ES2863251T3 - Procedimiento y dispositivo para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en vasos sanguíneos para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el ajuste del foco láser (30) de un láser de excitación (3) en un vaso sanguíneo (21) para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave (1), siendo móvil en el huevo (1) los vasos sanguíneos (21), incluyendo el embrión (22), y no estando aún fijados a la cáscara (28) los vasos sanguíneos (21), incluyendo el embrión (22), en el momento de una medición óptica de la radiación retrodispersada (7), caracterizado por los siguientes pasos: - selección de un vaso sanguíneo (21) en el huevo de ave (1) perforado e incubado por medio de un procedimiento de evaluación basado en el contraste, bajo al menos una iluminación de un entramado de vasos sanguíneos (27) con radiación en el intervalo de longitud de onda verde por medio de un dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, - producción del foco láser (30) para el láser de excitación (3) y de un foco (43) para una cámara (13) en el vaso sanguíneo seleccionado (21) a través del orificio (2) orientado al vaso (21) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, - ajuste del foco láser (30) dentro del vaso sanguíneo (21) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, por medio de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos en base a las modificaciones de intensidad que se presentan en cada caso en dos imágenes registradas sucesivamente de modo concomitante a consecuencia del movimiento de eritrocitos (36) dentro del vaso sanguíneo seleccionado (21), como valores de intensidad It-1(x), It(x) en la posición del píxel x respecto al tiempo t-1 y t, y seguimiento del foco láser (30) y del foco (43) de la cámara (13) en el descenso de la superficie del entramado de vasos sanguíneos (27) y una capa de albúmina (26) que se encuentra sobre el entramado de vasos sanguíneos (27), - compensación de movimientos horizontales x, y producidos del vaso sanguíneo seleccionado (21) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, - realización de mediciones ópticas por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento y dispositivo para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en vasos sanguíneos para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave
La invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en vasos sanguíneos para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave.
Por ejemplo, en la publicación Martinez-Martin, del Pobil: Robust Motion Detection in Real-Life Scenarios, 2012 Springer-Verlag London, DOI10.1007/978-1 -4471-4216-4 se describe una detección de movimiento (en inglés motion detection) mediante utilización de una información temporal a partir de una secuencia de imágenes. Para una imagen que contiene un objeto en movimiento en primer plano sobre un fondo estático se puede observar cada píxel cambiante como parte del primer plano. Por este motivo se pueden aplicar procedimientos que se basan en la información temporal a partir de una diferencia de imágentes definida en valor umbral. En este caso se establece que un píxel x es parte de un objeto en movimiento si su intensidad no se modifica significativamente entre dos imágenes sucesivas:
\h (x) - Im (x)\ > T (I)
con
It(x) como valor de intensidad en la posición de píxel x respecto al tiempo t y
t como valor umbral.
En la publicación US 2014/0273068 se describe un sistema de enfoque automático para células sanguíneas en una célula de flujo para la investigación hematológica. El enfoque automático se basa en una maximización de contraste respecto a un objetivo de referencia que está fijado a distancia invariable respecto a la célula de flujo. En las publicaciones US 7583380 B2 y US 7663748 B2 se describen dos sistemas de enfoque automático para mediciones Raman en vasos sanguíneos. En la publicación US 7583380 B2 se describe un aparato de análisis espectroscópico para el análisis de sangre de pacientes, en el que se realiza el enfoque automático con un sistema de imagen, que está constituido por dos cámaras con planos de imagen ligeramente diferentes. El plano de detección Raman confocal se sitúa entre estos dos planos de imagen, de modo que, con el mismo desenfoque de dos planos de imagen, el foco de la excitación láser se encuentra en el centro del vaso sanguíneo. Mediante registro del desenfoque de los planos de imagen durante la representación gráfica del vaso sanguíneo se puede conseguir un enfoque automático continuo del láser Raman en el vaso sanguíneo.
En la publicación US 7 663 748 B2 se describe un mecanismo de enfoque automático para sistemas espectroscópicos, que se basa en mediciones de fluctuación de propiedades ópticas del volumen de muestra. En el caso de la espectroscopía Raman de sangre fluida se mide la radiación dispersada elásticamente del haz de excitación para fluctuaciones que se generan mediante el flujo de glóbulos rojos. Un bucle de control maximiza la amplitud y/o la intensidad de fluctuaciones y se enfoca de este modo en el centro del vaso sanguíneo. El sistema está previsto para sistemas Raman confocales con un volumen de foco láser menor que el de glóbulos rojos, de modo que las fluctuaciones se basan en la dispersión de células individuales. En sistemas no confocales con láser para manchas mayores que los glóbulos rojos individuales, las fluctuaciones se promedian con volumen de muestra creciente y ya no son detectables si el volumen del foco láser contiene varias células sanguíneas. En la publicación US 6 681 133 B2 se describe un procedimiento para la formación de sistemas ópticos para investigaciones espectroscópicas in vivo de la piel. En este caso se diferencia entre señales Raman de la superficie de la piel y señales Raman de tejidos de la piel más profundos para posicionar el foco del sistema óptico en la capa de la piel deseada. El gran inconveniente de este procedimiento consiste en la duración de la medición Raman, que no posibilita una retroalimentación en tiempo real para mediciones in ovo.
En las publicaciones US 8159662 B2 y US 8306780 B2 se dan a conocer sistemas de espectroscopía Raman con enfoque automático integrado. Ambas aplicaciones están concebidas para teledetecciones, la distancia focal asciende hasta varios metros y el enfoque automático se basa en la medición de distancia.
En las publicaciones Lee, Ji, Lee: Micro-PIV measurements of blood flow in extraembryonic blood vessels of chicken embryos, Physiol. Meas. 28 (2007) 1149-1162 y Kloosterman, Hierck, Westerweel, Poelma: Quantification of Blood Flow and Topology in Developing Vascular Networks, PlosONE (2014) 9(5): e96856 se publica una detección de flujo in ovo por medio de velocimetría (en inglés Particle Image Velocimetry (PIV)) bajo un microscopio (micro-PIV), en el que se registran imágenes de glóbulos rojos fluidos con una cámara CMOS de alta velocidad para poder valorar el flujo sanguíneo en vasos sanguíneos extraembrionarios de embriones de pollo. Con este procedimiento no se puede obtener una información volumétrica para realizar un enfoque automático en el vaso sanguíneo.
En el estado de la técnica citado a continuación se indican procedimientos ópticos en el sector biomédico, que se utilizan para
- una detección de flujo sanguíneo por medio de análisis de imagen diferencial para obtener vasos irrigados y propiedades de fluidez, por ejemplo, en la retina, y
- una localización 3D de vasos sanguíneos para la extracción de sangre.
Para el análisis del flujo de partículas se utilizan procedimientos de holografía láser. Aunque un video holográfico puede proporcionar la información 4D total, como se describe en la publicación Meinecke, Sabitov, Sinzinger: Information extraction from digital holograms for particle flow analysis, Applied Optics 49(13), 2010, este procedimiento no se ha utilizado nunca para controlar un sistema de enfoque automático, lo que se puede atribuir principalmente a la complejidad del hardware necesario y a los elevados costes.
Todos los procedimientos descritos utilizan las diferencias temporales entre secuencias de imágenes, efectuándose la iluminación por medio de láser. Estos no se basan en una imagen de la cámara simple con iluminación con lámparas o LED. La aplicación de este procedimiento aún no se ha descrito nunca para un muestreo simple de vasos sanguíneos ni para un enfoque automático en combinación procedimientos espectroscópicos.
Es destacable que asimismo el ultrasonido de frecuencia elevada (>20 MHz) posibilita la imagen de flujo sanguíneo microvascular, como se describe en la publicación Goertz, Yu, Kerbel, Burns, Foster: High-frequency 3-D color-flow imaging of the microcirculation, Ultrasound Med Biol. 2003 Jan; 29 (1): páginas 39 - 51. Las imágenes de flujo 3D de volumen de tejidos con una dimensión de hasta 10 mm lateralmente y 5 mm de profundidad se utilizan para una variedad de cuestiones científicas y clínicas. Las velocidades de flujo sanguíneo que se pueden medir por estos sistemas se sitúan en el intervalo de <1 mm/s a 25 mm/s para vasos sanguíneos con diámetros entre 30 pm -100 pm. La aplicación de la imagen de moteado dinámica (en inglés Speckle Flow Imaging (SFI)) sobre la imagen ultrasónica posibilita la representación de un flujo sanguíneo lento en la microcirculación con alta resolución espacial, como se describe en la publicación Aoudi, Liebgott, Needles, Yang, Foster, Vray: Estimation methods for flow imaging with high frequency ultrasound, Ultrasonics 44 (2006), páginas 135-140. No obstante, la imagen ultrasónica en todas sus realizaciones no es aplicable para el análisis in ovo, ya que es necesario un contacto directo entre la superficie y el transductor/sonda, y, por lo tanto, no es comparable con la espectroscopía Raman sin contacto simultánea.
En las publicaciones Nakamachi: Development of Three Dimensional Blood Vessel Search System by Using on Stereo and Autofocus Hybrid Method, 33rd Annual International Conference of the IEEE EMBS, 2011 y Nakamachi, Morita, Mizuno: Development of Automatic 3D Blood Vessel Search and Automatic Blood Sampling System by Using Hybrid Stereo-Autofocus Method, International Journal of Optics Vol.2012, se describe respectivamente un sistema 3D para la localización de vasos sanguíneos, que se implementa en un sistema de muestras sanguíneas automático. El sistema 3D utiliza imagen de infrarrojo cercano y el procedimiento híbrido estéreo y enfoque automático para determinar la posición de vasos sanguíneos en tres dimensiones. El enfoque automático se basa en la nitidez de imágenes que se registran en transmisión. La exactitud de la determinación de posición de vasos sanguíneos asciende a 100 pm para vasos sanguíneos con diámetros de 500 pm -1000 pm. Esta aplicación no es utilizable in ovo: la medición se efectúa en transmisión, de modo que la localización de vasos sanguíneos se efectúa en base a las imágenes que se generan mediante la absorción de hemoglobina en la zona NIR.
En la publicación WO 2016/000678 A1 se describen un dispositivo y un procedimiento para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados por espectroscopía Raman. La representación esquemática del dispositivo 20 para la determinación del sexo de huevos de ave fecundados e incubados 1 mostrada en una Fig. 1 comprende al menos
- una unidad de almacenamiento de huevos 16,
- una instalación de evaluación de posición de vaso sanguíneo 14, que está unida a la unidad de almacenamiento de huevos 16,
- una instalación de radiación 19 con luz 10a de una fuente lumínica 10 para la identificación de al menos un vaso sanguíneo 21, irradiando la instalación de radiación 19 al menos una parte del huevo 1, - un detector 13 para la luz 10b para la identificación de vasos sanguíneos 21, estando unido el detector 13 a la instalación de evaluación de posicionamiento de vasos sanguíneos 14, formando la instalación de radiación 19 y el detector 13 al menos un sistema de visión 19, 13,
- una unidad de generación de orificios 67 para la creación de un orificio 2 en la cáscara 28 en la zona próxima del vaso sanguíneo 21 identificado,
- un dispositivo 5 para la introducción de luz láser 3a en el orificio creado 2 del huevo 1 y para el registro de la radiación dispersa Raman 7, que está unido al menos con
- una fuente de láser 3 que emite la luz láser 3a, estando orientada la luz láser 3a sobre al menos un vaso sanguíneo 21,
- un espectrómetro 8 para la absorción de la radiación dispersa Raman 7 de la sangre del vaso sanguíneo 21 irradiado con luz láser 3a a través de al menos un conducto 4b, y - una unidad de control 18 para el posicionamiento xyz del dispositivo 5 en un orificio 2 introducido en el huevo 1,
- una unidad de evaluación para la determinación del sexo 9, que está unida al espectrómetro 8 y a la instalación de evaluación de posicionamiento de vasos sanguíneos 14 e indica el sexo del huevo de ave incubado 1 a partir de la radiación dispersa Raman 7 del espectrómetro 8 elaborada registrada.
La unidad de generación de orificios 67 en forma de un láser o de una instalación para la perforación mecánica está unida a la instalación de evaluación de posición de vasos sanguíneos 14 a través de un conducto 68.
El sistema de visión 19, 13 presenta una instalación para la determinación de la posición de los vasos sanguíneos 21 con un detector 13.
El procedimiento correspondiente a la Fig. 1 para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados por espectroscopía Raman, siendo móvil en el huevo 1 el embrión, incluyendo las estructuras extraembrionarias, y no estando este aún fijado a la cáscara 28 en el momento de una medición de la radiación dispersa Raman 7, presenta los siguientes pasos:
- control de la evolución a lo largo del tiempo de incubación hasta la formación de al menos un vaso sanguíneo identificable 21,
- creación de un orificio 2 en la cáscara 28 en la zona próxima del vaso sanguíneo identificado 21 por medio de una unidad de generación de orificios 67,
- búsqueda de vasos sanguíneos 21 que se forman en el huevo 1 por medio de un sistema de visión 19, 13, y una iluminación coaxial o lateral con luz 10a del intervalo de longitud de onda visible,
- posicionamiento de al menos un vaso sanguíneo 21 en el foco láser 30 de una fuente de radiación láser 3 mediante movimiento del huevo 1 o movimiento de un objetivo 6 de un dispositivo 5 para la introducción de la radiación láser 3a y el registro de la radiación dispersa Raman 7,
- registro de la radiación dispersa Raman 7 del vaso sanguíneo irradiado 21,27 por medio del dispositivo 5 para la introducción de la radiación láser 3a y para el registro de la radiación dispersa Raman 7, pudiéndose evitar durante la medición un movimiento del vaso sanguíneo 21 fuera del foco 30 mediante seguimiento por medio del sistema de visión 19, 13,
- evaluación de la radiación dispersa Raman 7 y determinación del sexo del embrión en una unidad de evaluación 9,
- indicación del sexo del embrión en el huevo de ave 1.
Al sistema de visión 19, 13 pertenecen aún un filtro verde 11 y una lente 12. Por lo demás están presentes líneas de control 15 y 17, que conducen a la instalación de evaluación de posicionamiento de vasos sanguíneos 14.
Para el control de la evolución a lo largo del tiempo de los procesos en la incubación del huevo de ave 1 se emplea luz blanca o azul y/o verde de la fuente lumínica 10 de la instalación de radiación 19 del sistema de visión 19, 13 como luz 10a del intervalo de longitud de onda visible. En especial se emplea luz del intervalo de longitud de onda verde.
En general, el procedimiento descrito para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados 1 por espectroscopía Raman se realiza a partir del tercer día de incubación.
En la determinación previa del sexo, según la Fig. 1 el foco láser 30 se orienta a los vasos sanguíneos 21. A continuación se selecciona manualmente un vaso sanguíneo 21 con diámetro lo más elevado posible y se centra en el plano horizontal. De este modo se asegura que el láser de excitación Raman 3 se encuentre en la zona de trabajo. Tras la apertura de la cáscara 28 del huevo 1, debido a las propiedades características del huevo de gallina 1 se llega a un descenso de la albúmina y del saco vitelino y, por consiguiente, de los vasos sanguíneos 21 en la zona embrionaria, con lo cual el vaso sanguíneo 21 se desplaza fuera del foco láser 30 del láser de excitación 3. Para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave 1 fecundados e incubados por espectroscopía Raman es necesario que el foco láser 30 del láser de excitación 3 se posicione en el vaso sanguíneo embrionario 21 con un diámetro de 20 gm a 200 gm. No obstante, debido a los movimientos del vaso sanguíneo 21 en sentido x, y, z se puede dar el hecho de que el vaso sanguíneo seleccionado 21 abandone esta posición nominal del foco láser 30 durante la duración de las mediciones espectroscópicas. De este modo, la señal Raman 7 de la sangre reflejada a medir se debilita, lo que puede conducir a errores en la determinación del sexo. El descenso previo se produce mediante la difusión del aire de la cámara de aire de huevo de gallina. Por lo tanto, hasta el momento es siempre necesario mantener manualmente de manera continua el foco láser 30 del láser de excitación 3 en el vaso sanguíneo 21 descendente, lo que requiere relativamente mucho tiempo.
Además, en la determinación de la posición de un vaso sanguíneo 21 en el huevo 1 por medio de imagen, el contraste se reduce debido a factores de interferencia, como por ejemplo polvo de la cáscara, reflejo especular de la superficie de la capa de albúmina, o el movimiento de flujo de eritrocitos 36.
Por el documento DE 102010006161 B3 es conocido un procedimiento y un dispositivo para la determinación del sexo de huevos de ave fecundados y no incubados, presentando un huevo una cáscara de huevo, una yema de huevo rodeada de la cáscara de huevo y otras envolturas del huevo y un disco germinal asignado a la yema de huevo, y conduciéndose una sonda para la medición de un espectro a través de un orificio a través de la cáscara de huevo en dirección al disco germinal con células del disco germinal. En este caso se realizan los pasos de posicionamiento de la sonda en la zona del disco germinal, caracterización espectroscópica in ovo de las células del disco germinal, identificación del sexo mediante una clasificación automática de los espectros.
Y también es conocido por el documento DE 102007013107 A1 un procedimiento para la determinación del sexo de aves, en el que se analiza con luz material celular relevante respecto al ADN del ave a determinar en su sexo y se miden las vibraciones moleculares, de modo que se registra el espectro de vibraciones moleculares producido mediante la luz y se compara con estructuras de ADN determinadas, así como específicas del sexo, de los espectros de referencia que representan el tipo de ave a analizar, y a partir de esta comparación espectral se adopta una asignación de sexo del ave basada en el fundamento del contenido en ADN del material celular.
Por lo tanto, la invención toma como base la tarea de indicar un procedimiento y un dispositivo para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en vasos sanguíneos para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave, que están configurados convenientemente de modo que en primer lugar se posiciona el foco del rayo láser del láser de excitación de manera constante y con precisión elevada en el vaso sanguíneo que modifica su posición para la reflexión a medir, y en segundo lugar se dirige el foco al vaso sanguíneo que modifica su posición durante la medición óptica.
La tarea se soluciona mediante las características de las reivindicaciones 1 y 13. El procedimiento para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en un vaso sanguíneo para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave, siendo móviles en el huevo los vasos sanguíneos, incluyendo el embrión, y no estando estos aún fijados a la cáscara en el momento de una medición óptica de la radiación retrodispersada, en la parte de caracterización de la reivindicación 1, presenta los siguientes pasos:
- selección de un vaso sanguíneo en el huevo perforado e incubado por medio de un procedimiento de evaluación basado en el contraste, bajo al menos una iluminación de un entramado de vasos sanguíneos con radiación al menos en la zona de longitud de onda verde, por medio de un dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- producción del foco láser para el láser de excitación y de un foco para una cámara en el vaso sanguíneo seleccionado a través del orificio orientado al vaso por medio del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación de retrodispersión y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- ajuste del foco láser dentro del vaso sanguíneo seleccionado por medio del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación de retrodispersión y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, por medio de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos en base a las modificaciones de intensidad It-i(x), It(x) que se presentan en cada caso en dos imágenes registradas sucesivamente de modo concomitante a consecuencia del movimiento de eritrocitos dentro del vaso sanguíneo seleccionado, como valores de intensidad en la posición del píxel x respecto al tiempo t-1 y t, y seguimiento del foco láser y del foco de la cámara en el descenso de la superficie del entramado de vasos sanguíneos y la capa de albúmina,
- compensación de movimientos horizontales x, y producidos del vaso sanguíneo seleccionado por medio del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- realización de mediciones ópticas por medio del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2.
Para la realización del procedimiento, como radiación retrodispersada a medir, reflejada a partir del vaso sanguíneo, se puede seleccionar una radiación dispersa Raman y/o una radiación de fluorescencia retrodispersada para las mediciones ópticas.
En el procedimiento se realizan los siguientes pasos:
- introducción de un orificio en la cáscara por medio de una unidad de generación de orificios y posicionamiento de los vasos sanguíneos en la zona del orificio,
- búsqueda de los vasos sanguíneos que se forman en el huevo por medio de un sistema de visión constituido al menos por una instalación de radiación y por un detector y una iluminación coaxial o lateral con luz del intervalo de longitud de onda visible,
- posicionamiento de al menos el vaso sanguíneo en el foco láser del láser de excitación mediante movimiento del huevo por medio de una unidad de posicionamiento controlada o mediante un movimiento total de un dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, o mediante un cambio de al menos un objetivo o mediante un objetivo con aumento variable en el dispositivo para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- registro de la radiación retrodispersada del vaso sanguíneo irradiado por medio del dispositivo para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, pudiéndose evitar durante el registro de la radiación retrodispersada un movimiento del vaso sanguíneo fuera del foco láser y del foco de la cámara mediante seguimiento del huevo por medio de una unidad de posicionamiento controlada y/o mediante un movimiento total del dispositivo para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, o tras un cambio de al menos un objetivo o tras un cambio de aumento respectivamente de uno de los objetivos en el dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- evaluación de la radiación retrodispersada y determinación del sexo del embrión en una unidad de evaluación,
- indicación del sexo del embrión en el huevo de ave,
realizándose en la unidad de evaluación un procedimiento basado en el contraste para la determinación de una superficie de imagen en posición de análisis total SAF1 con el entramado de vasos sanguíneos a través de medios técnicos de programa en un primer algoritmo, y realizándose en la unidad de evaluación, a través de medios técnicos de programa en un segundo algoritmo, un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos para el ajuste del foco láser por medio del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2 sobre una superficie de imagen reducida RBF en la superficie de imagen en posición de absorción SAF2 con el vaso sanguíneo seleccionado, comparándose en el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos los contenidos en intensidad It-i(x), It(x) de al menos dos imágenes sucesivas de la superficie de imagen reducida al vaso sanguíneo seleccionado RBF - ROI - dentro de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2, formándose de diferente manera los contenidos de intensidad It-1 (x), It(x) de los movimientos de eritrocitos que se reflejan respectivamente en la superficie de imagen RBF, y ajustándose el foco láser del láser de excitación y el foco de la cámara unido de manera coincidente con el foco láser por medio del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, en una superficie de imagen RBF reducida asignada al vaso sanguíneo seleccionado de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2, encontrándose el foco láser y el foco en el paso final siempre dentro del vaso sanguíneo seleccionado.
Como radiación se puede emplear una radiación del intervalo de longitud de onda visible o del intervalo de longitud de onda verde de la fuente de radiación de la instalación de radiación del sistema de visión para el control de la evolución a lo largo del tiempo de los procesos en la incubación del huevo de ave.
El procedimiento de medición óptico para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados se puede realizar a partir del tercer día de incubación.
Para la realización del procedimiento se pueden emplear los siguientes parámetros para las mediciones ópticas de la radiación dispersa Raman retrodispersada por el vaso sanguíneo:
- longitudes de onda de excitación de la radiación láser del láser de excitación (3): > 600 nm (por ejemplo, láser HeNe 633 nm, láser de cuerpo sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd: YAG 1064 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo 785 nm),
- acoplamiento de la radiación láser directamente con espejos y/o con fibras ópticas,
- mediciones de radiación dispersa Raman bajo utilización de dispositivos ópticos con gran apertura numérica, como objetivos de microscopio o una sonda de fibra,
- desacoplamiento directo de la radiación dispersa Raman recogida por medio de espejos respecto a un espectrómetro o por medio de transporte a través de fibras ópticas,
- empleo de un espectrómetro en forma de espectrómetro dispersivo y espectrómetro de transformada de Fourier.
Por lo demás se pueden emplear los siguientes parámetros para las mediciones ópticas de radiación de fluorescencia retrodispersada por el vaso sanguíneo:
- longitudes de onda de excitación de la radiación láser (3a) del láser de excitación (3): > 400 nm (por ejemplo, láser HeNe 633 nm, láser de cuerpo sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd: YAG 532 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo 785 nm),
- acoplamiento de la radiación láser directamente con espejos y/o con fibras ópticas,
- mediciones de radiación de fluorescencia bajo utilización de dispositivos ópticos, como objetivos de microscopio o una sonda de fibra,
- desacoplamiento directo de la radiación de fluorescencia recogida por medio de al menos un espejo o por medio de transporte a través de fibras ópticas,
- empleo de un detector.
Durante el proceso de posicionamiento del huevo de ave, permanentemente se pueden registrar y alimentar a una evaluación valores de medida de mediciones ópticas, efectuándose una clasificación automática de la radiación retrodispersada por medio de la huella dactilar espectral de la sangre.
Para la realización de las mediciones ópticas, el huevo de ave se puede sensibilizar en los polos.
A tal efecto se puede formar un orificio en la zona del polo agudo orientado hacia arriba con un tamaño de perforación hasta 18 mm después de 48 horas por medio de la unidad de generación de orificios.
También se puede formar un orificio en el polo romo del huevo orientado hacia arriba con un diámetro hasta 18 mm, preferentemente entre 8 mm y 12 mm, por medio de la unidad de generación de orificios.
El procedimiento de medición óptico se puede realizar como procedimiento de medición in ovo para la determinación del sexo de huevos de ave fecundados e incubados por espectroscopía Raman a partir del tercer día de incubación.
El dispositivo para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en un vaso sanguíneo sirve para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave, siendo móviles en el huevo los vasos sanguíneos, incluyendo el embrión, y no estando estos aún fijados a la cáscara en el momento de una medición óptica de la radiación retrodispersada, bajo utilización del procedimiento citado anteriormente, comprendiendo el dispositivo, según la parte de caracterización de la reivindicación 13, al menos
- una instalación de soporte para el huevo provisto de un orificio, estando almacenados los huevos respectivamente con un polo hacia arriba,
- una instalación de iluminación para la iluminación de la superficie que se encuentra en el huevo con capa de albúmina y con entramado de vasos sanguíneos,
- una unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa para un dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- el dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, que contiene por lo menos
- al menos un objetivo de medición,
- un divisor de radiación,
- una cámara con al menos un objetivo de cámara,
sirviendo el dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2 para la modificación de tamaños de representación entre una imagen de SAF1 y una imagen de RBF en la superficie de posición de análisis SAF2 seleccionada, refiriéndose la imagen de la superficie de posición de análisis SAF1 a la superficie de imagen total del entramado de vasos sanguíneos y la imagen en la superficie de posición de análisis SAF2 a la superficie de imagen reducida del vaso sanguíneo seleccionado,
- una instalación de evaluación para espectros ópticos,
- una unidad de evaluación que comprende al menos
- una línea de conexión con la cámara,
- una línea de conexión con la instalación de soporte,
- una línea de conexión con la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa,
- una línea de conexión con la instalación de evaluación para mediciones ópticas,
la unidad de evaluación medios técnicos de programa para la realización de un procedimiento basado en el contraste, que se refiere a una superficie de imagen total de la superficie de imagen en posición de análisis SAF1 con el entramado de vasos sanguíneos, y de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de
eritrocitos, que se refiere a la superficie de imagen reducida RBF de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada con un vaso sanguíneo seleccionado del entramado de vasos sanguíneos.
El dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, puede contener al menos:
un primer objetivo de medición para la realización de un procedimiento de evaluación basado en el contraste y un segundo objetivo de medición para la realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, introduciéndose alternantemente los objetivos de medición en la trayectoria del haz de la cámara en cada caso para la realización de ambos procedimientos.
En lugar de ambos objetivos de medición se puede introducir un objetivo con aumento variable en la trayectoria del haz de la cámara, de modo que no es necesario un desplazamiento de objetivos.
El dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2 puede contener también:
un primer objetivo de cámara para la realización de un procedimiento de evaluación basado en el contraste y un segundo objetivo de cámara para la realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, introduciéndose alternantemente los objetivos de cámara en la trayectoria del haz de la cámara en cada caso para la realización de ambos procedimientos.
En lugar de ambos objetivos de cámara se puede introducir un objetivo con aumento variable en la trayectoria del haz de la cámara, de modo que no es necesario un desplazamiento de objetivos.
El dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, está unido a la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa, pudiendo controlar la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa el dispositivo óptico en sentido x, y, z.
La secuencia total de ajuste del foco láser del láser de excitación está constituida por los siguientes pasos: paso 1: posicionamiento de un huevo en una instalación de soporte,
paso 2 : introducción de un orificio/una perforación en la cáscara directamente a través del entramado de vasos sanguíneos o en una zona fuera del entramado de vasos sanguíneos, encontrándose el embrión con el entramado de vasos sanguíneos extraembrionario siempre en el punto más elevado del interior del huevo a partir del tercer día de incubación debido a las diferencias de densidad en el huevo, paso 3: posicionamiento del entramado de vasos sanguíneos en la zona de la perforación mediante movimiento/giro del huevo para el caso de generación de orificio en la cáscara fuera del entramado de vasos, hasta que el orificio generado forma el punto más elevado del huevo.
Paso 4: iluminación del embrión y del entramado de vasos sanguíneos por medio de radiación en el intervalo de longitud de onda visible o en el intervalo de longitud de onda verde bajo empleo de un sistema de visión.
Paso 5: determinación del plano del foco:
- mediante utilización de un aumento de objetivo adaptado, efectuándose una adaptación al diámetro de orificio,
- para poder determinar el plano zfocal más agudo dentro del vaso sanguíneo, por medio de motores de velocidad gradual de una unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa/control se recorre una zona definida de zmax < zfocal < zmin, siendo zmin la distancia mínima y zmax la distancia máxima entre objetivo y vaso sanguíneo,
- determinación del máximo por medio de un indicador de nitidez basado en el contraste con ayuda de un procedimiento basado en el contraste, por ejemplo, por medio de una representación de variación “varianza” con valor de nitidez de la varianza:
generándose, si es necesario, un nivelado de la evolución del indicador de nitidez para la minimización de las influencias interferentes ocasionadas mediante ruido, por ejemplo, con un filtro de Savitzky-Golay, y una limitación de la zona definida para el máximo local zfocal mediante formación de la primera derivada de la función del valor de nitidez de la varianza:
- posicionamiento del eje z a través de un movimiento absoluto respecto al punto zfocal determinado y - grabación de imagen del entramado de vasos total de la zona definida por medio de una cámara con un objetivo determinado.
Paso 6 : selección de vasos sanguíneos mediante evaluación de la matriz de imagen:
- homogeneización/eliminación del fondo (todos los componentes del huevo que no pertenecen al entramado de vasos extraembrionario, por ejemplo, saco vitelino, embrión con corazón) por medio de algoritmos matemáticos, por ejemplo, por medio de un algoritmo de Rolling-Ball,
- maximización del contraste, por ejemplo, mediante transformación lineal de la función de escala de grises, - segmentación de vasos sanguíneos, por ejemplo, constituida por los pasos
- determinación del valor umbral,
- eliminación de partículas por medio de erosión, y
- cierre morfológico,
- extracción del vaso sanguíneo y determinación de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 para la subsiguiente medición óptica:
determinación de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 mediante formación del centro de gravedad geométrico del objeto con la mayor superficie A, que se obtiene tras erosión múltiple hasta el paso de iteración i-1 (si Amax= 0 en el caso de variable de control i), entendiéndose por erosión la operación morfológica en el procesamiento de imagen, en la que se desgastan píxeles por un elemento estructural. Paso 7: adaptación del aumento de objetivo en el enfoque automático y el seguimiento del foco láser en la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada, a modo de ejemplo mediante un cambio de objetivo.
Paso 8 : enfoque automático y seguimiento de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada en el vaso sanguíneo:
subpaso 8.1: nueva determinación del plano focal correspondientemente al paso 5 solo si, debido a un fuerte descenso de los vasos sanguíneos durante el cambio de objetivo, el foco del objetivo del láser de excitación para la medición óptica no coincide con el foco del objetivo para la selección de vasos sanguíneos, es decir, si el foco láser y el foco de la cámara no coinciden.
Subpaso 8.2: posicionamiento exacto del eje z en el vaso sanguíneo mediante aplicación del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos en base a la modificación de la intensidad de píxel mediante modificación de la imagen debido al flujo sanguíneo modificado -a continuación llamado procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitosdefiniéndose el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos como diferencia de las intensidades de píxel de ambas imágenes registradas sucesivamente de un vaso sanguíneo.
En este caso se efectúa una
- selección de una sección de imagen reducida RBA, o bien ROI (en inglés region of interest) en un vaso sanguíneo a partir de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada.
Es necesario un posicionamiento exacto de la sección de imagen reducida RBA en la imagen del vaso sanguíneo total por medio del procedimiento de imagen diferencial, ya que un procedimiento basado en el contraste elabora el máximo del valor de nitidez para la imagen total con la superficie de imagen en posición de análisis SAF1, pero no en sí mismo el foco láser dentro del vaso sanguíneo.
La determinación del punto focal exacto zfocal_exacto funciona de la siguiente manera:
- la zona recorrida de la superficie de imagen reducida RBA se determina a partir del punto zfocai conocido y las modificaciones esperadas Azmax y Azmin, que se producen mediante el descenso del embrión dentro del huevo y el enfoque impreciso basado en el contraste en el vaso sanguíneo:
zmax-exacto = zfocal Azmax y zmin-exacto = zfocal Azmin,
- nivelado del valor de nitidez de la imagen diferencial preferentemente mediante un valor medio causal móvil para compensar la pulsación de eritrocitos en los vasos sanguíneos,
- determinación del máximo del valor de nitidez por medio de imagen diferencial,
- posicionamiento exacto del eje z en el vaso sanguíneo.
Adicionalmente se requiere un desplazamiento del máximo determinado zfocal_exacto para garantizar que el regulador de dos posiciones siempre permanezca continuamente detrás de la unidad de posicionamiento: zDesplazamiento = zfocal_exacto — AzDesplazamiento
Procedimiento de imagen diferencial: momento t = 0 ^ curva DifR
Por medio de un movimiento absoluto se inicia el punto de partida zDesplazamiento para la regulación. Debido al descenso del embrión en el huevo, la curva DifR-t se desplaza con tiempo t creciente,
- mantenimiento de la posición en el vaso sanguíneo por medio de una regulación, por ejemplo, una regulación de dos posiciones de la unidad de posicionamiento.
Subpaso 8.3: compensación de los movimientos en el plano x, y, por ejemplo, mediante una comparación de patrones.
En este caso se utiliza la imagen de eritrocitos fluidos de un vaso sanguíneo dentro de la superficie de imagen reducida RBA - Roi ("region of interest") - y su evaluación a través del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos de dos imágenes sucesivas modificadas en la intensidad de píxeles debido al flujo sanguíneo, es decir, al movimiento de eritrocitos, modificándose la intensidad de píxeles individuales para mantener un seguimiento del foco láser del láser de excitación y del foco de la cámara en el vaso sanguíneo que modifica su posición. De este modo, la diferencia de ambas imágenes subsiguientes consideradas en la evaluación, debido al movimiento de los eritrocitos, es incluso parte del indicador de nitidez para el vaso sanguíneo modificado en posición, ya que el movimiento de eritrocitos en el vaso sanguíneo se traduce en intensidades modificadas de píxeles de las imágenes a elaborar consideradas.
El indicador de nitidez en base al procedimiento de imagen diferencial del movimiento de eritrocitos favorece el posicionamiento del foco láser del láser de excitación en el vaso sanguíneo de un huevo de ave embrionario con precisión elevada y desviación estándar sensiblemente menor en comparación con algoritmos de evaluación basados en el contraste.
El procedimiento se distingue además por que solo es necesaria la sección de imagen reducida RBA, con lo cual se reduce considerablemente el tiempo de cálculo y se permite por primera vez un seguimiento in ovo en tiempo real.
Otras ventajas de este procedimiento consisten en que se pueden efectuar
- una estructura sencilla con solo una cámara,
- mediciones confocales y no confocales,
- una medición en vasos sanguíneos de todos los tamaños con la condición de eritrocitos que se mueven en el vaso sanguíneo.
En las demás reivindicaciones subordinadas se indican perfeccionamientos y otras configuraciones de la invención.
La invención se explica más detalladamente por medio de un ejemplo de realización en base a varios dibujos. Muestra:
la Fig. 1 una representación esquemática del dispositivo para la determinación del sexo de huevos de ave fecundados e incubados según el estado de la técnica,
la Fig. 2 una representación esquemática de la estructura de un dispositivo para el ajuste del foco láser de un láser de excitación en vasos sanguíneos para mediciones ópticas, preferentemente para mediciones por espectroscopía Raman en huevos de ave abiertos para la determinación del sexo de huevos de ave, mostrando la Fig. 2a una representación ampliada del dispositivo óptico para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
la Fig. 3 una representación esquemática de una parte de un huevo con el foco de la cámara en el vaso sanguíneo seleccionado en el huevo abierto, mostrando la Fig. 3a el seguimiento del foco de la cámara en un primer descenso de la capa de albúmina, incluyendo el entramado de vasos sanguíneos, en el sentido del eje z, la Fig. 3b el seguimiento del foco de la cámara en el caso de un descenso ulterior de la capa de albúmina, incluyendo el entramado de vasos sanguíneos, en el sentido del eje z, y la Fig. 3c una representación ampliada según la Fig. 3 del foco del objetivo de cámara y del foco láser del láser de excitación,
la Fig. 4 una representación esquemática de una superficie en posición de análisis SAF1 del entramado de vasos sanguíneos, incluyendo el embrión, para la utilización del procedimiento de evaluación basado en el contraste, incluyendo la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada,
la Fig. 5 una representación esquemática de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada y la superficie de imagen reducida RBF (ROI) en el vaso sanguíneo para la utilización del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, la Fig. 6 una representación del valor de nitidez normalizado en función del movimiento relativo del eje z para un procedimiento de evaluación basado en el contraste y para un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos,
la Fig. 7 una representación ampliada, adaptada a la Fig. 6 , del foco láser y del foco del objetivo de cámara con relación a la Fig. 3c,
la Fig. 8 una representación esquemática de los pasos de procedimiento a realizar en el ordenador de selección y posición SPR,
la Fig. 9 una representación esquemática de los pasos de procedimiento a realizar para la selección de un vaso sanguíneo,
la Fig. 10 una representación esquemática de pasos en detalle para la selección del vaso sanguíneo, la Fig. 11 una representación esquemática de pasos de procedimiento para el posicionamiento y el mantenimiento del vaso sanguíneo respecto al eje z,
la Fig. 12 una representación esquemática de pasos de procedimiento para el posicionamiento y el mantenimiento del vaso sanguíneo seleccionado en relación con el enfoque sobre los eritrocitos para la compensación en el plano horizontal x, y en el caso de movimiento del vaso sanguíneo respecto a los ejes x, y,
la Fig. 13 representaciones de curvas del valor de nitidez en un procedimiento de evaluación basado en el contraste y la primera derivada del valor de nitidez para la limitación de la zona Zfocal en relación con la distancia del eje z con los dos puntos ajustados Zmin y Zmax en relación con el foco Zfocal, y la Fig. 14 representaciones de curvas del valor de nitidez en un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos en relación con la distancia del eje z con los dos puntos ajustados Zmin_exacto y Zmax_exacto y el punto ajustado Zpesplazamiento y la diferencia de desplazamiento AZmax
A continuación, se consideran conjuntamente la Fig. 2 y la Fig. 2a.
En la Fig. 2 se muestra una representación esquemática de la estructura de un dispositivo 40 para el ajuste del foco láser 30 de un láser de excitación 3 en vasos sanguíneos 27, 21 para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave 1, explicándose a continuación mediciones por espectroscopía Raman como ejemplo de realización de las mediciones ópticas.
En la Fig. 2a se muestra una representación ampliada según la Fig. 2 del dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2.
El embrión 22, incluyendo los vasos sanguíneos 27, 21, es móvil en el huevo 1 y aún no está fijado a la cáscara 28 en el momento de una medición óptica de la radiación dispersa Raman.
En la Fig. 2, el dispositivo 40 comprende al menos
- una instalación de soporte 16 para el huevo 1 provisto de un orificio 2 , estando los huevos 1 almacenados respectivamente con el polo agudo 24 hacia arriba,
- una instalación de iluminación 10 para la iluminación de la superficie que se encuentra en el huevo 1 con capa de albúmina 26 y con entramado de vasos sanguíneos 27,
- un primer objetivo de medición 61 y un segundo objetivo de medición 62 introducible en la trayectoria del haz 42,
- un objetivo de cámara 38,
- un divisor de radiación 23 que está dispuesto entre el objetivo de medición 61 y el objetivo de cámara 38, - una cámara 13,
- una matriz CCD 29 en la cámara 13,
estando previstos el primer objetivo de medición 61 para la realización de un procedimiento de evaluación basado en el contraste y el segundo objetivo de medición 62 para la realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, introduciéndose los objetivos de medición 61,62 alternantemente en la trayectoria del haz 42 de la cámara 13 y presentando el segundo objetivo de medición 62 una distancia focal más corta, y de este modo un aumento frente al primer objetivo de medición 61,
- una instalación de evaluación 9 para mediciones por espectroscopía Raman,
- una unidad de evaluación 31 que comprende al menos
- una línea de conexión 32 con la cámara 13 con matriz CCD 29,
- una línea de conexión 33 con la instalación de soporte 16,
- una línea de conexión 34 con la fuente de radiación 10,
- una línea de conexión 35 con la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa 18,
- una línea de conexión 36 con la instalación de evaluación 9 para mediciones por espectroscopía Raman, la unidad de evaluación 31 medios técnicos de programa para la realización de un procedimiento basado en el contraste, que se refiere, según la Fig. 3 y la Fig. 4, a una superficie de imagen en posición de análisis total SAF1 65 con el entramado de vasos sanguíneos 27, y para la realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, que se refiere, según la Fig. 3 y la Fig. 5, a una superficie de imagen reducida RBF 41 de la superficie de imagen en posición de análisis SAF239 en un vaso sanguíneo seleccionado 21 del entramado de vasos sanguíneos 27.
En la Fig. 2, el dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, puede contener al menos
- ambos objetivos de medición 61,62,
- el divisor de radiación 23,
- el objetivo de cámara 38,
- la cámara 13 con una matriz CCD 29,
- el colimador 37 y
- el revólver 44 como cambiador de objetivo para el cambio de ambos objetivos de medición 61, 62 que presentan diferente distancia focal,
estando unido firmemente el dispositivo óptico 5 a la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa 18.
En la Fig. 2a puede presentar un dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, que puede contener al menos en la Fig. 2
- el objetivo de medición 61,
- el divisor de radiación 23,
- el primer objetivo de cámara 38 y un segundo objetivo de cámara 63 introducible en la trayectoria del haz 42,
- la cámara 13 con una matriz CCD 29,
- el colimador 37 y
- el revólver 64 como cambiador de objetivo para el cambio de ambos objetivos de cámara 38, 63 que presentan diferente distancia focal,
estando unido firmemente el dispositivo óptico 5 a la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa 18.
Ya que para la puesta en práctica del procedimiento es necesaria una modificación de distancia focal del objetivo de medición 61 o del objetivo de cámara 38, en lugar de los objetivos 62 y 63 variables introducidos, también los objetivos 61 y 38 pueden estar formados con distancias focales diferentes. Es esencial que en el cambio de procedimiento de evaluación basado en el contraste al procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos se empleen objetivos modificados en distancia focal.
En lugar de ambos objetivos de medición 61,62, en la trayectoria del haz 42 de la cámara 13 se puede introducir un objetivo con aumento variable, de modo que no son necesarios un segundo objetivo de medición ni un desplazamiento de objetivos de medición.
En lugar de ambos objetivos de cámara 38, 63, en la trayectoria del haz 42 de la cámara 13 se puede introducir un objetivo con aumento variable, de modo que no son necesarios un segundo objetivo de cámara ni un desplazamiento de objetivos de cámara.
En la Fig. 3 se muestran varias representaciones esquemáticas del foco 43 de la cámara 13 a la misma distancia del foco láser 30 en el vaso sanguíneo seleccionado 21 del huevo abierto 1, mostrando la Fig. 3a el seguimiento del foco 43 y, por lo tanto, del foco láser 30 en un primer descenso de la capa de albúmina 26, incluyendo el entramado de vasos sanguíneos 27, en el sentido del eje z, la Fig. 3b el seguimiento del foco 43 y, por lo tanto, del foco láser 30 en un descenso ulterior de la capa de albúmina 26, incluyendo el entramado de vasos sanguíneos 27, en el sentido del eje z, y la Fig. 3c una representación ampliada según la Fig. 3 del foco 43 y del foco 30 igualmente asignado. En este caso se asignan la superficie de imagen en posición de análisis reducida SAF2 al signo de referencia 39 y la superficie de imagen en posición de análisis reducida SAF1 al signo de referencia 65. El procedimiento para el ajuste del foco láser 30 de un láser de excitación 3 en vasos sanguíneos 27, 21 para mediciones por espectroscopía Raman o para mediciones de fluorescencia para la determinación del sexo de huevos de ave 1, siendo móvil en el huevo 1 el embrión 22, incluyendo el entramado de vasos sanguíneos 27, y no estando este aún fijado a la cáscara 28 en el momento de una medición de la radiación dispersa Raman o radiación de fluorescencia, realizado con el dispositivo 40, presenta los siguientes pasos:
- selección de un vaso sanguíneo 21 en el huevo 1 perforado e incubado con un procedimiento de evaluación basado en el contraste, bajo al menos iluminación verde de un entramado de vasos sanguíneos 27,
- producción de un foco 43 para una cámara 13 en el vaso sanguíneo seleccionado 21 a través del orificio 2 orientado al vaso sanguíneo 21 en la cáscara 28,
- producción de un foco láser 30 con el primer objetivo de medición 61 para un láser de excitación 3 en el vaso sanguíneo seleccionado 21 a través del orificio 2 orientado al vaso sanguíneo 21 en la cáscara 28, realizándose la producción de ambos focos 43 y 30 con un dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- mantenimiento del vaso sanguíneo 21 en el foco láser 30 de un segundo objetivo cambiado 62 dentro del vaso sanguíneo selectivo 21 y realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos en base a las modificaciones de intensidad de píxeles de al menos dos imágenes sucesivas a consecuencia del movimiento de eritrocitos dentro del vaso sanguíneo seleccionado 21, y seguimiento del foco láser 30 y del foco 43 en el descenso de la superficie de imagen en posición de análisis seleccionada SAF239 del entramado de vasos sanguíneos 27,
- compensación de movimientos horizontales x, y que se producen por medio del dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- realización de mediciones ópticas, en especial de mediciones por espectroscopía Raman y mediciones de fluorescencia.
El procedimiento comprende en detalle los siguientes pasos:
- introducción de un orificio 2 en la cáscara 28 por medio de una unidad de generación de orificios y posicionamiento de los vasos sanguíneos 21 en la zona del orificio 2 ,
- búsqueda de los vasos sanguíneos 21 que se forman en el huevo 1 por medio de un sistema de visión 10, 13 constituido al menos por una instalación de radiación 10 y por un detector/una cámara 13 y una iluminación coaxial o lateral con luz 10a del intervalo de longitud de onda visible,
- posicionamiento de al menos el vaso sanguíneo 21 en el foco láser 30 del láser de excitación 3 mediante movimiento del huevo 1 por medio de una unidad de posicionamiento controlada 16 o mediante un movimiento total de un dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, o mediante un cambio de al menos un objetivo 61,62 o, según la Fig. 2a, al menos de un objetivo de cámara 38, 63 en el dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- registro de la radiación retrodispersada 7 del vaso sanguíneo irradiado 21 por medio del dispositivo 5 para la introducción de radiación láser 3a y para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, pudiéndose evitar durante el registro de la radiación retrodispersada 7 un movimiento del vaso sanguíneo 21 fuera del foco láser 30 y del foco 43 de la cámara 13 mediante seguimiento del huevo 1 por medio de una unidad de posicionamiento controlada 16 y/o mediante un movimiento total del dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, o mediante un cambio de al menos un objetivo 61,62 o 38, 63 en el dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,
- evaluación de la radiación retrodispersada 7 y determinación del sexo del embrión en una unidad de evaluación 9,
- indicación del sexo del embrión en el huevo de ave 1,
caracterizado por que
en la unidad de evaluación 9 se realiza un procedimiento basado en el contraste para la determinación de una superficie de imagen en posición de análisis total SAF165 con el entramado de vasos sanguíneos 27 a través de medios técnicos de programa en un primer algoritmo, y
en la unidad de evaluación 9, a través de medios técnicos de programa en un segundo algoritmo, se realiza un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos para el ajuste del foco láser 30 por medio del dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2 para una superficie de imagen reducida RBF 41 de la superficie de imagen en posición de absorción SAF239 con el vaso sanguíneo seleccionado 21, comparándose en el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos los contenidos en intensidad It-i(x), It(x) de al menos dos imágenes sucesivas de una superficie de imagen RBF reducida al vaso sanguíneo seleccionado 21 con la - ROI - 41 de la SAF239, formándose de diferente manera los contenidos de intensidad It-1 (x), It(x) de los movimientos de eritrocitos 36 que se reflejan respectivamente en la imagen, y ajustándose el foco láser 30 del láser de excitación 3 y el foco 43 de la cámara 13 por medio del dispositivo óptico 5 para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, en una superficie de imagen RBF reducida asignada al vaso sanguíneo seleccionado 21 de la superficie de imagen en posición de análisis SAF239, encontrándose el foco láser 30 y el foco 43 siempre dentro del vaso sanguíneo seleccionado 21 en el paso final.
La secuencia total de ajuste del foco láser 30 del láser de excitación 3 móvil de manera coincidente con el foco 43 de la cámara 13 está constituida por los siguientes pasos:
paso 1: posicionamiento de un huevo 1 en una instalación de soporte 16,
paso 2 : introducción de un orificio/una perforación 2 en la cáscara 28 directamente a través del entramado de vasos sanguíneos 27 o en una zona fuera del entramado de vasos sanguíneos 27, encontrándose el embrión 22 con el entramado de vasos sanguíneos 27 siempre en el punto más elevado del interior del huevo a partir del tercer día de incubación debido a las diferencias de densidad en el huevo 1, paso 3: posicionamiento del entramado de vasos sanguíneos 27 en la zona de la perforación 2 mediante movimiento/giro del huevo 1 para el caso de generación de orificio en la cáscara 28 fuera del entramado de vasos 27, hasta que el orificio generado forma el punto más elevado del huevo 1:
paso 4: iluminación del embrión 22 y del entramado de vasos sanguíneos 27 por medio de radiación 10a en el intervalo de longitud de onda visible o en el intervalo de longitud de onda verde bajo empleo de la instalación de radiación 10.
Paso 5: determinación del plano del foco:
- mediante utilización de un aumento de objetivo adaptado, efectuándose una adaptación al diámetro de orificio,
- para poder determinar el plano zfocai más agudo dentro del vaso sanguíneo 21, por medio de motores de velocidad gradual de una unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa/control 18, según la Fig. 13 se recorre una zona definida de zmax < zfocal < a zmin, siendo zmin la distancia mínima y zmax la distancia máxima entre objetivo 61 y vaso sanguíneo 21,
- determinación del máximo según la Fig. 13 por medio de un indicador de nitidez basado en el contraste con ayuda de un procedimiento basado en el contraste, por ejemplo, por medio de una representación de varianza “varianza” con valor de nitidez de la varianza:
generándose, si es necesario, un nivelado de la evolución del indicador de nitidez para la minimización de las influencias interferentes ocasionadas mediante ruido, por ejemplo, con un filtro de Savitzky-Golay, y una limitación de la zona definida para el máximo local zfocal mediante formación de la primera derivada de la función del valor de nitidez de la varianza representada en la Fig. 13:
- posicionamiento del eje z a través de un movimiento absoluto respecto al punto zfocal determinado y - grabación de imagen del entramado de vasos total 27 de la zona definida por medio de una cámara 13 con un primer objetivo determinado 61.
Paso 6 : selección de vasos sanguíneos mediante evaluación de la matriz de imagen:
- homogeneización/eliminación del fondo (todos los componentes del huevo que no pertenecen al entramado de vasos extraembrionario, por ejemplo, saco vitelino, embrión con corazón) por medio de algoritmos matemáticos, por ejemplo, por medio de un algoritmo de Rolling-Ball,
- maximización del contraste, por ejemplo, mediante transformación lineal de la función de escala de grises, - segmentación de vasos sanguíneos 27, por ejemplo, constituida por los pasos
- determinación del valor umbral,
- eliminación de partículas por medio de erosión, y
- cierre morfológico,
- extracción del vaso sanguíneo 21 y determinación de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 39 para la subsiguiente medición óptica:
determinación de la superficie de imagen en posición de análisis SAF239 mediante formación del centro de gravedad geométrico del objeto con la mayor superficie A, que se obtiene tras erosión múltiple hasta el paso de iteración i-1 (si Amax= 0 en el caso de variable de control i), entendiéndose por erosión la operación morfológica en el procesamiento de imagen, en la que se desgastan píxeles por un elemento estructural.
Paso 7: adaptación del aumento de objetivo en el enfoque automático y el seguimiento del foco láser 30 en la superficie de imagen en posición de análisis SAF239 seleccionada, a modo de ejemplo mediante un cambio de objetivo 61 a objetivo 62 según la Fig. 2.
Paso 8 : enfoque automático y seguimiento de la superficie de imagen en posición de análisis SAF239 seleccionada en el vaso sanguíneo 21 :
subpaso 8.1: nueva determinación del plano focal correspondientemente al paso 5.) solo si, debido a un fuerte descenso de los vasos sanguíneos 27, incluyendo el vaso sanguíneo 21, durante el cambio de objetivo el foco láser 30 del primer objetivo 61 del láser de excitación 3 para la medición de radiación dispersa Raman no coincide con el foco 43 de la cámara 13 para la selección de vasos sanguíneos. Subpaso 8.2: posicionamiento exacto del eje z en el vaso sanguíneo 21 mediante aplicación del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, definiéndose el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos como diferencia de las intensidades de píxel de ambas imágenes registradas sucesivamente del vaso sanguíneo 21.
En este caso se efectúa una
- selección de una sección de imagen reducida RBF 41 según la Fig. 5 en forma de una ROI (en inglés region of interest), por ejemplo, con 400 x 400 píxeles (corresponde a 100 gm x 100 gm) a partir de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 seleccionada 39.
Es necesario un posicionamiento exacto de la sección de imagen reducida RBF 41 en la imagen del vaso sanguíneo 21 por medio del procedimiento de imagen diferencial, ya que, según la Fig. 13, el procedimiento basado en el contraste elabora el máximo del valor de nitidez para la imagen total con la SAF165, pero no puede elaborar en sí mismo el foco 30, o bien el foco 43, dentro del vaso sanguíneo 21.
La determinación del punto focal exacto zfocal_exacto 30 funciona de la siguiente manera análogamente a la determinación del plano focal SAF239:
- determinándose la zona recorrida de ROI 41 a partir del punto zfocal determinado y las modificaciones esperadas Azmax y Azmin, que se producen mediante el descenso del embrión 22 dentro del huevo 1 y el enfoque impreciso basado en el contraste en el vaso sanguíneo 21 :
zmax-exacto = zfocal Azmax y zmin-exacto = zfocal Azmin,
- nivelado del valor de nitidez de la imagen diferencial preferentemente mediante un valor medio causal móvil para compensar la pulsación de eritrocitos 36 en el vaso sanguíneo 21,
- determinación del máximo del valor de nitidez según la Fig. 6 por medio de las respectivas imágenes diferenciales basadas en el movimiento de eritrocitos,
- posicionamiento exacto del eje z en el vaso sanguíneo 21 según la Fig. 7.
Adicionalmente, según la Fig 14 se requiere un desplazamiento del máximo determinado zfocal_exacto para garantizar que el regulador de dos posiciones siempre permanezca continuamente detrás de la unidad de posicionamiento 18: zDesplazamiento = zfocal_exacto - AzDesplazamiento, mostrándose en la Fig. 14 la curva DifR de evolución continua para el procedimiento de imagen diferencial basada en el movimiento de eritrocitos del momento t = 0. Por medio de un movimiento absoluto se arranca el punto de partida zDesplazamiento para la regulación. Debido al descenso del embrión en el huevo 1, la curva DifR-t a trazos en la Fig. 14 se desplaza con tiempo t creciente, mediante lo cual se efectúa un mantenimiento de la posición en el vaso sanguíneo 21 por medio de esta regulación de dos posiciones.
Subpaso 8.3: compensación de los movimientos en el plano x, y, por ejemplo, mediante comparación de patrones. A continuación, se explica más detalladamente el empleo del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos:
en este caso se utiliza la imagen de eritrocitos fluidos 36 de un vaso sanguíneo 21 dentro de la superficie de imagen reducida RBA - Roi ("region of interest") - 41 y su evaluación a través del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos de dos imágenes sucesivas modificadas en la intensidad Ií y Ií- i en el momento í y í-1 debido al flujo sanguíneo, es decir, el movimiento de eritrocitos, para mantener el foco láser 30 del láser de excitación 2 y el foco 43 de la cámara 13, seguidos de manera coincidente, en el vaso sanguíneo 21 que se modifica en su posición. De este modo, la diferencia de ambas imágenes subsiguientes consideradas en la evaluación, debido al movimiento de los eritrocitos 36, es incluso parte del indicador de nitidez para el vaso sanguíneo 21 modificado en posición representado en la Fig. 6 , ya que el movimiento de eritrocitos 36 en el vaso sanguíneo 21 se traduce en intensidades de píxeles modificadas Ií y Ií-i de las imágenes a elaborar consideradas. El indicador de nitidez 46 en la Fig. 6 en base al procedimiento de imagen diferencial del movimiento de eritrocitos respecto al movimiento de los eritrocitos 36 favorece el posicionamiento del foco láser 30 del láser de excitación 3 en el vaso sanguíneo 21 de un huevo de ave embrionario 1 con precisión elevada y desviación estándar sensiblemente menor en comparación con algoritmos de evaluación basados en el contraste.
El procedimiento se distingue además por que solo es necesaria la sección de imagen reducida RBF 41 (ROI), con lo cual se reduce considerablemente el tiempo de cálculo y se permite por primera vez un seguimiento in ovo en tiempo real.
Otras ventajas de este procedimiento consisten en que se pueden efectuar
- una estructura sencilla con solo una cámara 13,
- mediciones confocales y no confocales,
- una medición en vasos sanguíneos 21 de todos los tamaños con la condición de eritrocitos 36 que se mueven en el vaso sanguíneo 21.
El orificio 2 en el polo agudo, orientado hacia arriba 24, del huevo 1 se puede formar con un diámetro hasta 18 mm, preferentemente entre 8 mm y 12 mm, por medio de la unidad de generación de orificios.
Como luz 10a del intervalo de longitud de onda visible se puede emplear luz blanca y/o verde de la fuente de luz 10 del sistema de visión 10, 13 para el control de la evolución a lo largo del tiempo de los procesos en la incubación del huevo de ave 1.
El procedimiento con las mediciones ópticas para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave 1 fecundados e incubados se puede realizar a partir del tercer día de incubación.
Por ejemplo, para la espectroscopía Raman según la Fig. 2 se pueden emplear los siguientes parámetros:
- longitudes de onda de excitación de la luz láser 3a de la fuente de radiación láser 3: > 600 nm (por ejemplo, láser HeNe 633 nm, láser de cuerpo sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd: YAG 1064 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo 785 nm),
- acoplamiento de la luz láser 3a directamente con espejos y/o con fibras ópticas 4a,
- mediciones de radiación dispersa Raman bajo utilización de un dispositivo óptico 5 con gran apertura numérica, como objetivos de microscopio 61 o una sonda de fibra Raman 4b,
- desacoplamiento directo de la radiación dispersa Raman recogida 7 con espejos respecto a un espectrómetro 8 o por medio de transporte con fibras ópticas 4b,
- empleo de un espectrómetro 8 en forma de espectrómetro Raman dispersivo y espectrómetro Raman de transformada de Fourier.
Durante el proceso de posicionamiento del huevo de ave 1 se pueden registrar permanentemente y alimentar a una evaluación los espectros Raman recuperados, efectuándose una clasificación automática de la radiación dispersa Raman 7 en base a la huella dactilar espectral de la sangre.
Para las mediciones ópticas de la radiación de fluorescencia redispersada por el vaso sanguíneo 21 se pueden emplear los siguientes parámetros:
- longitudes de onda de excitación de la radiación láser 3a de la fuente de radiación láser (3): > 400 nm (por ejemplo, láser HeNe 633 nm, láser de cuerpo sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd: YAG 532 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo 785 nm),
- acoplamiento de la radiación láser 3a directamente con espejos y/o con fibras ópticas 4a,
- mediciones de radiación de fluorescencia bajo utilización de dispositivos ópticos 5, como objetivos de microscopio 61 o una sonda de fibra 4b,
- desacoplamiento directo de la radiación de fluorescencia recogida 7 por medio de al menos un espejo o por medio de transporte a través de fibras ópticas,
- empleo de al menos un detector 8.
El huevo de ave 1 se sensibiliza en los polos y se puede introducir un orificio 2, por ejemplo, en la zona del polo agudo orientado hacia arriba 24, con un tamaño de orificio de 10 mm, a partir de tres días de incubación.
El primer paso representa la perforación de la cáscara 28 a través de un láser de una unidad de generación de orificios 67 según la Fig. 1. El tiempo de incubación, en lo sucesivo llamado incubación, del huevo de ave 1 asciende a tres días en este momento. En el segundo paso se puede abrir la cáscara 28 elaborada en la fase previa. En el tercer paso se analiza un vaso sanguíneo 21 con el espectroscopio Raman 8 y se determina el sexo. En el último paso se cierra de nuevo la cáscara 28 abierta en el segundo paso. La incubación del embrión 22 se puede continuar seguidamente.
La circulación sanguínea se produce ya en las primeras 36 a 48 horas de incubación. La sangre comienza a circular mediante la contracción del corazón. En esta fase se presenta un entramado de vasos sanguíneos 27 en un plano.
Los vasos sanguíneos 21 poseen un diámetro máximo de aproximadamente 150 a 350 gm en el tiempo de incubación de 72 a 84 horas.
Sobre el entramado de vasos sanguíneos 27 se encuentra una capa de albúmina 26, como se representa en las Fig. 3, 3a, 3b, 3c. Por consiguiente, existe una diferencia de altura entre la capa de albúmina 26 y el vaso sanguíneo 21 insertado. El láser de excitación 3 es un elemento central para las mediciones ópticas, en especial en la espectroscopía Raman. Para poder mantener siempre el foco láser 30 del láser de excitación 3 en el centro del vaso sanguíneo 21 se equipará respectivamente la posición nominal a la posición actual. El foco láser 30 del láser de excitación 3 y el foco 43 de la cámara 13 se encuentran en el mismo plano focal, como se muestra en las Fig. 3, Fig. 3c. En este caso, el foco láser 30 representado en la Fig. 3c presenta un talle 66 , en cuyo punto más estrecho se encuentra en firme conformidad con el foco 43.
En el tiempo de incubación de hasta cinco días es posible obtener acceso al entramado de vasos sanguíneos 27 mediante una orientación vertical del huevo de ave 1, con el polo agudo 24 hacia arriba. Mediante esta propiedad característica es posible un análisis con el espectroscopio Raman 8.
A continuación, se describe un ejemplo de realización para la estructura del cabezal de medición Raman en un dispositivo 40 según la invención para el ajuste del foco láser 30 para la determinación del sexo por espectroscopía Raman. La estructura del cabezal de medición Raman se representa como esquema en la Fig.2 y está constituida por varios componentes, cuyas funciones se explican brevemente a continuación.
El huevo de ave 1 a analizar se encuentra en la instalación de soporte 16, que se puede variar en un espacio limitado en sentido x, y y z. En este caso, la instalación de soporte 16 es necesaria para compensar los movimientos internos del huevo de ave 1. Por ejemplo, se pueden emplear tres etapas lineales (no dibujadas), que se accionan respectivamente por un motor de velocidad gradual.
Las tres etapas lineales están conectadas a un control de motor y se pueden parametrizar a través de la unidad de evaluación 31 en forma de un ordenador.
En general, la iluminación 10a es necesaria solo para el empleo de la cámara 13. La iluminación 10a se debe efectuar a una longitud de onda que no influya sobre la señal de medición.
Como se desprende de la Fig. 2, se utiliza un láser de excitación 3 con una longitud de onda emitida de 785 nm para una espectroscopía Raman, y los rayos dispersados por el vaso sanguíneo 21, o bien el entramado de vasos sanguíneos 27, inciden sobre el divisor de radiación 23 y se dejan pasar a la cámara 13 por debajo de 670 nm. Todas las longitudes de onda que son mayores que 670 nm se conducen al espectroscopio Raman 8. Por lo demás, existe una separación física entre el cabezal de medición 37, 23, 61 y el espectroscopio Raman 8 , de modo que las señales lumínicas se pueden enviar a través de una fibra óptica 4b. Simultáneamente a las señales lumínicas, el láser de excitación 3 se introduce en el cabezal de medición 37, 23, 61 a través de la misma fibra óptica 4a, introduciéndose un colimador 37 sobre el divisor de radiación 23 antes del objetivo de medición 61. El primer objetivo de medición 61 se emplea para la selección de la posición de medición. A tal efecto es ventajoso un aumento elevado de la zona de imagen para poder posicionarse lo más exactamente posible en un vaso sanguíneo 21 grande. El aumento lineal sin divisor de radiación puede ascender, por ejemplo, a 18 veces entre vaso sanguíneo 21 y sensor de cámara 29.
Para la realización se emplea el primer objetivo de medición 61, que presenta un aumento lineal de 5 con divisor de radiación entre vaso sanguíneo 21 y sensor de cámara 29.
Para la grabación de imágenes en el análisis se emplea la cámara 13. Mediante la matriz CCD 29 contenida en la cámara 13, en el análisis se determinan las imágenes que son necesarias para la determinación de indicadores de nitidez. La secuencia de imágenes de 20 fps es suficiente para fines de análisis.
Una secuencia de imágenes más elevada permite obtener más puntos de medición por unidad de tiempo. Esto es ventajoso en especial para la determinación de indicadores de nitidez. Los datos de imagen también se utilizan simultáneamente para la compensación horizontal x, y.
En las Fig. 4 y Fig. 5 se indica la diferencia entre superficie de imagen total SAF165 y superficie de imagen seleccionada SAF239 y superficie de imagen minimizada, reducida RBF (ROI) 41. Para la reducción del tiempo de cálculo se utiliza solo la ROI (engl. Region of Interest) 41 para estos indicadores. En este caso, la ROI 41 describe una sección que se encuentra solo en el vaso sanguíneo seleccionado 21.
Debido al ruido de los indicadores de nitidez, para todos los procedimientos se puede utilizar concomitantemente, por ejemplo, un filtro Savitzky-Golay.
La iluminación 10a tiene una influencia esencial sobre el contraste y, por lo tanto, también sobre el resultado total. La luz LED 10a emitida en color verde se absorbe con especial intensidad por la hemoglobina de los eritrocitos 36 analizada. De este modo, los eritrocitos 36 se separan claramente del saco vitelino. De esto se puede sacar la conclusión de que un canal verde de una cámara RGB 13 hace visibles los eritrocitos 36 de manera óptima, y proporciona simultáneamente un contraste elevado respecto al saco vitelino. Por lo demás se evidencia que la iluminación blanca con una fracción verde es suficiente para hacer visible los glóbulos rojos 36. En el caso de empleo de luz LED verde se obtiene un contraste aún mejor.
La superficie de imagen reducida RFB 41 se puede dividir en un retículo de píxeles (x, y). La intensidad de la escala de grises se describe mediante el tamaño I(x,y) de un determinado píxel (x,y). Como ejemplo para la
realización de un procedimiento basado en el contraste se utiliza el procedimiento conocido “varianza VAR” bajo empleo del tamaño I(x,y) con la fórmula:
El valor medio de las intensidades I(x,y) corresponde a las variables u (valor medio), y la “altura” y “anchura” se refieren al tamaño de la imagen 2D.
El procedimiento de “imagen diferencial” (Dif) representa la diferencia entre las intensidades U(x,y) y IB(x,y) de dos imágenes y la diferencia ÜDif se describe mediante la fórmula
refiriéndose A y B al tiempo.
En el caso especial del embrión de gallina 22 se utiliza la propiedad de movimiento de eritrocitos 36 en el vaso sanguíneo 21 para obtener una diferencia en la matriz de imagen. En este caso, ÍA (x,y) y /e(x,y) describen dos imágenes sucesivas registradas directamente en el tiempo. Para evitar la diferencia debida al ruido no se consideran todas las Uüif (x,y) que son menores que un valor umbral predeterminado SW, con lo que se considera para una imagen binaria b(x,y)
representando SW un valor umbral determinado.
Un filtro de paso TP(b(x,y)) bajo asegura que los píxeles individuales que se diferencian del entorno en gran medida se adapten al entorno. El valor de nitidez Sdu resultante de la imagen diferencial se determina a partir de
En todos los indicadores de nitidez basados en el contraste se emplea el tamaño completo de las superficies SAF165 de las imágenes.
No obstante, en el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos solo es interesante el movimiento de glóbulos rojos (eritrocitos) 36 dentro del vaso sanguíneo 21, como se muestra en la Fig. 5, ya que el saco vitelino estático no provoca una modificación de intensidad en dos imágenes sucesivas. La modificación de intensidad se genera mediante los eritrocitos 36, que generan una modificación en dos imágenes sucesivas. Además, como se ha descrito ya, dentro del huevo 1 existe una diferencia de alturas entre vaso sanguíneo 21 y capa de albúmina 26. Como resultado, la ROI 41 se encuentra directamente en el vaso sanguíneo 21.
En el caso ideal, el máximo de valor de nitidez SMax se encontrará en el centro del vaso sanguíneo 21. En este punto medio se debe partir de que la señal Raman de la sangre proporciona el valor máximo.
El procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos puede determinar con la mayor seguridad el foco láser 30 en el vaso sanguíneo 21. No obstante, los procedimientos de contraste están sujetos a fuertes modificaciones, y el máximo se puede situar tanto en la capa de albúmina 26 superpuesta como también en otros planos.
El procedimiento VAR basado en el contraste forma la mínima desviación estándar en el caso de utilización de la zona de imagen total de la superficie en posición de análisis SAF165. En el procedimiento basado en el contraste
no juega ningún papel el movimiento de eritrocitos 36 ni, por lo tanto, la modificación de las escalas de grises de las intensidades.
El tiempo de cálculo es una magnitud importante, en especial en el caso de tamaño de imagen o frecuencia de imagen elevados. El procedimiento VAR basado en el contraste es un algoritmo muy rápido, que se utiliza también para secuencias de imágenes muy elevadas. Por lo demás, el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos puede alcanzar un tiempo de cálculo muy corto debido a la utilización de su tamaño de imagen limitado.
El dispositivo 5 basado en cámara en la Fig. 2 para la selección y el posicionamiento de un vaso sanguíneo 21 requiere el empleo de algoritmos de procesamiento de imagen. En el transcurso ulterior se describen estos detalladamente desde el punto de vista formal y matemático.
Según las Fig. 2 y Fig. 8 , el ordenador de selección y posicionamiento (SPR) 31 representa el núcleo de la tarea de procesamiento de imagen. Además del procesamiento de imagen, también tienen lugar el control de los motores de velocidad gradual de la unidad de posicionamiento coordinativa 18 y la conmutación automática de objetivos de medición 61, 62, por ejemplo, a través de un revólver 44 o, según la Fig. 2a, la conmutación automática de los objetivos 38, 63 de la cámara 13, por ejemplo, a través de otro revólver 64. Además, para el usuario es posible interactuar con el SPR 31 a través de periferias. Los datos de imagen en sí mismos se generan mediante la cámara RGB 13. Con ayuda del control a través de motor se pueden parametrizar los motores de velocidad gradual y accionar los ejes X, Y y Z a través de un husillo. El ordenador Raman 9 en la Fig. 2 es responsable del registro del espectro, con lo cual se puede determinar el sexo. Tanto el ordenador Raman 9 como también el SPR 31 pueden estar también unidos en un único ordenador 45.
Al comienzo del análisis es necesario el registro de una imagen. En el paso ulterior se realizan el procesamiento previo y la subsiguiente segmentación. Estos pasos son necesarios para separar la imagen total de la superficie de imagen en posición de análisis SAF165 en zonas de objeto y fondo. En la Fig. 9 se representan los pasos parciales para el procesamiento previo y la segmentación como componentes para la “selección de un vaso”. Los bloques desplegados en la gráfica explican los pasos que se observan detalladamente en esta sección. Por lo demás se describe brevemente qué puntos se consideran en el registro de la imagen. La extracción de características y la clasificación de los vasos sanguíneos 21 según la Fig. 10 son componente de otros pasos. En el “procedimiento para la selección y el enfoque de un vaso sanguíneo” según la Fig. 8 está presente doblemente la “selección del vaso”. El procedimiento se utiliza en primer lugar para seleccionar un vaso sanguíneo 21 del entramado de vasos sanguíneos total 27. En el segundo paso, el procedimiento se puede utilizar para determinar de nuevo la posición en el vaso sanguíneo 21. Esto es necesario si la posición del foco láser 30 se ha perdido debido a la conmutación de objetivos del objetivo 61 al objetivo 62 en la cámara 13. A continuación se describe la primera llamada de la función “selección del vaso”. No obstante, primeramente, es necesario que se represente el entramado de vasos sanguíneos total 27 según la Fig. 4 en el sensor de cámara 29. A tal efecto se debe seleccionar un objetivo 61 que pueda registrar el entramado de vasos sanguíneos total 27, incluyendo el embrión 22. De este modo se garantiza que todos los vasos 21, que pueden servir como punto de análisis, sean visibles y por lo tanto evaluables. En la Fig. 4 se representa tal entramado de vasos sanguíneos 27 con embrión 22. El factor de aumento del primer objetivo 61 de la cámara 13 tiene gran influencia sobre el hecho de que la cáscara 28 del huevo 1 sea visible. Por lo tanto, el aumento del objetivo se debe adaptar al diámetro de la perforación de láser deseada.
Para poder realizar una segmentación del entramado de vasos sanguíneos 27 es ventajoso poseer un fondo homogéneo. Como fondo se debe entender todos los componentes que no pertenecen al propio entramado de vasos sanguíneos 27. A estos pertenecen sobre todo el saco vitelino, el corazón y el propio embrión.
El último paso de procesamiento previo sirve para la maximización del contraste y representa un procedimiento estándar. En este caso, la función de escalas de grises del histograma se transforma linealmente por etapas. Este escalado se puede describir mediante
255, si
para la transformación lineal del histograma.
Los parámetros at y bt para la transformación lineal se determinan a partir de la función de partida según un algoritmo de Rolling-Ball gRB. De esto resultan los parámetros
a t = ~ m i n í f f j » )
y
255
¿V - max(gRjB) - mín(£RB)
respectivamente con la máxima y mínima escala de grises que se presenta en la imagen original. De este modo, mediante empleo de las fórmulas se produce una función escalonada, de la que se produce una dispersión del intervalo de escalas de grises de min(gñe) a 0 y de max(gñe) a 255.
Una vez ha concluido el procesamiento previo, según la Fig. 10 se puede realizar la segmentación. Se entiende por esta la separación de fondo y vaso sanguíneo 21 como objeto de destino en valores binarios.
Si esta lógica se refiere a una imagen en escala de grises g(x,y), la matriz de imagen segmentada corresponde a 0., s i g(.x,y) < SW(.x,y)
para la segmentación de una imagen en escala de grises, representando SW el valor umbral. El objetivo en un umbral local automático según la Fig. 9 es determinar un valor umbral SW(x,y) para cada píxel (x,y). En el procedimiento descrito en la publicación de Sauvola J., Pietikanen, Adaptive document image binarization, Pergamon Vol. 33 (2000) se emplea a tal efecto el valor medio ¡u(x,y) y la desviación estándar o(x,y) dentro de un tamaño de ventana. La ventana posee un tamaño de hm ■ x ■ vm píxeles y está expandida alrededor del centro del píxel a analizar, siendo hm la anchura y vm la altura. De ello resulta el cálculo del valor umbral
En este caso, R representa el valor máximo de la desviación estándar y q representa un factor.
Con la segmentación se pueden eliminar casi todos los fondos definidos. Simultáneamente son localizables las estructuras mayores de vasos 21. Vasos que son reducidos o se sitúan a gran profundidad se eliminan parcialmente. No obstante, para el análisis es decisivo solo el vaso sanguíneo 21 con la mayor sección transversal según la Fig. 5.
Según la Fig. 9, para eliminar partículas reducidas que no pertenecen al vaso 21 es posible suprimir estas por medio de una erosión. A tal efecto, en la etapa previa se invierte la imagen total, ya que la mayor parte de algoritmos y fuentes definen objetos blancos como objeto de destino y objetos negros como fondo. La erosión se puede repetir con la frecuencia deseada en función del tamaño del vaso. Las estructuras que se conservan tras la erosión son exactamente las mismas que en la imagen original. Por consiguiente, no se efectúa una modificación de los vasos, sino que exclusivamente se eliminan partículas.
Las estructuras que no se rellenan completamente debido a la segmentación deben formar de nuevo una superficie homogénea con el paso: cierre morfológico según la Fig. 9. De este modo, todos los píxeles que pertenecen al fondo se sustituyen por primer plano, si estos están completamente rodeados de primer plano. Una vez la segmentación de los vasos 27 ha concluido con éxito se considera extraer el vaso sanguíneo 21 y determinar la posición de análisis para la espectroscopía Raman según la Fig. 9.
A continuación, se indica un ejemplo de determinación de una posición de análisis con una clasificación por bloques: la imagen segmentada se divide mediante una rasterización. A continuación, se clasifica cada bloque individual según superficie de bloque. A continuación, se puede determinar la posición para un análisis de la mayor superficie.
Para poder determinar un vaso sanguíneo 21 con diámetro elevado dentro de la gran superficie de imagen se extrae en primer lugar la característica necesaria. Si se supone que los vasos sanguíneos presentes son las estructuras de mayor tamaño, estas estructuras proporcionan también la mayor superficie. A partir de esta suposición se puede rasterizar la matriz de imagen segmentada, y para cada bloque se puede determinar la superficie del vaso 21.
El número de bloques depende del tamaño de imagen hm x vm del sensor de cámara 29 y del tamaño de bloque B. Para que se represente siempre el mismo tamaño de bloques se cumplen las condiciones
para el cálculo del número de bloques horizontales y
para el cálculo del número de bloques verticales. Si la mayor estructura se sitúa entre dos bloques, esta no se puede determinar con seguridad. Por lo tanto, se debe elaborar una segunda cuadrícula, que está desplazada en B/2 en sentido x e y, y posee Ki - 1, así como K2 - 1 bloques. Para excluir objetos que no pertenecen al entramado de vasos 27, B se debe seleccionar suficientemente grande. De este modo, en la clasificación se puede evitar que se incluyan partes del corazón. Por lo tanto, la superficie de varios vasos es mayor que la superficie total del corazón para un tamaño de bloque suficientemente grande.
Para el cálculo y la selección de la mayor superficie se determina iterativamente la superficie Aij de los píxeles de objeto g¡j(x,y) de todos los bloques. Esta relación se puede describir mediante
para el cálculo de la superficie de bloque de píxeles de objeto segmentados y
para la determinación de la superficie máxima de píxeles de objeto segmentados.
El bloque con la mayor superficie resultante se emplea para determinar la posición de análisis. Las variables de control i y j describen la posición del bloque en la matriz de imagen.
Con la determinación del centro de gravedad geométrico se efectúa una determinación de la posición de análisis. Este punto se puede determinar en sentido x mediante
para la determinación del centro de gravedad geométrico en sentido x
y en sentido y mediante
para la determinación del centro de gravedad geométrico en sentido y.
Según la Fig. 5, el punto determinado se sitúa en el centro del vaso sanguíneo 21 más ancho y, por lo tanto, es convenientemente apropiado para la espectroscopía Raman.
A continuación, se explican componentes de la conmutación de objetivos de un primer objetivo 61 al segundo objetivo 62 con distancia focal más corta y de nuevo respectivamente de vuelta al análisis Raman: la conmutación del objetivo Raman 61 es conveniente, ya que para la selección del vaso sanguíneo 21 a analizar se debe presentar la mayor selección posible de estructuras. En contrapartida, en el caso del propio análisis Raman lo esencial es un posicionamiento exacto del foco láser 30 en el vaso sanguíneo 21. Si se emplea solo un objetivo 61 o 38, para la selección del vaso sanguíneo 21 se debe rasterizar y rastrear gradualmente una zona. No obstante, en este proceso se puede modificar la posición horizontal del vaso 21 , con lo cual es necesaria una nueva búsqueda del vaso sanguíneo 21 determinado previamente, lo que requiere mucho tiempo.
El posicionamiento y el mantenimiento del vaso sanguíneo 21 en el foco láser 30 del haz de excitación es componente en la selección del vaso 21 y del propio análisis Raman. En el caso ideal, la conmutación de objetivos 61 a 62 no tiene ninguna influencia, de modo que la determinación del plano focal según la Fig. 11 se realiza una sola vez en la selección del vaso 21. Tras la conmutación al objetivo Raman 62, el foco 30 se sitúa exactamente en el mismo plano que con el objetivo 61 para la selección del vaso, de modo que el posicionamiento exacto del foco láser 30 en el vaso 21 puede tener lugar directamente. A continuación, se mantiene el foco láser 30 durante el análisis Raman. Si tiene lugar un fuerte descenso durante la selección y la conmutación de objetivos de 61 a 62, desde el principio se debe comenzar con la determinación del plano focal. En la Fig. 11 se representa una descomposición para este posicionamiento en el foco con una descomposición del enfoque en los eritrocitos 36. El primer paso según la Fig. 11 representa la determinación del plano focal por medio de procedimientos de contraste. A continuación, se conduce el eje Z al plano calculado. En la segunda parte se posiciona el eje Z exactamente en el vaso sanguíneo 21 mediante aplicación del procedimiento de imagen diferencial en la unidad de evaluación 31. En el último paso, este punto se mantiene en el foco mediante una regulación de dos posiciones de la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa 18.
Para poder determinar el plano más agudo dentro del vaso sanguíneo 21, según la Fig. 13 se recorre una zona definida a lo largo del eje z. Dentro de esta zona definida Zmax y Zmin se sitúa el punto Zfocal. El valor Zmax representa la distancia mínima de objetivo a vaso sanguíneo 21 y forma el punto inicial para el análisis. Por el contrario, el parámetro Zmin resulta del plano más profundo del entramado de vasos sanguíneos 27 que se puede alcanzar dentro del vaso sanguíneo 21.
Paralelamente al paso de la zona entre Zmax y Zmin se determina el indicador de nitidez mediante la cámara 13. Para minimizar influencias interferentes debidas al ruido, la evolución del indicador de nitidez se nivela mediante un filtro Savitzky-Golay. En este caso, el valor gsg nivelado resulta del punto de medición fi con una media ponderada sobre los valores vecinos nR a -nL.
En este caso, ci representa un ajuste de coeficiente apropiado para el filtro Savitzky-Golay. Concomitantemente se incluyen valores pasados y futuros en el algoritmo de nivelado. El filtro ofrece en total buenas propiedades en la representación de máximos, como se producen en la determinación de los valores focales de varianza, ya que también se pueden incluir concomitantemente señales de frecuencia más elevada en la evolución.
Si se aplican los valores de nitidez en el paso a través de la zona de Zmax a Zmin, el gráfico según la Fig. 13 se produce como evolución del indicador de nitidez VAR y VAR’ en función de la distancia, que forma un máximo en Zfocal.
Simultáneamente, de la Fig. 13 se desprende que el valor focal Zfocal se reduce con distancia más elevada y aumenta con distancia más reducida. Una posible causa de este comportamiento es la influencia de la iluminación 10a sobre la cáscara 28 del huevo 1. El valor Z creciente provoca un oscurecimiento del entramado de vasos sanguíneos 27, ya que el cono se cubre parcialmente por la cáscara 28 y, por consiguiente, no puede incidir sobre los vasos. Por el contrario, una reducción del eje Z conduce a una mayor superficie de iluminación y se refleja a través de la cáscara 28. Está pendiente puede conducir a que el máximo global sea mayor que el máximo local en Zfocal. Por lo tanto, es conveniente limitar la zona para el máximo local Zfocal. Una característica apropiada es el
fuerte aumento y descenso de la forma de GauB. Si se forma la primera derivada de la función VAR, como se muestra en la Fig. 13, resulta un máximo global y un mínimo que se pueden utilizar como limitación de la zona. El posicionamiento del eje Z se efectúa a través de un movimiento absoluto respecto al punto determinado Zfocal. El posicionamiento exacto en el vaso sanguíneo 21 por medio del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos según la Fig. 11 es necesario, ya que el procedimiento de contraste “varianza”, empleado a modo de ejemplo, produce el mayor valor focal para la imagen total de la superficie de imagen en posición de análisis SAF165, pero no el foco 30 en el vaso 21 en sí mismo. La determinación del punto Zfocal_exacto funciona en principio análogamente a los pasos de procedimiento “determinación del plano focal”. La zona que se recorre se determina a partir del punto zfocal conocido y las modificaciones esperadas Azmax y Azmin.
Estas modificaciones se producen mediante el descenso del embrión 22 dentro del huevo 1 y el enfoque impreciso sobre el vaso sanguíneo 21, debido al procedimiento de contraste. Las magnitudes Zmax_exacto describen mediante
zmax-exacto = zfocal Azmax
para la determinación de la posición máxima exacta para la zona de paso y
zmin-exacto = zfocal Azmin,
para la determinación de la posición mínima exacta para la zona de paso. Por lo demás se debe considerar que la velocidad es Vz >> vz_ exacto .
Para el nivelado del valor de nitidez del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos se emplea un valor medio causal móvil. El motivo es la pulsación del flujo de eritrocitos 36 en los vasos sanguíneos 21, que no se desea. El valor medio móvil gm(k) puede compensar este comportamiento y se determina mediante
El valor de nitidez S en la posición k describe el momento actual. La variable i describe los valores considerados. La anchura de ventana, que se puede calcular a través del valor medio, se expresa mediante la variable w. No es necesaria una determinación de la derivada del valor diferencial, ya que el máximo 46 calculado mostrado en la Fig. 6 es claro. Por otra parte, según la Fig. 14 se requiere un desplazamiento del máximo determinado Zfocal_exacto para garantizar que un regulador de dos posiciones siempre permanezca detrás. El punto Züesplazamiento se calcula a partir de
Züesplazamiento = Zfocal_exacto - AZüesplazamiento.
para la determinación de la posición Z con desplazamiento. En la Fig. 14 se explican los parámetros más importantes.
En la gráfica de la Fig. 14 es visible una curva “DifR”, que se registró en el momento t=0 con el procedimiento de imagen diferencial basada en el movimiento de eritrocitos. Por medio de un movimiento absoluto se arranca el punto de partida Züesplazamiento para la regulación. Debido a este descenso del embrión 22, la curva "DifR -t" se desplaza con tiempo t creciente.
Para compensar el comportamiento de descenso es necesario un aumento del valor Z por medio de un regulador -por ejemplo, un regulador de dos posiciones- en la unidad de posicionamiento 18. El umbral de conmutación superior y el umbral de conmutación inferior del regulador de dos posiciones con comportamiento de histéresis se determina a partir de
para la determinación del umbral de conmutación superior para la regulación de dos posiciones y
ws -(t ) = D ifRs_ = D i f R ^ - p s - con p£-{0,l] un d > p£_
para la determinación del umbral de conmutación superior para la regulación de dos posiciones, representando p£+ y pe- el valor porcentual para la determinación del umbral de conmutación.
Al comienzo se produce un tiempo muerto tmuerto, que se puede atribuir al descenso del embrión 22. El regulador intenta compensar este estado activándose la magnitud de ajuste uein(t). De este modo, el motor de velocidad gradual comienza a impulsar el eje Z con velocidad constante vz y a aumentar la variable Z. Este estado se mantiene hasta que se ha alcanzado el umbral de conmutación wE+(f). Por lo tanto, la magnitud de ajuste cambia a uaus(t) y el motor se detiene. Si se pasa de nuevo wE+(f), el motor permanece desconectado. Solo al sobrepasar el umbral de conmutación we- (t), el motor comienza a aumentar de nuevo la variable Z hasta que se ha sobrepasado we+(t). La regulación se detiene tan pronto el análisis Raman ha concluido con éxito.
La compensación del movimiento en el plano horizontal x, y según el subpaso 8.3 es siempre activa si el foco láser 30 se produce en el eje z. Los pasos necesarios como ejemplo de la compensación por medio de "coincidencia de patrones" se representan en la Fig. 12.
El primer paso es la elaboración de un patrón en la posición nominal horizontal con foco láser 30 producido en el plano Z. A continuación, se intenta encontrar de nuevo este patrón en la actual matriz de imagen. Si se correlaciona una sección de la actual matriz de imagen con el patrón generado, se determina el centro de la “coincidencia”. La diferencia entre coincidencia y posición nominal se puede convertir ahora en movimientos absolutos mediante una escala. Por consiguiente, los movimientos absolutos se realizan por los motores de velocidad gradual en sentido X e Y.
El patrón t(i,j) representa una matriz de escala de grises que posee una anchura hm y una altura vm . El origen del patrón en sí mismo se sitúa en la imagen original. Este representa una sección en el que el vaso 21 se encuentra centrado como objeto de destino.
Una vez el patrón se determina con éxito en la actual matriz de imagen, a partir de este se determina el centro z(x,y) con
para el centro del patrón en la actual matriz de imagen. La posición teórica ps(x,y) se puede seleccionar libremente en la matriz de imagen si se garantiza que el patrón se puede representar completamente en la matriz de imagen. La cuantía de la diferencia entre la posición real z(x,y) y la posición nominal ps(x,y) proporciona la modificación necesaria Aspx y Aspy.
Los motores de velocidad gradual empleados para los ejes X e Y poseen el mismo comportamiento dinámico que el eje Z. Los motores en el plano X-Y tienen la tarea de compensar la diferencia de tramos real srx y sry según situación. Las velocidades parametrizadas vx y vy se deben seleccionar ahora como máximo en una magnitud tal que no se produzcan modificaciones considerables dentro de la imagen diferencial debido al movimiento de los motores de velocidad gradual.
El análisis del sexo se realiza en el vaso sanguíneo 21. Partiendo del tamaño de eritrocito máximo se produce un grado máximo de modificación hasta una secuencia de imágenes de aproximadamente 70 fps. Para que estos eritrocitos 36 se puedan representar nítidamente, la modificación en la cámara 13 tiene que ascender a menos de 1 píxel, ya que, en caso contrario, se produce falta de nitidez debido al flujo.
Están presentes las siguientes ventajas de la invención reunidas: el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos seleccionado se distingue por que, en contrapartida a procedimientos basados en el contraste, es posible determinar el valor de nitidez 46 directamente en el vaso sanguíneo 21 con una desviación estándar reducida. Por consiguiente, solo es necesaria una sección de imagen reducida RFB 41 en la superficie de imagen en posición de análisis seleccionada SAF239, con lo cual el tiempo de cálculo es considerablemente más reducido que en otros procedimientos con tamaño de imagen completo según la Fig. 4.
Para que pueda tener lugar una selección óptima del vaso sanguíneo 21, es conveniente la selección de otro aumento a un objetivo 62 según la Fig. 2 u objetivo 63 según la Fig. 2a.
El primer paso para el enfoque se realiza mediante utilización, a modo de ejemplo, del procedimiento basado en el contraste “varianza”, que determina el plano más agudo independientemente de los vasos sanguíneos 21,27. La alta velocidad de paso garantiza que se pueda determinar rápidamente el plano focal a partir de una gran zona.
La utilización de la derivada de la función focal para la limitación de la zona aumenta además la robustez del sistema.
Para la compensación horizontal que trabaja paralelamente al foco es posible realizar una compensación, también en el caso de intensa modificación del eje Z, en el caso de distribución de claridad homogénea.
En especial mediante aplicación del procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos es posible un posicionamiento exacto del foco láser 30 en la vía sanguínea 21.
Con el procedimiento según la invención y los dispositivos 40 según la invención, con ventajas condicionales en el tiempo en una realización y un equipamiento automatizados, se pueden realizar conjuntamente al menos uno de los dispositivos 40 según la invención, varias veces en disposición paralela, para acelerar el paso por debajo del dispositivo óptico 5 de muchos huevos 1 que atraviesan en paralelo para su determinación de sexo. Esto se puede efectuar también mediante el empleo de una unidad de control central, que puede estar en conexión técnica con abastecimiento de energía y técnica de señalización con las unidades de control 45 individuales, o bien las unidades de evaluación de los dispositivos 40, a través de líneas de conexión o sin cable.
Lista de signos de referencia
1 Huevo
2 Orificio en la cáscara
3 Láser de excitación
3a Radiación láser introducida en el orificio de la cáscara
4a Radiación láser fibra de vidrio óptica que conduce al huevo
4b Radiación retrodispersada/radiación dispersa Raman fibra optica que conduce al espectrómetro/detector 5 Dispositivo óptico para la introducción de radiación láser 3a, para el registro de la radiación retrodispersada 7 y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2
6 Objetivo
7 Radiación retrodispersada/radiación dispersa Raman/radiación de fluorescencia
8 Espectrómetro con detector
9 Instalación de evaluación
10 Fuente lumínica/instalación de iluminación
10a Luz con la que se irradia el huevo de ave
10b Luz visible transmitida, o bien dispersa
11 Filtro verde
12 Lente
13 Cámara para la detección de luz 10b/detector
14 Instalación de evaluación de posición de vaso sanguíneo
15 Línea de control
16 Unidad de posicionamiento xyz para el control de la posición del huevo
17 Líneas de control
18 Unidad de posicionamiento x,y,z coordinativa/unidad de control
19 Instalación de radiación
20 Dispositivo del estado de la técnica
21 Vaso sanguíneo
22 Embrión
23 Divisor de radiación
24 Polo agudo
25 Superficie
26 Capa de albúmina
27 Entramado de vasos sanguíneos
28 Cáscara
29 Matriz CCD
30 Foco láser
31 Unidad de evaluación
32 Línea de conexión con la cámara,
33 Línea de conexión con la instalación de soporte,
34 Línea de conexión con la fuente de radiación,
35 Línea de conexión con la unidad de posicionamiento x, y, x coordinativa,
36 Línea de conexión con la instalación de evaluación para mediciones ópticas,
37 Colimador
38 Primer objetivo de cámara
39 Superficie de imagen en posición de análisis SAF2
40 Dispositivo según la invención
41 Superficie de imagen reducida RBF - ROI
42 Trayectoria del haz
43 Foco del objetivo de cámara
44 Primer revólver/cambiador de objetivo
45 Ordenador
46 Máximo del valor de nitidez normalizado en sentido del eje Z
61 Primer objetivo de medición
62 Segundo objetivo de medición
63 Segundo objetivo de cámara
64 Segundo revólver/cambiador de objetivo
65 Superficie de imagen en posición de análisis SAF1
66 Talle del foco láser
67 Unidad de generación de orificios
68 Línea eléctrica
at Parámetro para la transformación lineal
Aij Superficie de un bloque en la posición i, j
Amax Superficie máxima
bt Parámetro para la transformación lineal
b Imagen binaria
B Tamaño de bloque
ci Ajuste de coeficiente para filtro de Savitzky-Golay
fi Punto de medición en el punto i
g Función de escala de grises
ggm Función de nivelado mediante valor medio móvil
gij Píxel de objeto
gRB Función de partida según algoritmo de Rolling-Ball
gSG Función de nivelado según Savitzky-Golay
hm Anchura de una matriz de imagen
i Variable de control
l Intensidad de la matriz de escala de grises
j Variable de control
k Posición
K1, K2 Número de bloques
l Variable de control
n Número
nR, nL Valor vecino a la derecha y a la izquierda
o Matriz de imagen segmentada
pS Posición nominal
pE+ Valor porcentual para valor de conmutación superior
pE- Valor porcentual para valor de conmutación inferior
q Factor para la determinación del alcance de la desviación estándar R Valor Umbral máximo
Spx1, Spx2 Recorrido en píxeles
Srx Recorrido real en sentido x
Srz Recorrido real en sentido z
S Valor de nitidez
SW Valor umbral
t Tiempo; patrón
T Transformación lineal
TP Paso bajo
u Magnitud de ajuste
Uaus, Uein Magnitud de ajuste aus y ein
U Dif Diferencia de imagen diferencial
Vz Velocidad en sentido z
Vz-exacto Velocidad en sentido z para posicionamiento exacto
w Variable de referencia; anchura de ventana
wE+ Variable de referencia umbral de conmutación superior wE- Variable de referencia umbral de conmutación inferior x Posición del píxel en la matriz de imagen en sentido x xc Centroide en sentido x
X Posición del eje en sentido x
y Posición del píxel en la matriz de imagen en sentido y yc Centroide en sentido y
vm Altura de una matriz de imagen
Y Posición del eje en sentido y
z Centro
Z Posición del eje en sentido z A Modificación general
j Valor medio
a Desviación estándar
Claims (19)
- REIVINDICACIONES1 Procedimiento para el ajuste del foco láser (30) de un láser de excitación (3) en un vaso sanguíneo (21) para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave (1), siendo móvil en el huevo (1) los vasos sanguíneos (21), incluyendo el embrión (22), y no estando aún fijados a la cáscara (28) los vasos sanguíneos (21), incluyendo el embrión (22), en el momento de una medición óptica de la radiación retrodispersada (7), caracterizado por los siguientes pasos:- selección de un vaso sanguíneo (21) en el huevo de ave (1) perforado e incubado por medio de un procedimiento de evaluación basado en el contraste, bajo al menos una iluminación de un entramado de vasos sanguíneos (27) con radiación en el intervalo de longitud de onda verde por medio de un dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,- producción del foco láser (30) para el láser de excitación (3) y de un foco (43) para una cámara (13) en el vaso sanguíneo seleccionado (21) a través del orificio (2) orientado al vaso (21) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,- ajuste del foco láser (30) dentro del vaso sanguíneo (21) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, por medio de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos en base a las modificaciones de intensidad que se presentan en cada caso en dos imágenes registradas sucesivamente de modo concomitante a consecuencia del movimiento de eritrocitos (36) dentro del vaso sanguíneo seleccionado (21), como valores de intensidad It-i(x), It(x) en la posición del píxel x respecto al tiempo t-1 y t, y seguimiento del foco láser (30) y del foco (43) de la cámara (13) en el descenso de la superficie del entramado de vasos sanguíneos (27) y una capa de albúmina (26) que se encuentra sobre el entramado de vasos sanguíneos (27),- compensación de movimientos horizontales x, y producidos del vaso sanguíneo seleccionado (21) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,- realización de mediciones ópticas por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2.
- 2. - Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que, como radiación retrodispersada (7) a medir, reflejada a partir del vaso sanguíneo (21), se puede seleccionar una radiación dispersa Raman y/o una radiación de fluorescencia retrodispersada para las mediciones ópticas.
- 3. - Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por los siguientes pasos:- introducción de un orificio (2) en la cáscara (28) por medio de una unidad de generación de orificios y posicionamiento de los vasos sanguíneos (21) en la zona del orificio (2),- búsqueda de los vasos sanguíneos (21) que se forman en el huevo de ave (1) por medio de un sistema de visión (10, 13) constituido al menos por una instalación de radiación (10) y por un detector (13) y una iluminación coaxial o lateral con luz (10a) del intervalo de longitud de onda visible,- posicionamiento de al menos el vaso sanguíneo (21) en el foco láser (30) del láser de excitación (3) mediante movimiento del huevo de ave (1) por medio de una unidad de posicionamiento controlada (16) o mediante un movimiento total del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, o mediante un cambio de al menos un objetivo (61, 62; 38, 63) o mediante un objetivo (61; 38) con aumento variable en el dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,- registro de la radiación retrodispersada (7) del vaso sanguíneo (21) irradiado por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, pudiéndose evitar durante el registro de la radiación retrodispersada (7) un movimiento del vaso sanguíneo (21) fuera del foco láser (30) y del foco (43) de la cámara (13) mediante seguimiento del huevo de ave (1) por medio de una unidad de posicionamiento (16) controlada y/o mediante un movimiento total del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis (SAF1, SAF2), o tras un cambio de al menos un objetivo (61,62; 38, 63) o tras un cambio de aumento respectivamente de uno de los objetivos (61; 38) en el dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,- evaluación de la radiación retrodispersada (7) y determinación del sexo del embrión en una unidad de evaluación (9),- indicación del sexo del embrión en el huevo de ave (1),caracterizado por que en la unidad de evaluación (9) se realiza un procedimiento basado en el contraste para la determinación de una superficie de imagen en posición de análisis total SAF1 (65) con el entramado de vasos sanguíneos (27) a través de medios técnicos de programa en un primer algoritmo, y realizándose en la unidad de evaluación (9), a través de medios técnicos de programa en un segundo algoritmo, un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos para el ajuste del foco láser (30) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2 sobre una superficie de imagen reducida RBF (41) en la superficie de imagen en posición de absorción SAF2 (39) con el vaso sanguíneo seleccionado (21), comparándose en el procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos los contenidos en intensidad It-i(x), It(x) de al menos dos imágenes sucesivas de la superficie de imagen reducida al vaso sanguíneo seleccionado (21) RBF - ROI -(41) dentro de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 (39), formándose de diferente manera los valores de intensidad It-1 (x), It(x) de los movimientos de eritrocitos que se reflejan respectivamente en la superficie de imagen RBF (41), y ajustándose el foco láser (30) del láser de excitación (3) y el foco (43) de la cámara (13) por medio del dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, en una superficie de imagen RBF reducida (41) asignada al vaso sanguíneo seleccionado (21), encontrándose el foco láser (30) y el foco (43) siempre dentro del vaso sanguíneo seleccionado (21).
- 4. - Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que se emplea como luz (10a) una radiación del intervalo de longitud de onda visible o del intervalo de longitud de onda verde de la fuente de radiación (10) del sistema de visión (10, 13) para el control de la evolución a lo largo del tiempo de procesos en la incubación del huevo de ave (1).
- 5. - Procedimiento según la reivindicación 2 a 4, caracterizado por que el procedimiento de medición óptico para la determinación del sexo in ovo de huevos de ave (1) fecundados e incubados se realiza al menos después de 48 horas de incubación.
- 6. - Procedimiento según las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que se emplean los siguientes parámetros para las mediciones ópticas de la radiación dispersa Raman retrodispersada por el vaso sanguíneo (21):- longitudes de onda de excitación de la radiación láser (3a) del láser de excitación (3): > 600 nm (por ejemplo, láser HeNe 633 nm, láser de cuerpo sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd: YAG 1064 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo 785 nm),- acoplamiento de la radiación láser (3a) directamente con espejos y/o con fibras ópticas (4a),- mediciones de radiación dispersa Raman bajo utilización de un dispositivo óptico (5) con gran apertura numérica, como objetivos de microscopio (61) o una sonda de fibra (4b),- desacoplamiento directo de la radiación dispersa Raman recogida (7) por medio de espejos respecto a un espectrómetro (8) o por medio de transporte a través de fibras ópticas,- empleo de un espectrómetro (8) en forma de espectrómetro dispersivo y espectrómetro de transformada de Fourier.
- 7. - Procedimiento según las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que se emplean los siguientes parámetros para las mediciones ópticas de radiación de fluorescencia retrodispersada por el vaso sanguíneo (21):- longitudes de onda de excitación de la radiación láser (3a) del láser de excitación (3): > 400 nm (por ejemplo, láser HeNe 633 nm, láser de cuerpo sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd: YAG 532 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo 785 nm),- acoplamiento de la radiación láser (3a) directamente con espejos y/o con fibras ópticas (4a),- mediciones de radiación de fluorescencia bajo utilización de dispositivos ópticos (5), como objetivos de microscopio (61) o una sonda de fibra (4b),- desacoplamiento directo de la radiación de fluorescencia recogida (7) por medio de al menos un espejo o por medio de transporte a través de fibras ópticas,- empleo de un detector (8).
- 8. - Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que, durante un proceso de posicionamiento del huevo de ave (1), se registran permanentemente y se alimentan a una evaluación valores de medida de mediciones ópticas, efectuándose una clasificación automática de la radiación retrodispersada (7) por medio de una huella dactilar espectral de la sangre.
- 9. - Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que el huevo de ave (1) se sensibiliza en los polos.
- 10. - Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que se forma un orificio (2) en la zona del polo agudo orientado hacia arriba (24), con un tamaño de orificio de hasta 18 mm, por medio de la unidad de generación de orificios al menos después de 48 horas de incubación.
- 11. - Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que se forma un orificio (2) en el polo romo orientado hacia arriba del huevo de ave (1) con un diámetro de hasta 18 mm, preferentemente entre 8 mm y 12 mm, por medio de la unidad de generación de orificios.
- 12. - Procedimiento según la reivindicación 1 a 6 y 8 a 11, caracterizado por que el procedimiento de medición óptico se realiza como procedimiento de medición in ovo por espectroscopía Raman para la determinación del sexo de huevos de ave (1) fecundados e incubados al menos después de 48 horas de incubación.
- 13. - Dispositivo (40) para el ajuste del foco láser (30) de un láser de excitación (3) en un vaso sanguíneo (21) para mediciones ópticas para la determinación del sexo de huevos de ave (1), siendo móviles en el huevo de ave (1) los vasos sanguíneos (21), incluyendo el embrión (22), y no estando estos aún fijados a la cáscara (28) en el momento de una medición óptica de la radiación retrodispersada (7), estando equipado el dispositivo para realizar un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12 y comprendiendo el dispositivo (40) al menos- una instalación de soporte (16) para el huevo de ave (1) provisto de un orificio (2), estando almacenados los huevos de ave (1) respectivamente con un polo (24) hacia arriba,- una fuente de radiación (10) para la iluminación de la superficie que se encuentra en el huevo de ave (1) con capa de albúmina (26) y con entramado de vasos sanguíneos (27),- una unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa (18) para un dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2,- el dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, que contiene por lo menos - al menos un objetivo de medición (61,62),- un divisor de radiación (23),- una cámara (13) con al menos un objetivo de cámara (38, 63), sirviendo el dispositivo óptico (5) para la modificación de representación entre una imagen de SAF1 (65) y una imagen de RBF (41), refiriéndose la imagen de SAF1 (65) a la superficie de imagen total del entramado de vasos sanguíneos (27) y la imagen de RBF (41) a la superficie de imagen reducida del vaso sanguíneo (21) seleccionado,- una instalación de evaluación (9) para espectros ópticos,- una unidad de evaluación (31) que comprende al menos- una línea de conexión (32) con la cámara (13),- una línea de conexión (33) con la instalación de soporte (16),- una línea de conexión (34) con la fuente de radiación (10),- una línea de conexión (35) con la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa (18),- una línea de conexión (36) con la instalación de evaluación (9) para mediciones ópticas,la unidad de evaluación (31) medios técnicos de programa para la realización de un procedimiento basado en el contraste, que se refiere a una superficie de imagen total SAF1 (65) con el entramado de vasos sanguíneos (27), y de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, que se refiere a la superficie de imagen reducida RBF (41) de la superficie de imagen en posición de análisis SAF2 (39) seleccionada con un vaso sanguíneo (21) seleccionado del entramado de vasos sanguíneos (27).
- 14. - Dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado por que en el dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2, están contenidos un primer objetivo de medición (61) para la realización de un procedimiento de evaluación basado en el contraste y un segundo objetivo de medición (62) para la realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, introduciéndose alternantemente los objetivos de medición (61,62) en la trayectoria del haz (42) de la cámara (13) en cada caso para la realización de ambos procedimientos.
- 15. - Dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado por que, en lugar de ambos objetivos de medición (61, 62), se introduce un objetivo de medición con aumento variable en la trayectoria del haz (42) de la cámara (13), de modo que no son necesarios un segundo objetivo de medición ni un desplazamiento de objetivos.
- 16. - Dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado por que en el dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser (3a), para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAFi, SAF2, están contenidos un primer objetivo de cámara (38) para la realización de un procedimiento de evaluación basado en el contraste y un segundo objetivo de cámara (63) para la realización de un procedimiento de imagen diferencial basado en el movimiento de eritrocitos, introduciéndose alternantemente los objetivos de cámara (38, 63) en la trayectoria del haz (42) de la cámara (13) en cada caso para la realización de ambos procedimientos.
- 17. - Dispositivo según la reivindicación 16, caracterizado por que, en lugar de ambos objetivos de cámara (38, 63), se introduce un objetivo de cámara con aumento variable en la trayectoria del haz (42) de la cámara (13), de modo que no son necesarios un segundo objetivo de cámara ni un desplazamiento de objetivos.
- 18. - Dispositivo según las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por que el dispositivo óptico (5) para la introducción de radiación láser, para el registro de la radiación retrodispersada (7) y superficies de imagen en posición de análisis SAF1, SAF2 está unido a la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa (18), pudiendo mover la unidad de posicionamiento x, y, z coordinativa (18) el dispositivo óptico (5) en sentido x, y, z de manera controlada.
- 19. - Dispositivo según las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado por que la radiación retrodispersada (7) a medir, reflejada a partir del vaso sanguíneo (21), es una radiación dispersa Raman y/o una radiación de fluorescencia retrodispersada.
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