ES2841973B2 - BACTERIAL STRAINS AND THEIR USE FOR THE BIOREMEDIATION OF SOILS CONTAMINATED WITH BIPHENYL AND DIPHENYL OXIDE (HTF) - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

CEPAS BACTERIANAS Y SU USO PARA LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS BACTERIAL STRAINS AND THEIR USE FOR SOIL BIOREMEDIATION

CONTAMINADOS CON BIFENILO Y ÓXIDO DE DIFENILO (HTF)CONTAMINATED WITH BIPHENYL AND DIPHENYL OXIDE (HTF)

La presente invención se encuadra en el campo de la biotecnología aplicada al sector del medio ambiente, y en particular se refiere microorganismos útiles para la degradación in situ (biorremediación) de superficies, preferiblemente suelos, contaminados con los componentes del fluido calorportador HTF, bifenilo y óxido de difenilo (HTF).The present invention falls within the field of biotechnology applied to the environmental sector, and in particular refers to microorganisms useful for the in situ degradation (bioremediation) of surfaces, preferably soils, contaminated with the components of the heat transfer fluid HTF, biphenyl and diphenyl oxide (HTF).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION

Las centrales termosolares se basan en la captación y concentración de la radiación solar. La captación tiene lugar a través de espejos y la concentración se lleva a cabo mediante fluidos caloportadores. Básicamente, la función del fluido caloportador es la de transferir la energía recogida por los captadores cilindro parabólicos (espejos) al bloque de potencia a través de un sistema de intercambio de calor. El vapor producido en los intercambiadores se utiliza en una turbina de vapor para generar energía mecánica de rotación que en último término se transformará en energía eléctrica.Solar thermal power plants are based on the capture and concentration of solar radiation. The capture takes place through mirrors and the concentration is carried out by means of heat transfer fluids. Basically, the function of the heat transfer fluid is to transfer the energy collected by the parabolic trough collectors (mirrors) to the power block through a heat exchange system. The steam produced in the exchangers is used in a steam turbine to generate rotational mechanical energy that will ultimately be transformed into electrical energy.

Los fluidos caloportadores que dan mejores resultados son los fluidos orgánicos, que no cambian de estado aunque la temperatura se incremente mucho. Uno de los más utilizados es la mezcla eutéctica compuesta por un 73,5% en peso de difenil éter (óxido de difenilo) y un 26,5% de 1,1 -Bifenilo (bifenilo). A este fluido se le denomina habitualmente HTF (de sus siglas en inglés “Heat Transfer Fluid). Así, la mayoría de las centrales termosolares del mundo utilizan el fluido calorportador HTF para transferir el calor desde las parábolas hasta las turbinas que generan la electricidad. Este fluido es un líquido altamente tóxico, viscoso, incoloro-amarillento y que presenta un punto de ebullición de 257 °C.The heat transfer fluids that give the best results are organic fluids, which do not change state even if the temperature increases a lot. One of the most used is the eutectic mixture composed of 73.5% by weight of diphenyl ether (diphenyl oxide) and 26.5% of 1,1-Biphenyl (biphenyl). This fluid is usually called HTF (for its acronym in English "Heat Transfer Fluid"). Thus, most of the world's solar thermal power plants use the HTF heat transfer fluid to transfer heat from the parabolas to the turbines that generate electricity. This fluid is a highly toxic, viscous, colourless-yellowish liquid with a boiling point of 257 °C.

El HTF trabaja a temperaturas comprendidas entre unos 290°C, a la entrada de la línea en la que se concentra la radiación, y 390°C a la salida. Una mayor temperatura de salida supondría un mayor rendimiento global de la planta, pero las características químicas del fluido no hacen posible utilizarlo por encima de los 400°C: las reacciones de degradación aumentan exponencialmente de velocidad, originándose hidrocarburos volátiles y pesados que modifican el comportamiento de la planta y que plantean problemas de seguridad. Por ello, las centrales termosolares tienen limitada la temperatura máxima de trabajo del fluido orgánico a unos 400°C. Además, requieren de sistemas que eliminen los productos originados en la degradación, normalmente utilizando filtraciones y destilaciones sucesivas.The HTF works at temperatures between about 290°C, at the entrance of the line where the radiation is concentrated, and 390°C at the exit. A higher outlet temperature would mean a higher overall performance of the plant, but the chemical characteristics of the fluid do not make it possible to use it above 400°C: the degradation reactions increase exponentially in speed, giving rise to volatile and heavy hydrocarbons that modify the behavior of the plant and which pose safety concerns. For this reason, solar thermal power plants have a limited maximum working temperature of the organic fluid at about 400°C. In addition, they require systems that eliminate the products originating from the degradation, normally using successive filtrations and distillations.

Sin embargo, y pese a que en las plantas termosolares existen muchas medidas de control de emisiones al aire, suelo y agua, es inevitable que puedan ocurrir cierto tipo de vertidos impredecibles e incontrolables, cuya magnitud puede variar desde unos pocos litros en las juntas a toneladas si tuviera lugar un accidente de mayores dimensiones. Además, en ocasiones las tuberías de las centrales pierden la hermeticidad como consecuencia de los cambios de temperatura durante la operación de la planta, produciéndose fugas en los codos de unión de las mismas que contaminan el suelo de las centrales.However, and despite the fact that there are many measures to control emissions into the air, soil and water in solar thermal plants, it is inevitable that certain types of unpredictable and uncontrollable discharges may occur, the magnitude of which can vary from a few liters at the joints to tons if a larger accident were to take place. In addition, sometimes the pipes of the power plants lose their tightness as a result of changes in temperature during the operation of the plant, producing leaks in the union elbows of the same that contaminate the floor of the power plants.

Por tanto, además de la contaminación del aire debido a la volatilidad de los componentes del HTF, la matriz receptora que sufre mayor impacto es el suelo.Therefore, in addition to air pollution due to the volatility of the HTF components, the receiving matrix that suffers the greatest impact is the soil.

El HTF tiene índices de ecotoxicidad y de toxicidad en humanos de importante magnitud. Centrándonos en el medio ambiente, cuando sucede un derrame hay riesgos importantes de que el HTF afecte a las poblaciones de organismos que viven en el suelo, y eventualmente, también a los organismos acuáticos, ya que una filtración puede dar lugar a la contaminación de un acuífero, por ejemplo.HTF has high levels of ecotoxicity and toxicity in humans. Focusing on the environment, when a spill occurs, there are significant risks that HTF will affect the populations of organisms that live in the soil, and eventually also aquatic organisms, since a leak can lead to the contamination of a aquifer, for example.

El impacto ambiental del vertido de HTF se debe de forma mayoritaria al bifenilo, siendo la ecotoxicidad del óxido de difenilo mucho menor.The environmental impact of the HTF discharge is mainly due to biphenyl, with the ecotoxicity of diphenyl oxide being much lower.

Dado lo imprevisible de las pérdidas, y al hecho de que muchas veces los derrames pueden estar muy deslocalizados, esto es, ser de poca magnitud, pero de elevado alcance (goteos en juntas muy separadas entre sí a lo largo de toda la superficie del campo de espejos), las opciones de tratamiento del suelo contaminado deben ser lo suficientemente flexibles para poder implementarse en distintas localizaciones y con unos costes moderados. Asimismo, las alternativas de tratamiento deben mantener la filosofía de las plantas termosolares: energía sostenible y soluciones amigables con el medio ambiente.Given the unpredictability of the losses, and the fact that spills can often be very delocalized, that is, be of little magnitude, but of great scope (drips in widely separated joints along the entire surface of the field of mirrors), the treatment options for contaminated soil must be flexible enough to be implemented in different locations and with moderate costs. Likewise, treatment alternatives must maintain the philosophy of solar thermal plants: sustainable energy and environmentally friendly solutions.

Sin embargo, son muy escasos los estudios en relación a la biodegradación de HTF. Hasta el momento, dichos estudios se han centrado en evaluar la degradación de uno de los dos componentes por separado. Así, Gibson (Gibson et al., 1973, Biochemical and Biophysical Research Communications, 50(2):211-219) estudió la degradación de bifenilo por medio de la bacteria Beijennckia; Dodge empleó un hongo para el mismo compuesto (Dodge et al., 1979, Biodegra, 178(1):223-230) y Fugihara describió la capacidad de Pseudomonas aeruginosa KF702 (NBRC110665) para degradar bifenilo (Fugihara et al., 2015; Genome Announc 3: e00517-15). También está descrita la biodegradación bacteriana de difenil éter por Pseudomonas putida, la cepa SS3 de Sphingomonas sp., y Cupriavidus sp. (Catelani et al., 1971, Experientia, 27(10): 1173-1174; Schmidt et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol., 58(9):2744-2750; Wang et al., 2015, Environ Sci Pollut Res, DOI 10.1007/s11356-015-4854-3).However, there are very few studies regarding the biodegradation of HTF. Until now, these studies have focused on evaluating the degradation of one of the two components separately. Thus, Gibson (Gibson et al., 1973, Biochemical and Biophysical Research Communications, 50(2):211-219) studied the degradation of biphenyl by the bacteria Beijennckia ; Dodge used a fungus for the same compound (Dodge et al., 1979, Biodegra, 178(1):223-230) and Fugihara described the ability of Pseudomonas aeruginosa KF702 (NBRC110665) to degrade biphenyl (Fugihara et al., 2015; Genome Announc 3: e00517-15). Bacterial biodegradation of diphenyl ether by Pseudomonas putida, Sphingomonas sp. SS3 strain, and Cupriavidus sp. (Catelani et al., 1971, Experientia, 27(10): 1173-1174; Schmidt et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol., 58(9):2744-2750; Wang et al., 2015, Environ Sci Pollut Res, DOI 10.1007/s11356-015-4854-3).

En cuanto a la mezcla de ambos compuestos, es decir, al fluido HTF, hasta el momento no se ha descrito ningún microorganismo que pueda degradar simultánea y eficientemente los dos compuestos orgánicos presentes en esta mezcla eutéctica. Hay muy poco avanzado con la perspectiva de contemplar el efecto de la actividad degradadora bacteriana en el propio HTF. Únicamente se ha descrito una bacteria del género Pseudomonas, en particular la cepa P. oleovorans HBD2 CECT8969 (ES2641967), y un hongo, Phlebia lindtneri, (Mori et al., 2002, FEMS Microbiol Lett, 213(1): 127-31), que son de utilidad para la degradación del fluido HTF.As for the mixture of both compounds, that is, the HTF fluid, up to now no microorganism has been described that can simultaneously and efficiently degrade the two organic compounds present in this eutectic mixture. There is very little progress with the prospect of looking at the effect of bacterial degrading activity on HTF itself. Only one bacterium of the genus Pseudomonas, in particular the strain P. oleovorans HBD2 CECT8969 (ES2641967), and one fungus, Phlebia lindtneri, have been described (Mori et al., 2002, FEMS Microbiol Lett, 213(1): 127-31 ), which are useful for the degradation of the HTF fluid.

Por ello, existe la necesidad de identificar microorganismos, o combinaciones de los mismos, resistentes a los dos componentes del HTF y a sus productos de degradación, que sean eficaces en la utilización y, por tanto, eliminación, simultánea de ambos compuestos. La aplicación de dichos microorganismos supondría una solución ecológica, económica y eficiente para el tratamiento in situ o biorremediación de suelos contaminados con HTF, como por ejemplo, en las centrales termosolares y en las proximidades de las mismas.Therefore, there is a need to identify microorganisms, or combinations thereof, resistant to the two components of HTF and their degradation products, which are effective in the simultaneous use and, therefore, elimination of both compounds. The application of these microorganisms would be an ecological, economical and efficient solution for the in situ treatment or bioremediation of soils contaminated with HTF, such as, for example, in solar thermal power plants and in the vicinity of them.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invención supone una solución al problema anteriormente planteado, al proporcionar una cepa bacteriana de Enterococcus sp., aislada y caracterizada por los inventores, que es capaz de degradar eficientemente los dos componentes del fluido calorportador HTF, es decir, bifenilo y óxido de difenilo. Así, dicha cepa puede ser irrigada en las zonas contaminadas donde haya habido vertidos del citado fluido para su biorremediación o degradación in situ. The present invention represents a solution to the aforementioned problem, by providing a bacterial strain of Enterococcus sp., isolated and characterized by the inventors, which is capable of efficiently degrading the two components of the HTF heat transfer fluid, that is, biphenyl and diphenyl oxide . Thus, said strain can be irrigated in contaminated areas where there have been spills of said fluid for bioremediation or degradation in situ.

La presente invención propone además el empleo de dicha cepa de Enterococcus sp. en combinación, es decir, como consorcio bacteriano, con una cepa de Achromobacter y una cepa de Pseudomonas aeruginosa, también aisladas y caracterizadas por los inventores, en las proporciones 64,5%, 6,9% y 28,6%, respectivamente. Este consorcio bacteriano mejora la capacidad de la cepa de Enterococcus sp. descrita en la presente invención para degradar los componentes del HTF (bifenilo y óxido de difenilo), por lo que representa también una herramienta muy útil para la biorremediación de suelos contaminados con el mismo.The present invention also proposes the use of said strain of Enterococcus sp. in combination, that is, as a bacterial consortium, with an Achromobacter strain and a Pseudomonas aeruginosa strain, also isolated and characterized by the inventors, in the proportions 64.5%, 6.9% and 28.6%, respectively. This bacterial consortium enhances the ability of the Enterococcus sp. described in the present invention to degrade the components of HTF (biphenyl and diphenyl oxide), for which it also represents a very useful tool for the bioremediation of soils contaminated with it.

Los ensayos mostrados más adelante demuestran que la cepa de Enterococcus sp. de la presente invención es capaz de degradar bifenilo y óxido de difenilo, preferiblemente óxido de difenilo, con una mayor eficacia que otras bacterias, por ejemplo que las otras dos cepas de Achromobacter y P. aeruginosa descritas en la presente invención, cuando éstas se emplean de manera individual. Además, dichos ensayos ponen de manifiesto que la combinación o consorcio, en los porcentajes concretos indicados aquí, de las tres cepas bacterianas aisladas en la presente invención presenta una capacidad de degradación de bifenilo y de óxido de difenilo muy superior a la capacidad de degradación de dichos compuestos de cada una de estas cepas por separado e incluso a la capacidad de degradación de dichos compuestos por parte de una combinación de estas mismas cepas pero en otras proporciones diferentes a la indicada en el párrafo anterior (ver Tabla 1 de los ejemplos).The tests shown below demonstrate that the strain of Enterococcus sp. of the present invention is capable of degrading biphenyl and diphenyl oxide, preferably diphenyl oxide, with greater efficiency than other bacteria, for example than the other two strains of Achromobacter and P. aeruginosa described in the present invention, when these are used individually. In addition, these tests show that the combination or consortium, in the specific percentages indicated here, of the three bacterial strains isolated in the present invention has a biphenyl and diphenyl oxide degradation capacity much higher than the degradation capacity of said compounds of each of these strains separately and even to the degradation capacity of said compounds by a combination of these same strains but in other proportions different from that indicated in the previous paragraph (see Table 1 of the examples).

Con el objetivo de encontrar y diseñar aquellos microorganismos y combinaciones de los mismos más eficientes en la degradación de HTF, en la presente invención se aislaron las tres cepas bacterianas que se describen aquí de un suelo contaminado con HTF en territorio español, posteriormente fueron cultivadas in vitro mediante un procedimiento cuyas condiciones han sido optimizadas por los inventores para conseguir inducir la capacidad degradadora de HTF en dichas cepas y finalmente fueron caracterizadas.With the aim of finding and designing those microorganisms and combinations thereof that are most efficient in the degradation of HTF, in the present invention the three bacterial strains described here were isolated from a soil contaminated with HTF in Spanish territory, subsequently they were cultivated in vitro by means of a procedure whose conditions have been optimized by the inventors in order to induce the HTF-degrading capacity in said strains and were finally characterized.

Las ventajas asociadas a la presente invención son que permite la biorremediación de superficies, preferiblemente suelos, contaminados con cualquiera de los componentes del HTF (difenil éter o 1,1 -Bifenilo) o con la mezcla de ambos (el propio HTF), de una manera efectiva, ecológica y con bajo coste. Además, las cepas descritas en la presente invención se adaptan a vivir en suelos de distinta naturaleza contaminados con HTF o con cualquiera de sus componentes, consiguiendo degradarlo in situ a un bajo coste y a través de un procedimiento sencillo. La aplicación de las cepas de la invención para esta finalidad no plantea ninguna complicación a nivel de infraestructuras, en particular, no se necesita restaurar o modificar las instalaciones existentes de las plantas termosolares, lo que permite que el tratamiento se pueda implantar de manera inmediata en las infraestructuras existentes, y el coste de mantenimiento es mínimo. Además, en el proceso de biorremediación aquí descrito no se utilizan reactivos tóxicos ni sistemas que consuman energía, ya que es la propia actividad de las bacterias la que permite la degradación eficaz del HTF. Por último, las cepas de la presente invención admiten una gran versatilidad en sus aplicaciones en biorremediación de suelos contaminados con HTF o con cualquiera de sus componentes, pudiéndose aplicar tanto en pequeños derrames del fluido (goteos) como en zonas contaminadas de mayor magnitud.The advantages associated with the present invention are that it allows the bioremediation of surfaces, preferably soils, contaminated with any of the components of HTF (diphenyl ether or 1,1-Biphenyl) or with a mixture of both (HTF itself), in a effective, ecological and low-cost way. In addition, the strains described in the present invention are adapted to live in soils of a different nature contaminated with HTF or with any of its components, managing to degrade it in situ at low cost and through a simple procedure. The application of the strains of the invention for this purpose does not pose any complications at the infrastructure level, in particular, it is not necessary to restore or modify the existing facilities of the solar thermal plants, which allows the treatment to be implemented immediately in existing infrastructures, and the cost of maintenance is minimal. Also, in the bioremediation process here described, no toxic reagents or systems that consume energy are used, since it is the activity of the bacteria that allows the efficient degradation of HTF. Finally, the strains of the present invention allow great versatility in their applications in bioremediation of soils contaminated with HTF or with any of its components, being able to be applied both in small fluid spills (drips) and in larger contaminated areas.

Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a una cepa bacteriana de Enterococcus sp. aislada y depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT30012 (también llamada HTF1).For all these reasons, a first aspect of the invention relates to a bacterial strain of Enterococcus sp. isolated and deposited in the Spanish Collection of Type Cultures with deposit number CECT30012 (also called HTF1).

Otro aspecto de la invención se refiere a una cepa bacteriana de Achromobacter sp. aislada y depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT30013 (también llamada HTF2).Another aspect of the invention relates to a bacterial strain of Achromobacter sp. isolated and deposited in the Spanish Collection of Type Cultures with deposit number CECT30013 (also called HTF2).

Otro aspecto de la invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudomonas aeruginosa aislada y depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT30014 (también llamada HTF3).Another aspect of the invention refers to a bacterial strain of Pseudomonas aeruginosa isolated and deposited in the Spanish Collection of Type Cultures with deposit number CECT30014 (also called HTF3).

Como se ha indicado anteriormente, estas tres cepas, de ahora en adelante “cepas bacterianas de la invención” o “cepas de la invención”, han sido aisladas de un suelo contaminado con HTF en territorio español y depositadas el 19 de noviembre de 2019 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA). As indicated above, these three strains, from now on "bacterial strains of the invention" or "strains of the invention", have been isolated from soil contaminated with HTF in Spanish territory and deposited on November 19, 2019 under the Budapest Treaty on the Spanish Type Culture Collection as an International Depository Authority (headquartered in Building 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) SPAIN).

Dentro del alcance de la presente invención también están contempladas aquellas bacterias que derivan de las cepas bacterianas de la invención y éstas pueden formar parte de la composición o consorcio bacteriano descrito posteriormente como alternativa a las cepas específicamente indicadas, siempre y cuando conserven la capacidad de degradar HTF o cualquiera de sus componentes. Ejemplos de bacterias derivadas de las cepas bacterianas específicamente indicadas en la invención pueden ser mutantes y organismos modificados genéticamente que presenten variaciones en su genoma respecto al genoma de las cepas descritas en la invención, pero donde dichas variaciones no afectan a la capacidad de las cepas de degradar HTF o cualquiera de sus componentes. Las bacterias derivadas de las cepas bacterianas de la invención pueden producirse de forma natural o de forma intencionada por métodos de mutagénesis conocidos en el estado de la técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, el crecimiento de la cepa original en presencia de agentes mutagénicos o causantes de estrés o mediante ingeniería genética dirigida a la mutación o mutaciones deseada/s. También se contemplan organismos genéticamente modificados derivados de las cepas bacterianas de la invención que conservan su capacidad de degradar HTF o cualquiera de sus componentes y, por lo tanto, de ser usados en el tratamiento o biorremediación de superficies, preferiblemente suelos, contaminados con dicho fluido o con cualquiera de sus componentes. Un ensayo para comprobar si un microorganismo tiene capacidad de degradar HTF o cualquiera de sus componentes se describe en los ejemplos que acompañan a la presente descripción.Within the scope of the present invention, those bacteria that derive from the bacterial strains of the invention are also contemplated and these can form part of the bacterial composition or consortium described later as an alternative to the specifically indicated strains, as long as they retain the ability to degrade HTF or any of its components. Examples of bacteria derived from the bacterial strains specifically indicated in the invention may be mutants and genetically modified organisms that have variations in their genome with respect to the genome of the strains described in the invention, but where said variations do not affect the ability of the strains to downgrade HTF or any of its components. The bacteria derived from Bacterial strains of the invention can be produced naturally or intentionally by mutagenesis methods known in the state of the art, such as, but not limited to, growth of the original strain in the presence of mutagenic or stress-causing agents or by genetic engineering targeting the desired mutation(s). Genetically modified organisms derived from the bacterial strains of the invention that retain their ability to degrade HTF or any of its components and, therefore, to be used in the treatment or bioremediation of surfaces, preferably soils, contaminated with said fluid are also contemplated. or with any of its components. An assay to check whether a microorganism has the ability to degrade HTF or any of its components is described in the examples that accompany this description.

Por otro lado, dentro de la presente invención también se contemplan los componentes celulares, metabolitos, compuestos bioactivos y/o moléculas secretadas por cualquiera de las cepas bacterianas de la invención o por el cocultivo de las mismas, así como las composiciones que comprenden dichos elementos y los usos de los mismos para el tratamiento o biorremediación de superficies, preferiblemente suelos, contaminados con HTF o con cualquiera de sus componentes.On the other hand, within the present invention the cellular components, metabolites, bioactive compounds and/or molecules secreted by any of the bacterial strains of the invention or by their co-culture, as well as the compositions comprising said elements are also contemplated. and the uses thereof for the treatment or bioremediation of surfaces, preferably soils, contaminated with HTF or any of its components.

Otro aspecto de la invención se refiere a un cultivo bacteriano puro que comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa de Enterococcus sp. CECT30012.Another aspect of the invention relates to a pure bacterial culture comprising any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012.

Los “compuestos bioactivos son productos obtenidos a partir de las cepas de la presente invención, tanto sus componentes extracelulares como intracelulares. Dentro de dichos compuestos bioactivos se podrían incluir, pero sin limitarnos, componentes de la pared celular (como, por ejemplo, peptidoglicanos), ácidos nucleicos, ácidos orgánicos e inorgánicos, componentes de la membrana u otros, como proteínas, péptidos, aminoácidos, enzimas, lípidos e hidratos de carbono y sus combinaciones (como lipoproteínas, glicolípidos o glicoproteínas), vitaminas, sales, minerales, etc. También cualquier molécula producida o modificada por la bacteria, y/o secretada o liberada al exterior, como consecuencia de su actividad metabólica, durante su crecimiento, su uso en procesos tecnológicos o durante su almacenamiento.The “bioactive compounds are products obtained from the strains of the present invention, both their extracellular and intracellular components. Such bioactive compounds could include, but are not limited to, cell wall components (such as peptidoglycans), nucleic acids, organic and inorganic acids, membrane components or others, such as proteins, peptides, amino acids, enzymes. , lipids and carbohydrates and their combinations (such as lipoproteins, glycolipids or glycoproteins), vitamins, salts, minerals, etc. Also any molecule produced or modified by the bacterium, and/or secreted or released to the outside, as a consequence of its metabolic activity, during its growth, its use in technological processes or during its storage.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante “composición de la invención”, que comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa de Enterococcus sp. CECT30012, o el cultivo bacteriano puro que comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa de Enterococcus sp. CECT30012.Another aspect of the invention relates to a composition, hereinafter "composition of the invention”, which comprises any of the bacterial strains of the invention, preferably the strain of Enterococcus sp. CECT30012, or the pure bacterial culture comprising any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012.

En una realización preferida, esta composición de la invención además comprende un vehículo y/o excipiente biológicamente aceptable.In a preferred embodiment, this composition of the invention further comprises a biologically acceptable carrier and/or excipient.

El vehículo o excipiente biológicamente aceptable puede ser de origen natural o artificial, y debe ser compatible con el mantenimiento in vitro y almacenamiento de las cepas bacterianas de la invención, es decir, no debe comprometer su viabilidad y funcionalidad. Preferiblemente, el excipiente biológicamente aceptable es alginato.The biologically acceptable vehicle or excipient can be of natural or artificial origin, and must be compatible with the in vitro maintenance and storage of the bacterial strains of the invention, that is, it must not compromise their viability and functionality. Preferably, the biologically acceptable excipient is alginate.

En otra realización preferida, la composición de la invención comprende la cepa de Enterococcus sp. CECT30012, o el cultivo bacteriano puro que comprende dicha cepa, y además la cepa bacteriana de Achromobacter sp. CECT30013 y la cepa bacteriana de Pseudomonas aeruginosa CECT30014, donde la proporción de cada una de las cepas en la composición, con respecto a la cantidad total de cepas bacterianas presentes en la composición, es de 6,9% de Achromobacter sp. CECT30013, 64,5% de Enterococcus sp. CECT30012 y 28,6% de Pseudomonas aeruginosa CECT30014.In another preferred embodiment, the composition of the invention comprises the strain of Enterococcus sp. CECT30012, or the pure bacterial culture comprising said strain, and further the bacterial strain of Achromobacter sp. CECT30013 and the bacterial strain of Pseudomonas aeruginosa CECT30014, where the proportion of each of the strains in the composition, with respect to the total amount of bacterial strains present in the composition, is 6.9% of Achromobacter sp. CECT30013, 64.5% Enterococcus sp. CECT30012 and 28.6% Pseudomonas aeruginosa CECT30014.

La composición de la invención que comprende las cepas de Achromobacter sp. CECT30013, Enterococcus sp. CECT30012 y P. aeruginosa CECT30014 en los citados porcentajes ha demostrado ser la más eficiente en la degradación de los dos componentes del fluido calorportador HTF de entre todas las cepas ensayadas individualmente y de entre todas las combinaciones de dichas cepas ensayadas en distintos porcentajes (ver Tabla 1 de los ejemplos mostrados más adelante).The composition of the invention comprising the strains of Achromobacter sp. CECT30013, Enterococcus sp. CECT30012 and P. aeruginosa CECT30014 in the aforementioned percentages has shown to be the most efficient in the degradation of the two components of the HTF heat transfer fluid among all the strains tested individually and among all the combinations of said strains tested in different percentages (see Table 1 of the examples shown below).

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente de la cepa Enterococcus sp. CECT30012, del cultivo bacteriano puro que comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa Enterococcus sp. CECT30012, o de la composición de la invención, para la degradación, preferiblemente in situ, de bifenilo (1, 1 -Bifenilo), de óxido de difenilo (difenil éter) o de ambos (HTF). Another aspect of the invention refers to the use of any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012, from the pure bacterial culture comprising any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012, or the composition of the invention, for the degradation, preferably in situ, of biphenyl (1, 1-Biphenyl), diphenyl oxide (diphenyl ether) or both (HTF).

Por “degradación de HTF”, se entiende la degradación simultánea de los dos compuestos orgánicos presentes en esta mezcla eutéctica (bifenilo y óxido de difenilo).By "HTF degradation" is meant the simultaneous degradation of the two organic compounds present in this eutectic mixture (biphenyl and diphenyl oxide).

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente de la cepa Enterococcus sp. CECT30012, del cultivo bacteriano puro que comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa Enterococcus sp. CECT30012, o de la composición de la invención, para la biorremediación, tratamiento o descontaminación de superficies, preferiblemente suelos o agua, más preferiblemente suelos, contaminadas con bifenilo (1, 1 -Bifenilo), óxido de difenilo (difenil éter) o ambos (HTF).Another aspect of the invention refers to the use of any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012, from the pure bacterial culture comprising any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012, or the composition of the invention, for the bioremediation, treatment or decontamination of surfaces, preferably soils or water, more preferably soils, contaminated with biphenyl (1, 1-Biphenyl), diphenyl oxide (diphenyl ether) or both ( HTF).

Se entiende por “superficie” cualquier medio líquido, por ejemplo, agua, o sólido, por ejemplo, suelo, contaminados con HTF o con cualquiera de sus componentes químicos (bifenilo y óxido de difenilo).By "surface" is meant any liquid medium, for example, water, or solid, for example, soil, contaminated with HTF or with any of its chemical components (biphenyl and diphenyl oxide).

Se entiende por “biorremediación” o “biocorrección” el empleo de organismos vivos, en el contexto de la presente invención las cepas de la invención solas o en combinación, o sus cultivos puros, para eliminar, degradar o neutralizar contaminantes del suelo o del agua. Se refiere al uso de estos elementos directamente en el foco de la contaminación, mediante su inoculación al medio contaminado que se pretende tratar."Bioremediation" or "biocorrection" means the use of living organisms, in the context of the present invention the strains of the invention alone or in combination, or their pure cultures, to eliminate, degrade or neutralize contaminants from soil or water. . It refers to the use of these elements directly at the source of the contamination, by inoculating them into the contaminated environment that is intended to be treated.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método o procedimiento, de ahora en adelante “primer método de la invención”, para la biorremediación, tratamiento o descontaminación de superficies, preferiblemente suelos o agua, más preferiblemente suelos, contaminadas con bifenilo (1, 1 -Bifenilo), óxido de difenilo (difenil éter) o ambos (HTF), que comprende las siguientes etapas:Another aspect of the invention refers to a method or procedure, from now on "first method of the invention", for the bioremediation, treatment or decontamination of surfaces, preferably soils or water, more preferably soils, contaminated with biphenyl (1, 1-Biphenyl), diphenyl oxide (diphenyl ether) or both (HTF), comprising the following steps:

a. cultivar cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa Enterococcus sp. CECT30012, el cultivo bacteriano puro que comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención, preferiblemente la cepa Enterococcus sp. CECT30012, o la composición de la invención, preferiblemente hasta alcanzar una densidad de al menos 0,2 x 109 UFC/ml, más preferiblemente entre 0,5 x 109 y 1 x 109 UFC/ml, ya. cultivate any of the bacterial strains of the invention, preferably the strain Enterococcus sp. CECT30012, the pure bacterial culture comprising any of the bacterial strains of the invention, preferably the Enterococcus sp. CECT30012, or the composition of the invention, preferably until reaching a density of at least 0.2 x 109 CFU/ml, more preferably between 0.5 x 109 and 1 x 109 CFU/ml, and

b. dispensar, preferiblemente por irrigación, en la superficie, preferiblemente suelo, contaminada a tratar el cultivo obtenido tras la etapa (a). b. Dispense, preferably by irrigation, on the surface, preferably soil, contaminated to be treated, the culture obtained after step (a).

En la etapa (a) de este procedimiento el cultivo se debe llevar a cabo en un medio nutriente adecuado que tenga los componentes de HTF, es decir, bifenilo y óxido de difenilo, como única fuente de carbono, y en unas condiciones que favorezcan el crecimiento de las bacterias de la invención. Así, preferiblemente las condiciones de dicho cultivo son entre 20-30°C de temperatura, más preferiblemente 22°C, con agitación orbital constante entre 120 y 250 r.p.m., y la presencia de un medio de cultivo constituido por una concentración mínima de sales y HTF en proporción de al menos 10% (vol/vol).In stage (a) of this procedure, the culture must be carried out in a suitable nutrient medium that has the HTF components, that is, biphenyl and diphenyl oxide, as the only carbon source, and in conditions that favor the growth of the bacteria of the invention. Thus, preferably the conditions for said culture are between a temperature of 20-30°C, more preferably 22°C, with constant orbital agitation between 120 and 250 rpm, and the presence of a culture medium consisting of a minimum concentration of salts and HTF in a proportion of at least 10% (vol/vol).

Este procedimiento se puede aplicar directamente en, por ejemplo, superficies contaminadas en centrales termosolares en las que se utilice HTF como fluido caloportador (la mayoría de las centrales termolosolares en el mundo).This procedure can be applied directly to, for example, contaminated surfaces in solar thermal power plants where HTF is used as a heat transfer fluid (most of the solar thermal power plants in the world).

En otra realización preferida de este procedimiento, la irrigación de la etapa (b) se lleva a cabo en una relación de 5 ml de cultivo por gramo de suelo.In another preferred embodiment of this procedure, the irrigation of step (b) is carried out in a ratio of 5 ml of culture per gram of soil.

Como se ha explicado anteriormente, las cepas bacterianas de la invención, tras su aislamiento, fueron cultivadas bajo unas condiciones que favorecen la actividad degradadora de HTF. Así, otro aspecto de la invención se refiere a un método o procedimiento, de ahora en adelante “segundo método de la invención”, para la producción de microorganismos, preferiblemente bacterias, útiles para la degradación de bifenilo, de óxido de difenilo o de ambos (HTF), que comprende las siguientes etapas:As explained above, the bacterial strains of the invention, after their isolation, were cultivated under conditions that favor the degrading activity of HTF. Thus, another aspect of the invention refers to a method or procedure, hereinafter "second method of the invention", for the production of microorganisms, preferably bacteria, useful for the degradation of biphenyl, diphenyl oxide or both. (HTF), which includes the following stages:

a. aislar una muestra de agua o suelo, preferiblemente de 1g de suelo, contaminada con bifenilo, óxido de difenilo o ambos,a. isolate a sample of water or soil, preferably from 1g of soil, contaminated with biphenyl, diphenyl oxide or both,

b. cultivar la muestra aislada en la etapa (a) en un medio de cultivo en presencia de bifenilo, de óxido de difenilo o de ambos, a una temperatura de entre 20 y 30°C y con agitación orbital entre 120 y 250 r.p.m., preferiblemente 120 r.p.m.,b. cultivate the sample isolated in step (a) in a culture medium in the presence of biphenyl, diphenyl oxide or both, at a temperature between 20 and 30°C and with orbital agitation between 120 and 250 rpm, preferably 120 rpm,

c. realizar una o más transferencias del cultivo de la etapa (b) a medios frescos en los que se va reduciendo progresivamente la cantidad de medio de cultivo, preferiblemente sustituyéndolo por un medio mínimo de sales, y se mantiene la cantidad de bifenilo, óxido de difenilo o ambos, con el objeto de conseguir microorganismos que sean capaces de crecer en estos componentes y utilizarlos como única fuente de carbono,c. carry out one or more transfers of the culture from step (b) to fresh media in which the amount of culture medium is progressively reduced, preferably replacing it with a minimum salt medium, and the amount of biphenyl, diphenyl oxide is maintained or both, in order to obtain microorganisms that are able to grow in these components and use them as the only source of carbon,

d. repetir la etapa (c) hasta que el medio de cultivo sea eliminado por completo, e. inocular el cultivo obtenido tras la etapa (d) en un medio, preferiblemente en una muestra de suelo, comprendiendo una concentración conocida de bifenilo, óxido de difenilo o ambos, yd. repeat step (c) until the culture medium is completely removed, e. inoculate the culture obtained after step (d) in a medium, preferably in a soil sample, comprising a known concentration of biphenyl, diphenyl oxide, or both, and

f. analizar qué concentración de bifenilo, óxido de difenilo o ambos ha desaparecido tras la etapa (e).F. analyzing what concentration of biphenyl, diphenyl oxide or both has disappeared after step (e).

En una realización preferida de este segundo procedimiento, el medio de cultivo de la etapa (b) es Luria Bertani (medio LB).In a preferred embodiment of this second procedure, the culture medium of step (b) is Luria Bertani (LB medium).

En una realización más preferida, el medio de cultivo de la etapa (b) comprende bifenilo y óxido de difenilo a una concentración de al menos un 10% con respecto al volumen total del medio (vol/vol).In a more preferred embodiment, the culture medium of step (b) comprises biphenyl and diphenyl oxide at a concentration of at least 10% with respect to the total volume of the medium (vol/vol).

En otra realización preferida, las transferencias del cultivo en la etapa (c) se realizan con una frecuencia semanal.In another preferred embodiment, the culture transfers in step (c) are carried out weekly.

En otra realización preferida, la reducción progresiva de la cantidad de medio de cultivo en la etapa (c) se consigue eliminando un 10% de medio de cultivo en cada transferencia y sustituyéndolo por un medio mínimo de sales.In another preferred embodiment, the progressive reduction of the amount of culture medium in step (c) is achieved by eliminating 10% of the culture medium in each transfer and replacing it with a minimum salt medium.

Las etapas (e) y (f) tienen como objeto comprobar que el/los microorganismo/s presentes en el cultivo obtenido tras la etapa (d) no solo son resistentes a los componentes de1HTF sino que también son capaces de degradarlo. Para ello, preferiblemente, se compara el porcentaje de biodegradación en medios contaminados con HTF e inoculados con el cultivo resultante de la etapa (d) frente a un control (medio contaminado con la misma cantidad de HTF, pero sin la inoculación de dicho cultivo) y se analiza la concentración de los dos componentes del HTF al inicio del experimento (t=0) y a tiempo t (siendo t entre 7-15 días).Steps (e) and (f) are intended to verify that the microorganism(s) present in the culture obtained after step (d) are not only resistant to the components of 1HTF but are also capable of degrading it. To do this, preferably, the percentage of biodegradation in media contaminated with HTF and inoculated with the culture resulting from step (d) is compared to a control (medium contaminated with the same amount of HTF, but without the inoculation of said culture) and the concentration of the two HTF components is analyzed at the beginning of the experiment (t=0) and at time t (t being between 7-15 days).

En otra realización preferida, el análisis de la etapa (f) se realiza transcurridos entre 7 y 15 días del inóculo de la etapa (e), preferiblemente 15 días.In another preferred embodiment, the analysis of step (f) is carried out between 7 and 15 days after the inoculum of step (e), preferably 15 days.

En otra realización preferida del segundo procedimiento de la invención, se realizan paralelamente uno o varios controles negativos consistentes en medios, preferiblemente muestras de suelo, comprendiendo la misma concentración de bifenilo, óxido de difenilo o ambos que el medio empleado en la etapa (e), pero donde no se inocula el cultivo obtenido tras la etapa (d). Posteriormente, se analiza la concentración de bifenilo, óxido de difenilo o ambos que ha desaparecido en estos controles negativos y se compara con la obtenida en la etapa (f).In another preferred embodiment of the second method of the invention, one or more negative controls consisting of media, preferably soil samples, comprising the same concentration of biphenyl, diphenyl oxide or both as the medium used in step (e) are performed in parallel. , but where the culture obtained after step (d) is not inoculated. Subsequently, the concentration of biphenyl, diphenyl oxide or both that has disappeared in these negative controls is analyzed and compared with that obtained in the stage (f).

Si finalmente se comprueba que la concentración de HTF en los experimentos inoculados es significativamente inferior a la obtenida en el control negativo, se concluye que el cultivo empleado y obtenido tras la etapa (d) comprende microorganismos capaces de degradar HTF y se procederá al aislamiento e identificación de los mismos.If it is finally verified that the concentration of HTF in the inoculated experiments is significantly lower than that obtained in the negative control, it is concluded that the culture used and obtained after step (d) comprises microorganisms capable of degrading HTF and will proceed to the isolation and identification of them.

Posteriormente, se podrá opcionalmente proceder a determinar qué número de células, o volumen de cultivo, es necesario adicionar por gramo o kg o litro de superficie contaminada para una biorremediación eficiente. El tamaño de los inóculos, esto es, la relación entre el número de células (o unidades formadoras de colonias -UFC-) por unidad de peso de suelo (ejemplo, n° de células/g suelo) o litro de agua, variará en función del grado de contaminación de la superficie a tratar.Subsequently, it will be possible to optionally proceed to determine what number of cells, or culture volume, is necessary to add per gram or kg or liter of contaminated surface for efficient bioremediation. The size of the inocula, that is, the relationship between the number of cells (or colony-forming units -CFU-) per unit weight of soil (for example, number of cells/g soil) or liter of water, will vary depending on the depending on the degree of contamination of the surface to be treated.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and claims the word "comprise" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. Other objects, advantages and features of the invention will be apparent to those skilled in the art in part from the description and in part from the practice of the invention. The following examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

EJEMPLOSEXAMPLES

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que ponen de manifiesto la efectividad de las cepas de la invención y su combinación (consorcio) en la degradación de HTF.Next, the invention will be illustrated by means of tests carried out by the inventors that show the effectiveness of the strains of the invention and their combination (consortium) in the degradation of HTF.

EJEMPLO 1. OBTENCIÓN DE BACTERIAS RESISTENTES A BIFENILO Y ÓXIDO DE DIFENILO (HTF).EXAMPLE 1. OBTAINING BACTERIA RESISTANT TO BIPHENYL AND DIPHENYL OXIDE (HTF).

La primera parte de la invención consistió en la obtención de bacterias resistentes a bifenilo y óxido de difenilo (HTF). Para ello, se tomó una muestra de en torno a 1 g de suelo contaminado con HTF y se transfirió a 100 ml de un medio de cultivo preparado con medio LB (medio Luria Bertani), que es un medio generalista para el crecimiento de bacterias heterótrofas cuya composición es: 10 g/l de peptona; 5 g/l de extracto de levadura y 10 g/l de NaCl, a pH 7. The first part of the invention consisted in obtaining bacteria resistant to biphenyl and diphenyl oxide (HTF). To do this, a sample of around 1 g of soil contaminated with HTF was taken and transferred to 100 ml of a culture medium prepared with LB medium (Luria Bertani medium), which is a general medium for the growth of heterotrophic bacteria whose composition is: 10 g/l of peptone; 5 g/l of yeast extract and 10 g/l of NaCl, at pH 7.

Además, se adicionó un 10% (vol/vol) de HTF. Este cultivo se mantuvo en agitación orbital a 120 r.p.m. y temperatura ambiente (22°C aproximadamente).In addition, 10% (vol/vol) of HTF was added. This culture was kept in orbital shaking at 120 r.p.m. and room temperature (approximately 22°C).

Cuando se comprobó, al cabo de una semana aproximadamente, que había habido crecimiento de bacterias resistentes a los componentes del HTF en estas condiciones, se transfirió un 10% de este cultivo a un nuevo medio en el que la proporción de LB se había reducido en un 10%, dejando de nuevo que el cultivo prosperase. El volumen de LB eliminado se sustituyó por un medio mínimo de sales. Este proceso se repitió sucesivamente hasta conseguir eliminar el LB y el cultivo final se preparó con un medio mínimo de sales y HTF al 10%, exclusivamente.When it was verified, after approximately one week, that there had been growth of bacteria resistant to HTF components under these conditions, 10% of this culture was transferred to a new medium in which the proportion of LB had been reduced by 10%, again allowing the crop to prosper. The volume of LB removed was replaced by minimal salt medium. This process was repeated successively until the LB was eliminated and the final culture was prepared with a minimum salt medium and 10% HTF, exclusively.

A continuación, se comprobó que las bacterias así obtenidas eran capaces de degradar los componentes del HTF y transformar el bifenilo y óxido de difenilo a compuestos sencillos de carbono (CO 2 ) y compuestos que las bacterias puedan asimilar. Para comprobar esta capacidad de biodegradación, se prepararon cultivos de concentración conocida de HTF y se analizó qué concentración de HTF había desaparecido en cultivos inoculados al cabo de un periodo de entre 7-15 días en comparación con controles sin inóculo. En el caso de que la degradación no fuera efectiva debería comenzarse de nuevo con la obtención de nuevas muestras de suelo.Next, it was found that the bacteria thus obtained were capable of degrading the HTF components and transforming biphenyl and diphenyl oxide into simple carbon compounds (CO 2 ) and compounds that bacteria can assimilate. To verify this biodegradation capacity, cultures of known concentration of HTF were prepared and the concentration of HTF that had disappeared in inoculated cultures after a period of between 7-15 days compared to controls without inoculum was analyzed. In the event that the degradation is not effective, it should begin again with the obtaining of new soil samples.

EJEMPLO 2. ENSAYO DE BIORREMEDIACIÓN DE CONTAMINACIÓN POR HTF.EXAMPLE 2. BIOREMEDIATION TEST OF CONTAMINATION BY HTF.

Se procedió a inocular una disolución preparada con HTF al 10% con el cultivo final obtenido en el Ejemplo 1. El tamaño del inóculo inicial fue de 1.000.000 células/ml. Paralelamente, se preparó otra disolución similar pero sin bacterias. Se tomaron muestras de cada una de las disoluciones y se congelaron a la espera de su posterior análisis.A solution prepared with 10% HTF was inoculated with the final culture obtained in Example 1. The initial inoculum size was 1,000,000 cells/ml. In parallel, another similar solution was prepared but without bacteria. Samples of each of the solutions were taken and frozen pending further analysis.

Al cabo de 15 días se tomaron sendas muestras de cultivo y control y se procedió a analizar la concentración de bifenilo y óxido de difenilo en estos cultivos y en los preservados por congelación (representativos del tiempo t = 0). Así, se comprobó que el cultivo era capaz de eliminar la concentración de bifenilo y de óxido de difenilo con una eficacia del 95 y 92%, respectivamente.After 15 days, culture and control samples were taken and the concentration of biphenyl and diphenyl oxide in these cultures and in those preserved by freezing (representative of time t = 0) were analyzed. Thus, it was found that the culture was capable of eliminating the concentration of biphenyl and diphenyl oxide with an efficiency of 95 and 92%, respectively.

Una vez comprobada la capacidad del cultivo para resistir y degradar HTF se procedió a la identificación de las especies bacterianas presentes en el mismo mediante la secuenciación del gen ARNr 16S, resultando que el cultivo estaba formado por cepas de Achromobacter sp., Enterococcus sp. y Pseudomonas aeruginosa, las cuales fueron depositadas bajo el Tratado de Budapest como se ha indicado anteriormente.Once the capacity of the culture to resist and degrade HTF was verified, the bacterial species present in it were identified by means of sequencing. of the 16S rRNA gene, resulting in the culture being made up of strains of Achromobacter sp., Enterococcus sp. and Pseudomonas aeruginosa, which were deposited under the Budapest Treaty as indicated above.

Posteriormente, se realizó un inóculo con el cultivo de la invención en un suelo contaminado artificialmente con 20.000 mg/l de HTF. La simulación se hizo en un volumen de 1 m3 de suelo. Se adicionaron 5 ml de cultivo/g de suelo que contenían 109 UFC/g suelo, mediante un sistema de irrigación. Se tomó una muestra de suelo antes de realizar el inóculo y una vez adicionado éste, se dejó actuar a las bacterias por un periodo de 15 días, al cabo de los cuales se tomó una muestra de suelo nuevamente, encontrándose que el porcentaje de eliminación de bifenilo y de óxido de difenilo fue de 97 y 94%, respectivamente.Subsequently, an inoculum was made with the culture of the invention in soil artificially contaminated with 20,000 mg/l of HTF. The simulation was done in a volume of 1 m3 of soil. 5 ml of culture/g of soil containing 109 CFU/g soil were added through an irrigation system. A soil sample was taken before making the inoculum and once it was added, the bacteria were allowed to act for a period of 15 days, after which a soil sample was taken again, finding that the percentage of elimination of biphenyl and diphenyl oxide was 97 and 94%, respectively.

EJEMPLO 3. ENSAYO PARA IDENTIFICAR LAS BACTERIAS MÁS EFECTIVAS EN LA BIORREMEDIACIÓN DE CONTAMINACIÓN POR HTF.EXAMPLE 3. TEST TO IDENTIFY THE MOST EFFECTIVE BACTERIA IN THE BIOREMEDIATION OF HTF CONTAMINATION.

Finalmente, se realizó un ensayo para evaluar el porcentaje de degradación de los compuestos 1,1'- Bifenilo y difenil éter usando:Finally, a test was carried out to evaluate the degradation percentage of the 1,1'-Biphenyl and diphenyl ether compounds using:

- Únicamente la cepa de Enterococcus sp. obtenida en los ejemplos previos y depositada en la CECT bajo el número de acceso CECT30012.- Only the strain of Enterococcus sp. obtained in the previous examples and deposited in the CECT under the access number CECT30012.

- Únicamente la cepa de Achromobacter sp. obtenida en los ejemplos previos y depositada en la CECT bajo el número de acceso CECT30013.- Only the strain of Achromobacter sp. obtained in the previous examples and deposited in the CECT under the access number CECT30013.

- Únicamente la cepa de Pseudomonas aeruginosa obtenida en los ejemplos previos y depositada en la CECT bajo el número de acceso CECT30014.- Only the strain of Pseudomonas aeruginosa obtained in the previous examples and deposited in the CECT under the access number CECT30014.

- Consorcio bacteriano comprendiendo Achromobacter sp. CECT30013, Pseudomonas aeruginosa CECT30014 y Enterococcus sp. CECT30012 en diferentes proporciones para determinar cuál de las combinaciones era la más eficaz.- Bacterial consortium comprising Achromobacter sp. CECT30013, Pseudomonas aeruginosa CECT30014 and Enterococcus sp. CECT30012 in different proportions to determine which of the combinations was the most effective.

Para los experimentos se partió de un medio (el mismo que se utilizó en los ejemplos previos) comprendiendo un medio mínimo de sales y una concentración de HTF al 10% (vol/vol). Posteriormente, se prepararon los cultivos indicados en la Tabla 1 más abajo (todos con 100 ml de este medio y un inóculo de 1.000.000 células/ml). Los cultivos se mantuvieron en agitación orbital a 120 r.p.m y a 30°C. Los resultados mostrados en la Tabla 1 corresponden a la biodegradación de HTF a los 15 días. For the experiments, a medium (the same as that used in the previous examples) was started, comprising a minimum medium of salts and a concentration of HTF at 10% (vol/vol). Subsequently, the cultures indicated in Table 1 below were prepared (all with 100 ml of this medium and an inoculum of 1,000,000 cells/ml). The cultures were kept in orbital shaking at 120 rpm and at 30°C. The results shown in Table 1 correspond to the biodegradation of HTF at 15 days.

Tabla 1:Table 1:

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Se pudo comprobar que el monocultivo formado exclusivamente por Enterococcus sp. CECT30012 es el que mejor resultados proporcionó de entre todos los monocultivos ensayados, y que el consorcio que mejor funcionó fue aquel que estaba formado por la combinación de Achromobacter sp. CECT30013, Enterococcus sp. CECT30012 y Pseudomonas aeruginosa CECT30014 en proporciones 6,9%; 64,5% y 28,6%, respectivamente, es decir, un consorcio en el que predominaba la presencia de Enterococcus sp. CECT30012.It was found that the monoculture formed exclusively by Enterococcus sp. CECT30012 is the one that provided the best results among all the monocultures tested, and that the consortium that worked best was the one that was formed by the combination of Achromobacter sp. CECT30013, Enterococcus sp. CECT30012 and Pseudomonas aeruginosa CECT30014 in proportions of 6.9%; 64.5% and 28.6%, respectively, that is, a consortium in which the presence of Enterococcus sp. CECT30012.

El consorcio que peor funcionó fue aquel en el que predominaba la especie Achromobacter. Cuando la especie que predominaba era Pseudomonas, se obtuvieron unos rendimientos intermedios. The worst-performing consortium was the one in which the Achromobacter species predominated. When the predominant species was Pseudomonas , intermediate yields were obtained.

Claims (9)

REIVINDICACIONES 1. Una cepa bacteriana de Enterococcus sp. aislada y depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT30012.1. A bacterial strain of Enterococcus sp. isolated and deposited in the Spanish Collection of Type Cultures with deposit number CECT30012. 2. Un cultivo bacteriano puro que comprende la cepa según la reivindicación 1.2. A pure bacterial culture comprising the strain according to claim 1. 3. Una composición que comprende la cepa según la reivindicación 1, o el cultivo bacteriano puro según la reivindicación 2.3. A composition comprising the strain according to claim 1, or the pure bacterial culture according to claim 2. 4. La composición según la reivindicación 3, que además comprende un vehículo y/o excipiente biológicamente aceptable.4. The composition according to claim 3, further comprising a biologically acceptable carrier and/or excipient. 5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, que además comprende una cepa bacteriana de Achromobacter sp. depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT30013 y una cepa bacteriana de Pseudomonas aeruginosa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT30014, donde la proporción de cada una de las cepas en la composición, con respecto a la cantidad total de cepas bacterianas presentes en la composición, es de 6,9% de Achromobacter sp. CECT30013, 64,5% de Enterococcus sp. CECT30012 y 28,6% de Pseudomonas aeruginosa CECT30014.5. The composition according to any of claims 3 or 4, further comprising a bacterial strain of Achromobacter sp. deposited in the Spanish Type Culture Collection with deposit number CECT30013 and a bacterial strain of Pseudomonas aeruginosa deposited in the Spanish Type Culture Collection with deposit number CECT30014, where the proportion of each of the strains in the composition, with Regarding the total amount of bacterial strains present in the composition, it is 6.9% of Achromobacter sp. CECT30013, 64.5% Enterococcus sp. CECT30012 and 28.6% Pseudomonas aeruginosa CECT30014. 6. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del cultivo bacteriano puro según la reivindicación 2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para la degradación de bifenilo, de óxido de difenilo o de ambos.6. Use of the strain according to claim 1, of the pure bacterial culture according to claim 2 or of the composition according to any of claims 3 to 5 for the degradation of biphenyl, diphenyl oxide or both. 7. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del cultivo bacteriano puro según la reivindicación 2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para la biorremediación de suelos contaminados con bifenilo, óxido de difenilo o ambos.7. Use of the strain according to claim 1, of the pure bacterial culture according to claim 2 or of the composition according to any of claims 3 to 5 for the bioremediation of soils contaminated with biphenyl, diphenyl oxide or both. 8. Método para la biorremediación de suelos contaminados con bifenilo, óxido de difenilo o ambos, que comprende las siguientes etapas:8. Method for the bioremediation of soils contaminated with biphenyl, diphenyl oxide or both, comprising the following stages: a. cultivar la cepa según la reivindicación 1, el cultivo bacteriano puro según la reivindicación 2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, preferiblemente hasta alcanzar una densidad de al menos 0,2 x 109 UFC/ml, y b. irrigar la superficie del suelo contaminado a tratar con el cultivo obtenido tras la etapa (a).a. cultivating the strain according to claim 1, the pure bacterial culture according to claim 2 or the composition according to any of claims 3 to 5, preferably until reaching a density of at least 0.2 x 109 CFU/ml, and b. irrigating the surface of the contaminated soil to be treated with the crop obtained after step (a). 9. El método según la reivindicación 8, donde la irrigación de la etapa (b) se lleva a cabo en una relación de 5 ml de cultivo por gramo de suelo. 9. The method according to claim 8, wherein the irrigation of step (b) is carried out in a ratio of 5 ml of culture per gram of soil.
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