedad de aplicaciones diferentes donde es deseable clasificar o concentrar componentes (por ejemplo, células) en una muestra líquida. La presente descripción también encuentra uso en aplicaciones donde pueden desearse células preparadas a partir de una muestra biológica para investigación, pruebas de laboratorio o para uso en terapia. En algunas modalidades, los métodos y dispositivos objeto pueden facilitar la obtención de células individuales preparadas a partir de una muestra biológica de tejido o fluídica objeto. Por ejemplo, los métodos y sistemas objeto facilitan la obtención de células a partir de muestras fluídicas o de tejido para su uso como espécimen de investigación o diagnóstico para enfermedades tales como el cáncer. Igualmente, los métodos y sistemas objeto facilitan la obtención de células a partir de muestras fluídicas o de tejido para su uso en terapia. Los métodos y dispositivos de la presente descripción permiten separar y recolectar células de una muestra biológica (por ejemplo, órgano, tejido, fragmento de tejido, fluido) a alta eficiencia, alto caudal y bajo costo.

Ejemplos

Como puede apreciarse a partir de la descripción proporcionada anteriormente, la presente descripción tiene una amplia variedad de aplicaciones. En consecuencia, los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica con una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente similares. Por lo tanto, los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1

Las Figuras 9a-b muestran imágenes de separación de partículas de diferentes tamaños en un dispositivo concentrador acústico a caudales bajos (por ejemplo, 4 pL/minuto). En la Figura 9a, cuando el transductor piezoeléctrico no se activa y no se ejerce ninguna fuerza de radiación acústica sobre la muestra que fluye, las fuerzas de inercia provocan que solo unas pocas partículas grandes (diámetro de aproximadamente 50 pm) se muevan a la corriente central dentro del canal del dispositivo concentrador acústico. Por el contrario, en la Figura 9b, cuando el transductor piezoeléctrico se opera a un nivel de potencia de aproximadamente 200 mV, la onda acústica estacionaria aplicada ejerce presión de radiación para enfocar componentes más grandes (por ejemplo, partículas que tienen diámetros de aproximadamente 50 pm) a la corriente central mientras que las partículas más pequeñas (diámetros menos de 50 pm) permanecen en el flujo de laminación a lo largo de los lados del canal del dispositivo concentrador acústico.

Ejemplo 2

Las Figuras 10a-b muestran que el grado de enfoque hidrodinámico en el dispositivo concentrador acústico puede regularse mediante la relación de líquido que se desvía a las corrientes laterales frente al que sale de la corriente central. Al hacer esto, esta relación puede ajustarse a la dispersión de luz optimizada medida por el monitor de retroalimentación posicionado cerca de la salida del canal del dispositivo concentrador acústico. La Figura 10a ilustra las células que permanecen enfocadas de manera ajustada en la región de recolección en el centro del canal. La Figura 10b, por otro lado, ilustra que las células que llegan a la salida central se difunden significativamente. En algunos casos, puede ser necesario un flujo mínimo de fluido que sale del canal central del dispositivo concentrador acústico para que la corriente permanezca enfocada hidrodinámicamente después de salir del espacio afectado por la presión de radiación acústica de la onda estacionaria aplicada. Aquí, la relación de flujo que sale de las salidas laterales en comparación con el que sale de la salida central no excede de 5: 1.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, es fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta descripción que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse al mismo sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

En consecuencia, lo anterior solamente ilustra los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la técnica podrán idear varios arreglos los cuales, aunque no se describen o muestran explícitamente en la presente descripción, incorporan los principios de la invención y se incluyen dentro de su alcance. Además, todos los ejemplos y el lenguaje condicional citados en la presente descripción pretenden principalmente ayudar al lector en la comprensión de los principios de la invención sin limitarse a los ejemplos y condiciones citados específicamente. El alcance de la presente invención, por lo tanto, no pretende limitarse a las modalidades ejemplares mostradas y descritas en la presente descripción. Más bien, el alcance de la presente invención se incorpora en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para procesar una muestra biológica, el método que comprende:

disrumpir una muestra biológica en un disruptor de muestras para producir una primera muestra biológica disrumpida; y

separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la primera muestra biológica disrumpida en un separador acústico

que comprende una entrada y una salida que están en comunicación de fluidos con el disruptor de muestras; caracterizado porque el método comprende además evaluar, mediante el monitoreo de retroalimentación, el grado de disrupción de los componentes más grandes y pequeños separados acústicamente con un detector en la salida del separador acústico que se configura para transportar los componentes más grandes separados acústicamente de regreso al disruptor de muestras en respuesta al monitoreo de retroalimentación.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde disrumpir la muestra biológica comprende desagregar componentes de la muestra biológica.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde disrumpir la muestra biológica comprende agitar mecánicamente la muestra biológica o agitar ultrasónicamente las muestras biológicas o desagregar enzimáticamente componentes más grandes en la muestra biológica o triturar tejido en la muestra biológica.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la muestra biológica disrumpida comprende aplicar una onda acústica a la muestra biológica disrumpida.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la onda acústica tiene una frecuencia de 2 MHz o mayor.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, en donde separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños comprende concentrar los componentes más grandes en la muestra biológica disrumpida en un nodo de la onda acústica aplicada.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además recolectar los componentes más grandes de la muestra biológica separada acústicamente a través de una primera salida de la muestra y recolectar los componentes más pequeños de la muestra biológica separada acústicamente a través de una segunda salida de la muestra.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además poner en contacto la muestra biológica disrumpida con una etiqueta magnética.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el método comprende además separar las fracciones etiquetadas magnéticamente de las fracciones no etiquetadas magnéticamente en la muestra biológica.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además:

disrumpir los componentes mayores separados acústicamente para producir una segunda muestra biológica disrumpida; y

separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en la segunda muestra biológica disrumpida.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además lavar los componentes más pequeños separados acústicamente.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, linfa, lágrimas, saliva, orina, semen, fluidos vaginales, líquido amniótico, sangre de cordón umbilical, moco, líquido sinovial y secciones de tejido y homogeneizados y lisados de los mismos.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en los componentes más pequeños separados acústicamente.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además el análisis de células recolectadas de los componentes más pequeños separados acústicamente.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde evaluar el grado de disrupción comprende detectar la dispersión de luz con el detector de los componentes más grandes separados acústicamente y los componentes más pequeños separados acústicamente.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde evaluar el grado de disrupción comprende determinar la proporción de células libres y agregados celulares presentes en los componentes más grandes separados acústicamente.

17. Un sistema para procesar una muestra biológica, el sistema que comprende:

un disruptor para disrumpir una muestra biológica; y

un concentrador acústico que comprende una entrada y una salida acopladas fluídicamente al disruptor configurado para separar acústicamente componentes más grandes de componentes más pequeños en una muestra biológica disrumpida; y caracterizado porque el sistema comprende además

un detector posicionado en una salida del concentrador acústico configurado para evaluar con monitoreo de retroalimentación el grado de disrupción de una muestra separada acústicamente,

en donde el concentrador acústico se configura para transportar los componentes más grandes separados acústicamente de regreso al disruptor a través de la salida en base al monitoreo de retroalimentación.