ES2867898T3 - Bioelectrodo para la detección y/u oxidación de glucosa, su método de producción y dispositivo - Google Patents
Bioelectrodo para la detección y/u oxidación de glucosa, su método de producción y dispositivo Download PDFInfo
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Abstract
Bioelectrodo caracterizado porque comprende la superposición de: - una capa (2) de nanotubos de carbono, - una capa (3) depositada sobre la capa (2) de nanotubos de carbono, que consiste en moléculas aromáticas elegidas del grupo formado por 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10- antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico y mezclas de dos o más de estas moléculas, - una capa (4) de enzimas dinucleótido de flavina adenina-glucosa deshidrogenasa (FAD-GDH) adsorbidas en la capa (3) de las moléculas aromáticas.
Description
DESCRIPCIÓN
Bioelectrodo para la detección y/u oxidación de glucosa, su método de producción y dispositivo
La invención se refiere a un bioelectrodo en base a dinucleótido de flavina adenina glucosa deshidrogenasa, sus usos para la detección u oxidación de glucosa y los dispositivos que la componen, particularmente un dispositivo de detección de glucosa o una célula de biocombustible enzimático para la oxidación de glucosa.
También se relaciona con los métodos de producción para este bioelectrodo.
La detección de glucosa en orina o sangre es importante para detectar personas con diabetes.
Por tanto, también es importante un dispositivo de detección de glucosa.
Un dispositivo de monitoreo de glucosa que mida los niveles de glucosa en sangre u orina de pacientes diabéticos es una necesidad para que estos pacientes monitoreen su diabetes.
Tales dispositivos idealmente deberían ser fácilmente transportables, es decir pequeños y ligeros.
En los últimos años se han desarrollado un gran número de biosensores amperométricos para detectar y cuantificar la glucosa.
Además, el rápido desarrollo de la tecnología médica ha hecho posible recientemente monitorear y diagnosticar directamente el desempeño de un órgano en el cuerpo mediante dispositivos implantados.
El suministro de energía de estos dispositivos por las células de biocombustible enzimático es muy prometedor, especialmente cuando el biocombustible es glucosa porque en este caso, la célula se suministra constantemente con energía eléctrica de la glucosa contenida en los fluidos fisiológicos humanos.
Los detectores de glucosa, como las células de biocombustible enzimático que suministran energía a través de la oxidación de la glucosa, usan enzimas para actuar como catalizadores que convierten la glucosa en energía eléctrica.
Como enzimas para detectar y/u oxidar glucosa, las enzimas dinucleótido de flavina adenina glucosa deshidrogenasa (FAD-GDH) se estudiaron y promovieron específicamente en los últimos años.
La FAD-GDH es una enzima termoestable que es altamente selectiva para oxidar glucosa que no usa oxígeno como un aceptor de electrones.
Zafar y otros en “Characterization of different FAD-dependent glucose dehydrogenases for possible use in glucosebased biosensors and biofuel cells”, Anal Bioanal Chem (2012) 402: 2069-2077 describen un electrodo que consiste en una varilla de grafito en la parte superior de la cual varias enzimas ADF-GDH se han depositado y luego reticulado en un polímero óseo. Deby Fapyane y otros en “High performance enzyme fuel cells using a genetically expressed FAD-dependent glucose dehydrogenase a-subunit of Burkholderia cepacia immobilized in a carbon nanotube electrode for low glucose conditions”, Physical Chemistry Chemical Physics 15(24), May 2013, pp 9508 9512, XP55379514A describen un electrodo que comprende FAD-GDH acoplado con menadiona e inmovilizado en un soporte de nanotubos de carbono y Nafion®. Sin embargo, estos electrodos no permitían obtener una alta densidad de corriente, lo que demostraba que el contacto eléctrico entre la enzima y el grafito no era suficiente. La invención tiene como objetivo superar los problemas de los electrodos FAD-GDH de la técnica anterior.
Para este propósito, la invención propone un bioelectrodo caracterizado como la superposición de:
- una primera capa de nanotubos de carbono,
- una segunda capa, depositada sobre la primera capa de nanotubos de carbono, que consiste en moléculas aromáticas elegidas del grupo formado por 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico, y mezclas de dos o más de estas moléculas,
- una tercera capa de enzimas dinucleótido de flavina adenina glucosa deshidrogenasa (FAD-GDH) adsorbidas en la segunda capa de moléculas aromáticas.
El bioelectrodo de la invención puede comprender además una cuarta capa de un material poroso y/o hidrófilo que cubre al menos la superficie libre de la tercera capa de enzimas FAD-GDH.
Este material poroso y/o hidrofílico es preferentemente alginato, quitosano, Nafion® o gel de sílice. Preferentemente, en el bioelectrodo de acuerdo con la invención, la segunda capa de moléculas aromáticas consta de moléculas de 9,10-fenantrenoquinona o 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
También preferentemente, en el bioelectrodo de acuerdo con la invención, la capa de nanotubos de carbono consta de entre 2,5 |jg y 510 |jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie de capa, preferentemente entre 2,5 y 100 |jg de nanotubos de carbono, carbono por cm2 de superficie de la primera capa de nanotubos de carbono.
En una primera modalidad, el bioelectrodo de la invención consta también de un soporte hecho de un material eléctricamente conductor, preferentemente carbono vitreo, bajo la primera capa de nanotubos de carbono.
Incluso más preferentemente, el bioelectrodo de la invención también consiste en un alambre hecho de un material eléctricamente conductor conectado a la superficie de la capa de nanotubos de carbono que no está cubierta con la segunda capa de moléculas aromáticas.
El cobre, cobre plata, o platino se usa generalmente como material eléctricamente conductor.
En el bioelectrodo de la invención, el alambre conductor es preferentemente cobre plateado.
En una segunda modalidad del bioelectrodo de la invención, el bioelectrodo de la invención consiste además de una capa de recubrimiento impermeable a los fluidos, preferentemente un polímero a base de silicona, depositada sobre las superficies libres de las capas de nanotubos de carbono y enzimas y en los bordes de la superposición de la primera, segunda y tercera capas de nanotubos de carbono, moléculas aromáticas y enzimas FAD-GDH.
La invención también propone un dispositivo que consiste en un bioelectrodo de acuerdo con la invención.
Este dispositivo puede ser una célula de biocombustible enzimático.
Este dispositivo también puede ser un detector de glucosa cuando la capa de recubrimiento no está presente.
La invención también propone el uso de un bioelectrodo de acuerdo con la invención o un dispositivo de acuerdo con la invención para la oxidación de glucosa.
La invención también propone un primer método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con la invención, caracterizado como las siguientes etapas:
a) preparar una suspensión con una concentración de entre 0,5 mg.mL-1 y 10 mg.mL-1, y preferentemente 2,5 mg.mL-1 de nanotubos de carbono en un disolvente orgánico, preferentemente seleccionado de 1-metil-2-pirrolidinona (NMP), diclorometano (DCM), acetonitrilo (ACN), 1,3-dioxolano (DXL), dimetilformamida (DMF)), y mezclas de dos o más de estas moléculas preferentemente NMP,
b) depositar una gota (colada de gota) de la suspensión de nanotubos de carbono obtenida en la etapa a) sobre un soporte de material conductor de electrones, preferentemente carbono vitreo,
c) evaporar el disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono, por lo cual se forma una capa de nanotubos de carbono sobre el soporte,
d) preparar una solución que consiste en moléculas aromáticas seleccionadas del grupo que consiste en 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10- fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido 1-pireno-butírico, y mezclas de dos o más moléculas aromáticas, con una concentración entre 0,5 mmol.L'1 a 15 mmol.L'1, y preferentemente 2,5 mmol.L'1, disuelto en un disolvente orgánico seleccionado de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF, y mezclas de dos o más moléculas, preferentemente ACN, idénticas o diferentes al disolvente orgánico de la suspensión de nanotubo de carbono,
e) depositar sobre una superficie de la capa de nanotubo carbono obtenida en la etapa c), la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa d), al depositar una gota (colada de gota) de la solución de moléculas aromáticas sobre la superficie de la capa de nanotubos de carbono o por incubación de al menos la superficie libre de la capa de nanotubos de carbono en la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa d), la colada de gota o la solución de incubación preferentemente con un volumen entre 5 y 200 jL, donde más preferentemente el volumen es de 175 jL,
f) evaporar el disolvente de la solución de moléculas aromáticas depositada en la etapa e), por lo cual se forma una capa de moléculas aromáticas sobre la capa de nanotubos de carbono,
g) preparar una solución acuosa de enzimas FAD-GDH preferentemente con una concentración de enzimas FAD-GDH entre 0,1 mg.mL-1 y 5 mg.mL-1, y preferentemente 0,75 mg.mL-1 de enzimas FAD-GDH,
h) depositar sobre la capa de moléculas aromáticas obtenida en la etapa f), la solución de enzima FAD-GDH obtenida en la etapa g), mediante incubación de al menos la superficie libre de la capa de moléculas aromáticas obtenida en la etapa f), en una solución acuosa que contiene las enzimas FAD-GDH obtenidas en la etapa g), o al depositar una gota (colada de gota) de dicha solución acuosa que contiene las enzimas FAD-GDH obtenidas en la etapa g) sobre la superficie libre de la capa de moléculas aromáticas. El volumen de solución de enzima usado para la incubación o la gota de solución de enzima está preferentemente entre 5 y 200 j L, más preferentemente 40 j L, En este primer método, preferentemente se repite al menos una vez la etapa a) relacionada con el depósito de una gota de la dispersión de nanotubos de carbono.
La invención también propone un segundo método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con la invención, caracterizado en que comprende las siguientes etapas:
A) preparar un volumen de 150 mL de una suspensión de nanotubos de carbono en un disolvente orgánico preferentemente seleccionado de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF, y mezclas de dos o más de estos, preferentemente DMF, donde la suspensión tiene una concentración de nanotubo de carbono de entre 1 mg.mL-1 y 15 mg.mL-1, y preferentemente 1 mg.mL'1,
B) preparar una solución de 5 mL que contiene 0,3 mmol de moléculas aromáticas seleccionadas del grupo que consiste en 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico y mezclas de dos o más de las moléculas, preferentemente 1,10-fenantrolina-5,6-diona, en un disolvente orgánico idéntico o diferente del disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono obtenida en la etapa a), preferentemente DMF,
C) añadir los 5 mL de la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa B) a los 150 mL de la suspensión de nanotubos obtenida en la etapa A), y mezclar la suspensión obtenida,
D) filtrar la dispersión obtenida en la etapa C) a través de un soporte filtrante,
E) evaporar el disolvente de la suspensión de nanotubos de carbono y el disolvente de la solución de moléculas aromáticas, por lo cual se forma una capa de nanotubos de carbono en al menos una de sus superficies con una capa de dichas moléculas aromáticas,
F) preparar una solución acuosa de enzimas FAD-GDH con una concentración de enzimas FAD-GDH de entre 0,1 y 5 mg.mL-1, preferentemente 0,75 mg.mL-1,
G) depósito por colada de gota de 150 j L de la solución de enzima FAD-GDH preparada en la etapa F) sobre la superficie libre de la capa de moléculas aromáticas lo que forma una capa de enzimas FAD-GDH adsorbidas sobre la capa de moléculas aromáticas,
H) retirar el conjunto obtenido en la etapa G) del soporte filtrante.
La invención también propone un método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con la invención, caracterizado en que comprende las siguientes etapas:
a1) preparar un volumen de 150 mL de una suspensión de nanotubos de carbono en un disolvente orgánico seleccionado de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF, y mezclas de dos o más moléculas preferentemente DMF, donde la suspensión tiene una concentración de nanotubos de carbono de entre 1 mg.mL-1 y 15 mg.mL-1, preferentemente 1 mg.mL-1,
b1) preparar una solución de moléculas aromáticas con una concentración de entre 0,1 mmol. L-1 y 10 mmol. L-1, preferentemente 10 mmol. L-1 y seleccionarse del grupo que consiste en 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6 -diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico y mezclas de dos o más moléculas, preferentemente 1,10-fenantrolina-5,6-diona, en un disolvente orgánico seleccionado de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF, y mezclas de dos o más moléculas idénticas o diferentes al disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono obtenida en la etapa a1), preferentemente DMF, c1) filtrar la dispersión obtenida en la etapa a1) a través de un soporte filtrante,
d1) evaporar el disolvente de la dispersión de nanotubos de carbono depositados en la etapa c1) por lo cual se forma una capa de nanotubos de carbono,
e1) retirar la capa de nanotubos de carbono obtenida en la etapa d1) del soporte filtrante,
f1) depositar mediante colada de gota de 150 pL de la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa b1) sobre al menos una superficie de la capa de nanotubos de carbono obtenida en la etapa e1), o mediante remojo de la capa de nanotubos de carbono obtenida en la etapa e1) en la solución preparada en b1).
g1) evaporar el disolvente de la solución de moléculas aromáticas depositada en la etapa f1), por lo cual se forma una capa de dichas moléculas aromáticas sobre la capa de nanotubos de carbono,
h1) preparar una solución acuosa de enzimas FAD-GDH con una concentración de enzimas FAD-GDH de entre 0,1 y 5 mg.mL'1,
i1) depósito mediante colada de gota de 150 pL de la solución o mediante remojo de la capa de nanotubos de carbono obtenida en la etapa g1) en la solución preparada en h1) de las enzimas FAD-GDH obtenidas en la etapa h1) sobre la capa de moléculas aromáticas, lo que forma una capa de enzimas FAD-GDH adsorbidas en la capa (3). Preferentemente, el segundo y tercer métodos de la invención comprenden además una etapa k1) de sujetar un alambre hecho de un material eléctricamente conductor, preferentemente un material seleccionado de cobre, cobre plata, platino, más preferentemente cobre plata, sobre la superficie de la capa de nanotubos de carbono no cubiertos por la capa de la molécula aromática, donde esta etapa se realiza antes o después de la etapa G) o i1) de depositar la capa de enzimas FAD-GDH.
Preferentemente, todos los métodos de producción para un bioelectrodo de acuerdo con la invención también comprenden una etapa de recubrimiento de la superposición: capa de nanotubos de carbono/capa de moléculas aromáticas/capa de enzimas FAD-GDH/alambre hecho de material eléctricamente conductor, preferentemente con un compuesto a base de silicona.
La invención se entenderá mejor y otras características y ventajas de la misma aparecerán con mayor claridad al leer la descripción explicativa que sigue y que se hace con referencia a las figuras en las que:
La Figura 1 muestra una primera modalidad del electrodo de la invención, descrito en el Ejemplo 1,
La Figura 2 muestra una segunda modalidad del electrodo de la invención, descrita en el Ejemplo 2,
La Figura 3 muestra una tercera modalidad del electrodo de la invención, descrita en el Ejemplo 3,
La Figura 4 muestra los voltamogramas obtenidos con los electrodos obtenidos en los Ejemplos 1, 4 a 8 y los Ejemplos comparativos 2 y 4 a 6,
La Figura 5 muestra los voltamogramas obtenidos con los electrodos obtenidos en el Ejemplo 13.
Como se muestra en la Figura 1, en una primera modalidad, el bioelectrodo de la invención que consiste en la superposición sobre un soporte conductor, indicado con 1 en la Figura 1, de una capa, indicada con 2 en la Figura 1, de nanotubos de carbono, sobre la cual se encuentra depositada una capa, indicado 3 en la Figura 1, de moléculas aromáticas, sobre las cuales se deposita una capa, indicada 4 en la Figura 1, de enzimas dinucleótido de flavina adenina glucosa deshidrogenasa (FAD-GDH).
En la invención, nanotubo de carbono significa un nanotubo de carbono del cual al menos una dimensión es menor de 1500 nm.
La capa 2 de nanotubos de carbono puede consistir en nanotubos de carbono de pared simple o de pared múltiple. Sin embargo, preferentemente, consiste en nanotubos de carbono de paredes múltiples.
De hecho, los nanotubos de carbono de paredes múltiples tienen un diámetro externo mayor y por lo tanto una superficie más desarrollada, lo que permite inmovilizar mejor las moléculas aromáticas y las enzimas.
Preferentemente, los nanotubos de carbono tienen una relación de longitud (L) a diámetro indicada por L/diámetro de entre 100 y 5000.
Preferentemente, los nanotubos de carbono tienen una longitud de 1,5 pm y un diámetro interno de 9,5 nm.
La capa 2 de nanotubos de carbono debe ser porosa.
El tamaño de poro en la capa 2 de los nanotubos de carbono debe ser superior a 8 nm, el tamaño de la enzima FAD-GDH es de 78 A (7,8 nm).
Preferentemente, el tamaño de poro de la capa 2 de nanotubos de carbono está entre 8 y 50 nm.
Más preferentemente, el tamaño de los poros de la capa de nanotubos de carbono es de 10 nm.
Las moléculas aromáticas que forman la capa 3 están unidas por interacción n-n sobre la capa 2 de nanotubos de carbono.
Aunque en la Figura 1 (como en las Figuras 2 y 3), la capa 2 de nanotubos de carbono y la capa 3 de moléculas aromáticas se representan como una verdadera superposición, el experto en la técnica comprenderá fácilmente que la capa 2 consta de nanotubos de carbono porosos que son compuestas por varias “subcapas” de nanotubos de carbono, las moléculas aromáticas también se unen a los nanotubos de carbono (subcapas).
Por tanto, las capas 2 y 3 no están individualizadas sino imbricadas una dentro de la otra.
Las moléculas aromáticas promueven la transferencia de electrones entre la enzima y los nanotubos de carbono. Además, desempeñan el papel de moléculas que orientan la estructura tridimensional de la enzima que luego se adsorberá en estas moléculas para promover la transferencia electrónica de la enzima a los nanotubos de carbono. Las moléculas aromáticas que forman la capa 3 se eligen de 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9.10- antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico, y mezclas de dos o más de estas moléculas.
Preferentemente, las moléculas aromáticas que forman la capa 3 son moléculas de fenantreno o 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
Y es particularmente sorprendente que tales moléculas aromáticas puedan mediar entre los nanotubos de carbono y la enzima FAD-GDH porque, en particular, la molécula de 1,10-fenantrolina se sabe que es un inhibidor de la enzima FAD-GDH, para la oxidación de la glucosa porque ocupa el lugar de la glucosa en esta reacción de oxidación.
La actividad inhibidora de 1,10-fenantrolina para la reacción de FAD-GDH es enfatizada por las empresas que comercializan esta enzima, ver por ejemplo, Sekisui Enzymes, “Glucose Dehydrogenase FAD Dependent, Catalog No. GLDE-70- 1192, EC number 1.1.99.10”.
Esta actividad inhibidora de la 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, fenantreno y las moléculas de 1.10- fenantrolina se confirmaron mediante ensayos voltamétricos cíclicos.
Los voltamogramas obtenidos durante estos ensayos se muestran en la Figura 5. Se obtuvieron con electrodos cuya capa de enzimas FAD-GDH se deposita directamente sobre la capa 2 de nanotubos de carbono en presencia de 100 mmol L'1 de solución de glucosa.
Las moléculas aromáticas 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, fenantreno y 1,10-fenantrolina se añaden entonces gradualmente en solución.
La presencia de 200 jmol L_1 de 9,10-fenantrenoquinona o fenantreno no provoca una disminución drástica de las corrientes catalíticas medidas para tiempos de muestreo inferiores a tres horas.
Por otro lado, la presencia de moléculas aromáticas a base de piridinas tales como 1,10-fenantrolina-5,6-diona y 1.10- fenantrolina genera una disminución progresiva del rendimiento de la bioelectrocatálisis a lo largo del tiempo. La capa de enzimas FAD-GDH, indicada con 4 en las Figuras 1 a 3, es una capa de funcionalización de las moléculas aromáticas de la capa indicada con 3 en las Figuras 1 a 3.
La enzima o enzimas que forman la capa 4 se adsorben sobre las moléculas aromáticas que forman la capa 3.
Aquí nuevamente, aunque en la Figura 1 (como en las Figuras 2 y 3), la capa 4 de las enzimas FAD-GDH se representa como una capa distinta en contacto solo con la capa 3 de moléculas aromáticas, el experto en la técnica comprenderá fácilmente que las enzimas FAD-GDH que constituyen la capa 4 también se adsorben en las moléculas orgánicas que están unidas (por enlace n-n) a los nanotubos de carbono presentes en las subcapas de la capa 2 de nanotubos de carbono.
En otras palabras, la superposición de las capas 2, 3 y 4 en realidad está formada por conjuntos de nanotubos de carbono-moléculas aromáticas-enzimas FAD-GDH individuales.
En esta primera modalidad, preferentemente, la cantidad de nanotubos de carbono depositados sobre la superficie del soporte 1 está entre 2,5 |jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie del sustrato 1 y 510 |jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie del soporte 1, para una aplicación del electrodo en un sensor de glucosa y está
entre 5 |jg y 100 |jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie de soporte 1 cuando el electrodo está destinado a ser usado como electrodo de una celda de biocombustible para la oxidación de glucosa.
De hecho, en tal aplicación, si la cantidad de nanotubos de carbono por cm2 de superficie de soporte es menor de 5 jg, no hay suficientes nanotubos de carbono para producir una corriente catalítica que permita que la batería biotecnológica proporcione suficiente energía eléctrica y cuando la cantidad de nanotubos de carbono es más de 100 jg por cm2 de superficie de soporte 1, la capa 2 de nanotubos de carbono está formada por varias subcapas de nanotubos de carbono apiladas una sobre otra y las capas internas (las que no están en la superficie) de los nanotubos de carbono no ven una menor concentración de glucosa ya que se oxida principalmente en las capas superiores.
En esta primera modalidad de la invención, el electrodo es un electrodo soportado sobre un soporte indicado con 1 en la Figura 1.
Pero, en una segunda modalidad mostrada en la Figura 2, el bioelectrodo de la invención es autoportante.
Se realiza luego la superposición de las capas 2, 3 y 4 descrita en la primera modalidad sobre una superficie de este soporte 1.
El soporte 1 está hecho de un material eléctricamente conductor, preferentemente carbono vitreo.
En la segunda modalidad del bioelectrodo de la invención, consiste además de un alambre conductor de un material eléctricamente conductor para transferir la corriente del electrodo al dispositivo de detección u oxidación de glucosa. En todas las modalidades del bioelectrodo de la invención, y como se muestra en la Figura 3, al menos la superficie libre de la capa de enzimas FAD-GDH 4 está protegida por una capa indicada con 6, en la Figura 3 de material poroso y/o hidrófilo.
Esta capa 6 tiene la función de proteger las enzimas FAD-GDH al evitar el desplazamiento de las enzimas FAD-GDH en el entorno en el que se pretende usar el bioelectrodo de la invención.
Esta capa 6 debe estar hecha de un material poroso para permitir el acceso del fluido que contiene glucosa a las enzimas FAD-GDH y al desplazamiento de los productos de la reacción de oxidación (gluconolactona y protones), sin dejar pasar las enzimas FAD-GDH.
Por lo tanto, el diámetro de los poros del material que constituye la capa 6 debe ser inferior a 78 A. Preferentemente es menos de 75 A. Esto hace posible encapsular la enzima en el electrodo mientras se asegura la difusión del sustrato y el producto hacia y desde el electrodo respectivamente.
El material que constituye la capa 6 también es preferentemente hidrófilo para mejorar el desplazamiento en el bioelectrodo del medio acuoso en el que se colocará.
Preferentemente, la capa 6 es alginato, o quitosano, o Nafion® o gel de sílice.
La capa 6 cubre preferentemente todo el bioelectrodo.
Sin embargo, cuando se proporciona una capa de recubrimiento 5 de un material impermeable a los fluidos, solo la superficie de la capa 4 debe cubrirse imperativamente con la capa 6.
De hecho, cuando el bioelectrodo de la invención está destinado a colocarse en una biocélula para la oxidación de glucosa, preferentemente se recubre, como se muestra en la Figura 3, con una capa de un material impermeable a los fluidos, lo que forma una capa de recubrimiento, indicada con el número 5 en la Figura 3.
Esta capa de recubrimiento 5 no debe cubrir la capa 6.
La capa 5 está hecha de un material impermeable a los fluidos, preferentemente un material de silicona.
Esta capa 5 permite asegurar la estabilidad de la superposición de capas que constituyen el bioelectrodo de la invención y evitar el desplazamiento de nanotubos de carbono, moléculas aromáticas y enzimas FAD-GDH en las que se va a colocar el bioelectrodo de la invención.
Esta capa 5 es particularmente importante cuando la capa 6 no cubre el conjunto de superposición de las capas 2, 3 y 4, y posiblemente el soporte 1.
La invención también propone un dispositivo que consiste en un bioelectrodo de acuerdo con la invención.
Este dispositivo puede ser una celda de biocombustible en la que la energía se produce por oxidación de la glucosa. De hecho, el bioelectrodo de la invención es muy pequeño y muy ligero y puede colocarse en un dispositivo portátil miniaturizado o implantarse directamente en el cuerpo de un ser humano o un animal.
Este dispositivo también puede ser un dispositivo para detectar y cuantificar glucosa en un fluido corporal humano tales como sangre, orina, lágrimas o sudor. En este caso, el bioelectrodo no está incrustado en la capa 5 sino completamente cubierto con la capa 6.
El bioelectrodo de la invención se puede producir mediante métodos muy simples que no implementan ninguna reacción química o etapa de síntesis de creación de polímeros redox activos o ensamblajes supramoleculares complicados.
Además, con los métodos de la invención, los grosores de los bioelectrodos y las cantidades de moléculas aromáticas meadiátricas y enzimas pueden modificarse de acuerdo con la sensibilidad y eficiencia requeridas para la aplicación pretendida de estos bioelectrodos.
Un primer método de producción del bioelectrodo de acuerdo con la invención es un método de producción de un bioelectrodo soportado sobre un soporte rígido 1.
El soporte 1 está hecho de un material eléctricamente conductor, preferentemente carbono vítreo.
Este método comprende, como todos los demás métodos de acuerdo con la invención: una etapa de preparación de una suspensión de nanotubos de carbono en un disolvente orgánico.
Como un disolvente orgánico usable para esta suspensión incluye NMP, DCM, ACN, DMF DXL, y mezclas de dos o más de los mismos.
El disolvente orgánico preferido es NMP porque este disolvente tiene una mejor afinidad (humectabilidad) con el soporte 1, cuando este último es carbono vítreo.
La suspensión debe tener una concentración de nanotubos de carbono para depositar, en forma de una gota (método denominado “colada de gota”) una cantidad de nanotubos de carbono de entre 2,5 |jg y 510 |jg por cm2 de área de soporte 1, cuando el bioelectrodo de la invención se va a usar en un sensor de glucosa.
Generalmente se usa una concentración entre 0,5 mg.mL-1 y 10 mg.mL-1. Si la concentración de nanotubos de carbono en la dispersión es demasiado alta, las capas de nanotubos de carbono obtenidas son menos estables y menos reproducibles debido a una dispersión menos buena en la solución.
Preferentemente se usa una concentración de 2,5 mg.mL-1.
La cantidad de nanotubos depositados sobre el soporte 1 está preferentemente entre 5 |jg y 100 |jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie de soporte cuando el bioelectrodo está destinado a ser usado para producir una celda de biocombustible.
De hecho, en este caso, la cantidad de nanotubos de carbono es inferior a 5 jg por cm2 de superficie de soporte y no hay suficientes nanotubos de carbono para proporcionar una corriente catalítica que permita que la batería proporcione más energía.
Poner más de 100 jg por cm2 de superficie del soporte, entonces el grosor de esta capa es importante y los nanotubos de carbono que están debajo de los otros nanotubos de carbono no “sirven” para la oxidación de la glucosa porque la glucosa presente en el fluido es oxidado por los nanotubos en la superficie del soporte; la glucosa ya no se difunde por la capa formada por los nanotubos.
Entonces, como para todos los métodos de la invención, este primer método de la invención consiste en la fase de preparación de la solución de la(s) molécula(s) aromática(s) deseadas al disolver esta(s) molécula(s) aromática(s) en un disolvente orgánico. El disolvente puede ser el mismo o diferente del disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono.
Por tanto, un disolvente orgánico usable para disolver moléculas orgánicas incluye NMP, DCM, ACN, DXL, DMF y mezclas de dos o más moléculas.
Sin embargo, preferentemente, el disolvente orgánico para disolver la molécula o moléculas aromáticas es idéntico al disolvente orgánico usado para suspender los nanotubos de carbono.
Como tal, también es preferentemente NMP en el primer método de la invención.
La concentración de moléculas orgánicas en la solución está preferentemente entre 0,5 mmol L-1 y 15 mmol L-1. Es preferentemente 2,5 mmol L-1.
El primer método de la invención, como todos los métodos de la invención, consiste también en una fase de preparación de solución de una solución acuosa de enzimas FAD-GDH.
Solución acuosa significa una solución tampón de pH entre 4,0 y 9,0. Las soluciones tampón que pueden usarse y sus proporciones de agua se basan en ácido cítrico, ácido acético, fosfato, cualquier otra especie que pueda actuar como tampón o mezclas de dos o más de estos elementos para mantener el pH entre 4,0 y 9,0.
La concentración de enzima FAD-GDH en esta solución acuosa está preferentemente entre 0,1 mg.mL-1 y 5 mg.mL' 1. Es más preferentemente 0,75 mg.mL-1.
Una vez preparada la suspensión de nanotubos de carbono, en el primer método de producción del bioelectrodo de la invención, se deposita una gota de un volumen máximo de 20 pL de la dispersión de nanotubos de carbono sobre una superficie del soporte 1.
De hecho, si el volumen de la gota depositada es mayor, el grosor de la capa de nanotubos de carbono aumenta y podría ser perjudicial para la difusión de glucosa en la capa porosa.
Es posible repetir esta etapa más de una vez para aumentar la cantidad de nanotubos de carbono depositados y así aumentar el área de superficie activa específica del bioelectrodo.
Una vez obtenida la formación de una capa 2 de nanotubos de carbono del grosor deseado, la solución de moléculas aromáticas se pone en contacto con esta capa de nanotubos de carbono, generalmente a temperatura ambiente (entre 15 y 30 °C.).
Este contacto se puede realizar mediante la incubación del conjunto de soporte 1 cubierto con la capa 2 de nanotubos de carbono en la solución de moléculas aromáticas o solo la superficie libre de la capa 2 de nanotubos de carbono mediante la deposición de una gota de la solución de moléculas aromáticas directamente sobre la capa de nanotubos de carbono.
La solución de moléculas aromáticas se deja en contacto con la capa 2 de nanotubos de carbono durante un período de tiempo entre 5 minutos y 1 hora para permitir la funcionalización de los nanotubos de carbono.
La adsorción de más moléculas aromáticas no se puede realizar en un período de más de una hora.
Luego se enjuaga con agua destilada el conjunto de soporte 1/capa 2 de nanotubos de carbono/capa 3 de moléculas aromáticas en solución para eliminar las moléculas aromáticas que se adsorberían solo ligeramente en los nanotubos de carbono de la capa 2.
De hecho, las moléculas aromáticas se adsorben en los nanotubos de carbono mediante una interacción n-n y, por tanto, forman una capa 3 de moléculas aromáticas.
Entonces, el conjunto de soporte 1/capa de nanotubos de carbono 2/capa 3 de moléculas aromáticas se pone en contacto con la solución acuosa que contiene enzimas FAD-GDH durante un período de tiempo suficiente para la orientación preferida de la enzima FAD-GDH frente a moléculas orgánicas.
Generalmente, se usa un tiempo que varía de 4 horas a 1 día a 4 °C.
La solución de enzima acuosa FAD-GDH es una solución tamponada a un pH de entre 4,0 y 9,0 y preferentemente un pH de 7,0 para evitar dañar la enzima FAD-GDH.
Finalmente, el bioelectrodo obtenido entonces se enjuaga a fondo con la solución tamponada (aún para no dañar la enzima FAD-GDH) para eliminar las enzimas adsorbidas de forma suelta lo que forma una capa 4 de enzima FAD-GDH.
Si el bioelectrodo obtenido entonces no se usa inmediatamente, se almacena en una solución tampón o en aire hasta su uso o reuso.
Un segundo método para producir un bioelectrodo de acuerdo con la invención es un método en el que el bioelectrodo es autosoportante, es decir, no comprende un soporte 1.
En este segundo método, una vez preparada la suspensión de nanotubos de carbono y las soluciones FAD-GDH de moléculas y enzimas, se añade la solución de moléculas aromáticas a la suspensión de nanotubos de carbono y la solución obtenida se trata generalmente con ultrasonidos durante 30 minutos.
En el segundo método de la invención, la suspensión de nanotubos de carbono tiene una concentración entre 1 mg.mL-1 y 15 mg.mL-1, y preferentemente 1 mg.mL-1.
Esta dispersión mixta de nanotubos de carbono-moléculas aromáticas se filtra entonces al vacío en un filtro hecho de un material polimérico químicamente inerte.
Tal material polimérico químicamente inerte es preferentemente politetrafluoroetileno (PTFE).
Por tanto, lo que se llama “pasta de papel” se formó a partir de la técnica.
Esta “pasta de papel” se retira del filtro y se deja secar plano, generalmente durante la noche a temperatura ambiente. Luego se corta al tamaño deseado.
Luego, esta “pasta de papel” se incuba o se cubre con una gota de solución acuosa tamponada de enzimas FAD-GDH durante entre 4 horas y 1 día, preferentemente durante la noche, a 4 °C.
Después de este período de incubación o mantenimiento en contacto, la “pasta de papel” se enjuaga con una solución tampón para eliminar las enzimas adsorbidas sueltas en la superficie de las moléculas aromáticas. Las soluciones tampón que se pueden usar, así como también sus proporciones en agua, se basan en ácido cítrico, ácido acético, fosfato, cualquier otra especie que pueda actuar como tampón o mezclas de dos o más de estos elementos para mantener el pH entre 4,0 y 9,0.
Para asegurar la conexión eléctrica del electrodo, se une un alambre a la parte posterior del electrodo, por Ejemplo, con una pasta de carbón seguido de la aplicación de un material de silicona.
Esta etapa de unir el alambre se puede realizar antes o después de la formación de la capa 4 de las enzimas FAD-GDH.
El tercer método de la invención también consiste en preparar una “pasta de papel”, pero esta vez que consiste solo en nanotubos de carbono.
Por tanto, la diferencia entre el segundo método y el tercer método de la invención es que la suspensión de nanotubos de carbono no se mezcla con la solución de moléculas aromáticas antes de depositarse sobre un soporte filtrante sino que se deposita sola sobre el soporte filtrante.
Luego se filtra el disolvente de la suspensión de nanotubos de carbono y se retira la capa de nanotubos de carbono del soporte filtrante: se formó una “pasta de papel” que consta únicamente de nanotubos de carbono.
Luego, la solución de moléculas aromáticas se deposita mediante “colada de gota” sobre esta capa de nanotubos de carbono, como en el primer método de la invención.
Luego se sigue el primer método de la invención.
Con el fin de mejorar la comprensión de la invención, se describirán ahora varios Ejemplos de su implementación, únicamente con fines ilustrativos y no limitativos.
Ejemplo 1: Producción de un bioelectrodo de acuerdo con la invención soportado sobre un soporte de carbono vítreo.
Este Ejemplo se describirá con referencia a la Figura 2 adjunta.
Se obtiene una suspensión de nanotubos de carbono de paredes múltiples (9,5 nm de diámetro, pureza superior al 95 %) a partir de nanotubos de carbono no funcionalizados mediante tratamiento ultrasónico en NMP durante 30 minutos.
La concentración de nanotubos de carbono de esta suspensión es de 2,5 mg.mL-1.
La dispersión es estable y se agita vigorosamente para mejorar la reproducibilidad del depósito de la capa de nanotubos de carbono sobre el soporte 1.
Se deposita una gota de un volumen de 20 pL de esta suspensión sobre la superficie del soporte 1 en carbono vítreo.
A continuación, el NMP se evapora bajo vacío de soporte (vacíomáx = 10-3 mbar).
El soporte 1 en carbono vitreo recubierto en una de sus superficies se obtiene con una capa 2 de nanotubos de carbono secos.
Este conjunto se incuba entonces en una solución de 1,10-fenantrolina-5,6-diona a una concentración de 2,5 mmol.L-1 en ACN durante una hora a temperatura ambiente.
El conjunto obtenido entonces se enjuaga a fondo con agua destilada para eliminar las moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona no unidas completamente a los nanotubos de carbono de la capa 2.
En esta etapa, se obtiene entonces un conjunto de soporte 1/capa 2 de nanotubos de carbono/capa 3 de moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
Luego, se deposita una gota de 40 pL de solución de enzima FAD-GDH tamponada a pH 7,0 y con una concentración de 0,75 mg.mL-1 de enzimas sobre la superficie del conjunto obtenido de las tres capas 1, 2 y 3. Este conjunto se deja luego durante la noche a 4 °C para la adsorción de las enzimas.
Finalmente, el conjunto obtenido se enjuaga a fondo con una solución tampón Mcllvaine (0,2 mol L-1 de Na2 HPO4 , 0,1 mol L-1 de ácido cítrico) tamponada a pH 7,0 para eliminar las enzimas adsorbidas de forma suelta en la superficie del moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
Ejemplo 2: Producción de un bioelectrodo de acuerdo con la invención autosoportante (electrodo de “pasta de papel”).
Se prepara una suspensión de nanotubos de carbono de paredes múltiples en DMF al añadir 150 mg de nanotubos de carbono de paredes múltiples no funcionalizados (9,5 nm de diámetro, pureza superior al 95 %) en 150 mL de DMF.
La suspensión obtenida tiene una concentración de nanotubos de carbono de 1 mg.mL-1.
La dispersión luego se sonica durante 30 minutos.
Luego se prepara una solución de moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona al disolver 65 mg de sólido en un volumen de 5 mL de DMF y se agrega lentamente a la suspensión de nanotubos de carbono de paredes múltiples hasta una concentración final de molécula de 1,10-fenantrolina-5,6-diona de 2 mmol L-1.
La suspensión resultante luego se sonica durante otros 30 minutos.
Después de una vigorosa agitación manual durante un minuto, se filtran 66 mL de la suspensión obtenida a través de un filtro miliporo de PTFE (JHWP de tamaño de poro 0,45 pm, diámetro 46 mm) mediante el uso de una bomba de vacío (VacíoMáx. = 10-3 mbar). El conjunto se lava con agua destilada y se deja reposar durante una hora.
Luego, el conjunto de la capa 2 de nanotubos de carbono/capa 3 de moléculas aromáticas se retira del soporte filtrante y se corta en un precursor de electrodo de 10 mm de diámetro (superficie geométrica específica de 0,785 cm2).
Se obtiene un contacto eléctrico mediante un alambre sujetado por una pasta de carbono (Acheson, ELECTRODAG 423 SS) sobre la superficie libre de la capa 2 de nanotubos de carbono del conjunto obtenido.
Luego se depositan 150 pl de una solución de enzima FAD-GDH sobre la superficie del conjunto de la capa 2 de nanotubos de carbono/capa 3 de moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
La solución de enzimas FAD-GDH es una solución de 5 mg.mL'1 de enzimas FAD-GDH preparada en un tampón Mcllvaine de pH 7,0 (0,2 mol.L-1 de Na2 HPO4 , 0,1 mol L-1 de ácido cítrico).
El conjunto se coloca en el refrigerador (4 °C) durante la noche y luego se enjuaga con la solución tampón.
Luego, el otro lado del bioelectrodo y sus lados se sellan con una pasta de silicona (fabricantes: Rubson, GEB) para formar una capa de recubrimiento 5.
Ejemplo 3
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 2, pero el conjunto también se encapsuló en una capa de recubrimiento 6.
Esta capa puede ser alginato, quitosano, Nafion®, o gel de sílice, por Ejemplo.
Se obtuvo el electrodo que se muestra en la Figura 3.
Ejemplo 4
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1 pero se reemplaza la molécula aromática 1,10-fenantrolina-5,6-diona por una molécula de pireno.
Ejemplo 5
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1, pero las moléculas aromáticas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por moléculas de 9,10-fenantrolina.
Ejemplo 6
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1 pero las moléculas aromáticas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por la molécula de 5-metil-1,10-fenantrolina.
Ejemplo 7
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1, pero las moléculas aromáticas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por la molécula de 1,4-naftoquinona.
Ejemplo 8
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1, pero las moléculas aromáticas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por la molécula de 9,10-fenantrenoquinona.
Ejemplo 9
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 2, pero las moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por moléculas de 9,10-fenantrolina.
Ejemplo 10
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 2, pero las moléculas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por moléculas de 5-metil-1,10-fenantrolina.
Ejemplo Comparativo 1
Se obtuvo un bioelectrodo de control compuesto únicamente por la película de nanotubos de carbono al preparar una suspensión de nanotubos de carbono de paredes múltiples a una concentración de 1 mg.mL-1 mediante la adición de 150 mg de nanotubos de carbono no funcionalizados (9,5 nm de diámetro, pureza de más del 95 %) en 150 mL de DMF.
A continuación, esta suspensión se agita manualmente durante un minuto.
Se filtran 66 mL de la suspensión a través de un filtro miliporo de PTFE (JHWP, tamaño de poro 0,45 pm, diámetro 46 mm) mediante el uso de una bomba de vacío (Vacíomáx. = 10-3 mbar).
La capa de nanotubos de carbono se lavó con agua destilada y se dejó reposar durante una hora.
Después de la filtración, se dejó secar la “pasta de papel” resultante a temperatura ambiente.
Luego, la “pasta de papel” obtenida se retira con cuidado del filtro y se corta en un electrodo de 10 mm de diámetro (superficie geométrica 0,785 cm2).
Ejemplo Comparativo 2
Se preparó una dispersión de nanotubos de carbono de paredes múltiples como en el Ejemplo Comparativo 1 excepto que la dispersión obtenida tenía una concentración de 2,5 mg.mL-1.
Por tanto, la cantidad de nanotubos de carbono colocados en los 2 mL de NMP no fue de 150 mg sino de 5 mg. Se depositó luego una gota de un volumen de 20 pl de esta suspensión sobre un soporte de carbono vitreo que tenía una superficie de 0,196 cm2.
El grosor de la capa de nanotubos de carbono obtenida fue de 12 ± 4 |jm.
Ejemplo Comparativo 3
Se preparó un bioelectrodo al seguir el procedimiento del Ejemplo 2 pero se detiene antes de la etapa de depositar una gota de la solución de 5 mg.mL-1 de enzimas FAD-GDH.
Por tanto, el electrodo obtenido consistió únicamente en nanotubos de carbono en los que se absorbieron las moléculas aromáticas 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
Ejemplo Comparativo 4
Se preparó un bioelectrodo como en el Ejemplo 1 excepto que no se implementó la etapa de adsorción de la molécula aromática.
Se obtuvo un bioelectrodo que consiste en un soporte 1 de carbono vítreo recubierto en una de sus caras con una capa 2 de nanotubos de carbono sobre la que se adsorben directamente las enzimas FAD-GDH.
Ejemplo Comparativo 5
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1 pero la molécula aromática usada fue dinucleótido de flavina adenina (FAD: cofactor de la enzima FAD-GDH).
Ejemplo Comparativo 6
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 1, pero la molécula aromática usada fue el éster de N-hidroxisuccinimida de ácido pireno butírico.
Ejemplo Comparativo 7
Se siguió el mismo método que en el Ejemplo 2, pero las moléculas aromáticas de 1,10-fenantrolina-5,6-diona se reemplazaron por moléculas de 1,4-naftoquinona.
Ejemplo 11: Caracterización de capas de nanotubos de carbono.
La caracterización de las capas de nanotubos de carbono obtenidas en el Ejemplo Comparativo 1 se llevó a cabo con un microscopio de barrido láser confocal.
El grosor de la película de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 1 fue 275 ± 45 jm.
La capa de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 1 se caracterizó con un microscopio electrónico de barrido con un aumento de 40000.
La caracterización de la capa de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 2 se realizó con un microscopio de barrido láser confocal.
El grosor de la película de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 2 fue de 12 ± 4 jm.
La capa de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 2 se caracterizó con un microscopio electrónico de barrido con un aumento de 40000.
Se encontró que la capa de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 1 era más densa que la capa de nanotubos de carbono obtenida en el Ejemplo Comparativo 2, lo que significa que la filtración permite obtener capas de nanotubos de carbono más compactas.
El electrodo obtenido en el Ejemplo Comparativo 7, es decir una “pasta de papel” que consiste en nanotubos de carbono sobre los que se adsorben las moléculas aromáticas mediadoras de 1,10-fenantrolina-5,6-diona antes de la filtración de la mezcla de nanotubos/moléculas aromáticas, también se estudió bajo un microscopio de barrido electrónico con un aumento de 40000.
Este estudio mostró que la molécula aromática 1,10-fenantrolina-5,6-diona aumenta aún más la aglutinación de los tubos entre sí, como se esperaba, 1,10-fenantrolina-5,6-diona actúa como un aglutinante entre los nanotubos de carbono mediante el intercambio de electrones n.
Esto da como resultado una “pasta de papel” más sólida y más flexible que la “pasta de papel” no funcional dada en el Ejemplo Comparativo 1, que son en sí mismas mucho más frágiles.
Ejemplo 12: Caracterización electroquímica de los electrodos obtenidos en los Ejemplos 1 a 8 y Ejemplos Comparativos 2, 3, 4 y 5.
La Figura 4 muestra los voltamogramas cíclicos obtenidos con cada uno de los electrodos obtenidos en los Ejemplos 1, 4 a 8 y Ejemplos Comparativos 2, 4 a 6, así como la enzima FAD-GDH sola.
En la Figura 4, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
- uCNT = nanotubos de carbono solos,
- FADGDH = CNT funcionalizados por FAD-GDH,
glucosa 25 mM = CNT funcionalizados por FAD-GDH en presencia de una solución de glucosa a 25 mmol L-1, - glucosa 25 mM (región FAD) = igual que el anterior, incluida la región electroactiva del cofactor FAD-GDH (FAD) en la ventana de medición en presencia de una solución de glucosa a 25 mmol L-1,
- FAD = dinucleótido de flavina adenina,
- glucosa 25 mM = concentración de la solución de glucosa de 25 mmol L-1,
- PYR-NHS = éster de W-hidroxisuccinimida del ácido pireno-butírico,
- PYR = pireno,
1,4-NQ = 1,4-naftoquinona,
PQ = 9,10-fenantrenoquinona,
PL = 1,10-fenantrolina,
MPL = 5-metil-1,10-fenantrolina,
PLQ = 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
El cartucho indicado con A en la Figura 4 muestra los voltamogramas cíclicos obtenidos para los electrodos obtenidos en los Ejemplos Comparativos 2 y 4.
El electrodo ensayado fue un electrodo de carbono vítreo (soporte 1) recubierto con la capa 2 de nanotubos de carbono solo (Ejemplo Comparativo 2) o en el que la enzima FAD-GDH sola se depositó sobre la capa 2 de nanotubos de carbono (Ejemplo Comparativo 4).
Se puede ver en el voltamograma mostrado en el cartucho A que no hay señal redox visible (entre -0,300 y 0,100 V frente a SCE, SCE: electrodo de referencia con calomelanos saturados [electrodo de calomelanos saturados]) en un electrodo de carbono vítreo cubierto con una capa 2 de nanotubos de carbono (curva discontinua 0).
También se puede ver en el voltamograma mostrado en el cartucho A que no hay variación en la corriente catalítica en ausencia o en presencia de glucosa para un electrodo de carbono vítreo cubierto con una capa 2 de nanotubos de carbono directamente modificados por la capa de enzimas FAD-GDH 4 (la curva de línea de puntos 1 se ha obtenido en ausencia de glucosa y la curva de línea continua indicada con 2 es la curva obtenida en presencia de glucosa, 1 y 2 están perfectamente superpuestas).
La curva discontinua indicada con 3 representa el voltamograma cíclico obtenido con una ventana electroquímica mayor (de -0,600 a 0,100 V frente a SCE), en presencia de una solución de glucosa a 25 mmol L-1.
La curva 3 muestra la presencia de un pico redox centrado en -0,481 V frente a SCE.
Este pico se atribuye a la respuesta electroquímica del centro activo de la enzima FAD-GDH, FAD, para enzimas parcial o totalmente desnaturalizadas, lo que demuestra que, gracias a su estructura, el cofactor de la enzima también puede adsorberse en la superficie de nanotubos de carbono. Por otro lado, este FAD solo no puede en ningún caso ser el asiento de una reacción electrocatalítica ya que la estructura intacta de la enzima es un elemento clave de la catálisis enzimática.
Esto se confirma con el voltamograma que se muestra en el cartucho B de la Figura 4.
Este voltamograma se obtuvo para el electrodo obtenido en el Ejemplo Comparativo 5 y compuesto por las capas 2, 3 y 4, respectivamente, de nanotubos de carbono, moléculas aromáticas y enzimas FAD (sin o en presencia de glucosa a 25 mmol L-1, curvas idénticas 1 y 2), con la ventana electroquímica de -0,600 a 0,100 V frente a SCE idéntica a la usada por la curva 3 del cartucho A.
Encontrar un potencial redox idéntico para los voltamogramas de los cartuchos A y B proporciona información sobre la integridad de las enzimas en el electrodo.
Está ampliamente informado en la literatura que la enzima FAD, para una enzima funcional, tiene un potencial más alto que el FAD libre en solución.
Por esta razón, es razonable concluir que el pico presente en el cartucho A es de hecho solo FAD libre resultante de FAD-GDH cuya estructura habría sido alterada y por tanto enzimas inactivas.
El FAD solo no puede ser suficiente para oxidar la glucosa. Como tal, es imperativo que el FAD esté dentro de la estructura de la proteína.
En la Figura 4, el cartucho C representa los voltamogramos cíclicos del electrodo del Ejemplo Comparativo 6 que consiste en un electrodo de carbono vítreo, de la capa 2 de nanotubos de carbono funcionalizados por la capa 3 de una molécula aromática que es éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 1-pirenobutírico (PANHS).
Esta molécula aromática no es una de las moléculas que se pueden usar en la invención, aunque la función éster de N-hidrosuccinimida se usa habitualmente para realizar acoplamientos de tipo péptido entre un ácido carboxílico y una función amina. Por lo tanto, debería ser la función N-hidroxisuccinimida la que reaccione con las funciones -NH2 localizadas en la periferia de la enzima FAD-GDH y así inmovilizar covalentemente esta enzima sobre el electrodo con una orientación totalmente aleatoria. Como se muestra en el voltamograma del cartucho C, la restricción de movimiento durante la formación del enlace covalente que podría haber permitido el reconocimiento de “clavebloqueo” ya no es factible.
Los cartuchos D, G y H representan los voltamogramas cíclicos de los electrodos obtenidos en los Ejemplos 4, 5 y 6 respectivamente.
Todas las moléculas aromáticas usadas en estos Ejemplos son moléculas aromáticas no electroactivas.
De hecho, no se observa ninguna señal redox para tales electrodos en ausencia de glucosa (encontramos la misma señal que para los nanotubos de carbono no funcionalizados) mientras que se detecta una señal electrocatalítica durante la adición de glucosa (solución a 8 mmol L_1). Por lo tanto, este fenómeno puede parecerse completamente a la transferencia directa de electrones (DET) gracias a la interacción clave-bloqueo entre la molécula aromática y el centro hidrófobo de la enzima, lo que corrobora el hecho de que la 1,10-fenantrolina es un inhibidor de FAD-GDH. Cuando la molécula aromática se inmoviliza en los tubos por interacciones n-n, tenderá a atraer el centro activo de la enzima, sin provocar su inhibición.
Los cartuchos E, F e I muestran los voltamogramas cíclicos obtenidos con los electrodos obtenidos en los Ejemplos 7, 8 y 1 respectivamente.
Puede verse en estos voltamogramas cíclicos que todas las quinonas muestran un comportamiento mediador redox para la transferencia de electrones mediada (m Et ) de la enzima FAD-GDH.
Las corrientes electrocatalíticas son significativamente más altas que las obtenidas por transferencia directa de electrones (DET).
La forma de los voltamogramas cíclicos, especialmente para el electrodo que tiene la molécula aromática 1,10-fenantrolina-5,6-diona del Ejemplo 1, indica que una parte de la corriente electrocatalítica también podría provenir de una transferencia electrónica directa a una concentración baja de glucosa (<4 mmol L’1).
Por lo tanto, la 1,10-fenantrolina-5,6-diona parece ser la mejor molécula aromática redox para la oxidación electrocatalítica de la enzima FAD-GDH mediante el uso de inmovilización no covalente en una capa de nanotubos de carbono.
De hecho, las corrientes electrocatalíticas medidas para los electrodos con moléculas aromáticas tales como moléculas aromáticas de 1,4-naftaquinona (Ejemplo 7) y 9,10-fenantroquinona (Ejemplo 8) no superan los 200 pA respectivamente, y 300 pA para potenciales superiores a 0 V frente a SCE, este valor de 300 pA es sin embargo bastante aprovechable, después de la saturación (39 mmol L-1 de glucosa).
Por tanto, la 1,10-fenantrolina-5,6-diona tiene mejores rendimientos con una saturación cercana a 130 mmol L-1 de glucosa y corrientes cercanas a 600-700 pA.
Ejemplo 13: Caracterización electroquímica de los electrodos obtenidos en el Ejemplo Comparativo 4.
La Figura 5 muestra los voltamogramas cíclicos obtenidos con cada uno de los electrodos obtenidos de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 4.
En la Figura 5, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
0 pM PX = CNT funcionalizados por FAD-GDH en presencia de una solución de glucosa a 100 mmol L-1 y en ausencia de moléculas aromáticas (X representa la molécula aromática PLQ (cartucho A) o PQ (cartucho B)) 400 pM PX = CNT funcionalizados por FAD-GDH en presencia de una solución de glucosa a 100 mmol L-1 y 400 pmol L-1 de una molécula aromática PLQ (cartucho A) o PQ (cartucho B)
400 pM PX (180 min) = CNT funcionalizados por FAD-GDH en presencia de una solución de glucosa a 100 mmol L-1 y 200 pmol L-1 de una molécula aromática PLQ (cartucho A) o PQ (cartucho B) después de la incubación en la solución con una duración de 180 minutos.
200 pM PQ = CNT funcionalizados por FAD-GDH en presencia de una solución de glucosa a 100 mmol L-1 y 200 pmol L-1 de una molécula aromática PQ (cartucho C y D)
200 pM PQ 200 pM PY (180 min) = CNT funcionalizados por FAD-GDH en presencia de una solución de glucosa a 100 mmol L-1, 200 pmol L'1 de una molécula aromática PQ y 200 pmol L'1 de un molécula aromática PY después de la incubación en la solución durante 180 minutos. (Y representa la molécula aromática PL (cartucho C) o PH (cartucho D)).
PLQ = 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
PQ = 9,10-fenantrenoquinona,
PL = 1,10-fenantrolina,
- PH = fenantreno,
El cartucho indicado con A en la Figura 5 muestra los voltamogramas cíclicos obtenidos para los electrodos obtenidos en el Ejemplo Comparativo 4.
El electrodo ensayado fue un electrodo de carbono vitreo (soporte 1) en el que se depositó la enzima FAD-GDH sola sobre la capa 2 de nanotubos de carbono (Ejemplo Comparativo 4).
A partir del voltamograma que se muestra en el cartucho A, hay un fuerte aumento en la corriente catalítica entre -0,250 y 0,150 V frente a SCE en un electrodo de carbono vitreo en el que la enzima FAD-GDH sola se ha depositado en la capa 2 de nanotubos de carbono ya que la PLQ está presente (línea continua negra) frente a la ausencia de mediador redox en la solución (línea discontinua negra).
También se puede ver en el voltamograma mostrado en el cartucho A que hay una fuerte disminución de la corriente catalítica después de 180 minutos de inmersión del electrodo en la solución que contiene 100 mmol L_1 de glucosa y 400 pmol L_1 de PLQ para el mismo electrodo de carbono vítreo cubierto con una capa 2 de nanotubos de carbono modificados directamente por la capa 4 de enzima FAD-GDH. Esto sugiere una inhibición progresiva de la enzima por PLQ (análogo electroactivo de PL, inhibidor citado por la empresa que suministra la enzima).
De la misma forma, se nota un fuerte aumento de la corriente catalítica entre -0,300 y 0,150 V frente a SCE en los cartuchos B, C y D sobre un electrodo de carbono vítreo en el que la enzima FAD-GDH solo se deposita en la capa 2 de nanotubos de carbono cuando PQ está presente (línea continua negra) frente a la ausencia de mediador redox en la solución (línea discontinua negra).
Por otro lado, en este caso, no se observa disminución de la corriente catalítica después de una incubación de 180 min del electrodo descrito anteriormente en una solución que contiene 100 mmol L_1 de glucosa y 400 pmol L_1 de PQ.
Esta observación sigue siendo válida cuando la solución consta de 100 mmol L_1 de glucosa y 200 pmol L_1 de PQ y 200 pmol L_1 de PH (análogo no electroactivo de PQ).
El fenómeno se invierte cuando la solución consta de 100 mmol L-1 de glucosa y 200 |jmol L-1 de PQ y 200 |jmol L-1 de PL. La corriente catalítica vuelve a caer y se obtiene el fenómeno de inhibición descrito por el fabricante del FAD-GDH.
Claims (18)
1. Bioelectrodo caracterizado porque comprende la superposición de:
- una capa (2) de nanotubos de carbono,
- una capa (3) depositada sobre la capa (2) de nanotubos de carbono, que consiste en moléculas aromáticas elegidas del grupo formado por 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico y mezclas de dos o más de estas moléculas,
- una capa (4) de enzimas dinucleótido de flavina adenina-glucosa deshidrogenasa (FAD-GDH) adsorbidas en la capa (3) de las moléculas aromáticas.
2. Bioelectrodo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por la inclusión de una capa (6) de un material poroso y opcionalmente hidrófilo que cubre al menos la superficie libre de la capa (4) de enzimas FAD-GDH, preferentemente la capa (6) es de alginato, quitosano, Nafion® o gel de sílice.
3. Bioelectrodo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado como una capa (4) que consiste en moléculas de 9,10-fenantrenoquinona o 1,10-fenantrolina-5,6-diona.
4. Bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado como una capa (2) de nanotubos de carbono que consiste entre 2,5 |jg y 510 |jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie de capa, preferentemente entre 2,5 y 100 jg de nanotubos de carbono por cm2 de superficie de la capa (2).
5. Bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado como un soporte (1) de un material conductor de electrones, preferentemente carbono vitreo, bajo la capa (2) de nanotubos de carbono.
6. Bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado como un alambre hecho de un material eléctricamente conductor conectado a la superficie de la capa (2) de nanotubos de carbono que no está cubierta por la capa (3) de moléculas aromáticas.
7. Bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado como una capa (5) de recubrimiento impermeable a los fluidos, preferentemente de un material de silicona, que rodea la superposición de las capas (2), (3) y (4) y opcionalmente el soporte 1.
8. Dispositivo que comprende un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado como una célula enzimática de biocombustible.
10. Dispositivo que comprende un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado como un dispositivo de detección de glucosa.
11. Uso de un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8 para la oxidación de glucosa.
12. Un método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque consiste en las siguientes etapas:
a) preparar una suspensión de nanotubos de carbono con una concentración de nanotubos de carbono de entre 0,5 mg.mL'1 y 10 mg.mL'1, y preferentemente de 2,5 mg.mL'1, en un disolvente orgánico seleccionado de N-metil-2-pirrolidona (NMP), diclorometano (DCM), acetonitrilo (ACN), 1,3-dioxolano (DXL), dimetilformamida (d Mf ), y mezclas de dos o más de estas moléculas, preferentemente NMP, b) depositar una colada de gota de la suspensión de nanotubos de carbono obtenida en la etapa a) sobre un soporte (1) de material conductor de electrones, preferentemente carbono vitreo,
c) evaporación del disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono, por lo cual se forma una capa (2) de nanotubos de carbono sobre el soporte (1),
d) preparar una solución que comprende moléculas aromáticas, seleccionadas del grupo que consiste en 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1,10-fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido pireno-1-butírico, y mezclas de dos o más moléculas, que tengan una concentración que incluye entre 0,5 mmol.L'1 y 15 mmol.L'1, y preferentemente 2,5 mmol.L'1 de moléculas aromáticas disueltas en un disolvente orgánico idéntico o diferente al disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono, el disolvente se selecciona de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF y mezclas de dos o más de los mismos, y ser preferentemente NMP,
e) depositar sobre una superficie de la capa (2) de nanotubos de carbono obtenidos en la etapa c) de la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa d), por deposición de una gota, preferentemente teniendo un volumen comprendido entre 5 y 200 jL , más preferentemente un volumen de 175 jL, de la
solución de moléculas aromáticas en la superficie de la capa (2), o por incubación de al menos la superficie libre de la capa (2) en la solución de moléculas aromáticas obtenidas en la etapa d), f) evaporación del disolvente de la solución de moléculas aromáticas depositada en la etapa e), por lo cual se forma una capa (3) de moléculas aromáticas sobre la capa (2),
g) preparación de una solución acuosa de enzimas FAD-GDH que tiene una concentración de enzima FAD-GDH de entre 0,1 mg.mL-1 y 5 mg.mL-1, más preferentemente 0,75 mg.mL-1,
h) depositar sobre la capa (3) de moléculas aromáticas obtenidas en la etapa f), la solución de enzima FAD-GDH obtenida en la etapa g), mediante incubación de al menos la superficie libre de las moléculas aromáticas de la capa (3) en una solución acuosa que contiene las enzimas FAD-GDH obtenidas en la etapa g), o al depositar una colada de gota de dicha solución acuosa que contiene las enzimas FAD-GDH obtenidas en la etapa f) sobre la superficie libre de la capa (3).
13. Método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se repite al menos una vez la etapa a) de depositar una gota de la dispersión de nanotubos de carbono.
14. Un método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque consiste en las siguientes etapas:
A) preparar una suspensión de nanotubos de carbono en un disolvente orgánico preferentemente seleccionado de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF y mezclas de dos o más de estos, más preferentemente DMF con una suspensión que tenga una concentración de nanotubos de carbono de entre 1 mg. mL-1 y 15 mg.mL-1, preferentemente 1 mg.mL-1,
B) preparar una solución de moléculas aromáticas seleccionadas del grupo que consiste en 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1.10- fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido 1-pireno-butírico, y mezclas de dos o más elementos preferentemente 1,10-fenantrolina-5,6-diona, en un disolvente orgánico seleccionado de NMP, DCM, ACN, DXL, DMF y mezclas de dos o más elementos del mismo o diferente del disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono obtenida en la etapa a), preferentemente DMF, esta solución de moléculas aromáticas tiene una concentración de moléculas aromáticas entre 0,5 mmol.L-1 y 15 mmol.L-1, preferentemente 2,5 mmol.L-1,
C) añadir la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa b) en la suspensión de nanotubos obtenida en la etapa A), y mezclar,
D) filtrar la dispersión obtenida en la etapa C) a través de un soporte filtrante,
E) evaporar el disolvente de la suspensión de nanotubos de carbono y del disolvente de la solución de moléculas mediadoras aromáticas, por lo cual se forma una capa (2) de nanotubos de carbono, a su vez recubierta en al menos una de sus superficies con una capa (3) de dichas moléculas aromáticas,
F) preparar una solución acuosa de enzimas FAD-GDH con una concentración de enzimas FAD-GDH de entre 0,1 y 5 mg.mL’1,
G) depositar una gota de 150 pL de la solución de enzima FAD-GDH preparada en la etapa F) sobre la superficie libre de la capa (3) lo que forma una capa (4) de enzimas fAD-GDH adsorbidas sobre la capa (3) de moléculas aromáticas,
H) retirar el conjunto obtenido en la etapa G del soporte filtrante.
15. Un método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque consiste en las siguientes etapas:
a1) preparar una suspensión de nanotubos de carbono en un disolvente orgánico, preferentemente DMF, que tenga una concentración de nanotubos de carbono entre 1 mg.mL-1 y 15 mg.mL-1, preferentemente 1 mg.mL-1,
b1) preparar una solución de moléculas aromáticas seleccionadas del grupo que consiste en 9,10-fenantrenoquinona, 1,10-fenantrolina-5,6-diona, 9,10-antraquinona, fenantreno, 1,10-fenantrolina, 5-metil-1.10- fenantrolina, pireno, 1-aminopireno, ácido 1-pireno-butírico y mezclas de dos o más moléculas, preferentemente 1,10-fenantrolina-5,6-diona, en un disolvente orgánico idéntico o diferente al disolvente orgánico de la suspensión de nanotubos de carbono obtenida en la etapa a1), preferentemente DMF, esta solución tiene una concentración de moléculas aromáticas de entre 0,5 y 15 mmol.L-1, preferentemente 2,5 mmol.L-1,
c1) filtrar la dispersión obtenida en la etapa b1) a través de un soporte filtrante (1),
d1) evaporar el disolvente de la dispersión de nanotubos de carbono depositados en la etapa c), por lo cual se forma una capa (2) de nanotubos de carbono,
e1) retirar la capa de nanotubos de carbono obtenida en la etapa d1) del soporte filtrante (1),
f1) depositar una gota de 150 pL de la solución de moléculas aromáticas obtenida en la etapa b1) sobre al menos una superficie de la capa (2) de nanotubos de carbono obtenida en la etapa e1),
g1) evaporar el disolvente de la solución de moléculas aromáticas depositada en la etapa f1), por lo cual se forma una capa (3) de dichas moléculas aromáticas sobre la capa (2) de nanotubos de carbono, h1) preparar una solución acuosa de enzimas FAD-GDH, con una concentración de enzimas FAD-GDH de entre 0,1 y 5 mg.mL-1,
i1) depositar una gota de 150 pL de la solución de enzima FAD-GDH obtenida en la etapa h) sobre al menos una superficie de la capa (3) de moléculas aromáticas, lo que forma una capa (4) de enzimas FAD-GDH adsorbidas en la capa (3).
16. Un método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, caracterizado como la etapa k1) de fijar un alambre de un material eléctricamente conductor sobre la superficie de la capa (2) de nanotubos de carbono no cubierta con la capa (3) de moléculas aromáticas, esta etapa se implementa antes o después de la etapa G) o i1) de deposición de la capa (4) de enzimas FAD-GDH.
17. Un método de producción de biolectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado como una etapa para depositar una capa (6) de un material poroso y opcionalmente hidrófilo sobre al menos la superficie libre de la capa (4).
18. Un método de producción de un bioelectrodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado como la deposición de una etapa de recubrimiento de la superposición: capa (2) de nanotubos de carbono/capa (3) de moléculas aromáticas/capa (4) de enzimas FAD-GDH/opcionalmente soporte (1)/alambre hecho de material eléctricamente conductor, con material impermeable a los fluidos, preferentemente a base de silicona.
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