ES2853740T3 - Polímeros de impresión molecular para su uso en el tratamiento de una enfermedad - Google Patents

Abstract

Polímeros de impresión molecular (PIM) para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o profilaxis de una enfermedad causada por un error innato del metabolismo, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la fenilcetonuria (PKU, enfermedad de Følling), la hiperfenilalaninemia (HPA), la alcaptonuria (enfermedad de la orina negra) y la tirosinemia, y la hipertirosinemia, que consiste en administrar al tracto gastrointestinal de un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de una composición de dichos polímeros de impresión molecular (PIM), siendo dicha composición capaz de unirse a un agente provocador de los síntomas de dicha enfermedad, en la que el agente provocador de los síntomas es la L-fenilalanina.

Description

DESCRIPCIÓN

Polímeros de impresión molecular para su uso en el tratamiento de una enfermedad

Campo de la invención

La invención se refiere a polímeros de impresión molecular para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad causada por un error innato del metabolismo, en el que las biomoléculas derivadas de una dieta ordinaria provocan síntomas de enfermedad en los pacientes.

Antecedentes de la invención

La cromatografía de afinidad es un procedimiento que aprovecha la interacción entre una molécula de la matriz cromatográfica y un socio aglutinante de la molécula para seleccionar una subpoblación de socios aglutinantes de un conjunto más grande de sustancias con afinidad variable a la molécula o de una mezcla cruda, como un caldo de fermentación.

Los procedimientos, como la cromatografía de afinidad, que utiliza la unión entre moléculas con el fin de purificar, analizar, diagnosticar, etc., están intrínsecamente limitados por el obstáculo estérico causado por la orientación de la molécula en la matriz cromatográfica y por la forma en que se acopla a una matriz (a través de una molécula portadora, un espaciador, un enlazador, etc.). Como consecuencia de ello, sólo una parte limitada del conjunto total de sitios de unión discretos de la molécula está expuesta al receptor; los que se utilizan para el acoplamiento a la matriz no son accesibles a los socios de unión que se ponen en contacto con la matriz cromatográfica revestida. En muchos casos, esto no presenta un problema, ya que sólo una característica vinculante particular del socio vinculante es de interés.

En el desarrollo de receptores, ya sean los llamados receptores naturales como los anticuerpos, o los sintéticos como los polímeros de impresión molecular (PIM), la selección/aislamiento de las mejores entidades receptoras individuales vinculantes -moléculas de anticuerpos o partículas PIM, ya sean solubles o insolubles- es un medio de mejorar la afinidad, la especificidad, la capacidad, etc. del producto resultante basado en el receptor -en relación con los PIM, véase el documento WO 2007/095949, donde se revelan los procedimientos de purificación que dan lugar a composiciones PIM que han mejorado la afinidad de unión y la capacidad de una molécula objetivo.

El documento KR100841421B revela el uso de polímeros de impresión molecular con una selectividad de adsorción mejorada y capacidad para separar varios aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina, la histidina, la leucina y la isoleucina como material de separación en la cromatografía líquida. Sin embargo, es necesario mejorar aún más las características de unión de composiciones como los PIM y los anticuerpos policlonales.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cuando se preparan composiciones de receptores para una molécula objetivo, la afinidad o avidez por unirse a la molécula objetivo depende de varios factores. Las moléculas receptoras relativamente grandes, como los anticuerpos policlonales y los PIM, se unen a objetivos más pequeños en una serie de lugares discretos diferentes de los objetivos, y un procedimiento de purificación que utilice la molécula objetivo como agente de captura en una matriz cromatográfica, en la que la molécula objetivo se une a través de un grupo funcional particular, tendrá como consecuencia que el producto purificado no necesariamente se une a ese grupo funcional (porque no es accesible a la unión después de ser acoplado a la matriz). Por otra parte, la naturaleza misma de esos receptores de unión de múltiples sitios es que las moléculas obtenidas después de una primera ronda de purificación incluirán receptores que unen al menos parcialmente el sitio no accesible de la primera ronda de purificación. Por lo tanto, si se dan otros pasos, que utilizan la misma molécula objetivo como agente de captura, pero unida a través de una funcionalidad diferente, debería ser posible enriquecerse aún más para aquellos receptores que también exhiben una afinidad razonablemente alta por el "sitio de unión oculto" en el primer paso de la purificación.

También será posible enriquecer para los receptores que se unen a una parte "característica" de la molécula objetivo prevista - para cada paso de la purificación donde una funcionalidad está oculta a través de su unión a una matriz, los receptores que dependen de la funcionalidad oculta para su unión se excluirán durante el procedimiento de purificación - así, si la molécula objetivo incluye funcionalidades no características que son compartidas con otras numerosas moléculas (como es el caso de los aminoácidos que tienen cada uno un terminal N y un terminal C que son estructuralmente idénticos de aminoácido a aminoácido), un procedimiento de purificación de varios pasos en el que cada una de las funcionalidades no características a su vez están ocultas debería proporcionar una composición de receptores que unen lo que es realmente característico para la molécula objetivo.

La presente invención se refiere a los polímeros de impresión molecular (PIM) para su utilización en un procedimiento de tratamiento, mejora o profilaxis de una enfermedad causada por un error innato del metabolismo, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la fenilcetonuria (PKU, enfermedad de F0lling), la hiperfenilalaninemia (HPA) y la alcaptonuria (enfermedad de la orina negra), tirosinemia e hipertirosinemia, que comprende administrar al tracto gastrointestinal de un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de una composición de dichos polímeros de impresión molecular (PIM), siendo dicha composición capaz de aglutinar un agente provocador de síntomas de dicha enfermedad, siendo el agente provocador de síntomas la L-fenilalanina. En una realización de la presente invención, la composición de los PIM para su uso en el procedimiento para el tratamiento, mejora o profilaxis de las enfermedades mencionadas puede ser preparada según un procedimiento para preparar una composición enriquecida para los PIM que se unen a un agente, donde cada uno de dichos PIM se unen específicamente al menos a dos sitios discretos en dicho agente, el procedimiento comprende

a1. proporcionr una muestra que comprende dichos PIM,

b1. someter dicha muestra a un primer paso de cromatografía de afinidad, donde dicho agente se utiliza como agente de purificación de afinidad, y donde dicho agente se inmoviliza a una fase sólida o semisólida por medio de la unión a uno solo de dichos al menos dos sitios discretos, por lo menos,

c1. recuperar los PIMs que se unen al agente,

d1. someter a los PIM recuperados en el paso anterior a por lo menos un paso más de cromatografía de afinidad, donde dicho agente se utiliza como agente de purificación de afinidad, y donde dicho agente se inmoviliza a una fase sólida o semisólida mediante la unión a otro de dichos por lo menos dos sitios discretos, y recuperar los PIM unidos al agente,

en el que, en cada uno de dicho al menos un paso más de cromatografía de afinidad, dicho otro de dicho al menos dos sitios discretos es diferente de uno cualquiera de dicho al menos dos sitios discretos, que ha sido usado previamente en los pasos b1 y d1 para la inmovilización del agente a una fase sólida o semisólida, o que comprende

c2. proporcionar una muestra que comprenda dichos PIM y posteriormente

d2. aislar los PIM que se unen al agente por medio de la aglutinación donde los PIM unen varios de dichos agentes.

En otra realización de la presente invención, la composición de los PIM para su uso en el procedimiento para el tratamiento, mejora o profilaxis de las enfermedades mencionadas anteriormente también puede prepararse según un procedimiento para preparar una composición enriquecida para los PIM que se unen a un agente, donde cada uno de dichos PIM se unen específicamente al menos a dos sitios discretos de dicho agente, el procedimiento comprende la preparación de al menos dos composiciones según el procedimiento antes mencionado y la posterior combinación de dichas composiciones para obtener la composición enriquecida para PIM que se unen al agente, en el que el mismo agente se utiliza en los pasos b1 y d1 en la preparación de las al menos dos composiciones, y en el que i. la combinación de sitios discretos en el agente, que se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida con el fin de preparar cada una de dichas al menos dos composiciones, difieren para al menos dos composiciones, y/o ii. el orden secuencial en el que los sitios discretos en el agente se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida con el fin de preparar cada una de dichas al menos dos composiciones difieren en la preparación de al menos dos de dichas al menos dos composiciones.

Divulgación detallada de la invención

Definiciones

El término "receptor" se utiliza en la presente memoria para designar una sustancia que muestra afinidad por, y es capaz de unirse específicamente a, un agente de interés, es decir, un objetivo. Por lo tanto, el término abarca lo que normalmente se denomina moléculas receptoras biológicas, pero también otras moléculas que ejercen una unión específica, como anticuerpos y polímeros de impresión molecular. La calidad de la unión específica es importante en este contexto, y excluye efectivamente las sustancias que se unen a una serie de objetivos no relacionados; sin embargo, no se excluye la reactividad cruzada de un receptor para unirse a moléculas aparentemente no relacionadas, ya que esta característica requiere la existencia de un elemento estructural común en los dos objetivos que están unidos por el receptor. Típicamente, la unión específica se caracteriza por una mayor afinidad de unión a un objetivo que a una o varias moléculas irrelevantes que se utilizan como controles negativos en un ensayo de unión.

Un "polímero de impresión molecular" (PIM) es un polímero que comprende cavidades (o vacíos) que corresponden, al menos en parte, a una o más moléculas plantilla que han sido incorporadas en una matriz de monómeros, incluidos los monómeros de enlace cruzado, antes de la polimerización. El polímero resultante después de la polimerización incluye una serie de cavidades que corresponden en forma a la molécula plantilla. Típicamente, el PIM es secuestrado en pequeñas partículas, facilitando así la eliminación de la plantilla y dejando cavidades parciales abiertas para la interacción con una molécula objetivo que se asemeje o sea idéntica a la molécula de la plantilla. En la presente memoria y reivindicaciones, el término PIM se refiere generalmente a cualquier forma de PIM (tanto soluble como insoluble), lo que significa que los términos "PIM" y "PIMs" se utilizan indistintamente con las expresiones partícula PIM y partículas PIM, respectivamente.

Se entenderá que algunos PIM purificados o empleados en la presente invención son moléculas/entidades insolubles - este es el caso, por ejemplo, de los PIM preparados según los principios del documento WO 2007/095949. Estos PIM son especialmente adecuados como productos farmacéuticos para su uso en el tracto gastrointestinal, ya que su insolubilidad limita o impide su paso al cuerpo (por ejemplo, a la circulación) desde el tracto gastrointestinal. En otras palabras, cuando se administran por vía oral, los PIM insolubles utilizados en la presente invención permanecerán sustancialmente confinados al tracto gastrointestinal hasta que se eliminen en las heces.

Sin embargo, los PIM purificados según los principios presentados en la presente memoria pueden ser también PIM solubles, que son útiles en varias aplicaciones diferentes, donde no es de especial interés confinar los PIM al tracto gastrointestinal.

Un "anticuerpo" es una biomolécula soluble producida y secretada por los linfocitos B en respuesta a un desafío inmunológico. En el presente contexto, el término se usa principalmente para designar anticuerpos policlonales, es decir, una mezcla de anticuerpos producidos por varios clones de linfocitos B. El término también puede designar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos codificados y unidos a partículas fágicas, que se utilizan en la tecnología de visualización de fágicas. Los anticuerpos purificados según la invención pueden ser de cualquier clase de anticuerpo, y pueden ser, por ejemplo, de clase IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. También las especies de anticuerpos no humanos como los anticuerpos de cadena simple (como los anticuerpos de camello o llama) están dentro del alcance del término.

Una "molécula objetivo" es en el presente contexto cualquier molécula a la que un receptor puede unirse específicamente y es típicamente la molécula a la que se pretende que los receptores purificados se unan cuando finalmente se utilicen los receptores para un propósito. El término "molécula objetivo" se utiliza en el presente contexto indistintamente con el término "agente", cuando se habla de la unión de un receptor con ese "agente", pero cabe señalar que el "agente" utilizado en el procedimiento no tiene que ser necesariamente idéntico a la molécula objetivo, sino que el agente es con bastante frecuencia un imitador o un derivado de la molécula objetivo, lo que resulta útil para los pasos de purificación que se examinan en el presente documento. El agente puede, por ejemplo, constituir parte de una molécula mayor en comparación con la molécula objetivo - por ejemplo, si la molécula objetivo prevista es un aminoácido, también el correspondiente resto de aminoácido que forma parte de una proteína o péptido puede ser útil como agente en los pasos b y d. Por ejemplo, el proceso de purificación puede configurarse para enriquecer los receptores que unen un resto de aminoácido, en el que en una etapa de la purificación se emplea un péptido en el que el aminoácido se encuentra en el extremo C, y en otra etapa se emplea el aminoácido en el extremo N de un péptido; en tal caso, el agente es la sustancia utilizada en las etapas de purificación, mientras que se considera que la molécula objetivo es la sustancia que está efectivamente unida a los receptores enriquecidos.

De igual modo, una "molécula plantilla" es normalmente idéntica a una molécula/agente objetivo, pero también puede ser un imitador o un derivado de ella (es decir, una molécula que tiene, al menos en parte, una estructura y un perfil tridimensional idénticos que coinciden con los de la molécula objetivo; un imitador puede, por ejemplo, estar constituido por un fragmento de la molécula objetivo). La plantilla sirve como "generador" de los vacíos en la estructura del PIM que posteriormente deben ser capaces de unirse a la molécula objetivo.

Cabe señalar también que las composiciones de receptores enriquecidos (por ejemplo, las composiciones PIM) pueden ejercer una unión específica a otras moléculas distintas de las utilizadas como plantillas o de las utilizadas como agentes en el procedimiento descrito en el presente documento. Por lo tanto, esas composiciones de receptores pueden utilizarse en bibliotecas que pueden ser examinadas para determinar si se unen a moléculas objetivo potenciales (y no necesariamente relacionadas). Esto puede compararse con la tecnología de visualización de fagos, en la que se ha mostrado que los fagos que expresan moléculas receptoras (por ejemplo, las bibliotecas de anticuerpos) se unen a moléculas de origen completamente diferente al antígeno utilizado originalmente para unirse a las moléculas receptoras. Por ejemplo, en la 6a Reunión Internacional sobre Impresión Molecular, del 9 al 12 de agosto de 2010, en Nueva Orleans, ^lA, el Dr. Ecevit Yilmaz (SE) presentó ejemplos publicados de PIM que muestran una reactividad cruzada con moléculas muy diferentes en estructura a la molécula plantilla originalmente utilizada en el proceso de síntesis de PIM. Además, el Dr. Yilmaz presentó bibliotecas genéricas de PIM que pueden utilizarse para identificar composiciones de polímeros con afinidad hacia una molécula objetivo específica. Después de dicha identificación, el polímero seleccionado podría someterse al proceso de purificación por afinidad descrito en esta patente y, de este modo, lograr PIM con mayor capacidad que los PIM crudos no purificados.

"Cromatografía de afinidad" denota cualquier procedimiento de purificación de un receptor en el que se utiliza una unión específica entre el receptor y un compañero de unión mediante un agente de purificación de afinidad unido a un soporte sólido (como una matriz cromatográfica) que atrapa la sustancia. Ejemplos típicos conocidos en la técnica son la purificación por afinidad utilizando anticuerpos como agentes de captura acoplados a cuentas cromatográficas para purificar los antígenos que se unen al anticuerpo. Se entenderá que los procedimientos de purificación de afinidad aplicados según la presente invención son los que son capaces de PIM partículas con las características discutidas en la presente memoria. Por lo tanto, un procedimiento típico de purificación por afinidad para PIMs insolubles podría ser la adsorción en lecho expandido (EBA), conocida por un experto en la técnica. Una "fase sólida o semisólida" es, en el presente contexto, cualquier material que pueda utilizarse para anclar un agente de captura mediante una unión covalente o no covalente. Por lo tanto, cualquier material (polímeros plásticos, azúcares, metales, vidrio, sílice, caucho, etc.) que se utilice convencionalmente en la preparación de materiales cromatográficos puede servir de fase sólida. El material en fase sólida puede contener grupos funcionales adecuados que permitan el acoplamiento del agente de captura al material en cuestión. Tales materiales derivados son conocidos por el experto en la técnica de la purificación cromatográfica de proteínas y otras macromoléculas. Además, la fase sólida puede tener cualquier forma física que permita la captura de partículas relativamente grandes e insolubles como los PMI (cuando se compara con biomoléculas únicas como las proteínas). Por lo tanto, la fase sólida puede tener la forma de fibras (preferiblemente huecas), una matriz cromatográfica (preferiblemente una matriz adecuada para EBA), perlas (preferiblemente las que pueden separarse por medios magnéticos) o cualquier otra forma adecuada, véase más adelante.

Un oligonucleótido es una secuencia corta de nucleótidos, que suele tener una longitud máxima de 30 nucleótidos, como máximo 25, como máximo 20, como máximo 19, como máximo 18, como máximo 17, como máximo 16, como máximo 15, como máximo 14, como máximo 13, como máximo 12, como máximo 11, y como máximo restos de nucleótidos. Tanto los oligonucleótidos de ARN como de ADN están cubiertos por el término.

Un "derivado de oligonucleótido" tiene por objeto denotar oligonucleótidos derivados, en los que la columna vertebral es esencialmente la misma que en un oligonucleótido, pero en los que se introducen cambios químicos en los azúcares de la columna vertebral de la ribosa, por lo que el término incluye en su ámbito de aplicación moléculas como las que incluyen nucleótidos de ARN en la secuencia. Sin embargo, los derivados de los oligonucleótidos también pueden ser imitadores de oligonucleótidos como el PNA.

Realizaciones de un primer aspecto que no está de acuerdo con la invención

Un primer aspecto que no está de acuerdo con la invención en la presente memoria descrita se refiere a un procedimiento para preparar una composición enriquecida para los receptores que unen un agente, donde dichos receptores cada uno específicamente unen al menos dos sitios discretos en dicho agente, el procedimiento que comprende

a. proporcionar una muestra que comprenda dichos receptores,

b. someter dicha muestra a un primer paso de cromatografía de afinidad, donde dicho agente se utiliza como agente de purificación de afinidad, y donde dicho agente se inmoviliza a una fase sólida o semisólida por medio de la unión a uno de dichos al menos dos sitios discretos,

c. recuperar los receptores que se unen al agente,

d. someter a los receptores recuperados en el paso anterior a por lo menos un paso más de cromatografía de afinidad, donde dicho agente se utiliza como agente de purificación de afinidad, y donde dicho agente se inmoviliza a una fase sólida o semisólida mediante la unión a otro de dichos por lo menos dos sitios discretos, y recuperando los receptores que se unen al agente,

en el que, en cada uno de los dichos al menos un paso más de cromatografía de afinidad, dicho otro de dichos al menos dos sitios discretos es diferente de uno cualquiera de los dichos al menos dos sitios discretos, que se ha utilizado anteriormente en los pasos b y d para la inmovilización del agente a un sólido de fase semisólida.

El principio permite, pues, el enriquecimiento de los receptores en una composición inicial, que se unen a estructuras del agente que abarcan tanto la parte accesible del agente en la primera ronda de cromatografía de afinidad como la parte accesible del agente en la segunda y en las rondas posteriores de cromatografía de afinidad.

Como se ha mencionado anteriormente, el agente puede formar parte de una molécula mayor; un ejemplo práctico es el caso en que la molécula objetivo es un aminoácido como la fenilalanina (u otro aminoácido, véase más adelante), así como péptidos cortos que incluyen el aminoácido. A fin de poder enriquecer para los receptores que se unen al aminoácido de manera óptima, se puede, por ejemplo, preparar un dipéptido, en el que el aminoácido está presente como resto de aminoácido N-terminal y luego acoplar el péptido a la fase sólida o semisólida en el primer paso de purificación. Para enriquecer aún más, un péptido en el que el aminoácido es ahora el resto de aminoácido C-terminal puede acoplarse a la fase sólida o semisólida a través de su N-terminal en el siguiente paso de purificación. El paso combinado habrá enriquecido la composición para aquellos receptores que se unen a las partes del aminoácido que no están exclusivamente involucrados en los enlaces peptídicos o que constituyen el N- o C-terminal libre.

Los receptores se seleccionan típicamente del grupo que consiste en polímeros de impresión molecular (PIM) y anticuerpos policlonales, en el que se desea obtener una mezcla enriquecida de estas moléculas, pero los receptores pueden ser también, por ejemplo, una población de partículas fágicas que expresan fragmentos de anticuerpos en sus superficies. En esencia, la tecnología abarca entonces dos rondas de paneo contra un agente de captura, que tiene diferentes orientaciones en las dos rondas. Así pues, la presente invención encuentra un uso especial en situaciones en las que el receptor tiene una zona de contacto relativamente grande en comparación con la densidad de las zonas de superficie pertinentes de la molécula objetivo.

El procedimiento del primer aspecto es aplicable en situaciones en las que los receptores son seleccionados de PIM solubles o insolubles y en una realización dichos receptores son PIM insolubles. En otro caso, dichos receptores son PIM solubles.

En algunas realizaciones dichos receptores son anticuerpos policlonales monoespecíficos. El término "monoespecífico" significa que los diferentes anticuerpos que constituyen el anticuerpo policlonal se unen específicamente al mismo agente.

La cromatografía de afinidad puede realizarse por procedimientos conocidos por la persona experta. Por ejemplo, la cromatografía de afinidad puede implicar el uso de un sistema de lecho fluidizado, como un sistema de absorción de lecho expandido; esto es particularmente útil cuando los receptores son moléculas suspendidas insolubles. Sin embargo, la cromatografía de afinidad también puede ser la cromatografía tradicional en columna (incluidos los modos de HPLC y FPLC), que son particularmente útiles para los receptores solubles.

En las realizaciones anteriormente descritas, el agente puede ser una sustancia química con la fórmula H3N+-CH(R)-COO-, como un aminoácido, o el agente puede ser un péptido que tiene como máximo 5 restos de aminoácidos. El aminoácido se selecciona típicamente de la fenilalanina, tirosina, histidina, leucina, metionina, isoleucina, triptófano, treonina, valina y lisina. Además, el péptido es típicamente uno, que incluye dentro de su secuencia al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la fenilalanina, la tirosina, la histidina, la leucina, la metionina, la isoleucina, el triptófano, la treonina, la valina y la lisina. En particular, estos aminoácidos aparecen como el aminoácido N-terminal y/o C-terminal en el péptido.

En las realizaciones en las que el agente es un péptido, es típicamente un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido.

En algunas otras realizaciones del primer aspecto descrito anteriormente, el agente es un hidrato de carbono, como un oligosacárido ramificado o lineal que tiene un máximo de 10 unidades de monosacárido. En ciertas realizaciones, el carbohidrato se selecciona así entre un monosacárido, un disacárido y un trisacárido. Los carbohidratos particularmente interesantes son la D-galactosa y la lactosa.

Además, el agente puede ser un ácido graso o un lípido; en caso de que el agente sea un lípido, se selecciona típicamente del grupo que consiste en el colesterol, un triglicérido y un ácido biliar o una sal del mismo.

Además, el agente puede ser un oligonucleótido o un derivado de oligonucleótido, como un oligonucleótido o derivado de oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en un oligonucleótido de ARN, un oligonucleótido de ADN, un oligonucleótido de ARNL, un oligonucleótido de ARNP y un oligonucleótido mixto. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido o derivado de oligonucleótido es un oligonucleótido mixto, que comprende al menos una unidad de ribo- o desoxoribunucleótido y al menos una unidad de nucleótido de LNA o PNA.

Todas estas realizaciones pueden ser utilizadas alternativamente empleando la aglutinación en lugar de los procedimientos cromatográficos de afinidad. En tales realizaciones del primer aspecto de la invención, el aislamiento de los receptores se obtiene por aglutinación donde los receptores forman un "puente" entre varios de los agentes objetivo.

Consideraciones prácticas

El proceso de selección/aislamiento actualmente divulgado puede utilizar una columna cargada con un medio de cromatografía (la matriz) realizada de un material insoluble (ejemplos típicos son los polisacáridos reticulados, el poliestireno, el vidrio, etc.), en el que una molécula (el agente) se acopla a la matriz mediante un enlace (típicamente) covalente a través de un grupo funcional. El agente podría ser, como se ha mencionado anteriormente, un aminoácido, un péptido, un carbohidrato, el colesterol, un ácido biliar, un triglicérido, un ácido graso, etc. Se aplica una solución o suspensión de las entidades receptoras al medio cromatográfico (en una columna o en un sistema de lecho expandido) y las entidades receptoras o las moléculas receptoras con mayor afinidad a la parte expuesta del agente se unirán al agente en el medio cromatográfico en un proceso de selección y, cuando se eluyan de la columna, esto dará lugar a la provisión de una subpoblación de entidades receptoras o moléculas con mayor afinidad y capacidad que el material de partida.

Si se realiza una segunda selección en las entidades o moléculas receptoras seleccionadas de la primera selección, pero ahora con el agente acoplado al medio cromatográfico con una orientación diferente a la de la primera selección, el resultado será una nueva subpoblación de entidades o moléculas receptoras que reconocen ambas orientaciones del agente. Estas entidades o moléculas receptoras seleccionadas dobles, o en tándem, se unirán a las moléculas del agente libres y no unidas, con mayor afinidad, especificidad y capacidad que la subpoblación de entidades o moléculas receptoras de la primera selección.

Un ejemplo es la purificación de una población de PIM que se polimeriza con fenilalanina como objetivo. Los PIM de fenilalanina realizados por Piletsky y sus colaboradores (Piletsky, S.A, Andersson, H, and Nicholls, I.A. Polymer Journal, 37 (2005) 793-796) tienen tres puntos potenciales de interacción con el objetivo específico: El anillo de fenilo, el grupo amino y el grupo carboxílico. En un proceso posterior de selección o purificación mediante cromatografía de absorción en lecho expandido (EBA) con fenilalanina como agente de afinidad, la molécula de fenilalanina puede unirse al medio EBA por el grupo amino o por el grupo carboxílico (o, en principio, también por el grupo fenilo si se le suministró un grupo reactivo). Sin embargo, como se ilustra esquemáticamente en el documento de Piletsky, los PIM pueden contener cavidades de unión que interactúan tanto con el grupo fenilo como con el grupo amino, los grupos fenilo más el grupo carboxílico, el grupo amino más el grupo carboxílico o el grupo fenilo más el grupo amino y el grupo carboxílico simultáneamente. Si los PIM de fenilalanina se purifican utilizando la absorción en lecho expandido, u otro procedimiento que permita la purificación de partículas insolubles por afinidad a la molécula objetivo, y la molécula objetivo se inmoviliza en la matriz cromatográfica a través, por ejemplo, del grupo amino de la fenilalanina, entonces se seleccionarán los PIM que tengan la mejor unión al anillo fenilo y al grupo carboxílico simultáneamente. Esta subpoblación de PIM puede contener otra subpoblación de PIM que tiene predominantemente cavidades de unión que pueden interactuar también con el anillo de fenilo y el grupo amino. Esta subpoblación debe tener cavidades de unión que pueden interactuar con el anillo fenilo, el grupo carboxílico y el grupo amino simultáneamente. Se espera que la unión de los tres grupos funcionales tenga una mayor afinidad y una mayor selectividad, y dará a las partículas de PIM una mayor capacidad de unión en comparación con las partículas de PIM que predominantemente tienen sitios de unión que sólo reconocen dos de los tres puntos potenciales de interacción, es decir, sitios de unión discretos.

En un segundo ejemplo, las partículas de PIM de fenilalanina se muelen hasta un tamaño en el que se vuelven solubles. En ese caso, las partículas de PIM individuales tendrán menos cavidades de unión en comparación con las partículas de PIM más grandes y la posibilidad de que una partícula dada tenga predominantemente un tipo de cavidades de unión, es decir, o bien cavidades de unión que puedan interactuar con los tres grupos funcionales de la molécula de fenilalanina, o bien cavidades de unión que interactúen con sólo dos de los grupos funcionales de la fenilalanina, etc. Como en el primer ejemplo, si a una primera purificación, en la que la fenilalanina se inmoviliza en la matriz cromatográfica por medio del grupo amino, le sigue una segunda purificación en la que la fenilalanina se inmoviliza en la matriz cromatográfica por medio del grupo carboxílico, la subpoblación resultante tendrá predominantemente cavidades de unión que pueden interactuar con la fenilalanina tanto con el anillo de fenilo, como con el grupo carboxílico y el grupo amino. En el caso de que los PIM sean solubles, la cromatografía no tiene que ser necesariamente una cromatografía de absorción en lecho expandido, sino que puede ser una cromatografía en lecho empacado convencional.

En un tercer ejemplo, un anticuerpo se produce contra un antígeno con un complejo conjunto de epítopos y un alto grado de estereoquímica, por ejemplo un mono o un disacárido. Cuando el agente sacárido se acopla a la matriz cromatográfica para la purificación por afinidad del anticuerpo, sólo se expone una parte del conjunto total de epítopos. La subpoblación de moléculas de anticuerpo que se purifica con el agente está en dicha orientación también puede contener otra subpoblación de moléculas de anticuerpo que reconoce una combinación de epítopos que están expuestos en dicha orientación más un conjunto de epítopos que están expuestos cuando el agente tiene una orientación diferente. Esta segunda subpoblación puede seleccionarse si la primera subpoblación se aplica a una segunda columna cromatográfica con el agente sacárido acoplado con otra orientación. Esa segunda subpoblación puede tener mayor afinidad, mayor selectividad y mayor capacidad de unión que la primera subpoblación y el anticuerpo crudo no purificado.

Realización de un segundo aspecto que no está de acuerdo con la invención

El procedimiento descrito en el primer aspecto da como resultado composiciones enriquecidas de receptores que se unen a una superficie del agente objetivo que incluye cavidades de unión definidas por todos los grupos funcionales utilizados en cada uno de los pasos cromatográficos.

Sin embargo, no puede excluirse que una fracción de los receptores de unión multisitio deseados se excluya en el primer paso cromatográfico debido a la competencia de los receptores, que posteriormente se excluyen porque no unen los dos sitios de unión discretos pertinentes del agente.

A fin de explotar plenamente varias cavidades de unión en un objetivo, al preparar una composición enriquecida de los receptores según los principios de la presente invención, un enfoque ventajoso es, por tanto, ejecutar varios procedimientos cromatográficos de afinidad en paralelo en cada paso, en los que los diferentes procedimientos utilizan la unión del agente a la matriz cromatográfica a través de diferentes sitios discretos en el agente - después de esto, el material enriquecido en el primer paso se somete a los pasos siguientes, todavía con diferentes sitios discretos de unión utilizados en los procedimientos en un paso. Finalmente, las composiciones enriquecidas de cada "brazo" de los pasos de purificación consecutivos se juntan. Esto asegura que el orden de aplicación de cada paso cromatográfico no resulte en una exclusión involuntaria de los receptores, que son realmente capaces de unir la gran área deseada en el agente.

Una versión sencilla de este enfoque supone el uso de la unión del agente mediante dos funcionalidades diferentes: la muestra que contiene las moléculas receptoras se divide en dos porciones, que se someten ambas al procedimiento del primer aspecto de la invención, pero se invierte el orden de los pasos cromatográficos; finalmente se unen las dos fracciones enriquecidas resultantes.

Formulado de manera más general, este segundo aspecto conlleva un procedimiento para preparar una composición enriquecida para los receptores que unen un agente, donde cada uno de dichos receptores unen específicamente al menos dos sitios discretos en dicho agente, el procedimiento que comprende la preparación de al menos dos composiciones según el procedimiento del primer aspecto y cualquier realización del mismo y posteriormente la combinación de dichas composiciones para obtener la composición enriquecida para los receptores que unen el agente, donde el mismo agente se utiliza en los pasos b y d en la preparación de las al menos dos composiciones, y en el que

i. la combinación de sitios discretos en el agente, que se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida con el fin de preparar cada una de dichas al menos dos composiciones, difieren por lo menos en dos composiciones, y/o

ii. el orden secuencial en el que los sitios discretos del agente se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida con el fin de preparar cada una de dichas composiciones difieren en la preparación de al menos dos de dichas composiciones.

Las realizaciones preferentes de este aspecto son aquellas en las que se utilizan los mismos sitios discretos del agente para la inmovilización cuando se prepara cada una de las al menos dos composiciones, en las que el número de las al menos dos composiciones es igual al número de los dos sitios discretos por lo menos, y en las que el orden secuencial en el que los sitios discretos se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida para preparar cada una de dichas al menos dos composiciones es único para cada una de las al menos dos composiciones. Típicamente, el número de sitios discretos es de 2 o 3.

Realización del tercer aspecto de acuerdo con la invención

El tercer aspecto de la presente invención se refiere a los polímeros de impresión molecular (PIM) para su utilización en un procedimiento de tratamiento, mejora o profilaxis de una enfermedad causada por un error innato del metabolismo, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la fenilcetonuria (PKU, enfermedad de F0lling), la hiperfenilalaninemia (HPA), alcaptonuria (enfermedad de la orina negra), tirosinemia e hipertirosinemia, que consiste en administrar al tracto gastrointestinal de un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de una composición de polímeros de impresión molecular (PIM), siendo dicha composición capaz de aglutinar un agente provocador de los síntomas de dicha enfermedad, en la que el agente provocador de los síntomas es la L-fenilalanina.

Se conocen un número de errores innatos del metabolismo en los que la disfunción del metabolismo de los aminoácidos naturales da lugar a la acumulación de concentraciones patológicas de metabolitos o de los aminoácidos como tales. En el caso de las personas que padecen esas enfermedades, es necesario controlar la ingesta diaria de alimentos para evitar la acumulación de esos metabolitos.

Un ejemplo típico es la enfermedad de la fenilcetonuria. Los individuos que sufren esta enfermedad son deficientes en la enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH). Esta enzima es necesaria para metabolizar el aminoácido fenilalanina en el aminoácido tirosina, lo que significa que la fenilalanina se acumula en los pacientes y se convierte en el metabolito fenilpiruvato. Si no se trata, esta condición puede causar problemas en el desarrollo del cerebro, lo que lleva a un retraso mental progresivo, y otros problemas neurológicos. La fenilcetonuria se trata actualmente con una combinación de una dieta baja en fenilalanina, a menudo combinada con regímenes de tratamiento que tienen por objeto reducir el nivel de fenilalanina en la sangre a fin de alcanzar un rango de concentración seguro y no tóxico. La reducción de los niveles de fenilalanina a un rango seguro puede lograrse combinando una dieta baja en fenilalanina con medicación.

La presente invención ofrece una alternativa atractiva a los regímenes de tratamiento actualmente existentes. Mediante la administración oral de una composición de PIM (típicamente PIM insolubles, que debido a su insolubilidad no atravesarán con certeza la mucosa gastrointestinal), que se unen específicamente a la fenilalanina y la fenilalanina que contiene péptidos cortos, puede evitarse o reducirse la entrada en el torrente sanguíneo de cantidades tóxicas de fenilalanina. Además, la presencia en el tracto gastrointestinal de tales PIM "arrastrará" la fenilalanina libre sobre la mucosa gastrointestinal (simplemente proporcionando una mayor capacidad para unirse a la fenilalanina en el tracto gastrointestinal), disminuyendo así la concentración sanguínea de la misma.

Este principio particular se aplica en general a otras enfermedades en las que la acumulación de aminoácidos libres y/o sus metabolitos tiene lugar debido a la deficiencia de una enzima metabólica. En principio, cualquier composición de PIM insolubles puede ser útil en este enfoque, pero como se demuestra en el documento WO 2007/095949 , la composición típica de los PIM insolubles contiene cantidades sustanciales de PIM que no se unen a la molécula objetivo deseada; en consecuencia, tales composiciones deben administrarse en cantidades muy grandes, mientras que las composiciones preparadas según los procedimientos divulgados en el documento W^o 2007/095949 o preparadas según los procedimientos antes mencionados del primer o segundo aspecto serán mucho más eficaces, ya que están sustancialmente desprovistas de PIM no vinculantes. Una característica particularmente atractiva de las composiciones de PIM preparadas según los procedimientos antes mencionados del primer o segundo aspecto (y las preparadas de conformidad con el documento WO 2007/095949) es el hecho de que tales PIM no sólo se unirán al aminoácido libre en cuestión sino también péptidos cortos que comprenden el aminoácido pertinente en su secuencia de aminoácidos. Así pues, una importante realización de este tercer aspecto de la invención implica que la composición de los PIM está sustancialmente libre de PIM que no se unen a dicho agente provocador de síntomas.

Por lo tanto, el tratamiento de los errores innatos del metabolismo que se indican a continuación mediante la administración oral de PIM que se unen a los objetivos correspondientes (es decir, el agente que provoca la enfermedad) se realiza preferentemente utilizando composiciones de PIM insolubles preparadas según los procedimientos divulgados en el documento 2007/095949 y, más preferentemente, PIM insolubles preparados según los aspectos 1°y 2°, incluidas todas las realizaciones de los mismos.

Objetivo Indicación Referencia

L-fenilalanina Fenilcetonuria (PKU) Capítulo 77 (1): Hiperfenilalaninemia: Deficiencia de Fenilalanina Hidroxilasa

Hiperfenilalaninemia (HPA)

L-fenilalanina Alcaptonuria Capítulo 92(2): Alcaptonuria

L-fenilalanina y Tirosinemia Capítulo 79(1): Hipertirosinemia

L-tirosina Hipertirosinemia

L- Histidina Miastenia grave Capítulo 91(1): Trastornos de p- y Aminoácidos- ^y en formas libres y unidas a los péptidos

L- Histidina Histidinemia y Aciduria Urocánica Capítulo 80(1): Trastornos del metabolismo de la histidina

L- Leucina Enfermedad de la orina con jarabe de Capítulo 87(1): Enfermedad de la orina de jarabe de arce (MSUD) arce (cetoaciduria de cadena ramificada)

L- Leucina Acidemia isovalérica (Deficiencia de Capítulo 93(2): Acidurias orgánicas de cadena Isovaleril-CoA Deshidrogenasa) ramificada

L-Metionina Homocistinuria Capítulo 88(1): Trastornos de la Transsulfuración L-isoleucina, L-vallne, Acidemia Propiónica, Acidemia Capítulo 94(2): Trastornos del metabolismo del L-metionina y L- Metilmalónica propionato y el metilmalonato

treonina

L-Triptofano y L-Lisina Aciduria glutárica tipo 1 (GA-1) Capítulo 95(2): Acidemias orgánicas debidas a defectos en la oxidación de la lisina: Acidemia 2 ketoadípica y acidemia glutárica

D-galactosa Galactosemia Capítulo 72(3): Galactosemia

Fuente: OMMBID - Las bases metabólicas y moleculares en l ínea de las enfermedades hereditarias - (1)Parte 8: AMINOÁCIDOS, (2)Parte 9: ÁCIDOS ORGÁNICOS, <3>Parte7: CARBOHIDRATOS

Por tanto, en una realización del tercer aspecto de la invención, la enfermedad es la fenilcetonuria (PKU) y el agente que provoca los síntomas es la L-fenilalanina.

En otra realización del tercer aspecto de la invención, la enfermedad es la hiperfenilalaninemia (HPA) y el agente que provoca los síntomas es la L-fenilalanina.

En otra realización del tercer aspecto de la invención, la enfermedad es la alcaptonuria y el agente que provoca los síntomas es la L-fenilalanina.

En otra realización del tercer aspecto de la invención, la enfermedad es la tirosinemia y el agente que provoca los síntomas es la L-fenilalanina.

En otra realización del tercer aspecto de la invención, la enfermedad es la hipertirosinemia y el agente que provoca los síntomas es la L-fenilalanina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la miastenia grave y el agente que provoca los síntomas es la L-histidina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la histidinemia y el agente que provoca los síntomas es la L-histidina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la aciduria urocánica y el agente que provoca los síntomas es la L-histidina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la enfermedad de la orina de jarabe de arce y el agente que provoca los síntomas es la L-leucina.

En otra realización que no según la invención, la enfermedad es la acidemia isovalérica (deficiencia de isovaleril-CoA deshidrogenasa) y el agente que provoca los síntomas es la L-leucina.

En otra realización no según invención, la enfermedad es la homocistinuria y el agente que provoca los síntomas es la L-metionina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la acidemia propiónica, y el agente que provoca los síntomas es la L-isoleucina y/o la L-valina y/o la L-metionina y/o la L-treonina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la acidemia metilmalónica, y el agente que provoca los síntomas es la L-isoleucina y/o la L-valina y/o la L-metionina y/o la L-treonina.

En otra realización no según la invención, la enfermedad es la aciduria glutárica de tipo 1 (GA-1), y el agente que provoca los síntomas es el L-triptófano y/o la L-lisina.

Finalmente, en una realización no según la invención, la enfermedad es galactosemia y el agente que provoca los síntomas es la D-galactosa y/o la lactosa.

El régimen de dosificación dependerá de la composición del PIM y de su capacidad exacta de fijación del agente provocador de la enfermedad pertinente, la cantidad de agente provocador de síntomas a eliminar por medio del tratamiento y la constitución y edad del individuo a ser tratado. La persona experta podrá determinar los parámetros de la dosis pertinente caso por caso.

Con respecto a la formulación, las partículas de PIM preparadas según la presente invención pueden incluirse en forma suspendida o solubilizada en cualquier forma conveniente, típicamente para su administración oral. En ciertas realizaciones, las partículas de PIM se suspenden simplemente en agua, opcionalmente con la adición de aditivos de última generación para mejorar el sabor (para composiciones orales), el color, el olor, la consistencia/textura, la liberación, la distribución, etc. También es posible integrar las partículas de PIM en los alimentos y bebidas que se preparan mediante una simple adición.

Realizaciones del cuarto aspecto no de acuerdo con la invención

El cuarto aspecto no de acuerdo con la invención implica la preparación de una composición farmacéutica, dicho procedimiento comprende la preparación de una composición según el procedimiento del primer o segundo aspecto y la posterior mezcla de la composición con un portador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se prepara convenientemente para que sea adecuada para su administración oral, lo cual será práctico cuando la composición comprenda partículas de PIM insolubles. Sin embargo, si la composición comprende anticuerpos policlonales o partículas de PIM solubles, la preparación seguirá las normas de preparación de productos farmacéuticos para la administración parenteral.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Polímeros de impresión molecular (PIM) para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o profilaxis de una enfermedad causada por un error innato del metabolismo, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en la fenilcetonuria (PKU, enfermedad de F0lling), la hiperfenilalaninemia (HPA), la alcaptonuria (enfermedad de la orina negra) y la tirosinemia, y la hipertirosinemia, que consiste en administrar al tracto gastrointestinal de un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de una composición de dichos polímeros de impresión molecular (PIM), siendo dicha composición capaz de unirse a un agente provocador de los síntomas de dicha enfermedad, en la que el agente provocador de los síntomas es la L-fenilalanina.

2. Los PIM para su uso según la reivindicación 1, en los que la composición de los PIM está sustancialmente libre de PIM que no se unen a dicho agente provocador de síntomas.

3. Los PIM para su uso según la reivindicación 1 o 2, en los que la composición de los PIM se prepara según un procedimiento para preparar una composición enriquecida para los PIM que se unen a un agente, en el que cada uno de dichos PIM se unen específicamente al menos a dos sitios discretos de dicho agente, el procedimiento comprende, bien

a1. proporcionar una muestra que comprende dichos PIM,

b1. someter dicha muestra a un primer paso de cromatografía de afinidad, donde dicho agente se utiliza como agente de purificación de afinidad, y donde dicho agente se inmoviliza a una fase sólida o semisólida por medio de la unión a uno solo de dichos al menos dos sitios discretos,

c1. recuperar los PIM que se unen al agente,

d1. someter a los PIM recuperados en el paso anterior a por lo menos un paso más de cromatografía de afinidad, donde dicho agente se utiliza como agente de purificación de afinidad, y donde dicho agente se inmoviliza a una fase sólida o semisólida mediante la unión a otro de dichos por lo menos dos sitios discretos, y recuperar los PIM unidos al agente, en el que, en cada uno de dicho al menos un paso más de cromatografía de afinidad, dicho otro de dicho al menos dos sitios discretos es diferente de uno cualquiera de dicho al menos dos sitios discretos, que ha sido usado previamente en los pasos b1 y di para la inmovilización del agente a un sólido de fase semisólida, o que comprende

c2. proporcionar una muestra que comprenda dichos PIM y posteriormente

d2. aislar los PIM que se unen al agente por medio de la aglutinación donde los PIM unen varios de dichos agentes.

4. Los PIM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que los PIM se seleccionan entre los PIM solubles e insolubles.

5. Los PIM para su uso según la reivindicación 3 o 4, en los que el agente es una sustancia química que tiene la fórmula H3N+-CH(R)-COO-, como un aminoácido, o un péptido que tiene como máximo 5 restos de aminoácidos.

6. Los PIM para su uso según la reivindicación 5, en los que el aminoácido es la fenilalanina.

7. Los PIM para su uso según la reivindicación 5, en los que el péptido tiene fenilalanina en la terminal N, en la terminal C o en ambas terminales.

8. Los PIM para su uso según la reivindicación 5 o 7, en los que el péptido es un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido.

9. Los PIM para su uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en los que la composición de los PIM se prepara según un procedimiento para preparar una composición enriquecida para los PIM que se unen a un agente, en los que dichos PIM se unen a cada uno específicamente al menos dos sitios discretos de dicho agente, el procedimiento comprende la preparación de al menos dos composiciones según el procedimiento definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 y la posterior combinación de dichas composiciones para obtener la composición enriquecida para los PIM que se unen al agente, en los que el mismo agente se utiliza en los pasos b1 y di en la preparación de las al menos dos composiciones, y en los que

i. la combinación de sitios discretos en el agente, que se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida con el fin de preparar cada una de dichas al menos dos composiciones, difieren al menos en dos composiciones, y/o

ii. el orden secuencial en el que los sitios discretos del agente se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida con el fin de preparar cada una de dichas composiciones difieren en la preparación de al menos dos de dichas composiciones.

10. Los PIM para su uso según la reivindicación 9, en los que se utilizan los mismos sitios discretos del agente para la inmovilización al preparar cada una de las al menos dos composiciones, en los que el número de las al menos dos composiciones es igual al número de los al menos dos sitios discretos, y en los que el orden secuencial en el que los sitios discretos se utilizan para la inmovilización a la fase sólida o semisólida a fin de preparar cada una de dichas al menos dos composiciones es único para cada una de las al menos dos composiciones.

11. Los PIM para su uso según la reivindicación 9 o 10, en los que el número de sitios discretos es 2 o 3.