ES2866887T3 - Análisis de fluidos corporales usando espectroscopía de infrarrojos para el diagnóstico y/o el pronóstico de un cáncer - Google Patents

Análisis de fluidos corporales usando espectroscopía de infrarrojos para el diagnóstico y/o el pronóstico de un cáncer Download PDF

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Abstract

Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de un trastorno proliferativo en un sujeto, comprendiendo el método: realizar un análisis espectroscópico de ATR-IR de una muestra de suero sanguíneo líquida del sujeto para producir una firma espectroscópica característica de la muestra de suero sanguíneo líquida, en donde con la muestra de suero sanguíneo líquida se ha recubierto la superficie de un cristal de ATR y en donde la firma espectroscópica característica de la muestra de suero sanguíneo líquida se compara con una base de datos de firmas representativas, obtenidas previamente de muestras de sujetos con trastornos proliferativos o no proliferativos conocidos, para diagnosticar y/o pronosticar, mediante la comparación de las respectivas firmas, si el sujeto tiene o no un trastorno proliferativo, tal como el cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN
Análisis de fluidos corporales usando espectroscopia de infrarrojos para el diagnóstico y/o el pronóstico de un cáncer Campo
La presente invención se refiere a métodos de diagnóstico y/o de pronóstico de estados anómalos, tales como trastornos proliferativos, en especial, cánceres de cerebro, tales como gliomas.
Antecedentes
Los trastornos proliferativos, tales como el cáncer, están provocados por una proliferación celular descontrolada y no regulada, y pueden, en algunos casos, conducir a la formación de un tumor.
Para identificar clínicamente tumores se pueden utilizar diversas técnicas de diagnóstico por la imagen distintas, tales como la tomografía computarizada (TC), obtención de imágenes por resonancia magnética (RM), radiografías y tomografía por emisión de positrones (TEP). Sin embargo, estas técnicas pueden resultar costosas y/o lentas. Además, a menudo se precisa una biopsia final para determinar si los tumores identificados son malignos o benignos. Por lo tanto, es conveniente identificar nuevos métodos de diagnóstico de enfermedades proliferativas, tales como tumores, que se puedan realizar de forma rápida y eficaz sin la necesidad inicial de un procedimiento invasivo, lo que puede ser problemático en cualquier caso dependiendo de la ubicación de cualquier tumor.
Recientemente, la atención se ha centrado en el uso de la espectroscopia IR en el análisis de líquidos corporales para proporcionar pruebas de diagnóstico útiles. Sin embargo, la presencia de agua puede plantear un problema al intentar un análisis espectroscópico de infrarrojo de líquidos corporales, tales como muestras de sangre. El agua es un material muy activo en IR y, por lo tanto, la intensidad de los picos asociados con el agua a menudo domina el espectro de un líquido corporal y, en muchos casos, estos picos se superponen con los picos de los espectros de líquidos corporales que son de interés para el médico. Para abordar esto, las muestras generalmente se secan antes de realizar el análisis. Recientemente, en el documento WO 2014/076480 se ha descrito un método de diagnóstico de cáncer de cerebro mediante la realización de análisis espectroscópico de infrarrojo con transformada de Fourier - reflectancia total atenuada (ATR-FTIR, forma siglada de Attenuated Total Reflection - Fourier Transform Infrared) de muestras de sangre). A diferencia del ATR-IR (forma siglada de attenuated total reflection infrared, infrarrojo por reflectancia total atenuada) convencional (en que una muestra se coloca sobre un sustrato que luego se pone en contacto con el cristal de ATR), como sustrato para la muestra se utilizó el cristal de ATR. Este método proporciona una prueba diagnóstica inmediata y no destructiva. Sin embargo, precisa una preparación cuidadosa de las muestras de sangre antes de llevar a cabo un análisis espectroscópico, que incluye una etapa de secado para minimizar el agua presente en la muestra. P. Lasch et al. (Anal Chem 2003, 75, 6673-6678) describe el análisis de la firma espectral de IR de muestras de suero sanguíneo en un método de diagnóstico de EEB y, de manera similar, el documento WO2016/061613 describe la detección de un agente infeccioso.
El documento US2007/0292963, S. Caine et al. (Neurolmage 59 (2011), 3624-3640) y K.V. Oliver (tesis doctoral de la UCL, 2015)) tratan sobre el diagnóstico de enfermedades proliferativas, pero no describen el uso de la espectroscopia IR o de muestras de suero sanguíneo líquidas.
H. Fabian et al. (J. Biomedical Optics 2005, 10(3), 031103) y E. Stohr et al. (Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute (1992)) describen métodos que se basan en el análisis de espectros de FTIR obtenidos de muestras de sangre líquidas, pero no describen el diagnóstico de enfermedades proliferativas, tales como el cáncer. Es un objetivo de la presente invención obviar y/o mitigar al menos una de las desventajas mencionadas anteriormente.
Sumario
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que el análisis espectroscópico de líquidos corporales húmedos puede ayudar en el diagnóstico y/o el pronóstico de estados anómalos, tales como enfermedades proliferativas, tales como el cáncer. Las técnicas descritas en el presente documento facilitan el diagnóstico rápido de enfermedades proliferativas.
1. De acuerdo con un aspecto, se proporciona un método de diagnóstico y/o
pronóstico de un trastorno proliferativo en un sujeto, comprendiendo el método: realizar un análisis espectroscópico de ATR-IR de una muestra de suero sanguíneo líquida del sujeto para producir una firma espectroscópica característica de la muestra de suero sanguíneo líquida, en donde la muestra de suero sanguíneo líquida se ha recubierto sobre una superficie de un cristal de a Tr y en donde la firma espectroscópica característica de la muestra de suero sanguíneo líquida se compara con una base de datos de firmas representativas obtenidas previamente de muestras de sujetos con trastornos proliferativos o no proliferativos conocidos, para diagnosticar y/o pronosticar, mediante la comparación de las respectivas firmas, si el sujeto tiene o no un trastorno proliferativo, tal como el cáncer.
La firma espectroscópica característica de la muestra de líquido corporal/sangre se compara con una base de datos de firmas representativas obtenidas previamente de muestras de sujetos con anomalías conocidas, tales como trastornos proliferativos o no proliferativos, para diagnosticar y/o pronosticar, mediante la comparación de las respectivas firmas, si el sujeto tiene o no una anomalía, tal como un trastorno proliferativo, tal como el cáncer. Dicha comparación se llevaría a cabo utilizando un programa informático de reconocimiento de patrones y/o un análisis por aprendizaje automatizado conocidos en la técnica. Alternativamente, pueden cuantificarse y utilizarse medidas clínicas tales como los niveles de azúcar, hidratos de carbono, proteínas y ácido nucleico, metabolitos y lípidos, como marcadores de anomalías/proliferación celular. Por ejemplo, pueden determinarse los niveles totales de albúmina y/o globulina a partir de la muestra de líquido corporal/sangre, tal como una muestra de suero.
Como se usa en el presente documento, una muestra de líquido corporal/sangre "húmeda" se refiere a una muestra que no se ha secado antes del análisis espectroscópico. En los métodos reivindicados, la muestra de sangre húmeda es una muestra de suero sanguíneo líquida. Así pues, la muestra puede contener agua (por ejemplo, hasta el 95 % de agua) y/o estar en forma líquida. Los inventores han identificado sorprendentemente que el análisis espectroscópico de tales muestras de líquidos corporales húmedas puede proporcionar un indicio rápido de la presencia de una anomalía, tal como una enfermedad proliferativa, en un sujeto. Por lo tanto, a diferencia de los procedimientos de la técnica anterior, los presentes métodos no precisan que la muestra líquida se seque antes de llevar a cabo el análisis espectroscópico IR. En algunas realizaciones de la presente invención, el método se realiza en la muestra líquida rápidamente, antes de dejar secar la muestra. Por lo tanto, el método puede realizarse, por ejemplo, al cabo de 1 minuto, de 5 minutos o de 10 minutos de aplicar la muestra a un sustrato para su detección.
El método puede proporcionar un indicio de si un sujeto es canceroso o no canceroso/benigno. En otros casos, el método puede proporcionar un diagnóstico más específico de una afección o enfermedad proliferativa particular.
De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un método de diagnóstico y/o pronóstico de un trastorno proliferativo en un sujeto de acuerdo con el primer aspecto, que comprende: analizar la firma espectroscópica para determinar si está presente un trastorno proliferativo;
cuando está presente un trastorno proliferativo, analizar adicionalmente la firma espectroscópica, u obtener una segunda firma espectroscópica de ATR-IR característica de la muestra de suero sanguíneo líquida; y
analizar adicionalmente la firma o la segunda firma espectroscópica para proporcionar un diagnóstico más específico del trastorno proliferativo.
Como se apreciará, un método de dos fases, como se describe anteriormente, puede proporcionar un indicio temprano y rápido de si una enfermedad proliferativa, tal como el cáncer de cerebro, está presente o no en un sujeto. Si el primer análisis espectroscópico indica que tal enfermedad proliferativa está presente, entonces, un análisis secundario puede proporcionar un diagnóstico más específico (por ejemplo, tumores cerebrales primarios frente a tumores cerebrales secundarios, o tumores benignos).
En algunos casos, el método puede comprender realizar un segundo análisis espectroscópico de una muestra seca de líquido corporal/sangre (o un componente de los mismos) para obtener la segunda firma espectroscópica. En tales casos, tanto el primer como el segundo análisis espectroscópico pueden llevarse a cabo en el mismo instrumento.
Como alternativa, el método puede comprender un procesamiento adicional de la primera firma espectroscópica llevada a cabo en una muestra húmeda, para comparar la primera firma espectroscópica con bases de datos de espectros obtenidos de muestras húmedas de sujetos con afecciones proliferativas específicas. Dicho procesamiento adicional puede ser la comparación de la firma obtenida del sujeto con una base de datos de firmas obtenidas previamente de muestras de líquido corporal/sangre secas de sujetos con trastornos proliferativos/no proliferativos conocidos. Dicha comparación se llevaría a cabo utilizando un programa informático de reconocimiento de patrones y/o un análisis por aprendizaje automatizado conocidos en la técnica.
Por ejemplo, la firma obtenida de un sujeto puede compararse con una base de datos de firmas que permita diferenciar entre sujetos positivos y negativos para una anomalía/trastorno proliferativo. Solo si un sujeto se identifica como anómalo o como positivo para un trastorno de proliferación, se llevará a cabo el análisis adicional para buscar determinar más específicamente el tipo de anomalía o de trastorno proliferativo, tal como un tumor primario o tumor metastásico.
En otros casos, la segunda firma espectroscópica puede obtenerse secando digitalmente un espectro obtenido del primer análisis espectroscópico de la muestra de sangre húmeda. Como se usa en el presente documento, "secar digitalmente" un espectro puede comprender un método de los mínimos cuadrados basado en programas informáticos para eliminar "digitalmente" picos de agua de un espectro.
Los métodos de la invención generalmente utilizan análisis espectroscópico de infrarrojo (IR). La firma espectroscópica característica de la muestra de sangre (que puede denominarse la firma o región de huella (fingerprint región)) puede ser parte o todo el espectro de IR pertinente entre 400 y 2500 cm-1, parte o todo el espectro entre 800 y 2000 cm-1 o, alternativamente, el espectro entre 900 y 1800 cm-1, además, pueden ser pertinentes áreas dentro de todo el espectro de 400 a 4000 cm-1.
Antes de un análisis espectroscópico, se puede obtener un espectro de fondo. Dichos espectros de fondo pueden proporcionar una corrección para un entorno de fondo. Por ejemplo, puede obtenerse el espectro de fondo del aire para proporcionar una corrección atmosférica. Como alternativa, o adicionalmente, puede obtenerse el espectro de fondo de una solución, por ejemplo, una solución acuosa tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS).
El análisis espectroscópico puede implicar normalización (por ejemplo, por variable normal estándar), reducción del ruido (por ejemplo, basado en ACP) y derivación (por ejemplo, 1' o 2'), como pasos de preprocesamiento.
A continuación, se describen diversas técnicas de IR que pueden emplearse en los métodos de la presente divulgación.
El método puede utilizar análisis espectroscópico de IR con transformada de Fourier (FTIR). En el FTIR, los espectros de IR se pueden obtener en la región de 400-4000 números de onda (cm-1). Generalmente, los espectros de IR pueden tener una resolución de 10 cm-1 o menos, 5 cm-1 o menos, o de aproximadamente 4 cm-1. El análisis espectroscópico de FTIR puede emplear al menos 10 exploraciones, al menos 15 o al menos 30. El análisis espectroscópico de FTIR puede emplear como máximo 100 exploraciones, como máximo 50 exploraciones o como máximo 40 exploraciones. Por ejemplo, pueden utilizarse 32 exploraciones. Las exploraciones pueden coañadirse. Como apreciará el experto en la materia, puede seleccionarse el número de exploraciones para optimizar el contenido de datos y el tiempo de adquisición de los datos.
Como alternativa, los métodos de la presente divulgación pueden utilizar IR de frecuencia discreta (DFIR, forma siglada de discrete frequency IR). Por ejemplo, puede utilizarse una fuente de láser de cascada cuántica (QCL, forma siglada de quantum cascade laser). Los QCL son láseres semiconductores que emiten en la parte del infrarrojo medio a lejano del espectro electromagnético. Los QCL generalmente proporcionan densidades espectrales de potencia que son varios órdenes de magnitud más altas que las globars (Alcaraz et al. Anal Chem, 2015, 87). El uso de estas fuentes dentro de las regiones de interés de un líquido corporal, tal como una muestra de sangre, (por ejemplo, 1800 -1000 cm-1) permite una penetración más profunda de la luz en un analito. Por lo tanto, el uso de un q Cl en los métodos de la invención puede permitir analizar una mayor proporción de la muestra, aumentando así la sensibilidad de la técnica. Además, es posible fabricar un QCL que emita en una región de longitudes de onda deseada, por ejemplo, tales fuentes pueden ajustarse para emitir en una región de longitudes de onda deseada. Esto puede permitir obtener una firma espectroscópica más rápidamente al dirigirse a una región de interés (tal como una región de firma).
Los métodos reivindicados utilizan análisis espectroscópico de IR por reflectancia total atenuada (ATR). En algunas realizaciones, el análisis espectroscópico puede ser de ATR-FTIR.
Anteriormente se creía que la baja intensidad de emisión de las fuentes de IR clásicas de baja intensidad (por ejemplo, un globar) limita las posibilidades de análisis de muestras con una matriz altamente absorbente, por ejemplo, agua. En tales muestras, el agua absorbe gran parte de la luz irradiada, atenuando así la intensidad de la luz que está disponible para la interacción con el analito propiamente dicho. Así pues, en el área de interés para la mayoría de las investigaciones sobre líquidos corporales (1800 - 100 cm-1), el espesor de un analito de líquido corporal generalmente se limitaba a 8 micrómetros cuando se realizaba espectroscopia de IR de transmisión (Alcaraz et al. Anal Chem, 2015, 87). De manera análoga, se creía que la intensidad de los picos de agua también ocultaría la información útil al realizar espectroscopia de IR por reflectancia total atenuada (ATR) de líquidos corporales que contienen agua. En particular, dado que la ATR solo penetra a una profundidad de aproximadamente 2 micrómetros en la muestra, se pensó que esta técnica carecería de sensibilidad debido a la concentración relativamente baja de biomoléculas (en comparación con el agua). Sin embargo, los presentes inventores identificaron sorprendentemente que un análisis espectroscópico de (ATR)-IR de una muestra de sangre húmeda puede proporcionar información diagnóstica útil que indique la presencia de una enfermedad proliferativa o de otro tipo en un sujeto. Así pues, se ha descubierto que un método que implica el uso de análisis espectroscópico de ATR-IR es particularmente eficaz en un método de diagnóstico de dos fases.
Como alternativa, la segunda firma espectroscópica puede obtenerse en cambio secando digitalmente la primera firma espectroscópica.
En un método que implica ATR-IR, pueden emplearse "cristales de ATR" para soportar la muestra de sangre durante el análisis de IR. De manera adecuada, la muestra de sangre recubre la superficie (o parte de la misma) del "cristal de ATR" durante el análisis de IR. Los cristales de ATR adecuados incluyen germanio, k RS-5 seleniuro de zinc, diamante y silicio. Los cristales de ATR pueden tener forma de placa. En una realización particular, el cristal de ATR es un cristal de diamante de reflectancia única.
Durante un análisis espectroscópico de ATR-IR típico, la muestra de sangre puede cargarse en un cristal de ATR y la luz IR puede viajar a través del cristal de ATR y reflejarse (por ejemplo, por reflectancia interna total) al menos una vez en una superficie interna del cristal que está en contacto con la muestra. Dicha reflexión puede formar una "onda evanescente" que penetra en la muestra de sangre en una medida que depende de la longitud de onda de la luz, del ángulo de incidencia y de los índices de refracción del cristal de ATR, y la propia muestra de sangre. Los números de reflexiones pueden alterarse variando el ángulo de incidencia. El haz puede ser recibido por un detector de IR cuando sale del cristal. Generalmente, el cristal de ATR es un material óptico con un índice de refracción más alto que la muestra de sangre, para permitir el efecto de onda evanescente.
El análisis espectroscópico puede ser análisis de transmisión de IR. Durante un análisis de transmisión típico, puede colocarse una muestra, tal como una muestra de sangre, sobre un sustrato transparente para IR o dentro de un medio transparente para IR. La luz IR puede transmitirse a través de la muestra y detectarse el haz resultante.
En algunas realizaciones, el análisis espectroscópico puede ser análisis de transmisión de IR por QLC. En tales métodos, la muestra de sangre puede colocarse en una celda de transmisión.
Después de obtener una firma espectroscópica característica de la muestra de sangre (o de un componente de la misma) utilizando una o más de las técnicas descritas anteriormente, la firma puede correlacionarse a continuación con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable. Por ejemplo, la firma puede correlacionarse para proporcionar un indicio de si un sujeto es canceroso o no canceroso/benigno. Adicionalmente, o como alternativa, la firma puede correlacionarse para proporcionar un diagnóstico de un cáncer de cerebro primario o secundario.
En particular, el método de diagnóstico y/o pronóstico de una anomalía, tal como un trastorno proliferativo, en un sujeto, puede comprender además comparar y/o correlacionar la firma espectroscópica de la muestra de sangre (o de un componente de la misma) con una o más firmas espectroscópicas de referencia indicativas de una o más anomalías específicas o enfermedades proliferativas.
La firma espectroscópica de referencia puede ser una firma espectroscópica que previamente se ha correlacionado con un diagnóstico particular. Por ejemplo, la firma espectroscópica de referencia puede ser una firma precorrelacionada, opcionalmente almacenada en una base de datos con otras firmas precorrelacionadas. La firma espectroscópica de referencia puede haberse obtenido utilizando la misma técnica espectroscópica y en las mismas condiciones que la firma espectroscópica a correlacionar. Por ejemplo, puede correlacionarse una firma espectroscópica obtenida de una muestra de sangre húmeda con una firma espectroscópica de referencia también obtenida de una muestra de sangre húmeda.
La firma espectroscópica de la muestra de sangre puede estar normalmente en la región de 900-1800 cm-1.
La etapa de correlación puede realizarse comparando la firma espectroscópica con una o más firmas precorrelacionadas (por ejemplo, firmas obtenidas y verificadas previamente, por ejemplo, mediante biopsias, como indicativo de un diagnóstico y/o pronóstico particular). Esto se puede lograr mediante una evaluación cualitativa, por ejemplo, determinadas firmas se asemejarán, tal vez en diversos grados, a una firma característica de una muestra de sangre de un sujeto con un trastorno proliferativo, mientras que otras firmas pueden diferir de tales firmas. Así pues, en el diagnóstico y/o pronóstico de un trastorno proliferativo puede utilizarse una evaluación cualitativa de la aparición de la firma. Dicha evaluación cualitativa puede realizarse de forma manual, pero preferentemente se realiza de forma digital mediante un ordenador que se ejecuta según un programa informático que realiza tal evaluación. Adecuadamente, cualquier programa informático de este tipo puede, a partir de la evaluación, correlacionar la firma con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable.
Como alternativa o adicionalmente, la correlación con un diagnóstico y/o pronóstico particular puede hacerse mediante una evaluación cuantitativa, por ejemplo, cuando la firma de la muestra de líquido corporal/sangre se compara con una o más firmas de referencia (ya correlacionadas previamente con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable), opcionalmente almacenarse en una base de datos y, adecuadamente, analizarse estadísticamente en cuanto a una probabilidad de una correlación.
El método de uso de una evaluación cuantitativa para ayudar en el diagnóstico y/o pronóstico permitiría que la invención descrita tenga una realización que sea comparable al análisis de sangre tomado dentro de la consulta médica. En particular, el método detalla cómo la identificación de la concentración de proteínas en una muestra de líquido corporal/sangre mediante análisis espectroscópico podría compararse con los resultados obtenidos a partir de un análisis de sangre en una consulta médica de rutina.
El análisis espectroscópico de muestras de líquidos corporales humanos enriquecidas preparadas o estandarizadas puede utilizarse para producir modelos de calibración utilizando un algoritmo de regresión por mínimos cuadrados parciales (PLSR, forma siglada de partial least squares regression). Las muestras enriquecidas pueden prepararse utilizando, por ejemplo, dos proteínas encontradas comúnmente (seroalbúmina humana y gammaglobulinas) y concentraciones preparadas en un intervalo que cubre las concentraciones humanas normales esperadas. Se pueden utilizar firmas precorrelacionadas para llevar a cabo una validación cruzada, analizando la validez del modelo antes de que se utilicen para predecir la concentración de proteína desconocida en muestras de pacientes. En una realización particular, una firma obtenida espectroscópicamente se compara con una pluralidad de firmas precorrelacionadas almacenadas en una base de datos (por ejemplo, un "conjunto de entrenamiento") para obtener una correlación con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable. Se puede realizar un análisis estadístico (por ejemplo, mediante algoritmos de reconocimiento de patrones y aprendizaje automatizado), preferentemente basado en una comparación de las similitudes y diferencias de la firma con las firmas precorrelacionadas, antes de utilizar el análisis estadístico para correlacionar la firma con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable. Adecuadamente, los algoritmos de reconocimiento de patrones y de aprendizaje automático incluyen máquinas de vectores de soporte (SVM, forma siglada de support vector machines), clasificadores de bosques aleatorios y análisis de función discriminante de componentes principales (PC-DFA, forma siglada de principal component discriminan function analysis).
En una realización particular, se correlaciona una firma obtenida espectroscópicamente con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable basado en un modelo predictivo desarrollado por "entrenamiento" (por ejemplo, mediante algoritmos de reconocimiento de patrones) de una base de datos de análisis precorrelacionados.
El examen y/o la comparación de firmas de muestras de sangre a partir de análisis espectroscópicos no necesariamente se centra en picos particulares, o sustancias particulares responsables de picos particulares. Sin embargo, en el caso de ATR-FTIR, dos picos de amida, que generalmente aparecen como un doblete de picos a aproximadamente 1550 cm-1 y 1650 cm-1 parecen ser indicadores importantes de trastornos proliferativos dado que determinados cambios en estos picos indican cambios en la estructura proteica que sugieren un trastorno proliferativo.
En los métodos de la invención, el análisis espectroscópico se lleva a cabo en una muestra de suero sanguíneo. En algunas realizaciones, la muestra de sangre puede ser suero sanguíneo humano. En algunos casos, la muestra de sangre puede ser suero entero. En otros casos, la muestra de sangre puede ser suero entero al que se le han eliminado los componentes por encima de 100 kDa mediante filtración por centrifugación, o suero entero al que se le han eliminado los componentes por encima de 10 kDa mediante filtración por centrifugación, o suero entero al que se le han eliminado los componentes por encima de 3 kDa mediante filtración por centrifugación. Otros posibles líquidos corporales descritos en conformidad con la presente divulgación incluyen, orina, líquido cefalorraquídeo, heces, bilis, leche materna, semen, mucosidad, saliva, humor vítreo, lágrimas, linfa y similares.
Cualquiera de tales filtraciones por centrifugación puede realizarse utilizando una minicentrífuga combinada con filtros de proteínas apropiados a 14.000 rpm, según las instrucciones del fabricante (por ejemplo, filtros de membrana Amicon, Merck Millipore).
En algunas realizaciones de la divulgación, se realizan una pluralidad de análisis espectroscópicos utilizando diversos sueros/líquidos corporales (es decir, con distintos grados de filtración) obtenidos de la misma muestra de líquido corporal/sangre entera, y los resultados se comparan y/o utilizan para una validación cruzada.
Puede tomarse una parte alícuota individual de la muestra de sangre total y utilizarse para cada análisis espectroscópico. De esta manera, más tarde pueden utilizarse alícuotas adicionales para análisis espectroscópicos adicionales sobre la misma muestra de sangre, ayudando de este modo a la validación de los resultados. De manera adecuada, se realizan al menos dos análisis espectroscópicos sobre cada muestra de sangre. Además, cada análisis espectroscópico individual se repite convenientemente al menos dos veces con la misma alícuota, preferentemente al menos tres veces, para ayudar a validar los resultados.
Adicionalmente, o como alternativa, pueden obtenerse múltiples muestras al mismo tiempo o en distintos momentos y analizarlas.
Los métodos de la invención proporcionan un indicio de si un sujeto padece cáncer o no, por ejemplo, un cáncer de cerebro o columna vertebral (y/o tumores asociados). En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo puede ser un cáncer de cerebro. La enfermedad proliferativa puede ser un glioma.
Como alternativa, o adicionalmente, los métodos de la invención pueden permitir determinar la naturaleza del trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer de cerebro primario o cáncer de cerebro secundario (cáncer de cerebro metastásico).
Los tres tipos principales de glioma maligno son los astrocitomas, los ependimomas (grado II de la OMS) y los oligodendrogliomas. Los métodos de diagnóstico de la invención pueden aplicarse a todos estos tipos de gliomas. Un tumor con una mezcla de las características histológicas presentes en los tres principales se conoce como glioma mixto, el cual la presente invención también puede servir para diagnosticar. La siguiente tabla muestra los subtipos de gliomas de grado alto y bajo grado.
Figure imgf000007_0001
En una realización particular, el cáncer de cerebro es un glioma de grado bajo o de grado alto. En una realización particular, el cáncer de cerebro es uno cualquiera de astrocitoma pilocítico, oligodendroglioma, astrocitoma, astrocitomas anaplásicos, oligodendrogliomas, subtipos de glioma glioblastoma multiforme. En una realización particular, el cáncer de cerebro es un glioma de Grado III o de Grado IV. El cáncer de cerebro puede, por ejemplo, ser un glioblastoma multiforme (GBM) de grado IV.
La firma espectroscópica puede correlacionarse con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable basado en un modelo predictivo desarrollado por "entrenamiento" (por ejemplo, mediante algoritmos de reconocimiento de patrones y/o de aprendizaje automatizado) de una base de datos de análisis precorrelacionados.
La correlación de los resultados analíticos con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable puede realizarse de forma manual (por ejemplo, por un médico u otro analista adecuado) o de forma automáticamente (por ejemplo, por medios informáticos). Las correlaciones pueden establecerse cualitativamente (por ejemplo, mediante una comparación de trazados gráficos o firmas) o cuantitativamente (por ejemplo, por referencia a valores umbral predeterminados o límites estadísticos). La correlación de los resultados analíticos puede realizarse utilizando un modelo predictivo, opcionalmente como se define en el presente documento, que puede haberse desarrollado "entrenando" una base de datos de ensayos y/o análisis precorrelacionados.
En una realización particular, la correlación de los resultados analíticos con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable implica una comparación inicial de los resultados analíticos con un patrón de referencia o con resultados analíticos previos que ya se han correlacionado con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable (por ejemplo, resultados analíticos precorrelacionados almacenados en una base de datos). Las correlaciones con resultados analíticos previos pueden implicar una comparación estadística o una comparación de "mejor ajuste" (por ejemplo, si se comparan trazados gráficos con los almacenados en una base de datos). El método de correlación de los resultados analíticos con un diagnóstico y/o pronóstico favorable o desfavorable puede ser un método de correlación implementado por ordenador. Adecuadamente, tales métodos implementados por ordenador incorporan modelos predictivos, opcionalmente junto con las bases de datos apropiadas.
Los métodos descritos anteriormente también pueden utilizarse para estudiar la eficacia de cualquier tratamiento. Por lo tanto, por ejemplo, puede analizarse un sujeto antes de comenzar un tratamiento para obtener una primera firma y analizarlo nuevamente después de un período de tratamiento para determinar si ha habido o no un cambio en la firma y, por lo tanto, si un tratamiento particular puede considerarse o no como eficaz. Pueden realizarse análisis adicionales durante el curso del tratamiento para asegurar que el tratamiento continúa siendo eficaz.
Los métodos de la presente invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros métodos de detección.
Además de los métodos descritos en el presente documento, la presente divulgación también se extiende a una base de datos o bases de datos de firmas representativas obtenidas de muestras de líquido corporal/sangre húmedas y/o secas para su uso en conformidad con los presentes métodos.
Descripción detallada
La presente invención se describirá a continuación con más detalle, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes Figuras, que muestran:
Las Figuras 1 - 12 muestran los resultados del coeficiente de Gini de diversos espectros obtenidos utilizando análisis espectral por ATR-FTIR realizados en muestras de suero húmedas y su uso para distinguir entre sujetos con cáncer frente a sin cáncer y sujetos con glioblastomas metastásicos frente a primarios.
Las Figuras 13 - 17 muestran los gráficos posteriores a la PLSR de las muestras de pacientes y enriquecidas analizadas espectroscópicamente por ATR-FTIR y su uso para determinar la capacidad de uso de esta técnica para cuantificar la concentración de proteínas en muestras de sangre. En particular: la Figura 13 muestra gráficos que presentan el efecto de las etapas de preprocesamiento espectral. De arriba a abajo, datos sin procesar, datos corregidos por valores iniciales y finalmente corregidos por valores iniciales y con normalización vectorial.
La Figura 14 muestra un gráfico de convergencia representativo del valor de R2 /- ET frente al n.° de iteraciones del análisis de globulina al 10 % secada al aire. Este gráfico en particular dio lugar a la selección de 26 iteraciones que se compararon con el número seleccionado de los gráficos del RMSEC (forma siglada de root mean square errors of calibration, error cuadrático medio de calibración) y el RMSEV (forma siglada de root mean square error of validation error cuadrático medio de validación), antes de seleccionar el valor más alto y llevarlo al análisis de PLSR
La Figura 15 muestra la evolución del error cuadrático medio en el conjunto de validación (RMSEV). En este caso, los valores se promedian a partir de las 234 validaciones cruzadas.
Las Figuras 16a, 16b y 16c muestran modelos predictivos construidos a partir del análisis PLS. Cada gráfico muestra la proteína utilizada para el enriquecimiento, así como el estado de la muestra. Para cada concentración, los valores presentados son un promedio de la concentración predicha a partir de las iteraciones de la validación cruzada. En cada gráfico se muestra el RMSEV y los valores de R2, así como la desviación típica correspondiente a cada uno de los valores.
La Figura 17 muestra modelos predictivos construidos a partir del análisis de PLS de las muestras de pacientes. Cada gráfico representa un estado distinto de la muestra. Para cada concentración los valores presentados son un promedio de la concentración predicha a partir de las iteraciones de la validación cruzada. En cada gráfico se muestra el RMSEV y los valores de R2, así como la desviación típica correspondiente a cada uno de los valores Ejemplos
Poblaciones de estudio
El conjunto de datos utilizado estaba compuesto por 150 sujetos. El conjunto de datos comprendía una mezcla igual de sujetos que padecían tumores de cerebro de alto grado (glioblastoma multiforme (GBM) de grado IV), cáncer de cerebro metastásico (cáncer de cerebro secundario de múltiples sitios del cuerpo) y sujetos no cancerosos.
Como alternativa, los conjuntos de datos utilizados para las mediciones cuantitativas consistieron en un conjunto enriquecido compuesto por muestras con las siguientes concentraciones:
Seroalbúmina humana, 7 muestras, intervalo de concentraciones de 0 mg/ml - 70 mg/ml inmunoglobulina, 7 muestras, intervalo de concentraciones de 0 mg/ml - 30 mg/ml mezcla combinada (proteína total), 70 mg/ml - 30 mg/ml Adicionalmente, se predijo un conjunto de pacientes compuesto por 20 pacientes con concentraciones de proteína total de 81 mg/ml - 54 mg/ml utilizando los modelos de calibración a partir de las muestras enriquecidas preparadas. Obtención de espectros
1) El análisis espectral por ATR-FTIR se realizó dejando caer 1 microlitro de cada muestra de paciente sobre la superficie del cristal, y se obtuvieron 3 espectros (de 4000 - 650 o de 400 cirr1) en rápida sucesión
a. Además, para un conjunto espectral, el suero se dejó secar y se volvieron a obtener 3 espectros b. Se obtuvo un conjunto espectral después de realizar el fondo para PBS en lugar de aire
Conjuntos de datos resultantes
Esto dio a lugar a 4 conjuntos de datos que los inventores están analizando actualmente
1) 450 espectros (1 punto de 150 pacientes analizados 3 veces) de muestras se suero húmedas con un fondo para aire mediante ATR-FTIR
Análisis de datos espectrales
El procedimiento de análisis de datos espectrales de los inventores generalmente sigue:
1) Prueba de calidad
2) Selección de la región de huella del espectro de IR (1800 - 1000 cm-1)
3) Normalización vectorial seguida de
a. 1a derivada
b. 2a derivada
4) Los conjuntos de datos resultantes se dividen aleatoriamente en 2/3 de conjunto de entrenamiento y 1/3 con enmascaramiento (conjunto de prueba) basándose en las poblaciones de pacientes, de modo que los espectros de un paciente estén todos en el conjunto de entrenamiento o todos en el conjunto con enmascaramiento, pero no divididos entre ambos.
5) El conjunto de entrenamiento se alimenta a un clasificador de bosque aleatorio con 96 iteraciones
6) Se descubren los picos que mejor describen la pregunta de diagnóstico en cuestión dentro del espectro (es decir, cáncer frente a sin cáncer y GBM frente a MET) y luego se proyecta el conjunto con enmascaramiento en el modelo basado en esta información para proporcionar predicciones de diagnóstico, a partir de lo que se calculan la sensibilidad y la especificidad
7) Para descubrir si hay alguna diferencia entre el inicio de la obtención de espectros y el final de la obtención de espectros para los conjuntos de datos en que se tienen 3 repeticiones, los inventores ejecutaron 3 combinaciones espectrales distintas
a. Un modelo basado en 150 espectros que se compone del 1er espectro obtenido de cada paciente b. Un modelo basado en 150 espectros que se compone del 3° (espectro final obtenido de cada paciente) c. Un modelo basado en 450 espectros que representa todos los espectros de cada paciente
Entonces, los inventores han realizado en total 20 análisis
Para el conjunto de datos 1 anterior se tiene
A) La 1a derivada del modelo del 1er espectro
B) La 2a derivada del modelo del 1er espectro
C) La 1a derivada del modelo del 3er espectro
D) La 2a derivada del modelo del 3er espectro
E) La 1a derivada del modelo de todos espectros
F) La 2a derivada del modelo de todos espectros
Se tienen los mismos 6 modelos para el conjunto de datos 2 y 3, y para el conjunto de datos por QCL se tienen 2 análisis (ya que solo se obtuvo 1 espectro de cada paciente) que representan el análisis de la 1a y 2a derivada
Resultados del análisis por ATR-FTIR húmedo
Cáncer frente a sin cáncer
Los resultados obtenidos identifican los picos principales que se utilizan en el análisis de bosque aleatorio para discriminar cáncer frente a sin cáncer, Figura 1 (o GBM frente a Met., Figura 2). La sensibilidad y la especificidad fueron 84 % y el 78 % respectivamente para cáncer frente a sin cáncer y del 56 % y el 57 % respectivamente para metastásico frente a glioblastoma.
En términos de la 2a derivada del modelo del 1er de espectro para cáncer frente a sin cáncer (Figura 3) la sensibilidad y la especificidad fueron del 85 % y el 82 % respectivamente, y para glioblastoma frente a cáncer metastásico (Figura 4) la sensibilidad y la especificidad fueron del 57 % y el 59 % respectivamente.
En términos de la 1a derivada del modelo del 3er espectro para cáncer frente a sin cáncer (Figura 5) la sensibilidad y especificidad fueron del 82 % y el 77 % respectivamente y para glioblastoma frente a cáncer metastásico (Figura 6) la sensibilidad y la especificidad fueron del 53 % y el 54 % respectivamente. Los resultados observados con respecto a la 2a derivada del modelo de 3er espectro se muestran en la Figura 7 para cáncer frente a sin cáncer (la sensibilidad y la especificidad fueron del 78 % y el 77 % respectivamente) y la Figura 8 para glioblastoma frente a cáncer metastásico (la sensibilidad y la especificidad fueron del 58 % y el 59 %.
En términos de la 1a derivada del modelo de todos los espectros para cáncer frente a sin cáncer (Figura 9) la sensibilidad y especificidad fueron del 84 % y el 78 % respectivamente y para glioblastoma frente a cáncer metastásico (Figura 10) la sensibilidad y la especificidad fueron del 57 % y el 58 % respectivamente. Los resultados observados con respecto a la 2a derivada del modelo de todos los espectros se muestran en la Figura 11 para cáncer frente a sin cáncer (la sensibilidad y la especificidad fueron del 84 % y el 82 % respectivamente) y la Figura 12 para glioblastoma frente a cáncer metastásico (la sensibilidad y la especificidad fueron del 56 % y el 56 %.
En conclusión, se puede observar que, en términos del uso de muestras húmedas, existe un alto grado de especificidad y de sensibilidad en términos de distinguir sujetos con cáncer frente a sin cáncer, aunque esto disminuye algo en términos de distinguir sujetos que padecen tumores cerebrales primarios (por ejemplo, glioblastoma) en contraposición a tumores cerebrales metastásicos secundarios. Por lo tanto, puede ser apropiado realizar una detección específica de cáncer en muestras secas, después de una detección inicial de la presencia de un cáncer que se realiza en una muestra húmeda.
Obtención de espectros: Mediciones cuantitativas
El análisis espectral por ATR-FTIR se realizó dejando caer 1 microlitro de cada muestra enriquecida/de paciente sobre la superficie del cristal, y se obtuvieron 3 espectros (de 4000-650 cirr1) en rápida sucesión
Conjuntos de datos resultantes: Mediciones cuantitativas
Esto dio lugar a 3 conjuntos de datos de enriquecidas y 1 conjunto de datos de pacientes
1. ) 105 espectros (3 puntos de 7 muestras analizadas 5 veces) de muestras enriquecidas con un fondo para aire mediante ATR-FTIR
2. ) 300 espectros (3 puntos de 20 muestras analizadas 5 veces) de muestras de pacientes secadas al aire diluidas al 10 % con un fondo para aire mediante ATR-FTIR
Análisis de datos espectrales: Mediciones cuantitativas
El procedimiento de análisis de datos espectrales de los inventores generalmente sigue:
1. ) Selección de la región de huella (1800 - 900 cirr1)
2. ) Corrección de "banda elástica" (Rubberband) de valores iniciales
3. ) Normalización vectorial
4. ) 512 iteraciones de validación cruzada, se llevó a cabo 1000 veces sobre los datos, produciendo tres gráficos de convergencia, para los resultados del RMSE de calibración (RMSEC), el RMSE de validación (RMSEV) y los valores de R2 Se ajustó un modelo de series de potencias de un término a la curva, destacando cuando el gradiente era <0,0001 y, por lo tanto, el número óptimo de ciclos de validación cruzada a llevar a cabo. Sin embargo, esto significaba que el número de ciclos de validación cruzada no era el mismo con las distintas proteínas, pero fue seleccionado constantemente como el más grande
5. ) Los conjuntos de datos de enriquecidas resultantes se dividieron en calibración:validación 50:50 para ejecutar el PLSR
6. ) Se calcularon la media y la desviación típica del RMSE (medida de la precisión de los modelos) y de R2 (medida de la linealidad de los modelos) para cada conjunto de datos de enriquecidas y se utilizaron para determinar el modelo óptimo a utilizar
7. ) Una vez que se identificó la capacidad de la espectroscopia ATR-FTIR para determinar la concentración de proteínas de las muestras enriquecidas, así como de un conjunto de muestras de pacientes al azar, el conjunto de pacientes se probó enmascarado con muestras de concentraciones desconocidas.
8. ) Se repitió la PLSR utilizando el modelo enriquecido como conjunto de calibración y las muestras de pacientes como la validación para probar con enmascaramiento el modelo
Así, en total se produjeron 15 modelos enriquecidos:
Secado al aire = globulina, albúmina, total, total (glob.), total (alb.)
Dilución al 10% secado al aire = globulina, albúmina, total, total (glob.), total (alb.)
Líquido = globulina, albúmina, total, total (glob.), total (alb.)
Resultados: Mediciones cuantitativas
A partir de la PLSR inicial llevada a cabo en el conjunto de datos de enriquecidas, para determinar el estado óptimo de la muestra (húmedo, seco o seco diluido), se compararon los valores de la RMSE y R2 predictivos para los 15 modelos - Las Figuras 16a, 16b y 16c muestran gráficamente los resultados obtenidos para albúmina, globulina y proteína total.
La siguiente tabla muestra los resultados obtenidos de los 15 modelos
Figure imgf000010_0001
El mejor RMSEV, que destaca la precisión, se obtuvo consistentemente para cada modelo a partir de las muestras al 10% secas, siendo el mejor de 0,857 ± 0,102 mg/ml de los espectros de ATR-FTIR de globulina que estiman la concentración de globulina. Este resultado demuestra que las concentraciones se pueden estimar inequívocamente. Los valores de R2, una medida de la linealidad de los modelos, siguieron una tendencia similar, previniendo los mejores resultados de las muestras diluidas al 10 % secadas al aire, siendo el resultado óptimo de 0,993.
Como las al 10 % secadas al aire produjeron los mejores resultados de los modelos enriquecidos, las muestras de pacientes se analizaron de esta forma (Figura 17). Los valores predictivos obtenidos fueron los siguientes: para la cuantificación de la concentración de proteína total se lograron un RMSEV de 0,6617 ± 0,0464 y un valor de R2 de 0,992.
Al cuantificar las concentraciones de albúmina y globulina en las muestras de pacientes individualmente, el modelo predictivo se desempeñó de manera comparable a las muestras enriquecidas. La cuantificación de la concentración de albúmina a partir de las muestras secadas al aire diluidas dio como resultado un RMSEV de 0,8483± 0,0639 y un valor de R2 de 0,976. La cuantificación de globulina produjo un RMSEV de 1,875 ±.0,123 y un valor de R2 de 0,918, que están ambos relativamente cerca de las muestras enriquecidas.
Concluyendo, la presente divulgación destaca la capacidad de la espectroscopía infrarroja no solo para detectar dos moléculas proteicas distintas sino para cuantificarlas combinadas e individualmente en matrices biológicas complejas, como muestras de suero de pacientes y agrupadas humanas enriquecidas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de un trastorno proliferativo en un sujeto,
comprendiendo el método:
realizar un análisis espectroscópico de ATR-IR de una muestra de suero sanguíneo líquida del sujeto para producir una firma espectroscópica característica de la muestra de suero sanguíneo líquida, en donde con la muestra de suero sanguíneo líquida se ha recubierto la superficie de un cristal de ATR y en donde la firma espectroscópica característica de la muestra de suero sanguíneo líquida se compara con una base de datos de firmas representativas, obtenidas previamente de muestras de sujetos con trastornos proliferativos o no proliferativos conocidos, para diagnosticar y/o pronosticar, mediante la comparación de las respectivas firmas, si el sujeto tiene o no un trastorno proliferativo, tal como el cáncer.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la firma espectroscópica se utiliza para cuantificar un nivel de una o más proteínas en la muestra de suero sanguíneo líquida, para que el nivel de proteínas se utilice como un marcador de proliferación celular.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichas una o más proteínas es/son albúmina y/o globulina.
4. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el análisis de ATR-IR se lleva a cabo entre 400 y 2500 cirr1 en el espectro electromagnético.
5. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde se obtiene un espectro de fondo para proporcionar una corrección para un entorno de fondo.
6. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el análisis espectroscópico comprende normalización, reducción del ruido y/o derivación como una o más etapas de preprocesamiento y/o análisis espectroscópico de IR con transformada de Fourier (FTIR).
7. Un método de diagnóstico y/o de pronóstico de un trastorno proliferativo en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
analizar la firma espectroscópica para determinar si está presente un trastorno proliferativo;
cuando está presente un trastorno proliferativo, analizar adicionalmente la firma espectroscópica, u obtener una segunda firma espectroscópica de ATR-IR característica de la muestra de suero sanguíneo líquida; y analizar adicionalmente la firma o la segunda firma espectroscópica para proporcionar un diagnóstico más específico del trastorno proliferativo.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además realizar un segundo análisis espectroscópico de una muestra de suero sanguíneo seca para obtener la segunda firma espectroscópica.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la segunda firma espectroscópica se obtiene secando digitalmente la firma espectroscópica.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el procesamiento adicional de la firma espectroscópica se lleva a cabo sobre la muestra de suero sanguíneo líquida, para comparar la firma espectroscópica con bases de datos de espectros obtenidos de muestras de suero sanguíneo líquidas de sujetos con afecciones proliferativas específicas.
11. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el análisis de la firma comprende comparar y/o correlacionar la firma espectroscópica de la muestra de suero sanguíneo líquida con una o más firmas espectroscópicas de referencia indicativas de una o más enfermedades proliferativas específicas.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la firma se correlaciona con un diagnóstico y/o un pronóstico favorables o desfavorables basados en un modelo predictivo desarrollado por "entrenamiento" (por ejemplo, mediante algoritmos de reconocimiento de patrones) de una base de datos de análisis precorrelacionados.
13. El método de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, en donde el análisis de la firma proporciona un indicio de si un sujeto es canceroso o no canceroso; y en donde el análisis puede proporcionar un diagnóstico de un cáncer de cerebro primario o secundario.
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