ES2873799T3

ES2873799T3 - Procedimiento para la determinación cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo

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Publication number: ES2873799T3
Application number: ES17835797T
Authority: ES
Inventors: Erdmann Flindt; Detlef Timmermann
Original assignee: Membrapure GmbH
Current assignee: Membrapure GmbH
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2021-11-03
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: EP3596474B1; EP3596474A1; DE102017002523A1; WO2018166546A1

Abstract

Procedimiento para la determinación cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo, en el que el aminoácido homocisteína también se detecta cuantitativamente en un único ciclo cromatográfico, en el que el procedimiento es un procedimiento cromatográfico que utiliza un eluyente múltiple y un programa de separación, caracterizado por, que los eluyentes son los siguientes, cada uno con la siguiente composición relativa: B: hidróxido de litio monohidratado 2,5 g, ácido bórico 0,5 g, etanol 5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50 % 4,7 ml, agua ultrapura 480 ml; C: hidróxido de litio monohidratado 2,1 g, ácido bórico 1,5 g, ácido fórmico 1,5 ml, ácido acético al 100 % 1,5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50 % 0,8 ml, agua ultrapura 495 ml.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la determinación cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo

La invención se refiere a un procedimiento para la detección cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en plasma sanguíneo.

Después de que la tecnología de espectrometría de masas en tándem se haya reformado en proteómica, metabolómica y en la búsqueda de nuevos biomarcadores para la detección temprana de enfermedades, ahora se utiliza de forma rutinaria en análisis clínicos. La espectrometría de masas en tándem pudo ampliar la gama de diagnósticos de enfermedades metabólicas congénitas (fenilcetonuria, enfermedad de jarabe de arce) en el cribado neonatal. Para la prueba de cribado, se analizan algunas gotas de sangre en busca de aminoácidos mediante espectrometría de masas en tándem. Debido a su masa molecular idéntica, no es posible una diferenciación entre los aminoácidos leucina (Leu) e isoleucina (Ile) por medio de espectrometría de masas y pueden surgir resultados falsos positivos. Por lo tanto, los aminoácidos isoleucina y leucina se determinan en un segundo análisis utilizando un analizador de aminoácidos o HPLC. Los biomarcadores adecuados para predecir la diabetes tipo 2 pueden ser los aminoácidos isoleucina, leucina, valina, tirosina y fenilalanina. En un estudio publicado en "Nature Medicine" (Wang T. et. al.: Metabolite profiles and the risk of developing diabetes), los científicos pudieron determinar las concentraciones cambiantes de aminoácidos en el plasma sanguíneo antes de la aparición de la diabetes tipo 2. En la homocisteinemia, la concentración del aminoácido homocisteína en el plasma sanguíneo aumenta y representa un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. La homocisteína se utiliza como un biomarcador bien conocido en el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares. La determinación de homocisteína en plasma sanguíneo se realiza mediante una prueba enzimática o HPLC.

Los documentos US 2011/085983 A1 y "PRINSEN HUBERTUS C ET AL.: "Rapid quantification of underivatized amino acids in plasma by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled with trandom mass-spectrometry", JOURNALN OF INHERITED METABOLIC DISEASE, KLUWER, DORDRECHT, NL, Bd. 39, No. 5, 21 de abril de 2016 (21/04/2016), páginas 651-660, XP036033275, ISSN: 0141-8955, DOI: 10.1007 / S10545-016-9935-Z [encontrado el 2016-04-21]", describen un procedimiento para la determinación cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo, en el que el aminoácido homocisteína se detecta cuantitativamente en un solo ciclo de cromatografía y que es un procedimiento cromatográfico que utiliza varios eluyentes y un programa de separación, en el que se utiliza una combinación de ácido TDFHA y TDFHA-acetonitrilo como eluato, que discurren por dos columnas diferentes.

"Yong Qu ET AL.: "Quantitative amino acid analysis using a Beckman system gold HPLC 126AA analyzer", CLINICA CHIMICA ACTA, Bd. 312, N.°. 1-2, 1 de octubre de 2001 (01/10/2001), páginas 153-162, XP055457019, DOI 10.1016 / S0009-8981 (01) 00615-5" y "FREETO SM ET AL.: "A rapid UPLC-MS/MS method for the determination of specific amino acids associated with maple syrup urine disease and phenylketonuria", CLINICAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY, WASHINGTON, DC, Bd. 52, núm. 6, Supl. S, 31 de mayo de 2006 (31/05/2006), página A34, XP009503925, ISSN: 0009-9147" describen la cuantificación de 7 aminoácidos diferentes, en el que se utilizan tampones a base de litio como eluyentes.

"PIRAUD MONIQUE ET AL.: "Ion-pairing reversed-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric analysis of 76 underivatized amino acids of biological interest: a new tool fort he diagnosis of inherited disorders of amino acid metabolism", RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, JOHN WILEY & SONS, GB, Bd. 19, N.° 12, 1 de enero de 2005 (01/01/2005), páginas 1587-1602, XP002470321, ISSN: 0951-4198, DOI: 10.1002 / RCM.1957" describen un procedimiento para la determinación cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina.

El documento DE 102016 010887 B3 describe un procedimiento para la detección cualitativa de plasma sanguíneo añadido en alimentos en carne y productos cárnicos, en el que los alimentos se separan en fases precipitadas y fluidas durante la preparación de la muestra, en el que al menos parte de la fase fluida se examina cualitativa y cuantitativamente en busca de aminoácidos, en el que los contenidos de muestra determinados de estos aminoácidos en fase líquida se comparan con los contenidos de muestra que proceden de los alimentos correspondientes que no han sido tratados con plasma sanguíneo, en el que los aminoácidos ornitina y cistina se tienen en cuenta al examinar el plasma sanguíneo añadido en la fase líquida.

La invención se refiere a un procedimiento para determinar las concentraciones de la combinación de aminoácidos homocisteína, valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo. Los 8 aminoácidos enumerados aquí se determinan con un ciclo de análisis/ciclo de cromatografía. Por lo tanto, no se requieren más pruebas para la determinación de la homocisteína, lo que ahorra tiempo y dinero.

De acuerdo con la invención, el procedimiento es un procedimiento cromatográfico que utiliza varios eluyentes y un programa de separación.

Esto también se aplica al hecho de que los eluyentes son los siguientes, cada uno con la siguiente composición relativa:

B: hidróxido de litio monohidratado 2,5 g, ácido bórico 0,5 g, etanol 5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50% 4,7 ml, agua ultrapura 480 ml;

C: hidróxido de litio monohidratado 2,1 g, ácido bórico 1,5 g, ácido fórmico 1,5 ml, ácido acético al 100% 1,5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50% 0,8 ml, agua ultrapura 495 ml.

En este contexto, también es ventajoso que los eluyentes se utilicen con los siguientes valores de pH:

Eluyente B: el valor de pH corresponde a 3,46 así como Eluyente C: el valor de pH corresponde a 4,48.

Además, es ventajoso en este contexto, ya que se ha demostrado, que los eluyentes B a C se utilicen uno tras otro en el orden B, C.

En la práctica, ha demostrado ser particularmente útil si se utiliza el siguiente programa de separación, en el que los datos son relativos a un caudal de eluyente de 240 microlitros por minuto y el siguiente perfil de eluyente y temperatura de la columna:

eluyente B: tiempo de 0 horas, 0 minutos a 9 minutos, 57 segundos; eluyente C: tiempo de 9 minutos, 57 segundos a 40 minutos, 3 segundos;

Perfil de temperatura de la columna:

Tiempo: 0 horas, 0 minutos a 34 minutos, 28 segundos;

Temperatura de la columna: 57 grados Celsius a las 0 horas, 0 minutos;

Temperatura de la columna: 57 grados Celsius a los 34 minutos, 28 segundos;

Tiempo: 34 minutos, 28 segundos a 37 minutos, 2 segundos;

Temperatura de la columna: 57 grados Celsius a los 34 minutos, 28 segundos;

Temperatura de la columna: 70 grados Celsius a los 37 minutos, 2 segundos;

Tiempo: 37 minutos, 2 segundos a 40 minutos, 3 segundos;

Temperatura de la columna: 70 grados Celsius a los 37 minutos, 2 segundos;

Temperatura de la columna: 70 grados Celsius a los 40 minutos, 3 segundos,

en el que el perfil de temperatura entre los diferentes niveles de temperatura se ejecuta esencialmente de forma lineal entre los respectivos puntos temporales de inicio y finalización a diferencias de temperatura especificadas.

Debido a la interacción muy compleja de temperatura, valor de pH, momento dipolar y polarizabilidad de los eluyentes y sus constituyentes, anteriormente no era posible detectar cuantitativamente la homocisteína cromatográficamente junto con los otros aminoácidos mencionados anteriormente. De acuerdo con la invención, esto se ha logrado ahora sorprendentemente.

Las siguientes realizaciones explican la invención de forma no limitativa.

Desarrollo y validación de procedimientos

Material

Se preparó una muestra de plasma sanguíneo para el desarrollo y validación del procedimiento de la siguiente manera. Preparación de la muestra

La homocisteína unida se reduce a homocisteína libre con una solución de ditiotreitol al 4%, en este caso la homocisteína se libera de su unión a proteínas y disulfuros. Esto permite determinar la homocisteína total.

Preparación de la muestra: Se colocan 500 pl de plasma 100 pl de solución de ditiotreitol al 4% en un tubo Eppendorf, se mezclan e incuba a 40 °C durante 30 min. A continuación, se añaden 150 pl de solución de ácido sulfosalicílico al 10% para la precipitación de proteínas y se guarda en el frigorífico durante 30 min.

A continuación, se añaden 500 pl de tampón de dilución de la muestra (con estándar interno de norleucina 100 nmol/ml) y se centrifuga a 14000 rpm durante 5 min. Se pipetea el sobrenadante y se centrifuga una segunda vez con un filtro de centrifugación de membrana a 14000 rpm durante 5 min. La muestra de plasma está lista para el análisis de aminoácidos.

Análisis de aminoácidos

Las columnas de separación, los eluyentes y los programas de separación se han desarrollado y utilizado especialmente para una separación y reproducibilidad óptimas. La columna de separación rellena con resina polimérica a base de estireno y divinilbenceno y una reticulación del 10%. Las dimensiones de la columna de separación son 4 mm de diámetro interno y 118 mm de longitud interna y 125 mm de longitud externa.

Los 2 eluyentes, etiquetados como B y C, se componen de:

B: hidróxido de litio monohidratado 2,5 g, ácido bórico 0,5 g, etanol 5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50% 4,7 ml, agua ultrapura 480 ml.

con diferentes valores de pH: eluyente B 3,46, eluyente C 4,48,

Se utiliza una solución de hidróxido de litio, pH 12,43, como solución de regeneración (eluyente F) para regenerar la columna de separación después de que los aminoácidos se hayan separado de la muestra.

El valor de pH del eluyente aumenta gradualmente desde el eluyente B al eluyente F (ver gráfico 1). El pH de 3,48 es el más bajo en la primera fase y aumenta a 12.46 hasta la fase de regeneración de la columna con eluyente F. La temperatura se cambia en varias fases. La regulación de la temperatura de la columna (ver tabla 1) se limita al procedimiento y se realiza a través de un reactor.

Después de la separación, los aminoácidos reaccionan con la solución de reactivo de ninhidrina para formar un tinte azul (púrpura de Ruhemann). La intensidad del color es proporcional a la concentración del tinte y, por lo tanto, a la concentración de un aminoácido a determinar. Para el análisis cuantitativo, los aminoácidos se determinan fotométricamente a 570 nm y la muestra estándar con concentraciones conocidas se compara con la muestra a examinar y evaluar (figuras 1 y 2).

Tabla 1 perfil de temperatura de la columna

Valores de pH de eluyentes:

B: 3,48 ± 0,2

C: 4,41 ± 0,2

F: 12,43 ± 0,2

Validación del procedimiento

Precisión

Al determinar la precisión, se demuestra que los valores medidos respectivos se pueden reproducir en las condiciones específicas del análisis. En principio, se hace una distinción entre dos tipos de precisión: precisión intraensayo e interensayo. Con precisión intraensayo, las concentraciones de mediciones sucesivas (n = 10) del mismo plasma se miden dentro de una serie de pruebas. Los resultados obtenidos de las mediciones individuales deben estar lo más cerca posible entre sí. Para determinar la precisión interensayo, la precisión se determina en diferentes ciclos (n = 10) y en diferentes días con el mismo plasma en las mismas condiciones. También en este caso, se espera que los resultados sean cercanos. El coeficiente de variación (VK) como expresión de las desviaciones intraensayo e interensayo se utiliza como medida de precisión. La buena reproducibilidad intraensayo e interensayo del procedimiento puede derivarse de los resultados determinados y mostrados en las tablas 2 y 3.

Tabla 2 precisión intraensayo de los AA H-Cys, Val, Met, Ile, Leu, Nle, Tyr y Phe Mediciones n = 10 AA Valor medio SD VK (%)

H-Cys x = 7,34 ± 0,305 4,15

Val x = 164,4 ± 0,855 0,52

Met x = 20,87 ± 0,244 1,17

lle x = 46,22 ± 0,269 0,58

Leu x = 107,2 ± 0,586 0,55

Nle x = 99,53 ± 0,607 0,61

Tyr x = 67,8 ± 0,380 0,56

Phe x = 69,61 ± 0,511 0,73

Tabla 3 Precisión interensayo de los AA H-Cys, Val, Met, Ile, Leu, Nle, Tyr y Phe Mediciones n = 10 AA Valor medio SD VK (%)

H-Cys x = 7,56 ± 0,436 5,77

Val x = 163,8 ± 2,172 1,33

Met x = 21,24 ± 0,592 2,76

lle x = 44,67 ± 0,908 2,03

Leu x = 105,3 ± 1,721 1,63

Nle x = 100,37 ± 1,141 1,14

Tyr x = 69,13 ± 0,830 1,2

Phe x = 70,35 ± 0,617 0,88 Recuperación

Se realizaron una serie de diluciones para probar la tasa de recuperación. Para este propósito, una muestra de plasma se enriqueció con una solución de homocisteína (concentración de 40 nmol/ml).

Preparación de plasma para la serie de diluciones: 2 ml de plasma más 2 ml de solución de homocisteína (concentración de homocisteína 40 nmol/ml).

Tabla 4 esquema de la serie de diluciones

Concentración relativa del plasma 100% 80% 60% 40% 20% 10% Adición de volumen de plasma 1000 Ml 800 Ml 600 Ml 400 Ml 200 Ml 100 Ml Volumen de tampón de dilución 200 Ml 400 Ml 600 Ml 800 Ml 900 Ml

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Linealidad

La linealidad proporciona información sobre el intervalo de concentración de las sustancias analizadas en el que la cantidad de sustancia es lineal con el tamaño del área del pico. La linealidad de las sustancias utilizadas en el intervalo medido se comprobó con referencia a rectas de calibración. Las rectas de calibración se crearon con Excel y se muestran en nmol/ml. Para crear la recta estándar, se inyectaron cinco veces 20 pl de cada una de las 6 soluciones de calibración (intervalo de concentración de 5 a 50 nmol/ml). En el cálculo, los valores medios de las áreas de los picos se representaron frente a las concentraciones. Las curvas de calibración se calcularon como líneas de tendencia (tipo: lineal). Las rectas de calibración fueron lineales y hubo regresiones lineales con altos coeficientes de regresión (ver tabla 12).

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o o o o ^oCM co ,^ r LO o Límite de detección (NG) y límite de cuantificación (BG)

Un procedimiento se basa en la determinación de los denominados valores en blanco o valores en vacío. Para ello, se preparó una muestra en blanco (tampón de dilución) y se midió diez veces, determinándose el valor medio y la desviación estándar. Para determinar el límite de detección inferior, se determinó tres veces la desviación estándar si x está en el rango cero con una probabilidad del 99,9%; de lo contrario, se le suma el valor en blanco medio.

El límite de cuantificación es la concentración más pequeña de un analito que se puede determinar cuantitativamente con una precisión especificada. Los resultados del análisis cuantitativo solo se dan por encima del límite de cuantificación. El límite de cuantificación siempre tiene una precisión mayor que el límite de detección. Al igual que con el límite de detección, el criterio de la precisión deseada suele basarse en la precisión del valor en blanco, es decir, en el error estadístico (expresado por la desviación estándar) del procedimiento de medición para una medición nula o una medición en vacío. Un valor medido a menudo se considera cuantitativo (determinado) si la precisión de la medición es tres veces mayor (mejor) que la precisión del límite de detección; el límite de cuantificación corresponde aproximadamente a tres veces el valor del límite de detección.

Fuentes:

DIN 32645: Análisis químico; Límite de detección, registro y cuantificación;

Determinación en condiciones repetitivas; términos, procedimientos, evaluación

Tabla 13 límite de detección (NWG) y límite de cuantificación (BG)

AA NWG (nmol/ml) BG (nmol/ml)

H-Cys 0,82 2,46

Val 0,74 2,22

Met 0,84 2,52

Ile 0,83 2,49

Leu 0,76 2,28

Nle 0,8 2,4

Tyr 0,76 2,28

Phe 0,89 2,27

Tabla 14

Concentración de aminoácido de valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en nmol/ml de plasma sanguíneo A sin reducción y B con reducción

A B

X SD ^X SD AA

Val 204,3 ± 74,9 203,8 ± 79,8

Met 35,8 ± 12,4 35,2 ± 11,8

Ile 77,5 ± 33,3 77,8 ± 35,8

Leu 126,8 ± 46,6 125,7 ± 48,5

Tyr 81,8 ± 24,5 80,6 ± 23,3

Phe 72,1 ± 18,0 72,7 ± 17,7

Los valores son valores medios ± desviación estándar (n = 10)

La reducción de la homocisteína unida a homocisteína total libre con una solución de ditiotreitol al 4% no tiene una influencia significativa sobre las otras concentraciones de aminoácidos (valina, metionina, isoleucina, leucina tirosina y fenilalanina, tabla 14).

Los ejemplos que se muestran en las tablas siguientes están destinados a explicar la invención con más detalle. Para ello, se prepararon muestras de plasma sanguíneo de recién nacidos sanos, recién nacidos con enfermedad de jarabe de arce, pacientes con y sin infarto de miocardio, pacientes con y sin diabetes mellitus tipo 2 como se describió anteriormente y se determinaron las concentraciones de aminoácidos.

Tabla 15

Concentración de aminoácido de valina, homocisteína, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en nmol/ml de plasma sanguíneo A recién nacidos sin enfermedad de jarabe de arce y B recién nacidos con enfermedad de jarabe de arce

A B

X SD ^X SD

AA

Val 202,1 <a> ± 54,1 467,9 ± 116,9

H-cisteína 4,4<a> ± 1,5 6,9 ± 2,8

Met 31,1<a> ± 7,9 17,2 ± 4,0

alo-ile <2<a> 66,2 ± 37,4

Ile 58,9<a> ± 16,9 213,0 ± 48,6

Leu 141,9<a> ± 40,5 433,6 ± 108,1

Tyr 108,0<8> ± 31,2 67,4 ± 20,9

Phe 99,4<a> ± 18,6 70,2 ± 11,2

Los valores son valores medios ± desviación estándar (n = 10)

Los valores medios con diferentes letras mayúsculas difieren significativamente entre sí, p < 0,05

En los recién nacidos con enfermedad de jarabe de arce, las concentraciones de aminoácido de valina, homocisteína, aloisoleucina, isoleucina y leucina aumentan significativamente y las concentraciones de aminoácido de metionina, tirosina y fenilalanina son significativamente más bajas en comparación con los recién nacidos sin enfermedad de jarabe de arce (tabla 15).

Estudios comparativos: Oglesbee D. et. al. Second-Tier Test for Quantification of Alloisoleucine and Branched-Chain Amino Acids in Dried Blood Spots to Improve Newborn Screening for Maple Syrup Urine Disease (MSUD) Clinical Chemistry 54, N.°.:3 2008. Schadewaldt P. et al. Significance of L-allo-isoleucine in plasma for diagnosis of maple syrup urine disease. Clin Chem. Octubre de 1999; 45(10): 1734-40. Refsum H. et. al. Screening for Serum Total Homocysteine in Newborn Children. Clinical Chemistry 50, N.° 10, 2004

Tabla 16

Concentración de aminoácido de valina, homocisteína, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en nmol/ml de plasma sanguíneo A pacientes sin diabetes tipo 2 B pacientes con diabetes tipo 2

A B

^X SD ^X SD

AA

Val 197,6 ± 28,7 218,6 ± 24,3

H-cisteína 10,7<a> ± 4,0 19,6 ± 2,6

Met 22,9 ± 5,2 19,1 ± 2,1

Ile 66,3 ± 9,4 73,4 ± 13,2

Leu 124,1 ± 25,2 143,5 ± 20,6

Tyr 65,5 ± 5,4 74,9 ± 15,1

Phe 101,4<a> ± 21,8 56,9 ± 7,2

Los valores son valores medios ± desviación estándar (n = 10)

Los pacientes con diabetes tipo 2 mostraron una concentración de aminoácido de homocisteína significativamente más alta y una concentración de aminoácido de fenilalanina significativamente más baja en comparación con los pacientes sin diabetes tipo 2 (tabla 16).

Estudios comparativos: Buysschaert M. et.al.: Hyperhomocysteinemia in Type 2 Diabetes Care, volumen 23, número 12, diciembre de 2000. Singh M. A. et. al. Serum homocysteine in type 2 diabetes with cardiovascular complications J Med Soc 2013;27: 31-5.

Tabla 17

Concentración de aminoácido de valina, homocisteína, metionina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en nmol/ml de plasma sanguíneo A pacientes sin infarto de miocardio y B pacientes con infarto de miocardio

A B

X SD ^X SD

AA

Val 197,6<a> ± 28,7 250,4 ± 48,5

H-cisteína 10,7<a> ± 4,0 29,7 ± 4,2

Met 22,9 ± 5,2 26,7 ± 7,3

Ile 66,3<a> ± 9,4 88,4 ± 12,4

Leu 124,1 <a> ± 25,2 159,1 ± 23,7

Tyr 65,5<a> ± 5,4 83,5 ± 21,9

Phe 101,4 ± 21,8 102,6 ± 27,4

Los valores son valores medios ± desviación estándar (n = 10)

En pacientes con infarto de miocardio, las concentraciones de aminoácido de homocisteína, valina, isoleucina, leucina y tirosina aumentan significativamente en comparación con pacientes sin infarto de miocardio (tabla 17).

Estudios comparativos: Nygard O. et.al. Plasma Homocysteine Levels and Mortality in Patients with coronary artery disease. The New England Journal of Medicine Volumen 337 Número 424 de julio de 1997. Wali V. et. al. Serum Homocysteine Levels As a Novel Biomarker in Patients with Acute Myocardial Infarction. International Journal of Medical and Health Sciences, octubre de 2012, Vol-1; Número 4.

Conclusión

El procedimiento desarrollado para determinar los aminoácidos homocisteína, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo es lineal, preciso y reproducible.

La prueba es económica, fácil de usar y ahorra tiempo.

Utilización del procedimiento en el cribado neonatal para la detección precoz de enfermedades metabólicas congénitas tales como la fenilcetonuria (PKU), la enfermedad de jarabe de arce (MSUD) y la hiperhomocisteinemia. La ventaja del procedimiento es la determinación combinada o simultánea de las concentraciones de aminoácidos homocisteína, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo, y ya no es necesaria una segunda prueba para la determinación de homocisteína, por tanto también se ahorra tiempo de trabajo y costes.

Aplicación del procedimiento en laboratorios médicos, en particular en química clínica con fines diagnósticos para la detección precoz y prevención de enfermedades, especialmente enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2 en pacientes de riesgo.

El paciente debe recibir una evaluación específica de su salud y su estado, lo que a su vez conduce a evitar o prevenir enfermedades previsibles y tiene una influencia positiva en el uso de medidas de promoción de la salud y, en última instancia, conduce al éxito.

Los costes totales de los pacientes con enfermedades cardiovasculares y diabetes mellitus tipo 2 se han elevado a unos 56 mil millones de euros anuales en los últimos años.

Por lo tanto, la introducción de una prueba de diagnóstico para la detección precoz de enfermedades cardiovasculares y diabetes mellitus tipo 2 no solo es ventajosa desde el punto de vista médico, sino también desde el punto de vista económico. Por un lado, se mejora la calidad de vida y, por otro lado, se reducen los costes de tratamiento de las enfermedades secundarias.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la determinación cuantitativa cromatográfica de los aminoácidos valina, metionina, aloisoleucina, isoleucina, leucina, tirosina y fenilalanina en el plasma sanguíneo, en el que el aminoácido homocisteína también se detecta cuantitativamente en un único ciclo cromatográfico, en el que el procedimiento es un procedimiento cromatográfico que utiliza un eluyente múltiple y un programa de separación,

caracterizado por,

que los eluyentes son los siguientes, cada uno con la siguiente composición relativa:

B: hidróxido de litio monohidratado 2,5 g, ácido bórico 0,5 g, etanol 5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50 % 4,7 ml, agua ultrapura 480 ml;

C: hidróxido de litio monohidratado 2,1 g, ácido bórico 1,5 g, ácido fórmico 1,5 ml, ácido acético al 100 % 1,5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50 % 0,8 ml, agua ultrapura 495 ml.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que los eluyentes se utilizan a los siguientes valores de pH:

Eluyente B: el valor de pH corresponde a 3,46;

Eluyente C: el valor de pH corresponde a 4,48.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que los eluyentes B a C se utilizan sucesivamente en la secuencia B, C.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que se utiliza el siguiente programa de separación, en el que los datos son relativos a un caudal de eluyente de 240 microlitros por minuto y el siguiente perfil del eluyente y de temperatura de la columna:

Eluyente B: tiempo de 0 horas, 0 minutos a 9 minutos, 57 segundos;

Eluyente C: tiempo de 9 minutos, 57 segundos a 40 minutos, 3 segundos;

Perfil de temperatura de la columna:

Tiempo: 0 horas, 0 minutos a 34 minutos, 28 segundos;

Temperatura de la columna: 57 grados Celsius a las 0 horas, 0 minutos;

Temperatura de la columna: 57 grados Celsius a los 34 minutos, 28 segundos;

Tiempo: 34 minutos, 28 segundos a 37 minutos, 2 segundos;

Temperatura de la columna: 57 grados Celsius a los 34 minutos, 28 segundos;

Temperatura de la columna: 70 grados Celsius a los 37 minutos, 2 segundos;

Tiempo: 37 minutos, 2 segundos a 40 minutos, 3 segundos;

Temperatura de la columna: 70 grados Celsius a los 37 minutos, 2 segundos;

Temperatura de la columna: 70 grados Celsius a los 40 minutos, 3 segundos,

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que se utiliza una columna de separación que está rellena con resina polimérica de estireno y divinilbenceno y una reticulación del 10%.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que las dimensiones de la columna de separación son 4 mm de diámetro interno y 118 mm de longitud interna y 125 mm de longitud externa.

7. Uso de un eluyente de acuerdo con la reivindicación 8 en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Eluyente seleccionado de un grupo formado por:

C: hidróxido de litio monohidratado 2,1 g, ácido bórico 1,5 g, ácido fórmico 1,5 ml, ácido acético al 100% 1,5 ml, ácido caprílico 0,1 ml, solución de ácido trifluoroacético al 50% 0,8 ml, agua ultrapura 495 ml,

en el que los detalles de composición de los constituyentes deben entenderse en un sentido relativo.

9. Eluyente de acuerdo con la reivindicación 8, adecuado para su uso en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6.