ES2848862T3 - Agente quimioterapéutico/formulación para el cáncer, su fabricación y su uso - Google Patents

Abstract

Un agente quimioterapéutico para el cáncer que comprende bis(3-[4-({[3-({4-[(2- cianoetil)(metil)amino]benciliden}amino)propil]imino}metil)(metil)anilino]propanonitrilo), el compuesto de fórmula (II): **(Ver fórmula)** para su uso en el tratamiento del cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN

Agente quimioterapéutico/formulación para el cáncer, su fabricación y su uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un agente quimioterapéutico para el cáncer y, en particular, a un agente quimioterapéutico para el cáncer que será un agente supresor de quinasas y/o que interfiere en cualquier otra vía de señalización, y a formulaciones/composiciones farmacéuticas que lo contienen y a su proceso de fabricación. Según otro aspecto de la descripción, esta se dirige a un agente quimioterapéutico potencial para el cáncer que, además de la actividad anticáncer mencionada como un agente probado supresor de quinasas y/o que interfiere en cualquier otra vía de señalización, también puede presentar afinidad de unión potencial específica hacia la estructura de ADN G-cuádruplex intramolecular y/u otras secuencias potenciales formadoras de cuádruplex frente a estructuras de ADN dúplex, lo cual favorece diversos otros usos finales y aplicaciones, que incluyen, pero no se limitan a usos finales y aplicaciones antienvejecimiento, antiangiogénicos, antiproliferativos, antitumorales, antibióticos, antivíricos, antifúngicos y múltiples productos terapéuticos anticáncer. El avance también se dirige a avances en compuestos/agentes y la identificación de sus atributos beneficiosos/cantidades selectivas y formulaciones/composiciones farmacéuticas que los incluyen, que confirmen que poseen una actividad anticancerosa favorable, que incluye poseer valores de citotoxicidad favorables contra células que proliferan sin control mediante la inducción de la apoptosis con independencia del estado de p53 de la célula, sin que sean citotóxicos para las células normales.

Antecedentes de la técnica

En la técnica se sabe que la mayoría de los agentes quimioterapéuticos para el cáncer citotóxicos actúan de una manera relativamente indiscriminada. La eficacia de agentes, tales como ciclofosfamida, c/'s-platino y adriamicina, es consecuencia de una alquilación del ADN, de defectos en la reparación del ADN y de niveles elevados de ADN topoisomerasa II, respectivamente, en tipos de células de cáncer susceptibles. Sin embargo, estas características, aunque son muy significativas para el resultado clínico positivo que a veces se observa con estos agentes, requieren ser contrarrestadas, por tanto, por su alta toxicidad y generación de mecanismos de resistencia (Current Opinion in Chemical Biology, 2009, 13:345-353).

Las alteraciones de las vías de transducción de señales que conducen a la proliferación celular incontrolada, su supervivencia, invasión y metástasis son características del proceso carcinogénico. Se considera que las proteína quinasas son reguladores clave de estas vías de transducción de señales. Cada vez resulta más evidente que muchas de estas aberraciones convergen en unas pocas vías clave implicadas en la transducción de señales de células de cáncer, que incluyen la vía de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/AKT/diana de rapamicina en células de mamífero (mTOR) y la cascada activada por Raf/mitógenos y de quinasa quinasa regulada por señales extracelulares (MEK)/quinasa regulada por señales extracelulares (ERK). Ambas vías desempeñan papeles importantes en la fisiología celular normal; el proceso carcinogénico se aprovecha y usa estas mismas vías para transmitir señales de supervivencia constitutivamente activas al núcleo. La desregulación de la actividad quinasa ha surgido como un mecanismo importante mediante el cual las células de cáncer evaden las restricciones fisiológicas normales sobre el crecimiento y la supervivencia (Cancer Treatment Reviews, 39 (2013), 935-946).

Por tanto, a lo largo de la pasada década, el desarrollo de fármacos anticáncer ha sufrido cambios cruciales. Mientras que la quimioterapia convencional se dirige a células normales y células que se están dividiendo con rapidez, los agentes más recientes tienden a aprovechar las alteraciones específicas de tumor en el ADN o en las vías de transducción de señales.

Una de las estrategias podría ser dirigirse a secuencias de ADN específicas que pueden combinar una alta selectividad de diana con la perspectiva de desarrollar moléculas similares a fármacos pequeños. Esto supone dirigirse a motivos de la secuencia de ADN que se pliegan en estructuras de cuatro hebras denominadas G-cuádruplex. Un número cada vez mayor de pruebas sugiere la existencia de la conformación de G-cuádruplex para secuencias de ADN telomérico /n v/tro e /n v/vo.

Los telómeros son complejos de ADN-proteínas que son secuencias altamente repetitivas no codificadoras localizadas en la región terminal 3' de los cromosomas, que consisten en casi 200 nucleótidos constituidos por repeticiones en tándem de un hexanucleótido (TTAGGG)ⁿ y que terminan como una única hebra colgante que proporciona protección frente a la erosión de los genes durante las divisiones celulares, la unión de extremos no homólogos cromosómicos y los ataques por nucleasas. Los telómeros desempeñan un papel crucial para la vida, porque funcionan con proteínas asociadas a telómeros, se unen a la matriz nuclear y estructuras de cromatina de orden superior (Collado et al., 2007; Campbell, 2012). La conservación de la longitud telomérica es una condición biológica importante para el crecimiento celular (Engelhardt y Finke, 2001; Lange, 2009). El ADN telomérico en vertebrados consiste en repeticiones en tándem de una secuencia de hexanucleótido, d(TTAGGG). La secuencia monocatenaria rica en G que se encuentra en el extremo 3' del ADN telomérico puede adoptar estructuras terciarias variables, que incluyen G-cuádruplex. Después de cada división celular, la secuencia del telómero se acorta, y esto conduce a la detención de la división celular (senescencia) y, en último término, se produce la muerte celular controlada (apoptosis). La telomerasa es la enzima que funcionaliza la adición de las repeticiones del hexanucleótido TTAGGG al extremo 3' del telómero y su mantenimiento durante la división celular normal (mitosis). Una sobreexpresión poco habitual de la enzima telomerasa provoca una extensión masiva de los extremos teloméricos y provoca una proliferación celular anómala que provoca cáncer. Además, también se ha demostrado que en 85 % de las células de cáncer, la telomerasa está sobreexpresada, lo cual evita el acortamiento natural del telómero y conduce a la proliferación celular.

Por tanto, también se sabe que los telómeros y la telomerasa son dianas terapéuticas atractivas en el cáncer, porque se ha descubierto que la telomerasa se expresa en 80-85 % de las células de cáncer y tumores primarios, pero no en células somáticas normales.

Los telómeros son la localización principal que forma estas estructuras secundarias funcionales cruciales de ADN, formadas por la región del extremo 3' de los cromosomas que consiste en casi 200 nucleótidos que constituyen repeticiones en tándem de un hexanucleótido (TTAGGG)ⁿ, y terminan como una única hebra colgante. Las unidades de ADN repetitivas ricas en G colgantes en el extremo 3' de los telómeros pueden formar diversas estructuras terciarias, que incluyen G-cuádruplex, en la que las bases de guanina se apilan unas sobre otras y son estabilizadas por un enlace de hidrógeno de tipo Hoogesteen cíclico (Dai y Carver, 2007; Luu et al., 2008; Burge et al., 2006; Dai y Punchihewa, 2007). El hecho más prometedor de la estructura de G-cuádruplex es su topología, que no puede ser reconocida por el componente de ARN monocatenario de la enzima telomerasa. Al contrario, puede ser reconocida en sí misma como una señal de daños en el ADN y, por tanto, puede invocar la apoptosis (Rodríguez et al., 2008). La inhibición de la acción de la telomerasa es una manera eficaz de reprogramar a las células de cáncer para una muerte celular natural, y una destacada estrategia emergente para la inhibición de la telomerasa es la estabilización de las estructuras de G-cuádruplex del ADN telomérico, evitando de esto modo su disponibilidad como cebador para el alargamiento asistido por la telomerasa, por lo cual la actividad telomerasa quedará infrarregulada para que se produzca la apoptosis en células cancerosas.

La cuarfloxina (o cuarfloxacina) es conocida como un derivado de fluoroquinolona con actividad antineoplásica. La cuarfloxina altera la interacción entre la proteína nucleolina y una estructura de ADN G-cuádruplex en el molde de ADN ribosómico (ADNr), una interacción crucial para la biogénesis del ARNr que está sobreexpresado en células de cáncer; la alteración de esta interacción de proteína:ADN G-cuádruplex en la biogénesis aberrante de ARNr puede dar como resultado la inhibición de la síntesis de ribosomas y la apoptosis de las células tumorales.

Solo unos pocos de los compuestos previamente investigados en la técnica han demostrado una inhibición específica de la telomerasa usando concentraciones nanomolares, que se refleja en sus valores de CI⁵⁰ y, por tanto, sigue siendo necesario en la técnica la exploración para descubrir moléculas selectivas que tendrían una alta selectividad de unión a estructuras de G-cuádruplex intramoleculares del telómero frente a una estructura de ADN dúplex u otras secuencias formadoras de cuádruplex potenciales en el genoma, que estabilizarían, de modo eficaz, dichas estructuras de G-cuádruplex del telómero en concentraciones eficaces mínimas, siendo estas concentraciones o dosis las que matarían a más del 50 % de las células cancerosas, pero sin ser citotóxicas para las células normales.

De forma interesante, existe un cuerpo creciente de trabajos que han explorado una hipótesis que relaciona la existencia de secuencias formadoras de G-cuádruplex en promotores de oncogenes, incluyendo los de las quinasas. Por tanto, el descubrimiento de estabilizadores de cuádruplex que se unen a regiones de promotores de oncogenes, inhibiendo con ello su transcripción, es bastante importante para los productos terapéuticos para el cáncer (Current Opinion in Chemical Biology, 2009, 13:345-353).

Además, también se sabe en la técnica que en más del 50 % de los cánceres, p53 (proteína supresora de tumor) está mutada, y se ha descubierto que muchos fármacos quimioterapéuticos existentes no son eficaces en cánceres con p53 mutado y, por tanto, en la actualidad también constituye un desafío importante desarrollar agentes anticáncer que puedan matar a las células de cáncer con p53 no funcional.

Objetos de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. El objeto básico de la presente descripción consiste en proporcionar un agente quimioterapéutico para el cáncer y, en particular, un agente supresor de quinasas y/o que interfiere en cualquier otra vía de señalización, para matar las células de cáncer, y formulaciones/composiciones farmacéuticas que lo contienen y su proceso de fabricación.

Otro objeto de la presente descripción se dirige a identificar un agente quimioterapéutico para el cáncer y sus niveles selectivos que poseen valores de citotoxicidad favorables contra células que proliferan sin control mediante la inducción de la apoptosis con independencia del estado de p53 de la célula, sin que sean citotóxicos para las células normales.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un agente quimioterapéutico para el cáncer e identificar sus concentraciones mínimas eficaces, siendo esta concentración o dosis la que mataría a más del 50 % de las células cancerosas, pero sin ser citotóxica para las células normales.

Según otro objeto de la presente descripción, las concentraciones mínimas eficaces del agente quimioterapéutico son las concentraciones o dosis que matarían a más del 50 % de las células cancerosas, pero sin ser citotóxicas para las células normales.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar una composición farmacéutica que comprende un agente quimioterapéutico para el cáncer, como ingrediente activo, con un excipiente farmacéuticamente aceptable que puede inducir la apoptosis para evitar, de modo favorable, la proliferación incontrolada de células, sin que sea citotóxica para las células normales.

Otro objeto de la presente descripción se dirige a un agente quimioterapéutico para el cáncer/formulaciones que lo contienen que tienen una alta afinidad de unión a la estructura de ADN G-cuádruplex intramolecular y/u otras secuencias potenciales formadoras de cuádruplex frente a estructuras de ADN dúplex.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un agente quimioterapéutico para el cáncer/formulaciones que lo contienen que se unen selectivamente a una estructura de ADN G-cuádruplex intramolecular que está presente a la región telomérica del cromosoma, la región de promotor de oncogenes, pero no se limita estas localizaciones.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un agente quimioterapéutico para el cáncer/formulaciones que lo contienen que tienen una alta afinidad de unión a dichas estructuras de G-cuádruplex intramoleculares con independencia del estado de p53 (proteína supresora de tumor) de la célula.

Otro objeto de la presente descripción se dirige a un agente quimioterapéutico para el cáncer/formulaciones que lo contienen y, en particular, a agentes supresores de quinasas y/o que interfieren en cualquier otra vía de señalización, con o sin una potencial afinidad de unión específica muy selectiva a la estructura de ADN G-cuádruplex intramolecular y/u otras secuencias potenciales formadoras de cuádruplex frente a estructuras de ADN dúplex, lo cual favorece diversos usos finales y aplicaciones, que incluyen, pero no se limitan a usos finales y aplicaciones antienvejecimiento, antiangiogénicos, antiproliferativos, antitumorales, antibióticos, antivíricos, antifúngicos y múltiples productos terapéuticos anticáncer.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un agente quimioterapéutico para el cáncer y formulaciones que lo contienen para inducir la apoptosis, que tienen diversos usos finales y aplicaciones, preferiblemente como usos finales y aplicaciones antienvejecimiento, antiangiogénicos, antiproliferativos, antitumorales, antibióticos, antivíricos, antifúngicos y múltiples productos terapéuticos anticáncer.

Otro objetivo de la presente descripción consiste en proporcionar un método de tratamiento para el cáncer que puede llevarse a cabo sin ser citotóxico para las células normales con independencia del estado de p53 (proteína supresora de tumor) de la célula, que implica el agente quimioterapéutico para el cáncer para inducir la apoptosis en diversos tratamientos, que incluyen tratamientos del envejecimiento, angiogénesis, proliferación, tumores, bacterianos, víricos, fúngicos y para múltiples terapias del cáncer.

Otro objeto de la presente descripción se dirige al uso de un agente quimioterapéutico para el cáncer para inducir la apoptosis para múltiples terapias para al cáncer.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar el uso de un agente quimioterapéutico para el cáncer para la fabricación de un fármaco para inducir la apoptosis evitando, de modo favorable, la proliferación incontrolada de células, sin que sea citotóxico para las células normales con independencia del estado de p53 (proteína supresora de tumor) de la célula.

Según la presente invención, se proporciona un agente quimioterapéutico para el cáncer que comprende bis(3-[4-({[3-({4-[(2-cianoetil)(metil)amino]benciliden}amino)propil]imino}metil)(metil)anilino]propanonitrilo), el compuesto de fórmula II (M2):

para su uso en el tratamiento del cáncer.

El agente quimioterapéutico para el cáncer según la invención se administra preferiblemente en una cantidad de 15­ 40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg de peso corporal.

La invención proporciona además un proceso para la preparación de un agente quimioterapéutico para el cáncer que tiene la fórmula general II en forma hidrosoluble, según la reivindicación 3 de la presente.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona una formulación/composición farmacéutica, en la que dicho agente quimioterapéutico para el cáncer comprende el compuesto de fórmula II, que tiene la estructura representada a continuación como fórmula II:

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona una formulación/composición farmacéutica, según se reivindica, en formas seleccionadas de una formulación sólida en forma de comprimidos, suspensiones, jarabes, dispersiones. inyectables.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona un método para la fabricación de una formulación/composición farmacéutica, que comprende:

proporcionar selectivamente cantidades quimioterapéuticas para el cáncer de 15-40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg para una actividad quimioterapéutica para el cáncer.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona un método para inducir la apoptosis para prevenir, de modo favorable, la proliferación incontrolada de células, que comprende administrar dichas cantidades quimioterapéuticas para el cáncer selectivas de 15-40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg de dicho compuesto de fórmula I o fórmula II.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona el uso de un agente quimioterapéutico para el cáncer de fórmula general (I) o fórmula II en las cantidades quimioterapéuticas para el cáncer eficaces de 15-40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg para llevar a cabo selectivamente uno cualquiera o más de estabilizar estructuras de G-cuádruplex en células de cáncer infrarregulando la telomerasa, actividades oncogénicas o suprimiendo la expresión de quinasas.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona el uso de un agente quimioterapéutico para el cáncer de fórmula general (I) o fórmula II en las cantidades eficaces de 15-40 pM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg para la fabricación de un fármaco para inducir la apoptosis evitando, de modo favorable, la proliferación incontrolada de células de cáner, sin que sea citotóxico para las células normales con independencia del estado de p53 (proteína supresora de tumor) de la célula.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona la forma quimioterapéutica para el cáncer de un compuesto de fórmula I o fórmula II, o sus derivados, para diversos tratamientos, que incluyen tratamientos del envejecimiento, angiogénesis, proliferación, tumorales, bacterianos, víricos, fúngicos y para múltiples terapias del cáncer, que incluyen cáncer de pulmón, mama, hígado, gástrico, sarcoma, cáncer cervical, etc., que comprenden p53 de tipo salvaje y mutado, en la que la dosificación del compuesto es la más eficaz a una concentración entre 10­ 25 pM en el fluido o tejido o alrededor de estos.

Según otro aspecto preferido de la presente invención, se proporciona el método que comprende, además, un tratamiento con una dosis intraperitoneal de entre 15 pM (0,4974 mg/kg) y 40 pM (1,3264 mg/kg)

Los detalles de la invención, sus objetos y ventajas se explican a continuación con más detalle en los siguientes ejemplos de ilustraciones, que incluyen las siguientes figuras adjuntas:

Breve descripción de las figuras adjuntas

La figura 1 ilustra el efecto de M2 sobre A) el recuento de células tumorales, B) el peso del tumor, C) el porcentaje de inhibición en el recuento celular, y D) el porcentaje de inhibición en el peso del tumor. (A) Se recolectaron células procedentes del tejido tumoral y se preparó una suspensión de una sola célula. El recuento celular se determinó mediante el método de exclusión de azul de tripano. B) Los tumores se extirparon 4 semanas después de una inyección subcutánea de células de sarcoma-180 y se pesaron. Los datos representados en los diagramas de barras son el promedio ± DE de tres experimentos independientes.

La figura 3 ilustra la detección mediante citometría de flujo del efecto de M2 sobre la distribución de las fases del ciclo de células S-180. Las células S-180 procedentes de ratones no tratados y tratados que portan tumores se fijaron, y el ADN nuclear se marcó con PI. Se determinó la distribución de las fases del ciclo celular del ADN nuclear de S-180 mediante citometría de flujo de un solo marcador. Se muestra la presentación del histograma de contenido en ADN (eje de abscisas, fluorescencia de PI) frente a los recuentos (eje de ordenadas). El análisis del ciclo de las células tumorales revela que el tratamiento con M2 reduce la fase proliferativa y aumenta el porcentaje de hipoploidía, comparado con los grupos no tratados.

La figura 4 ilustra el efecto de M2 sobre la inducción de la apoptosis en células tumorales, según se determina mediante electroforesis alcalina en gel de una sola célula (ensayo de cometas). A) Las gráficas de barras representan el porcentaje de células cometa por campo del portaobjetos estudiado en diferentes grupos experimentales.

La figura 5 ilustra el efecto de M2 sobre los marcadores bioquímicos en suero de la toxicidad. A) Nivel de fosfatasa alcalina (AP), B) niveles de alanina aminotransferasa (ALT), C) niveles de aspartato aminotransferasa (AST), y D) niveles de creatinina.

La figura 6 ilustra el efecto de M2 sobre el estrés oxidativo hepático. Se determinó cuantitativamente el grado de LPO en homogeneizados de hígado mediante una reacción con ácido tiobarbitúrico a 532 nm usando un espectrofotómetro y se expresa como nM MDA/mg de proteína.

La figura 7 ilustra el efecto de M2 sobre las enzimas antioxidantes hepáticas. A) La actividad SOD se midió basándose en la inhibición de la autooxidación de pirogalol y se expresa como unidad/mg de proteína. B) Se evaluó la actividad CAT midiendo la descomposición de H2O2 de modo espectrofotométrico a 240 nm. C) Se midió la actividad GST hepática determinando el aumento en la absorbancia a 340 nm con 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) como sustrato. Los datos representados en los diagramas de barras son el promedio ± DE de tres experimentos independientes.

La figura 8 ilustra el efecto de M2 sobre el recuento de células de médula ósea. Se preparó una suspensión de una sola célula de médula ósea con aspiración repetida del fémur (1 cm) extirpado de ratones de todos los grupos experimentales, y se determinó el recuento celular mediante el método de exclusión de azul de tripano. Los datos representados en los diagramas de barras son el promedio ± DE de tres experimentos independientes.

La figura 9 ilustra el efecto de M2 sobre la distribución de las fases del ciclo de células de la médula ósea. Las células de médula ósea procedentes de ratones se fijaron, y el ADN nuclear se marcó con PI. Se determinó la distribución de las fases del ciclo celular del ADN nuclear de la médula ósea mediante citometría de flujo de un solo marcador. Se muestra la presentación del histograma de contenido en ADN (eje de abscisas, fluorescencia de PI) frente a los recuentos (eje de ordenadas).

La figura 10 ilustra el efecto de M2 sobre la expresión de proteínas. A) Lisados de células de tejido hepático se sometieron a un análisis de la transferencia Western con anticuerpo anti-Nrf 2 en todos los grupos experimentales. B) Lisados de células procedentes de médula ósea se sometieron a análisis de la transferencia Western para estudiar la expresión de PCNA en todos los grupos experimentales. Se confirmó una carga equivalente de proteínas en los carriles mediante GAPDH.

La figura 11 ilustra el efecto de M2 sobre marcadores de la proliferación tumoral en tejidos y quinasas. Lisados de células procedentes de tejido tumoral se sometieron a análisis de la transferencia Western para estudiar la expresión de A) PCNA, y B) ERK de los grupos experimentales mencionados.

La figura 12 ilustra el efecto antitumoral de M2 frente a un modelo de tumor EAC. El tratamiento con M2 fue capaz de reducir significativamente el volumen tumoral. B) Los ratones se sacrificaron y se midió el fluido peritoneal en un cilindro calibrado 4 semanas después de la inyección intraperitoneal de células EAC. C) Recuento de células tumorales. Se recolectaron células procedentes de fluido peritoneal y se preparó una suspensión de una sola célula. El recuento celular se determinó mediante el método de exclusión de azul de tripano. Los datos representados en los diagramas de barras son el promedio ± DE de tres experimentos independientes.

La figura 13 ilustra el efecto de M2 sobre el recuento de células de médula ósea en ratones que portan tumores EAC. Se preparó una suspensión de una sola célula de médula ósea con aspiración repetida del fémur (1 cm) extirpado de ratones de todos los grupos experimentales, y se determinó el recuento celular mediante el método de exclusión de azul de tripano. Los datos representados en los diagramas de barras son el promedio ± DE de tres experimentos independientes.

La figura 15 ilustra una representación esquemática del ligando M2, que se une a G-cuádruplex, TAGGG(TTAGGG)³(2LD8.pdb); Scl, Sc2 estabiliza el esqueleto de fosfato; Arol, Aro2 estabiliza la cara G rica en guanina con apilamiento; L (conector), estabiliza la cara G rica en guanina con enlaces de hidrógeno.

La figura 17 ilustra los espectros de emisión de fluorescencia de G-cuádruplex (representado como GQ) en presencia de M2 (gráfica A). Determinación de la afinidad de unión a G-cuádruplex de M2 (gráfica B), después de cambios en la emisión máxima (Amax) de G-cuádruplex en el contexto de las concentraciones de ligandos. Espectros de emisión de fluorescencia de ADN dúplex rico en GC (representado como DD) en presencia de M2 (gráfica C).

Descripción detallada de la invención

Tal como se analizó anteriormente en la presente, la presente invención, en una realización, proporciona, en cantidades eficaces de 15-40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg de peso corporal, un agente quimioterapéutico para el cáncer/supresor de quinasas y/o que interfiere en cualquier otra vía de señalización (I) que matará las células de cáncer con independencia del estado de p53 celular y que induce la apoptosis para prevenir la proliferación incontrolada de células cancerosas, pero sin ser citotóxico para las células normales, lo cual indica sus diversos usos finales y aplicaciones en usos finales y aplicaciones antienvejecimiento, antiangiogénicos, antiproliferativos, antitumorales, antibióticos, antivíricos, antifúngicos y múltiples productos terapéuticos anticáncer.

En otra realización, la presente invención proporciona una forma soluble de un agente quimioterapéutico para el cáncer (I), en la que la molécula de fórmula general (I) está con al menos un nitrógeno catióni

proliferación incontrolada de células cancerosas, sin que sea citotóxica para las células normales.

La forma hidrosoluble de M2 se obtiene disminuyendo el pH y la protonación con la ayuda de ácidos, y después ajustando el pH con bicarbonato de sodio o potasio hasta 7,0. La disminución del pH y la protonación pueden realizarse usando ácidos seleccionados de HCl, H²SO⁴ , HNO³ , etc.

Se ha descubierto que dichos agentes terapéuticos para el cáncer hidrosolubles/formulaciones que comprenden M2 de la presente invención mencionados anteriormente y los marcos moleculares derivados de dichas moléculas poseen dicha actividad terapéutica para el cáncer a concentraciones mínimas eficaces, siendo estas concentraciones o dosis las que matarían, con eficacia, a más del 50 % de las células cancerosas, y también son, de modo ventajoso, no citotóxicas para las células normales, en la que dicha unión fuerte selectiva es independiente del estado de p53 (proteína supresora de tumor) de la célula.

En otra realización preferida de la presente invención, dicho agente quimioterapéutico para el cáncer hidrosoluble/supresor de quinasas/formulaciones que lo contienen también poseen unos valores de citotoxicidad favorables con independencia del estado de p53 de la célula, ajustados para evitar, de modo favorable, la proliferación incontrolada de células. Se sabe que, en más del 50 % de los cánceres, p53 está mutado, y se ha descubierto que muchos fármacos quimioterapéuticos existentes no son eficaces en cánceres con p53 mutado. Por tanto, constituye un gran desafío desarrollar agentes anticáncer que puedan matar células de cáncer con p53 no funcional. Como resulta evidente a partir de los ejemplos, este nuevo compuesto M2, en el intervalo de 15-40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg de peso corporal, y la forma hidrosoluble de M2, la forma II, tienen un gran potencial como agente anticáncer cuya citotoxicidad no depende del estado de p53 de la célula.

El avance se ilustra a continuación con más detalle con relación a los siguientes ejemplos de ilustraciones:

El efecto antiproliferativo de M2 hidrosoluble, que puede extenderse como actividad antitumoral, también se estudia in vitro e in vivo siguiendo los procedimientos mencionados a continuación:

Ejemplo I: Protonación de M2 para convertirlo en soluble

M2 no es soluble en agua a pH 7,0 en su forma normal. Cuando se protona usando HCl 0,1 M se solubiliza. Después de esto, el pH se ajusta mediante la adición de bicarbonato de sodio o potasio para mantener la forma soluble de M2 a pH 7,0. La protonación es muy importante para generar M2 protonado (forma II), que es una nueva especie que es soluble en agua y que se usa para otros estudios experimentales.

Todos los siguientes ejemplos citados a continuación se realizaron con la forma hidrosoluble de M2.

Ejemplo II: Estudio in vitro

(A) Estudios de citotoxicidad de M2 frente a células mononucleares de sangre periférica ("human peripheral blood mononuclear cells", PBMC) humanas.

Se ensayó la toxicidad de M2 frente a PBMC humanas. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre humana normal y se mantuvieron en RPMI suplementado con FBS al 10 %, estreptomicina 100 pg/ml y penicilina 50 unidades/ml, a 37 °C en un incubador humidificado que contenía 5 % de CO². Para los experimentos, se cultivó en placa el número requerido de células (10⁶) con suero al 2 % y después se realizaron los experimentos, en los que una serie de concentraciones de M2 se administraron a PBMC humanas y se evaluó la viabilidad celular después de 12 horas. Las dosis que se ensayaron variaron entre 0,5433x10^{' 7} pM a 35 pM. De estas, se descubrió que la concentración de 35 pM (que fue la dosis más alta usada) era tóxica, puesto que aproximadamente 25 % de PBMC no sobrevivieron a este tratamiento.

Durante la siguiente fase, algunas dosis del conjunto de experimentos previos se seleccionaron y de nuevo se realizó un ensayo de citotoxicidad con estas dosis seleccionadas frente a PBMC humanas. Esta vez, se seleccionó una concentración que variaba entre 0,1 y 30 pM. De nuevo, se descubrió que las dosis de 0,1 a 25 pM tenían un efecto despreciable sobre la viabilidad de PBMC humanas. Sin embargo, se descubrió que la dosis más alta (30 pM) ejercía un efecto citotóxico sobre las PBMC humanas (tabla 1). Aparte del ensayo de viabilidad celular, también se ensayó la genotoxicidad de las diferentes concentraciones de compuesto frente a PBMC humanas mediante un ensayo de electroforesis alcalina en gel de una sola célula. Según los datos de citotoxicidad, no hubo formación significativa de cometas con ninguna de las dosis, excepto la dosis de 30 pM. Se tabuló la capacidad de supervivencia de las células a concentraciones variables del compuesto como el promedio ± desviación estándar de cinco experimentos independientes.

Tabla 1

(B) Estudios de citotoxicidad de M2 frente a líneas de células de cáncer con p53 de tipo salvaje y mutado

Líneas de células de cáncer con expresión de p53 funcional o alterada se mantuvieron en medio de cultivo recomendado por ATCC suplementado con FBS al 10 %, estreptomicina 100 pg/ml y penicilina 50 unidades/ml, a 37 °C en un incubador humidificado que contenía 5 % de CO². Para los experimentos se cultivaron en placa células (10⁶) con suero al 2 % y después se realizaron los experimentos requeridos. Basándose en el anterior estudio, se seleccionaron tres dosis (15, 20, 25 pM) y se ensayaron los efectos del compuesto frente a líneas celulares de cáncer de pulmón, hígado y mama que presentan p53 de tipo salvaje. Simultáneamente, también se investigó el efecto del compuesto en una línea de células de cáncer de mama con p53 mutado y en una línea de células de cáncer cervical con la vía de p53 alterada. En la siguiente tabla 2 se representan los porcentajes de muerte celular.

Tabla 2

A partir de la anterior tabla (tabla 2), es evidente que el compuesto mostró un aumento dependiente de la dosis en la citotoxicidad en las 5 líneas de células de cáncer ensayadas. De modo interesante, la mayor mortalidad en cada una de las tres concentraciones se observó en la línea de células de cáncer de mama con p53 mutado, mostrando la dosis más alta 60 % de muerte celular. Sin embargo, la citotoxicidad en la línea de células de cáncer cervical con una función alterada de p53 fue comparable a la de las líneas de células de p53 de tipo salvaje. A partir de estos datos de citotoxicidad en una serie de líneas de células de cáncer, puede establecerse la hipótesis de que, a diferencia de muchos fármacos quimioterapéuticos, este compuesto puede ejercer su efecto citotóxico sobre células de cáncer con independencia del estado de p53 de la célula. Otro punto de interés en los anteriores datos de citotoxicidad es que, entre las dos líneas de células de cáncer de mama, se descubrió que la mortalidad era mayor en las células con p53 mutado que en las que presentan p53 de tipo salvaje.

(C) Análisis del ciclo celular de una línea de células de cáncer de mama con p53 mutado tratada con M2

Se realizaron análisis del ciclo celular con la línea de células de cáncer de mama con p53 mutado para explorar más a fondo el mecanismo probable. La línea de células de cáncer MDA MB 231 (p53 mutado) se mantuvo en medio de cultivo recomendado por ATCC suplementado con FBS al 10 %, estreptomicina 100 pg/ml y penicilina 50 unidades/ml, a 37 °C en un incubador humidificado que contenía 5 % de CO². Para los experimentos, se cultivaron en placa células (10⁶) con suero al 2 % y después se realizaron los experimentos requeridos. Las células se recolectaron después de una exposición durante 12 horas con el compuesto a concentraciones variables y se determinó la distribución de las fases del ciclo celular del ADN nuclear mediante citometría de flujo usando yoduro de propidio ("propidium iodide", PI) como fluorocromo de unión al ADN.

Los resultados (véase la siguiente tabla) muestran un aumento dependiente de la dosis en el pico sub-G0 con las dosis del tratamiento que indican la muerte celular. Así, es evidente que el compuesto es capaz de inducir la apoptosis incluso en ausencia de p53. Sin embargo, se descubrió que el porcentaje de células en la fase S-G2-M, que es la fase proliferativa, era la más baja a la dosis de 15 pM (tabla 3). Los análisis de las células en la fase sub G0 y S/G2/M se ofrecen como promedio ± desviación estándar de cinco experimentos independientes.

Tabla 3

(D) Estudio de citotoxicidad de M2 frente a células de sarcoma 160.

Antes de empezar los experimentos in vivo con el modelo de tumor sólido trasplantable de sarcoma 180, se ensayó la eficacia del fármaco frente a las mismas células tumorales in vitro. Los datos se listan en la tabla 4.

Tabla 4

A partir del anterior estudio in vitro es evidente que M2, en su forma soluble, muestra una propiedad anticáncer dentro del intervalo de 15 |uM -25 |uM sin ser citotóxico para las células normales. Se descubrió que 30 |uM ejerce un efecto citotóxico sobre PBMC humanas. Por tanto, para estudiar el efecto in vivo, se seleccionó el intervalo de 15 |uM a 40 |uM. Se seleccionó 15 |uM como extremo inferior, puesto que, por debajo de este límite, la actividad anticáncer no es muy significativa, mientras que se seleccionó 40 |uM como extremo superior para comprobar su actividad anticáncer junto con la actividad citotóxica contra células normales.

Para la actividad anticáncer in vivo, se indican a continuación los parámetros que se van a estudiar y las técnicas que se van a usar:

Ensayo de viabilidad celular

Se ensayó la citotoxicidad de M2 hidrosoluble a diferentes dosis sobre la proliferación de células tumorales mediante el método de exclusión de azul de tripano. Las células se recolectaron a partir de tejido de sarcoma y se preparó una suspensión de una sola célula. Las células que podían excluir el tinte de azul de tripano se contaron en un hemocitómetro como células viables.

Medición del peso y volumen tumoral

Se evaluó la actividad antitumoral midiendo el cambio en el volumen del tumor y el peso del tumor. En todos los grupos experimentales se evaluaron los cambios en el tamaño del tumor a lo largo del tiempo después de un trasplante de tumor. Se midió la longitud y la anchura del tumor usando calibradores digitales. El volumen del tumor se calculó mediante la siguiente fórmula:

Volumen del tumor (mm3): 0,5 x a x b2, en la que a es el diámetro mayor, y b el perpendicular.

Disección y recolección de tejido

Todos los ratones recibieron eutanasia después de la última dosis del tratamiento de M2 en el 21er día. Se recogieron tejidos del hígado y del tumor de los animales de todos los grupos experimentales, se lavaron en disolución salina al 0,9 %, se remojaron en papel de filtro y se procesaron para los estudios celulares, bioquímicos, histológicos e inmunohistoquímicos. Los fémures también se retiraron de forma aséptica; la médula ósea se enjuagó con una aguja de calibre 26 y se suspendió en RPMI para el recuento celular y el análisis del ciclo celular.

Recuento de células del tumor y de la médula ósea

Se recolectaron células procedentes del tejido tumoral y se preparó una suspensión de una sola célula en RPMI suplementado con EDTA y colagenasa. Se preparó una suspensión de una sola célula de médula ósea con aspiración repetida. Las células se resuspendieron en RPMI-1640. Las células del tumor y de la médula ósea viables se contaron en un hemocitómetro mediante el método de exclusión de azul de tripano.

Análisis de la distribución del ciclo de células del tumor y de la médula ósea

Para la determinación de la distribución de las fases del ciclo celular del ADN nuclear, se recolectaron células de la médula ósea y de tejido tumoral (1x106 células) de ratones tratados y no tratados que portan tumores. Después de preparar una suspensión de una sola célula, las células se fijaron con p-formaldehído al 3 %, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 %, y el ADN nuclear se marcó con yoduro de propidio (PI, 125 pg/ml) después de un tratamiento con ARNasa usando el kit de reactivo Cycle TEST PLUS DNA. Se determinó la distribución de las fases del ciclo celular del ADN nuclear en un FACS Calibur usando Cell Quest Software (Becton-Dickinson). Se muestra la presentación del histograma de contenido en ADN (eje de abscisas, fluorescencia de PI) frente a los recuentos (eje de ordenadas). Se empleó el estadístico Cell Quest para cuantificar los datos en diferentes fases del ciclo celular. Detección de la apoptosis

Se realizó una electroforesis en gel de una sola célula (ensayo de cometas) en células de sarcoma para estudiar la inducción de la apoptosis por M2. El ensayo de cometas es un método sensible, fiable y rápido para la evaluación de daños en el ADN. El ADN segmentado emigra desde el núcleo hacia el ánodo bajo una corriente eléctrica para producir cometas. Se mezclaron aproximadamente 400 pl de la suspensión de células con 800 pl de agarosa de punto de fusión bajo al 1 %. Después se dispusieron 100 pl de la mezcla en una capa sobre portaobjetos prerrevestidos con agarosa de punto de fusión normal al 1 % y después se cubrieron con un cubreobjetos. Los portaobjetos después se colocaron en una nevera durante 5 min. Después, los cubreobjetos se retiraron cuidadosamente y se dejaron los portaobjetos en un lugar oscuro, excepto para los portaobjetos de control positivo. Los portaobjetos de control positivo se trataron con una disolución de H2O2200 pM durante 17 min a 4 °C, mientras que los portaobjetos de control negativo se dejaron sin tratar. Después todos los portaobjetos se sumergieron en una disolución de lisis fría (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, NaOH 0,2 M, Tris 10 mM, Triton X-100 al 1 %, pH = 10), se protegieron de la luz y se refrigeraron a 4 °C durante 45 min. Después los portaobjetos se dejaron en una disolución de electroforesis recién preparada (NaOH 0,3 M, EDTA 1 mM, pH>13) durante 40 min. Se realizó la electroforesis usando la misma disolución a 300 mA, 25 V durante 45 min. Después de la electroforesis, los portaobjetos se neutralizaron suavemente con tampón Tris 0,4 M a pH 7,5 durante 10 min y se tiñeron con bromuro de etidio 20 pg/ml durante 7 min. Los portaobjetos se lavaron y después se secaron. Se usaron dos portaobjetos para cada muestra y se tomaron fotografías de al menos 100 células (50 células para cada portaobjeto) usando un microscopio de fluorescencia a un aumento de 400. Las células sin daños en el ADN conservaron un aspecto circular. Durante la electroforesis, el ADN con roturas en las hebras migra hacia el ánodo, dando a la célula un aspecto de "cometa". Se contaron los cometas en cuatro a cinco campos diferentes de una sección, y los datos se resumen en términos de porcentaje de cometas. Cada experimento se repitió tres veces.

Medición de los parámetros bioquímicos en suero

Se midieron los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP) y creatinina a partir de los sueros recogidos usando kits (Sigma).

Medición de los biomarcadores del estrés oxidativo

Preparación de tejido de hígado y de tumor

Se homogeneizaron 400 mg de tejido de hígado y de tumor hepático en KCl al 1,15%. El homogeneizado después se centrifugó a 10.000 g a 4 °C durante 20 min. El sobrenadante transparente recogido se usó para el cálculo cuantitativo de la peroxidación de lípidos (LPO), superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión-S-transferasa (GST) y proteínas (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951).

Ensayo de LPO (por favor, proporcionar el formulario completo)

Se determinó de modo cuantitativo el grado de LPO en homogeneizados de médula ósea e hígado realizando el método descrito por Ohkawa et al. (Anal. Biochem., 95, 351-358, 1979). Se midió la cantidad de malondialdehído mediante una reacción con ácido tiobarbitúrico a 532 nm usando un espectrofotómetro. Se calcularon los niveles de MDA usando la curva patrón de malondialdehído y su nivel expresado en nM/mg de proteína.

Ensayo de enzimas antioxidantes

Actividad CAT (por favor, proporcionar el formulario completo)

Se evaluó la actividad CAT mediante el método de Luck (Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press, Nueva York, pp. 895-897, 1963), en el que se mide la descomposición de H2O2. Brevemente, la mezcla de ensayo consiste en 3 ml de tampón fosfato H2O2 y 0,05 ml del sobrenadante del homogeneizado de tejido. Se registró el cambio en la absorbancia durante 2 min a intervalos de 30 s a 240 nm usando un espectrofotómetro.

Actividad superóxido dismutasa (SOD)

Se ensayó la actividad SOD mediante el método de Marklund et al. (Eur. J. Biochem., 47, 469-474, 1974) basado en la inhibición de la autooxidación del pirogalol y expresada como unidad/mg de proteína. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para inhibir la reacción en 50 %. Se mide la autooxidación del pirogalol en tampón Tris-HCl (50 mM, pH 7,5) mediante el aumento en la absorbancia a 420 nm. Actividad glutatión S-transferasa (GST)

Se midieron las actividades GST en el citosol de tejidos determinando el aumento en la absorbancia a 340 nm con 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) como sustrato, y se expresó la actividad específica de la enzima como la formación de un conjugado de CDNB-GSH por minuto por miligramo de proteína (J. Biol. Chem., 249, 7130-7139, 1974). Análisis de la transferencia Western

Se obtuvieron lisados de células y se diluyeron cantidades iguales de proteína procedentes de cada muestra con tampón de carga, se desnaturalizaron y se separaron mediante una electroforesis en gel de poliacrilamidadodecilsulfato de sodio al 10 % (SDS-PAGE), seguida de la transferencia de las proteínas a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF). Se determinó el efecto del tratamiento de M2 sobre la expresión de ciertas proteínas del ciclo celular, tales como p53, p21 y PCNA, ERK3 y sobre Nrf-2, el regulador de la respuesta antioxidante celular. Las proteínas se detectaron mediante incubación con los correspondientes anticuerpos primarios (anti-p53, anti-p21, anti-Nrf-2,anti-ERK3 y anti-PCNA), seguido de una transferencia con anticuerpo secundario conjugado con AP. Las transferencias después se expusieron al sustrato NBT/BCIP para la detección. Este análisis se realizó tres veces.

Análisis estadístico

Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se analizaron estadísticamente. Los valores se muestran como error estándar del promedio, excepto cuando se indica lo contrario. Los datos se analizaron y, cuando fue apropiado, se determinó la significancia de las diferencias entre los valores promedio mediante el ensayo de la t de Student. Los resultados se consideran significativos a p < 0,05.

Ejemplo III: Estudio in vivo

Después de confirmar su efecto anticáncer in vitro, se ensayó también el efecto in vivo de M2 en un modelo de tumor sólido trasplantable murino, el sarcoma-180.

Animales: Se mantuvo la raza de ratones albinos macho Swiss (obtenidos de la colonia de animales de la institución de los inventores) en jaulas de plástico (aproximadamente 4 ratones/jaula) a temperatura ambiente de 22-25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso sin límite a agua y dieta de pienso convencional. El uso de los animales siguió estrictamente las líneas directrices para el bienestar animal del instituto.

Selección de la dosis: Se determinaron las dosis para el estudio in vivo basándose en los resultados in vitro y tomando en consideración el volumen de sangre de los ratones albinos Swiss, que es de 2 ml (Riches et al., J. Phygiol., 228, 279-284, 1973). Las concentraciones que se seleccionaron fueron 15 pM (0,4974 mg/kg), 25 pM (0,829 mg/kg), 30 pM (0,9948 mg/kg), 35 pM (1,1606 mg/kg) y 40 pM (1,3264 mg/kg). La cantidad total de fármaco que se administró por vía intraperitoneal durante este periodo de tratamiento fue de: 99,48 pg, 165,8 pg, 198,96 pg, 232,12 pg y 265,28 pg.

Modelos de tumor in vivo

Modela A: Tumor trasplantable de sarcoma 180

Las células de sarcoma-180 (S-180) murino usadas en este estudio se mantuvieron in vivo mediante transferencia intraperitoneal semanal de 1x106 células en ratones albinos macho Swiss. Los tumores sólidos se produjeron mediante inoculación subcutánea de 1 x106/ml de células S-180 en la superficie dorsal de la pata derecha de ratones albinos Swiss. Se evaluó la viabilidad mediante el método de exclusión de azul de tripano.

Modelo B: Carcinoma de ascitis de Ehrlich

Se mantuvieron células de carcinoma de ascitis de Ehrlich (EAC) mediante una transferencia intraperitoneal en serie de 105 células por ratón. Las células EAC se recolectaron de ratones que portan tumores en la fase exponencial de crecimiento, aproximadamente 7 días después del trasplante del tumor. Las células se extrajeron de modo aséptico con la ayuda de una aguja fina. Las células se lavaron en PBS y se contaron con la ayuda de un hemocitómetro mediante el ensayo de exclusión del tinte azul de tripano. Las células se suspendieron en PBS y se inocularon en el siguiente lote de ratones.

Grupos experimentales (modelo A):

Gr 1: ratones normales tratados con disolución salina

Gr 2: ratones control que portan tumores (S-180)

Gr 3: animales que portan tumores (S-180) tratados con M215 pM

Gr 4: animales que portan tumores (S-180) tratados con M225 pM

Gr 5: animales que portan tumores (S-180) tratados con M230 pM

Gr 6: animales que portan tumores (S-180) tratados con M235 pM

Gr 7: animales que portan tumores (S-180) tratados con M240 pM

Grupos experimentales (modelo B):

Gr 1: ratones normales tratados con disolución salina

Gr 2: ratones control que portan tumores (EAC)

Gr 3: animales que portan tumores (EAC) tratados con M235 pM

Resultados obtenidos con el modelo de tumor de sarcoma-180 (modelo A)

(A) Actividad antitumorigénica de M2

Se compararon los efectos tumoricidas de M2 con los de un agente quimioterapéutico convencional, la ciclofosfamida. Se comparó el recuento de células tumorales y el peso del tumor (figuras 1 A y B) en diferentes grupos de animales experimentales. El tratamiento con las 5 dosis totales de M2 produjo una disminución significativa en el peso del tumor y el recuento de células tumorales (p<0,05), comparado con el grupo control de sarcoma (SC), mostrando así una prometedora actividad antitumoral. El peso del tumor mostró una disminución dependiente de la dosis con el tratamiento de M2. También se observó una disminución dependiente de la dosis en el recuento de células tumorales hasta la dosis de 35 pM. La dosis de 40 pM mostró una inhibición ligeramente menor en el recuento de células tumorales. El porcentaje de inhibición en el peso del tumor y el recuento de células tumorales se representa gráficamente en las figuras 1C y D. De modo interesante, el tratamiento con M2 fue significativamente más eficaz que el tratamiento con ciclofosfamida, en términos de peso del tumor y de recuento de células tumorales.

(B) Modulación de la distribución de las fases del ciclo celular de células tumorales por M2

El tratamiento con M2 produjo un aumento significativo en la región sub-G0 (población de hipoploidía) a todas las dosis administradas; la figura 3 muestra los datos representativos de los diversos experimentos. Comparado con 18,4 % de células en la región de hipoploidía del grupo SC y con 42,1 % en el grupo tratado con ciclofosfamida, el tratamiento con M2 registró 39,94 %, 69,2 % y 41,5 % de células hipoploides, respectivamente, para las concentraciones de 30 pM, 35 pM y 40 pM. La etapa proliferativa, tal como se calcula mediante la suma de S y G2/M, también mostró una disminución distintiva en los grupos tratados con M2, comparado con sus homólogos no tratados.

(C) Efecto de M2 sobre la apoptosis de células tumorales

Se investigó la inducción de daños en el ADN en las células tumorales, por los cuales se induce la apoptosis, después de un tratamiento con M2, mediante el ensayo de cometas. El tratamiento con M2 provocó daños significativos en el ADN en las células tumorales, tal como resulta evidente por el aumento en el porcentaje de células 'cometa' por campo de los portaobjetos estudiados (figura 4), comparado con el grupo control de sarcoma no tratado. Por tanto, la reducción observada en el volumen del tumor, el peso del tumor y el recuento de células tumorales en los grupos tratados con M2 puede atribuirse a la inducción de la apoptosis en células tumorales mediante el tratamiento con M2.

(D) Efecto de M2 sobre la función hepática y renal de un hospedante tratado

Los valores de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP) y los niveles de creatinina en suero de todos los grupos tratados con M2 se encontraban dentro del intervalo normal, excepto para la dosis más alta (figura 5). Esto sugiere que el fármaco M2, excepto a la concentración de 40 pM, no es tóxico en todas las demás dosis.

(E) Efecto de M2 sobre el estrés oxidativo hepático y las enzimas antioxidantes

Se investigó el efecto del compuesto sobre el estado de redox de tejidos normales detectando los niveles de LPO en el hígado de portadores de tumores tratados y no tratados. La figura 6 muestra la modulación de LPO hepática por diferentes dosis de M2, comparado con portadores de tumores, SC y normales tratados con ciclofosfamida. Los hígados de los ratones control de sarcoma mostraron un aumento en los niveles de LPO, comparado con los ratones normales. El tratamiento con ciclofosfamida aumenta aún más este estrés oxidativo hepático. Sin embargo, los niveles de LPO mostraron una disminución significativa (p<0,05) en todos los portadores de tumores tratados con M2 y se descubrió que era comparable a los valores normales.

La figura 7 muestra los cambios en la actividad de las enzimas antioxidantes hepáticas, concretamente, SOD, CAT y GST, en todos los grupos experimentales de ratones. Los tratamientos con M2 condujeron a un aumento en todas las actividades enzimáticas, comparado con los ratones normales, así como con los ratones control de sarcoma. Se descubrió que las dosis particularmente eficaces fueron las concentraciones de 30 pM y 35 pM. Además, la comparación del efecto de M2 y ciclofosfamida sobre las enzimas antioxidantes sugiere que esta última provoca una disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes hepáticas que crea un estrés oxidativo en el hospedante. Por tanto, M2 no induce un estrés oxidativo en tejidos normales del hospedante, a diferencia del agente quimioterapéutico de uso habitual ciclofosfamida.

(F) Efecto de M2 sobre la celularidad de la médula ósea

Se sabe que el fármaco quimioterapéutico convencional ciclofosfamida induce una mielosupresión grave en el hospedante. Por tanto, para comparar este efecto secundario de la ciclofosfamida con M2, se ensayó el efecto de M2 sobre este órgano inmunológico primario. De manera interesante, a pesar de tener una significativa actividad antitumorigénica, que es mayor que la de la ciclofosfamida, incluso la dosis más alta de M2 no provocó una supresión de la médula ósea en los portadores de tumores. La figura 8 muestra los recuentos de células de médula ósea en animales normales y experimentales. En el control de sarcoma, así como en el grupo de sarcoma tratado con ciclofosfamida, existe una significativa disminución en el recuento de células de la médula ósea (p<0,05), que fue mejorada hasta un grado significativo por la administración de M2 en los ratones que portan tumores (p<0,05). Los cambios en la distribución de las fases del ciclo celular en la médula ósea en los grupos normales y experimentales se muestran en la figura 9. La grave mielosupresión tras el tratamiento con ciclofosfamida puede atribuirse al aumento en el pico de hipoploidía, concretamente 48,5 %, comparado con solo 5,5 % en el grupo normal y 20,9 % en el grupo control de sarcoma. Además, se produjo una disminución en las fases proliferativas (S y G2/M combinadas), concretamente 3 % en CP, comparado con 21,23 % en el grupo normal y 15,15 % en el grupo control de sarcoma. Sin embargo, el tratamiento con M2 redujo significativamente el pico de hipoploidía (solo 5,4 % en la concentración de 40 pM), comparado con el control de sarcoma o los portadores de tumores tratados con ciclofosfamida. Además, a diferencia de los grupos tratados con ciclofosfamida, el tratamiento de M2 no disminuyó la fase proliferativa, comparado con los grupos control de sarcoma.

(G) Efecto de M2 sobre los niveles de la proteína Nrf-2 en el hígado

Para validar aún más el efecto antioxidativo de M2 sobre el sistema hepático del hospedante, se estudió la expresión de la proteína Nrf-2 mediante transferencia Western. La Nrf-2 es un factor de transcripción importante que regula la respuesta antioxidante induciendo la expresión de enzimas antioxidantes. Se descubrió que M2 modula la expresión de la Nrf-2 hepática de una manera que complementa los descubrimientos bioquímicos observados (figura 10A). En el hígado, la expresión de Nrf-2 aumenta con el tratamiento de M2, comparado con el grupo control de sarcoma. (H) Efecto de M2 sobre el marcador de la proliferación PCNA en médula ósea

Para establecer aún más la falta de toxicidad de M2 en el compartimento de la médula ósea, se estudió la expresión del marcador de la proliferación PCNA mediante transferencia Western. La expresión de PCNA muestra un aumento significativo en todos los grupos tratados con M2, comparado con el grupo control de sarcoma (figura 10B), lo cual demuestra que M2 no provoca una supresión de la médula ósea, que es un efecto secundario característico del fármaco quimioterapéutico convencional ciclofosfamida.

(I) Efecto de M2 sobre PCNA y quinasas del tejido tumoral

Se descubrió que la expresión del marcador de la proliferación PCNA, determinada en tejidos tumorales mediante transferencia Western, disminuyó por el tratamiento con M2, lo cual apoya el efecto antiproliferativo del compuesto (figura 11A).

Las quinasas se han convertido en una de las clases más intensamente buscadas de diana de fármacos. Así, para evaluar el efecto de M2 sobre las quinasas, se detectó la expresión de ERK en tejidos tumorales de grupos tratados y no tratados mediante transferencia Western. M2 fue capaz de reducir significativamente la expresión de ERK, comparado con el control de sarcoma, así como con los grupos tratados con ciclofosfamida (figura 11B).

Resultados obtenidos con el modelo de tumor EAC (modelo B)

Actividad antitumorigénica de M2 en EAC

El tratamiento con la dosis más eficaz de M2 (35 gM) produjo una reducción significativa en el volumen del tumor y el recuento de células tumorales en los ratones que portan EAC, comparado con el control de EAC y los ratones que portan tumores EAC tratados con ciclofosfamida (figuras 12A, B y C). Esto confirma la potente actividad antitumorigénica de M2 en otro modelo de tumor in vivo.

Efecto de M2 sobre la celularidad de la médula ósea

Como en los ratones que portan tumores S-180 analizados anteriormente, se descubrió que M2 tenía un efecto protector sobre la médula ósea en ratones que portan tumores EAC, a diferencia de la ciclofosfamida, que induce mielosupresión en ratones que portan tumores EAC (figura 13). Así, el significativo efecto antitumoral de M2 no viene acompañado de ninguna toxicidad indeseable en la médula ósea en ratones que portan tumores EAC, a diferencia de la ciclofosfamida, que induce mielosupresión.

A este respecto, de nuevo es un descubrimiento selectivo de la presente invención que, de modo sorprendente y después de dichos estudios a fondo, el compuesto bis[(3-[4-({[3-({4-[(2-cianoetil)(metil)amino]benciliden}amino)propil]imino}metil)(metil)anilino] propanonitrilo)] (M2), se une a una estructura de ADN G-cuádruplex intramolecular y otras potenciales secuencias formadoras de cuádruplex frente a estructuras de ADN dúplex, y se identificó específicamente como potencialmente eficaz como producto terapéutico para el cáncer para dicha actividad terapéutica para el cáncer, en cantidades eficaces de 15 gM-40 gM/0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg, para interferir en diferentes vías de señalización y/o para infrarregular las funciones de diferentes proteínas asociadas en la biología del cáncer, y con ello está adaptado como agente supresor de quinasas y/o que interfiere en cualquier otra vía de señalización y/o formulaciones que lo contienen.

La selección de una diana, tal como la estructura de ADN G-cuádruplex, es una etapa fundamental para diseñar un potente ligante o estabilizador para el G-cuádruplex, que existe como repeticiones en la región telomérica 3' del cromosoma, la región de promotor de oncogenes y algunas regiones de promotores de genes de quinasas. Un descubrimiento selectivo del presente avance consiste en que solo cuando la estructura seleccionada de este modo tiene una disposición preferida en un medio orgánico concurrido, solo entonces puede correlacionarse realmente con las estructuras naturales preferidas en la matriz nuclear. Dicha estructura de G-cuádruplex (2LD8.pdb) eficaz solo puede obtenerse selectivamente mediante estudios a fondo y un análisis bajo el presente avance a partir de un medio concurrido, en el que la cara G del cuádruplex se expone selectivamente para la unión con un ligando. De manera importante, puesto que la misma composición de dicho cuádruplex existe como una forma estructural diferentes en disolución acuosa, resultó un desafío obtener dicha estructura mediante las técnicas disponibles para permitir el ensayo de la interacción de cara G-ligando con diversas moléculas y conseguir las moléculas de fármaco adaptadas como nuevos productos quimioterapéuticos para el cáncer, lo cual se resuelve y se logra selectivamente mediante el presente avance y se considera que es muy especial y que resuelve técnicamente los objetivos previstos del presente avance.

Se descubrieron dos tipos de sitios de unión en la estructura de G-cuádruplex (2LD8.pdb) selectiva a partir de un análisis SiteMap. Desde el punto de vista estructural, estos dos sitios de unión se clasifican como (a) región de bucle, que tiene la forma de cavidades pequeñas; (b) región de apilamiento terminal/cofacial presente en la parte superior de la macromolécula. Las regiones de bucle son muy ricas en densidad de electrones y son favorables para la unión con fragmentos moleculares pequeños. Estas regiones de bucle proporcionan una buena afinidad de unión para aceptores de enlaces de hidrógeno.

El otro sitio de unión, es decir, la región de apilamiento terminal/cofacial que contiene los restos guanina apilados (cara G) (que forma el primer cuarteto), está enriquecido en nubes de n-electrones que proceden de las cuatro direcciones. Por tanto, este sitio es importante para desarrollar los agentes estabilizadores de G-cuádruplex avanzados/formulaciones que los contienen, puesto que es la región más adecuada para moléculas pequeñas, péptidos o ADN, aptámeros de ARN que introducen una entropía favorable en el sistema, lo cual provoca su estabilización.

La figura 15 muestra las interacciones entre diferentes partes de M2 y el G-cuádruplex. 15 En la patología del cáncer, dichos agentes quimioterapéuticos para el cáncer hidrosolubles/supresores de quinasas y/o que interfieren en cualquier otra vía de múltiple señalización/formulaciones que comprenden M2 también pueden unirse a las regiones de promotores de varios oncogenes en los que se forman estructuras de G-cuádruplex. En teoría, se descubrió que M2 puede unirse al cuádruplex de C-Myc.

Ejemplo IV: Estudios espectroscópicos de agentes estabilizadores de G-cuádruplex 20

Estudios de fluorescencia: Se usó la espectroscopía de emisión de fluorescencia para analizar el comportamiento de unión de la molécula M2 con el G-cuádruplex 5'-TAGGG(TTAGGG)3-3'. Se usó un ADN dúplex rico en G como control en este estudio, con la secuencia:

5' - G CGCATGCTACGCG - 3'

y - CCCGTáfc&WCCGC - 5#

Los espectros de emisión de una secuencia de ADN dúplex y G-cuádruplex se registraron a temperatura ambiente usando un espectrómetro Hitachi (espectrofotómetro F-700 FL) con una cubeta de cuarzo de longitud de paso de 1 cm. El espectro de emisión se registró de 300-500 nm con una longitud de onda de excitación de 260 nm. Las ranuras de excitación y de emisión se ajustaron a 5 nm cada una. Los espectros de emisión se registraron titulando moléculas pequeñas hasta una concentración de 50 pM frente a ADN dúplex y G-cuádruplex 10 pM.

Un significativo desplazamiento hipsocrómico o desplazamiento al azul en la emisión de fluorescencia proporciona una prueba potente de que una molécula de ligando/fármaco se une o no se une al G-cuádruplex. El experimento de fluorescencia se realizó titulando la molécula M2 (0-50 pM) con G-cuádruplex, 5'-TAGGG(T^t AGGG)3 (10 pM). La emisión característica del espectro se muestra en la figura 5. Se observaron un total de 18 nm desplazamientos hipsocrómicos en los espectros de emisión de G-cuádruplex cuando M2 se une a este (figura 17A). El cambio en la emisión máxima de fluorescencia del G-cuádruplex como una función de la concentración de la molécula de ligando M2 produce una constante de disociación en equilibrio (K^d) de 31 ± 1,2 pM (figura 17B). Se realizó un experimento control para un ADN dúplex rico en GC:

S ' — GCG CATG Cm CG CtS — 3*

3 ' — CGGGmCGATGCGC — S r

en presencia de M2. De manera interesante, se observó que no se produjo un desplazamiento al azul en los espectros de emisión del ADN dúplex tras la adición de los ligandos (figura 17C). Estas pruebas experimentales demuestran que M2 es un ligante muy selectivo a estructuras de G-cuádruplex frente al ADN dúplex.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1.- Un agente quimioterapéutico para el cáncer que comprende bis(3-[4-({[3-({4-[(2-cianoetil)(metil)amino]benciliden}amino)propil]imino}metil)(metil)anilino]propanonitrilo), el compuesto de fórmula (II):

para su uso en el tratamiento del cáncer.

2. - El agente quimioterapéutico para el cáncer para el uso según la reivindicación 1, en el que el agente se administra en una cantidad de 0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg de peso corporal.

3. - Un proceso para la preparación de un agente quimioterapéutico para el cáncer que tiene la fórmula general (II), según la reivindicación 1, en forma hidrosoluble, que comprende las etapas de:

(i) añadir un catión a la molécula de fórmula general (IIa) en cantidades para favorecer un enlace catiónico con al menos un nitrógeno;

(ii) opcionalmente, si se requiere, ajustar el pH para obtener con ello dicha forma soluble de dicho agente.

4.- Un proceso para la preparación de un agente quimioterapéutico para el cáncer, según la reivindicación 3, en el que dicha (i) implica añadir ácido para protonar al menos un nitrógeno;

en el que dicha (ii) implica ajustar el pH a aproximadamente 7 mediante la adición de bicarbonato de sodio o potasio para obtener preferiblemente una forma hidrosoluble protonada del compuesto de fórmula (II).

5. - Un proceso según la reivindicación 4, en el que los ácidos incluyen ácidos inorgánicos seleccionados de HCl, H²SO⁴ o HNO³.

6. - Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, que comprende proporcionar dicho agente en cantidades selectivas de 15-40 pM.

7. - Una formulación/composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicha formulación/composición farmacéutica el agente quimioterapéutico para el cáncer según la reivindicación 1 en cantidades quimioterapéuticas para el cáncer selectivas de 15-40 pM o 0,4974 mg/kg-1,3264 mg/kg de peso corporal, y que comprende además excipientes/vehículos farmacéuticamente aceptables para esta.

8. - Una formulación/composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 7 en una forma seleccionada del grupo que comprende comprimidos, suspensiones, jarabes, dispersiones o inyectables.

9.- El agente quimioterapéutico para el cáncer del compuesto de fórmula (II):

para su uso en el tratamiento de múltiples cánceres que incluyen cáncer de pulmón, mama, hígado, gástrico, sarcoma, cáncer cervical, que comprenden p53 de tipo salvaje y mutado.