ES2850249T3 - Composiciones y métodos para inmunomodulación en un organismo - Google Patents

Abstract

Un complejo polipeptídico terapéutico preacoplado para su uso en un método para modular la respuesta inmunitaria en un organismo, en el que el complejo comprende un polipéptido IL-15 y una forma soluble de un polipéptido receptor alfa de IL-15, y en el que dicho componente polipeptídico IL-15 y dicho componente polipeptídico receptor alfa de IL-15 se preacoplan antes de su uso.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para inmunomodulación en un organismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un complejo polipeptídico terapéutico preacoplado para su uso en un método para modular la respuesta inmunitaria en un organismo, en el que el complejo comprende un polipéptido IL-15 y una forma soluble de un polipéptido receptor alfa de IL-15, y en el que dicho componente polipeptídico IL-15 y dicho componente polipeptídico receptor alfa de iL-15 se preacoplan antes de su uso.

Antecedentes

Los linfocitos son un tipo de glóbulos blancos implicados en la regulación del sistema inmunitario. Hay dos amplias categorías de los linfocitos, concretamente los linfocitos T y los linfocitos B. Los linfocitos T son responsables de la inmunidad celular, mientras que los linfocitos B son responsables de la inmunidad humoral (que se refiere a los anticuerpos). Los linfocitos T se denominan de este modo porque estos linfocitos maduran en el timo y los linfocitos B maduran en la médula ósea (bone marrow en inglés). Los linfocitos son mucho más comunes en el sistema linfático, e incluyen linfocitos B, linfocitos T, linfocitos T citolíticos y linfocitos citolíticos naturales. Los linfocitos B generan los anticuerpos, que se unen a patógenos para posibilitar su destrucción. Los linfocitos T CD4+ (auxiliares) coordinan la respuesta inmunitaria (son los que llegan a alterarse en una infección por VIH). Los linfocitos T CD8+ (citotóxicos) y los linfocitos citolíticos naturales (NK) pueden destruir células del organismo que están infectadas por un virus o presentan una secuencia antigénica.

Los linfocitos citolíticos naturales son granulocitos grandes CD56(+)CD3(-) que constituyen un componente clave de la respuesta inmunitaria innata humana. Además de su potente actividad citolítica, los linfocitos NK expresan un gran número de citocinas y quimiocinas inmunorreguladoras que desempeñan una función crucial en la eliminación de los patógenos. Además, las interacciones entre los NK y otros inmunocitos están implicadas en la activación de la respuesta inmunitaria adaptiva o específica de antígeno.

Las interacciones entre los inmunocitos y las células inflamatorias están mediadas en gran parte por proteínas citocinas, por ejemplo, linfocinas tales como interleucinas (IL), que pueden promover el crecimiento celular, la diferenciación y la activación funcional. Actualmente, se han descrito al menos veintitrés interleucinas y sus diversas variantes de corte y empalme. Algunas de estas citocinas median distintos efectos biológicos, pero muchas tienen actividades solapantes. La comprensión de la estructura y función de las interleucinas ha dado lugar a perspectivas nuevas e importantes en la biología fundamental de la inmunidad y la inflamación. Por ejemplo, la interleucina 2 (IL-2) y la IL-15 son dos citocinas distintas con propiedades parcialmente solapantes que están implicadas en el desarrollo, homeostasis y función de los linfocitos T y linfocitos NK.

La IL-2, antiguamente denominada factor de crecimiento de linfocitos T, es una linfocina inmunorreguladora potente que se produce por linfocitos T activados por antígeno. Se produce por linfocitos T maduros al estimularse, pero también constitutivamente por determinadas líneas celulares de linfoma de linfocitos T. La IL-2 es útil en el estudio de la naturaleza molecular de la diferenciación de linfocitos T, y como potencia la actividad de los linfocitos citolíticos naturales, puede ser útil en la modulación de la respuesta inmunitaria a los cánceres, infecciones víricas o bacterianas. Además, la IL-2 puede actuar como hormona del crecimiento tanto para linfocitos B como para linfocitos T, y estimula la expansión clonal y la maduración de estos linfocitos. La IL-2 se une a su complejo receptor (R) compuesto por las cadenas IL-2R alfa ("IL-2Ra"), IL-2R beta ("IL-2Rb") y gamma ("gC"), y ejerce su efecto mediante segundos mensajeros, principalmente tirosina cinasas, que finalmente estimulan la expresión génica.

La heterotrimerización de las cadenas del receptor da lugar a una unión de alta afinidad por IL-2. La importancia funcional de IL-2Ra en los sistemas de células hematopoyéticas es bien conocida. Sin embargo, la posible función que desempeña IL-2Ra en la tumorigénesis todavía no se ha dilucidado completamente. Se ha encontrado expresión de IL-2Ra en muchos tipos de cánceres, incluyendo leucemia, linfoma, de pulmón, mama, cabeza y cuello, y próstata. Además, la alta expresión de IL-2Ra en tumores se correlaciona con un mal pronóstico para el paciente.

La IL-15 es un miembro de la familia de grupo de cuatro hélices alfa de linfocinas y su ARNm puede detectarse en una amplia diversidad de tejidos de linajes tanto no hematopoyéticos como hematopoyéticos, pero no se produce por linfocitos T. La IL-15 es difícil de detectar a nivel proteínico in vivo, quizás debido a la corta semivida de la proteína y el estricto control transcripcional y traduccional. La IL-15 es una proteína soluble generada por muchas células en el organismo, que desempeña una función importante en el desarrollo del sistema inmunitario. La IL-15 se descubrió simultáneamente en una línea celular de leucemia de linfocitos T de adulto y una línea celular epitelial de riñón de simio como una proteína de 14 kDa-16 kDa que podía estimular la línea celular de linfocitos T citotóxicos (CTLL) y la proliferación de linfocitos T en sangre periférica, e inducir que leucocitos mononucleares en la sangre periférica muestren función efectora.

La IL-15 desempeña una función multifacética en el desarrollo y control del sistema inmunitario. Más específicamente, la IL-15 influye en la función, desarrollo, supervivencia y proliferación de linfocitos T CD8+, linfocitos NK, linfocitos T citolíticos, linfocitos B, linfocitos intraepiteliales intestinales (IEL) y células presentadoras de antígeno (APC). Se ha demostrado que tanto los ratones transgénicos IL-15-/- como los IL-15Ra-/- carecen de poblaciones periféricas de linfocitos NK y linfocitos T citolíticos, determinados subconjuntos de IEL y la mayoría de linfocitos T CD8+ con fenotipo de memoria. Además, aunque los linfocitos T CD8+ de memoria específicos de antígeno pueden desarrollarse en respuesta a patógenos en ambos tipos de ratones de inactivación, la combinación resultante de linfocitos T CD8+ de memoria experimenta erosión drástica a lo largo del tiempo. Lo que sugiere una función crucial para IL-15 en la mediación de la proliferación y supervivencia de linfocitos T CD8+ de memoria a largo plazo.

El receptor (R) de IL-15 consiste en tres polipéptidos, la cadena IL-15R alfa específica de tipo ("IL-15Ra"), la IL-2/IL-15Rbeta ("IL-2Rb") y la gamma común ("gC", que está compartida por múltiples receptores de citocinas). Se cree que la cadena IL-15Ra de alta afinidad (Kd = 10'11 M) forma un complejo heterotrimérico con la IL-2Rb compartida, y la gC. Similar a IL-15, se cree que IL-15Ra se expresa por una amplia diversidad de tipos celulares, pero no necesariamente junto con IL-2Rb y gC. Aunque se cree que las cadenas IL-15Ra, las IL-2Rb y las gC se asocian como un receptor heterotrimérico, sigue sin conocerse si esta es la forma fisiológicamente pertinente del receptor de IL-15. Por ejemplo, la cadena IL-15Ra no coprecipita con la IL-2Rb/gC en presencia de IL-15.

Además, a diferencia de la cadena IL-2Ra, la cadena IL-15Ra aparentemente media la transducción de señales. La IL-15Ra es una proteína de 58 - 60 kDa que comparte similitudes estructurales con la proteína IL-2Ra. Los genes de IL-15Ra e IL-2Ra también comparten una organización de intrones y exones similar y están muy ligados en el cromosoma humano 10p14-p15. La IL-15Ra humana comparte aproximadamente un 45 % de homología de aminoácidos (aa) con la forma de ratón del receptor. Se han identificado ocho isoformas del ARNm de IL-15Ra resultantes de eventos de corte y empalme alternativo que implican diferentes exones. La exclusión del exón 2 (AExón2) provoca una isoforma de IL-15Ra que no se une a IL-15. El ADNc humano de IL-15Ra-AExón3 codifica una proteína de 267 aminoácidos (aa) que contiene una secuencia señal de 30 aa, una región extracelular de 175 aa que contiene un sitio de glucosilación ligado a N, un dominio transmembranario de 21 aa y una cola citoplasmática de 41 aa.

La señalización de IL-15 puede producirse a través del complejo heterotrimérico de IL-15Ra, IL-2Rb y gC; a través del complejo heterodimérico de IL-2Rb y gC; o a través de una subunidad novedosa IL-15RX de 60 - 65 kDa encontrada en mastocitos. (Anderson, D.M. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:29862 - 29869; Waldemann, T.A. e Y. Tagaya, 1999, Ann. Rev. Immunol., 17:19 - 49; Dubois, S. et al., 1999, J. Biol. Chem.274:26978 - 26984). Recientemente, se ha informado de que la unión de IL-15 a IL-15Ra antagoniza la apoptosis mediada por TNF-alfa en fibroblastos mediante competencia con TNFRI por la unión a TRAF2 (Bulfone-Paus, S. et al., 1999, FASEB 13:1575 - 1585).

Dados los efectos conocidos de IL-15 sobre el sistema inmunitario, varios grupos han propuesto abordar IL-15, para manipular el sistema inmunitario para el beneficio de los hospedadores. Aunque se ha empleado la administración de IL-15 para fomentar las respuesta inmunitarias o mejorar la reconstitución del sistema inmunitario, el bloqueo de la actividad de IL-15 puede inhibir las respuestas autoinmunitarias. Por ejemplo, la administración de una proteína IL-15-Fc mutante que bloquea la actividad de IL-15 o una forma soluble de la IL-15Ra tiene potencial terapéutico en un modelo de ratón de artritis y supervivencia de aloinjerto.

A la inversa, la IL-15 (proteína o vector de expresión de ADN) administrada como adyuvante durante vacunación o infección mejora la inmunidad de linfocitos T CD8+, y el tratamiento con IL-15 puede potenciar la protección de los ratones contra las dosis letales de Mycobacterium tuberculosis y Escherichia coli. Además, el tratamiento con IL-15 estimula la inmunidad anti-VIH y aumenta la supervivencia de los linfocitos CD4+ y CD8+ de los pacientes infectados con VIH in vitro. La IL-15 también puede acelerar la reconstitución inmunitaria después de trasplante de médula ósea. Varios grupos han descubierto que el tratamiento con IL-15, junto con quimioterapia, agonistas del receptor de tipo Toll, o transferencia adoptiva de linfocitos T CD8+ reactivos al tumor, puede provocar una supervivencia aumentada o regresión tumoral completa en modelos de tumor de ratón, en contraste con cada tratamiento en solitario. Por tanto, la manipulación de la actividad de IL-15 tiene potencial como modalidad terapéutica en varias situaciones clínicas.

La IL-15 se está usando actualmente en muchos estudios en que es deseable una potenciación de la respuesta inmunitaria. Estos incluyen aumentar la eficacia de las vacunas contra tumores e infecciones, así como potenciar la capacidad del organismo de eliminar los cánceres en ausencia de vacunación manifiesta. Además, la IL-15 puede ayudar a regenerar el sistema inmunitario después de trasplante de médula ósea o en el SIDA. Sin embargo, la semivida de la IL-15 in vivo es muy corta (de minutos a 1 hora o así) y esta es una razón de su poca eficacia. Actualmente, la única manera de obtener algún efecto de actividad de IL-15 es usando dosis grandes, e IL-15 en solitario no siempre es eficaz. Los investigadores han intentado aumentar la semivida de IL-15 usando modificaciones moleculares, pero estas en general han sido ineficaces. Por ejemplo, la PEGilación (una técnica común para aumentar la semivida de las proteínas) de IL-15 aumenta la semivida, pero destruye la mayoría de la actividad de la citocina, de hecho, PEG-IL-15 es un antagonista de la actividad de IL-15.

Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de proporcionar una forma terapéutica adecuada de IL-15 que demuestre una semivida más larga, y una mayor eficacia a dosificaciones inferiores cuando se administre a un organismo que lo necesite con el fin de modular o potenciar la inmunidad. Dicho agente terapéutico permitiría la administración de menos citocina, mientras se proporciona simultáneamente la potenciación del sistema inmunitario del hospedador más allá de los efectos de IL-15 en solitario.

El trabajo de Burkett et al. (PNAS USA, 2003, 100: 4724) describió que IL-15Ra/IL-15 unido a placa puede mantener la supervivencia de linfocitos T de memoria CD8 purificados in vitro. Los experimentos de Dubois et al. (Immunity, 2002, 17: 537) detallaron que IL-15 e IL-15Ra forman complejos estables sobre la superficie celular de monocitos activados y estos complejos de IL-15/IL-15Ra unidos a superficie celular se dirigen a linfocitos T CD8 que expresan únicamente IL-2/15Rp y yc tras la interacción de célula-célula. En estos dos estudios, la IL-15Ra usada se inmovilizó en una superficie; ya fuera una superficie de una placa o una superficie celular y ninguno de estos estudios describió la formación de complejos de IL-15 con una forma soluble de IL-15Ra que no estuviera inmovilizada en una superficie.

Fischer et al. (Nature Biotechnology 1997, 15: 142) describen una proteína de fusión que comprende un componente IL-6 y un componente receptor de IL-6 (IL-6R) dentro de una sola cadena polipeptídica. La proteína de fusión de IL-6/IL-6R puede expandir de forma eficaz las células progenitoras madre hematopoyéticas humanas ex vivo. Asimismo, Pflanz et al. (FEBS Lett, 1999, 450: 117) describen una proteína de fusión que comprende un componente I L-11 y un componente IL-11R dentro de una sola cadena polipeptídica. La IL-11 pertenece a la misma subfamilia de las citocinas de grupo de 4 hélices como IL-6, pero estas dos citocinas son distintas de IL-15 y tienen diferentes actividades y mecanismos de acción.

Mortier et al. (J. Biol. Chemistry 2006, 281(3): 1612) distinguen la actividad biológica de IL-6R soluble de IL-15Ra soluble y divulgan que receptores solubles de citocinas pueden funcionar como antagonistas naturales (tales como IL-2Ra, IL-4R, LIF-R), agonistas biológicos (tales como IL-6R, CNTF-R), moléculas transportadoras (tales como IL-4R) o chaperonas para proteger sus ligandos de la degradación proteolítica. La IL-15Ra soluble actúa como antagonista inhibiendo la actividad biológica de IL-15 a niveles muy bajos, a diferencia del receptor soluble de IL-6.

Wei et al. (J. Immunology 2001, 167(1): 277) realizaron experimentos para localizar el dominio funcional de IL-15Ra. Construyeron diversas versiones truncadas de sIL-15Ra y determinaron la unión a IL-15. La región más corta que retenía actividad de unión a IL-15 fue una secuencia de 65 aminoácidos que abarcaba el dominio Sushi de IL-15Ra. Los dominios Sushi son motivos comunes en las interacciones de proteína-proteína, que contienen cuatro cisteínas que forman dos enlaces disulfuro en un patrón 1-3 y 2-4.

Nuestros estudios mostraron que la IL-15Ra actúa "transpresentando" IL-15 a células opuestas que expresan el complejo de IL-2/15Rb/gC sin necesidad de expresión de IL-15Ra. Además, in vitro, IL-15 unida a una quimera compuesta por la parte soluble de la IL-15Ra unida covalentemente a una región Fc de anticuerpo (IL-15Ra-Fc) (R&D Systems, Inc., Mineápolis, MN), mantiene la supervivencia de linfocitos T CD8 de memoria I L-15Ra-/-, en contraste con cualquier componente en solitario.

Los expertos en la técnica pertinente han percibido en general que la parte soluble de la IL-15Ra es un inhibidor de la acción de IL-15. De hecho, una investigación publicada ha demostrado que IL-15Ra puede inhibir la actividad de IL-15 in vitro e in vivo. Actualmente, nadie ha ideado todavía un sistema en que IL-15 e IL-15Ra se preacoplen antes de su administración como un tratamiento in vivo.

Sumario de la invención

La presente divulgación con fines de referencia (también denominada divulgación con fines de referencia a partir de ahora en este documento) describe una composición de polipéptido terapéutico y métodos para su administración a un individuo que lo necesita. También se divulgan ácidos nucleicos y polipéptidos codificados por los mismos, así como composiciones relacionadas que incluyen vectores de ácido nucleico que contienen los ácidos nucleicos, líneas celulares que contienen los ácidos nucleicos, y anticuerpos (por ejemplo, policlonales, monoclonales, quiméricos, etc.) que se unen al polipéptido terapéutico divulgado. La presente divulgación con fines de referencia también se refiere a métodos para generar un agente terapéutico que comprende al menos una linfocina o parte de la misma, en un complejo preacoplado con al menos un receptor de linfocinas o parte del mismo. Se observó sorprendente e inesperadamente que la combinación preacoplada de la invención demuestra una semivida más larga in vivo, y mayor eficacia terapéutica que la observada con la administración de IL-15 en solitario.

La divulgación con fines de referencia engloba además moléculas de ácido nucleico que tiene al menos un 25 % de homología con las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16. Los expertos en la materia apreciarán que los polimorfismos de secuencia de ADN que dan lugar a cambios en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos NOVX pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Dicho polimorfismo genético en los genes de NOVX pueden existir entre individuos dentro de una población debido a variación alélica natural. Como se usa en este documento, las expresiones "gen" y "y gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco abierto de lectura (ORF - open reading frame) que codifica un polipéptido de interleucina y/o de receptor de interleucina, preferiblemente de un vertebrado. Dichas variaciones alélicas naturales pueden provocar típicamente una variación de un 1-5 % en la secuencia de nucleótidos.

En un aspecto, la divulgación con fines de referencia se refiere a ácidos nucleicos y moléculas polinucleotídicas que codifican una linfocina o partes de la misma. Además, la divulgación con fines de referencia se refiere a ácidos nucleicos y moléculas polinucleotídicas que codifican un receptor de linfocinas o partes del mismo y contempla el uso de polinucleótidos que codifican sustancialmente la proteína de longitud completa, polipéptidos de tipo silvestre o mutantes; segmentos concretos, dominios, subdominios, fragmentos, mutaciones de eliminación o inserción; quimeras; e isoformas y variantes de corte y empalme. Este aspecto de la divulgación con fines de referencia también incluye ácidos nucleicos que comprenden un segmento que codifica al menos una linfocina o parte de la misma, contiguo con un segmento que codifica al menos un receptor de linfocinas o partes del mismo dentro de un solo marco abierto de lectura (ORF). En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos de la divulgación con fines de referencia comprenden al menos un segmento polinucleotídico adicional que corresponde a secuencias reguladoras de la transcripción (por ejemplo, promotores, promotores inducibles, potenciadores y similares); secuencias de proteínas de fusión (por ejemplo, marca de His, GST, GFP, partes Fc de anticuerpo, resistencia a antibióticos, péptidos señal y similares); y/o secuencias conectoras dispuestas en el extremo 5', extremo 3' o en una ubicación dentro de las secuencias que codifican el polipéptido; y/o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los polinucleótidos de la divulgación con fines de referencia también pueden estar dispuestos en un vector vírico adecuado, plásmidos bacterianos o cromosoma artificial adecuado para clonación y/o expresión en una célula eucariota o extracto de células eucariotas, célula procariota o extracto de células procariotas, y/o combinaciones de los mismos.

En determinados aspectos, la presente invención se refiere a un complejo polipéptido preacoplado para su uso como se define en la reivindicación 1 y sus reivindicaciones dependientes, comprendiendo una IL-15 (SEQ ID NO: 6) en un complejo proteínico preacoplado con una forma soluble de una IL-15Ra (SEQ ID NO: 8).

En otro aspecto, la divulgación con fines de referencia se refiere al uso de un polipéptido quimérico en el complejo polipeptídico de la invención. En determinadas realizaciones, la divulgación con fines de referencia comprende polipéptidos quiméricos que comprenden una o más interleucinas, receptor de interleucinas, partes y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, la divulgación con fines de referencia comprende polipéptidos quiméricos que comprenden al menos un polipéptido de receptor de interleucinas o parte del mismo, por ejemplo, la parte soluble de un receptor de interleucinas y/o el dominio de unión a ligando, unido covalentemente y contiguo a la parte Fc de un anticuerpo. Las moléculas quiméricas de la divulgación con fines de referencia pueden sintetizarse de forma recombinante expresando un polinucleótido que contiene los elementos deseados dentro de un solo ORF en muchísimas combinaciones, que un experto en la materia reconocerá. Otros polipéptidos quiméricos, por ejemplo, un polipéptido de IL-15Ra humana (1Met-94Ile)-K-(129Pro-205Thr)-conector-Fc, están disponibles en el mercado en R&D Systems (Mineápolis, MN).

En otro aspecto de la divulgación con fines de referencia, las moléculas polinucleotídicas quiméricas están contenidas en un vector de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un plásmido o construcción de ADN vírico, para subclonación, expresión, purificación u otra manipulación genética de rutina adecuada para su uso en una célula u organismo eucariota o procariota. Además, las moléculas polinucleotídicas quiméricas opcionalmente pueden contener secuencias codificantes o no codificantes adicionales, insertadas por manipulación genética entre regiones que codifican las partes de linfocina o receptor de linfocinas. En una realización de la divulgación con fines de referencia y en la medida en que pertenezca a las reivindicaciones de acuerdo con la invención, el ácido nucleico que codifica la interleucina o parte de la misma, está dispuesto en ligamiento en tándem con una parte de receptor de interleucinas. En otras realizaciones más de la divulgación con fines de referencia, una secuencia conectora se inserta entre el codón terminal del primer ácido nucleico y el primer codón del segundo ácido nucleico. Estos conectores pueden ser de cualquier longitud y tipo adecuado, y pueden usarse, por ejemplo, para reducir las restricciones estéricas sobre el plegamiento del polipéptido, introducir un sitio de escisión de proteasa o nucleasa, proporcionar un sitio conveniente para modificación química, conjugación u otro elemento funcional.

En realizaciones preferidas, la proteína candidata es una proteína humana. En otras realizaciones, la proteína candidata es una proteína eucariótica, por ejemplo, una proteína de mamífero, o una proteína de ratón. En otro aspecto, la divulgación con fines de referencia ofrece una célula u organismo transgénico que contiene un transgén que codifica una interleucina, un receptor de interleucinas o parte del mismo, y/o un polipéptido quimérico de interleucinas/receptor de interleucinas. En otro aspecto, la divulgación con fines de referencia se refiere a una o más líneas celulares genéticamente alteradas que contienen las construcciones polinucleotídicas descritas en este documento, tales como, por ejemplo, por incorporación en el ADN genómico de la célula, retención episómica o como parte de un cromosoma artificial. En un aspecto relacionado, la presente divulgación con fines de referencia se refiere a la expresión mediante una célula hospedadora modificada de un ácido nucleico que codifica componentes individuales o el complejo polipeptídico completo. En algunas realizaciones de la divulgación con fines de referencia, el transgén codifica una proteína que normalmente es exógena a la célula transgénica. En algunas realizaciones de la divulgación con fines de referencia, el transgén codifica una proteína humana. En algunas realizaciones, el transgén está ligado a un promotor heterólogo. En otras realizaciones de la divulgación con fines de referencia, el transgén está ligado a su promotor natural.

En otro aspecto, la divulgación con fines de referencia se refiere a anticuerpos, por ejemplo, policlonales, monoclonales o quiméricos, que reconocen y se unen a epítopos concretos del complejo polipeptídico o componentes del mismo. En determinados aspectos, la divulgación con fines de referencia se refiere a la administración de anticuerpos específicos contra los componentes del complejo, el complejo, contra otras linfocinas, otros receptores de linfocinas o combinaciones de los mismos. En una realización, la divulgación con fines de referencia comprende una interleucina, por ejemplo, IL-2, IL-7 o IL-15, preacoplada con un anticuerpo específico para dicha interleucina. En otras realizaciones, los métodos de la divulgación con fines de referencia incluyen un método para tratar una enfermedad en un individuo, que comprende administrar una cantidad eficaz del complejo preacoplado que comprende una interleucina y un anticuerpo específico para dicha interleucina a un individuo que lo necesita.

En otro aspecto, la presente divulgación con fines de referencia se refiere a métodos para producir un agente terapéutico inmunomodulador que comprende un complejo preacoplado de al menos un polipéptido de linfocina o parte del mismo, y al menos un polipéptido de receptor de linfocinas o parte del mismo. En determinadas realizaciones, la divulgación con fines de referencia incluye métodos para crear el complejo in vitro, que comprende expresar o sintetizar polipéptidos componentes, aislar los polipéptidos, purificar y/o concentrar los polipéptidos y formar el complejo. En este aspecto, la divulgación con fines de referencia se refiere a crear el complejo polipeptídico preacoplado para su uso en la invención a partir de polipéptidos aislados de una célula hospedadora o extracto de células hospedadoras en que cada componente polipeptídico del complejo se expresa a partir de dos ácidos nucleicos concretos o la divulgación con fines de referencia como un solo marco abierto de lectura, que comprende una quimera que comprende la interleucina y receptor de interleucinas ligados, en el marco de lectura, en tándem. La purificación puede realizarse por un medio cromatográfico conocido por los expertos en la materia y puede incluir, por ejemplo, purificación por afinidad, exclusión de tamaño, intercambio iónico, hidroxiapatita, HPLC y similares.

En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para inducir, potenciar o inhibir la actividad y proliferación de los inmunocitos, que comprende administrar una cantidad eficaz de un complejo polipeptídico preacoplado a un individuo que lo necesita, en el que el complejo polipeptídico preacoplado comprende al menos una linfocina o parte de la misma y al menos un receptor de linfocinas o parte del mismo. En un aspecto relacionado de la invención, el complejo puede usarse para potenciar la inmunidad o respuesta inmunitaria del organismo hospedador contra un antígeno, tal como, por ejemplo, una bacteria, un virus, una proteína, un péptido, un ácido nucleico y similares. Todos los objetos precedentes de la divulgación con fines de referencia contemplan el uso de polipéptidos de IL-15, IL-2, IL-15Ra o IL-2Ra, partes y combinaciones de los mismos. En otro aspecto más, la divulgación con fines de referencia incluye métodos de tratamiento de un organismo, que comprenden administrar a un organismo un vector que codifica una o más de las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16.

En otro aspecto, la invención se refiere a un complejo polipeptídico preacoplado útil para aumentar la proliferación y supervivencia de los linfocitos T de memoria, linfocitos B y linfocitos NK. Por tanto, la administración del agente terapéutico de la presente invención también puede usarse para potenciar la inmunidad preexistente (por ejemplo, individuos vacunados previamente) sin la necesidad de una vacuna de refuerzo real. En determinados aspectos, el agente terapéutico para su uso de acuerdo con la invención se administra, por ejemplo, para la potenciación de la vacunación, y para el tratamiento de cánceres.

En otros aspectos más, el complejo polipeptídico preacoplado de la invención es útil para inhibir una respuesta inmunitaria del organismo hospedador en casos donde es un perjuicio para el organismo. Por ejemplo, el complejo de la invención puede usarse para inhibir la inmunidad o una respuesta inmunitaria de unorganismo hospedador contra un antígeno, por ejemplo, un autoantígeno, como se observa en individuos que padecen enfermedades y afecciones autoinmunitarias como artritis reumatoide o lupus. En determinadas realizaciones de este aspecto de la invención, el complejo polipeptídico preacoplado comprende polipéptidos de linfocina y receptor de linfocinas o partes de los mismos, que no pueden activar los inmunocitos o estimular su proliferación. Por ejemplo, los componentes polipeptídicos del complejo pueden contener mutaciones, eliminaciones, inserciones o modificaciones químicas que inhiben la señalización mediante las rutas de IL-15.

En cualquiera de los aspectos descritos anteriormente, el complejo polipeptídico preacoplado puede administrarse en cualquier forma farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, líquido, polvo, píldora, fórmula de liberación controlada, etc.), mediante cualquier vía adecuada (por ejemplo, intravenosa, oral, parenteral, subdérmica, tópica, anal, nasal, etc.), y opcionalmente con cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable, vehículo y/o en combinación con otros ingredientes activos (por ejemplo, AINE, inmunosupresores, antihistamínicos, antioncogénicos, antibióticos, sulfonamidas, etc.). Lo anterior se da a modo de ejemplo no limitante, y la formulación particular puede variar de muchísimas maneras, que se incorporan expresamente en este documento, dependiendo de una multitud de factores que un experto en la materia podrá reconocer.

En otro aspecto más, la presente divulgación con fines de referencia se refiere a un kit que comprende un recipiente adecuado, el complejo polipeptídico preacoplado de la invención o los componentes para el mismo en una forma farmacéuticamente aceptable dispuestos en el mismo, e instrucciones para su uso.

En otro aspecto, la presente divulgación con fines de referencia se refiere a la producción de colecciones que contienen ácidos nucleicos mutados y modificados para su uso en los métodos descritos, y los ácidos nucleicos identificados en las mismas.

En otro aspecto, la divulgación con fines de referencia se refiere a un método de detección de la presencia de un complejo polipeptídico de linfocina-receptor de linfocinas en una muestra. En el método, una muestra se pone en contacto con un compuesto o anticuerpo que se une selectivamente en condiciones que permiten la formación de un complejo entre los polipéptidos. El complejo se detecta, si está presente, identificando de ese modo el complejo polipeptídico dentro de la muestra. También se incluye en la divulgación con fines de referencia un método de detección de la presencia de una molécula de ácido nucleico quimérica de linfocina-receptor de linfocinas en una muestra, poniendo en contacto la muestra con una sonda o cebador de ácido nucleico de linfocina o receptor de linfocinas, y detectando si la sonda o cebador de ácido nucleico se une a una molécula de ácido nucleico quimérica de linfocina-receptor de linfocinas en la muestra.

Serán evidentes características y funcionalidades ventajosas adicionales asociadas con los sistemas, métodos y procesos de la presente divulgación con fines de referencia a partir de la descripción detallada que sigue. Las publicaciones y otros materiales usados en este documento para esclarecer los antecedentes de la invención y, en casos particulares, para proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica, se enumeran por conveniencia en la bibliografía adjunta.

Descripción de los dibujos

Figura 1. La coadministración de IL-15 IL-15Ra-Fc preacoplado potencia la respuesta proliferativa de linfocitos T CD8+ contra IL-15 exógena. En el día -1, ratones recibieron i.v. aproximadamente 1 x 107 linfocitos congénicos enriquecidos para CD8, marcados con CFSE y se trataron i.p. en el día 0 con PBS; IL-15 (aproximadamente 2,5 |jg); o IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg ) con IL-15 (2,5 jg). Se analizaron los esplenocitos CD8+ en el día 4 por citometría de flujo para la fluorescencia de CFSe y la expresión de CD45.1 (paneles superiores); o se analizaron las células CD45.1+ CD8+ para la fluorescencia de CFSE y la expresión de CD44 (paneles intermedios). Paneles inferiores: En el día -1, ratones recibieron esplenocitos enriquecidos para linfocitos T CD8+ marcados con CFSE que contenían aproximadamente 6,5 x 105 linfocitos T CD8+ de memoria específicos para OVA tetrámero+ y se trataron en el día 0 con PBS, IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) o IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg ) con IL-15 (aproximadamente 2,5 jg). Los esplenocitos tetrámero+ donadores se analizaron por citometría de flujo en el día 4 para la fluorescencia de CFSE. El tratamiento con IL-15Ra-Fc en solitario no tuvo efecto sobre la proliferación (datos no mostrados). Los datos son representativos de 3 experimentos similares con 3 ratones por grupo.

Figura 2. Los linfocitos NK son muy sensibles a IL-15+IL-15Ra-Fc preacoplado. En el día -1, ratones recibieron i.v. aproximadamente 1,5 x 107 linfocitos congénicos marcados con CFSe y en el día 0 se trataron i.p. con PBS, IL-15 (aproximadamente 2,5 jg), o IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg). Los esplenocitos se analizaron por citometría de flujo en el día 4. Las muestras se seleccionaron en la ventana de adquisición indicada en la población donadora. Los datos son representativos de 2 experimentos con 3 ratones por grupo.

Figura 3. Los linfocitos T CD8+ se dividen rápidamente en respuesta a tratamiento con IL-15+IL-15Ra-Fc preacoplado. En el día -1, ratones recibieron i.v. aproximadamente 1 x 107 linfocitos congénicos enriquecidos para CD8, marcados con CFSE y se trataron con PBS o IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg ) en el día 0. Los linfocitos en la sangre periférica se analizaron por citometría de flujo en los días 1-4. Las muestras mostradas se seleccionan en la ventana de adquisición de linfocitos T CD8 donadores vivos. Los datos son representativos de 2 experimentos con al menos 3 ratones por grupo. El tratamiento con PBS no tuvo efecto sobre la división celular (datos no mostrados).

Descripción detallada de la invención

En ejemplos de las composiciones y métodos de realizaciones preferidas, se presenta la generación útil y ventajosa de polipéptidos terapéuticos. En una realización preferida, la divulgación con fines de referencia y en la medida en que esté cubierta por las reivindicaciones, la invención se refiere a un complejo polipeptídico terapéutico que comprende una linfocina o partes de la misma, y un receptor de linfocinas o partes del mismo. La expresión "receptor de linfocinas" o "receptor de interleucinas" se refiere a los receptores transmembranarios para una linfocina o interleucina respectiva y, en algunas realizaciones, puede comprender un anticuerpo que puede unirse a dicha linfocina o interleucina. En este contexto el anticuerpo funciona de manera eficaz como "receptor" para el polipéptido de linfocina o interleucina.

Sin restringirse a teoría particular alguna, los autores de la invención plantean la hipótesis de que la actividad del agente terapéutico de la invención resulta de un proceso denominado "transpresentación" en que la parte receptora del complejo polipeptídico funciona presentando la parte de molécula de señalización a su o sus receptores respectivos en la superficie de la célula diana. Por ejemplo, las evidencias experimentales indican que IL-15Ra transpresenta IL-15 a los linfocitos T y otras células in vivo a través de las cadenas beta y gamma del receptor de IL-15. La teoría está respaldada por los resultados in vivo en ratones, que muestran que IL-15 en solitaria tenía poca actividad, pero el complejo de IL-15+IL-15Ra preacoplado tenía actividad sustancial en dirigir la proliferación de linfocitos T de memoria (uno de los rasgos distintivos de la actividad de IL-15) como se muestra en la figura 1, y reducir la carga tumoral, tabla 1. Preacoplando IL-15 a la cadena IL-15Ra, se potenciaba enormemente la actividad biológica de IL-15 en ratones (figuras 1-3).

Salvo que se indique claramente lo contrario, las siguientes definiciones complementan las definiciones de los términos conocidos en la técnica.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, ácidos desoxirribonucleicos, ribonucleótidos y ácidos ribonucleicos, y formas poliméricas de los mismos, e incluye formas monocatenarias o bicatenarias. Además, salvo que se limite expresamente, la expresión "ácido nucleico" incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales, por ejemplo, ácidos peptidonucleicos ("APN"), que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia. Además, en cualquiera de las realizaciones preferidas de la divulgación con fines de referencia, un nucleótido o secuencia de ácido nucleico particular incluye variaciones conservativas (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados; véase a continuación), secuencias complementarias, así como la secuencia indicada de forma explícita. Una sustitución de codón degenerado es una en que la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye con cualquier nucleótido que produzca el mismo aminoácido. La expresión ácido nucleico es genérica para los términos "gen", "ADN", "ADNc", "oligonucleótido", "ARN", "ARNm", "nucleótido", "polinucleótido" y similares.

Como se usa en este documento, el término "oligonucleótido" se refiere a una serie de residuos nucleotídicos ligados. Una secuencia oligonucleotídica corta puede estar basada en, o diseñada a partir de, una secuencia genómica o de ADNc y se usa para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un ADN o ARN idéntico, similar o complementario en una célula o tejido particular. Los oligonucleótidos comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene aproximadamente 10 nt, 50 nt o 100 nt de longitud, preferiblemente de aproximadamente 15 nt a 30 nt de longitud. En una realización de la divulgación con fines de referencia, un oligonucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico de menos de 100 nt de longitud comprendería además al menos 6 nucleótidos contiguos de las SEQ ID NO: 1-4 o 13-16. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse químicamente y también pueden usarse como sondas.

Un ácido nucleico "recombinante" es cualquier ácido nucleico producido por un proceso in vitro o artificial (que significa que no es de origen natural) o mediante recombinación de dos o más ácidos nucleicos.

El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con la expresión de un ARN o proteína dado. Por tanto, los genes incluyen regiones que codifican ARN expresados (que típicamente incluyen secuencias codificantes de polipéptido) y, a menudo, las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Los genes pueden obtenerse de una diversidad de fuentes, incluyendo clonación desde una fuente de interés o síntesis a partir de información de secuencia conocida o predicha, y pueden incluir secuencias diseñadas para que tengan parámetros deseados específicamente.

En otra realización de la divulgación con fines de referencia, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16. Como se usa en este documento, el término "complementaria" se refiere a emparejamiento de bases de Watson y Crick o Hoogsteen entre unidades de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico, y el término "unión " significa la interacción física o química entre dos polipéptidos o compuestos o polipéptidos o compuestos asociados o combinaciones de los mismos. La unión incluye interacciones iónicas, no iónicas, de van der Waals, hidrófobas y similares. Una interacción física puede ser directa o indirecta. Las interacciones indirectas pueden ser a través de o debidas a los efectos de otro polipéptido o compuesto. La unión directa se refiere a interacciones que no tienen lugar a través de, o debidas a, el efecto de otro polipéptido o compuesto, sino que en su lugar son sin otros intermedios químicos sustanciales. Los "fragmentos" proporcionados en este documento se definen como secuencias de al menos 6 ácidos nucleicos (contiguos) o al menos 4 aminoácidos (contiguos), una longitud suficiente para permitir la hibridación específica en el caso de ácidos nucleicos o el reconocimiento específico de un epítopo en el caso de aminoácidos, y son, a lo sumo, alguna parte menores que una secuencia de longitud completa. Los fragmentos pueden derivar de cualquier parte contigua de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de elección. Un clon de longitud completa se identificar por contener un codón de inicio de la traducción ATG y un codón de parada en el mismo marco de lectura. Cualquier secuencia de nucleótidos de NOVX divulgada que careza de un codón de inicio ATG, por lo tanto, codifica un fragmento C terminal truncado del polipéptido respectivos, y requiere que el ADNc de longitud completa correspondiente se extienda en la dirección 5' de la secuencia divulgada. Cualquier secuencia de nucleótidos divulgada que carezca de un codón de parada en el mismo marco de lectura codifica asimismo un fragmento N terminal truncado del polipéptido respectivos, y requiere que el ADNc de longitud completa correspondiente se extienda en la dirección 3' de la secuencia divulgada.

La expresión "célula hospedadora" incluye una célula que podría usarse para transportar un ácido nucleico heterólogo, o expresa un polipéptido o proteína codificado por un ácido nucleico heterólogo. Una célula hospedadora puede contener genes que no se encuentran dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula, genes encontrados en la forma natural de la célula donde los genes se modifican y reintroducen en la célula por medios artificiales, o un ácido nucleico endógeno de la célula que se ha modificado artificialmente sin retirar el ácido nucleico de la célula. Una célula hospedadora puede ser eucariota o procariota. Por ejemplo, pueden usarse células bacterianas para transportar o clonar secuencias de ácido nucleico o expresar polipéptidos. Pueden encontrarse condiciones de crecimiento generales necesarias para el cultivo de bacterias en textos tales como BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol. 1, N. R. Krieg, ed., Williams y Wilkins, Baltimore/Londres (1984). Una "célula hospedadora" también puede ser una en que los genes o promotores endógenos o ambos se han modificado para producir uno o más de los componentes polipeptídicos del complejo de la invención.

Los "derivados" son secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos formadas a partir de compuesto naturales directamente, por modificación o por sustitución parcial. Los "análogos" son secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos que tienen una estructura similar, aunque no idéntica, al compuesto natural, por ejemplo, difieren del mismo con respecto a determinados componentes o cadenas laterales. Los análogos pueden ser sintéticos o derivar de un origen evolutivo diferente y pueden tener una actividad metabólica similar u opuesta en comparación con el tipo silvestre. Los homólogos son secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos de un gen particular que derivan de especies diferentes.

Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o distintos de la longitud completa. Los derivados o análogos de los ácidos nucleicos o proteínas de la divulgación con fines de referencia incluyen, aunque sin limitación, moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homólogas a los ácidos nucleicos o proteínas de la divulgación con fines de referencia, en diversas realizaciones, en al menos aproximadamente un 30 %, 45 %, 70 %, 80 % o 95 % de identidad (con una identidad preferida de un 80-95 %) sobre una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de tamaño idéntico o cuando se comparan con una secuencia alineada en que la alineación se hace mediante un programa informático de homología conocido en la técnica, o cuyo ácido nucleico codificante puede hibridar con el complemento de una secuencia que codifica las proteínas de la invención en condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas o de baja rigurosidad. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1993. Los derivados y modificaciones de ácido nucleico incluyen los obtenidos por remplazo génico, mutación específica de sitio, eliminación, inserción, recombinación, reparación, reordenamiento, digestión con endonucleasa, PCR, subclonación y técnicas relacionadas.

Los "homólogos" pueden ser de origen natural, o crearse por síntesis artificial de uno o más ácidos nucleicos que tienen secuencias relacionadas, o por modificación de uno o más ácidos nucleicos para producir ácidos nucleicos relacionados. Los ácidos nucleicos son homólogos cuando derivan, de forma natural o artificial, de una secuencia ancestral común (por ejemplo, ortólogos o parálogos). Si la homología entre dos ácidos nucleicos no se describe expresamente, la homología puede deducirse mediante una comparación de ácidos nucleicos entre dos o más secuencias. Si las secuencias demuestran algún grado de similitud de secuencia, por ejemplo, mayor de aproximadamente un 30 % al nivel de estructura primaria de aminoácidos, se concluye que comparten un ancestro común. El grado de similitud variará y factores importantes incluyen, por ejemplo, el grado de similitud global, el grado de similitud dentro de regiones específicas de la secuencia codificante, la similitud de la secuencia no codificante y la actividad del polipéptido. Para el propósito de la presente divulgación con fines de referencia, los genes son homólogos si las secuencias de ácido nucleico son suficientemente similares para permitir la recombinación.

Los términos "homología" o "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o similares, y tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una máxima correspondencia, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias tales como b La ST, ClustalW u otros algoritmos disponibles para los expertos en la materia o por inspección visual. Para la comparación de secuencias y la determinación de la homología, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se indican las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se indican los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias entonces calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la una o más secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa indicados. Otras determinaciones de homología incluyen la hibridación de ácidos nucleicos en condiciones rigurosas.

La expresión "hibridar" se refiere a la unión, formación de estructuras bicatenarias o hibridación de una molécula únicamente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas, incluyendo cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total).

El término "preacoplado", como se usa en este documento, se refiere a una situación donde los componentes polipeptídicos individuales se combinan para formar el complejo activo antes de la activación o unión en el sitio diana, por ejemplo, un inmunocito. Esto incluye la situación donde los componentes individuales del complejo polipeptídico se sintetiza o expresan de forma recombinante y posteriormente se aíslan y combinan para formar un complejo, in vitro, antes de su administración a un organismo.

Las "mutaciones conservativas" de una secuencia de ácido nucleico se refieren a esos nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el nucleótido no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Esto se basa en el hecho de que el código genético está "degenerado", es decir, varios ácidos nucleicos distintos codifican el mismo aminoácido. Por ejemplo, los codones GTT, GTA, GTC y GTG codifican todos el aminoácido valina. Por tanto, en cada posición donde se especifique una valina por un codón, el codón puede alterarse en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "mutaciones sinónimas", que son una especie de "mutación conservativa". Salvo que se describa de otro modo, cada secuencia de nucleótidos descrita en este documento que codifique un aminoácido también incluye cada posible variación sinónima. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto ATG, que normalmente es el único codón para metionina) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica por técnicas convencionales. Por consiguiente, en cada caso, cuando se usa mutagénesis, cada "mutación sinónima" de un ácido nucleico, que codifica un aminoácido, se incluye de forma implícita.

Además, un experto en la materia reconocerá que las "mutaciones conservativas" también incluyen la sustitución, eliminación o adición de ácidos nucleicos que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño número de aminoácidos en una secuencia codificante, donde las alteraciones del ácido nucleico provocan la sustitución de un aminoácido químicamente similar. Los aminoácidos que pueden servir como sustituciones conservativas entre sí incluyen los siguientes: básicos: arginina (R), lisina (K), histidina (H); ácidos: ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), asparagina (N), glutamina (Q); hidrófilos: glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I); hidrófobos: fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); azufrados: metionina (M), cisteína (C). Además, las secuencias que difieren en variaciones conservativas en general son homólogas.

Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos que comprende una parte de una secuencia más larga de ácido nucleico o aminoácidos (por ejemplo, polipéptido), respectivamente.

Un "operón" de ácido nucleico incluye un gen que está situado en una relación funcional con otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, un promotor, un potenciador, señales de terminación u otro gen si aumenta la transcripción de la secuencia codificante.

La "mutagénesis", como se usa en este documento, incluye técnicas conocidas en la técnica tales como mutagénesis por PCR, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria, mutagénesis por PCR propensa a errores, etc., y recombinación reiterativa de secuencia por cualquiera de las técnicas descritas en este documento.

Las descripciones de las técnicas de biología molecular útiles para la práctica de la invención, incluyendo mutagénesis, PCR, clonación y similares incluyen Berger y Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL (2.a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, un proyecto común entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc.; Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullis et al., patente de Estados Unidos n.° 4683 202 (1987); PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis et al. eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1990) (Innis); Arnheim y Levinson (1 de octubre, 1990) C&EN 36-47; Lueng, et al., A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polimerase chain reaction. Technique: J Methods Cell Molec Biol 1(1): 11-15 (1989). Métodos ejemplares de la presente divulgación con fines de referencia incluyen realizar mutagénesis de secuencia, recombinación, o ambas, y cribar o seleccionar genes individuales.

Como se usa en este documento, los términos "linfocina", "interleucina", "IL-15" o "IL-2" se usan para referirse colectivamente a las secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas correspondientes incluyendo, por ejemplo, la secuencia de longitud completa, isoformas, variantes de corte y empalme, y cualquier combinación de las mismas.

Como se usa en este documento, los términos "IL-15Ra" o "IL-2Ra" se usan para referirse colectivamente a las secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas correspondientes incluyendo, por ejemplo, la secuencia de longitud completa, isoformas, variantes de corte y empalme, y cualquier combinación de las mismas.

Moléculas de ácido nucleico

En algunas realizaciones, la divulgación con fines de referencia comprende ácidos nucleicos y moléculas polinucleotídicas que codifican una linfocina o partes de la misma, y ácidos nucleicos y moléculas polinucleotídicas que codifican un receptor de linfocinas o partes del mismo. En cualquiera de las realizaciones de ácido nucleico, la divulgación con fines de referencia contempla el uso de polinucleótidos que codifican sustancialmente la proteína de longitud completa, polipéptidos de tipo silvestre o mutantes; segmentos concretos, dominios, subdominios, fragmentos, mutaciones de eliminación o inserción; quimeras; e isoformas y variantes de corte y empalme. En determinadas realizaciones preferidas, la divulgación con fines de referencia comprende ácidos nucleicos que comprenden un segmento polinucleotídico que codifica al menos una linfocina o parte de la misma, contiguo con un segmento polinucleotídico que codifica al menos un receptor de linfocinas o parte del mismo dentro de un solo marco abierto de lectura u ORF (es decir, desde el codón de inicio hasta el codón de parada). En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos de la divulgación con fines de referencia comprenden al menos un segmento polinucleotídico adicional que comprende secuencias reguladoras de la transcripción (por ejemplo, promotores, promotores inducibles, potenciadores y similares); secuencias de proteínas de fusión (por ejemplo, marca de His, GST, GFP, partes Fc de anticuerpo, resistencia a antibióticos, péptidos señal y similares); y/o secuencias conectoras dispuestas en el extremo 5', extremo 3' o en una ubicación dentro de las secuencias que codifican el polipéptido; y/o combinaciones de los mismos. En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los polinucleótidos de la divulgación con fines de referencia también pueden estar dispuestos en un vector vírico adecuado, plásmidos bacteriano o cromosoma artificial adecuado para clonación y/o expresión en una célula eucariota o extracto de células eucariotas, célula procariota o extracto de células procariotas, y/o combinaciones de los mismos.

Muchas técnicas para la clonación, subclonación y transferencia de ácidos nucleicos recombinantes en un vector plasmídico o una célula hospedadora o ambos, y técnicas para el cribado y selección de colecciones, son conocidas en la técnica, y cada uno de estos formatos y/o técnicas es aplicable en general a la presente divulgación con fines de referencia. Por ejemplo, textos que divulgan técnicas generales para manipular ácidos nucleicos de uso en esta divulgación con fines de referencia incluyen "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds., 1994)); Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (2.a ed. 1989); y Kriegler, "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual" (1990).

Otro aspecto de la divulgación con fines de referencia se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica las SEQ ID NO: 5-12, o derivados, fragmentos u homólogos de las mismas. Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha "unido de forma funcional". Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de la célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma funcional. Dichos vectores se denominan en este documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la divulgación con fines de referencia pretende incluir otras de estas formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la divulgación con fines de referencia comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras a usar para la expresión, que se unen de forma funcional a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido de forma funcional" pretende indicar que la secuencia de nucleótidos de interés se une a una o más secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora).

La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula hospedadora y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en determinadas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la divulgación con fines de referencia pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en este documento. Los vectores de expresión recombinante de la divulgación con fines de referencia pueden diseñarse para la expresión de proteínas en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, las proteínas pueden expresarse en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Se analizan células hospedadoras adecuadas adicionalmente en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladores del promotor T7 y la polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas muy a menudo se realiza en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, habitualmente al extremo amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión típicamente cumplen tres propósitos: (i) aumentar la expresión de la proteína recombinante; (ii) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para posibilitar la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento análogas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988, Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Ejemplos de vectores de expresión en E. coli sin fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).

Una estrategia para maximizar la expresión de la proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad alterada de escindir proteolíticamente la proteína recombinante. Véase, por ejemplo, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en E. coli (véase, por ejemplo, Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la divulgación con fines de referencia puede realizarse por técnicas convencionales de síntesis de ADN. En otra realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para su expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae incluyen pYepSec (Baldari, et al., 1987, EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.). Como alternativa, los polipéptidos pueden expresarse en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

En otra realización de la divulgación con fines de referencia, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufmnan, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo se proporcionan por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, promotores habitualmente usados derivan de virus del polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas véanse, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR Cl ONING: A LABORATORY MANUAL. 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

En otra realización de la divulgación con fines de referencia, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de linfocitos T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de la leche; patente de Estados Unidos n.° 4.873.316 y publicación de solicitud europea n.° 264.166). También están englobados promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss, 1990. Science 249: 374-379) y el promotor de la alfa-fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546).

En una realización de la presente divulgación con fines de referencia, los segmentos de ácido nucleico de partida se recombinan en primer lugar mediante cualquiera de los formatos mencionados en este documento para generar una colección de ácidos nucleicos recombinantes. La colección puede variar de tamaño, por ejemplo, variando de aproximadamente 10 a aproximadamente 109 miembros. En general, los segmentos de ácido nucleico iniciales, y las colecciones recombinantes de ácidos nucleicos generadas incluyen secuencias codificantes de longitud completa (es decir, marco abierto de lectura (ORF), que incluye el codón de inicio, secuencia codificante y codón de parada), y cualquier secuencia reguladora esencial, por ejemplo, un promotor y secuencia de poliadenilación, necesaria para la expresión. Sin embargo, en el caso de que el ácido nucleico recombinante no contenga estos elementos, los ácidos nucleicos recombinantes en la colección pueden insertarse en un vector que incluye las secuencias perdidas antes del cribado y la selección de clones recombinantes.

Las secuencias de ácido nucleico recombinante pueden combinarse en un formato in vivo que produce una colección de segmentos recombinantes con capacidad de expresión. Como alternativa, la recombinación puede realizarse in vitro, y la colección recombinante se introduce en el tipo celular deseado antes de la etapa de cribado y selección. En algunas realizaciones de la divulgación con fines de referencia, la colección de ácidos nucleicos recombinantes se amplifica en un primer hospedador, y entonces se recuperan de ese hospedador y se introducen en un segundo hospedador por razones de expresión, selección o cribado, o cualquier otro parámetro deseable. La manera por la que el ácido nucleico recombinante se introduce en la célula hospedadora depende de las características de captación de ácido nucleico del tipo celular (por ejemplo, que tiene receptores víricos, que tiene capacidad de conjugación, que es competente de forma natural y/o que requiere cañón de ADN o electroimpulso). Después de la introducción de la colección de genes de ADN recombinante, las células pueden propagarse para permitir que se produzca la expresión de los genes.

En cualquiera de las realizaciones de la divulgación con fines de referencia, los ácidos nucleicos que codifican la linfocina o receptor de linfocinas pueden estar presentes como: uno o más ADN desnudos; uno o más ácidos nucleicos dispuestos en un vector de expresión apropiado y mantenidos de forma episómica; uno o más ácidos nucleicos incorporados en el genoma de la célula hospedadora; una versión modificada de un gen endógeno que codifica los componentes del complejo; uno o más ácidos nucleicos en combinación con una o más secuencias de ácido nucleico reguladoras; o combinaciones de los mismos. En una realización de la divulgación con fines de referencia, los genes endógenos de interleucina y/o receptor de interleucinas de la célula hospedadora se modifican usando técnicas de recombinación homóloga de modo que la célula produce una combinación de polipéptido de interleucina, un polipéptido de receptor soluble de interleucinas y polipéptidos del complejo de interleucina/receptor de interleucinas, que pueden aislarse y purificarse usando técnicas convencionales. En cualquiera de las realizaciones de la divulgación con fines de referencia, un ácido nucleico que codifica el componente de linfocina comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 14, 15, partes y combinaciones de los mismos. Además, en cualquiera de las realizaciones de la divulgación con fines de referencia, un ácido nucleico que codifica el componente de receptor de linfocinas comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 4, 13, 16, partes y combinaciones de los mismos. El ácido nucleico que codifica la linfocina, la parte de receptor de linfocinas y/o la quimera de linfocina/receptor de linfocinas puede comprender opcionalmente un péptido conector o componente de proteína de fusión, por ejemplo, marca de His, marca FLAG, GFP, GST, una parte de anticuerpo, un péptido señal y similares, en el extremo 5', el extremo 3', o en cualquier ubicación dentro del ORF.

En una realización preferida, el ácido nucleico de la divulgación con fines de referencia comprende un polinucleótido que codifica la parte soluble (es decir, la extracelular) de un receptor de linfocinas. En una realización particularmente preferida, la divulgación con fines de referencia comprende un ácido nucleico contiguo que codifica un péptido señal, una linfocina, un péptido conector y la parte soluble de un receptor de linfocinas, y la parte Fc de un anticuerpo. Cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, puede conseguirse usando estrategias convencionales de biología molecular y genética bien conocidas por los expertos en la materia. En cualquiera de las realizaciones de la divulgación con fines de referencia un ADNc que codifica el marco abierto de lectura de las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16 o partes de las mismas puede incorporarse en plásmidos de expresión bacterianos disponibles en el mercado tales como los vectores pGEM (Promega) o pBluescript (Stratagene), o vectores de expresión eucarióticos tales como el sistema de baculovirus, pCEP, vectores pcDNA o uno de sus derivados.

En determinadas realizaciones, la divulgación con fines de referencia comprende una secuencia polinucleotídica aislada que codifica el polipéptido de las SEQ ID NO: 5-12 o partes de las mismas. Por "secuencia de ácido nucleico aislado" se entiende un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo a cualquiera de las secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que deriva. El término, por lo tanto, incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus de replicación automática; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula diferente (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleótidos pueden ser formas modificadas de ADN o a Rn . Las modificaciones incluyen, aunque sin limitación, sustituciones conocidas de una base, glúcido o enlace internucleosídico (cadena principal) de origen natural con una base modificada tal como 5-metilcitosina, un glúcido modificado tal como 2'-metoxi y 2'-fluoro glúcidos, y cadenas principales modificadas tales como fosforotioato y metil fosfonato.

Un polinucleótido puede ser una molécula de ADN, una molécula de ADNc, molécula de ADN genómico o una molécula de ARN. Un polinucleótido como ADN o ARN puede incluir una secuencia en la que la T (timidina) también puede U (uracilo). El polinucleótido puede ser complementario a las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16, en el que la complementariedad se refiere a la capacidad de formar pares de bases precisos entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una determinada posición de un polinucleótido puede formar un emparejamiento de bases de Watson y Crick con un nucleótido en la misma posición en una hebra de ADN o ARN antiparalela, entonces el polinucleótido y la molécula de ADN o ARN son complementarios entre sí en esa posición. El polinucleótido y la molécula de ADN o ARN son sustancialmente complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden hibridar entre sí para logar el proceso deseado. Como se usa en este documento, hibridación significa formación de enlace de hidrógeno de Watson y Crick entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias.

Además, los polinucleótidos que codifican la totalidad o una parte de las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16 se incluyen en la divulgación con fines de referencia. Dichos polinucleótidos incluyen moléculas de ADN de origen natural, sintéticas y manipuladas intencionadamente. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden someterse a mutagénesis dirigida al sitio por técnicas conocidas en la técnica de biología molecular. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales se especifica por más de un codón. Por lo tanto, se incluyen secuencias degeneradas de nucleótidos. Los polinucleótidos también incluyen polinucleótidos que codifican análogos polipeptídicos, fragmentos o derivados de polipéptidos antigénicos que difieren de las formas de origen natural en términos de identidad o ubicación de uno o más residuos aminoacídicos (análogos de eliminación que contienen menos de la totalidad de los residuos especificados para el polipéptido, análogos de sustitución en los que uno o más residuos especificados se remplazan por otros residuos y análogos de adición donde se añade uno o más residuos aminoacídicos a una parte terminal o interna del polipéptido) y que comparten algunas o todas las propiedades de las formas de origen natural. Estas moléculas incluyen la incorporación de codones adecuados para la expresión por hospedadores seleccionados que no son de mamífero; la provisión de sitios para la escisión por enzimas endonucleasa de restricción; y la provisión de secuencias de ADN iniciales, terminales o intermedias adicionales que facilitan la construcción de vectores expresados fácilmente.

Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos o proteínas de longitud completa que contienen sustituciones, inserciones o eliminaciones en la cadena principal proteínica. Los polipéptidos relacionados se alinean asignando grados de homología a diversas eliminaciones, sustituciones y otras modificaciones. La homología puede determinarse a lo largo del polipéptido o polinucleótido completo o a lo largo de subconjuntos de residuos contiguos. El porcentaje de identidad es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos cuando se comparan las dos secuencias. El porcentaje de similitud es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son químicamente similares cuando se comparan las dos secuencias. Los polipéptidos homólogos son preferiblemente más de o igual a un 25 %, preferiblemente más de o igual a un 30 %, más preferiblemente más de o igual a un 35 % o mucho más preferiblemente más de o igual a un 40 % idénticos.

Los plásmidos divulgados en este documento están disponibles en el mercado, disponibles al público en una base no restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles por aplicación de rutina de procedimientos publicados bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión son bien conocidos y están fácilmente disponibles, o los expertos en la materia pueden construir fácilmente muchos otros plásmidos adecuados para su uso. Estos vectores pueden transformarse en una célula hospedadora adecuada para formar un sistema de vector de célula hospedadora para la producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un transportador celular. Los hospedadores adecuados incluyen microbios tales como organismos o líneas celulares de bacteria, levadura, insecto o mamífero. Ejemplos de bacterias adecuadas son E. coli y B. subtilis. Un vector de levadura preferido es pRS426-Gal. Ejemplos de levaduras adecuadas son Saccharomyces y Pichia. Células de anfibio adecuadas son células de Xenopus. Vectores adecuados para líneas celulares de insecto incluyen vectores de baculovirus. Las células de rata o humanas son células de mamífero preferidas.

La transformación de una célula hospedadora con ADN recombinante puede realizarse por técnicas convencionales que son bien conocidas por los expertos en la materia. Por "transformación" se entiende un cambio genético permanente o transitorio inducido en una célula después de la incorporación de nuevo ADN (es decir, ADN exógeno a la célula). Cuando la célula es una célula de mamífero, un cambio genético permanente en general se consigue mediante introducción del ADN en el genoma de la célula. Por "célula transformada" o "célula hospedadora" se entiende una célula (por ejemplo, procariota o eucariota) en que (o en uno de cuyos ancestros) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, una molécula de ADN que codifica un polipéptido de la invención (es decir, un polipéptido INDY), o fragmento del mismo.

Cuando el hospedador es procariota, tal como E. coli, pueden prepararse células competentes que tienen capacidad de captación de ADN a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y posteriormente tratadas por el método de CaCh mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, puede usarse MgCh o RbCl. La transformación también puede realizarse después de formar un protoplasto de la célula hospedadora o por electroporación.

Cuando el hospedador es un eucariota, dichos métodos de transfección con ADN incluyen coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores víricos, así como otros conocidos en la técnica, que pueden usarse. Las células eucariotas también pueden cotransfectarse con secuencias de ADN que codifican un polipéptido de esta divulgación, y una segunda molécula de ADN exógeno que codifica un fenotipo de selección, tal como el gen de la timidina cinasa del herpes simple. Otros método es usar un vector vírico eucariótico, tal como el virus del simio 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar o transformar de forma transitoria células eucariotas y expresar la proteína. (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Preferiblemente, un hospedador eucariota se utiliza como célula hospedadora como se describe en este documento. La célula eucariota puede ser una célula de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o puede ser una célula de mamífero, incluyendo una célula humana.

Pueden genomanipularse sistemas de células de mamífero que utilizan virus recombinantes o elementos víricos para dirigir la expresión. Por ejemplo, cuando se usan vectores de expresión adenovíricos, las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína exógena pueden ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción adenovírico, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico después puede insertarse en el genoma adenovírico por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, región E1 o E3) producirá un virus recombinante que es viable y que puede expresar los polipéptidos en hospedadores infectados (por ejemplo, Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659, 1984).

Para producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere expresión estable. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden transformarse con el ADNc que codifica una proteína de fusión de interleucina/receptor de interleucinas controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador de selección. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos, que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Por ejemplo, después de la introducción de ADN exógeno, puede permitirse que las células genomanipuladas crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, aunque sin limitación, el gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11: 233, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Sci. U.S.A. 48: 2026, 1962) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980), que pueden emplearse.

En otras realizaciones, la divulgación con fines de referencia se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos de interleucina, polipéptidos de receptor de interleucinas, polipéptidos de anticuerpo y polipéptidos quiméricos de interleucina/receptor de interleucinas o partes biológicamente activas de los mismos. También se incluyen en la divulgación con fines de referencia fragmentos de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos quiméricos que codifican interleucina/receptor de interleucinas y fragmentos para su uso como cebadores de PCR para la amplificación y/o mutación de moléculas de ácido nucleico quiméricas de interleucina/receptor de interleucinas. Como se usa en este documento, la expresión "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), análogos del ADN o ARN generados usando análogos nucleotídicos, y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente está compuesta por ADN bicatenario.

En otra realización preferida más, la divulgación con fines de referencia incluye un método para aislar un ácido nucleico de la invención, que incluye uno o más de: (a) recombinar ácidos nucleicos de al menos dos linfocinas o receptores de linfocinas para crear una colección de ácidos nucleicos; (b) transformar los genes recombinantes en una célula competente; (c) cribar las células; (d) aislar el ácido nucleico deseado para ciclos adicionales de recombinación con otro ácido nucleico. El método de esta divulgación con fines de referencia también puede implicar la construcción de ácidos nucleicos recombinantes, vectores plasmídicos o ambos, y la expresión de genes en células hospedadoras transformadas. Las técnicas de clonación molecular requeridas para conseguir estos objetivos son bien conocidas en la técnica.

Un ácido nucleico codificante de interleucina puede codificar un polipéptido maduro de interleucina. Como se usa en este documento, una forma "madura" de un polipéptido o proteína divulgado en la presente divulgación con fines de referencia es el producto de un polipéptido de origen natural, forma precursora, preproproteína o proproteína. El polipéptido de origen natural, precursor o proproteína incluye, a modo de ejemplo no limitante, el producto génico de longitud completa codificado por el gen correspondiente. Como alternativa, puede definirse como el polipéptido, precursor o proproteína codificado por un ORF descrito en este documento. La forma "madura" del producto surge, a modo de ejemplo no limitante, como resultado de una o más etapas de procesamiento de origen natural que pueden tener lugar dentro de la célula (célula hospedadora) en que surge el producto génico. Ejemplos de dichas etapas de procesamiento que dan lugar a una forma "madura" de un polipéptido o proteína incluyen la escisión del residuo de metionina (Met) N terminal codificado por el codón de inicio de un ORF o la escisión proteolítica de un péptido señal o secuencia líder. Por tanto, una forma madura que surge de un polipéptido o proteína precursora que tiene los residuos 1 a n, donde el residuo 1 es la metionina N terminal, tendría los residuos 2 a n restantes después de la eliminación de la metionina N terminal. Como alternativa, una forma madura que surge de un polipéptido o proteína precursora que tiene los residuos 1 a n, en que se escinde una secuencia señal N terminal del residuo 1 al residuo Met, tendría los residuos desde el residuo Met+1 hasta el residuo n restantes. Además, como se usa en este documento, una forma "madura" de un polipéptido o proteína puede surgir de una modificación postraduccional distinta de un evento de escisión proteolítica. Dichos procesos adicionales incluyen, a modo de ejemplo no limitante, glucosilación, miristoilación, oligomerización o fosforilación. En general, un polipéptido o proteína madura puede ser el resultado del funcionamiento de solamente uno de estos procesos, o una combinación de cualquiera de ellos.

Un ácido nucleico de la divulgación con fines de referencia puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genómico como molde con cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas convencionales de amplificación por PCR. Además, los oligonucleótidos correspondientes a las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16 y partes y combinaciones de los mismos pueden prepararse por técnicas sintéticas convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado de ADN.

Polipéptidos

La presente divulgación con fines de referencia se basa en el descubrimiento de que la eficacia terapéutica de las interleucinas puede potenciarse preacoplando o formando complejos de la interleucina con un receptor de interleucinas o parte soluble del mismo. En determinadas realizaciones, la divulgación con fines de referencia incluye métodos para formar el complejo polipeptídico terapéutico de la divulgación con fines de referencia. En una realización de la divulgación con fines de referencia, el método comprende proporcionar una cantidad adecuada de al menos un polipéptido de linfocina o parte del mismo, proporciona una cantidad adecuada de al menos un polipéptido de receptor de linfocinas o parte del mismo, mezclar los polipéptidos de linfocina y receptor de linfocinas en condiciones adecuadas de pH e iónica durante un tiempo suficiente para permitir la formación de complejos, y opcionalmente concentrar o purificar el complejo. Los polipéptidos del complejo pueden formarse, por ejemplo, usando un sintetizador peptídico de acuerdo con métodos convencionales; expresando cada polipéptido componente por separado en una célula o extracto celular, después aislando y purificando el polipéptido. Opcionalmente, el complejo polipeptídico terapéutico de la invención puede formarse expresando ambos componentes polipeptídicos del complejo de la invención en la misma célula o extracto celular, después aislando y purificando los complejos, por ejemplo, usando técnicas cromatográficas, tales como cromatografía de afinidad con anticuerpos contra la parte de linfocina, la parte de receptor de linfocinas o contra el complejo. Además, la divulgación con fines de referencia incluye la expresión de una quimera o proteína de fusión que comprende una interleucina, en el mismo marco y contigua a un receptor de interleucinas o parte del mismo.

El complejo de la invención de como resultado una composición terapéutica que muestra semivida más larga in vivo con respecto a la administración de IL-15 en solitario. Por tanto, en una realización preferida, el complejo polipeptídico terapéutico de la divulgación con fines de referencia comprende al menos un polipéptido de linfocina o parte del mismo, preacoplado o en complejo con al menos un receptor de linfocinas, en el que el complejo demuestra una semivida in vivo y eficacia mayores que la IL-15 en solitario. En otra realización, el complejo demuestra una semivida in vivo de más de aproximadamente una hora. En un aspecto de esta realización, el complejo terapéutico de la invención se forma a partir de polipéptidos recombinantes expresados en una célula bacteriana o eucariota o a través del uso de péptidos sintetizados químicamente. En determinadas realizaciones de la divulgación con fines de referencia, el polipéptido de linfocina o parte del mismo es un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6, 10, 12, y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones de la divulgación con fines de referencia, el polipéptido de receptor de linfocinas o parte del mismo es un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, y combinaciones de los mismos. En otra realización, el complejo terapéutico de la divulgación con fines de referencia demuestra eficacia aumentada cuando se administra a un organismo que lo necesita, en comparación con el suministro de linfocina, por ejemplo, IL-15 o IL-2, en solitario.

En otra de las realizaciones preferidas, la divulgación con fines de referencia se refiere a un método de creación de un complejo polipeptídico terapéutico preacoplado que comprende al menos una interleucina, por ejemplo, IL-15, IL-2, partes o combinaciones de las mismas, preacoplada o en complejo con al menos un receptor de interleucinas, por ejemplo, IL-15Ra, IL-2Ra, partes de o combinaciones de los mismos, generado incubando el polipéptido de interleucina con un dominio soluble de receptor de interleucinas o expresando una molécula quimérica novedosa de ácido nucleico que comprende el segmento polinucleotídico de linfocina y el segmento polinucleotídico de receptor de linfocinas. En una realización preferida, la divulgación con fines de referencia proporciona un método para preacoplar una linfocina y un receptor de linfocinas, que comprende proporcionar una parte de linfocina y una parte de receptor de linfocinas, y combinar durante una cantidad adecuada de tiempo en condiciones iónicas y de pH tamponado que permitan la formación del complejo. En una realización particularmente preferida de la divulgación con fines de referencia, el polipéptido de linfocina se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6, partes o combinaciones de los mismos, y el polipéptido de receptor de linfocinas se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, partes o combinaciones de los mismos. En una realización, la divulgación con fines de referencia incluye un método para formar el complejo, que comprende proporcionar los componentes polipeptídicos aislados resuspendidos en un tampón, por ejemplo, PBS, mezclar los polipéptidos, e incubar durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos a de aproximadamente 26 °C a aproximadamente 40 °C. En una realización adicional de la divulgación con fines de referencia, el polipéptido de receptor de linfocinas comprende una quimera de una parte de unión a linfocina y una parte Fc de anticuerpo. En una realización preferida de la divulgación con fines de referencia, la SEQ ID NO: 6 o partes de la misma, y la molécula quimérica de SEQ Id NO: 8 - Fc se suspenden ambas en PBS, se mezclan y se incuban durante aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos a de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 39 °C.

En otra realización de la divulgación con fines de referencia, se proporcionan polipéptidos sustancialmente puros homólogos a las SEQ ID NO: 5-12. Un "polipéptido sustancialmente puro" es un polipéptido de interleucina o receptor de interleucinas, o parte del mismo que se ha separado de componentes que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido es sustancialmente puro cuando está al menos un 60 %, en peso, libre de proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con las que se asocia de forma natural. Preferiblemente, la preparación es al menos un 75 %, más preferiblemente al menos un 90 % y mucho más preferiblemente al menos un 99 %, en peso, de polipéptidos de interleucina y/o receptor de interleucinas. Un polipéptido sustancialmente puro puede obtenerse, por ejemplo, por extracción de una fuente natural (por ejemplo, una célula eucariota); por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido; o por síntesis química de la proteína. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o por análisis de HPLC.

Los aminoácidos esenciales para la función de los polipéptidos de interleucina y receptor de interleucinas pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502, 1991). En la última técnica, se introducen mutaciones de una sola alanina en diferentes residuos en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para la actividad biológica (por ejemplo, unión al ligando y transducción de señales) para identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción del ligando-proteína también pueden determinarse por análisis de la estructura cristalina determinada por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcaje de fotoafinidad. (Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992). Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden deducirse del análisis de homologías con proteínas relacionadas.

Pueden generarse múltiples sustituciones de aminoácidos y ensayarse usando métodos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los divulgados por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-57,1988; o Bowie y Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). En resumen, estos autores divulgan métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar polipéptidos funcionales y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., patente de Estados Unidos n.° 5223 409; Huse, publicación de la OMPI WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988). Los métodos de mutagénesis como se divulgan anteriormente pueden combinarse con métodos de cribado de alto rendimiento para detectar la actividad de proteínas mutagenizadas, clonadas en células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican proteínas activas o partes de las mismas (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando) pueden recuperarse de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando equipos modernos. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

Usando los métodos divulgados anteriormente, un experto en la materia puede preparar una diversidad de polipéptidos que sean sustancialmente homólogos a la SEQ ID NO: 5-12 o variantes alélicas de los mismos y retengan las propiedades de los polipéptidos de tipo silvestre. Como se expresa en este documento, la expresión "un polipéptido como se define por la SEQ ID NO: 5-12" incluye todas las variantes alélicas y ortólogos de especie de los polipéptidos. El término "polipéptido", como se usa en este documento, incluye secuencias modificadas tales como glucoproteínas, y se pretende específicamente que cubra polipéptidos o proteínas de origen natural, así como aquellos que se sintetizan de forma recombinante o sintética, que se producen en al menos dos conformaciones diferentes en los que ambas conformaciones tienen la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos, pero tienen diferentes estructuras tridimensionales. Los "fragmentos" son un parte de una proteína de origen natural. Los fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína de origen natural.

La divulgación, como divulgación con fines de referencia también engloba proteínas que son funcionalmente equivalentes al producto génico de interleucina y receptor de interleucinas, que se consideran por muchísimos criterios, incluyendo, aunque sin limitación, el efecto biológico resultante, por ejemplo, un cambio en el fenotipo tal como proliferación de inmunocitos, cambios en la expresión génica, por ejemplo, biomarcadores específicos que confirman la activación de las rutas de señalización de IL-15 y/o IL-2. Dichas proteínas funcionalmente equivalentes incluyen adiciones o sustituciones de residuos aminoacídicos dentro de la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de nucleótidos descritas, pero que provocan un cambio sinónimo o "mutaciones conservativa", produciendo de este modo un producto génico funcionalmente equivalente. En el caso de secuencias polipeptídicas que son menos de un 100 % idénticas a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas son preferiblemente, pero no necesariamente, sustituciones conservativas para la secuencia de referencia. Preferiblemente, se generan sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más residuos aminoacídicos no esenciales predichos. Una "sustitución conservativa de aminoácido" es una en que el residuo aminoacídico se remplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo aminoacídico no esencial predicho en la proteína se remplaza con otro residuo aminoacídico de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, en otra realización de la divulgación con fines de referencia, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse por la actividad biológica para identificar mutantes que retengan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse mediante cualquier tecnología recombinante conocida en la técnica y la actividad de la proteína puede determinarse.

Los polinucleótidos también pueden diseñarse para proporcionar secuencias adicionales tales como, por ejemplo, la adición de secuencias codificantes para aminoácidos C terminales o N terminales añadidos que facilitarían la purificación atrapándolos en columnas o mediante el uso de anticuerpos. Dichas marcas incluyen, por ejemplo, marcas ricas en histidina que permiten la purificación de polipéptidos en columnas de níquel. Dichas técnicas de modificación génica y secuencias adicionales adecuadas son bien conocidas en las técnicas de biología molecular.

En otra realización, la divulgación con fines de referencia se refiere a un complejo peptídico que comprende un polipéptido que tiene al menos un 30 % de homología con un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ iD NO: 5, 6, 10, 12, partes y combinaciones de los mismos, con un polipéptido que tiene al menos un 30 % de homología con un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, partes y combinaciones de los mismos. En otra realización, la divulgación con fines de referencia se refiere a un complejo peptídico que comprende un polipéptido que tiene al menos un 80 % de homología con un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6, 10, 12, partes y combinaciones de los mismos, con un polipéptido que tiene al menos un 80 % de homología con un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, partes y combinaciones de los mismos. En otra realización, la divulgación con fines de referencia comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6, 10, 12, partes y combinaciones de los mismos, acoplado o en complejo con un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, partes y combinaciones de los mismos.

La proliferación celular, por ejemplo, la proliferación de inmunocitos, disminuye en la carga o formación tumoral o aumenta en la resistencia tumoral, son parámetros que pueden usarse para evaluar la eficacia del complejo de la invención. Un experto en la materia entenderá que hay muchos métodos para evaluar la capacidad proliferativa de las células que son adecuadas para su uso en los métodos de la divulgación con fines de referencia. Por ejemplo, las células pueden marcarse in vitro (o in vivo) con BrdU para determinar el porcentaje de células en división o pueden evaluarse usando un ensayos de formación de colonias, como se describe en Li et al. (1997), supra. Las células adecuadas para el análisis de la capacidad proliferativa incluyen células que han crecido en histocultivo, células aisladas de un animal que se ha tratado con un compuesto de ensayo, células que son parte de un animal vivo o células que son parte de un corte histológico obtenido de un animal.

En más de una realización de los métodos ensayo anteriores de la divulgación con fines de referencia, puede ser deseable inmovilizar la interleucina, el receptor de interleucinas o el complejo de interleucina/receptor de interleucinas para facilitar la separación de las formas en complejo de las que no están en complejo de las proteínas. En una realización de la divulgación con fines de referencia, puede proporcionarse una proteína de fusión de interleucina o receptor de interleucinas que añada un dominio que permita que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión con GST o las proteínas de fusión de diana de GST pueden adsorberse en microesferas de Sepharose con glutatión (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivatizadas con glutatión, y la mezcla de interleucina y receptor de interleucinas se incuba en condiciones que dan lugar a la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para la sal y el pH). Después de la incubación, las microesferas o pocillos de la placa de microvaloración se lavan para retirar cualquier componente no unido, la matriz inmovilizada en el caso de microesferas, y la cantidad de complejo se determina directa o indirectamente. Como alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz, y la cantidad o actividad se determina usando técnicas convencionales.

También pueden usarse en la invención otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices. Por ejemplo, las proteínas pueden inmovilizarse utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas proteínicas biotiniladas pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, anticuerpos reactivos con los polipéptidos de interleucina o receptor de interleucinas, pero que no impiden la unión, pueden derivatizarse en los pocillos de la placa, y atraparse complejos proteínicos en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar dichos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados en GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con los polipéptidos de interleucina o receptor de interleucinas, así como ensayos enzimáticos que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con los polipéptidos de interleucina o receptor de interleucinas.

Otra realización preferida de la divulgación con fines de referencia se refiere a métodos para modular, inhibir o potenciar una respuesta inmunitaria, que comprende administrar una cantidad eficaz del complejo polipeptídico terapéutico de la invención a un individuo. Otros aspectos de este método incluyen la administración de una cantidad eficaz del complejo polipeptídico terapéutico en combinación con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, adyuvante, agente biológicamente activo o una combinación de los mismos.

En otra realización, la divulgación con fines de referencia proporciona un método para potenciar la inmunidad de un organismo que lo necesita, mediante la administración de un complejo preacoplado de una linfocina y receptor de linfocinas que demuestra una semivida in vivo sustancialmente más larga, y una eficacia sustancialmente mayor que la linfocina en solitario. Además, esta realización de la divulgación con fines de referencia también incluye un método de accionamiento de la proliferación homeostática de inmunocitos sensibles a linfocina, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK o similares. En determinadas realizaciones preferidas de la divulgación con fines de referencia, la presente realización incluye el uso de una molécula receptora de linfocinas que contiene un fragmento Fc de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, una construcción de IL-15Ra-Fc está disponible en el mercado en R&D Systems (Mineápolis, MN). Además, un experto en la materia reconocerá que el dominio receptor de linfocinas del complejo de la divulgación con fines de referencia puede tener opcionalmente el fragmento Fc de inmunoglobulina eliminado.

En otra realización, la presente divulgación con fines de referencia incluye un método para aplicar el complejo como un adyuvante para aumentar las respuestas inmunitarias contra cáncer, infección, o para potenciar la vacunación de cualquier tipo. En un aspecto de esta realización, el complejo de la invención se usa para potenciar la reconstitución del sistema inmunitario después de trasplante de médula ósea, de células madre o en casos de inmunodeficiencia tales como SIDA. La presente divulgación con fines de referencia también incluye un método de uso del complejo de la invención para ayudar en el crecimiento de linfocitos in vitro, que después pueden usarse para inmunoterapia adoptiva, que comprende proporcionar un paciente; retirar un volumen de sangre del paciente y aislar los linfocitos del paciente; tratar los linfocitos con una cantidad eficaz del complejo de la invención; y administrar los linfocitos tratados de nuevo al paciente.

En otra más de las realizaciones preferidas, la divulgación con fines de referencia incluye un método de uso del complejo modificado para usarse como antagonista de la actividad de la linfocina, por ejemplo, IL-15. Por ejemplo, a través de modificaciones de secuencia de una linfocina o receptor de linfocinas, por ejemplo, IL-15 o IL-15Ra, el complejo combinado podría convertirse en un inhibidor de la actividad de la linfocina in vivo. Dicha molécula podría tener efectos terapéuticos potenciales en la inhibición de la autoinmunidad, el rechazo de trasplantes o la enfermedad de injerto contra hospedador.

En cualquiera de las realizaciones preferidas de la divulgación con fines de referencia, se contempla cualquiera de las posibles formas recombinantes de la molécula del complejo de linfocina/receptor de linfocinas. Por ejemplo, una molécula peptídica monocatenaria producida a partir de una construcción genética que contenga el gen de la linfocina, por ejemplo, IL-2, IL-15, partes o combinaciones de los mismos, fusionado con el gen del receptor de linfocinas, por ejemplo, IL-2Ra, IL-15Ra, partes o combinaciones de los mismos, y opcionalmente la parte Fc de un anticuerpo. En determinadas realizaciones de la divulgación con fines de referencia la construcción genética puede incluir además una o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos conectores. Además de servir para aliviar las restricciones estéricas o conformacionales en el complejo, es concebible que la secuencia conectora pudiera conferir otras cualidades, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento por nucleasa, una secuencia de reconocimiento por proteasa, un dominio fotorreactivo, un dominio hidrófobo, un dominio hidrófilo, un dominio activo, función enzimática, un sitio para modificación química o conjugación, purificación o similares. En otras realizaciones, la divulgación con fines de referencia proporciona moléculas quiméricas compuestas por al menos un gen de linfocina y al menos un gen de receptor de linfocinas ligados en tándem de modo que permitirían la expresión de formas multiméricas del complejo, por ejemplo, dímeros, trímeros y similares. Estas proteínas también podría producirse en células eucariotas o procariotas.

Proteínas quiméricas y de fusión

Como se describe supra, la divulgación con fines de referencia también proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Como se usa en este documento, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende un polipéptido unido de forma funcional a otro polipéptido, por ejemplo, uno o más de los polipéptidos elegidos de las SEQ ID NO: 5-12 o partes de las mismas. Aunque los polipéptidos elegidos de las SEQ ID NO: 5-12 incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos un 30 % de homología. Dentro de la proteína de fusión, el polipéptido puede correspondes a la totalidad o a una parte de un polipéptido elegido de las SEQ ID NO: 5-12. En una realización de la divulgación con fines de referencia, la proteína de fusión comprende al menos una parte biológicamente activa de la proteína. En otra realización de la divulgación con fines de referencia, la proteína de fusión comprende al menos dos partes biológicamente activas de al menos una proteína elegida de las SEQ ID NO: 5-12. En otra realización de la divulgación con fines de referencia, la proteína de fusión comprende al menos tres partes biológicamente activas de al menos una proteína elegida de las SEQ ID NO: 5-12. Dentro de la proteína de fusión, la expresión "unido de forma funcional" pretende indicar que los polipéptidos concretos se fusionan en el mismo marco entre sí en el extremo N o el extremo C.

En más de una realización de la divulgación con fines de referencia de los métodos de ensayo anteriores, puede ser deseable inmovilizar los polipéptidos quiméricos de la invención para facilitar la separación de las proteínas. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añada un dominio que permita que las proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión con la glutatión-S-transferasa o conjugación de biotina y estreptavidina.

En una realización de la divulgación con fines de referencia, la proteína de fusión es una proteína de fusión con GST en que las secuencias polipeptídicas se fusionan en el extremo C o el extremo N de las secuencias de GST (glutatión-S-transferasa). En otra realización de la divulgación con fines de referencia, la proteína de fusión contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. En determinadas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción pueden aumentarse a través del uso de una secuencia señal heteróloga. En otra realización de la divulgación con fines de referencia, la proteína de fusión es una proteína de fusión de inmunoglobulina en que los polipéptidos o complejo polipeptídico de la invención se fusionan con secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. En una realización de la divulgación con fines de referencia, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto para modular una interacción entre un ligando y una proteína sobre la superficie de una célula. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina pueden usarse para afectar a la biodisponibilidad de un ligando análogo. La inhibición de la interacción del ligando puede ser útil terapéuticamente tanto para el tratamiento de trastornos proliferativos y de diferenciación, así como para la modulación (por ejemplo, promoción o inhibición) de la supervivencia celular. Además, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos en un sujeto, para purificar ligandos, y en ensayos de cribado para identificar moléculas que inhiban la interacción.

Una proteína quimérica o de fusión de la divulgación con fines de referencia puede producirse por técnicas convencionales de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan conjuntamente en el mismo marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminales con extremos romos o extremos escalonados para el ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminales apropiados, relleno de extremos cohesivos según lo apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable y ligamiento enzimático. En otra realización de la divulgación con fines de referencia, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores automatizados de ADN. Como alternativa, puede realizarse amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse y volver a amplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Una o más de las SEQ ID NO: 1-4 y 13-16 puede clonarse en dicho vector de expresión, de modo que el resto de fusión se ligue en el mismo marco al polipéptido deseado.

Anticuerpos

El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno, que comprende al menos una, y preferiblemente dos, regiones variables de la cadena pesada (H) (abreviadas en este documento como VH), y al menos una y preferiblemente dos regiones variables de la cadena ligera (L) (abreviadas en este documento como VL). Dichos anticuerpos incluyen, aunque sin limitación, fragmentos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, Fab, Fab' y F(ab')2, y una colección de expresión de Fab. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones flanqueantes" (FR). La extensión de la región flanqueante y las CDR se ha definido de forma precisa (véase, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH n.° 91-3242, y Chotia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, c DR3, FR4. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Determinadas clases tienen subclases también, tales como IgG1, IgG2 y otras. Además, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. La referencia en este documento a anticuerpos incluye una referencia a todas estas clases, subclases y tipos de especies de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos pueden prepararse a partir del polipéptido intacto o fragmentos que contienen péptidos de interés como agente inmunizador. Un fragmento polipeptídico antigénico preferido para la divulgación con fines de referencia es de 15­ 100 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 5-12. En una realización de la divulgación con fines de referencia, el péptido está ubicado en un dominio que no es transmembranario del polipéptido, por ejemplo, en un dominio extracelular o intracelular. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo ejemplar se une a un epítopo que es accesible desde el medio extracelular y que altera la funcionalidad de la proteína. En determinadas realizaciones, la presente divulgación con fines de referencia comprende anticuerpos que reconocen y son específicos para uno o más epítopos de cualquiera de las SEQ ID NO: 5-12, variantes, partes y/o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones de la divulgación con fines de referencia, los anticuerpos pueden ser específicos para el propio complejo de interleucina/receptor de interleucinas. En otras realizaciones más de la divulgación con fines de referencia, un anticuerpo específico para una interleucina puede funcionar como "receptor de interleucinas", es decir, funciona en un mecanismo de transpresentación similar al observado con un complejo que implica la parte soluble de los polipéptidos receptores de interleucinas, es decir, IL-15Ra y/o IL-2Ra. En realizaciones alternativas, los anticuerpos de la divulgación con fines de referencia pueden dirigirse a e impedir la interacción de la interleucina/receptor de interleucinas para inhibir la señalización de la interleucina.

La preparación de anticuerpos policlonales es bien conocida en la técnica de biología molecular; véase, por ejemplo, Production of Polyclonal Antisera in Immunochemical Processes (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992) y Coligan et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters in Current Protocols in Immunology, sección 2.4.1 (1992). La preparación de anticuerpos monoclonales también es bien conocida en la técnica; véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988).

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse inyectando a ratones o conejos una composición que comprende un antígeno, verificando la presencia de producción de anticuerpo al retirar una muestra de suero, retirando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos con células mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos contra el antígeno, y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales puede aislarse y purificarse de cultivos de hibridoma por técnicas bien conocidas en la técnica.

En otras realizaciones de la divulgación con fines de referencia, el anticuerpo puede producirse de forma recombinante, por ejemplo, producirse por presentación en fagos o por métodos combinatorios. La presentación en fagos y los métodos combinatorios pueden usarse para aislar anticuerpos recombinantes que se unan a las SEQ ID NO: 5-12 o fragmentos de las mismas (como se describe en, por ejemplo, Ladner et al. patente de Estados Unidos n.° 5223 409; Kang et al.

publicación internacional n.° WO 92/18619; Dower et al. publicación internacional n.° WO 91/17271; Winter et al. publicación internacional WO 92/20791; Markland et al. publicación internacional n.° WO 92/15679; Breitling et al. publicación internacional WO 93/01288; McCafferty et al. publicación internacional n.° WO 92/01047; Garrard et al. publicación internacional n.° WO 92/09690; Ladner et al. publicación internacional n.° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982).

Los anticuerpos monoclonales humanos también pueden generarse usando ratones transgénicos que portan los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se usan para producir hibridomas que secretan mAb humanos con afinidades específicas por epítopos de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood et al. solicitud internacional WO 91/00906, Kucherlapati et al. publicación p Ct WO 91/10741; Lonberg et al. solicitud internacional WO 92/03918; Kay et al. solicitud internacional 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L. L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S. L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326).

Un anticuerpo terapéuticamente útil contra los componentes del complejo de la invención o el propio complejo puede obtenerse de un anticuerpo monoclonal "humanizado". Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes de complementariedad de ratón de cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano, después sustituyendo los residuos humanos en las regiones flanqueantes de los equivalentes murinos. El uso de componentes de anticuerpo derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia los posibles problemas asociados con la inmunogenia de las regiones constantes murinas. Pueden encontrarse técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados en Jones et al., Nature 321: 522, 1986 y Singer et al., J. Immunol. 150: 2844, 1993. Los anticuerpos también pueden derivar de fragmentos de anticuerpo humano aislados de una colección combinatoria de inmunoglobulinas; véase, por ejemplo, Barbas et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2, 119, 1991.

Además, pueden obtenerse anticuerpos quiméricos por corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de especificidad biológica apropiada; véase, por ejemplo, Takeda et al., Nature 314: 544-546, 1985. Un anticuerpo quimérico es uno en que diferentes partes derivan de diferentes especies de animales.

Puede usarse tecnología antidiotípica para producir anticuerpos monoclonales que imiten a un epítopo. Un anticuerpo monoclonal antidiotípico generado contra un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que es la "imagen" del epítopo unido por el primer anticuerpo monoclonal. Como alternativa, pueden usarse técnicas usadas para producir anticuerpos monocatenarios para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios se forman conectando los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, lo que da como resultado un polipéptido monocatenario. Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconozcan epítopos específicos, por ejemplo, epítopos extracelulares, por técnicas bien conocidas en la técnica. Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fab producidos por digestión proteolítica, y fragmentos Fab generados por reducción de los puentes disulfuro. Cuando se usan para inmunoterapia, los anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos o ambos, pueden marcarse o no marcarse con un agente terapéutico. Estos agentes pueden acoplarse directa o indirectamente al anticuerpo monoclonal por técnicas bien conocidas en la técnica, e incluyen agentes tales como fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas.

Los intervalos de dosificación para la administración de anticuerpos monoclonales son suficientemente grandes para producir el efecto deseado, y variarán con la edad, estado, peso, sexo, edad y el grado de la afección a tratar, y pueden determinarlos fácilmente los expertos en la materia. Las dosificaciones pueden ser de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2000 mg/kg. Los anticuerpos monoclonales pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y/o subcutánea.

En determinadas realizaciones de la divulgación con fines de referencia, al menos un epítopo englobado por el péptido antigénico es una región de las SEQ ID NO: 5-12 que está ubicado sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, una región hidrófila. Un análisis de la hidrofobia de la secuencia proteínica indicará las regiones de un polipéptido que son particularmente hidrófilas y, por lo tanto, que probablemente codificarán residuos superficiales útiles para la producción de anticuerpos dirigidos. Como un medio para la producción de anticuerpos dirigidos, pueden generarse diagramas de hidropatía que muestran regiones de hidrofilia e hidrofobia por cualquier método bien conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los métodos de Kyte y Doolittle o de Hopp y Woods, ya sea con o sin transformada de Fourier. Véase, por ejemplo, Hopp y Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte y Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142. También se proporcionan en este documento anticuerpos que son específicos para uno o más dominios dentro de una proteína antigénica, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Una proteína de la invención, o un derivado, fragmento, análogo, homólogo u ortólogo de la misma, puede utilizarse como inmunógeno en la generación de anticuerpos que se unan inmunoespecíficamente a estos componentes proteínicos.

Anticuerpos humanos

Los anticuerpos completamente humanos se refieren esencialmente a moléculas de anticuerpo en que la secuencia completa tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluyendo las CDR, surgen de genes humanos. Dichos anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos" o "anticuerpos completamente humanos" en este documento. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse por la técnica de trioma; la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (véase, Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72) y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase, Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden utilizarse en la práctica de la presente invención y pueden producirse usando hibridomas humanos (véase, Cote, et al., 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando linfocitos B humanos con virus de Epstein Barr in vitro (véase, Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96).

Además, los anticuerpos humanos también pueden producirse usando técnicas adicionales, incluyendo colecciones de presentación en fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Asimismo, los anticuerpos humanos pueden generarse introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Tras la exposición, se observa producción de anticuerpos humanos, que se parecen mucho a los observados en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento génico, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5545 807; 5545 806; 5 569 825; 5625 126; 5633 425; 5661 016, y en Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992)); Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994)); Morrison (Nature 368, 812-13 (1994)); Fishwild et al., (Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)); Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)); y Lonberg y Huszar (Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995)).

Los anticuerpos humanos pueden producirse adicionalmente usando animales no humanos transgénicos que se modifican para que produzcan anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta a la exposición por el antígeno. (Véase la publicación PCT WO 94/02602). Los genes endógenos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en el hospedador no humano se han incapacitado, y se insertan locus activos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas humanas en el genoma del hospedador. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano necesarios. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas se obtiene entonces como descendencia por cruce de animales transgénicos intermedios que contienen menos de la totalidad del complemento de las modificaciones. La realización preferida de dicho animal no humano es un ratón, y se denomina Xenomouse™ como se divulga en las publicaciones PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce linfocitos B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del animal después de inmunización con un inmunógeno de interés como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal, o como alternativa de linfocitos B inmortalizados derivados del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Además, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener análogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moléculas Fv monocatenarias.

Fragmentos Fab y anticuerpos monocatenarios

De acuerdo con la divulgación con fines de referencia, las técnicas pueden adaptarse para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos contra una proteína antigénica de la invención (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4946 778). Además, los métodos pueden adaptarse para la construcción de colecciones de expresión de Fab (véase, por ejemplo, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por una proteína o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos contra un antígeno proteínico pueden producirse por técnicas conocidas en la técnica incluyendo, aunque sin limitación: (i) un fragmento F(ab')2 producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.

Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por una proteína antigénica de la invención. La segunda diana de unión es cualquier otro antígeno, y ventajosamente es una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Los métodos para generar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537 539 (1983)). A causa de la gama aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se consigue habitualmente por etapas de cromatografía de afinidad. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpoantígeno) pueden fusionarse a las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener presente la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión con la cadena ligera en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión diferentes, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otra estrategia descrita en el documento WO 96/27011, la superficie de contacto entre un par de moléculas de anticuerpo puede genomanipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La superficie de contacto preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la superficie de contacto de la primera molécula de anticuerpo se remplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la una o más cadenas laterales grandes en la superficie de contacto de la segunda molécula de anticuerpo remplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos con las más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar la producción del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Se han descrito en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando ligamiento químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formado de complejos con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles adyacentes y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados entonces se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se vuelve a convertir entonces en el Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Además, los fragmentos Fab' puede recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado podía unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como activaba la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

También se han descrito diversas técnicas para generar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para generar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se obligan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para generar fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes, de los que al menos uno de ellos proviene del antígeno proteínico de la invención. Como alternativa, un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina puede combinarse con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores de Fc para IgG (FcgammaR), tales como FcgammaRI (CD64), FcgammaRII (CD32) y FcgammaRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúdido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA.

Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente divulgación con fines de referencia. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmunitario a células indeseadas (patente de Estados Unidos n.° 4676 980), y para el tratamiento de infección por VIH (documentos WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando métodos conocidos en química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o por formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los divulgados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 4 676 980.

Inmunoconjugados

La divulgación con fines de referencia también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterápico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se generan usando una diversidad de agentes bifuncionales de acoplamiento proteínico tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutareldehído), compuestos bisacido (tales como bis (p-acidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido triaminapentaacético de 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026.

En otra realización de la divulgación con fines de referencia, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" para su utilización en preabordaje de tumores, en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente de depuración y después administración de un "ligando" que a su vez esté conjugado con un agente citotóxico.

Inmunoliposomas

Los anticuerpos divulgados en este documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las patentes de Estados Unidos n.° 4485 045 y 4544 545. Los liposomas con tiempo en circulación aumentado se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 5013 556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterápico (tal como Doxorrubicina) está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la divulgación con fines de referencia se refiere en general a la cantidad necesaria para conseguir un objetivo terapéutico. Como se indica anteriormente, este puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno diana que, en determinados casos, impide el funcionamiento de la diana y, en otros casos, promueve una respuesta fisiológica. La cantidad requerida a administrarse dependerá, además, de la afinidad de unión del anticuerpo por su antígeno específico, y también dependerá de la tasa a la que un anticuerpo administrado se reduzca del volumen libre de otro sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación con fines de referencia pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez a la semana.

Como divulgación con fines de referencia, los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de la invención, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado divulgados en este documento, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos en forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones implicados en la preparación de dichas composiciones, así como las directrices en la elección de componentes se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19.a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editores) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, Nueva York.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Las formulaciones a usar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Pueden prepararse preparaciones de liberación mantenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, que son matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de Estados Unidos n.° 3773 919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

Ensayo ELISA

Un agente para detectar una proteína analito es un anticuerpo que puede unirse a una proteína analito, preferiblemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab)2). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende englobar marcaje directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento (es decir, ligamiento físico) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Ejemplos de marcaje indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpos secundario marcado de forma fluorescente y marcaje del extremo de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada de forma fluorescente. La expresión "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y líquidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y líquidos presentes dentro de un sujeto. Se incluye dentro del uso de la expresión "muestra biológica", por lo tanto, sangre y una fracción o componente de la sangre, incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el método de detección de la invención puede usarse para detectar un ARNm analito, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro, así como in vivo. Por ejemplo, técnicas in vitro para la detección de un ARNm analito incluyen hibridaciones de Northern e hibridaciones in situ. Técnicas in vitro para la detección de una proteína analito incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Técnicas in vitro para la detección de un ADN genómico analito incluyen hibridaciones de Southern. Se describen procedimiento para realizar inmunoensayos, por ejemplo en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, N.J., 1995; "Immunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, 1985. Además, técnicas in vivo para la detección de una proteína analito incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado antiproteína analito. Por ejemplo, el anticuerpo puede detectarse con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse por técnicas convencionales de imágenes de forma intracavitaria o transdérmica, en solitario o con células efectoras.

Usos terapéuticos y formulaciones

Los ácidos nucleicos de la divulgación con fines de referencia y proteínas de la invención son útiles en posibles aplicaciones profilácticas y terapéuticas implicadas en una diversidad de trastornos incluyendo, aunque sin limitación: trastornos metabólicos, diabetes, obesidad, enfermedad infecciosa, anorexia, cáncer, trastornos neurodegenerativos, enfermedad de Alzheimer, trastorno de Parkinson, trastornos inmunitarios, trastornos hematopoyéticos y las diversas dislipidemias, alteraciones metabólicas asociadas con obesidad, el síndrome metabólico X y trastornos consuntivos asociados con enfermedades crónicas y diversos cánceres, cardiomiopatía, ateroesclerosis, hipertensión, defectos cardiacos congénitos, estenosis aórtica, comunicación interauricular (CIA), comunicación auriculoventricular (CAV), conducto arterial, estenosis pulmonar, estenosis subaórtica, comunicación interventricular (CIV), valvulopatías, esclerosis tuberosa, esclerodermia, lupus eritematoso, obesidad, trasplante, adrenoleucodistrofia, hiperplasia suprarrenal congénita, cáncer de próstata, neoplasia; adenocarcinoma, linfoma, cáncer de útero, fertilidad, leucemia, hemofilia, hipercoagulación, púrpura trombocitopénica idiopática, inmunodeficiencias, enfermedad de injerto contra hospedador, SIDA, asma bronquial, artritis reumatoide y artrosis, enfermedad de Crohn; esclerosis múltiples, el tratamiento de ostoeodistrofia hereditaria de Albright, y otras enfermedades, trastornos y afecciones similares.

Las preparaciones para la administración del complejo terapéutico de la invención incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos incluyen solución de cloruro de sodio de Ringer con dextrosa, solución de dextrosa y cloruro de sodio de Ringer con lactato, incluyendo los vehículos intravenosos reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos y similares. Pueden añadirse conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación con fines de referencia, polipéptidos para su uso de acuerdo con la invención, y como anticuerpos de la divulgación con fines de referencia (también denominados en este documento "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Dichas composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína o anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se describen vehículos adecuados en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia habitual en el campo. Ejemplos preferidos de dichos vehículos o diluyentes incluyen, aunque sin limitación, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y seroalbúmina humana al 5 %. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios a las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa, intraperitoneal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH pude ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede confinarse en ampollas, jeringas deseables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor™. (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida en la medida que sea fácil de inyectar. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, el complejo terapéutico de la invención) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, métodos de preparación son secado al vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo.

Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se confinan en cápsulas de gelatina o se comprimen en comprimidos. Con fines de administración terapéutica oral, al compuesto activo se le puede incorporar excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también puede prepararse usando un vehículo líquido para su uso como colutorio, en el que el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se remueve enjuagando y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites comestibles fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponantes, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según lo apropiado.

Las preparaciones para administración oral se pueden formular de forma adecuada para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o grageas formuladas de manera convencional. Para administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de pulverización de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma monodosis, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril antes de su uso. Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implante (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resines de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble.

Para su administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente o dosificador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes en general son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede conseguirse a través del uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas como se conoce en general en la técnica.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto contra la rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a las células infectadas, con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4522 811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente concretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención están dictaminadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de formulación de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación con fines de referencia pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de genoterapia. Los vectores de genoterapia pueden suministrarse a un sujeto por, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5328 470) o por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de genoterapia puede incluir el vector de genoterapia en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en que se incluya el vehículo de genoterapia. Como alternativa, cuando el vector de genoterapia completo puede producirse intacto desde células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro génico. Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dosificador junto con instrucciones para su administración.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del complejo terapéutico suficiente para provocar una mejora o retardar los síntomas. La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéutico es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DL50/DL50. Se prefieren compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado de diseñar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el posible daño a las células no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración plasmática en circulación que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue la mitad de la inhibición máxima de la los síntomas) determinada en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de manera más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Por tanto, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para su administración por inhalación o insuflación (a través de la boca o la nariz) o administración oral, bucal, intravenosa, intraperitoneal, parenteral o rectal.

También se divulga de acuerdo con la presente divulgación con fines de referencia un kit o sistema que utiliza uno cualquiera de los métodos, estrategias de selección, materiales o componentes descritos en este documento. Los kits ejemplares de acuerdo con la presente divulgación opcionalmente incluirán, adicionalmente instrucciones para realizar métodos o ensayos, materiales de embalaje, uno o más recipientes que contienen un ensayo, un dispositivo o componentes del sistema, o similares.

En un aspecto adicional, la presente divulgación con fines de referencia proporciona kits que materializan el complejo y los métodos de uso divulgados en este documento. Los kits de la invención opcionalmente incluyen uno o más de los siguientes: (1) componentes polipeptídicos o de ácido nucleico descritos en este documento; (2) instrucciones para poner en práctica los métodos descritos en este documento y/o para llevar a cabo el procedimiento de selección de este documento; (3) uno o más componentes del ensayo de detección; (4) un recipiente para alojar ácidos nucleicos o polipéptidos, otros ácidos nucleicos, plantas transgénicas, animales, células o similares y, (5) materiales de embalaje.

Organismos transgénicos

Una célula o animal transgénico usado en los métodos de la divulgación con fines de referencia puede incluir un transgén que codifique, por ejemplo, una copia de un polipéptido quimérico que comprenda una interleucina y receptor de interleucinas. El transgén puede codificar una proteína que sea normalmente exógena a la célula o animal transgénico, incluyendo una proteína humana. El transgén puede ligarse a un promotor heterólogo o natural.

Esta divulgación se refiere además a un método de producción de animales transgénicos. Pueden usarse técnicas conocidas en la técnica para introducir el transgén en animales para producir la línea creadora de animales. Dichas técnicas incluyen, aunque sin limitación: microinyección de pronúcleos; transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152, 1985; dirección génica en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell 56: 313-321, 1989; electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell Biol. 3: 1803­ 1814, 1983; y transferencia génica mediada por esperma (Lavitrano, et al., Cell 57: 717-723, 1989; etc. Para una revisión de dichas técnicas, véase Gordon, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229, 1989. Por consiguiente, la divulgación con fines de referencia ofrece un organismo transgénico que contiene un transgén que codifica un polipéptido quimérico de interleucina/receptor de interleucinas. El organismo transgénico puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una célula de levadura, un insecto, por ejemplo, un gusano o una mosca, un pez, un reptil, un ave o un mamífero, por ejemplo, un roedor. El organismo transgénico puede comprender además una alteración genética, por ejemplo, una mutación puntual, inserción o deficiencia, en un gen endógeno.

Una célula hospedadora de la divulgación con fines de referencia, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar) los componentes polipeptídicos o complejo de la invención. Por consiguiente, la divulgación con fines de referencia proporciona además métodos para producir proteína usando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la divulgación con fines de referencia (en que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica la proteína) en un medio adecuado de modo que se produzca la proteína. En otra realización de la divulgación con fines de referencia, el método comprende además aislar la proteína del medio o la célula hospedadora.

Otro aspecto de la divulgación con fines de referencia se refiere a células hospedadoras en que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan indistintamente en este documento. Se entiende que dichas expresiones se refieren no solamente a la célula en cuestión particular, sino también a la descendencia o posible descendencia de dicha célula. Como pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión como se usa en este documento. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, la proteína puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los expertos en la materia conocen otras células hospedadoras adecuadas.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usa en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico exógeno (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN exógeno en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, en general se introduce un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Diversos marcadores de selección incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Puede introducirse un ácido nucleico que codifique un marcador de selección en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica la proteína o puede introducirse en un vector diferente. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador de selección sobrevivirán, mientras que las otras morirán).

Las células hospedadoras de la divulgación con fines de referencia también pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula hospedadora de la invención es un ovocito fertilizado o una célula madre embrionaria en que se han introducido las secuencias codificantes de la proteína. Dichas células hospedadoras pueden usarse entonces para crear animales transgénicos no humanos en que se han introducido secuencias polipeptídicas exógenas en su genoma o animales recombinantes homólogos en que se han alterado las secuencias polipeptídicas endógenas. Dichos animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de las proteínas y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad proteínica. Como se usa en este documento, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o ratón, en que una o más de las células del animal incluyen un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgén es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico. Como se usa en este documento, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en que se ha alterado un gen endógeno por recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógeno introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.

Un ejemplo de una realización preferida de la invención se proporciona a continuación.

Ejemplo 1

La coadministración de IL-15 e IL-15Ra dirige la proliferación de linfocitos T CD8 de memoria y linfocitos NK in vivo

Para determinar si la coadministración de IL-15 e IL-15Ra de ratón recombinante-Fc (rmIL-15Ra-Fc) podría mediar la actividad de IL-15 in vivo, se utilizó un modelo de transferencia adoptiva para estimar el efecto de IL-15 sobre la proliferación de linfocitos T CD8+. Se transfirieron linfocitos T CD8+ esplénicos enriquecidos marcados con CFSE CD45.1 a ratones CD45.2 normales y rmIL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 |jg). Cuatro días después del tratamiento con IL-15 en solitario, aproximadamente un 11 % de la población de linfocitos T CD8+ donadores se había dividido (figura 1a, paneles superiores), en consonancia con nuestros resultados previos. En drástico contraste, la coadministración de la misma cantidad de IL-15 unida a rmIL-15Ra-Fc provocó la proliferación de aproximadamente un 69 % de los linfocitos T CD8+ donadores (figura 1). Además, aunque la mayoría de linfocitos T CD8 que responden a IL-15 en solitario se dividían una vez, las células que respondían al tratamiento de combinación experimentaban 5-7 divisiones, provocando un aumento sustancial en los números de células (datos no mostrados). El grueso de las células en división expresaba niveles altos de CD44, lo que sugiere que las células que responden eran principalmente linfocitos T CD8+ de memoria o que CD44 se había regulado por aumento (figura 1a, paneles inferiores). De forma importante, la administración de rmIL-15Ra-Fc en solitario no indujo la proliferación de linfocitos T CD8+ (datos no mostrados). Cabe destacar que la coadministración de una forma soluble de rmIL-15Ra con IL-15 también provocaba proliferación potenciada de linfocitos T CD8+ donadores aunque a un nivel intermedio a IL-15 en solitario e IL-15 combinada con rmIL-15Ra-Fc (datos no mostrados). Para ensayar la acción del tratamiento combinado en linfocitos T CD8 de memoria auténticos, se transfirieron de forma adoptiva linfocitos T de memoria CD8+ específicos de ovalbúmina (OVA) marcados con CFSE que se habían generado por infección con virus de la estomatitis vesicular recombinante que expresaba OVA (VSV-OVA). Similar a los resultados anteriores, los linfocitos T CD8+ de memoria específicos de antígeno que respondían al tratamiento combinado con IL-15/IL-15Ra-Fc proliferaron a un grado mucho mayor que a los que se proporcionó IL-15 en solitario (figura 1b).

Estudios pasados han implicado la IL-15 como inductor de la proliferación de linfocitos B, linfocitos NK y linfocitos T NK, pero no de la proliferación de linfocitos T CD4+. Por lo tanto, se examinó la capacidad de la IL-15 y la iL-15 en complejo con el receptor de inducir la proliferación de estos tipos celulares usando el sistema de transferencia adoptiva. Los linfocitos T CD4+ y los linfocitos B no proliferaron en respuesta a aproximadamente 2,5 jg de IL-15, mientras que los linfocitos NK proliferaron muy poco (figura 2). En contraste, la coadministración de rmIL-15Ra-Fc con IL-15 indujo proliferación extensa de linfocitos NK, mientras que los linfocitos B no respondieron. La respuesta de los linfocitos T NK fue similar a la de los linfocitos NK (datos no mostrados). De forma interesante, aunque no se cree que la IL-15 medie la proliferación de los linfocitos T CD4+ de ratón, los linfocitos T CD4+ ilustraron una respuesta intermedia al complejo administrado.

Ejemplo 2

La IL-15/IL-15Ra en complejo potencia enormemente la actividad de IL-15 in vivo

A continuación se examinó la cinética temprana de la respuesta proliferativa a la coadministración de rmIL-15Ra-Fc con IL-15. La dilución de CFSE era insignificante un día después del tratamiento, pero en el día dos, aproximadamente un 36 % de la población de linfocitos T CD8+ donadores se había dividido, con un número apreciable de células en la tercera y cuarta ronda de división (figura 3). En el día tres, aproximadamente un 59 % de los linfocitos T CD8+ donadores se había dividido con muchas células en divisiones 5-6, mientras que aproximadamente un 73 % se había dividido en el día cuatro con algunas células en la séptima ronda de división. Estos resultados y otros mostraron que el efecto máximo de una sola dosis de IL-15/rmIL-15Ra-Fc se conseguía en aproximadamente 4 días después del tratamiento, seguido de la entrada de los linfocitos T CD8+ donadores en una tasa de proliferación prolongada característica de los linfocitos T CD8+ de memoria (datos no mostrados).

La coadministración de IL-15Ra-Fc con IL-15 potencia enormemente la potencia de IL-15. En el día -1, ratones recibieron i.v. aproximadamente 1,5 x 106 linfocitos congénicos enriquecidos en CD8 marcados con CFSE y en el día 0 recibieron i.p. PBS, IL-15 (aproximadamente 5 jg ) o dosis variables de IL-15 con IL-15Ra-Fc (aproximadamente 2,5 jg 15 jg , aproximadamente 0,5 jg 3 jg , aproximadamente 0,1 jg 0,6 jg o aproximadamente 0,02 jg 0,12 jg). En el día -1, cada ratón recibió i.v. aproximadamente 4,5 x 106 linfocitos congénicos enriquecidos en CD8 marcados con CFSE y en el día 0 recibieron i.p. PBS, IL-15 (aproximadamente 0,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 3 jg ) o dosis variables de IL-15 (aproximadamente 12,5 jg , 25 jg o 37,5 jg). Los esplenocitos CD8+ se analizaron en el día 4 para la dilución de CFSE por citometría de flujo.

Para obtener una aproximación de la potenciación de la actividad obtenida por tratamiento combinado sobre el de IL-15 en solitario, se realizaron valoraciones de IL-15 e IL-15/rmIL-15Ra-Fc usando el modelo de transferencia adoptiva. Las comparaciones se basaron en el grado de proliferación de los linfocitos T CD8+ donadores, evaluado por dilución de CFSE. Una dosis de aproximadamente 0,1 |jg de IL-15 combinada con aproximadamente 0,6 |jg de IL-15Ra-Fc indujo un nivel de proliferación similar al de aproximadamente 5 jg de IL-15. Por tanto, en este tipo de experimento, la actividad de IL-15 se potenció ~50 veces por la coadministración con rmIL-15Ra-Fc. Considerando esta potenciación sustancial, nos cuestionamos si IL-15 en solitario podría conseguir este nivel de actividad. Incluso con la administración de aproximadamente 37,5 jg de IL-15, no pudo conseguirse el nivel de proliferación obtenido con aproximadamente 0,5 jg de IL-15 en complejo con el receptor. Estos resultados sugirieron que la disponibilidad de IL-15Ra puede ser limitante in vivo ya que aumentar los niveles de IL-15 no provocaba potenciación adicional de la actividad.

Ejemplo 3

La IL-15/IL-15Ra en complejo funciona mediante transpresentación que requiere IL-15Rb

La actividad de IL-15+IL-15Ra-Fc en complejo requiere IL-2Ra, pero no la expresión de IL-15Ra por las células que responden. En el día -1, ratones IL-15Ra-/- recibieron i.v. linfocitos congénicos IL-15Ra-/- enriquecidos en CD8 marcados con CFSE y en el día 0 se trataron i.p. con PBS, IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) o IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg). En el día 4, se analizaron los esplenocitos donadores CD8+ para la fluorescencia de CFSE y la expresión de CD44 y CD122. En el día -1, ratones normales recibieron i.v. esplenocitos congénicos de tipo silvestre o IL-2/IL-15Ra -/- marcados con CFSE y en el día 0 se trataron i.p. con PBS o IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg). Los esplenocitos donadores CD8+ se analizaron para la dilución de CFSE en el día 4 por citometría de flujo.

Los efectos de I L-15/IL-15Ra en complejo podrían estar mediados por efectos directos o indirectos sobre los tipos celulares que responden. Si son directos, entonces podría esperarse que no se requiriera que las células diana expresaran uno o más componentes de IL-15R. Para ensayar esto, se transfirieron linfocitos T CD8+ IL-15Ra-/- marcados con CFSE a hospedadores IL-15Ra-/- y los ratones se trataron con IL-15 o IL-15/IL-15Ra en complejo. La IL-15 no se pudo transpresentar en ausencia de IL-15Ra, y no indujo proliferación. Por otro lado, los linfocitos T c D8+ donadores de ratones tratados con IL-15/rmIL-15Ra-Fc proliferaron extensamente. Además, las células donadoras IL-15Ra-/-, que consistían principalmente en linfocitos T CD8+ de fenotipo virgen, aumentaron progresivamente su expresión de CD44 y CD122 con división. Como los linfocitos T que responden no requerían IL-15Ra para responder a la IL-15/IL-15Ra en complejo, se examinó la función de IL-15Rb (CD122) en la mediación de este efecto. Para este fin, se transfirieron linfocitos T CD8+ CD122+/+ o CD122-/- marcados con CFSE a ratones normales y se analizaron las células donadoras para la dilución de CFSE 4 días después del tratamiento. Aunque las células de control proliferaron vigorosamente en respuesta al tratamiento con IL-15/rmIL-15Ra-Fc, los linfocitos T CD8+ donadores CD122-/- no proliferaron en respuesta a la coadministración. Tomados conjuntamente, los resultados indicaron que IL-15/IL-15Ra-Fc funcionaba mediante transpresentación directa a través de interacción con la IL-15Rb probablemente junto con gammaC.

Ejemplo 4

La proliferación inducida por transpresentación obligada de IL-15 requiere MHC de clase I, pero no IL-7 o células dendríticas

La proliferación dirigida por IL-15+IL-15Ra-Fc preacoplado de los linfocitos T CD8+ requiere la expresión de MHC de clase I, pero no requiere IL-7 o DC. En el día -1, ratones B6 y beta2m-/- recibieron una mezcla de linfocitos T CD8+ marcados con CFSE B6 normales y OT-I-RAG-/- vírgenes y en el día 0 se trataron con PBS o IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg). En el día -1, ratones IL-7+/- o IL-7-/- recibieron linfocitos congénicos enriquecidos en CD8 marcados con CFSE. En el día 0, los ratones recibieron i.p. IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg). En el día -1, quimeras producidas con médula ósea B6 o CD11c-DTR recibieron esplenocitos i.v y en el día 0 se trataron i.p. con PBS o IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg ) IL-15 (aproximadamente 2,5 jg). Todos los ratones se trataron con DT en los días 0, 1 y 3. En todos los casos, los esplenocitos CD8+ donadores se analizaron para la dilución de CFSE en el día 4.

Mientras que los linfocitos T vírgenes requieren MHC de clase I y péptido endógeno para su supervivencia, se cree que la supervivencia y proliferación de los linfocitos T CD8 de memoria es independiente de MHC de clase I. La proliferación homeostática de estos subconjuntos en hospedadores vacíos muestra requisitos de MHC similares. Dados estos resultados, fue importante determinar los requisitos de MHC para la proliferación inducida por la coadministración de rmIL-15Ra-Fc con IL-15. Por tanto, se cotransfirieron linfocitos T CD8+ transgénicos TCR vírgenes (OT-I) y linfocitos T CD8+ B6 enriquecidos (que contienen células de memoria) a ratones normales o deficientes de MHC de clase I (b2-microglobulina-/-). De forma interesante, los linfocitos T CD8 OT-IRAG-/- vírgenes proliferaron vigorosamente en respuesta al tratamiento con el complejo en un hospedador suficiente de MHC de clase I. En contraste, en hospedadores de MHC de clase I-/-, la proliferación de linfocitos T vírgenes no se produjo. Asimismo, los linfocitos T CD8 B6 proliferaron en hospedadores normales, pero sorprendentemente la proliferación fue casi ausente en hospedadores de m Hc de clase I-/-. Estos datos indicaron que la inducción de la proliferación por IL-15/IL-15Ra era dependiente de MHC de clase I tanto para linfocitos T CD8+ vírgenes como de memoria. Como la respuesta proliferativa inducida por la coadministración de rmIL-15Ra-Fc con IL-15 fue dependiente de la expresión en el hospedador de MHC de clase I, se aspiró a investigar otros criterios que también pudieran desempeñar una función. Se examinó la implicación de IL-7, ya que esta citocina es esencial para la proliferación homeostática de linfocitos T CD8 en hospedadores inmunodeficientes. Se transfirieron linfocitos T CD8+ marcados con CFSE a ratones de control o IL-7-/- y se les administró IL-15/rmIL-15Ra-Fc combinadas. En presencia o ausencia de IL-7, los linfocitos T CD8+ proliferaban igual de bien en respuesta a IL-15 con IL-15Ra-Fc, lo que indica que IL-7 no estaba implicada en la proliferación mediada por IL-15 en nuestro sistema. Estudios previos han resaltado el potencial de las células dendríticas (DC) en mediar la actividad de IL-15 y la expresión de MHC por DC puede ser importante en la homeostasis de los linfocitos T. Para ensayar la función que desempeñan las DC en la respuesta proliferativa inducida por la coadministración de IL-15/IL-15Ra, se utilizó un sistema en que las DC pueden reducirse de forma condicionada. Los ratones CD11c-DTR expresan el receptor de simio de la toxina diftérica bajo el control del promotor de CD11c, que hace que las células CD11c+ sean susceptibles a DT, lo que elimina > 95 % de las DC. Debido a la toxicidad de DT para los ratones CD11 c-DTR sanos como resultado de los efectos sobre células no hematopoyéticas, se generaron quimeras usando médula ósea CD11c-DTR y hospedadores B6 normales. Entonces se transfirieron linfocitos T CD8+ marcados con CFSE a las quimeras que se trataron con DT antes de la administración del complejo de IL-15/IL-15Ra. De forma interesante, no se encontraron diferencias en la proliferación de linfocitos T CD8+ entre quimeras de control o CD11c-DTR tratadas con DT. Por tanto, aunque el MHC de clase I era esencial para la proliferación mediada por IL-15, no se requerían DC.

Ejemplo 5

La inmunoterapia con IL-15/IL-15Ra induce la activación y función efectora de linfocitos T vírgenes

Los linfocitos T CD8+ vírgenes adquieren el fenotipo efector y funcionan en respuesta al tratamiento con IL-15+IL-15Ra-Fc preacoplado. En el día -1, ratones recibieron una mezcla de linfocitos OT-I-RAG-/- vírgenes y de memoria o solamente linfocitos OT-I-RAG-/- vírgenes, y se trataron con PBS o rmIL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 |jg) con IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) en el día 0. Cuatro días después, los esplenocitos se examinaron para la intensidad de CFSE, el porcentaje de OT-I donadores y la expresión de CD44. En el día -1, ratones recibieron aproximadamente 7 x 105 linfocitos OT-I-RAG-/- vírgenes y en el día 0 se trataron con PBS, IL-15 (aproximadamente 2,5 jg), IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg ) o aproximadamente 1 x 105 ufp de VSV-OVA. En el día 4, los esplenocitos se incubaron in vitro con o sin péptido SIINFEKL durante aproximadamente 5 horas y la producción de IFN-a se analizó por tinción intracelular. En el día -1, ratones recibieron aproximadamente 2 x 106 linfocitos OT-I-RAG-/- vírgenes y se trataron con PBS o IL-15 (aproximadamente 2,5 jg ) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 jg ) i.p. o aproximadamente 1 x 105 ufp de VSV-OVA i.v. En el día 4 después del tratamiento, cada ratón recibió una mezcla de esplenocitos marcados con CFSE (aproximadamente 0,25 jM ) no estimulados con péptido y esplenocitos marcados con CFSE (aproximadamente 2,5 jM ) estimulados con péptido SIINFEKL. Cuatro horas después, los esplenocitos se analizaron para la presencia de las poblaciones diana marcadas con CFSE.

En experimentos previos, se apreció que los linfocitos T CD8 policlonales de CD44bajo, así como los linfocitos T transgénicos TCR vírgenes respondían a IL-15 cuando se coadministraba con IL-15Ra-Fc. Considerando que, en condiciones homeostáticas, los linfocitos T de memoria CD8 muestran sensibilidad mucho mayor a IL-15 de lo que los hacen los linfocitos T CD8+ vírgenes, se aspiró a comparar directamente la sensibilidad de estos dos conjuntos a la IL-15/rmIL-15Ra-Fc en complejo. Para hacerlo, se transfirieron de forma adoptiva linfocitos T CD8+ OT-I de memoria y OT-I vírgenes marcados con CFSE en los mismos hospedadores C57BL/6 congénicos y se analizó la proliferación 4 días después del tratamiento con IL-15/IL-15Ra-Fc. Sorprendentemente, los linfocitos T CD8 OT-I vírgenes proliferaron casi tan bien como los linfocitos T CD8+ OT-I de memoria. Los linfocitos OT-I vírgenes también se expandieron ~10 veces en respuesta al complejo en comparación con los y CD44 regulado por aumento. A la luz de la proliferación vigorosa inducida en linfocitos T vírgenes, fue de interés establecer si la función efectora se inducía simultáneamente. Para ensayar esta cuestión, se transfirieron de forma adoptiva linfocitos T CD8+ OT-I vírgenes en hospedadores C57BL/6 congénicos y, usando un ensayo de destrucción in vivo, se midió la actividad lítica específica de antígeno cuatro días después del tratamiento con IL-15/rmIL-15Ra-Fc o después de la infección con virus de la estomatitis vesicular recombinante que expresaba ovoalbúmina (VSV-OVA) para la comparación. De forma interesante, el tratamiento con IL-15/rmIL-15Ra-Fc provocó la inducción de actividad lítica robusta específica de antígeno, similar al nivel obtenido con infección vírica. Además de la actividad lítica, la mayoría de los linfocitos T CD8+ OT-I vírgenes activados por IL-15/IL-15Ra-Fc o infección con VSV-OVA producían niveles altos de IFNg, después de reestimulación in vitro con péptido. Este resultado contrastaba con la frecuencia insignificante de linfocitos OT-I que producen IFNg a partir de ratones de control (PBS) y tratados con IL-15. Por tanto, la inducción de la función efectora en linfocitos T CD8+ vírgenes por la coadministración de IL-15Ra-Fc con IL-15 equipara la activación obtenida por infección.

Ejemplo 6

El tratamiento de linfocitos T vírgenes con IL-15/IL-15Ra-Fc en complejo genera linfocitos T CD8+ de memoria El tratamiento con IL-15+IL-15Ra-Fc preacoplado genera linfocitos de memoria a partir de linfocitos T CD8+ vírgenes. En el día uno, ratones B6 recibieron aproximadamente 6 x 106 linfocitos OT-I-RAG-/- vírgenes marcados con CFSE y en el día 0 se trataron i.p. con PBS o IL-15 (aproximadamente 2,5 |jg) IL-15Ra-Fc (aproximadamente 15 |jg). Unos 44 días después, los esplenocitos se analizaron para el porcentaje de linfocitos T CD8+ OT-I donadores y la expresión en OT-I de CD44 y CD122.

Aunque los linfocitos T vírgenes se desarrollaban en células efectoras en respuesta a IL-15 transpresentada, quedaba por ver si este era un efecto transitorio o provocaba el desarrollo de linfocitos T de memoria. Por lo tanto, se analizó el número y fenotipo de linfocitos T OT-I 44 días después de la transferencia de linfocitos T OT-I vírgenes y el tratamiento con IL-15/IL-15Ra-Fc. En este punto temporal había un porcentaje ~5 veces mayor de linfocitos OT-I presentes después de la administración de IL-15/IL-15Ra en comparación con los ratones no tratados. Además, casi todas estas células expresaban niveles altos de CD44 y CD122. Por tanto, incluso en ausencia de antígeno, el tratamiento con IL-15/IL-15Ra-Fc podía inducir el desarrollo de linfocitos T CD8+ de memoria.

Los recientes hallazgos respaldan el uso de IL-15 como adyuvante para vacunación, inmunoterapia tumoral y reconstitución del sistema inmunitario en inmunodeficiencia. En el caso de tratamiento del cáncer, la inducción de linfopenia se está empelando actualmente para potenciar la actividad funcional de linfocitos transferidos de forma adoptiva. Esta modalidad se basa en el hallazgo de que los linfocitos T CD8+ que experimentan proliferación homeostática dirigida por linfopenia se diferencian en células efectoras con actividades líticas y productoras de citocinas. La diferenciación de linfocitos T CD8+ en células con fenotipo efector y de memoria también requiere la expresión de MHC de clase I. Por tanto, la proliferación y las actividades funcionales inducidas por el complejo de IL-15/IL-15Ra-Fc en hospedadores sanos imitaban la proliferación homeostática activada por linfopenia. Además, el nivel de proliferación obtenido por tratamiento con el complejo no podía conseguirse mediante dosis altas de IL-15 en solitario. Como la misma célula que produce IL-15 también puede transpresentar la citocina, la disponibilidad de IL-15Ra libre puede estar limitada. Además, la semivida corta de la IL-15 puede prolongarse cuando está en complejo con el receptor. Por lo tanto, el tratamiento con IL-15 en solitario es poco probable que consiga todo el potencial terapéutico de la citocina. La administración combinada de IL-15/IL-15Ra puede evadir estos problemas y proporcionar una eficacia mejorada.

El mecanismo de acción de I L-15/I L-15Ra en complejo fue de particular interés dado el actual paradigma con respecto a los requisitos para la supervivencia y proliferación homeostáticas de linfocitos T vírgenes y de memoria. En condiciones normales, la supervivencia de linfocitos T CD8+ vírgenes y también los de memoria requiere IL-7, mientras que IL-15 es esencial para la proliferación homeostática de linfocitos T CD8+ de memoria y linfocitos NK. En un entorno linfopénico, se requiere IL-7 para la proliferación homeostática de linfocitos T CD8+ y CD4+ vírgenes, y desempeña una función, junto con IL-15, en la mediación de la proliferación homeostática de linfocitos T de memoria CD8+. Por tanto, fue inesperado que los linfocitos T CD8+ vírgenes respondieran vigorosamente al complejo de I L-15/IL-15Ra. Debe apreciarse, sin embargo, que en ratones IL-15-/-, la combinación de linfocitos T CD8+ vírgenes se disminuye en aproximadamente un 50 %, lo que sugiere que el desarrollo y/o la supervivencia de linfocitos T CD8+ vírgenes requiere IL-15. En cualquier caso, la proliferación de linfocitos T CD8+ vírgenes dirigida por IL-15 unida a receptor/IL-15Ra fue independiente de IL-7 y requería la expresión de IL-15Ra. Este resultado indicó que los linfocitos T CD8+ vírgenes expresaban niveles suficientes de iL-15Ra para responder a IL-15/IL-15Ra, pero no a IL-15 soluble en solitario. Además, los linfocitos T CD8+ vírgenes adquirieron función efectora y posteriormente se desarrollaron en linfocitos T CD8+ de memoria de vida larga que expresaban niveles altos de CD44 y CD122. De forma interesante, la activación desencadenada por IL-15/IL-15Ra de linfocitos T CD8+ vírgenes o de memoria requería expresión de MHC de clase I. Aunque la supervivencia de los linfocitos T CD8+ vírgenes es dependiente de MHC, se cree que la supervivencia de los linfocitos T CD8 de memoria es independiente de MHC. Por tanto, un requisito de MHC de clase I en la proliferación de linfocitos de memoria inducida por IL-15 en complejo con el receptor fue algo inesperado, pero respalda una función para MHC en aspectos de función celular de memoria, como se ha demostrado previamente. Nuestros hallazgos ilustran la posible capacidad de IL-15 en dirigir la expansión vigorosa de linfocitos NK y T CD8+ y la diferenciación efectora en hospedadores sanos. Como con cualquier adyuvante, será necesario determinar si dicha activación también puede potenciar la autoinmunidad. No obstante, este sistema puede proporcionar el medio para fomentar la reconstitución inmunitaria en inmunodeficiencias o después de trasplante de médula ósea o células madre. Además, aunque la inmunoterapia adoptiva en el tratamiento del cáncer también puede potenciarse mediante la administración de IL-15/IL-15Ra, también es posible que el tratamiento con el complejo en solitario pudiera dirigir suficiente expansión de linfocitos T endógenos específicos de antígeno, así como linfocitos NK/NKT, para proporcionar algún nivel de protección. Se necesitan más estudios para determinar el potencial de este complejo novedoso en inmunoterapia.

Tabla 1. El tratamiento combinado con IL-15Ra/IL-15 es un tratamiento antitumoral eficaz.1"

f La dosis indicada de melanoma B16-F1 se administró por vía intravenosa, y uno y 10 días después los ratones se trataron por vía intraperitoneal, con PBS, 2,5 ug de IL-15 o 2,5 ug de IL-15 15 ug de sIL-15Ra-Fc. Unos 21 días después de la inoculación de tumor, se evaluó la carga tumoral.

Tamaño del tumor: (s) = de microscópico a 2 mm; (m) = 2-5 mm; (l) > 5 mm

*Muerto antes del análisis

£No realizado

*Incluye tumores en la cavidad corporal, incluyendo en riñón, páncreas, ganglios linfáticos y otros tejidos. § = son tumores observados; = 1 tumor pequeño; ++ = múltiples tumores de medianos a grandes; +++ = masas tumorales grandes. Métodos ejemplares

Ratones. Los ratones C57BL/6-Ly 5.1 se adquirieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los ratones C57BL/6-Ly 5.2 se adquirieron de Charles River. La línea de ratón OT-I la proporcionó generosamente el Dr. W. R. Heath (WEHI, Parkville, Australia) y el Dr. F. Carbone (Monash Medical School, Prahan, Victoria, Australia) y se mantuvo como una línea C57BL/6-Ly5.2 en un fondo RAG-/-.

Los ratones 22 IL-15Ra -/- los proporcionó generosamente el Dr. Averil Ma (UCSF). Los esplenocitos de ratones IL-2Rb-/- los proporcionó generosamente el Dr. Michael Farrar (UMINN). Los ratones transgénicos DTR fueron un obsequio del Dr. D. Littman (Skirball Institute, NY, NY). Los ratones se retrocruzaron 10 veces con C57BL/6 en las instalaciones de UCONN Health Center. Los ratones DTR Tg+ se cribaron por PCR de ADN de la cola como se describe previamente. Los ratones IL-7-/- se obtuvieron originalmente del DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology (Palo Alto, CA) y se mantuvieron en un fondo híbrido C57BL/6 x 129/Ola.

En un ejemplo de una proteína de fusión de IL-15+IL-15Ra-Fc de la invención, es la versión de ratón de la proteína de fusión. En este ejemplo, la construcción general incluye un péptido señal de IL-2 para expresión y procesamiento potenciados, el gen de IL-15 o parte del mismo, una región conectora variable para promover la libertar estérica y el plegamiento de la proteína (puede ser de cualquier longitud o secuencia deseada), la parte soluble o extracelular del gen de IL-15Ra, y la parte Fc de una IgG humana. Los genes o partes de los mismos de los homólogos humanos pueden sustituirse de una manera similar. Asimismo, los genes de IL-2 y IL-2Ra o partes de los mismos pueden sustituirse en una construcción quimérica, que también incluye combinaciones con genes de IL-15 o IL-15Ra o partes de los mismos. La proteína de fusión de IL-15+IL-15Ra provoca la proliferación de linfocitos T CD8+ y linfocitos NK. Los linfocitos marcados con CFSE se transfirieron a ratones normales que después se trataron con ~ 10 |jg de la proteína de fusión de IL-15+IL-15Ra. Cuatro días después, se aislaron los esplenocitos y se analizaron por citometría de flujo.

La carga de cáncer hepático se redujo por el complejo proteínico de IL-15+IL-15Ra en ratones. Aproximadamente 1 x 105 células de melanoma B6-F1 se inyectaron de forma intraesplénica (que dirige los tumores al hígado). En los días 1 y 7 días después, los ratones se trataron con PBS (control), 2,5 jg de IL-15 o 2,5 jg de complejo de IL-15+IL-15Ra. Catorce días después de la inoculación los tumores se contaron en el hígado y se pesaron los bazos.

La formación de complejos de IL-15 con IL-15Ra potencia enormemente la semivida y biodisponibilidad in vivo. Se administraron 2,5 jg de IL-15 humana en solitario o en precomplejo con IL-15Ra a ratones por inyección intraperitoneal. En los momentos indicados, se obtuvo suero y se ensayó por ELISA para la presencia de IL-15. La IL-15 total presente se calculó a partir de una curva de concentración patrón. La semivida se calculó a partir de la parte lineal de la curva de descenso en A.

Tratamiento con IL-15. La molécula recombinante de ratón quimérica IL-15Ra-Fc se adquirió de R&D Systems, Inc. (Mineápolis, MN). hIL-15 y rmIL-15Ra-Fc, ambas suspendidas en PBS, se mezclaron e incubaron durante aproximadamente 30 min a aproximadamente 37 °C. Cada ratón, salvo que se indicara específicamente, recibió i.p. 2,5 |jg de IL-15 y 15 jg de rmIL-15Ra-Fc en 200 ul de PBS.

Seres humanos. Una secuencia de ADN que codificaba el dominio extracelular de IL-15 humana Ra-E3, que carece del exón 3 (Anderson, D. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:29862 - 29869) se fusionó al Fc marcado con 6X histidina de IgG1 humana mediante un conector polipeptídico. La proteína quimérica se expresó en células Sf 21 usando un sistema de expresión de baculovirus. Masa molecular. La IL-15 Ra/Fc humana madura recombinante es una proteína homodimérica ligada por disulfuro. Basándose en la secuenciación N terminal, la proteína IL-15Ra humana recombinante tiene Ile 31 en el extremo amínico. El monómero de IL-15 Ra/Fc humano reducido tiene una masa molecular calculada de aproximadamente 42,6 kDa. Como resultado de la glucosilación, el monómero recombinante migra como una proteína de aproximadamente 60 - 70 kDa en SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Ratón. Una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de CD33 humano, unido con los residuos aminoacídicos 33 - 205 del dominio extracelular de IL-15 Ra de ratón (Giri, J.G. et al., 1995, EMBO. 14:3654 - 3663) se fusionó a la región Fc de IgG1 humana mediante un conector polipeptídico. La proteína quimérica se expresó en una línea celular de mieloma de ratón, NS0. Masa molecular.La IL-15 Ra-Fc de ratón madura recombinante es una proteína homodimérica ligada por disulfuro. Basándose en la secuenciación N terminal, la proteína IL-15 Ra-Fc de ratón recombinante tiene Gly 33 en el extremo amínico. El monómero de IL-15 Ra-Fc de ratón reducido tiene una masa molecular calculada de 44,9 kDa. Como resultado de la glucosilación, la proteína recombinante migra como una proteína de aproximadamente 80 - 90 kDa en SDS-PAGE en condiciones reductoras. Además de la IL-15 Ra-Fc de longitud completa, esta preparación también contiene una pequeña cantidad (10 %) de IL-15 Ra y Fc libres generados por escisión proteolítica. IL-15 Ra y Fc libres migran como proteínas de aproximadamente 42 kDa y 35 kDa, respectivamente, en SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Marcaje con CFSE de células y transferencia adoptiva. Los linfocitos se aislaron de bazo y/o ganglios linfáticos periféricos (como se describe en Aislamiento de poblaciones de linfocitos) y se resuspendieron en HBSS (aproximadamente un 1 % de HGPG) a 10 x 106 células/ml y después se calentaron hasta 37 °C. Las células se incubaron durante aproximadamente 10 min con CFSE (0,01 mM; Molecular Probes, Eugene, OR) y la reacción se interrumpió con HBSS con aproximadamente un 1 % de HGPG y aproximadamente un 5 % de FCS. Las células se lavaron dos veces con HBSS (aproximadamente un 1 % de HGPG). Las células marcadas con CFSE se resuspendieron (1-20 x 106 células) en PBS y se inyectaron i.v. en ratones congénicos. Las células se aislaron en los momentos indicados y se analizaron para la presencia de células donadoras usando el estado del alelo CD45 y su expresión de marcadores de superficie y la intensidad de CFSE.

Aislamiento de poblaciones de linfocitos y análisis de inmunofluorescencia. Se crearon suspensiones de células individuales en HBSS (con aproximadamente un 1 % de HGPG) homogeneizando bazos usando portaobjetos de vidrio esmerilado. Los glóbulos rojos se lisaron y los esplenocitos se filtraron a través de Nitex. En los puntos temporales indicados, los linfocitos se aislaron y las células marcadas con CFSE donadoras se detectaron usando el estado de su alelo de CD45 o las células donadoras específicas de OVA se detectaron usando un tetrámero H-2Kb que contenía el péptido SIINFEKL derivado de OVA producido como se describe previamente. Para la tinción, los linfocitos se suspendieron en PBS/aproximadamente un 0,2 % de BSA/aproximadamente un 0,1 % de NaN3 (tampón FACS) a una concentración de aproximadamente 3-15 x 106/200 jl. Cuando se teñían para el tetrámero, las células se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h con APC de tetrámero de OVA más la dilución apropiada de PerCp anti-CD8. Las células se lavaron con tampón FACS y se tiñeron con PE anti-CD44 a aproximadamente 4 °C durante aproximadamente 20 min, se lavaron y después se fijaron en PBS con aproximadamente un 3 % de paraformaldehído. Se midieron las intensidades relativas de fluorescencia con un FACScalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA).

Ensayo de citotoxicidad in vivo. Este ensayo se realizó esencialmente como se describe previamente. Esplenocitos normales se marcaron para niveles bajos (aproximadamente 0,25 um) o altos (aproximadamente 2,5 um) de CFSE y las células CFSEalto se incubaron con aproximadamente 1 jg/ml de péptido SIINFEKL durante aproximadamente 45 min a aproximadamente 37 °C. Se mezclaron números iguales (10 x 106) de cada población y se inyectaron i.v. en ratones con transferencia de OT-I que no se trataron o que se trataron con IL-15/IL-15Ra o se infectaron con 1 x 105 ufp de virus de la estomatitis vesicular que expresaba ovoalbúmina de pollo cuatro días antes. Cuatro horas después, los esplenocitos se analizaron para la presencia de poblaciones de CFSEalto y CFSEbajo. Porcentaje de lisis = [1-(relación sin sensibilidad/relación sensibilizadas)] x 100. Relación = porcentaje de CFSEbajo/porcentaje de CFSEalto.

Detección intracelular de IFN-g. Los linfocitos se aislaron del bazo y se cultivaron durante aproximadamente 5 h con aproximadamente 1 jg/m l de Golgistop (BD PharMingen), con o con aproximadamente 1 jg/m l del péptido SIINFEKL derivado de OVA. Después del cultivo, las células se tiñeron para las moléculas de superficie, después se fijaron y las membranas celulares se permeabilizaron en solución Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen) y se tiñeron con anti-IFN-gPE o IgG1 PE de rata de control. Las células entonces se lavaron y se midió la intensidad de la fluorescencia en un FACScalibur.

Quimeras de médula ósea. Se recogieron los fémures y las tibias de ratones CD11c-DTR Tg+ o crías de la misma camada no Tg. La médula ósea (BM - bone marrow) se lavó abundantemente con una jeringa y se pasó a través de una malla de nailon de 70 um para generar una suspensión de una sola célula. Los glóbulos rojos (RBC - Red blood cells) se lisaron y las células se resuspendieron en HBSS complementado con HEPES, L-glutamina, penicilina, estreptomicina, sulfato de gentamicina (HBSS-HGPG). Para retirar los linfocitos T maduros de la BM, las células se incubaron con líquido ascítico anti-Thy1 (T24), se lavaron una vez en HBSS-HGPG, después se incubaron con complemento de conejo Low-Tox-M (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canadá) durante aproximadamente 45 min, a aproximadamente 37 °C. Los ratones B6 destinatarios CD45.1 se irradiaron (aproximadamente 1000 rad) antes de que se les transfirieran i.v. aproximadamente 2­ 5 x 106 células de médula ósea. Se permitió que los ratones reposaran 8 semanas antes de usarlos. La toxina diftérica (Sigma, St Louis, MO) en PBS se administró i.p. a los ratones a aproximadamente 4 ng/g de peso corporal. Las quimeras recibieron DT un día antes del tratamiento con citocina, una dosis exactamente antes del tratamiento con citocina y una dosis final en el día tres después del tratamiento con citocina.

Referencias

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo polipeptídico terapéutico preacoplado para su uso en un método para modular la respuesta inmunitaria en un organismo, en el que el complejo comprende un polipéptido IL-15 y una forma soluble de un polipéptido receptor alfa de IL-15, y en el que dicho componente polipeptídico iL-15 y dicho componente polipeptídico receptor alfa de IL-15 se preacoplan antes de su uso.

2. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 1, en el que el polipéptido IL-15 tiene una estructura primaria de aminoácidos con al menos un 80 % de homología con la SEQ ID NO: 6.

3. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido IL-15 comprende además una secuencia del péptido señal en el extremo amino.

4. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido receptor alfa de IL-15 comprende un polipéptido con una estructura primaria de aminoácidos con al menos un 40 % de homología con la SEQ ID NO: 8.

5. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 4, en el que el componente receptor alfa de IL-15 comprende además una parte Fc de anticuerpo.

6. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 1, en el que el complejo preacoplado tiene una semivida in vivo de al menos una hora.

7. El complejo polipeptídico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el complejo es para uso en el tratamiento del cáncer en un ser humano.

8. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 7, en el que el cáncer es linfoma, leucemia, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de hígado, neoplasia, adenocarcinoma, cáncer de pulmón, cáncer de riñón o cáncer pancreático.

9. El complejo polipeptídico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el complejo es adecuado para la administración mediante vía intravenosa, vía oral, vía parenteral, vía subdérmica, vía intradérmica, vía transdérmica, vía subcutánea.

10. El complejo polipeptídico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el complejo se administra combinado con otro ingrediente activo.

11. El complejo polipeptídico para uso de la reivindicación 10, en el que el ingrediente activo es un AINE, inmunosupresor, antihistamínico, antioncogénico, antibiótico o sulfonamida.