ES2875372T3

ES2875372T3 - Oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP)

Info

Publication number: ES2875372T3
Application number: ES18701670T
Authority: ES
Inventors: Surender Kumar Dhayal; Martin Lund; Den Brink Johannes Maarten Van
Original assignee: Chr Hansen AS
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2018-01-08
Publication date: 2021-11-10
Anticipated expiration: 2038-01-08
Also published as: EP3570678A1; WO2018134066A9; EP3570678B1; CN110381743A; DK3570678T3; CN110381743B; US11246320B2; WO2018134066A1; US20190350217A1

Abstract

Un método para elaborar un nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, que comprende la siguiente etapa: (i): adición de una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares a un alimento, pienso o producto farmacéutico, con el fin de elaborar de ese modo el nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, y en el que: (a): el producto comprende, después de la adición de la composición, al menos 1 mg de oligómeros de CGMP por kg del producto; y en el que el CGMP monomérico es el péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de k- caseína y los monómeros de los oligómeros de CGMP son el CGMP monomérico; y en el que los oligómeros de CGMP añadidos en la etapa (i) se usan para la unión de iones, por ejemplo, la unión de Ca y preferiblemente la unión de fosfato de calcio (CaP), la encapsulación de una sustancia, por ejemplo, un fitoquímico tal como, por ejemplo, curcumina o b-caroteno, la encapsulación de una molécula, por ejemplo, una enzima tal como, por ejemplo, lactasa, la gelificación, el hinchamiento del gel en respuesta a la liberación desencadenada por, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica o la temperatura, la conjugación covalente, la formación de complejos electrostáticos o la estabilización de coloides, por ejemplo, estabilización ácida, estabilización de Pickering o por medio de estructuras autoensambladas o agregados.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP)

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para elaborar un nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, que comprende la adición de una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMp ) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares al producto. Técnica anterior

Las proteínas de la leche son vehículos naturales que han evolucionado para administrar micronutrientes esenciales (por ejemplo, calcio y fosfato) y componentes básicos (por ejemplo, aminoácidos), así como componentes del sistema inmunitario (por ejemplo, inmunoglobulinas y lactoferrina), de la madre al recién nacido.

Por consiguiente, las proteínas de la leche pueden considerarse vehículos naturales para bioactivos. Muchas de sus propiedades estructurales y fisicoquímicas facilitan su funcionalidad en los sistemas de administración. Estas propiedades incluyen la unión de iones y pequeñas moléculas, excelentes propiedades superficiales y de autoensamblaje; magníficas propiedades de gelificación; comportamiento de hinchamiento del gel en respuesta al pH, útil para la liberación programable; interacciones con otras macromoléculas para formar complejos y conjugados con combinaciones sinérgicas de propiedades; diversas capacidades de blindaje, esenciales para proteger la carga útil sensible; biocompatibilidad y biodegradabilidad, que permiten controlar la bioaccesibilidad del bioactivo y fomentar su biodisponibilidad.

En la figura 1 del artículo de revisión de Yoav D. Livney (Current Opinion in Colloid & Interface Science 15 (2010) 73 83) se ilustran varias funcionalidades de las proteínas de la leche; esta figura 1 del artículo de Yoav D. Livney se muestra en el presente documento como figura 21.

Tal como se comenta en el artículo de revisión de M.H. Abd El-Salam, 2006 (Separation of Casein Glycomacropeptide from Whey: Methods of Potential Industrial Application. International Journal of Dairy Science, 1: 93-99), el glicomacropéptido de caseína (GMP o CGMP, a continuación en el presente documento “CGMP”) es un péptido derivado de la caseína que se encuentra en el lactosuero. Cuando la leche se coagula con quimosina durante la elaboración del queso, la K-caseína se hidroliza en dos péptidos. El péptido más grande, que contiene los residuos de aminoácidos 1-105, se denomina para-K-caseína, que es insoluble y pasa a formar parte de la cuajada del queso. El péptido más pequeño, que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína, es soluble y pasa a formar parte de las proteínas del lactosuero. Por consiguiente, el CGMP se refiere al péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína. Tal como se conoce en la técnica, el CGMP puede aparecer en las diferentes variantes así denominadas (véase, por ejemplo, la figura 1 en el presente documento). En la técnica anterior, el CGMP se denomina a veces caseinomacropéptido (CMP).

El CGMP es una fracción heterogénea que contiene péptidos que tienen la misma cadena peptídica pero con contenido variable de hidratos de carbono y fósforo. La funcionalidad y la actividad biológica de esta fracción se han atribuido a su resto de hidrato de carbono.

El interés por CGMP ha aumentado recientemente como resultado de la actividad biológica descubierta y sus posibles usos, por ejemplo, en relación con los productos alimenticios.

El CGMP está presente en cantidades significativas en el lactosuero de los quesos elaborados por coagulación del cuajo. Se estima que el CGMP se produce en el lactosuero del cuajo/queso a aproximadamente 1,2-1,5 g l-1, lo que constituye entre el 15-25 % de las proteínas de este lactosuero. La recuperación de CGMP a partir del lactosuero está recibiendo mucha atención como componente para usos especiales y como medio para modificar las propiedades funcionales de los concentrados y aislados de proteínas del lactosuero.

Se han desarrollado diferentes métodos para la preparación de CGMP que usan caseína o lactosuero del queso como fuente de esta fracción. Sin embargo, la disponibilidad mundial de lactosuero hace que sea el material de partida preferido para este fin.

Tal como se comenta en el artículo de revisión de M.H. Abd El-Salam, 2006, se han desarrollado diferentes métodos para la separación a gran escala de CGMP del lactosuero; tales métodos incluyen métodos basados en la precipitación por calor de otras proteínas del lactosuero, métodos basados en filtración por membrana y métodos basados en la combinación de ultrafiltración y cromatografía de intercambio iónico.

El CGMP es un monómero y tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 7,5 kDa. La masa molar del CGMP monomérico puede variar entre 6,7 - 11 kDa dependiendo de la razón de CGMP no glicosilado y glicosilado (es decir, el contenido de hidratos de carbono). Debido a la agregación de diferentes CGMP monoméricos, su tamaño real puede ser de desde 23 hasta 28 kDa (Jianquan Luo et al. Journal of Membrane Science 469 (2014) 127-139). Tal como se conoce en la técnica, la agregación de diferentes CGMP monoméricos, tal como se comenta, por ejemplo, en el artículo de Jianquan Luo et al. mencionado anteriormente, no se basa en la reticulación por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares.

Un ejemplo de un producto comercial disponible que comprende CGMP monomérico es el producto Lacprodan® CGMP-10 de Arla Foods Ingredients, Dinamarca. El contenido de proteína CGMP de este producto es de aproximadamente el 75 % y el 85 % de materia seca de concentrado de proteínas.

La transglutaminasa (TGasa) (código C.E. 2.3.2.13) es una enzima que forma reticulaciones inter e intramoleculares en diferentes proteínas.

La TGasa se ha usado para obtener una coagulación/gelificación deseada de la leche para la producción de, por ejemplo, queso. Por ejemplo, el documento WO2008/017499A1 describe un método para mejorar el contenido (rendimiento) de proteínas de la cuajada, que comprende la adición simultánea de TGasa y cuajo/quimosina a leche entera (véase, por ejemplo, el ejemplo 1 del documento WO2008/017499A1). Es evidente que la cuajada producida comprende una cantidad significativa de para-K-caseína.

El artículo de A. Tolkach et al. (Journal of Food Engineering 67 (2005) 13-20)) describe un método para obtener un concentrado de proteínas del lactosuero sin CMP (véase el resumen). El propósito del artículo es retirar CGMP de un concentrado de proteínas del lactosuero con el fin de obtener fracciones más puras de las proteínas del lactosuero p-lactoglobulina (P-Ig) y a -lactalbúmina (a -la), por ejemplo, el artículo dice en la página 15, columna de la derecha, parte central: “El propósito de este estudio es demostrar una nueva forma de separar las proteínas del lactosuero a partir del CMP en el lactosuero del cuajo por medio de TGasa, con el fin de permitir la obtención de fracciones más puras de p-Ig y a -Ia aguas abajo”.

Una etapa en el método de purificación de p-Ig/a -Ia descrito en el artículo de A. Tolkach es la adición de transglutaminasa (TGasa) a un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC), que se muestra para dar CGMP reticulado (es decir, la formación de oligómeros de CGMP). Los CGMP reticulados (es decir, los oligómeros de CGMP) se retiran a continuación para obtener las fracciones más puras de las proteínas del lactosuero p-Ig/a -Ia. El monómero de CGMP tiene tres residuos de Lys y dos de Gln en su secuencia primaria, y estos son los sustratos diana de la TGasa. Tal como se comenta en el artículo de A. Tolkach, la reticulación de Lys y Gln inducida por la TGasa conduce a la formación de CGMP oligomérico por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares; véase la figura 1 para una ilustración de un posible mecanismo de reticulación de CGMP basado en TGasa.

Tal como se comentó anteriormente, el propósito del artículo de A. Tolkach es retirar CGMP y no describe ningún uso comercialmente relevante en el presente documento (por ejemplo, para elaborar un producto alimenticio) de las fracciones de CGMP reticulado obtenidas (es decir, los oligómeros de CGMP), ya que se entiende que estas fracciones/composiciones de CGMP reticulado se retiran esencialmente de las fracciones que contienen p-Ig/a -Ia (es decir, para obtener las fracciones más puras de p-Ig y a - Ia).

Sumario de la invención

El problema que va a resolverse mediante la presente invención es proporcionar una novedosa composición derivada de proteínas de la leche con funcionalidades mejoradas en relación con la elaboración de, por ejemplo, nuevos alimentos, piensos y/o productos farmacéuticos.

La solución se basa en que los presentes inventores identificaron que CGMP reticulado covalentemente (denominado a continuación en el presente documento oligómeros de CGMP u oligo-CGMP) tenía muchas propiedades funcionales mejoradas nuevas/novedosas no mostradas por el CGMP monomérico.

La invención se define por las reivindicaciones, y se refiere a un método para elaborar un nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, que comprende las siguientes etapas:

(i): adición de una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares a un alimento, pienso o producto farmacéutico, con el fin de elaborar el nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, y en el que (a): el producto comprende, después de la adición de la composición, al menos 1 mg de oligómeros de CGMP por kg del producto;

y en el que el CGMP monomérico es el péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína y los monómeros de los oligómeros de CGMP son el CGMP monomérico;

y en el que los oligómeros de CGMP añadidos en la etapa (i) se usan para la unión de iones, la encapsulación de una sustancia, la encapsulación de una molécula, la gelificación, el hinchamiento del gel en respuesta a la liberación desencadenada, la conjugación covalente, la formación de complejos electrostáticos o la estabilización de coloides.

Tal como se comenta en el presente documento, los oligómeros de CGMP pueden elaborarse, por ejemplo, mediante el uso de TGasa basándose en, por ejemplo, lactosuero, concentrado de proteínas del lactosuero (WPC), aislado de proteínas del lactosuero (WPI) o CGMp monomérico más purificado (por ejemplo, el producto Lacprodan® CGMP-10) como material de partida de “CGMP monomérico” (véase, por ejemplo, la figura 1 y los ejemplos de realización en el presente documento). En los ejemplos de realización en el presente documento, se usó la transglutaminasa microbiana, que puede denominarse en el presente documento mTG.

Tal como se comentó anteriormente, el glicomacropéptido de caseína (GMP, CMP o CGMP, a continuación en el presente documento “CGMP”) es un péptido derivado de la caseína que se encuentra en el lactosuero. Cuando la leche se coagula con quimosina durante la elaboración del queso, la fracción k se hidroliza en dos péptidos. El péptido más grande, que contiene los residuos de aminoácidos 1-105, se denomina para-K-caseína, que es insoluble y pasa a formar parte de la cuajada del queso. El péptido más pequeño, que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína, es soluble y pasa a formar parte de las proteínas del lactosuero.

Por consiguiente, el CGMP monomérico se refiere al péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína. Tal como se conoce en la técnica, el CGMP monomérico puede existir en diferentes variantes así denominadas (véase, por ejemplo, la figura 1 en el presente documento).

Por consiguiente, los términos oligómeros de CGMP u oligo-CGMP se refieren en el presente documento a CGMP reticulado covalentemente, en el que los monómeros son el CGMP monomérico.

Los ejemplos de realización en el presente documento describen con detalle ejemplos de propiedades funcionales mejoradas relevantes en el presente documento de oligómeros de CGMP, por ejemplo:

Ejemplo 2: describe el autoensamblaje (asociación/agregación) de oligo-CGMP en micelas “similares a caseína” (coloides en asociación) y su uso para encapsular fitoquímicos tales como curcumina y p-caroteno; el CGMP monomérico no mostró adecuadamente esta propiedad de autoensamblaje y, por tanto, su utilidad para encapsular fitoquímicos tales como curcumina y p-caroteno;

Ejemplo 3: describe el uso del oligo-CGMP para la elaboración de bebidas transparentes ácidas estables a base de CGMP, lo que no es posible con la forma monomérica, ya que la estabilidad de CGMP monomérico en las bebidas ácidas no es muy buena y se agrega a un pH bajo, lo que conduce a la acumulación de turbidez en estas bebidas; por consiguiente, el uso de oligo-CGMP ofrece la posibilidad de elaborar bebidas transparentes ácidas ricas en proteínas únicamente a base de componentes derivados de la leche;

Ejemplo 4: describe la estabilización coloidal de partículas precipitadas a base de sales de calcio con oligo-CGMP y su uso para el enriquecimiento con calcio. Tal como se describe en el ejemplo, los oligo-CGMP ralentizan la precipitación de las partículas de fosfato de calcio (CaP) de forma mucho más eficaz en comparación con su forma monomérica;

Ejemplo 5: describe la estabilización coloidal de partículas precipitadas a base de sales de calcio con oligo-CGMP y su uso para la encapsulación (por ejemplo, la administración y la liberación controladas de enzimas lácteas en la matriz del queso) y el uso de oligo-CGMP para la estabilización de Pickering de emulsiones. Por ejemplo, se encontró que la enzima lactasa se encapsulaba eficazmente y que la mayor parte de la actividad enzimática se conservaba en la cuajada (es decir, no había una cantidad significativa de enzima en el lactosuero).

Ejemplo 6: describe la inmovilización de una proteína/enzima básica con oligo-CGMP basándose en lo que puede denominarse un mecanismo basado en la formación de complejos electrostáticos. El ejemplo demuestra que la inmovilización conduce a mayores rendimientos de actividad y, por tanto, puede usarse, por ejemplo, para inmovilizar cantidades relativamente grandes de enzimas (por ejemplo, lactosa oxidasa (LOX, LactoYIELD®, Chr. Hansen A/S)).

Ejemplo 7: describe el uso de oligo-CGMP para la gelificación. Tal como se describe, las propiedades de gelificación del oligo-CGMP (poli-CGMP) pueden usarse, por ejemplo, para proporcionar funcionalidades de textura y encapsulación a los productos alimenticios (lácteos), así como en otras aplicaciones relacionadas con la biología. Ejemplo 8: describe el autoensamblaje mediante el denominado ensamblaje jerárquico de oligo-CGMP. El ensamblaje jerárquico descrito en este ejemplo, junto con lo descrito en los ejemplos 2 a 7, pueden combinarse de diversas maneras (complejas) para tener cantidades variables de fases orgánicas (por ejemplo, poli-CGMP) e inorgánicas (por ejemplo, CaP/CaC) que conducen a diversas aplicaciones, tales como estabilización coloidal, texturización y encapsulación. Por consiguiente, este ejemplo ilustra que las estructuras/agregados autoensamblados de oligo-CGMP pueden usarse, por ejemplo, para la estabilización coloidal, texturización y/o encapsulación.

Basándose en las numerosas y sorprendentes propiedades ventajosas detalladas de los oligómeros de CGMP descritas en el presente documento, no hay razón para creer que los oligómeros de CGMP no sean ventajosos en relación con los numerosos usos comerciales relevantes en el presente documento.

Tal como se comentó anteriormente, en la figura 1 del artículo de revisión de Yoav D. Livney (Current Opinión in Colloid & Interface Science 15 (2010) 73-83) se proporciona una ilustración de varias funcionalidades de las proteínas de la leche; esta figura 1 del artículo de Yoav D. Livney se muestra en el presente documento como figura 21 y se cree que los oligómeros de CGMP comentados en el presente documento pueden ser útiles en todas las varias funcionalidades que se muestran en la figura 21.

Por consiguiente, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para elaborar un nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, que comprende la siguiente etapa:

y en el que el CGMP monomérico es el péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína y los monómeros de los oligómeros de CGMP son el CGMP monomérico.

El punto (a) según el primer aspecto se refiere a que debe añadirse al producto una cantidad significativa comercialmente relevante de oligómeros de CGMP. Se requiere que la cantidad añadida de oligómeros de CGMP en la etapa (i) sea una cantidad lo suficientemente alta como para proporcionar un producto (por ejemplo, un yogur) que comprenda al menos 1 mg de oligómeros de CGMP por kg del producto; por ejemplo, si el producto es un yogur, entonces el yogur debe comprender al menos 1 mg de oligómeros de CGMP por kg del yogur.

Tal como se comenta en el presente documento, los oligómeros de CGMP pueden elaborarse mediante el uso de TGasa basándose en, por ejemplo, lactosuero, concentrado de proteínas del lactosuero o CGMP monomérico más purificado (por ejemplo, el producto Lacprodan® CGMP-10) como material de partida de “CGMP monomérico” (véase, por ejemplo, la figura 1 y los ejemplos de realización en el presente documento).

Según la técnica, el término “enlace isopeptídico” se refiere a un enlace amida que no está presente en la cadena principal de una proteína. El enlace se forma entre el extremo carboxilo de una proteína (por ejemplo, un residuo de glutamina) y el grupo amino de un residuo de lisina en otra proteína (diana).

Tal como se ilustra en la figura 1 en el presente documento, los oligómeros de CGMP relevantes comprenden enlace(s) isopeptídico(s).

Tal como se comentó anteriormente, el propósito del artículo de A. Tolkach es retirar CGMP y no describe ningún uso comercialmente relevante en el presente documento (por ejemplo, para elaborar un producto alimenticio) de las fracciones de CGMP reticulado obtenidas (es decir, los oligómeros de CGMP), ya que se entiende que estas fracciones/composiciones de CGMP reticulado se retiran esencialmente de las fracciones que contienen p-Ig/a -Ia (es decir, para obtener las fracciones más puras de p-Ig y a -Ia). Por consiguiente, el artículo de A. Tolkach no describe directamente y sin ambigüedades un método según el primer aspecto, en el que se realiza la etapa (i) de adición de una composición que comprende oligómeros de CGMP a un alimento, pienso o producto farmacéutico para elaborar de ese modo el nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico.

Tal como se comentó anteriormente, la TGasa se ha usado para obtener una coagulación/gelificación deseada de la leche para la producción de, por ejemplo, queso. Por ejemplo, el documento WO2008/017499A1 describe un método para mejorar el contenido (rendimiento) de proteínas de la cuajada, que comprende la adición simultánea de TGasa y cuajo/quimosina a leche entera (véase, por ejemplo, el ejemplo 1 del documento WO2008/017499A1). La técnica anterior que se refiere esencialmente a la adición de TGasa a leche entera (como el documento WO2008/017499A1) no describe directamente y sin ambigüedades un método según el primer aspecto, ya que no se realiza la etapa (i) de adición de una composición que comprende oligómeros de CGMP a un alimento, pienso o producto farmacéutico para elaborar de ese modo el nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico.

La adición de la composición que comprende los oligómeros de CGMP de la etapa (i) del método según el primer aspecto hará que un alimento, pienso o producto farmacéutico estructuralmente novedoso sea estructural, ya que los oligómeros de CGMP añadidos serán una parte estructuralmente novedosa del producto como tal.

Por consiguiente, un segundo aspecto de la divulgación se refiere a un alimento, pienso o producto farmacéutico que puede obtenerse mediante el método según el primer aspecto y/o una realización relevante del mismo en el presente documento.

El término “que puede obtenerse” según el segundo aspecto puede ser preferiblemente “obtenido”.

La realización de la presente invención se describe a continuación, sólo a modo de ejemplo.

Tal como entiende el experto en el presente contexto, una combinación de una realización preferida con otra realización preferida puede considerarse como una realización aún más preferida.

Por ejemplo, a continuación se comentan varios aspectos independientes de la invención que, por ejemplo, se refieren a una composición que comprende oligómeros de CGMP como tal; se entiende que tales aspectos independientes que se refieren una composición que comprende oligómeros de CGMP como tal pueden representar realizaciones preferidas para una composición preferida que comprende oligómeros de CGMP como tal en relación con el método según el primer aspecto.

Dibujos

Figura 1: (a) Secuencia primaria de CGMP (b, c) Diagrama esquemático de la polimerización de CGMP después de la formación de una reticulación covalente entre Lys y Gln en presencia de transglutaminasa microbiana (mTG). Figura 2: (a) Cromatograma de exclusión molecular que muestra la formación de polímeros de mayor masa molar (que eluyen entre 7 - 8 ml) y que los oligómeros (8-15 ml) eluyen mucho antes que los monómeros (15 -17 ml). Figura 3: Distribución basada en el volumen del radio hidrodinámico, Rh medido durante el transcurso de la reacción de reticulación (muestras recogidas entre los puntos de tiempo 0 - 72 horas).

Figura 4: Propiedades de autoensamblaje de oligo-CGMP, tal como se miden mediante DLS: (a) Distribución basada en el volumen del radio hidrodinámico, R^hmedido para la muestra recogida después de 72 horas de reacción y luego diluida hasta diversas concentraciones entre 0,1 - 30 g l^-1. (b) La variación de Rh para los oligómeros y monómeros para concentraciones volumétricas variables.

Figura 5: Encapsulación y estabilización de curcumina y p-caroteno en micelas de oligo-CGMP autoensambladas (coloides de asociación).

Figura 6: Propensión a la gelificación reducida de oligo-CGMP a pH ácido en comparación con CGMP monomérico. Figura 7: Cinética de la acumulación de turbidez debida a la precipitación de fosfato de calcio (CaP) a pH neutro y en presencia o ausencia de 10 g l^-1de polímeros y monómeros de CGMP. Las concentraciones iónicas se indican en el texto. También se muestra un ejemplo de formación de partículas de CaP en presencia tanto de los polímeros de CGMP como de la enzima lactasa (La).

Figura 8: Cinética de la acumulación de turbidez debida a la precipitación de fosfato de calcio (CaP) en presencia de una mayor concentración de iones Ca²⁺(100 mM). Las demás condiciones son las mismas que se muestran en la figura 1.

Figura 9: Variación temporal del radio hidrodinámico (R^h) promedio en volumen de las partículas de CaP formadas en presencia de CGMP monomérico. Se representan tres mediciones diferentes con Ca²⁺10, 50 y 100 mM.

Figura 10: Cinética de la formación de partículas de CaP tal como se evalúa mediante la medición del aumento y la meseta del radio hidrodinámico (R^h) promedio en volumen de las partículas de CaP formadas en presencia de CGMP oligomérico con el paso del tiempo después de la adición de Ca²⁺. La concentración de Ca²⁺en estos experimentos fue de 10, 50 y 100 mM.

Figura 11: Distribución de tamaño basada en la intensidad de las partículas de CaP formadas en presencia de oligo-CGMP. Se representan tres mediciones diferentes con Ca²⁺10, 50 y 100 mM justo después de añadir calcio (t0) y después de 72 h de incubación (tf).

Figura 12: Distribución de tamaño promedio en volumen de las partículas de CaP formadas en presencia de oligo-CGMP. Se representan tres mediciones diferentes con Ca²⁺10, 50 y 100 mM justo después de añadir calcio (t0) y después de 72 h de incubación (tf).

Figura 13: Dependencia del radio hidrodinámico (R^h) promedio en volumen de las partículas de CaP formadas en presencia de cantidades variables de oligo-CGMP para una concentración fija de Ca²⁺a 100 mM.

Figura 14: Velocidad de formación del producto (ONP) (v) catalizada por Ha-Lactase libre (control) o por Ha-Lactase encapsulada (oligómero) en función de la concentración de sustrato (S, ONPG).

Figura 15: Los parámetros de Michaelis Menten obtenidos para la lactasa libre y encapsulada.

Figura 16: Microcápsulas elaboradas mediante el método de doble emulsión. Las imágenes muestran una emulsión doble de tipo agua en aceite en agua (W¹/O/W²). La fase acuosa interna contiene Ha-Lactase, que puede observarse como pequeñas gotas finamente dispersas dentro de una gota grande. La imagen superior izquierda corresponde a la emulsión doble elaborada únicamente con CGMP oligomérico y la imagen superior derecha corresponde a la emulsión doble elaborada usando una combinación de CGMP oligomérico y CaP. Las tres imágenes inferiores son imágenes capturadas después de enfocar a diferentes profundidades (moviéndose de arriba a abajo de la gota). Las partículas de CaP grandes pueden observarse claramente adsorbidas en la superficie de contacto de la gota.

Figura 17: Reparto de microcápsulas coloreadas en la cuajada del queso modelo. Las muestras (de izquierda a derecha) son el control, las microcápsulas de color rojo, microcápsulas de color azul y el control.

Figura 18: El lactosuero obtenido al final del protocolo de elaboración del queso. Las muestras de lactosuero corresponden a las muestras de cuajada mostradas en la figura 17.

Figura 19: Actividad de la lactasa libre y encapsulada medida en el lactosuero obtenido a partir del protocolo de elaboración del queso modelo.

Figura 20: Parte superior: Microcápsulas de CaP estabilizadas con oligo-CGMP y los diversos recubrimientos aplicados a las mismas (parte central). Parte inferior: Administración controlada de enzimas encapsuladas a la cuajada del queso variando el grosor del recubrimiento.

Figura 21: Ilustraciones de varias funcionalidades de las proteínas de la leche útiles para, por ejemplo, tareas de administración.

Figura 22: Movilidad electroforética de CGMP monomérico y oligomérico.

Figura 23: (a) Carril 1=patrón, carril 2=agua MQ, carriles 3-9=tampón NaP de fuerzas iónicas crecientes de desde 20 hasta 460 mM y carril 10=tampón NaP 200 mM EDTA 0,1 M. (b) La cantidad de liberación de LOX de las partículas en función del aumento de la fuerza iónica de la disolución en la que se suspendieron las partículas. Figura 24: La cantidad de LOX repartida en el lactosuero en comparación con la cantidad total inicial añadida a la leche en forma libre o inmovilizada.

Figura 25: Gel de CGMP polimerizado (vial de vidrio de la derecha) elaborado mediante reticulación con mTG. El rayo láser rojo se introdujo desde el lado derecho y es visible dentro del gel transparente debido a la dispersión. El vial de vidrio de la izquierda contiene la muestra de control viscosa (no gelificada).

Figura 26: Microencapsulación de bacterias en la fase acuosa interna “gelificada” (W1) emulsionada en la fase oleosa (O) que contiene PGPR. La emulsión W1/O se emulsionó de nuevo en la fase acuosa externa (W2) que contenía 60 g/l de oligo-CGMP en tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7). La barra blanca de la imagen corresponde a una escala de longitud de 10 |im.

Figura 27: (a) Birrefringencia observada en imágenes de microscopía óptica de polarización cruzada a medida que el gel de oligo-CGMP se secaba progresivamente a temperatura ambiente. (b) Las fibrillas ensambladas (ordenadas) formando una fibra gruesa (ensamblaje jerárquico) con vueltas/giros se observaron en algunas partes de la muestra de oligo-CGMP secada. La barra blanca de la imagen corresponde a una escala de longitud de 10 |im.

Descripción detallada de la invención

Alimento, pienso o producto farmacéutico

En principio, el alimento, pienso o producto farmacéutico puede ser cualquier producto comercialmente relevante en el presente documento.

En relación con un producto alimenticio o pienso, un producto alimenticio o pienso preferido puede ser un producto a base de leche. Preferiblemente, el producto a base de leche es un producto lácteo tal como, por ejemplo, un producto de yogur o un producto de queso.

Ejemplos de un producto farmacéutico relevante podrían ser, por ejemplo, un medicamento, un dentífrico o un cemento óseo.

En una realización preferida, el producto es un producto alimenticio; preferiblemente, el producto alimenticio es un producto a base de leche (preferiblemente un producto lácteo tal como, por ejemplo, un producto de yogur o un producto de queso).

La leche puede ser, por ejemplo, leche de soja, leche de oveja, leche de cabra, leche de búfala, leche de yak, leche de llama, leche de camella o leche de vaca.

Puede preferirse que el producto alimenticio lácteo sea un producto lácteo fermentado tal como, por ejemplo, yogur, quark, queso, queso para pizza, yogur para beber, queso para untar, skyr o leche entera agria.

Etapa (i) - adición de una composición que comprende oligómeros de CGMP

Tal como entiende el experto en el presente contexto, la cantidad preferida de composición añadida que comprende oligómeros de CGMP en la etapa (i) dependerá generalmente de la funcionalidad relevante específica deseada (por ejemplo, como agente tensioactivo para la estabilización de coloides o para la encapsulación de un bioactivo (por ejemplo, una enzima)).

En relación con el punto (a) según el primer aspecto, puede preferirse que el producto comprenda, después de la adición de la composición, al menos 2 mg (tal como al menos 5 mg, al menos 10 mg, al menos 100 mg o al menos 1 g) de oligómeros de CGMP por kg del producto.

Composición que comprende oligómeros de CGMP tal como se comenta en el presente documento:

Tal como se comenta en el presente documento, los oligómeros de CGMP pueden elaborarse, por ejemplo, mediante el uso de TGasa basándose en, por ejemplo, lactosuero, concentrado de proteínas del lactosuero (WPC), aislado de proteínas del lactosuero (WPI) o CGMp monomérico más purificado (por ejemplo, el producto Lacprodan® CGMP-10) como material de partida de “CGMP monomérico” (véase, por ejemplo, la figura 1 y los ejemplos de realización en el presente documento).

Tal como entiende el experto en el presente contexto, los oligómeros de CGMP pueden elaborarse mediante otros métodos (por ejemplo, mediante reticulación química o fotoquímica).

Preferiblemente, la composición que comprende oligómeros de CGMP es una composición obtenida mediante la adición de transglutaminasa (TGasa) a una muestra de lactosuero en condiciones en las que los CGMP monoméricos de la muestra de lactosuero se reticulan para obtener de ese modo oligómeros de CGMp y, por tanto, la composición que comprende oligómeros de CGMP.

Basándose en las enseñanzas en el presente documento, es un trabajo rutinario para el experto identificar condiciones adecuadas (por ejemplo, temperatura, tiempo de incubación, etc.) para que la TGasa funcione correctamente y obtener de ese modo una composición que comprenda una cantidad adecuada de oligómeros de CGMP.

La muestra de lactosuero puede ser lactosuero o una muestra de lactosuero más concentrada, tal como, por ejemplo, concentrado de proteínas del lactosuero (WPC), aislado de proteínas del lactosuero (WPI) o CGMP monomérico más purificado (por ejemplo, el producto Lacprodan® CGMP-10).

Un experto conoce bien el término “lactosuero”, y se entiende que una muestra de lactosuero comprenderá una cantidad relativamente pequeña de proteínas relacionadas con la leche/cuajada, tales como, por ejemplo, para-K-caseína y/o K-caseína.

Preferiblemente, la muestra de lactosuero es una muestra de lactosuero, en la que la muestra comprende al menos el 50 % (tal como al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %) de proteínas del lactosuero (p/p del contenido total de proteínas de la muestra). En el ejemplo de realización en el presente documento, se usó el producto comercialmente disponible Lacprodan® CGMP-10 como material de partida de “CGMP monomérico”; comprende aproximadamente el 84 % de concentrado de proteínas y el contenido de CGMP monomérico es de aproximadamente el 72 % del contenido de proteínas. Es evidente que mediante el uso de tal material de partida de CGMP monomérico concentrado puede obtenerse una composición que comprenda oligómeros de CGMP con una concentración relativamente alta de oligómeros de CGMP; esto puede preferirse.

Por consiguiente, puede preferirse que la composición que comprende oligómeros de CGMP se refiera a una composición que comprende al menos el 2 % (tal como al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 % o al menos el 70 %) de oligómeros de CGMP (p/p del contenido total de proteínas de la composición).

Puede preferirse que la composición que comprende oligómeros de CGMP sea una composición que comprende desde 0,00001 mg hasta 1 mg (tal como desde 0,0001 mg hasta 0,99 mg, desde 0,001 mg hasta 0,99 mg o desde 0,01 mg hasta 0,99 mg) de oligómeros de CGMP por mg de la composición.

En el artículo de A. Tolkach comentado anteriormente, se usó un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC) como material de partida; sin limitarse a la teoría, se cree que una composición de oligómeros de CGMP con al menos el 30 % de oligómeros de CGMP (p/p) no se da a conocer directamente y sin ambigüedades en el artículo de A. Tolkach.

Por consiguiente, un aspecto independiente de la divulgación se refiere a una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares, en la que la composición comprende:

(a): al menos el 30 % (preferiblemente el 40 %, más preferiblemente el 50 %) de oligómeros de CGMP (p/p del contenido total de proteínas de la composición);

y en la que el CGMP monomérico es el péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de K-caseína y los monómeros de los oligómeros de CGMP son el CGMP monomérico.

Puede preferirse que la composición de oligómeros de CGMP comprenda la menor cantidad posible de proteínas relacionadas con la leche/cuajada, tales como para-K-caseína y/o K-caseína.

Por consiguiente, puede preferirse que la composición que comprende oligómeros de CGMP sea una composición en la que la razón oligómeros de CGMP/para -K-caseína K-caseína (p/p) es superior a 1 (tal como superior a 2, superior a 5, superior a 10 o superior a 100).

En el ejemplo de realización 2 en el presente documento, se comenta la formación de oligómeros de CGMP; tal como se comenta en este ejemplo 2, la formación de oligómeros de CGMP de mayor masa molar puede observarse claramente en los cromatogramas de exclusión molecular (figura 2). Se sabe que la masa molar de CGMP monomérico varía entre 6,7 -11 kDa dependiendo de la razón de CGMP no glicosilado y O-glicosilado.

En el ejemplo 2 se concluyó que la masa molar de los oligómeros de CGMP creados parece estar entre 14 -4000 kDa, es decir, un grado de polimerización (DP) ~ 2 - 600. El DP promedio en peso parece ser de 10 -100. El grado de polimerización (DP) promedio preferido puede depender generalmente de la funcionalidad relevante específica deseada (por ejemplo, como agente tensioactivo para la estabilización de coloides o para la encapsulación de un bioactivo (por ejemplo, una enzima)).

En general, se prefiere que la composición que comprende oligómeros de CGMP sea una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio del oligómero de CGMP es de desde 2 hasta 100000 (tal como desde 3 hasta 10000, desde 5 hasta 1000, desde 8 hasta 200 o más preferiblemente desde 9 hasta 125).

En algunos casos, puede preferirse que la composición que comprende los oligómeros de CGMP sea una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio es de desde 20 hasta 1000 (tal como desde 20 hasta 500, desde 30 hasta 300 o desde 40 hasta 125).

Los términos “oligómeros de CGMP” u “oligo-CGMP” usados en el presente documento abarcan en el presente documento una composición con, por ejemplo, un grado de polimerización (DP) promedio relativamente alto (por ejemplo, de 30 a 1000).

A veces, puede hacerse referencia en el presente documento (por ejemplo, en los ejemplos de realización en el presente documento) a, por ejemplo, “CGMP polimérico”; tal como entiende el experto en el presente contexto, “CGMP polimérico” se referirá generalmente a una situación con un grado de polimerización (DP) promedio relativamente alto (por ejemplo, un DP promedio de más de 50).

Un aspecto independiente de la divulgación se refiere a una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalente intermoleculares, en la que la composición comprende:

(a): al menos el 2 % (tal como al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 % o al menos el 70 %) de oligómeros de CGMP (p/p del contenido total de proteínas de la composición); y

en la que el grado de polimerización (DP) promedio del oligómero de CGMP es desde 2 hasta 100000 (tal como desde 3 hasta 10000, desde 5 hasta 1000, desde 8 hasta 200 o más preferiblemente desde 9 hasta 125);

Tal como se comenta en el ejemplo de realización a continuación, los presentes inventores encontraron que, en condiciones apropiadas, la a -lactalbúmina y la p-lactoglobulina también pueden modificarse mediante mTG y, de hecho, también pueden formarse hetero-oligómeros/polímeros con CGMP. En el caso del ejemplo de realización en el presente documento, había una pequeña cantidad de a -lactalbúmina y p-lactoglobulina presente en el material de partida y se encontró que cantidades menores de estas proteínas del lactosuero se incorporaron a los oligómeros de CGMP.

No se encontraron diferencias significativas entre homo-oligo-CGMP y hetero-oligo-CGMP con proteínas del lactosuero (por ejemplo, a -lactalbúmina y/o p-lactoglobulina) incorporadas en los mismos. Por tanto, la funcionalidad es muy similar para los homo-oligómeros y los hetero-oligómeros.

Los términos “oligómeros de CGMP” u “oligo-CGMP” usados en el presente documento abarcan tanto los homooligómeros como los hetero-oligómeros.

Funcionalidades/usos novedosos de los oligómeros de CGMP, tal como se comenta en el presente documento Tal como se comentó anteriormente, los presentes inventores identificaron que el CGMP reticulado covalentemente (denominado a continuación en el presente documento oligómeros de CGMP u oligo-CGMP) tenía muchas propiedades funcionales mejoradas nuevas/novedosas que no mostraba el CGMP monomérico. A continuación se comentan ejemplos preferidos de tales funcionalidades/usos novedosos.

En una realización preferida, los oligómeros de CGMP añadidos en la etapa (i) se usan para la unión de iones (por ejemplo, la unión de Ca, preferiblemente la unión de fosfato de calcio (CaP)), la encapsulación de una sustancia (por ejemplo, un fitoquímico tal como, por ejemplo, curcumina o p-caroteno), la encapsulación de una molécula (por ejemplo, una enzima tal como, por ejemplo, lactasa), la gelificación, el hinchamiento del gel en respuesta a la liberación desencadenada (por ejemplo, pH, fuerza iónica, temperatura), la conjugación covalente, la formación de complejos electrostáticos o la estabilización de coloides (por ejemplo, estabilización ácida, estabilización de Pickering o a través de estructuras/agregados autoensamblados).

Los mismos usos son usos preferidos para el aspecto independiente de la invención que se refiere a una composición que comprende oligómeros de CGMP como tal.

Tal como se comenta en el presente documento, el ejemplo 2 en el presente documento describe el autoensamblaje (asociación/agregación) de oligo-CGMP en micelas “similares a caseína” (coloides de asociación) y su uso para encapsular fitoquímicos tales como curcumina y p-caroteno; el CGMP monomérico no mostró adecuadamente esta propiedad de autoensamblaje y, por tanto, su utilidad para encapsular fitoquímicos tales como curcumina y pcaroteno. Por consiguiente, se prefiere que los oligómeros de CGMP del punto (a) sean partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas).

Preferiblemente, las partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas) comprenden sustancias encapsuladas (por ejemplo, dos o más moléculas de curcumina).

Tal como entiende el experto en el presente contexto, el grado de polimerización (DP) promedio se refiere a la reticulación, por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares, de los monómeros de CGMP para obtener los oligómeros de CGMP. Por consiguiente, las partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas) pueden comprender dos o más oligómeros de CGMP autoensamblados con diferente grado de polimerización (DP) de las moléculas individuales de oligómero de CGMP presentes en las partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas).

Preferiblemente, una partícula de oligómero de CGMP autoensamblada (agregada) comprende desde 2 hasta 100000 (tal como desde 3 hasta 10000 o desde 5 hasta 1000) oligómeros de CGMP individuales autoensamblados. Véase, por ejemplo, la figura 21 en el presente documento para una ilustración de partículas autoensambladas (agregadas).

Un aspecto independiente de la invención se refiere a una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares, en la que la composición comprende:

en la que los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas), preferiblemente en la que las partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas) comprenden sustancias encapsuladas;

La sustancia encapsulada puede ser, por ejemplo, un fitoquímico tal como, por ejemplo, curcumina, p-caroteno o, por ejemplo, un pigmento colorante (preferiblemente un pigmento colorante natural).

Tal como entiende el experto, el método de encapsulación puede extenderse fácilmente a diversos otros compuestos relevantes para aplicaciones alimentarias, tales como vitaminas insolubles en agua (D, E, K), ácidos grasos, etc., que deben protegerse mediante encapsulación. Por consiguiente, la sustancia puede ser, por ejemplo, una vitamina insoluble en agua (tal como, por ejemplo, vitamina D, E o K), un mineral, un péptido o un ácido graso. Tal como se comenta en el presente documento, el ejemplo 3 en el presente documento describe el uso de oligo-CGMP para elaborar bebidas transparentes ácidas estables a base de CGMP, lo que no es posible con la forma monomérica, ya que la estabilidad de CGMP monomérico en las bebidas ácidas no es muy buena y se agregan a un pH bajo, lo que conduce a la acumulación de turbidez en estas bebidas; por consiguiente, el uso de oligo-CGMP ofrece la posibilidad de elaborar bebidas ácidas ricas en proteínas únicamente a base de componentes derivados de la leche.

Por consiguiente, y en relación con el primer aspecto, el alimento, pienso o producto farmacéutico es preferiblemente un producto con un pH inferior a 5. Preferiblemente, el producto es una bebida (preferiblemente para consumo humano) con un pH inferior a 5.

Cuando el producto es un producto con un pH tan bajo/ácido, se prefiere que la composición que comprende los oligómeros de CGMP sea una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio es de desde 3 hasta 100000 (tal como desde 4 hasta 1000, desde 5 hasta 300 o desde 8 hasta 125).

Tal como se comentó anteriormente, el ejemplo 4 en el presente documento describe la estabilización coloidal de partículas precipitadas a base de sales de calcio con oligo-CGMP y su uso para el enriquecimiento con calcio. Tal como se describe en el ejemplo, los oligo-CGMP ralentizan la precipitación de las partículas de fosfato de calcio (CaP) de forma mucho más eficaz en comparación con su forma monomérica. En otras palabras, el oligo-CGMP puede interactuar con el fosfato de calcio (CaP) y actuar como estabilizador de las partículas de CaP. Puede estabilizar coloidalmente las partículas de CaP. Por tanto, pueden prepararse de forma muy controlada partículas de CaP de cualquier intervalo de tamaño deseado, por ejemplo, de 50 nm a > 10 |im. Además, el oligo-CGMP parece actuar también como estabilizador de otras sales de calcio. Por ejemplo, se han observado resultados similares a CaP con el carbonato de calcio (CaC). Basándose en esto, se espera que puedan obtenerse resultados similares para una amplia variedad de sales de calcio, tales como para el sulfato de calcio (CaS) o el oxalato de calcio (CaOx).

Un uso relevante en el presente documento es, por ejemplo, el uso de partículas de oligo-CGMP-sal de calcio (por ejemplo, oligo-CGMP-CaP) con el fin de enriquecer con calcio bebidas a base de productos lácteos y otras bebidas en las que se desea un enriquecimiento con calcio con partículas a base de calcio coloidalmente estables que no den lugar a problemas asociados con el calcio libre ni con partículas de mayor tamaño que se depositan por la acción de la gravedad o que puedan ser percibidas negativamente por los consumidores como sensación arenosa en la boca. De lo contrario, el enriquecimiento con calcio con partículas a base de calcio requeriría el uso de estabilizadores a base de hidrocoloides o tensioactivos (dispersantes).

Por consiguiente, se prefiere que los oligómeros de CGMP del punto (a) sean partículas de oligómero de CGMP-Ca (preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP o partículas de oligómero de CGMP-CaC (lo más preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP)).

Las partículas pueden tener preferiblemente un tamaño de entre 10 nm hasta 1000 |im (preferiblemente desde 25 nm hasta 750 |im, más preferiblemente desde 50 nm hasta 100 |im).

Un uso preferido es para bebidas con enriquecimiento con calcio (por ejemplo, en bebidas a base de lácteos). Otro uso preferido es como estabilizadores de Pickering para elaborar emulsiones y/o espumas estables.

Tal como se conoce en la técnica, una emulsión de Pickering es una emulsión estabilizada mediante partículas sólidas que se adsorben en la superficie de contacto entre las dos fases.

Cuando los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca, se prefiere que la composición que comprende los oligómeros de CGMP sea una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio es de desde 3 hasta 100000 (tal como desde 4 hasta 1000, desde 6 hasta 300 o desde 8 hasta 125). Un aspecto independiente de la divulgación se refiere a una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares, en la que la composición comprende:

en la que los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca, preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP o partículas de oligómero de CGMP-CaC (lo más preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP);

Un uso preferido es para el enriquecimiento con calcio de, por ejemplo, una bebida (por ejemplo, en una bebida a base de lácteos). Otro uso preferido es como estabilizadores de Pickering para, por ejemplo, elaborar emulsiones y/o espumas estables.

Tal como se comenta en el presente documento, el ejemplo 5 en el presente documento describe la estabilización coloidal de partículas precipitadas a base de sal de calcio con oligo-CGMP y su uso para la encapsulación (por ejemplo, la administración y la liberación controladas de enzimas lácteas en la matriz del queso) y el uso de oligo-CGMP para la estabilización de Pickering de emulsiones. Por ejemplo, se encontró que la enzima lactasa se encapsulaba eficazmente y que la mayor parte de la actividad enzimática se conservaba en la cuajada (es decir, no había una cantidad significativa de enzima en el lactosuero).

El ejemplo 5 también describe el uso de las partículas mesoporosas/macroporosas de tamaño controlado obtenidas mediante combinaciones de sal de calcio (por ejemplo, CaP/CaC) y oligo-CGMP con el fin de encapsular una amplia variedad de moléculas tales como curcumina, bacteriocinas tales como la nisina, lisozima, enzimas lácteas, bacterias probióticas, etc.

También es relevante destacar el uso descrito de partículas de oligo-CGMP-CaP como tal o recubiertas con recubrimientos a base de componentes lácteos adecuados (tales como caseinatos, proteínas del lactosuero, proteínas del lactosuero modificadas, lisozima, grasa láctea, lecitina, etc.) para encapsular las enzimas de maduración del queso, de modo que puedan administrarse y liberarse preferiblemente en la matriz de la cuajada del queso y pueda minimizarse su fuga hacia el lactosuero.

Por consiguiente, se prefiere que los oligómeros de CGMP del punto (a) sean partículas de oligómero de CGMP-Ca (preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP o partículas de oligómero de CGMP-CaC (lo más preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP)) que comprenden moléculas encapsuladas. Las partículas pueden tener preferiblemente un tamaño de entre 10 nm hasta 1000 |i m (preferiblemente desde 25 nm hasta 750 |i m, más preferiblemente desde 50 nm hasta 100 |i m).

Cuando los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca que comprenden moléculas encapsuladas, se prefiere que la composición que comprende los oligómeros de CGMP sea una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio es de desde 3 hasta 100000 (tal como desde 4 hasta 1000, desde 6 hasta 300 o desde 8 hasta 125).

Un aspecto independiente de la divulgación se refiere a una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares, en la que la composición comprende:

en la que los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca (preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP o partículas de oligómero de CGMP-CaC (lo más preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP)) que comprenden moléculas encapsuladas;

Las partículas pueden tener preferiblemente un tamaño de entre 10 nm hasta 1000 |i m (preferiblemente desde 25 nm hasta 750 |i m, más preferiblemente desde 50 nm hasta 100 |i m).

La molécula encapsulada puede ser, por ejemplo, un pigmento colorante (por ejemplo, curcumina), una bacteriocina (tal como, por ejemplo, nisina), una enzima (tal como, por ejemplo, lisozima, lactasa o una enzima láctea (por ejemplo, quimosina)) o bacterias (por ejemplo, bacterias probióticas).

Cuando los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca que comprenden moléculas encapsuladas (por ejemplo, una enzima), puede preferirse que el producto sea un producto alimenticio (preferiblemente un producto a base de leche, tal como un producto lácteo (por ejemplo, un producto de yogur o un producto de queso)).

Basándose en la enseñanza en el presente documento, se espera que los oligómeros de CGMP (por ejemplo, la combinación de oligómero CGMP-sal de partículas de Ca (oligo-CGMP-sal de calcio, tal como, por ejemplo, oligo-CGMP-CaP)) puedan ser útiles para, por ejemplo, cualquiera de las aplicaciones enumeradas a continuación:

- Aplicaciones para la salud bucal (dientes) en las que se desea un efecto anticariogénico y encapsulación; - Aplicaciones para la salud ósea (regeneración);

- Vector no viral para insertar moléculas encapsuladas tales como ácidos nucleicos, ADN o ARN en las células. La ventaja es que pueden obtenerse partículas de CaP de tamaño y eficiencia de encapsulación (atrapamiento) muy controlados y todos los componentes son muy biocompatibles;

- Elaborar partículas cerámicas a base de sales de calcio de tamaño, morfología, tamaños de poro, etc., muy controlados, que pueden usarse para muchos fines, por ejemplo, cromatografía de afinidad, etc;

- Elaborar partículas/cerámicas biocompatibles de propiedades fisicoquímicas controladas.

Ejemplos

Tal como se entiende, cuando en los ejemplos de realización a continuación se hace referencia a “nosotros”, se hace referencia a los presentes inventores.

Ejemplo 1 - Materiales y métodos

Materiales

Se obtuvo la muestra comercial de glicomacropéptido de caseína (CGMP) de Arla Food Ingredients, Dinamarca, con la marca Lacprodan® CGMP-10. Según la información del proveedor, este CGMP (nuestro material de partida) tenía tanto grasa como lactosa < 0,2 %, y el 84,6 % de concentrado de proteínas aprox. de materia seca. El contenido de CGMP era de aproximadamente el 72,67 % del contenido de proteínas. El contenido de ácido siálico del CGMP era de aproximadamente el 6,2 %. Se obtuvo transglutaminasa microbiana (mTG) de Leveking y se comercializa con el nombre comercial: Leveking TG. Tiene un aspecto de polvo blanco. Esta formulación de mTG tiene un intervalo de pH efectivo de 5,0 a 8,0 y el pH óptimo es de 6,0. El intervalo de temperatura efectiva es de 5 a 60 °C y el intervalo de temperatura óptima es de aproximadamente 45 a 55 °C. Se declara que la actividad enzimática puede mantenerse por encima del 80 % durante 12 meses si se almacena en las siguientes condiciones: 1) mantener alejada de la luz solar y del agua de lluvia durante el transporte y el almacenamiento y 2) mantener en un ambiente seco y bien ventilado por debajo de 25 °C. El resto de los productos químicos eran de calidad analítica.

Método

Preparación de disoluciones

Se suspendió polvo de CGMP (30 mg) en 1 ml de tampón fosfato de sodio 100 mM ajustado a pH 7,04 NaCl 100 mM NaNa al 0,02 % en un tubo Eppendorf para obtener una concentración de 30 g l-1. Se agitó el tubo Eppendorf a 1500 rpm en un dispositivo vibrador para Eppendorf (IKA MS 3 Basic) durante 1 minuto y luego se dejó toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, se centrifugaron los tubos Eppendorf a 13500 *g (Mini Spin) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se filtró el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,2 |im (Minisart Sterile-EO, Sartorius Stedim biotech).

Determinación del contenido de CGMP soluble mediante el método de secado

Se preparó una dispersión de 20 ml de 30 g l-1 de polvo de CGMP suspendido en un tampón fosfato de sodio 100 mM NaCl 100 mM NaN³al 0,05 % ajustado a pH 7. A continuación, se llenó 1 ml de esta disolución en diez tubos Eppendorf diferentes, previamente pesados y numerados (de 2 ml de capacidad), y se agitó a 1500 rpm en un dispositivo vibrador para Eppendorf (IKA MS 3 Basic) y se dejó toda la noche a 4 °C para su completa hidratación, solubilización y equilibrio. Al día siguiente, se centrifugaron los tubos Eppendorf a 13500 xg (Mini Spin) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se decantó cuidadosamente el sobrenadante de los tubos. A continuación, se colocaron los tubos Eppendorf en una campana de humos y se secaron bajo un flujo constante de aire a temperatura ambiente. Se registró el peso de los tubos numerados cada 24 horas durante un periodo de tres días consecutivos. Se corrigió el peso medido en función del peso vacío inicial de los tubos. Se promedió el peso seco corregido del sedimento centrifugado de los 10 tubos para obtener el peso seco promedio de la fracción insoluble, es decir, el sedimento, y el error máximo en las mediciones.

Reticulación enzimática

Se realizó la reticulación de CGMP con mTG a 40 °C usando una razón CGMP: polvo de enzima de 10:1 (p/p) que corresponde a una razón molar CGMP:mTG de “ 100:1. En resumen, se llenan 1,5 ml de la disolución de CGMP en un tubo Eppendorf de 2 ml y se le añadió polvo de mTG para obtener la razón tal como se describió anteriormente. A continuación, se agitaron con vórtex los tubos Eppendorf (2000 rpm, IKA MS 3 Basic) y se mantuvieron en incubación a 40 °C en una incubadora para Eppendorf (Eppendorf Thermo Mixer C, 2 ml) con agitación continua a 500 rpm. Se tomaron muestras después de diversos puntos de tiempo (0 - 72 horas) de reacción y se usaron para el análisis posterior después de la inactivación de la actividad residual de mTG. Se inactivó la mTG calentando la disolución a 95 °C durante 5 minutos. Se verificó, mediante mediciones de funcionalidad, que el tratamiento térmico a 95 °C durante 5 minutos no dio como resultado ningún cambio en la funcionalidad de los oligómeros/polímeros solubles en comparación con los no calentados. Esto indicó que el tamaño (masa molar) de los oligómeros/polímeros de CGMP no cambió debido a este tratamiento térmico y todos los resultados observados se deben efectivamente a oligómeros/polímeros reticulados.

Cromatografía de exclusión molecular

Se centrifugaron las muestras extraídas en diversos puntos de tiempo a 13400 *g durante 90 s y, a continuación, se diluyó el sobrenadante hasta 3 g l-1 en tampón fosfato de sodio 100 mM NaCl 100 mM (pH = 7). Se inyectaron las muestras manualmente usando un bucle de 100 |il. La columna usada fue Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) que tiene un volumen de lecho de columna de ~ 24 ml. Se conectó la columna a un sistema purificador Ákta y se hizo funcionar a temperatura ambiente. Se equilibró la columna y se eluyó con tampón fosfato de sodio 10 mM a pH 7,04 a una velocidad de flujo de 0,5 ml min-1. Se monitorizó el eluato a 220 y 280 nm. Se usaron los datos de calibración de la columna del proveedor para obtener una indicación aproximada de los intervalos de masa molar y para juzgar la calidad de la separación y la elución. Según la información del proveedor, el límite de exclusión de la columna era de ~ 4 MDa y el volumen de huecos (V0) es de ~ 7 ml. Los volúmenes de elución (retención) notificados (Ve de pico) para las proteínas globulares eluidas en tampón fosfato 50 mM que contenía NaCl 0,15 M a pH 7 y una velocidad de flujo de 0,5 ml min-1 son de ~ 12 ml para tiroglobulina (669 kDa), ~ 14,5 ml para ferritina (440 kDa), ~ 16 ml para BSA (67 kDa) y ~ 18 ml para ribonucleasa-A (13,7 kDa). Para describir la distribución de tamaño de los productos formados, el cromatograma SEC se dividió en cuatro regiones: 7,0 -8,0 ml (polímeros), 8,0 - 15,0 ml (oligómeros), 15,0 - 17,0 ml (monómeros). Para comparar las cantidades relativas, se integró la región monomérica, oligomérica y polimérica para obtener el área bajo los picos de absorbancia medida a UV 220 nm, que es un indicador de la cantidad de material bajo los picos. A partir de esta información se estimó la disminución del péptido monomérico y el aumento de los oligómeros/polímeros, suponiendo arbitrariamente coeficientes de extinción molar similares para las formas monoméricas y oligoméricas/poliméricas. La fracción de cada especie se tomó como la razón del área en el cromatograma para esa especie particular dividida entre el área total. Se calculó el aumento de las fracciones de oligómeros para obtener la distribución de tamaño (masa) de los productos.

Experimentos de precipitación de CaP

En una cubeta de plástico de 2 ml (1 cm de longitud de paso), se mezclaron 0,5 ml de CGMP monomérico (20 g l-1) o 0,5 ml de oligo-CGMP (20 g l-1) con 0,5 ml de tampón fosfato de sodio 0,1 M que contenía NaCl 0,1 M adicional y ajustado a pH 7,04. Se logró el mezclado pipeteando hacia dentro y hacia fuera cinco veces usando la misma punta. Por último, se añadió un volumen fijo (por ejemplo, 2, 10 o 20 |il) de CaCl²(50 %, p/v) y se mezcló la disolución rápidamente pipeteando hacia dentro y hacia fuera cinco veces, tras lo cual se introdujo inmediatamente en el instrumento de dispersión de luz dinámica y se analizó. La demora típica entre la adición de CaCl²y el inicio del análisis es de aproximadamente un minuto.

Si el tamaño de las partículas se volvía muy superior a aproximadamente 1 |im y comenzaban a sedimentar bajo la influencia de la fuerza gravitatoria, la intensidad dispersada promedio a lo largo de la duración de la medición no es constante y los resultados no son fiables. Esto sólo se produce en el caso del experimento de control, es decir, cuando sólo se forma CaP y las partículas son demasiado grandes, lo que da lugar a una disolución muy turbia. En el caso del oligo-CGMP, el tamaño de las partículas estaba en la dimensión “nano” y no había artefactos debidos a la dispersión múltiple. Por tanto, los resultados son reproducibles y precisos.

Alternativamente, los experimentos de precipitación de CaP también pueden realizarse midiendo las turbideces en un espectrofotómetro, y estos experimentos se realizaron de la siguiente manera: en un tubo Eppendorf de 2 ml, se mezclaron 0,5 ml de Ha-Lactase-5200 con 0,5 ml de tampón fosfato de sodio 0,1 M que contenía NaCl 0,1 M adicional y ajustado a pH 7,04 (experimento de control). Para un experimento del blanco, se usaron 0,5 ml de agua MQ en lugar de Ha-Lactase. En el caso de las disoluciones de prueba, se mezclaron 0,5 ml de agua MQ o Ha-Lactase-5200 con 0,5 ml de CGMP monomérico o CGMP polimérico a una concentración volumétrica fija de 10 g l-1 disuelta en tampón fosfato de sodio 0,1 M que contenía NaCl 0,1 M adicional (pH 7,04). Se realizó el mezclado usando una mezcladora en vórtex para Eppendorf durante 60 s (IKA MS 3 Basic). A continuación, se transfirió la disolución mezclada a una cubeta de plástico de 1 ml de 1 cm de longitud de paso. Por último, se añadieron 2 o 20 |il de CaCl²(50 %, p/v) y se mezcló la disolución rápidamente pipeteando hacia dentro y hacia fuera 6 veces, después de lo cual se introdujo inmediatamente en el espectrofotómetro (UV-1800, Shimadzu) y se registró la absorbancia en función del tiempo a una longitud de onda de 400 nm. La absorbancia medida es un indicador de la turbidez de la disolución, que a su vez es el indicador del tamaño de las partículas de la disolución. La absorbancia medida a tiempo cero se corrigió restando la absorbancia del experimento del blanco. Cuando el tamaño de las partículas es muy superior a aproximadamente 1 |im y empiezan a sedimentar bajo la influencia de la fuerza gravitatoria, la absorbancia comienza a disminuir, lo que indica el inicio de la separación de fases. Para una suspensión estable, el inicio de la separación de fases se retrasa. Para una reacción de precipitación rápida, el aumento de la absorbancia con el tiempo es rápido, mientras que esta pendiente disminuye para los sistemas en los que la precipitación se retrasa debido a la ralentización de la cinética de formación de CaP.

El control exacto del pH durante o después de la formación de las partículas de CaP se optimizó de la siguiente manera: en un tubo Eppendorf de 2 ml, se mezclaron 0,5 ml de Ha-Lactase con 0,5 ml de Na²HPO⁴(C = 0,05, 0,1, 0,2 y 0,3 M) agitando con vórtex vigorosamente el tubo Eppendorf durante 60 s y luego dándole la vuelta 10 veces. A continuación, se añadieron 20 |il de CaCl²a la disolución anterior y se agitó con vórtex el tubo Eppendorf durante 60 s (se repitió 6 veces, es decir, 60 s de vórtex seguido de 60 s de descanso y, a continuación, el siguiente ciclo de 60 s de vórtex, repetido 6 veces). Después de esto, se dejó la disolución durante 1 hora y luego se centrifugó a 13500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se midió con precisión el pH del sobrenadante (precisión hasta el segundo decimal) usando un medidor de pH (sensIon PH3 de Hach equipado con un electrodo de Mettler toledo). En una segunda serie de experimentos, se diluyó la disolución obtenida después de la precipitación de CaP a partir de una concentración de Na²HPO⁴de 0,3 M con 1 ml de agua MQ o con 1 ml de Na²HPO⁴(C = 0,1, 0,2 y 0,3 M) y se midió con precisión el pH del sobrenadante.

Dispersión dinámica de luz (DLS)

Se midió el radio hidrodinámico (Rh) usando un aparato nano-zetasizer (Nano-ZS, modelo: ZEN 3600, Malvern Instruments, Worcestershire, RU) equipado con un láser de 633 nm. Se colocaron las muestras en una cubeta de plástico de 2 ml con 10 mm de longitud de paso (cubetas VWR PS, semi-micro, n.° de cat. 634-0676, VWR Int. bvba, Alemania). Se realizaron las mediciones a 25 °C en el modo automático, en el que el atenuador y la posición de medición se seleccionaron automáticamente. Se midieron las fluctuaciones de intensidad de la luz dispersada a 173 °C durante 30 s. Se promediaron diez barridos de este tipo para obtener la curva de correlación. A continuación, se calcularon las distribuciones de tamaño basadas en la intensidad y el volumen usando el software convencional de Malvern. Se usó el tiempo de decaimiento de las curvas de correlación para ajustar la distribución de los coeficientes de difusión y luego se calcularon los radios hidrodinámicos usando la ecuación de Stokes-Einstein. Se realizaron automáticamente estas etapas seleccionando el modelo de propósito general para ajustar la distribución usando el análisis acumulativo y especificando la salida del radio hidrodinámico.

Experimentos de agregación a pH bajo

En una cubeta de plástico de 1,5 ml de 1 cm longitud de paso, se tomaron 900 |il de CGMP monomérico o polimérico de 10 g l-1 disuelto en agua MQ y luego se añadieron 100 |il de HCl 1 M y se mezcló rápidamente la disolución pipeteando hacia dentro y hacia fuera 6 veces, tras lo cual se colocó inmediatamente en el espectrofotómetro (UV-1800, Shimadzu) y se registró la absorbancia en función del tiempo a una longitud de onda de 400 nm. A partir de los primeros experimentos, se determinó el volumen de HCl que debía añadirse para alcanzar un objetivo en el intervalo ácido comprendido entre pH 2 y 3,5.

La absorbancia medida es un indicador de la turbidez (t) de la disolución, según la siguiente relación:

t = H M , C

La turbidez de una disolución es un indicador del tamaño molecular o de agregado (indicado por Mw) y de su concentración (C). La agregación de moléculas para una concentración volumétrica fija conduce a un aumento de la turbidez, que se indica mediante un aumento de la absorbancia medida.

Método para elaborar microcápsulas mediante un procedimiento de doble emulsión

En primer lugar, se elabora una emulsión primaria de agua al 10 % en aceite (v/v) usando la disolución de enzima (Ha-Lactase-5200) como fase de agua y aceite de soja Span-80 (100 x CMC, es decir, ~ 2 % p/v) como fase de aceite. Se elabora la emulsión mezclando vigorosamente las disoluciones de enzima y aceite. En la escala de 1 ml, es decir, en un tubo Eppendorf, se realiza un mezclado vigoroso usando un dispositivo agitador para Eppendorf a 3000 rpm durante 60 s. Se repite la etapa de mezclado 5 veces. A continuación, se elabora la emulsión doble (secundaria) emulsionando el 1 % (v/v) de la emulsión primaria (W/O) en agua. La fase acuosa externa comprende 10 g l-1 de oligo-CGMP en tampón fosfato de sodio 100 mM NaCl 100 mM ajustado a pH 7. Se realiza el mezclado en esta etapa en condiciones suaves, es decir, a 500 rpm durante 30 s (¡sólo una vez!). Después de esta etapa, las microcápsulas de doble emulsión tienen un recubrimiento de proteínas superamoleculares de la leche. A continuación, la doble emulsión así obtenida se diluye ~ 100 veces en tampón fosfato de sodio 0,1 M NaCl 0,1 M y se observa al microscopio óptico.

Pueden elaborarse microcápsulas estabilizadas por Pickering a base de CaP-oligo-CGMP mediante el procedimiento de doble emulsión haciendo un cambio importante en la etapa de elaborar la emulsión secundaria. Se elabora la emulsión secundaria usando CGMP polimérico y luego se genera inmediatamente CaP in situ tal como se describió anteriormente. Se planteó la hipótesis de que esta etapa adicional conduce a la deposición de la cubierta de CaP alrededor del CGMP polimérico que está estabilizando la superficie de contacto exterior. Se usó microscopía óptica (tal como se describe a continuación) para observar si las partículas de CaP estaban efectivamente recubiertas en la superficie de contacto exterior. Los experimentos de control, en los que se generó CaP en ausencia de CGMP polimérico, no pudieron realizarse porque estas emulsiones dobles no eran estables y no podían observarse al microscopio óptico. Por tanto, sólo se describen los resultados del experimento de “prueba”.

Microscopía óptica

Se colocó una gota de 50 |il de la emulsión doble diluida obtenida en la etapa 8 (anterior) en un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos de vidrio delgado. Se observó el portaobjetos bajo el modo de transmitancia en un microscopio óptico (Olympus BX 51) y con un aumento de 40X (Olympus Plan CN, 40x/0,65 Ph2, Infinite/0,17/FN 22). Se capturaron las imágenes usando una cámara CCD (Olympus SC 30) acoplada al microscopio. La imagen capturada se escaló usando un portaobjetos de calibración y la barra blanca de la imagen corresponde a una escala de longitud de 20 |im.

Método para elaborar partículas de CaP cargadas de enzimas estabilizadas por oligo-CGMP y medición de la actividad

Mezclar 0,5 ml de Ha-Lactase-5200 con 0,5 ml de oligo-CGMP (20 g l-1 en tampón fosfato de sodio 0,1 M NaCl 0,1 M, pH 7) agitando con vórtex. A continuación, añadir 20 |il de CaCl²(50 % p/v) y mezclar con vórtex. A continuación, añadir 1 ml de disolución de caseinato de sodio (20 g l-1 en Na²HPO⁴0,15 M glicerol al 50 %) a lo anterior y agitar con vórtex inmediatamente durante 30 s y luego dejar en reposo durante 15 minutos. A continuación, se agita con vórtex durante 30 s y se mezcla suavemente dando la vuelta al tubo Eppendorf a 10 rpm durante 2 horas. A continuación, se centrifuga la suspensión durante 5 minutos a 3.000 rpm y a temperatura ambiente y se separa cuidadosamente el sedimento retirando el sobrenadante. El sedimento así obtenido se lava a continuación al menos 4 veces con 1,5 ml de tampón (tampón fosfato de sodio 0,1 M NaCl 0,1 M, pH 7).

Se diluye el sobrenadante 100X con agua MQ y se mide su absorbancia a UV 280 nm. El cambio en la absorbancia en comparación con la disolución de enzima de partida es la cantidad de enzima encapsulada en las partículas de CaP-CGMP polimérico. La concentración de proteína también se confirma mediante un método convencional conocido en la técnica, tal como el ensayo BCA.

Se comprueba el balance de masas disolviendo un conjunto de sedimentos en HCl 0,1 M y luego midiendo la concentración de proteína de la disolución transparente. Esta es la medición directa de la enzima atrapada en las partículas de CaP-CGMP polimérico.

Se preparan disoluciones para la medición de la actividad de la lactasa para la medición de la actividad de la lactasa neutra según la técnica (método de la lactasa neutra en FCC IV - Pruebas y Ensayos Generales - 801-802). A continuación se representó la tasa de producto formado a una concentración variable de sustrato como tasa frente a la concentración de sustrato. Los puntos de datos se ajustaron con el modelo de Michaelis-Menten y los parámetros de mejor ajuste se obtuvieron mediante la minimización de la suma de las diferencias al cuadrado entre los puntos de datos y el cálculo del modelo. El procedimiento de regresión no lineal seguido en estos ajustes es fiable (R2 > 0,99). Los parámetros cinéticos obtenidos mediante el ajuste se indican en la figura 15.

Encapsulación de curcumina

Para preparar una disolución madre de curcumina, se suspendieron 100 mg de polvo de cúrcuma comercial en 10 ml de etanol y se agitaron con vórtex y se mantuvieron para la inversión durante 2 horas. Se cerró el tubo y se cubrió con papel de aluminio para impedir la degradación de la curcumina por la oxidación y la luz UV. A continuación, se centrifugó la suspensión a 13200 rpm durante 30 minutos para separar las partículas insolubles de la curcumina solubilizada en etanol. Se recogió el sobrenadante cuidadosamente y se usó como disolución madre de curcumina en etanol. Se ajustó la disolución madre con etanol de manera que una dilución 100x de esta disolución madre en agua MQ diera una absorbancia de 2 ± 0,1 a 420 nm, cuando se midió inmediatamente después de la dilución. Si se almacena en condiciones ambientales, la absorbancia disminuye rápidamente debido a la degradación de la curcumina por la oxidación y la luz. Sin embargo, cuando se encapsula en partículas de CaP estabilizadas por oligo-CGMP o en liposomas, la curcumina resulta mucho más estable (la semivida aumenta en 5 -10 veces) y, por tanto, resulta adecuada para estudiar el reparto de las microcápsulas en cuajos de queso modelo (los experimentos típicos se terminan en dos días).

Para encapsular la curcumina, se añadieron 10 |il de disolución madre de curcumina a 990 |il de diversas concentraciones de oligo-CGMP autoensamblado. La encapsulación de la lactasa y la curcumina en partículas de CaP estabilizadas por oligo-CGMP fue similar al método de encapsulación mencionado anteriormente de las enzimas en estas partículas. Para cargar la curcumina, se añadieron 10 |il de disolución madre de curcumina a 990 |il de tampón (± lactasa) que se usó para la encapsulación. La curcumina cargada no se retiró mediante repetidos lavados, lo que indica una buena encapsulación y estabilización. La suspensión de microcápsulas con curcumina encapsulada tenía un aspecto amarillo.

Experimentos del queso modelo

Método para elaborar un queso modelo a escala de 10 ml

Añadir 11 g de leche desnatada en polvo (SMP) a 100 ml de agua MQ que también contiene 100 |il de CaCl²al 50 % p/v (concentración final de 4,5 mM) en un frasco de vidrio para obtener una concentración de SMP de 110 g l-1. Agitar suavemente usando un agitador magnético durante 30 minutos (¡evitar la formación excesiva de espuma!). A continuación, mantener la dispersión de SMP a temperatura ambiente (~ 24 °C) durante al menos 30 min (sin agitación) para dejar que se equilibre. Pipetear 10 ml de leche en los tubos de vidrio (2,1 cm de diámetro y 9,5 cm de longitud). Poner los tubos de vidrio a 32 °C durante 10 minutos en un baño de agua que también esté provisto de un dispositivo mecánico para hacer girar los tubos de vidrio a aproximadamente 32 rpm. A continuación, añadir 100 -300 |il de microcápsulas (dependiendo de la dosis requerida). Añadir 200 |il de Thermolase diluida para obtener la coagulación en aproximadamente 300 - 350 s. Cuando se observa una coagulación visible en la película delgada de leche, se registra el tiempo de coagulación y se saca el tubo de vidrio y se mantiene quieto a temperatura ambiente para que cure el gel durante un periodo de 3x CT. Después del periodo de espera de 3x CT, se rompe el gel usando una punta de pipeta de 1 ml (aproximadamente 5 pasadas lineales en direcciones perpendiculares). A continuación, los tubos de vidrio se transfieren de nuevo al baño remcat y se agitan a 32 °C durante 10 minutos para la separación de fases del lactosuero (sinéresis). A continuación, la cuajada y el lactosuero sometidos a separación de fases se transfieren a un tubo de plástico de 50 ml y se centrifugan a 3000 rpm durante 5 minutos a 20 °C usando un rotor de cubeta oscilante. El sobrenadante (lactosuero) después de la centrifugación se recoge por separado y se usa para su posterior análisis. El sedimento (“cuajada” del queso modelo) en el fondo del tubo se mantiene en el tubo de plástico y se usa para su posterior análisis.

Preparación de microcápsulas coloreadas

El método seguido para encapsular la lactasa en partículas de CaP-oligo-CGMP-caseinato de Na fue similar al método descrito anteriormente para encapsular la enzima en estas partículas (se en el presente documento). El método de encapsulación de la lactasa mediante el método de doble emulsión se ha descrito en detalle en el presente documento. Se usaron dos enfoques distintos para elaborar las microcápsulas coloreadas; 1) las cápsulas de color azul se elaboraron añadiendo 1 mg de azul de Coomassie (R-250) a 1 ml de la disolución de enzima y equilibrándola durante 48 horas a 4 °C y después retirando cualquier partícula insoluble mediante centrifugación a 13200 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante contenía azul de Coomassie unido molecularmente a la enzima, proporcionándole un color azul intenso y algo de colorante libre. A continuación se encapsuló la enzima coloreada y las microcápsulas se lavaron repetidamente (protocolo de 6 lavados) para retirar el colorante libre (no unido). En un experimento independiente se comprobó que, cuando sólo se encapsulaba el colorante libre, la mayor parte del mismo podía retirarse después de 6 lavados. Por tanto, las partículas finales de color azul contenían enzima encapsulada que tenía azul de Coomassie unido a la misma. Si la enzima se escapa de las microcápsulas, se repartirá en el lactosuero y podrá detectarse mediante observación visual o usando un espectrofotómetro. 2) En el caso de las micropartículas elaboradas mediante el método de doble emulsión, se añadieron 10 |il de disolución madre de p-caroteno (NBC al 30 %, Natural Colors, Chr. Hansen) a 1 ml de la fase de aceite y se agitó con vórtex para dispersarla uniformemente en la fase de aceite. Cuando las microcápsulas se elaboraron mediante el método de doble emulsión (W/O/W) tenían un color rojo debido a la presencia de p-caroteno en la fase de aceite.

Medición de la actividad enzimática en lactosuero

El método para medir la actividad de la lactasa fue similar al descrito anteriormente y se realizó según la técnica (que se adaptó básicamente a una escala más pequeña (1 ml) a partir del procedimiento analítico de enzimas convencional; por ejemplo, el método de la lactasa neutra en FCC IV - Pruebas y Ensayos Generales - 801-802), con algunas modificaciones adicionales tal como se describe a continuación. El cambio más importante para la medición de la actividad en el lactosuero fue que el blanco usado en este caso fue lactosuero obtenido del procedimiento del queso modelo en el que no se añadió lactasa (libre de encapsulada). Este es el blanco correcto que va a usarse en el ensayo para tener en cuenta la dispersión de fondo de diversos componentes del lactosuero. Este lactosuero del blanco se mezcla con el sustrato y se trata de manera similar al caso de prueba. El otro punto importante a tener en cuenta es que, después de la adición de Na²CO³(para detener la reacción enzimática), se centrifugaron las muestras que contenían partículas a 13400 rpm durante 5 minutos y luego se transfirió el sobrenadante cuidadosamente a una cubeta de plástico para medir la absorbancia a 420 nm.

Para estos experimentos de medición del reparto de la actividad de la lactasa en el lactosuero, se dosificaron 5,5 NLU por ml de la leche usada para elaborar el queso modelo. Para ello, se diluyó adecuadamente la enzima “libre” a partir de su disolución madre (Ha-Lactase-5200, formulada y comercializada por Chr. Hansen), de forma que pudieran dosificarse 5,5 NLU ml-1 añadiendo 100-300 |il de la disolución diluida a la leche. Las microcápsulas contenían lactasa con un rendimiento de encapsulación de 11238 ± 3 % NLU/g (base seca), tal como se mide a 40 °C, pH 6,5 usando el sustrato ONPG. La fracción de volumen de las microcápsulas suspendidas en el tampón se ajustó a aproximadamente 50 mg ml-1 para garantizar que puedan dosificarse 5,5 NLU ml-1 añadiendo 100 -300 |il de estas suspensiones.

Ejemplo 2 - Autoensamblaje (asociación/agregación) de oligo-CGMP en micelas “similares a caseína" (coloides de asociación) y su uso para encapsular fitoquímicos tales como curcumina y p-caroteno.

Se reticuló CCGMP monomérico (Lacprodan® CGMP-10, véase la figura 1) usando transglutaminasa microbiana (mTG). El monómero CGMP tiene tres residuos de Lys y dos de Gln en su secuencia primaria y estos son los sustratos diana de la mTG. La reticulación de Lys y Gln inducida por la mTG conduce a la formación de CGMP oligomérico por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares. Los términos oligómero y polímero se usan manera intercambiable en el presente documento, ya que la mayoría de las funcionalidades son válidas para ambos.

La formación de oligómeros de CGMP de mayor masa molar puede observarse claramente en los cromatogramas de exclusión molecular (figura 2). Se sabe que la masa molar del CGMP monomérico varía entre 6,7 - 11 kDa dependiendo de la razón de CGMP no glicosilado y O-glicosilado. La columna usada fue Superose 610/300 GL (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) que tenía un volumen de lecho de columna de ~ 24 ml. El límite de exclusión de la columna (aproximadamente el volumen de huecos, es decir, ~ 7 ml) se notifica como ~ 4 MDa. Este límite de exclusión se basa en un patrón de proteína globular y no puede usarse como tal para los oligómeros de CGMP, que muy probablemente son bobinas aleatorias. Aun así, este cromatograma indica que, después de 45 h de reacción, más del 80 % del CGMP monomérico se convirtió en oligómeros de mayor masa molar. La masa molar de estos oligómeros parece estar entre 14 - 4000 kDa, es decir, un grado de polimerización (DP) de ~ 2 - 600. El DP promedio en peso parece ser de 10 - 100. Pueden obtenerse cifras más precisas al respecto usando diversas técnicas analíticas, tales como espectrometría de masas y dispersión de luz. Basándose en los datos comentados en el presente documento, puede concluirse con seguridad que la reticulación de CGMP monomérico usando mTG conduce a la formación de CGMP oligomérico y esto puede observarse a partir del aumento en el área bajo los cromatogramas de las moléculas que eluyen (véase la figura 2) entre el volumen de huecos (7 ml) y el del CGMP monomérico (15 - 17 ml). El DP es lo suficientemente alto como para denominar a estas moléculas oligómeros, es decir, oligómeros de CGMP.

El cromatograma de exclusión molecular del CGMP nativo, es decir, no modificado (figura 2), indica que se compone principalmente de CGMP y que hay cantidades menores de otras proteínas que aparecen como un hombro. El volumen de elución del hombro es similar al de las proteínas del lactosuero p-lactoglobulina. También hay una cantidad menor de proteínas de mayor tamaño que eluyen a tiempos de elución más bajos que el CGMP. Esto podría ser la fracción más glicosilada del CGMP que eluye antes debido al mayor tamaño hidrodinámico debido a la glicosilación. El volumen de elución del pico principal del CGMP monomérico es mayor que el de la p-lactoglobulina. Esto no significa que la masa molar del CGMP sea mayor que la de la p-lactoglobulina. En la bibliografía, a menudo, los volúmenes de elución más bajos de CGMP se han interpretado como CGMP oligomérico, pero esto no es concluyente. El menor volumen de elución del CGMP de masa molar de aproximadamente 6,7 kDa en comparación con el de la p-lactoglobulina de masa molar 18,2 kDa se debe a sus diferentes conformaciones en la disolución. La p-lactoglobulina existe como un glóbulo en la disolución mientras que el CGMP es un péptido desordenado (bobina aleatoria). El radio de giro y, por tanto, el radio hidrodinámico de una proteína o un péptido con forma de bobina aleatoria de baja masa molar puede seguir siendo mayor que el de una proteína globular de mayor masa molar. Se especula que los menores volúmenes de elución se deben a la naturaleza de la bobina aleatoria del CGMP monomérico en disolución.

Después de la reticulación con mTG, el pico de CGMP monomérico disminuyó significativamente (figura 2) y simultáneamente hubo un aumento de las áreas de los picos a volúmenes de elución más bajos que el CGMP monomérico (figura 2). De esto se concluye que están formándose oligómeros y polímeros después de la reticulación inducida por mTG. La reticulación intermolecular da lugar a la formación de CGMP oligomérico/polimérico y que eluye a tiempos de elución más bajos que el de CGMP monomérico.

Las muestras recogidas en diversos puntos de tiempo también se analizaron mediante DLS (figura 3), y estos resultados indican que los oligómeros tenían un tamaño hidrodinámico que aumentaba desde aproximadamente 3 nm al principio de la reticulación hasta aproximadamente 10 nm después de 4 horas de reticulación (que es cinco veces más que el del CGMP monomérico con un tamaño hidrodinámico de aproximadamente 2 nm). A tiempos de reacción más largos, se forman polímeros del intervalo de tamaño de 20 - 200 nm.

La muestra recogida después 32 horas de reacción se ajustó a diversas concentraciones y, en la figura 4, se muestra el tamaño hidrodinámico en función de la concentración volumétrica de oligo-CGMP. Se comprobó que el oligo-CGMP se autoensamblada (agregaba) en micelas similares a caseína más grandes más allá de una concentración crítica de aproximadamente 20 g l-1. El tamaño de estos coloides de asociación se encontró en el intervalo de 100 - 500 nm (figura 4), mientras que el CGMP monomérico no mostró esta propiedad y su tamaño permanece igual a diversas concentraciones.

Se comprobó que las micelas “similares a caseína” de oligo-CGMP autoensambladas encapsulaban eficazmente la curcumina y el p-caroteno (figura 5). La estabilidad, indicada por la semivida y el cuarto de vida de la curcumina, aumentó significativamente cuando se encapsuló en micelas de oligo-CGMP. La región de estabilidad mejorada se correlacionó muy bien con la concentración crítica por encima de la cual se encontró que el oligo-CGMP se autoensamblaba.

Ejemplo 3 - Uso del oligo-CGMP para la elaboración de bebidas transparentes ácidas estables a base de CGMP, lo que no es posible con la forma monomérica.

Hay muchos alimentos en los que el pH es ácido, es decir, pH < 4. A pH ácido, se sabe que el CGMP monomérico se autoensambla. La agregación resultante del autoensamblaje a un pH bajo conduce a la formación de agregados visibles y, finalmente, a la separación de fases. Esto no se desea en muchas bebidas ácidas a base de proteínas. Para garantizar que los experimentos de agregación realizados a un pH bajo no sean engañosos debido a la contribución de la turbidez por el mayor tamaño (masa molar) del CGMP polimérico, se midió la turbidez del CGMP monomérico y polimérico a concentraciones volumétricas variables a pH 7. Tal como se esperaba, la turbidez aumenta con el aumento de la concentración, y el aumento es mayor para el caso del CGMP polimérico que el del CGMP monomérico. La absorbancia más alta registrada para el CGMP polimérico es < 0,04 para una concentración volumétrica de 10 g l-1. Dado que, a pH 7, tanto el CGMP monomérico como el polimérico tienen una carga neta negativa, no se agregan. Por tanto, para llegar a una conclusión clara sobre la agregación a un pH bajo, la absorbancia debe ser >> 0,04. Por tanto, en el caso de los estudios de agregación a pH< 4, si la absorbancia aumenta por encima de 0,05, se considera que el sistema se agrega y, si aumenta más allá de 1, es decir, cuando la disolución se vuelve turbia, la disolución puede considerarse inestable. Para una disolución opalescente coloidalmente estable, la turbidez será inferior a 0,5, por ejemplo, tal como se espera para una disolución concentrada de micelas coloidales de oligo-CGMP autoensambladas.

A partir de la figura 6, resulta muy claro que el CGMP polimérico no parece agregarse ni siquiera a largos tiempos de almacenamiento. Por otro lado, el CGMP monomérico comienza a agregarse y la agregación aumenta con el tiempo, lo que se indica por el aumento significativo de la absorbancia con el tiempo de almacenamiento. Por tanto, puede concluirse que el CGMP polimérico es coloidalmente estable en un amplio intervalo de pH.

Se usa CGMP monomérico para elaborar bebidas ácidas a base de proteínas para los pacientes que padecen problemas relacionados con la PKU. El CGMP monomérico también está presente en las bebidas ácidas a base de lactosuero, ya que es uno de los componentes del lactosuero en polvo. Sin embargo, la estabilidad del CGMP en las bebidas ácidas no es muy buena, ya que se sabe que se agrega a un pH bajo, lo que conduce a la acumulación de turbidez en estas bebidas. El CGMp polimérico podría ser una muy buena alternativa para estas aplicaciones, ya que no se agrega a pH bajo. La diferencia entre el comportamiento de agregación de estas dos moléculas puede observarse claramente en la figura 6. Para escalas de tiempo similares de almacenamiento a pH < 4, el CGMP polimérico no se agrega.

La reticulación de CGMP impide que se agregue y lo hace estable a pH ácido, a diferencia de su forma monomérica. Esto podría ser muy útil para las bebidas ácidas a base de proteínas. Muchas bebidas ácidas complementadas con proteínas para personas que padecen PKU se basan en CGMP monomérico. Las bebidas ácidas a base de proteínas lácteas (de la leche) tienen, en general, algunos problemas de estabilidad y a menudo la precipitación de las proteínas es la causa principal. Un método actual para resolver este problema es usar polisacáridos tales como pectina para dar estabilidad. Se espera que el CGMP polimérico pueda proporcionar potencialmente una estabilidad coloidal similar a pH bajo. De este modo, pueden elaborarse bebidas basadas únicamente en componentes derivados de la leche. Esto puede ser ventajoso para el etiquetado (limpio) del producto. Es de esperar que el uso de CGMP polimérico para estas bebidas conduzca a una estabilidad potenciada.

Ejemplo 4 - Estabilización coloidal de partículas precipitadas a base de sal de calcio con oligo-CGMP y su uso para el enriquecimiento con calcio.

Con el CGMP oligomérico/polimérico se observó que el CGMP polimérico parece retardar la cinética de precipitación del fosfato de calcio (CaP). Por tanto, la siguiente pregunta es si esta estabilidad coloidal potenciada puede usarse también para estabilizar las suspensiones de partículas. El fosfato de calcio (CaP) es una opción natural para un estudio de este tipo sobre la estabilización coloidal de suspensiones de partículas inorgánicas. En la leche, las nanopartículas de CaP interactúan fuertemente con los grupos fosfato unidos a serina. Se cree que esto conduce a su estabilización contra la separación completa de fases. El CGMP monomérico presenta fosforilación en la serina que resulta de una modificación postraduccional. Por tanto, se planteó la hipótesis de que el CGMP polimérico podría unirse muy bien a las nanoagrupaciones de CaP y otorgarles estabilidad coloidal.

Se formó CaP mediante reacción de precipitación de CaCl²y fosfato de Na en presencia del CGMP monomérico o polimérico manteniendo las mismas condiciones (figuras 7 y 8). Estas dos figuras indican la formación de CaP a partir de dos concentraciones diferentes de iones Ca2+, es decir, 10 mM (figura 7) y 100 mM (figura 8). Puede observarse a partir de estas figuras que, en ausencia de CGMP, la velocidad de formación de CaP es muy elevada y las partículas de CaP de tamaño muy superior a 1 |im (a juzgar por la separación de fases aparente) se forman en el plazo de dos minutos. Esta velocidad no se ve alterada por una proteína globular, por ejemplo, la lactasa (indicada con la abreviatura “La” en las figuras). Sin embargo, la tasa de formación de CaP se ralentiza en presencia de CGMP monomérico. Esto indica que el CGMP está interactuando con las partículas de CaP y dándoles cierta estabilidad. Aun así, se obtienen agregados visiblemente grandes. Sin embargo, la tasa de formación de CaP es mucho más lenta en presencia de CGMP polimérico. Esto indica que el CGMP polimérico proporciona mucha más estabilidad coloidal que su forma monomérica.

El CGMP monomérico presenta fosforilación en la serina (modificación postraduccional). El CGMP se obtiene a partir de K-caseína, que no es conocida por ser sensible a la presencia de iones de calcio. Sin embargo, el CGMP polimérico tiene más fosfo-serinas por molécula y potencialmente podría unirse a los fosfatos de calcio inorgánicos (CaP) de manera similar a la unión de otras caseínas a los grupos de CaP en una micela de caseína. Por tanto, mediante una cuidadosa selección de las condiciones de precipitación, puede controlarse la formación de partículas de CaP usando CGMP poliméricos. Esta combinación de CGMP polimérico y CaP podría tener muchas aplicaciones tecnofuncionales y biofuncionales diferentes en, por ejemplo, la industria alimentaria.

Los polímeros CGMP son modificadores eficaces de la cinética de precipitación del fosfato de calcio (CaP). Ralentizan la precipitación de manera mucho más eficaz en comparación con su forma monomérica. Por tanto, los polímeros de CGMP pueden usarse para elaborar (nano)partículas amorfas de fosfato de calcio . Estas partículas biocompuestas de CGMP-CaP pueden usarse para diversos fines, por ejemplo, la encapsulación de enzimas alimentarias (lácteas).

El biocompuesto elaborado a partir de CGMP polimérico y CaP también puede usarse como material de recubrimiento para las microcápsulas blandas elaboradas mediante el método de (doble) emulsión. Usando este método puede encapsularse casi todo para aplicaciones alimentarias, tales como bacterias probióticas, sabores/aroma, fitonutrientes y colorantes. Se espera que estos recubrimientos biocompuestos den lugar a microcápsulas más fuertes y protegidas. La biomineralización controlada para tales aplicaciones de recubrimiento es un reto importante en la actualidad. La precipitación controlada de CaP en presencia de CGMP polimérico conduce a la formación de agregados biocompuestos similares a la micela de caseína. Dado que la micela de caseína se ha propuesto como vehículo de administración para diversas aplicaciones alimentarias y biomédicas, estos agregados también pueden considerarse imitaciones de la micela de caseína que contiene calcio inorgánico. Por ejemplo, la leche artificial para bebés cuyo objetivo es suministrar ácido siálico a través de CGMP puede formularse alternativamente con la combinación CGMP polimérico-CaP con la ventaja añadida de encapsular moléculas sensibles tales como las vitaminas. Los polímeros de CGMP son modificadores eficaces de la cinética de precipitación del fosfato de calcio (CaP). Ralentizan la precipitación de manera mucho más eficaz en comparación con su forma monomérica. Por tanto, los polímeros de CGMP pueden usarse para elaborar (nano)partículas amorfas de fosfato de calcio de cualquier tamaño deseado. Por tanto, estas dispersiones coloidales estables de CaP pueden usarse en bebidas lácteas enriquecidas con calcio.

Los experimentos de turbidez se repitieron usando DLS. El objetivo era comparar la cinética de precipitación del fosfato de calcio (CaP) en presencia del CGMP monomérico (nativo) y del CGMP oligomérico en condiciones de disolución similares de concentraciones de proteínas, pH, concentraciones de Ca²⁺, etc., y medir el tamaño hidrodinámico de las partículas de CaP formadas en cada caso mediante dispersión dinámica de luz. A continuación se describen los resultados y se comenta el mecanismo con detalle.

La precipitación se produce cuando el producto de las concentraciones iónicas es > K^sppara una sal poco soluble. La K^sppara CaP (Ca³(PO⁴)²) es = 2,07*10 ^{' 33}a 25 °C. El producto de solubilidad indica la baja solubilidad de un compuesto poco soluble tal como CaP. Ignorando la valencia del ion disociado, por simplicidad, sólo se considera la estequiometría, por lo que, para Ca^xP^y, el producto de solubilidad es K^sp= [Ca]^x-[P]^y(unidad = M^x+y). Debido a la baja solubilidad, las actividades iónicas se aproximan por sus concentraciones molares. Además, pK^sppuede obtenerse fácilmente como -log K^sp. Los valores de pK^spson positivos. Un valor positivo grande significa una solubilidad muy baja de la sal. Para CaP (Ca³(PO⁴)²), el pK^sppuede calcularse en 32,68, lo que indica una solubilidad muy baja en comparación con el hidróxido de calcio (pK^sp=5,3) o el carbonato de calcio (pK^sp=8,47). Las concentraciones usadas en nuestros experimentos indican que el CaP precipita fácilmente a temperatura ambiente. Sin embargo, esto no dice nada sobre la velocidad (tasa) a la que crecerán las partículas ni el tamaño/forma/morfología final que alcanzarán.

Cuando se mezcla CaCl²rápidamente con Na²HPO⁴, se precipita CaP instantáneamente si no hay un inhibidor del crecimiento de los cristales (estabilizador). Esto, por ejemplo, tiene lugar en el caso del experimento de control, es decir, cuando sólo se forma CaP. Las partículas de CaP crecen rápidamente (en el plazo de pocos minutos) hasta alcanzar un tamaño superior a 1 |im y comienzan a sedimentar bajo la influencia de la fuerza gravitatoria. Evidentemente, la carga superficial (potencial) no es lo suficientemente alta como para impedir el crecimiento de las partículas hasta unas dimensiones tan grandes. En presencia de un estabilizador adecuado (estérico o cargado), puede detenerse el crecimiento de las partículas y pueden obtenerse partículas de una dimensión mucho más pequeña (< 1000 nm). Por tanto, se probaron el CGMP monomérico y el CGMP oligomérico como estabilizadores y, a continuación, se describe la capacidad de estabilización y de control del tamaño de las partículas para el CaP.

La figura 9 indica que el CGMP monomérico no es un estabilizador muy eficaz (inhibidor del crecimiento de las partículas) para las partículas de CaP. Las partículas grandes (> 1000 nm) se forman en el plazo de aproximadamente 10 minutos para la concentración de iones Ca²⁺que varía desde 10 mM hasta 100 mM. Comparando el caso del control con el del CGMP monomérico, puede concluirse que la velocidad de formación de CaP es muy alta y que se forman partículas de CaP muy superiores a 1 |im (según la separación de fases aparente) en el plazo de cinco minutos. Sin embargo, la tasa de formación de CaP se ralentiza en presencia de CGMP monomérico y se necesitan al menos 10 minutos para que las partículas sean superiores a 1000 nm. Esto indica que el CGMP está interactuando con las partículas de CaP y dándoles cierta estabilidad. Aun así, se obtienen agregados grandes (> 1000 nm).

En comparación con los dos casos anteriores, la tasa de formación de partículas de CaP es mucho más lenta y reducida, es decir, de menor tamaño, en presencia de CGMP oligomérico (figura 10). Esto indica que el CGMP oligomérico proporciona mucha más estabilidad coloidal que su forma monomérica. El CGMP monomérico tiene fosforilación en la serina (modificación postraduccional). El CGMP se obtiene a partir de K-caseína y su solubilidad no es conocida por ser sensible a la presencia de iones de calcio. Sin embargo, el CGMP oligomérico tiene más fosfo-serinas por molécula y potencialmente podría unirse a los fosfatos de calcio inorgánicos (CaP) de manera similar a la unión de otras caseínas a los grupos de CaP en una micela de caseína.

Además, parece haber dos etapas en la formación de nanopartículas de CaP estabilizadas por oligo-CGMP. Inicialmente (< 10 minutos), se forman nanopartículas con un R^hque varía entre 60 - 80 nm. En la siguiente etapa (> 10 minutos), estas partículas maduran hasta un tamaño ligeramente mayor de R^hde aproximadamente 90 110 nm (figura 10). Además, las nanopartículas estabilizadas por oligo-CGMP son altamente monodispersas (figuras 11 y 12). Las distribuciones de tamaño basadas en la intensidad (figura 11) parecen ser más monodispersas, ya que la dispersión está dominada por las partículas más grandes (¡de la segunda etapa de maduración!). De manera más realista, se espera que la maduración sea un procedimiento continuo y, por tanto, la distribución de partículas medida en una etapa determinada debe comprender partículas tanto de la etapa inicial como de la de maduración. Esto puede observarse más claramente en las distribuciones basadas en el volumen (figura 12), donde aparece un hombro en los tamaños medidos durante la primera etapa (t0 para la variación de la concentración de calcio en la figura 12). A pesar de estas variaciones nanoscópicas durante la etapa inicial, las partículas después de la maduración son monodispersas, siendo el radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 100 nm (figura 10-12).

Finalmente, se sometió a prueba si el radio hidrodinámico de la meseta (después de la segunda etapa o maduración) puede controlarse variando la razón de la concentración de CaP con respecto a oligo-CGMP. Tal como puede observarse a partir de la figura 13, el tamaño final de la meseta aumenta con la disminución de las cantidades de oligo-CGMP. Esto demuestra claramente que los oligo-CGMP actúan como estabilizadores coloidales y puede especularse que el modo de acción es una combinación de repulsión electrostática y repulsión estérica originada por una combinación de estructura principal cargada y una mayor masa molar de oligo-CGMP. Por tanto, mediante una cuidadosa selección de las condiciones de precipitación, puede controlarse la formación de partículas de CaP usando oligo-CGMP. Esta combinación de CGMP oligoméricos/poliméricos y CaP podría tener muchas aplicaciones tecnofuncionales y biofuncionales diferentes en la industria alimentaria y farmacéutica.

Los oligómeros (polímeros) de CGMP, elaborados reticulando CGMP con mTG, son modificadores eficaces de la cinética de precipitación del fosfato de calcio (CaP) y del crecimiento de las partículas. Ralentizan la tasa de crecimiento de las partículas de manera mucho más eficaz en comparación con su forma monomérica. Por tanto, los oligo-CGMP pueden usarse para elaborar (nano)partículas amorfas de fosfato cálcico. Estas partículas biocompuestas de oligo-CGMP-CaP pueden usarse para diversos fines, por ejemplo, la encapsulación de enzimas alimentarias (lácteas). Además, los resultados descritos anteriormente también apuntan a un principio más fundamental de estabilidad coloidal de CaP en presencia de las fosfoproteínas adsorbidas. Además, la razón de oligo-CGMP con respecto a CaP parece ser un parámetro muy bueno para controlar el tamaño de las partículas. Sorprendentemente, parece haber dos regiones distintas, que pueden designarse como una especie de diagrama de estado para las dos fases que interactúan y que comprenden CaP y oligo-CGMP. El tamaño de las partículas de CaP se estabiliza a un radio hidrodinámico de aproximadamente 100 nm a partir de una concentración de oligo-CGMP de unos 10 g l-1. Esta concentración crítica parece estar en torno a la concentración crítica de agregación del oligo-CGMP. Por tanto, la notable estabilidad coloidal también podría tener su origen en las capas autoensambladas adsorbidas de oligo-CGMP que conducen a un recubrimiento más grueso alrededor de las nanopartículas de CaP. Ejemplo 5 - Estabilización coloidal de partículas precipitadas a base de sales de calcio con oligo-CGMP y su uso para encapsulación (por ejemplo, administración y liberación controladas de enzimas lácteas a la matriz del queso) Un uso potencial de los biocompuestos basados en CGMP oligomérico y CaP es la encapsulación de enzimas para aplicaciones alimentarias. Esto se demuestra con la encapsulación de Ha-Lactase en partículas amorfas de CaP estabilizadas por CGMP oligomérico. Tal como puede observarse en las figuras 14 y 15, la lactasa se encapsuló con éxito en estas partículas. Estas partículas biocompuestas de CaP y CGMP oligomérico tienen un enorme potencial para el propósito de encapsulación. Pueden usarse como tal o como material de recubrimiento para las microcápsulas blandas fabricadas mediante el método de doble emulsión.

Para someter a prueba la idea del uso potencial de los biocompuestos basados en CGMP polimérico y CaP para encapsular enzimas alimentarias, se prepararon partículas de CaP-CGMP polimérico cargadas de lactasa. La idea se sometió a prueba mediante la medición de la actividad de la enzima libre y de la enzima encapsulada en partículas amorfas de CaP estabilizadas por CGMP polimérico.

La kcat más baja (figura 15) y la tasa de formación de producto más lenta (figuras 14 y 15) en el caso de la enzima encapsulada indican que la enzima se encapsuló con éxito en los poros de las micropartículas y que hubo una resistencia significativa a la transferencia de masa del sustrato hacia las partículas y al transporte de productos fuera de las mismas. La disminución de la tasa global se debe a la resistencia difusional a la transferencia de masa del sustrato hacia las partículas y al transporte del producto fuera de la matriz de la partícula. Una parte de la pérdida de actividad podría deberse a la interacción directa de la enzima con la superficie de CaP, lo que podría conducir a la desnaturalización parcial de la enzima, por ejemplo, debido a cierto grado de cambio en la estructura terciaria.

La reticulación enzimática del glicomacropéptido de caseína (CGMP) usando transglutaminasa microbiana conduce a la formación de polímeros de CGMP. Se ha encontrado que estos polímeros de CGMP tienen propiedades fisicoquímicas diferentes a las de su molécula monomérica y estas diferencias conducen a la mejora de las funcionalidades. Además, los CGMP poliméricos también pueden usarse para elaborar emulsiones dobles estables de tipo W/O/W en las que la fase externa se ha estabilizado mediante los CGMP poliméricos (figura 16). Los experimentos iniciales de “prueba de concepto” para elaborar emulsiones dobles W/O/W usando CGMP poliméricos son muy prometedores e incluso es el uso de partículas biocompuestas de CGMP polimérico-CaP para elaborar la emulsión doble y, por tanto, usar este enfoque para la encapsulación de enzimas alimentarias (lácteas). El biocompuesto elaborado a partir de CGMP polimérico y CaP también puede usarse como material de recubrimiento para las microcápsulas blandas elaboradas mediante el método de (doble) emulsión. Usando este método puede encapsularse casi todo para aplicaciones alimentarias, tales como bacterias probióticas, sabores/aroma, fitonutrientes y colorantes. Se plantea la hipótesis de que estos recubrimientos biocompuestos conducen a microcápsulas más fuertes y protegidas. Estos experimentos iniciales de prueba de concepto son la primera etapa hacia este objetivo.

El uso potencial del complejo de CGMP oligomérico-CaP como estabilizador de Ramsden-Pickering de calidad alimentaria (comúnmente conocido como estabilización de “Pickering”) resulta evidente a partir de la figura 16. Las gotas de emulsión doble estabilizadas sólo por el CGMP oligomérico tienen forma esférica (curvatura “laplaciana”), pero las gotas estabilizadas por la combinación de CGMP oligomérico y CaP no son esféricas. Esta forma no esférica es una indicación de la existencia de una membrana o capa muy rígida en la superficie exterior de la gota. Este tipo de forma no laplaciana se ha notificado en la bibliografía para gotas estabilizadas por Pickering usando otros tipos de partículas inorgánicas. Cuando se trata de sistemas alimenticios, no hay muchas opciones de estabilizadores de Pickering de calidad alimentaria. Por tanto, el CGMP oligomérico-CaP podría ser muy ventajoso, especialmente desde el punto de vista del etiquetado.

La combinación de CGMP polimerizado y CaP puede usarse para la estabilización de Pickering de las emulsiones. El CaP por sí mismo no produce el efecto Pickering, pero el efecto Pickering se observa cuando está complejado con polímeros de CGMP. Esta combinación de CGMP polimérico y CaP, al ser de calidad alimentaria, puede usarse para elaborar emulsiones alimentarias estabilizadas por Pickering. Por ejemplo, el biocompuesto elaborado a partir de CGMP polimérico y CaP también puede usarse como material de recubrimiento para las microcápsulas blandas elaboradas mediante el método de (doble) emulsión. Usando este método puede encapsularse casi todo para aplicaciones alimentarias, tales como bacterias probióticas, sabores/aroma, fitonutrientes y colorantes. Se espera que estos recubrimientos biocompuestos den lugar a microcápsulas más fuertes y protegidas. La biomineralización controlada para este tipo de aplicaciones de recubrimiento es un reto importante en la actualidad.

Administración y actividad controladas de enzimas encapsuladas en la matriz del queso

En la figura 17 se muestra la cuajada obtenida al final del método de preparación de quesos modelo tal como se describió en el ejemplo 1. Estos cuatro quesos modelo independientes se prepararon con y sin (control) microcápsulas rojas y azules. Se encontró que las cuajadas en el caso de las microcápsulas coloreadas estaban coloreadas uniformemente en comparación con el queso de control, que parece blanco (figura 17). Por tanto, el protocolo de agitación/mezclado, etc., fue lo suficientemente bueno como para mantener las microcápsulas suspendidas de manera uniforme durante la etapa de coagulación. La consistencia de la cuajada del queso modelo indica que la mayor parte de las etapas esenciales de la elaboración de queso a gran escala, por ejemplo, el prensado de la cuajada para drenar el lactosuero, etc., podrían imitarse muy bien mediante el protocolo de centrifugación descrito anteriormente. Además, el lactosuero en todos los casos resultó ser visiblemente transparente de cualquier color (figura 18). Esto indica que las microcápsulas se habían repartido preferiblemente en la cuajada del queso.

Además de la observación visual, también se midió la actividad enzimática en el lactosuero para comparar la enzima libre con la encapsulada. Los resultados se muestran en la figura 19. Se encontró que la enzima libre se reparte significativamente en el lactosuero, donde se midió una actividad de ~ 40 % de la cantidad total dosificada. En el caso de la enzima encapsulada, sólo se midió una actividad de < 4 % en el lactosuero, lo que indica que la encapsulación fue eficaz para impedir el reparto de la enzima en el lactosuero.

Los experimentos con microcápsulas coloreadas y la actividad medida en el lactosuero parecen demostrar muy bien el concepto, es decir, la encapsulación parece ser una estrategia muy buena para repartir las enzimas solubles en la cuajada del queso.

En resumen, se encontró que la lactasa estaba eficazmente encapsulada mediante ambos métodos de encapsulación. Esto ya se había demostrado en el presente documento, pero los experimentos anteriores proporcionan un apoyo adicional a los datos existentes. Se encontró que las microcápsulas coloreadas penetraban eficazmente (preferiblemente) en la cuajada del queso modelo. No se detectaron micropartículas coloreadas en el lactosuero modelo separado del queso modelo. Esto complementa la observación de que se encontró que la cuajada del queso modelo estaba coloreada uniformemente. Estas observaciones indican que las partículas de microcápsulas quedan efectivamente atrapadas en la red de caseína formada después de la coagulación. Las observaciones con el color se correspondieron muy bien con la medición de la actividad enzimática, es decir, se encontró que la enzima libre se repartió significativamente en el lactosuero (~ 40 %) mientras que se midió una actividad de < 4 % en el caso de la enzima encapsulada, lo que indica claramente que la mayor parte de la actividad debe haberse conservado en la cuajada (¡similar al color!).

Por tanto, se plantea la hipótesis de que las micropartículas que contienen lactasa encapsulada eran lo suficientemente grandes como para repartirse preferiblemente en la cuajada del queso. El mecanismo (modo de acción) del reparto de estas microcápsulas (partículas) en la cuajada del queso modelo debe ser similar al mecanismo de “atrapamiento/tamizado” de las partículas de grasa de la leche en la cuajada del queso, que se debe principalmente a su mayor tamaño (> 1 |im).

La actividad de la enzima repartida en la matriz del queso puede aumentarse recubriendo las microcápsulas con recubrimientos adecuados de un grosor bien definido, tal como se muestra en la figura 20. La figura 20 indica que la enzima es activa en la cuajada del queso y que un recubrimiento más grueso protege a la enzima de las fugas hacia el lactosuero. En conclusión, la microencapsulación parece impedir de forma significativa el reparto de las enzimas en el lactosuero y es una estrategia muy eficaz para el reparto de las enzimas en la matriz de la cuajada del queso.

Los métodos de encapsulación que se usan actualmente para las aplicaciones en quesos no son adecuados para el uso alimentario y, por tanto, el método descrito en el presente documento con el uso de componentes a base de lácteos es novedoso.

Ejemplo 6 - “Inmovilización de una proteína básica (enzima)’’

Materiales y métodos

La encapsulación de la lactosa oxidasa (LOX, LactoYield®, Chr. Hansen A/S) siguiendo el método descrito en el ejemplo 1 dio lugar a un rendimiento de la actividad encapsulada de aproximadamente 10 U/g de LOX. La actividad de la lactosa oxidasa se midió usando el método empleado para medir la actividad de la celobiosa deshidrogenasa con algunas modificaciones. El ensayo de actividad se basó en la reducción de 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) por LOX y la cinética se siguió midiendo la absorbancia a 500 nm, 37 °C, pH 6,5 (tampón fosfato de sodio 0,1 M). La actividad enzimática (U/g de LOX) se obtuvo a partir de una curva de calibración de la velocidad de conversión de DCPIP frente a las diluciones de la disolución madre de LOX convencional proporcionada por Chr. Hansen A/S, con una actividad notificada de 15 U/g de LOX. A partir de las consideraciones de la carga electrostática, se planteó la hipótesis de que la inmovilización de LOX en las partículas de la matriz inorgánica-orgánica estabilizadas por oligo-CGMP conduciría a un mayor rendimiento de la actividad de LOX. Nuestra idea era que una proteína o enzima básica (punto isoeléctrico, pl > 7), tal como LOX, puede inmovilizarse en las micropartículas cargadas negativamente mediante un mecanismo electrostático (intercambio de iones). La carga negativa neta teóricamente esperada (a 3,5 < pH < 7) en oligo-CGMP también se comprobó experimentalmente midiendo la movilidad electroforética de CGMP monomérico y de oligo-CGMP en el intervalo de pH de 2 - 7. La movilidad electroforética se midió usando el aparato nano-zetasizer (Nano-ZS, Malvern, detalles descritos en el ejemplo 1 - medición mediante DLS) en una celda capilar plegada (Malvern). Las muestras se dializaron extensamente contra agua MQ usando tubos de diálisis de 6 - 8 kDa punto de corte de peso molecular (Pur-A-Lyzer Maxi 6000, Sigma-Aldrich) a 4 °C. El CGMP monomérico y el oligo-CGMP dializados se diluyeron además con agua Milli-Q hasta 1 g/l y se ajustó el pH con NaOH o HCl 0,1 M. Se realizaron tres mediciones para cada una de las muestras duplicadas y los resultados se presentan como el promedio ± desviación estándar de estas mediciones.

A continuación se describen los materiales y métodos usados para la inmovilización. Para el experimento de inmovilización, se usó una transglutaminasa microbiana comercialmente disponible (mTG, 1000 U/g, Ajinomoto) para elaborar CGMP reticulado (oligomerizado/polimerizado) (oligo-CGMP/poli-CGMP) y caseína (poli-Cas). El caseinato de sodio (Cas), el hidrogenofosfato de disodio (Na²HPO⁴), el dihidrogenofosfato de sodio (NaH²PO⁴), el carbonato de sodio (Na²CO³) y el cloruro de calcio (CaCh) eran de calidad analítica. El tubo de diálisis era de Spectra Por (MWCO de 12-14 kDa, tubo Standard RC, diámetro de 29 mm). El papel de filtro era de Whatman (diámetro de 320 mm, cono de papel de filtro Whatman 114 V, reforzado en húmedo, GE Healthcare Life Sciences). Se usó agua MQ para preparar todas las disoluciones y también para la diálisis de LOX y el lavado de las micropartículas antes y después de la inmovilización.

Para elaborar CGMP polimerizado (poli-CGMP), se suspendió 120 g/l de CGMP en tampón fosfato de sodio (0,2 M, pH 7). A continuación, se añadió la cantidad pesada de polvo de CGMP en la mitad del volumen del volumen de disolución final requerido. La suspensión se agitó durante la noche a 4 °C y, al día siguiente, se añadió tampón para que el volumen de la suspensión alcanzara el 95 % del volumen final y se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la suspensión se incubó a 40 °C durante 1 hora. A continuación, se suspendió el polvo de mTG en tampón fosfato de sodio (0,2 M, pH 7). El volumen de tampón usado fue el 5 % del volumen total requerido para la reacción de reticulación y la cantidad de polvo de mTG usada fue para lograr una dosificación de 2 U/ml de volumen de reacción después de que la disolución de enzima se mezclara con la disolución de CGMP. El polvo de mTG se disolvió agitando o girando suavemente y luego se incubó a 40 °C durante 15 minutos. La disolución de mTG se añadió a la disolución de CGMP agitando suavemente y luego se incubó la mezcla de reacción a 40 °C durante 30 horas. Después de 30 horas de reacción de reticulación, la mTG se inactivó manteniendo la disolución a 90 °C durante 10 minutos y, a continuación, se enfrió hasta temperatura ambiente. Finalmente, se añadió un conservante (benzoato de sodio) al 0,5 % (p/v) y se almacenó la disolución a 4 °C. La caseína polimerizada (poli-Cas) se elaboró siguiendo el mismo método usado para poli-CGMP. El único cambio fue la concentración de caseinato de sodio, es decir, se usaron 30 g/l de caseinato de sodio.

También se elaboraron las siguientes disoluciones de sales: CaCl²4,5 M, Na²HPO⁴0,52 M y Na²CO³0,75 M. Para dializar la disolución madre de LOX, se llenaron 100 ml de la disolución madre de LOX en el tubo de diálisis de aproximadamente 40 cm de longitud y luego se mantuvo este tubo en 5 l de agua MQ a 4 °C con agitación lenta durante 4 horas. A continuación, se sustituyó el agua MQ exterior y se continuó con la diálisis durante otras 20 horas. Al final de la diálisis, se midió el volumen de LOX dializada para corregir la reducción de la concentración debida al aumento de volumen después de la diálisis de equilibrio.

La disolución madre de poli-CGMP (120 g/l) se diluyó hasta una concentración de 20 g/l usando Na²HPO⁴0,52 M. La disolución madre de poli-Cas (30 g/l) se diluyó hasta una concentración de 10 g/l usando Na²CO³0,75 M. A continuación, se añadieron 100 ml de CaCl²(4,5 M) a 450 ml de disolución de poli-CGMP (20 g/l). La adición de CaCl²se realizó durante un periodo de 10 minutos mientras se agitaba la suspensión. A continuación, se añadieron 450 ml de poli-Cas (10 g/l) a la suspensión anterior. La adición se realizó durante un periodo de 10 minutos mientras se agitaba la suspensión. La suspensión se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se filtró sobre un papel de filtro y se lavó con un volumen 2X de agua MQ (es decir, usando 2 l de agua MQ para 1 l de volumen de suspensión original). Se pesó la torta húmeda lavada de micropartículas y luego se suspendió en un peso igual de la disolución de LOX dializada. La suspensión se mantuvo con agitación a 4 °C durante 12 horas. Después del intercambio iónico de equilibrio, la suspensión se filtró por gravedad usando un papel de filtro en el cono para separar las aguas madre (que contienen LOX residual/libre). La torta retenida en el papel de filtro se lavó con 2 l de agua MQ (es decir, 4 lavados usando 500 ml de agua MQ por lavado). La torta lavada de LOX inmovilizada se formuló entonces como suspensión líquida y como polvo seco. Para obtener un polvo seco, la torta lavada se extendió sobre una placa de Petri y luego se mantuvo en una campana de humos a temperatura ambiente para su secado. Los copos secos se trituraron usando un mortero y una mano de mortero para obtener un polvo fino. Para la suspensión líquida, la torta lavada se suspendió en un peso igual de glicerol al 99 % y se almacenó a 4 °C.

La actividad de LOX inmovilizada se midió mediante el método descrito anteriormente, que se basa en la reducción de DCPIP. Se encontró que la actividad del polvo seco (LOX inmovilizada) era de 29 U/g de LOX.

Se suspendió polvo de LOX inmovilizada (29 U/g de LOX) a una concentración de 10 mg/ml en 1 ml de estas disoluciones: agua MQ, tampón fosfato de sodio (NaP), pH 7 (concentración = 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200 mM) y tampón NaP 200 mM, pH 7 EDTA 0,1 M. A continuación, se incubaron los tubos Eppendorf a 40 °C y 1000 rpm durante 1 hora. Después del final de la incubación, se centrifugaron las suspensiones a 13400 rpm durante 5 minutos y se transfirieron cuidadosamente 50 |il del sobrenadante a otro tubo Eppendorf. A continuación, se mezclaron 50 |il del sobrenadante con 50 |il de tampón de muestra SDS-PAGE (tampón de muestra 2X Laemmli, Bio-Rad) en el que también se añadió DTT 0,1 M. Se calentó la mezcla anterior a 90 °C durante 10 minutos y se enfrió hasta temperatura ambiente con mezclado con vórtex. A continuación, se cargaron 20 |il de la mezcla anterior en los geles sin tinción (geles prefabricados sin tinción Mini-Protean TGX, cualquier kD, Bio-Rad) y se sumergió el gel en el tampón de ejecución TGS (Tris 25 mM-glicina 192 mM-SDS al 0,1 % p/v, pH 8,3). Se realizó electroforesis a 300 V durante 18 minutos y, a continuación, se obtuvieron imágenes del gel con el dispositivo de obtención de imágenes Gel Doc EZ (Bio-Rad). Se estimó la masa molar relativa de las bandas separadas comparándolas con un patrón de masa molar en el primer carril (patrón Precision Plus Protein, sin teñir, Bio-Rad). Se cuantificó la cantidad de LOX en cada carril de la muestra mediante un análisis de imagen usando Image Lab 5.1 (Bio-Rad). Se usó el área bajo la curva de la intensidad frente a la distancia de migración correspondiente a LOX como cantidad de LOX en esa muestra. Se normalizó la cantidad de LOX estimada a partir de SDS-PAGE para cada fuerza iónica mediante la cantidad de LOX encontrada en la muestra totalmente disociada en EDTA 0,1 M añadido a tampón fosfato 0,2 M. Se calculó la fuerza iónica a partir de las cantidades molares de fosfato monosódico y disódico usadas para cada muestra (suponiendo una disociación completa) usando la ecuación I = 0,5 £¡(c¡ zi2), en la que I es la fuerza iónica (mM), c es la concentración molar y z es la valencia de cada especie iónica (i) presente en el tampón.

Se elaboró el queso modelo siguiendo el método descrito en el ejemplo 1. Para imitar la acidificación por parte de los cultivos iniciadores, se añadieron 100 mg de ácido glucónico 8-lactona (GDL) a 10 ml de leche y luego se incubaron los tubos durante 10 minutos. El resultado es una concentración inicial de GDL de aproximadamente 56 mM en la leche. Se prepararon las muestras para cuantificar la cantidad inicial de LOX libre (F⁰) diluyendo los 50 |il de disolución madre de LOX (15 U/g de LOX) en 10 ml de agua MQ en lugar de leche. La muestra que indica la cantidad total inicial de LOX inmovilizada (I⁰) se preparó disolviendo 35 mg de polvo de LOX inmovilizada (29 U/g de LOX) en 10 ml de tampón NaP 200 mM, pH 7+ EDTA 0,1 M. De manera similar, se añadieron 50 |il de LOX libre y 35 mg de polvo de LOX inmovilizada en 10 ml de leche modelo etiquetada como blanco (B), LOX libre (F), LOX libre con GDL (F+GDL). En el caso de LOX inmovilizada, se añadió la enzima de coagulación después de 10 minutos de acidificación (I¹⁰+GDL) o después de 10 minutos de incubación sin GDL (I¹⁰). De manera similar, I⁶⁰e I⁶⁰+GDL son las muestras después de 60 minutos de incubación a 32 °C. Para iniciar la coagulación de la leche, se añadieron 200 |il de 3,125 IMCU/ml de enzima de coagulación (Thermolase, 625 IMCU/ml, Chr. Hansen A/S) a 10 ml de leche modelo incubada a 32 °C. Después de la coagulación, se trataron y procesaron las muestras tal como se describió en el ejemplo 1. Se analizaron y cuantificaron las muestras de lactosuero para determinar LOX mediante el método SDS-PAGE siguiendo el mismo procedimiento de preparación y análisis de muestras tal como se describió anteriormente para los experimentos de estabilidad de LOX inmovilizada a diversas fuerzas iónicas. Se obtuvo la cantidad de lOx repartida en el lactosuero normalizando el área “corregida por el blanco” correspondiente a LOX con respecto al área total de LOX en las muestras F⁰e I⁰. Esta razón indica la parte de LOX que se ha repartido en el lactosuero del total de LOX dosificada inicialmente en la leche.

Resultados y conclusiones

El oligo-CGMP está cargado más negativamente que el CGMP monomérico en el intervalo de pH de pI - 7 (figura 22). El pI de la proteína monomérica resultó ser de aproximadamente 3,3, mientras que disminuyó después de la reticulación en el caso del oligo-CGMP hasta 2,5. Esta disminución del pI se debe a la reticulación de los residuos de Lys (figura 1) y, por tanto, la carga negativa neta aumenta para el oligo-CGMP en comparación con el CGMP monomérico. Esta carga negativa es responsable de la formación de un complejo electrostático con LOX y, por tanto, es el mecanismo detrás de la inmovilización por intercambio de iones. Se encontró que la actividad del polvo seco (LOX inmovilizada) era de 29 U/g de LOX.

Se encontró que la LOX inmovilizada era estable cuando se mantenía suspendida en glicerol al 50 % o en forma de polvo seco y no se encontró que se liberara ninguna enzima ni siquiera después de dos meses de almacenamiento. La fuerza iónica típica de la leche bovina es de aproximadamente 80 mM y, por tanto, se decidió suspender las partículas de LOX inmovilizadas en tampón de diversas fuerzas iónicas y cuantificar la cantidad de LOX liberada de las partículas (figura 23 a y b).

Se encontró que se liberaba LOX inmovilizada de las micropartículas en función del aumento de la fuerza iónica. A una fuerza iónica comparable a la de la leche, es decir, aproximadamente 80 mM, se libera menos del 10 % de la enzima inmovilizada. Incluso a una fuerza iónica elevada de aproximadamente 460 mM, más del 70 % de LOX permaneció inmovilizada en las partículas. Por tanto, puede deducirse que LOX se mantiene en las partículas mediante fuertes interacciones.

La disolución de la matriz inorgánica (CaP/CaC) en EDTA 0,1 M condujo al reparto completo de LOX en la fase de disolución del sobrenadante. Este resultado indicó que la mayor parte de LOX inmovilizada permanecería adsorbida en las partículas de la leche y, por tanto, se repartiría en la cuajada del queso.

Cuando LOX no está inmovilizada, es decir, cuando está libre, más del 85 % de la enzima se pierde en el lactosuero (figura 24). Sin embargo, después de la inmovilización, se encontró que más del 90 % de la enzima inmovilizada se reparte en la cuajada del queso y la cantidad perdida en el lactosuero es inferior al 5 %. Por tanto, mediante la inmovilización, la mayor parte de LOX puede pasar a la cuajada del queso y las pérdidas en el lactosuero pueden minimizarse significativamente. La acidificación hasta un pH de 5,4 (60 minutos después de la adición de 10 g/l de GDL) no cambia esta conclusión.

En resumen, las partículas de calidad alimentaria basadas en componentes lácteos tales como oligo-CGMP pueden usarse para la inmovilización de LOX. El método actual da como resultado una actividad de aproximadamente 30 U/g de LOX del polvo seco. Puede conseguirse una actividad/g aún mayor de las micropartículas variando la razón de las fases orgánica e inorgánica para tener más fracción de proteínas. La LOX inmovilizada se libera de las partículas en función del aumento de la fuerza iónica. A una fuerza iónica comparable a la de la leche, es decir, aproximadamente 80 mM, se libera menos del 10 % de la enzima inmovilizada. Los experimentos con quesos modelo con LOX inmovilizada indican que > 90 % de la enzima inmovilizada se reparte en la cuajada del queso y la cantidad perdida en el lactosuero es inferior al 5 %. En el caso de LOX libre, más del 85 % de la enzima se pierde en el lactosuero. Por tanto, mediante la inmovilización, la mayor parte de LOX puede administrarse a la cuajada del queso y las pérdidas en el lactosuero pueden minimizarse significativamente. Resulta evidente para los expertos en la técnica que el método de inmovilización descrito anteriormente también funcionaría para otras proteínas o péptidos básicos tales como la lisozima, la lactoferrina, la polilisina, la lactoperoxidasa, la nisina, etc.

En conclusión, el CGMP oligomérico injertado (adsorbido) en nano/micropartículas de CaP (CaC), con o sin recubrimiento adicional de otras proteínas de la leche (alimentarias) polimerizadas, puede usarse para la inmovilización de enzimas básicas (proteínas/péptidos). La inmovilización usando el método descrito anteriormente conduce a mayores rendimientos de actividad y, por tanto, puede usarse para inmovilizar cantidades relativamente grandes de enzimas (por ejemplo, LOX).

Ejemplo 7 - “Gelificación”

Método

Se indujo la gelificación de oligo-CGMP a pH neutro y temperatura ambiente mediante mTG. El método para elaborar el oligo-CGMP fue el mismo que se describió en el ejemplo 6, pero con una etapa adicional de purificación para el CGMP monomérico. El polvo comercial contenía otras proteínas del lactosuero mezcladas con CGMP. Por tanto, después de la disolución de 120 g/l de este polvo, se redujeron las proteínas del lactosuero, se desnaturalizaron por calor y se agregaron por calentamiento a 90 °C durante 30 minutos, seguido de ultracentrifugación para retirar las proteínas del lactosuero insolubles/agregadas. Esto dio como resultado una disolución transparente y casi pura de CGMP. La concentración de CGMP monomérico purificado se ajustó a 60 g/l y luego se reticuló usando mTG tal como se describió en el ejemplo 6. Después de la reticulación se obtuvo una disolución transparente de 60 g/l de oligo-CGMP. Esta disolución transparente de 60 g/l de oligo-CGMP disuelta en tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7) se usó entonces como componente de partida para polimerizarse y gelificarse adicionalmente mediante mTG. Se mezcló la disolución de oligo-CGMP con la mTG disuelta en el mismo tampón en una razón en volumen de 95:5 v/v, de manera que la concentración final de la mTG añadida fue de 2 U/ml de la disolución de oligo-CGMP. Se realizó un experimento de control con tampón sin la enzima. Las muestras de control y de prueba se mantuvieron a temperatura ambiente (24 ± 2 °C) durante 24 horas. Los viales de vidrio se invirtieron después de 24 h para distinguir la muestra gelificada. Se hizo pasar un rayo láser rojo a través de las muestras transparentes para observar la dispersión de la fase de gel.

La gelificación “en frío” de oligo-CGMP se usó para la microencapsulación de bacterias. Las bacterias se microencapsularon en la fase acuosa interna “gelificada” (W¹) emulsionada en la fase de aceite (O) que contenía polirricinoleato de poliglicerol, es decir, PGPR (PGPR-4125, Palsgaard). La emulsión W¹/O se emulsionó de nuevo en la fase acuosa externa (W²). Este procedimiento de encapsulación por doble emulsión es esencialmente similar al que se describió en el ejemplo 1 y da como resultado una emulsión doble W¹/O/W². La fase W¹contenía 200 g/l de bacterias mezcladas con crioprotectores (FLORA C160, Chr. Hansen A/S) dispersados en oligo-CGMP (60 g/l, tampón 0,2 M, pH 7). La fase O estaba compuesta por el 20 % p/v de PGPR disuelto en aceite de soja. La fase W²contenía oligo-CGMP (60 g/l, tampón 0,2 M, pH 7). La mTG (2 U/ml) se añadió a la fase W¹justo antes de la emulsión. La fracción de volumen de W¹en O fue de 0,75 y la fracción de volumen de la emulsión primaria (W¹/O) en la fase W²fue de 0,3. La emulsión doble se diluyó 100 veces en agua MQ para la obtención de imágenes en el microscopio óptico, tal como se describió en el ejemplo 1.

Resultados y conclusión

La muestra de prueba que contenía mTG dio lugar a la formación de un gel transparente (figura 25). Esto indica que el CGMP oligomérico puede reticularse (polimerizarse) adicionalmente usando mTG para formar un gel claro (transparente/translúcido) en torno a pH neutro y temperatura ambiente (gelificación “en frío”). Este gel parece similar a los geles de proteínas de hebras finas (por ejemplo, geles obtenidos a partir de gelatina o proteína del lactosuero calentados lejos de su pI a bajas fuerzas iónicas), lo que indica que la gelificación está provocada por la reticulación de las fibrillas y el enmarañado de las hebras (fibrillas) finas de poli-CGMP. La transparencia también indica la ausencia de partículas proteicas densas en estas condiciones de disolución. Las partículas proteicas densas suelen dar lugar a geles “particulados” turbios (opacos). Lo que es más importante, la transición desde una disolución viscosa a un gel puede controlarse con precisión en nuestro caso. Para obtener un gel transparente a partir de la gelatina es necesario calentar la disolución y enfriarla para formar un gel (también conocido como gel termoendurecido). En cambio, el CGMP oligomérico se usó como componente de partida para formar un gel “frío” (gel endurecido en frío), es decir, a temperatura ambiente y sin necesidad de una etapa de calentamiento. La disolución de 60 g/l es muy viscosa y forma un gel en el plazo de 24 horas de la adición de 2 U/ml de mTG a 25 °C (figura 25). La cinética de la gelificación puede controlarse variando la masa molar de oligo-CGMP (grado de polimerización, DP), la concentración de oligo-CGMP, la fuerza iónica, la temperatura, el pH y la dosificación de enzima. La velocidad de gelificación está relacionada con la masa molar (es decir, el DP) del oligo-CGMP de partida. Por tanto, un oligo-CGMP de mayor masa molar gelifica más rápidamente que la muestra de menor masa molar. Una mayor fuerza iónica, la temperatura (hasta la temperatura óptima de la enzima) y la dosificación de enzima conducen a una gelificación más rápida. Los iones de calcio (Ca2+) así como las nano/micropartículas insolubles de CaP (o CaC) modificaron las propiedades del gel. Cuando se genera una baja concentración de nanopartículas de CaP in situ en el gel de poli-CGMP, el gel muestra opalescencia y parece tener un tinte azulado. El aspecto cambia a lechoso/blanquecino al aumentar la concentración de las partículas de CaP.

Este mecanismo de gelificación se aprovechó para encapsular (inmovilizar/atrapar) bacterias en perlas de gel elaboradas de oligo-CGMP reticulado, tal como se muestra en la figura 26. En general, la estabilidad de las emulsiones dobles con fase W¹gelificada fue mayor que sin gelificación. La formulación puede variarse para conseguir diversos tamaños de gota (1 - 100 |im), fracciones de volumen (0,01 - 0,95 para la emulsión primaria y 0,001 - 0,75 para la emulsión secundaria), concentración de emulsionante (0,25 - 5 % p/v en la emulsión doble) y estabilidad (de horas a meses) y eficacia de encapsulación (hasta aproximadamente el 90 %). Después de la gelificación de las gotas de agua internas, las perlas que contienen bacterias encapsuladas pueden separarse mediante centrifugación o filtración suave o mediante desemulsionamiento por calor o diluciones o añadiendo un desemulsionante. Estas perlas que contienen microorganismos pueden recubrirse fácilmente con un recubrimiento adecuado, por ejemplo, un recubrimiento capa a capa de polielectrolitos de carga opuesta (proteínas o polisacáridos). La fase de aceite puede cambiarse por cualquier aceite o grasa de calidad alimentaria (por ejemplo, grasas lácteas, ácidos grasos, lípidos, etc.) y emulsionante de calidad alimentaria. Las microcápsulas pueden secarse por pulverización o liofilización para obtener bacterias encapsuladas en seco. En conclusión, las propiedades de gelificación en frío de oligo-CGMP (poli-CGMP) pueden usarse para proporcionar funcionalidades de textura y encapsulación a los productos alimenticios (lácteos), así como en otras aplicaciones relacionadas con la biología.

Ejemplo 8 - “Estructuras ensambladas jerárquicamente”

Método

Tal como se explicó en el ejemplo 2, el oligo-CGMP se autoensambla en un coloide de asociación similar a caseína cuando la concentración de la disolución se cambia desde muy diluida hasta diluida. También se investigó experimentalmente el comportamiento de fase del oligo-CGMP a concentraciones muy altas (>> 120 g/l), por ejemplo, cuando se seca la disolución o el gel de oligo-CGMP (tal como se obtuvo en el ejemplo 7). Se colocó una gota de aproximadamente 50 |il de la disolución o el gel de 60 g/l de oligo-CGMP (tal como se describió en el ejemplo 7) en un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos de vidrio delgado. La muestra se observó bajo el modo de transmitancia en un microscopio óptico (BX 53, Olympus) y con un aumento de 40X (UPlan FL N, 40x/0,75 Ph2). Las imágenes se capturaron con una cámara CCD (SC 50, Olympus) acoplada al microscopio. La imagen se capturó usando el software proporcionado por Olympus (cellSens Entry, exposición: 5,027 ms en modo normal y 50,09 ms en modo de polarización cruzada). Se capturaron imágenes en color de alta calidad con una relación de aspecto convencional y una resolución de 2560*1920 y se etiquetaron con una escala precalibrada (barra blanca=10 |im). Para monitorizar la birrefringencia, se cruzaron el polarizador (U-POT, Olympus, Japón) y el analizador (U-ANT, Olympus, Japón) a un ángulo de 90° con la muestra mantenida entre ellos. Las imágenes normales y de polarización cruzada se registraron en función del tiempo de secado de las muestras a una temperatura de aproximadamente 25 °C. El secado se realizó desde el lado del cubreobjetos de vidrio que no estaba sellado, es decir, se mantuvo abierto para un secado controlado en función del tiempo (0 - 72 h).

Resultados y conclusión

El gel de oligo-CGMP (tal como se obtuvo en el ejemplo 7) se parecía a los geles de proteínas de hebras finas y era transparente. Estas hebras (fibrillas) finas en el gel están orientadas aleatoriamente y, por tanto, el gel parece “negro” (oscuro) sin birrefringencia en las imágenes microscópicas de polarización cruzada (figura 27a, izquierda). En la bibliografía se ha notificado que el ensamblaje jerárquico de las fibras de proteínas puede conducir a la formación de fases cristalinas líquidas nemáticas debido a la orientación ordenada. Esto se sometió a prueba en el caso del CGMP oligomérico secando la disolución y el gel mientras se monitorizaba bajo luz polarizada cruzada. Al principio, la disolución parece ser isotrópica, pero en el transcurso del secado empiezan a aparecer algunos puntos birrefringentes cerca del borde abierto del cubreobjetos. El material birrefringente aparece alargado (figura 27a). El material birrefringente alargado aumentó en número y se observó con muchas ramificaciones después de un secado prolongado. Finalmente, la birrefringencia aparece en toda la muestra. En algunos casos, también se observó una fibra fuertemente birrefringente (haces de fibrillas) con algunos giros y vueltas (figura 27b). Este fenómeno no se observó con el CGMP monomérico y, por tanto, está relacionado con la polimerización del CGMP. Este desarrollo de birrefringencia en la disolución/gel de oligo-CGMP durante el secado se origina muy probablemente por el ordenamiento (ensamblaje jerárquico) de las hebras (fibrillas) finas que conduce a la formación de una fase cristalina líquida. Se espera que estas hebras finas ensambladas jerárquicamente sean muy útiles para aplicaciones prácticas que requieran fibras basadas en proteínas, una mayor estabilización coloidal y la manipulación de la estructura a mesoescala, por ejemplo, la modificación de la reología (textura) de un producto lácteo fermentado o fresco. Así como para aplicaciones tales como la estabilización potenciada de la emulsión que conduce a una microencapsulación muy estable y eficaz, así como para la liberación o administración controlada del material encapsulado.

En conclusión, el ensamblaje jerárquico descrito en este ejemplo junto con el descrito en los ejemplos 2 - 7 puede combinarse de diversas maneras (complejas) para tener cantidades variables de fases orgánicas (por ejemplo, poli-CGMP) e inorgánicas (por ejemplo, CaP/CaC) que conducen a diversas aplicaciones tales como la estabilización coloidal, la texturización y la encapsulación. Estas funcionalidades potenciadas (modificadas) se rigen por interacciones a escalas jerárquicas de longitud (tiempo). A escala molecular, las interacciones entre los grupos fosfato unidos a serina y la superficie de las partículas inorgánicas basadas en calcio (por ejemplo, CaP/CaC) conducen a la unión del oligo-CGMP en la fase inorgánica. En la mesoescala, esta interacción conduce a la creación de diversos tipos de estructuras jerárquicas. Por ejemplo, las interacciones entre los grupos fosfato unidos a serina y la superficie inorgánica de CaP o CaC, junto con la carga neta resultante del equilibrio entre el ácido siálico, el ácido carboxílico y los grupos amina, pueden modificar el tamaño, el tipo y el grado de amorfia del cristal. Esto, a su vez, conduce a un aumento del área de superficie y, por tanto, a una mayor capacidad de inmovilización y encapsulación. Las interacciones a escala molecular y mesoescala acaban contribuyendo a la funcionalidad a macroescala (por ejemplo, en un producto lácteo), tal como la textura y la estabilidad. Por tanto, la polimerización de CGMP para formar oligo-CGMP (poli-CGMP) puede usarse para proporcionar funcionalidades novedosas (tales como las descritas en la figura 21) en diversas aplicaciones (biológicas) alimentarias y productos lácteos.

Bibliografía

1: Yoav D. Livney (Current Opinion in Colloid & Interface Science 15 (2010) 73-83)

2: M.H. Abd El-Salam, 2006. Separation of Casein Glycomacropeptide from Whey: Methods of Potential Industrial Application. International Journal of Dairy Science, 1: 93-99.

3: Jianquan Luo et al. Journal of Membrane Science 469 (2014) 127-139.

4: Documento WO2008/017499A1

5: A. Tolkach et al. (Journal of Food Engineering 67 (2005) 13-20))

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método para elaborar un nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, que comprende la siguiente etapa:

(i): adición de una composición que comprende oligómeros de glicomacropéptido de caseína (CGMP) (oligómeros de CGMP) reticulados por medio de enlaces isopeptídicos covalentes intermoleculares a un alimento, pienso o producto farmacéutico, con el fin de elaborar de ese modo el nuevo alimento, pienso o producto farmacéutico, y en el que:

(a): el producto comprende, después de la adición de la composición, al menos 1 mg de oligómeros de CGMP por kg del producto;

y en el que el CGMP monomérico es el péptido que contiene los residuos de aminoácidos 106-169 de kcaseína y los monómeros de los oligómeros de CGMP son el CGMP monomérico;

y en el que los oligómeros de CGMP añadidos en la etapa (i) se usan para la unión de iones, por ejemplo, la unión de Ca y preferiblemente la unión de fosfato de calcio (CaP), la encapsulación de una sustancia, por ejemplo, un fitoquímico tal como, por ejemplo, curcumina o p-caroteno, la encapsulación de una molécula, por ejemplo, una enzima tal como, por ejemplo, lactasa, la gelificación, el hinchamiento del gel en respuesta a la liberación desencadenada por, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica o la temperatura, la conjugación covalente, la formación de complejos electrostáticos o la estabilización de coloides, por ejemplo, estabilización ácida, estabilización de Pickering o por medio de estructuras autoensambladas o agregados.
2. El método según la reivindicación 1, en el que el producto es un producto alimenticio y en el que el producto alimenticio es un producto lácteo.
3. El método según la reivindicación 2, en el que el producto lácteo es yogur, quark, queso, queso para pizza, yogur para beber, queso para untar, skyr o leche entera agria.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en relación con el punto (a) según la reivindicación 1, el producto comprende, después de la adición de la composición, al menos 10 mg de oligómeros de CGMP por kg del producto.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición que comprende oligómeros de CGMP es una composición obtenida mediante la adición de transglutaminasa (TGasa) a una muestra de lactosuero en condiciones en las que los CGMP monoméricos de la muestra de lactosuero se reticulan para obtener de ese modo oligómeros de CGMP y, de ese modo, la composición que comprende oligómeros de CGMP, y en el que la muestra de lactosuero es lactosuero o una muestra de lactosuero más concentrada, tal como, por ejemplo, concentrado de proteínas del lactosuero (WPC), aislado de proteínas del lactosuero (WPI) o CGMP monomérico más purificado, preferiblemente en el que la muestra de lactosuero comprende al menos el 90 % de proteínas del lactosuero en p/p del contenido total de proteínas de la muestra.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición que comprende oligómeros de CGMP es una composición que comprende al menos el 20 % de oligómeros de CGMP en p/p del contenido total de proteínas de la composición, y en el que la composición que comprende oligómeros de CGMP es una composición que comprende desde 0,01 mg hasta 0,99 mg de oligómeros de CGMP por mg de la composición y en el que la composición que comprende oligómeros de CGMP es una composición en la que la razón oligómeros de CGMP/para -K-caseína K-caseína (p/p) es superior a 2.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición que comprende oligómeros de CGMP es una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio del oligómero de CGMP es de desde 3 hasta 10000.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligómeros de CGMP del punto (a) según la reivindicación 1 son partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas).
9. El método según la reivindicación 8, en el que las partículas de oligómero de CGMP autoensambladas (agregadas) comprenden sustancias encapsuladas y en el que la sustancia encapsulada es un fitoquímico tal como curcumina, p-caroteno, un pigmento colorante, preferiblemente un pigmento colorante natural, una vitamina insoluble en agua, por ejemplo, vitamina D, E o K, un mineral, un péptido o un ácido graso.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alimento, pienso o producto farmacéutico es un producto con un pH inferior a pH 5 y en el que el producto es una bebida para consumo humano con un pH inferior a pH 5 y en el que el grado de polimerización (DP) promedio del oligómero de CGMP es de desde 4 hasta 1000.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca y en el que las partículas tienen un tamaño de entre 10 nm hasta 1000 |im y en el que las partículas de oligómero de CGMP-Ca añadidas en la etapa (i) se usan para el enriquecimiento con calcio de una bebida o se usan como estabilizadores de Pickering para elaborar emulsiones y/o espumas estables y en el que la composición que comprende partículas de oligómero de CGMP-Ca es una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio es de desde 3 hasta 100000.
12. El método según la reivindicación 11, en el que las partículas de oligómero de CGMP-Ca son partículas de oligómero de CGMP-CaP.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligómeros de CGMP del punto (a) son partículas de oligómero de CGMP-Ca, preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP o partículas de oligómero de CGMP-CaC, lo más preferiblemente partículas de oligómero de CGMP-CaP, que comprenden moléculas encapsuladas y en el que las partículas tienen un tamaño de entre 10 nm hasta 1000 |im y en el que la composición que comprende las partículas de oligómero de CGMP-Ca que comprenden moléculas encapsuladas es una composición en la que el grado de polimerización (DP) promedio es de desde 3 hasta 100000 y en la que la molécula encapsulada es un pigmento colorante, una bacteriocina, una enzima o bacterias.
14. El método según la reivindicación 13, en el que las partículas de oligómero de CGMP-Ca son partículas de oligómero de CGMP-CaP.