ES2839085T3 - Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2) y sindecan-1 (SDC1) como biomarcadores para pacientes con linfoma de Hodgkin con mal pronóstico - Google Patents

Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2) y sindecan-1 (SDC1) como biomarcadores para pacientes con linfoma de Hodgkin con mal pronóstico Download PDF

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Abstract

Un método para predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en un sujeto tratado con un primer régimen de tratamiento que comprende: (a) proporcionar una muestra aislada del sujeto y una muestra aislada de un sujeto de control con buen pronóstico clínico; (b) aislar el ARN total que comprende ARN de CD30, ARN del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2), ARN de TGFβ1, ARN de MMP9 y ARN de Sindecan-1 (SDC1) de la muestra aislada del sujeto y de la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFβ1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto y en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFβ1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la etapa (d) en la muestra aislada del sujeto con el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFβ1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la etapa (d) en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFβ1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFβ1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico es indicativo de recurrencia de LH en el sujeto; (f) predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en el sujeto basándose en la etapa (e).

Description

DESCRIPCIÓN
Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2) y sindecan-1 (SDC1) como biomarcadores para pacientes con linfoma de Hodgkin con mal pronóstico
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad con respecto a la solicitud provisional número 61/949.629 (presentada el 7 de marzo de 2014).
Campo de la invención
La invención descrita se refiere en general al linfoma de Hodgkin (LH).
Antecedentes
El linfoma de Hodgkin (antes enfermedad de Hodgkin) es un linfoma potencialmente curable con características histológicas, biológicas y clínicas distintas. La enfermedad se define en términos de su apariencia microscópica (histología) y la expresión de marcadores de superficie celular (inmunofenotipo).
Hay 5 tipos de linfoma de Hodgkin clasificados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Jaffe, ES, et al Eds. World Health Organization Classification of Tumours: Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon Francia: IARC Press; 2001). Con esclerosis nodular, con celularidad mixta, con depleción linfocítica y rico en linfocitos son los 4 tipos denominados linfoma de Hodgkin clásico (LHc). El quinto tipo, linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular (NLPHL), es una entidad distinta con características clínicas únicas y un paradigma de tratamiento diferente.
El LH clásico (LHc) es una neoplasia linfoide monoclonal que, en casi todos los casos, parece derivar de células B pos-centro germinal. El sello inmunohistoquímico (IHQ) de las células tumorales del LH es la expresión del antígeno CD30. El fenotipo morfológico de LHc comprende un número inusualmente pequeño (< 2 %) de células mononucleares de Hodgkin (H) y células de Reed-Sternberg (RS) multinucleadas que residen en un amplio trasfondo inflamatorio, que se compone principalmente de linfocitos T, histocitos, eosinófilos, células plasmáticas y macrófagos. Este trasfondo inflamatorio en el microambiente tumoral es mantenido por las quimiocinas y citocinas derivadas de células de Hodgkin y Reed-Sternberg (HRS) que reclutan los componentes celulares del microambiente tumoral. La composición del microambiente tumoral o el fenotipo molecular de las células HRS, o ambos, se cree que determina la agresividad relativa del LHc a nivel individual. (Gharbaran et al., "Fibroblast growth factor-2 (FGF2) and syndecan-1 (SDC1) are potential biomarkers for putative circulating CD15+/CD30+ cells in poor outcome Hodgkin Lymphoma patients". Journal of Hematology & Oncology, 2013, 6:62)
En el linfoma de Hodgkin clásico, la célula neoplásica es la célula de Reed-Sternberg, que es un linfocito grande anómalo que puede contener más de un núcleo. (Thomas, RK et al., Part I: Hodgkin's lymphoma-molecular biology of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Lancet Oncol. Ene. 2004; 5(1): 11-18; Re, D, et al, Molecular pathogenesis of Hodgkin's lymphoma. J. Clin. Oncol. 10 de Sept. de 2005; 23(26): 6379-86). Las células de Reed-Sternberg comprenden solo el 1-2 % de la masa total de células tumorales. El resto está compuesto por una variedad de células inflamatorias mixtas reactivas que consisten en linfocitos, células plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos e histiocitos. Las células de Reed-Sternberg expresan consistentemente antígenos CD30 (Ki-1) y CD15 (Leu-M1). CD30 es un marcador de activación de linfocitos expresado por células linfoides reactivas y malignas. CD15 es un marcador de granulocitos tardíos, monocitos y linfocitos T activados que normalmente no se expresan en células de linaje B.
Linfoma de Hodgkin con esclerosis nodular (NSHL)
En el NSHL, que constituye el 60-80 % de todos los casos de linfoma de Hodgkin, la morfología muestra un patrón nodular. Anchas bandas de fibrosis dividen el ganglio en nódulos y la cápsula se engrosa. La célula característica es la célula de Reed-Sternberg de tipo lacunar, que tiene un núcleo monolobulado o multilobulado, un pequeño nucleolo y abundante citoplasma pálido.
Linfoma de Hodgkin con celularidad mixta (MCHL)
En el MCHL, que constituye el 15-30 % de los casos, el infiltrado suele ser difuso. Las células de Reed-Sternberg son del tipo clásico (grandes, con núcleo bilobulado, doble o múltiple y un nucleolo eosinofílico grande). El MCHL comúnmente afecta a los ganglios linfáticos abdominales y al bazo. Los pacientes con esta histología suelen tener enfermedad en estadio avanzado con síntomas sistémicos. El MCHL es el tipo histológico que se observa con mayor frecuencia en pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Linfoma de Hodgkin con depleción linfocítica (LDHL)
El LDHL constituye menos del 1 % de los casos de linfoma de Hodgkin. El infiltrado en LDHL es difuso y con frecuencia parece hipocelular. Hay un gran número de células de Reed-Sternberg y variantes sarcomatosas extrañas.
El LDHL está asociado con la edad avanzada y el estado de VIH positivo. Los pacientes suelen presentarse con enfermedad en estadio avanzado. Las proteínas del virus de Epstein-Barr (VEB) se expresan en muchos de estos tumores. Muchos casos de LDHL diagnosticados en el pasado eran en realidad linfomas no de Hodgkin, a menudo del tipo de células grandes anaplásicas.
Linfoma de Hodgkin clásico rico en linfocitos (LRHL)
El LRHL constituye el 5 % de los casos. En el LRHL, se observan células de Reed-Sternberg del tipo clásico o lacunar, con un infiltrado de fondo de linfocitos. Requiere diagnóstico inmunohistoquímico. Algunos casos pueden tener un patrón nodular. Clínicamente, los patrones de presentación y supervivencia son similares a los de MCHL. Linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular
El linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares (LHPLN) constituye el 5 % de los casos de linfoma de Hodgkin. Es una entidad clínica distinta y no se considera parte del linfoma de Hodgkin clásico. Las células de Reed-Sternberg típicas son poco frecuentes o están ausentes en el NLPHL. En cambio, las células linfocíticas e histiocíticas (LeH), o "células en palomitas de maíz" (sus núcleos se asemejan a un grano de maíz explotado), se ven dentro de un fondo de células inflamatorias, que son predominantemente linfocitos benignos. A diferencia de las células de Reed-Sternberg, las células LeH son positivas para antígenos de linfocitos B, como CD20, y son negativos para CD15 y CD30. Un diagnóstico de NLPHL debe estar respaldado por estudios inmunohistoquímicos, porque puede parecer similar al LRHL o incluso a algunos linfomas no de Hodgkin.
Etiología
Se desconoce la etiología del linfoma de Hodgkin. Los agentes infecciosos, particularmente el virus de Epstein-Barr (VEB), pueden estar involucrados en la patogenia. Según el estudio, los datos muestran que hasta un 30 % de los casos de linfoma de Hodgkin clásico pueden ser positivos para las proteínas del VEB. (Staal, SP, et al, A survey of Epstein-Barr virus DNA in lymphoid tissue. Frequent detection in Hodgkin's disease. Am. J. Clin. Pathol. Enero de 1989; 91(1): 1-5). Además, un estudio de casos y controles respalda un mayor riesgo de linfoma de Hodgkin clásico después de la infección por VEB, con un riesgo de aproximadamente 1 en 1000 casos. (Hjalgrim, H., et al, Characteristics of Hodgkin's lymphoma after infectious mononucleosis. N. Eng. J. Med. 2 de Oct., 2003; 349 (14): 1324-32). La incidencia de positividad para el VEB varía según el subtipo. El linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares (NLPHL) rara vez expresa proteínas del VEB (Weiss, LM, et al, Epstein-Barr virus and Hodgkin's disease. A correlative in situ hybridization and polymerase chain reaction study. Am. J. Pathol. Dic. de 1991; 139(6): 1259-65), mientras que en el linfoma de Hodgkin clásico, la positividad al VEB es más común en la variante de celularidad mixta. (Pallesen, G et al., Expression of Epstein-Barr virus latent gene products in tumour cells of Hodgkin's disease. Lancet: 9 de Feb., 1991; 337 (8737): 320-322). Sin embargo, se desconoce el mecanismo exacto por el cual el VEB puede provocar el linfoma de Hodgkin.
Los pacientes VIH positivos también tienen una mayor incidencia de linfoma de Hodgkin en comparación con los pacientes VIH negativos. Sin embargo, el linfoma de Hodgkin no se considera una neoplasia definitoria de SIDA. La predisposición genética juega un papel en la patogenia del linfoma de Hodgkin. Aproximadamente el 1 % de los pacientes con linfoma de Hodgkin tienen antecedentes familiares de la enfermedad y los hermanos de una persona afectada tienen un riesgo de 3 a 7 veces mayor de desarrollar la enfermedad. (Goldin, LR et al, Familial aggregation of Hodgkin lymphoma and related tumors Cancer, 1 de mayo, 2004 100(9): 1902-1908). La mayor parte de la evidencia de una etiología genética se ha establecido en el subtipo distinto de linfoma de Hodgkin no esclerosante (NSHL). Se ha demostrado que el NSHL es uno de los tipos de neoplasia más hereditarios con un riesgo 100 veces mayor en gemelos idénticos. Harty, LC et al, HLA-DR, HLA-DQ and TAP genes in familia1Hodgkin disease. Blood, 15 de enero, 2002; 99(2): 690-93; Mack, TM et al, Concordance for Hodgkin's disease in identical twins suggesting genetic susceptibility to the young-adult form of the disease. N. Engl. J. Med. 16 de Feb., 1995; 332(7): 413-18). Existe evidencia de que el NSHL puede dar como resultado una respuesta inmunitaria atípica a un virus u otro desencadenante, y que está involucrada una respuesta inmunogénica atípica. (Mueller, NE y Grufferman, S. Hodgkin lymphoma. En Schottenfield, D., Fraumeni, JF, Jr. Eds. Cancer Epidemiology and Prevention. Nueva York, NY: Oxford Univ. Press; 2006: 872-97). Durante décadas, se conocen genotipos específicos de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II, incluyendo HLA-DRB1 y HLA-DQB1, que están asociados con el NSHL, y esto ha sido confirmado por estudios de asociación de todo el genoma. (Cozen, W et al, A genome-wide meta-analysis of nodular sclerosing Hodgkin lymphoma identifies risk loci at 6p21.32. Blood. 12 de enero, 2012; 119 (2): 469-75; Enciso-Mora, V et al, A genome-wide association study of Hodgkin's lymphoma identifies new susceptibility loci at 2p16.1 (REL), 8q24.21 and 10p14 (GATA3). Natl Genet. diciembre de 2010: 42(12): 1126-30). Varios polimorfismos de un solo nucleótido en la región 6p21.32, que es rico en genes asociados con la función inmunológica, también se han asociado con el riesgo de NSHL. (Cozen, W et al, A genome-wide meta-analysis of nodular sclerosing Hodgkin lymphoma identifies risk loci at 6p21.32. Blood. 12 de enero, 2012; 119 (2): 469-75).
La clasificación de Ann Arbor se ha utilizado para describir el estadio de la enfermedad de Hodgkin en la presentación inicial. Esta clasificación se modificó para modificar la clasificación a la luz de la experiencia y nuevas técnicas para evaluar la enfermedad. Como resultado, se recomendó que se incluyese la tomografía computarizada (TC) como técnica de evaluación de los ganglios linfáticos intratorácicos e infradiafragmáticos; que se modificasen los criterios para la afectación clínica del bazo y el hígado para incluir evidencia de defectos focales con dos técnicas de imagen, y que se ignorasen las anomalías de la función hepática; que se introduzca el sufijo "X" para designar enfermedad voluminosa (dimensión máxima superior a 10 cm); y que se introdujese una nueva categoría de respuesta a la terapia, remisión completa no confirmada/incierta [RC[nc]] para adaptarse a la dificultad de las anomalías radiológicas persistentes de significado incierto. (Lister, TA, et al, J Clin. Oncol. Noviembre de 1989; 7(11): 1630-36). El sistema de estadificación de Ann Arbor modificado de Cotswolds para el linfoma de Hodgkin se muestra en la Tabla 1. Las regiones de afectación de los nódulos linfáticos se indican con una designación E. Las designaciones A y B denotan la ausencia o presencia de síntomas, respectivamente; la presencia de síntomas se correlaciona con la respuesta al tratamiento.
Figure imgf000004_0003
Además del estadio de la enfermedad, muchos factores contribuyen a la probabilidad de supervivencia del linfoma de Hodgkin. La siguiente tabla, que incluye datos de 3 organizaciones (el German Study Hodgkin Lymphoma Study Group (GSHG), la European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) y el National Cancer Institute of Canada (NCIC)), muestra ejemplos de factores de riesgo desfavorables para los estadios I y II.
Figure imgf000004_0002
Tabla 3. Distribución por estadios y supervivencia relativa a 5 años por estadio en el momento del
-
Figure imgf000004_0001
Basándose en estos criterios, los pacientes se clasifican de la siguiente manera:
LH favorable en estadio temprano (incluye pacientes con LH en estadio I o II y sin factores de riesgo según GSHG/EORTC o NCIC)
LH desfavorable en estadio temprano (incluye pacientes con LH en estadio I y II y uno o más factores de riesgo) LH en estadio avanzado (incluye pacientes con estadio IIB, III y IV)
Los pacientes con enfermedad avanzada se estratifican aún más en función del riesgo mediante la puntuación internacional de pronóstico (IPS), que incluye los siguientes factores de riesgo (por cada factor presente, el paciente recibe 1 punto) (Hasenclever, D y Diehl, V, "A Prognostic score for advanced Hodgkin's disease. Intl prognostic factors project on advanced Hodgkin's disease, N. Eng. J. Med. Noviembre de 1998; 339 (21): 1506-14):
Albúmina < 4 g/dl
Hemoglobina < 10,5 g/dl
Varón
Edad > 45 años
Enfermedad en estadio IV
Leucocitosis: recuento de glóbulos blancos (CGB)> 15.000/pl
Linfopenia: recuento de linfocitos < 8 % del recuento de leucocitos y/o recuento absoluto de linfocitos < 600 células/pl
Según la puntuación IPS, los pacientes con enfermedad avanzada se pueden clasificar de la siguiente manera: • Alto riesgo (IPS 0-1)
• Riesgo moderado (IPS 2-3)
• Bajo riesgo (IPS 4-7)
Aunque se introdujo la puntuación de pronóstico internacional para mejorar la estratificación del riesgo de los pacientes, su aplicabilidad es limitada para predecir pacientes con LH clásico de alto riesgo, independientemente del estadio clínico.
Hasta el 20 % de los pacientes con linfoma de Hodgkin (LH) son refractarios al tratamiento (refractarios primarios) o experimentan una recaída dentro de los cuatro años (recaída temprana) después de lograr la remisión completa (RC); esta cifra incluye a pacientes que experimentan una enfermedad progresiva y pacientes con un pronóstico particularmente malo por otras razones. Solo la mitad de los pacientes con LH sobreviven dos años si falla la terapia de primera línea, y el trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (ASCT) es curativo solo en un 50 %. Si bien los pacientes de este grupo pueden beneficiarse del análisis del marcador de macrófagos CD68 asociado a tumores, que se puede utilizar para predecir los resultados adversos del LHc, la predicción es controvertida.
El tratamiento del linfoma de Hodgkin (LH) en estadio temprano ha mejorado significativamente, y el fracaso del tratamiento ocurre en aproximadamente el 10 % de los pacientes. Aunque la terapia del LH en estadio avanzado también ha mejorado, hasta el 10 % de los pacientes con LH en estadio avanzado no lograrán la remisión completa (RC) y entre el 20 % y el 30 % de los pacientes que respondieron recaen posteriormente después del tratamiento. La quimioterapia de rescate seguida de un autotrasplante de células madre (ASCT) es el tratamiento de elección en pacientes con LH recidivante o si la enfermedad es refractaria a la quimioterapia inicial. (Kuruvilla, J. et al., Blood, 2011; 117(16): 4208-4217, a 4208.)
Se han identificado factores pronósticos en cohortes de pacientes con LH en recaída o refractario (LH-RR) que se han sometido a quimioterapia de rescate y ASCT posteriores (resumidos en la Tabla 4). Se ha demostrado que el tiempo transcurrido hasta la recaída después de la terapia inicial, la etapa avanzada de la recaída y el estado de desempeño deficiente son predictores de un mal pronóstico. (Id..)
Figure imgf000005_0001
continuación
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(Tabla reproducida de: Kuruvilla, J. et al., Blood, 2011; 117(16): 4208-4217, a 4208.)
Hasta la fecha, no existen biomarcadores fiables para predecir el resultado de alto riesgo, desfavorable y precario del linfoma de Hodgkin (LH) en el momento del diagnóstico o como marcador de referencia. Dichos biomarcadores serían útiles (1) para proporcionar mejores opciones de tratamiento alternativo, por ejemplo, regímenes de dosificación a medida/personalizados, o (2) para evitar a los pacientes de un curso de tratamiento que no tiene esperanzas de funcionar desde el principio.
Las anomalías moleculares que definen un proceso de enfermedad personifican las oportunidades asociadas con los biomarcadores porque estos no son solo un criterio de diagnóstico de la enfermedad, pero también son dianas para la intervención terapéutica y sirven como medidas cuantitativas del proceso de la enfermedad que se pueden usar para monitorear la respuesta terapéutica en los individuos. Sin embargo, tales biomarcadores son raros (Meyer RM, Blood 2 de mayo, 2013 vol. 121 n.° 18 3541-3542). La lista de biomarcadores relacionados con el cáncer que tienen propiedades predictivas es corta (Meyer RM, Blood 2 de mayo, 2013 vol. 121 n.° 183541-3542; Dancey JE et al., Cell 2012; 148(3): 409-420; Hasenclever D. et al., N Engl J Med 1998; 339(21): 1506-1514). Los que se utilizan actualmente tienen una característica común: todos representan una entidad molecular que define la enfermedad o están íntimamente involucrados en el mecanismo de acción de la terapia dirigida como una membrana celular o una proteína de señalización intracelular que puede servir como sitio de unión del agente terapéutico y que afecta la maquinaria molecular descendente que finalmente determina la supervivencia del cáncer (Meyer Rm , Blood 2 de mayo, 2013 vol. 121 n.° 183541-3542).
Hasta ahora, ninguno de los biomarcadores de pronóstico asociados con eventos biológicos secundarios, incluidos los identificados en el linfoma de Hodgkin (LH), han demostrado capacidades predictivas (Steidl C. et al., J Clin Oncol 2011; 29(14): 1812-1826). Por ejemplo, aunque CD68, una proteína transmembrana de tipo I presente en los monocitos, macrófagos, osteoclastos, mastocitos, gránulos citoplásmicos, plaquetas activadas y linfocitos grandes, se ha utilizado como un biomarcador para LH (Véase, Steidl C. et al., J Clin Oncol 2011; 29(14): 1812-1826; Tabla 2 en la página 1818), su expresión no se limita al LH, es decir, CD68 no solo se expresa en linfomas anaplásicos, sino que también se expresa en células de Schwann del neuroma, en los nervios que sufren degeneración walleriana, en tumores de células mieloides y tumores epiteliales.
La invención descrita identifica biomarcadores útiles en la detección de pacientes con linfoma de Hodgkin con mala evolución clínica, en la detección de linfoma de Hodgkin recurrente y en la detección de evidencia de linfoma de Hodgkin metastásico.
El término "familia de genes FGF", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una familia de genes que consta de al menos 23 genes diferentes que codifican polipéptidos relacionados. Los FGF se expresan en casi todos los tejidos y juegan un papel importante en una variedad de procesos normales y patológicos, incluido el desarrollo, la cicatrización de heridas y la transformación neoplásica. Los FGF tienen una amplia gama de actividades biológicas que pueden desempeñar un papel en la tumorigénesis, por ejemplo, son mitógenos para muchos tipos de células, tanto epiteliales como mesenquimales; algunos FGF, como el FGF2, tienen una potente actividad angiogénica y han estado implicados como promotores de la angiogénesis tumoral; se ha demostrado que aumentan la motilidad y la invasividad de una variedad de tipos de células; y los FGF pueden inhibir la muerte celular en el contexto apropiado. (Kwabi-Addo et al., "The role of fibroblast growth factors and their receptors in prostate cancer". Endocrine-Related Cancer, 2004, 11:709-724, a 709-710.)
Se observa un aumento de la expresión de Sindecan-1 (SDC-1) en fibroblastos estromales en varios carcinomas, como los del pecho, estómago y tiroides. En un modelo de xenoinjerto de células de carcinoma de mama humano e implantación de fibroblastos transfectados con SDC-1 en ratones, la expresión estromal de SDC-1 se asoció con una densidad de microvasos significativamente elevada y un área de vasos más grande. La expresión de SDC-1 en fibroblastos estromales de carcinomas de mama humanos también se correlacionó significativamente con una alta densidad de microvasos y un área de vasos más grande. Estos hallazgos plantean la posibilidad de que SDC-1 en el estroma reactivo pueda secuestrar factores proangiogénicos y aumentar la concentración local de estos factores para promover la angiogénesis (Teng et al., "Molecular functions of syndecan-1 in disease". Matrix Biol. 2012; 31(1):3-16.).
La angiogénesis tumoral genera nuevos lechos vasculares que aportan nutrientes y oxígeno a la masa tumoral altamente metabólica. SDC-1 puede unirse a factores proangiogénicos tales como FGF-2 y VEGF, y posteriormente presentar estos factores a sus respectivos receptores en las células endoteliales para iniciar la invasión endotelial y la gemación. Las implicaciones funcionales más amplias de SDC-1 en la angiogénesis también pueden ser permitir ectodominios de SDC-1 solubles con factores proangiogénicos unidos para fomentar la angiogénesis en nichos premetastásicos. Por ejemplo, en mieloma, el desprendimiento de ectodominios de SDC-1 por heparanasa facilitó la invasión endotelial y la posterior angiogénesis. La heparanasa también regulaba positivamente HGF y VEGF en células de mieloma, y los ectodominios SDC-1 se unían a VEGF y presentaban VEGf a las células endoteliales. La unión de los ectodominios de SDC-1 a las integrinas avp3 y avp5 es aparentemente necesaria para su función proangiogénica, como un péptido inhibidor corto que imita la invasión de células endoteliales del ectodominio SDC-1, así como el crecimiento tumoral in vivo. (Teng et al., "Molecular functions of syndecan-1 in disease". Matrix Biol.
2012; 31(1):3-16). FGF2 y SDC1 se describen como posibles biomarcadores para identificar pacientes con linfoma de Hodgkin con mal pronóstico (Gharbaran et al.,"Fibroblast growth factor-2 (FGF2) and syndecan-1 (SDC1) are potential biomarkers for putative circulating CD 15+/CD 30+ cells in poor outcome Hodgkin lymphoma patients" Journal of Hematology and Oncology 2013; 6(1):62).
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto, la divulgación descrita proporciona un método para predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en un sujeto tratado con un primer régimen de tratamiento que comprende: (a) proporcionar una muestra del sujeto y una muestra de un sujeto de control con buen pronóstico clínico; (b) aislar el ARN total que comprende el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y el a Rn de sindecan-1 (SDC1) de la muestra del sujeto y de la muestra del sujeto de control con buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en el sujeto y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del a Rn de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de recurrencia de LH en el sujeto; (f) predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en el sujeto basándose en la etapa (e); y (g) tratar al sujeto con un segundo régimen de tratamiento eficaz para tratar la recurrencia de LH.
Según una realización, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una biopsia de tumor, sangre, un nódulo linfático y leucocitos de sangre periférica (LSP).
Según una realización, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Según una realización, el método para predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en un sujeto tratado con un primer régimen de tratamiento comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en el sujeto y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto con el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de TGFp1 y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de recurrencia de LH en el sujeto.
De acuerdo con otro aspecto, la invención descrita proporciona un método para predecir un mal pronóstico clínico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) que comprende: (a) proporcionar una muestra del sujeto con LH y una muestra de un sujeto de control con buen pronóstico clínico; (b) aislar el ARN total que comprende el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y el ARN de sindecan-1 (SDC1) de la muestra del sujeto con LH y de la muestra del sujeto de control con buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de mal pronóstico clínico para el sujeto con LH; (f) predecir un mal pronóstico clínico para el sujeto con LH basándose en la etapa (e); y (g) reemplazar un régimen de tratamiento que probablemente sea ineficaz por un régimen de tratamiento de reemplazo eficaz para mantener la calidad de vida del sujeto.
Según una realización, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una biopsia de tumor, sangre, un nódulo linfático y leucocitos de sangre periférica (LSP).
Según una realización, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Según una realización, el método para predecir un mal pronóstico clínico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en el sujeto y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de TGFpl y el a Rn de MMP9 expresado por el sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y el Ar N de MMP9 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de mal pronóstico clínico para el sujeto con LH.
De acuerdo con otro aspecto, la divulgación descrita proporciona un método para detectar evidencia de linfoma de Hodgkin metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) que comprende: (a) proporcionar una muestra de leucocitos de sangre periférica (LSP) del sujeto con LH y una muestra de LSP de un sujeto de control de buen resultado clínico; (b) aislar el ARN total que comprende el ARN de CD30, factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y sindecan-1 (SDC1) de la muestra de LSP del sujeto con LH y de la muestra de LSP del sujeto de control con buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico es indicativo de una metástasis en el sujeto con LH; y (f) detectar evidencia de linfoma de Hodgkin metastásico en el sujeto con LH basándose en la etapa (e), y (g) implementar un plan de tratamiento apropiado.
Según una realización, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Según una realización, el método de detección del linfoma de Hodgkin metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de CD15 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de CD15 en la etapa (d') expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de CD15 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de CD15 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de CD15 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de mal pronóstico clínico para el sujeto con 1H.
Según una realización, el método de detección de evidencia del linfoma de Hodgkin metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del a Rn de TGFpl y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de LH metastásico en el sujeto con LH.
Según una realización, la evidencia de linfoma de Hodgkin metastásico comprende una célula CD30+ en circulación con un inmunofenotipo FGF2+/SDC1+. Según otra realización, la célula CD30+ en circulación con el inmunofenotipo FGF2+/SDC1+ es un linfoma de Hodgkin y una célula de Reed-Sternberg (HRS).
Breve descripción de los dibujos
Para una comprensión más completa de la presente divulgación, se hace referencia a la siguiente descripción detallada de ejemplos de realización considerados junto con los dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra falta de asociación entre el pronóstico clínico y la estadificación del tumor, la edad, la voluminosidad, o las terapias de primera línea y la sobreexpresión de FGF2 y SDC1 por las líneas celulares de LH. Se realizó un análisis de contingencia frente a las principales características clínicas (eje y, columna derecha), incluido el estadio del tumor (p> 0,4), el grupo de edad (p> 0,11), el volumen de la enfermedad (p> 0,18) y las terapias de primera línea utilizadas (p> 0,27) para los pacientes con LH con buen pronóstico (BP) frente a mal pronóstico (MP) (eje x). Se indica el porcentaje de cada característica clínica dentro de cada grupo.
La Figura 2 muestra que FGF2 y SDC1 están sobreexpresados por las líneas celulares de LH y por las células CD30+ en el grupo de pacientes con LH con mal pronóstico. (A) La expresión de FGF2 y SDC1 en 10 líneas celulares de LH diferentes (barra negra sólida) se representa como el múltiplo de variación normalizado con respecto a los linfocitos B normales purificados (NBC, barra gris sólida). El error estándar (ES) para cada línea celular se indica encima de cada barra. (B) Puntuaciones de intensidad media cualitativa para FGF2 (barra negra sólida) y SDC1 (barra gris sólida) de tejidos inmunoteñidos en un formato de matriz que consta de 10 muestras normales, 30 de LH clásico (LHc) y 18 muestras de linfocitos predominantes-LH (LP-HL) y 116 muestras L no H (LNH) (eje y). La intensidad de la inmunotinción se puntuó como 0 (sin tinción), 1 (débil), 2 (moderada) o 3 (intensa). Se indican las barras de error estándar de la media. (C) Los niveles de expresión de ARNm de FGF2, SDC1 y CD30 en controles de nódulos linfáticos normales (CN, barra gris sólida) y tejidos de LH asociados con buen pronóstico (BP, barra rayada) y mal pronóstico (MP, barra negra sólida) se analizaron mediante qRT-PCR. Las medidas representan el múltiplo después de la normalización con el grupo CN. (D) El mismo conjunto de tejidos normales y LH de (B) fueron inmunoteñidos para FGF2, SDC1 y CD30. Se muestran pacientes normales y con BP y MP en estadio II representativos. (E) Expresión de CD20 en nódulos linfáticos normales y tejidos de LH analizados por inmunotinción. Se indica la significación de todos los datos de qRT-PCR que comparan BP y MP (p <0,005). Las barras de escala representan 100 pm.
La Figura 3 muestra que las células CD30+ coexpresan FGF2 y SDC1 en tejidos de LH ricos en macrófagos con mal pronóstico. (A) Tinción inmunofluorescente doble que muestra la expresión de FGF2 o SDC1 por células CD30+ de muestras de mal pronóstico. La fluorescencia verde o roja individual se representa en la parte inferior de cada imagen; La barra de escala (barra sólida blanca) representa 100 pm. (B) Distribución de los inmunofenotipos por pronóstico. Las puntuaciones medias de intensidad para FGF2 (barra gris sólida) y SDC1 (barra negra sólida) (eje y) para los grupos de pacientes con LH con buen pronóstico (BP) y con mal pronóstico (MP). La intensidad de la inmunofluorescencia se puntuó como 0 (sin tinción), 1 (débil), 2 (moderada) o 3 (fuerte) para FGF2+ o FGF2- y SDC1+ o SDC1-. La frecuencia (%) de expresión de cada combinación de FGF2+/- y SDC1+/- entre todas las secciones de tejido se indica encima de cada barra. (C) La expresión del marcador de macrófagos CD68 se analizó mediante inmunotinción (imagen) y qRT-PCR (gráfico) en control de nódulo linfático normal (CN), grupos de pacientes con LH con buen pronóstico (BP) y con mal pronóstico (MP). El múltiplo de variación en el ARNm de CD68 se calculó después de la normalización con CN. La significación de todos los datos de qRT-PCR que comparan BP y MP se indica para (B) y (C) (p <0,005). Las barras de escala representan 100 pm.
La Figura 4 muestra que los marcadores metastásicos TGFp1 y MMP9 se sobreexpresan en pacientes con LH y en líneas celulares de LH con mal pronóstico. (A) Niveles de expresión de proteínas y ARNm de TGFp1 y MMP9 en el control de los nódulos linfáticos normales (CN), grupo de buen pronóstico (BP) y grupo de mal pronóstico (MP) analizados por inmunotinción (izquierda, imágenes solo para el grupo de MP) y qRT-PCR (derecha). La expresión de ARNm está representada por el múltiplo de variación (eje y) después de la normalización con el control (CN). Se indica la significación de todos los datos de qRT-PCR que comparan BP y MP (p <0,005). TGFp1 y MMP9 también están sobreexpresados por las líneas celulares de LH (imagen inferior de electroforesis en gel de (A)). (B) Coexpresión de proteínas de TGFp1 y MMP9 en tejidos del grupo de pacientes con LH de mal pronóstico analizado mediante tinción de inmunofluorescencia doble para CD30, TGFp1 y MMP9 o SDC1, TGFp1 y MMP9. La fluorescencia verde o roja individual se representa en la parte inferior de cada imagen. (C) Coexpresión de TGFp1 y MMP9 por subconjuntos de células tumorales en una muestra de mal pronóstico. (Recuadro de A y B) Células de Hodgkin Reed Sternberg (HRS) que coexpresan SDC1 y TGFp1 o SDC1 y MMP9. La barra de escala (barra sólida blanca) representa 100 pm.
La Figura 5 muestra que FGF2 y SDC1 se sobreexpresan en las células CD15+/CD30+ en circulación de pacientes con LH de mal pronóstico sin quimioterapia previa. Análisis de qRT-PCR de células aisladas de la capa leucocitaria de sangre periférica de controles de donantes normales (CN, barra rayada), grupos de buen pronóstico (BP, punteado) y de mal pronóstico (MP, barra negra sólida) SQ sin quimioterapia previa (SQ) y grupo de MP expuesto a la quimioterapia (EQ, barra a cuadros). Los niveles de expresión se representan como múltiplo de variación (eje y) después de la normalización con células de control normales (N, barra gris sólida: N denota linfocitos B en A y C; N denota monocitos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8 y linfocitos B CD19 en B). (A) expresión de ARNm de CD30 y CD15; (B) marcadores específicos de células para monocitos (CD14, CD63), linfocitos T (CD4.CD8) y linfocitos B (CD38, CD19); (C) fGf2 y SDC1. Se indica la significación de todos los datos de qRT-PCR que comparan BP sin quimioterapia previa y MP sin quimioterapia previa (p <0,0001; ANOVA y PLSD).
Descripción detallada de la invención
La invención descrita puede entenderse mejor a partir de la siguiente descripción de realizaciones ilustrativas, junto con las figuras y los dibujos adjuntos. Debería ser evidente para los expertos en la técnica que las realizaciones descritas de la invención descrita proporcionada en el presente documento son meramente ejemplares e ilustrativas y no limitantes.
Definiciones
Varios términos usados a lo largo de la presente memoria descriptiva tendrán las definiciones establecidas en el presente documento.
"Activación" o "activación de linfocitos" se refiere a la estimulación de linfocitos por antígenos específicos, mitógenos inespecíficos o células alogénicas que dan como resultado la síntesis de ARN, proteína y ADN y la producción de linfocinas; le sigue la proliferación y diferenciación de varias células efectoras y de memoria. Por ejemplo, un linfocito B maduro se puede activar por un encuentro con un antígeno que expresa epítopos que son reconocidos por su inmunoglobulina de superficie celular (Ig). El proceso de activación puede ser directo, dependiente de la reticulación de moléculas de Ig de membrana por el antígeno (activación de linfocitos B dependiente de reticulación) o uno indirecto, que se da de manera más eficaz en el contexto de una interacción íntima con un linfocito T colaborador ("proceso de ayuda afín"). La activación de los linfocitos T depende de la interacción del complejo TCR/CD3 con su ligando afín, un péptido unido en el surco de una molécula del MHC de clase I o de clase II. Los eventos moleculares que se desencadenan por la participación del receptor son complejos. Entre las primeras etapas parece estar la activación de tirosina quinasas que conducen a la fosforilación de tirosina de un conjunto de sustratos que controlan varias vías de señalización. Estos incluyen un conjunto de proteínas adaptadoras que unen el TCR a la vía ras, fosfolipasa Cy1, cuya fosforilación de tirosina aumenta su actividad catalítica y activa la vía metabólica del fosfolípido inositol, que conduce a la elevación de la concentración de calcio libre intracelular y la activación de la proteína quinasa C, y una serie de otras enzimas que controlan el crecimiento y la diferenciación celular. La capacidad de respuesta completa de un linfocito T requiere, además de la participación del receptor, una actividad coestimuladora suministrada por células accesorias, por ejemplo, la participación de CD28 en el linfocito T por CD80 y/o CD86 en la célula presentadora de antígeno (CPA). El producto soluble de un linfocito B activado son las inmunoglobulinas (anticuerpos). El producto soluble de un linfocito T activado son las linfocinas.
El término "administrar" tal como se usa en el presente documento incluye la administración in vivo, así como la administración directamente al tejido ex vivo. En general, las composiciones se pueden administrar sistémicamente ya sea por vía oral, bucal, parenteral, tópica, por inhalación o insuflación (es decir, por la boca o por la nariz), o por vía rectal en formulaciones unitarias de dosis que contienen vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y vehículos según se desee, o se pueden administrar localmente por medios tales como, pero sin limitación, inyección, implantación, injerto, aplicación tópica o por vía parenteral.
El término "biomarcador" (o "biofirma") tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un anticuerpo, un gen, un metabolito o cualquier otra sustancia utilizada como indicador de un estado biológico. Es una característica que se mide objetivamente y se evalúa como indicador celular o molecular de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. El término "biomarcador de cáncer" (o "biofirma de cáncer") tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un anticuerpo, un gen, un metabolito, o cualquier otra sustancia utilizada para detectar la predisposición o la presencia de, cáncer primario o metastásico en un sujeto. Según la invención descrita, los biomarcadores útiles en la detección de pacientes con linfoma de Hodgkin con malos pronósticos clínicos (MP) incluyen, pero sin limitación, CD15, CD30, FGF2, MMP9, SDC1, TGFpl y similares. La nomenclatura del sistema de CD que se usa comúnmente para identificar marcadores celulares permite, por lo tanto, definir las células en función de las moléculas que están presentes en su superficie. Estos marcadores se utilizan a menudo para asociar células con determinadas funciones inmunitarias. Si bien el uso de una molécula de CD para definir poblaciones es poco común, la combinación de marcadores ha permitido tipos de células con definiciones muy específicas dentro del sistema inmunológico. Hay más de 350 moléculas de CD identificadas para humanos.
Las moléculas de CD se utilizan en la clasificación celular mediante varios métodos, incluida la citometría de flujo. Las poblaciones de células generalmente se definen usando un símbolo "+" o "-" para indicar si una determinada fracción celular expresa ("+") o carece de ("-") una molécula de CD. Las moléculas de CD no son exclusivamente marcadores en la superficie celular. La mayoría de las moléculas de CD tienen una función importante, aunque solo se ha caracterizado una pequeña parte de las moléculas de CD conocidas. Por ejemplo, hasta el momento se han identificado más de 350 moléculas de CD para humanos.
CD4 es una glucoproteína de membrana de linfocitos T que interactúa con antígenos de del complejo principal de histocompatibilidad de clase II y también es un receptor del virus de inmunodeficiencia humana. CD4 sirve para iniciar o aumentar la fase temprana de activación de los linfocitos T y puede funcionar como un mediador importante del daño neuronal indirecto en enfermedades infecciosas e inmunomediadas del sistema nervioso central.
CD8 es una proteína transmembrana de tipo I que se encuentra en los linfocitos T supresores (citotóxicos), algunos linfocitos citolíticos naturales y la mayoría de los timocitos que participan en el reconocimiento de antígenos de los linfocitos T. El CD8 se expresa en algunos linfomas de linfocitos T y leucemias de linfocitos granulares grandes. CD14 es una proteína de la superficie celular expresada principalmente por macrófagos y, en menor medida, granulocitos neutrófilos. Las células CD14+ son monocitos que se pueden diferenciar en una multitud de células diferentes; por ejemplo, la diferenciación a células dendríticas es promovida por citocinas tales como GM-CSF e IL-4. CD14 actúa como un correceptor (junto con el receptor tipo toll (TLR) 4 y el antígeno linfocitario 96 (MD-2)) para la detección de lipopolisacárido (LPS) bacteriano. El CD14 solo se puede unir al LPS en presencia de proteína de unión a lipopolisacáridos (LPU).
El CD15 (3-fucosil-N-acetil-lactosamina; antígeno embrionario específico de estadio 1 (SSEA-1)) es una molécula de adhesión de carbohidratos que se puede expresar en glucoproteínas, glucolípidos y proteoglucanos. El CD15 se encuentra comúnmente en neutrófilos y media la fagocitosis y la quimiotaxis. El CD15 también se encuentra en las células de Reed-Sternberg (HRS) del linfoma de Hodgkin clásico.
El CD19 es una proteína humana expresada en células dendríticas foliculares y linfocitos B. Esta molécula de la superficie celular se ensambla con el receptor de antígeno de los linfocitos B para disminuir el umbral para la estimulación dependiente del receptor de antígeno. Generalmente se cree que, tras la activación, la cola citoplasmática de CD19 se fosforila, lo que permite la unión por quinasas de la familia Src y el reclutamiento de quinasas de fosfoinosítido 3 (PI-3).
La CD20 es una fosfoproteína no glucosilada expresada en la superficie de todos los linfocitos B maduros. Los estudios sugieren que la CD20 juega un papel en el desarrollo y diferenciación de los linfocitos B en células plasmáticas. La CD20 está codificada por un miembro de la familia de genes 4A que atraviesa la membrana (MS4A). Los miembros de esta familia de proteínas se caracterizan por características estructurales comunes y muestran patrones de expresión únicos entre células hematopoyéticas y tejidos no linfoides.
La CD30 es una proteína transmembrana de tipo I presente en los linfocitos T y B activados que puede desempeñar un papel en la activación y/o diferenciación celular. La CD30 se expresa en la enfermedad de Hodgkin, algunos linfomas de linfocitos T y linfomas anaplásicos de células grandes.
La CD38 es una ectoenzima multifuncional expresada en células hematopoyéticas, linfocitos B, linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, monocitos y macrófagos. La CD38 sirve en la adhesión celular, la transducción de señales y la señalización de calcio.
La CD63 (LAMP-3; ME491; MLA1; OMA81H) es una glucoproteína de superficie celular de la superfamilia transmembrana 4 (familia de tetraspanina). Muchos de estos receptores de superficie celular tienen cuatro dominios hidrófobos y median eventos de transducción de señales que juegan un papel en la regulación del desarrollo, la activación, el crecimiento y la motilidad celular. La CD63 forma complejos con integrinas y puede servir como marcador de activación de plaquetas en sangre. En general, se cree que la sensibilidad y la especificidad de medir la regulación positiva de CD63 sola o como parte de una combinación, no es lo suficientemente específica como para servir como marcador de diagnóstico para el diagnóstico de alergia mediada por IgE.
La CD68 es una proteína transmembrana de tipo I presente en los monocitos, macrófagos, osteoclastos, mastocitos, gránulos citoplásmicos, plaquetas activadas y linfocitos grandes. La CD68 se expresa en células de Schwann del neuroma, en los nervios que sufren degeneración walleriana, en tumores de células mieloides y en linfomas anaplásicos y tumores epiteliales.
El término "ADNc" se refiere a ADN sintetizado a partir de un molde de ARNm maduro. El ADNc se sintetiza con mayor frecuencia a partir de ARNm maduro utilizando la enzima transcriptasa inversa. La enzima opera en una sola hebra de ARNm, generando su ADN complementario basado en el emparejamiento de pares de bases de ARN (A, U, G, C) con sus complementos de ADN (T, A, C, G). Existen varios métodos conocidos para generar ADNc para obtener, por ejemplo, ADNc eucariota cuyos intrones se han cortado y empalmado. En general, estos métodos incorporan las siguientes etapas: a) una célula eucariota transcribe el ADN (de los genes) en ARN (pre-ARNm); b) la misma célula procesa las hebras de pre-ARNm cortando y empalmando intrones y añadiendo una cola de poli-A y un casquete de 5' metil-guanina; c) esta mezcla de hebras de ARNm maduras se extrae de la célula; d) se hibrida un cebador de oligonucleótidos de poli-T en la cola de poli-A del molde de ARNm maduro. (La transcriptasa inversa requiere este segmento de cadena doble como cebador para iniciar su funcionamiento); e) se añade transcriptasa inversa, junto con desoxinucleótidos trifosfatos (A, T, G, C); f) la transcriptasa inversa explora el ARNm maduro y sintetiza una secuencia de ADN que complementa el molde de ARNm. Esta hebra de ADN es ADN complementario.
En el presente documento el término "célula" se utiliza para referirse a la unidad estructural y funcional de los organismos vivos y es la unidad más pequeña de un organismo clasificada como viva.
El término "quimioexpuesto" o "expuesto a quimioterapia" tal como se usa en el presente documento se refiere a pacientes que han recibido tratamiento con un agente quimioterapéutico o régimen quimioterapéutico.
El término "sin quimioterapia" o "sin quimioterapia previa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a pacientes que no han recibido tratamiento con un agente quimioterapéutico o régimen quimioterápico.
El término "afección" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una variedad de estados de salud y pretende incluir trastornos o enfermedades causadas por lesiones o cualquier mecanismo o trastorno subyacente. El término "enfermedad" o "trastorno" tal como se usa en el presente documento se refiere a un deterioro de la salud o una condición de funcionamiento anormal.
Las expresiones "factor de crecimiento de fibroblastos 2" o "FGF2" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que se une a la heparina y posee amplias actividades mitogénicas y angiogénicas. El FGF2 se ha implicado en diversos procesos biológicos, tales como el desarrollo del sistema nervioso y de las extremidades, la cicatrización de heridas y el crecimiento de tumores. El ARNm de este gen contiene múltiples sitios de poliadenilación y alternativamente se traduce de codones de iniciación no AUG (CUG) y AUG, dando como resultado cinco isoformas diferentes con propiedades distintas. Las isoformas iniciadas por CUG se localizan en el núcleo y son responsables del efecto intracrino (es decir, actuar dentro de una célula), mientras que, la forma iniciada por AUG es principalmente citosólica y es responsable de los efectos paracrino (es decir, secretado por una célula y que actúa localmente sobre células adyacentes de un tipo diferente) y autocrino (es decir, secretado por una célula y que actúa sobre células del mismo tipo) de este FGF.
El término "gen", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ADN que controla una característica hereditaria discreta, normalmente se corresponde con una sola proteína o ARN. Esta definición incluye toda la unidad funcional, que abarca secuencias de ADN codificantes, intrones y secuencias de ADN reguladoras no codificantes.
Los términos "buen pronóstico clínico", "buen pronóstico" o "BP", tal como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a una supervivencia libre de recaída/libre de progresión/libre de enfermedad sin experiencia de quimioterapia de más de cuatro (4) años.
El término "aislado" y sus diversas formas gramaticales tal como se usa en el presente documento se refiere a colocar, separar u obtener una proteína, molécula, sustancia, ácido nucleico, péptido, célula o partícula, en una forma esencialmente libre de contaminantes u otros materiales con los que se asocia comúnmente, separado de su entorno natural.
La expresión "gráfico de Kaplan Meier" o "curva de supervivencia de Kaplan Meier", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al gráfico de probabilidad de que los pacientes de un estudio clínico sobrevivan en un período de tiempo determinado teniendo en cuenta el tiempo en muchos intervalos pequeños. El gráfico de Kaplan Meier supone que: (i) en cualquier momento, los pacientes objeto de censura estadística (es decir, perdidos) tienen las mismas perspectivas de supervivencia que los pacientes objeto de seguimiento; (ii) las probabilidades de supervivencia son las mismas para los pacientes reclutados al principio y al final del estudio; y (iii) el episodio (por ejemplo, la muerte) ocurre en el momento especificado. Las probabilidades de aparición de sucesos se calculan en un punto temporal determinado multiplicando las probabilidades sucesivas por cualquier probabilidad calculada anteriormente para obtener una estimación final. La probabilidad de supervivencia en cualquier momento particular se calcula como el número de pacientes que sobreviven dividido entre el número de pacientes en riesgo. Los pacientes que han fallecido, que han abandonado el estudio, o que han sido objeto de censura estadística, no se cuentan como sujetos en riesgo.
El término "linfocito" se refiere a un pequeño glóbulo blanco formado en el tejido linfático de todo el cuerpo y en adultos normales que constituye aproximadamente el 22-28 % del número total de leucocitos en la sangre en circulación que desempeña un papel importante en la defensa del cuerpo contra enfermedad. Los linfocitos individuales están especializados en que están comprometidos a responder a un conjunto limitado de antígenos relacionados estructuralmente. Este compromiso, que existe antes del primer contacto del sistema inmunológico con un antígeno determinado, se expresa por la presencia en la membrana de la superficie del linfocito de receptores específicos para determinantes (epítopos) del antígeno. Cada linfocito posee una población de receptores, todos los cuales tienen sitios de combinación idénticos. Un conjunto, o clon, de linfocitos difiere de otro clon en la estructura de la región de combinación de sus receptores y, por tanto, difiere en los epítopos que puede reconocer. Los linfocitos se diferencian entre sí no solo en la especificidad de sus receptores, sino también en sus funciones.
Se reconocen dos amplias clases de linfocitos: los linfocitos B (células B), que son precursores de células secretoras de anticuerpos y linfocitos T (células T).
Linfocitos B
Los linfocitos B provienen de células hematopoyéticas de la médula ósea. Un linfocito B maduro se puede activar con un antígeno que expresa epítopos que son reconocidos por su superficie celular. El proceso de activación puede ser directo, dependiente de la reticulación de las moléculas de Ig de membrana por el antígeno (activación de linfocitos B dependiente de la reticulación), o indirecta, a través de la interacción con un linfocito T colaborador, en un proceso denominado ayuda afín. En muchas situaciones fisiológicas, los estímulos de reticulación del receptor y los afines ayudan a sinergizar para producir respuestas de linfocitos B más vigorosas. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4a edición, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)).
Linfocitos T
Los linfocitos T provienen de precursores en el tejido hematopoyético, experimentan diferenciación en el timo y luego se siembran en tejido linfoide periférico y en el grupo de linfocitos en recirculación. Los linfocitos T o las células T median una amplia gama de funciones inmunológicas. Estos incluyen la capacidad de ayudar a los linfocitos B a convertirse en células productoras de anticuerpos, la capacidad de aumentar la acción microbicida de los monocitos/macrófagos, la inhibición de ciertos tipos de respuestas inmunitarias, la destrucción directa de las células diana y la movilización de la respuesta inflamatoria. Estos efectos dependen de su expresión de moléculas específicas de la superficie celular y de la secreción de citocinas. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4a edición, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)).
Los linfocitos T se diferencian de los linfocitos B en su mecanismo de reconocimiento de antígenos. La inmunoglobulina, el receptor de los linfocitos B, se une a epítopos individuales en moléculas solubles o en superficies particuladas. Los receptores de linfocitos B ven epítopos expresados en la superficie de moléculas naturales. Los anticuerpos y los receptores de linfocitos B evolucionaron para unirse y proteger contra microorganismos en los fluidos extracelulares. Por el contrario, los linfocitos T reconocen antígenos en la superficie de otras células y median en sus funciones al interactuar y alterar, el comportamiento de estas células presentadoras de antígeno (CPA). Hay tres tipos principales de células presentadoras de antígenos en los órganos linfoides periféricos que pueden activar los linfocitos T: células dendríticas, macrófagos y linfocitos B.
Los linfocitos T se subdividen en dos clases distintas según los receptores de la superficie celular que expresan. La mayoría de los linfocitos T expresan receptores de linfocitos T (TCR) que consisten en cadenas a y p. Un pequeño grupo de linfocitos T expresa receptores formados por cadenas y y 6. Entre los linfocitos T a/p hay dos sublinajes: los que expresan la molécula correceptora CD4 (linfocitos T CD4+); y los que expresan CD8 (linfocitos T CD8+). Estas células difieren en cómo reconocen el antígeno y en sus funciones efectoras y reguladoras.
Los linfocitos T CD4+ son las principales células reguladoras del sistema inmunitario. Su función reguladora depende tanto de la expresión de sus moléculas de superficie celular, tal como el ligando CD40 cuya expresión se induce cuando se activan los linfocitos T, y la amplia gama de citocinas que secretan cuando se activan.
Los linfocitos T también median funciones efectoras importantes, algunas de las cuales están determinadas por los patrones de citocinas que secretan. Las citocinas pueden ser directamente tóxicas para las células diana y pueden movilizar potentes mecanismos inflamatorios. Además, Los linfocitos T, en particular los linfocitos T CD8+, se pueden convertir en linfocitos T citotóxicos (LTC) capaces de lisar eficazmente las células diana que expresan antígenos reconocidos por los LTC. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4a edición, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)).
Los linfocitos T también se pueden clasificar según su función como linfocitos T colaboradores; linfocitos T implicados en la inducción de inmunidad celular; linfocitos T supresores; y linfocitos T citotóxicos.
Linfocitos T colaboradores
Los linfocitos T colaboradores son linfocitos T que estimulan a los linfocitos B para que produzcan respuestas de anticuerpos a proteínas y otros antígenos dependientes de linfocitos T. Los linfocitos TH2 son muy eficaces para ayudar a que los linfocitos B se conviertan en células productoras de anticuerpos, considerando que los linfocitos TH1 son inductores eficaces de la respuesta inmunitaria celular, lo que implica el aumento de la actividad microbicida de los monocitos y macrófagos, y el consiguiente aumento de la eficacia en la lisis de microorganismos en los compartimentos vesiculares intracelulares.
Linfocitos T involucrados en la inducción de la inmunidad celular
Los linfocitos T pueden actuar para mejorar la capacidad de los monocitos y macrófagos para destruir microorganismos intracelulares. En particular, el interferón-gamma (IFN-y) producido por los linfocitos T colaboradores potencia varios mecanismos a través de los cuales los fagocitos mononucleares destruyen las bacterias intracelulares y el parasitismo, incluida la generación de óxido nítrico y la inducción de la producción del factor de necrosis tumoral (TNF). Los linfocitos TH1 son eficaces para potenciar la acción microbicida porque producen IFN-y. Por el contrario, dos de las principales citocinas producidas por los linfocitos TH2, IL-4 y IL-10, bloquean estas actividades. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4a edición, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)).
Linfocitos T supresores
Un equilibrio controlado entre el inicio y la regulación negativa de la respuesta inmunitaria es importante para mantener la homeostasis inmunitaria. Tanto la apoptosis como la anergia de los linfocitos T (un mecanismo de tolerancia en el que los linfocitos T se inactivan funcionalmente intrínsecamente después de un encuentro con un antígeno (Scwartz, R. H., "T cell anergy", Annu. Rev. Immunol., 21: 305-334 (2003)) son mecanismos importantes que contribuyen a la regulación negativa de la respuesta inmunitaria. Un tercer mecanismo lo proporciona la supresión activa de los linfocitos T activados por los linfocitos T CD4+ reguladores o supresores (Treg). (Revisado en Kronenberg, M. et al., "Regulation of immunity by self-reactive T cells", Nature 435: 598-604 (2005)). Los Treg CD4+ que expresan constitutivamente la cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Ra) (CD4+CD25+) son un subconjunto de linfocitos T de origen natural que son anérgicos y supresores. (Taams, L. S. et I., "Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells: a highly differentiated and apoptosis-prone population", Eur. J. Immunol., 31: 1122-1131 (2001)). El agotamiento de los Treg CD4+CD25+ da como resultado una enfermedad autoinmunitaria sistémica en ratones. Asimismo, la transferencia de estos Treg previene el desarrollo de enfermedades autoinmunes. los Treg CD4+CD25+ humanos, similares a su homólogo murino, se generan en el timo y se caracterizan por la capacidad de suprimir la proliferación de linfocitos T respondedores a través de un mecanismo dependiente del contacto célula-célula, la incapacidad para producir IL-2, y el fenotipo anérgico in vitro. Los linfocitos T CD4+CD25+ humanos se pueden dividir en células supresoras (CD25high) y no supresoras (CD25low), según el nivel de expresión de CD25. Un miembro de la familia forkhead de factores de transcripción, FOXP3, se ha demostrado que se expresa en los Treg CD4+CD25+ murinos y humanos y parece ser un gen maestro que controla el desarrollo de los Treg CD4+CD25+. (Battaglia, M. et al., "Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+ regulator T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients", J. Immunol., 177: 8338­ 8347 (200)).
Linfocitos T citotóxicos (LTC)
Los linfocitos T CD8+ que reconocen péptidos de proteínas producidas dentro de la célula diana tienen propiedades citotóxicas en el sentido de que conducen a la lisis de las células diana. El mecanismo de lisis inducido por LTC implica la producción por parte de los LTC de perforina, una molécula que se puede insertar en la membrana de las células diana y promover la lisis de esa célula. La lisis mediada por perforina se ve reforzada por una serie de enzimas producidas por LTC activados, denominadas granzimas. Muchos LTC activos también expresan grandes cantidades de ligando fas en su superficie. La interacción del ligando fas en la superficie de los LTC con fas en la superficie de la célula diana inicia la apoptosis en la célula diana, lo que lleva a la muerte de estas células. La lisis mediada por LTC parece ser un mecanismo importante para la destrucción de células infectadas por virus.
Los términos "marcador" o "marcador de superficie celular" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un determinante antigénico o epítopo que se encuentra en la superficie de un tipo específico de célula. Los marcadores de superficie celular pueden facilitar la caracterización de un tipo de célula, su identificación y eventualmente su aislamiento. Las técnicas de clasificación celular se basan en biomarcadores celulares en donde para la selección positiva o negativa se puede utilizar uno o más marcadores de la superficie celular, es decir, para la inclusión o exclusión, de una población celular.
Los términos "metástasis" (en singular o en plural), tal como se usan en el presente documento, se refieren al crecimiento o depósito tumoral que se ha diseminado a través de la linfa o la sangre a un área del cuerpo alejada del tumor primario.
El término "metastatizar" tal como se usa en el presente documento se refiere a la propagación del cáncer de una parte del cuerpo a otra. Un tumor formado por células que se han diseminado se denomina "tumor metastásico" o "metástasis". La forma plural de "metástasis" es "metástasis".
Los términos "metalopeptidasa de matriz 9" o "MMP9", tal como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a un miembro de la familia de metaloproteinasas (MMP) implicado en la proteólisis local de la matriz extracelular y en la migración de leucocitos. La MMP9 escinde la kispeptina (KiSS1), un ligando del receptor acoplado a proteína G del receptor acoplado a proteína G GPR54, en un enlace Gly-/-Leu, escinde el colágeno tipo IV y tipo V y degrada la fibronectina.
El término "monocito", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tipo de célula inmunitaria que se fabrica en la médula ósea y viaja a través de la sangre hasta los tejidos del cuerpo donde se convierte en macrófago. Un monocito es un tipo de glóbulo blanco y un tipo de fagocito.
La expresión "ácido nucleico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales porque hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).
El término "nucleótido" tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico que consta de una base heterocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En los nucleótidos más comunes, la base es un derivado de purina o pirimidina y el azúcar es la pentosa desoxirribosa o ribosa. Los nucleótidos son los monómeros de los ácidos nucleicos, con tres o más enlaces para formar un ácido nucleico. Los nucleótidos son las unidades estructurales del ARN, ADN, y varios cofactores, incluyendo, pero sin limitación, CoA, FAD, DMN, NAD y NADP. Las purinas incluyen adenina (A) y guanina (G); las pirimidinas incluyen citosina (C), timina (T) y uracilo (U).
En el presente documento, el término "péptido" se utiliza para referirse a dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico.
En el presente documento, el término "proteína" se utiliza para referirse a una molécula o polipéptido complejo grande compuesto por aminoácidos. La secuencia de los aminoácidos en la proteína se determina por la secuencia de las bases en la secuencia de ácido nucleico que la codifica.
Los términos "péptido", "péptido" y "proteína", también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácido son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural. La naturaleza esencial de dichos análogos de aminoácidos de origen natural es que, cuando se incorporan en una proteína, dicha proteína reacciona específicamente con anticuerpos generados contra la misma proteína pero que consiste completamente en aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también incluyen modificaciones que incluyen, pero sin limitación, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP. Se apreciará, como es de sobra conocido y como se ha indicado anteriormente, que los polipéptidos pueden no ser completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de sucesos postraduccionales, incluyendo sucesos de procesamiento natural y sucesos provocados por la manipulación humana que no se producen de manera natural. También pueden sintetizarse polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados mediante procesos naturales no traduccionales y también mediante métodos completamente sintéticos.
Los términos "mal pronóstico clínico", "mal pronóstico" o "MP" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a refractarios primarios no tratados con quimioterapia o quimioexpuestos con recaída temprana, recaída múltiple dentro de los cuatro (4) años o reducción de la supervivencia/muerte dos (2) a tres (3) años después del diagnóstico.
El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico que, cuando hibrida con una hebra de ADN, es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión en presencia de un agente de polimerización adecuado. El cebador es suficientemente largo para hibridar de forma única con una región específica de la hebra de ADN. También se puede usar un cebador en ARN, por ejemplo, para sintetizar la primera hebra de ADNc.
El término "progresión" tal como se usa en el presente documento se refiere al curso de una enfermedad, tal como LH, a medida que empeora o se propaga por el cuerpo.
El término "supervivencia sin progresión" o "SSP" tal como se usa en el presente documento se refiere al período de tiempo durante y después del tratamiento de una enfermedad, tal como cáncer, que un paciente vive con la enfermedad pero no empeora. En un ensayo clínico, medir la supervivencia libre de progresión es una forma de determinar qué tan bien funciona un nuevo tratamiento.
El término "calidad de vida", tal como se usa en el presente documento, se refiere al disfrute general de la vida, incluyendo aspectos de la sensación de bienestar y la capacidad de un individuo para realizar diversas actividades. Los términos "recurrencia" o "recaída" se usan indistintamente en el presente documento para referirse al regreso de un cáncer después de un tratamiento de primera línea y después de un período de tiempo durante el cual no se puede detectar el cáncer. El término "recurrencia del linfoma de Hodgkin", "recaída del linfoma de Hodgkin", "linfoma de Hodgkin recurrente" o "linfoma de Hodgkin recidivante", tal como se usa en el presente documento, se refiere al regreso del linfoma de Hodgkin después del tratamiento y después de un período de tiempo durante el cual no se puede detectar el linfoma de Hodgkin. El término "recaída temprana" o "recurrencia temprana" tal como se usa en el presente documento se refiere a una recaída o recurrencia de cáncer (por ejemplo, linfoma de Hodgkin) que ocurre en menos de 1 año (< 1 año) después del final de la terapia. El término "recaída múltiple" o "recurrencia múltiple" tal como se usa en el presente documento se refiere a más de una recaída o recurrencia del cáncer (por ejemplo, linfoma de Hodgkin).
El término "refractario", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser resistente al comienzo del tratamiento o puede volverse resistente durante el tratamiento. La expresión "refractario primario" tal como se usa en el presente documento se refiere a la progresión de la enfermedad (por ejemplo, linfoma de Hodgkin) durante el tratamiento de inducción o una respuesta parcial o transitoria (por ejemplo, menos de 60 días) a la terapia de inducción. La expresión "terapia de inducción" tal como se usa en el presente documento se refiere al primer tratamiento administrado para una enfermedad que a menudo es parte de un conjunto estándar de tratamientos, por ejemplo, cirugía seguida de quimioterapia y radiación. La terapia de inducción se acepta a menudo como la mejor opción de tratamiento. La terapia de inducción también se conoce como "terapia de primera línea", "terapia primaria" y "tratamiento primario".
La expresión "supervivencia sin recaída (SSR)", tal como se usa en el presente documento, se refiere al período de tiempo después del tratamiento primario para un cáncer durante el cual el paciente sobrevive sin ningún signo o síntoma de ese cáncer. También se llama supervivencia libre de enfermedad (SLE).
El término "relativo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a algo que tiene, o está en, alguna asociación significativa con algo más. La expresión "frecuencia relativa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la tasa de aparición de algo que tiene o está en alguna asociación significativa con la tasa de aparición de otra cosa. Por ejemplo, dos tipos de células, las células X y las células Y ocupan una ubicación determinada. Hay 5 células X y 5 células Y en esa ubicación. La frecuencia relativa del tipo de célula X es 5/10; la frecuencia relativa del tipo de célula Y es 5/10 en esa ubicación. Después del procesamiento, hay 5 células X, pero solo 1 célula Y en esa ubicación. La frecuencia relativa del tipo de célula X después del procesamiento es 5/6, y la frecuencia relativa del tipo de célula Y después del procesamiento es 1/6 en esa ubicación.
La expresión "factor de riesgo" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier cosa que aumente las posibilidades de que una persona desarrolle una enfermedad.
Los términos "sindecan-1" o "SDC1" tal como se usan en el presente documento se usan indistintamente para referirse a un proteoglicano de heparán sulfato de tipo I transmembrana ampliamente expresado que funciona como una proteína integral de membrana y participa en la proliferación celular, migración celular e interacciones célulamatriz.
Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a especies animales de origen mamífero que se pueden beneficiar de la administración de una composición de fármaco o método de la invención descrita. Los ejemplos de sujetos incluyen humanos y otros animales como caballos, cerdos, vacas, perros, gatos, conejos, ratones, ratas y mamíferos acuáticos.
El término "síndrome", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un patrón de síntomas indicativos de alguna enfermedad o afección.
De acuerdo con un aspecto, la invención descrita proporciona un método para predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en un sujeto tratado con un primer régimen de tratamiento que comprende: (a) proporcionar una muestra del sujeto y una muestra de un sujeto de control con buen pronóstico clínico; (b) aislar el ARN total que comprende el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y el a Rn de sindecan-1 (SDC1) de la muestra del sujeto y de la muestra del sujeto de control con buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en el sujeto y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de recurrencia de LH en el sujeto; (f) predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en el sujeto basándose en la etapa (e); y (g) tratar al sujeto con un segundo régimen de tratamiento eficaz para tratar la recurrencia de LH.
Según una realización, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una biopsia de tumor, sangre, un nódulo linfático y leucocitos de sangre periférica (LSP).
Según una realización, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Según una realización, el método para predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en un sujeto tratado con un primer régimen de tratamiento comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en el sujeto y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto con el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de TGFpl y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de recurrencia de LH en el sujeto.
De acuerdo con otro aspecto, la invención descrita proporciona un método para predecir un mal pronóstico clínico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) que comprende: (a) proporcionar una muestra del sujeto con LH y una muestra de un sujeto de control con buen pronóstico clínico; (b) aislar el ARN total que comprende el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y el ARN de sindecan-1 (SDC1) de la muestra del sujeto con LH y de la muestra del sujeto de control con buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de FGF2 y el ARN de SDC1 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de mal pronóstico clínico para el sujeto con LH; (f) predecir un mal pronóstico clínico para el sujeto con LH basándose en la etapa (e); y (g) reemplazar un régimen de tratamiento que probablemente sea ineficaz por un régimen de tratamiento eficaz para mantener la calidad de vida del sujeto.
Según una realización, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una biopsia de tumor, sangre, un nódulo linfático y leucocitos de sangre periférica (LSP).
Según una realización, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Según una realización, el método para predecir un mal pronóstico clínico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en el sujeto y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de TGFpl y el a Rn de MMP9 expresado por el sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de TGFpl y el Ar N de MMP9 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de mal pronóstico clínico en el sujeto con LH.
De acuerdo con otro aspecto, la invención descrita proporciona un método para detectar evidencia de enfermedad de linfoma de Hodgkin (LH) metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin que comprende: (a) proporcionar una muestra de leucocitos de sangre periférica (LSP) del sujeto con LH y una muestra de lSp de un sujeto de control de buen resultado clínico; (b) aislar el ARN total que comprende CD30, Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2) y ARN de sindecan-1 (SDC1) de la muestra de LSP del sujeto con LH y de la muestra de LSP del sujeto de control con buen pronóstico clínico; (c) amplificar el ARN total de la etapa (b); (d) medir un nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e) comparar el nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 en la etapa (d) expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN del CD30, el FGF2 y el SDC1 expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico es indicativo de una metástasis en el sujeto con LH; (f) detectar la evidencia de metástasis en el sujeto con LH basándose en la etapa (e), y (g) implementar un plan de tratamiento apropiado.
Según una realización, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Según una realización, el método de detección de evidencia del linfoma de Hodgkin metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de CD15 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de CD15 en la etapa (d') expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de CD15 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de CDl5 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de CD15 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de mal pronóstico clínico para el sujeto con LH.
Según una realización, el método de detección de evidencia del linfoma de Hodgkin metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) comprende además: (d') medir un nivel de expresión del ARN de TGFpl y MMP9 en el sujeto con LH y en el sujeto de control con buen pronóstico clínico; (e') comparar el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y MMP9 en la etapa (d') expresado por el sujeto de control con buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN de TGFp1 y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de TGFp1 y el ARN de MMP9 expresado por el sujeto de control de buen resultado clínico es indicativo de LH metastásico en el sujeto con LH.
Según una realización, la evidencia de linfoma de Hodgkin metastásico en un sujeto con linfoma de Hodgkin comprende una célula CD30+ en circulación con un inmunofenotipo FGF2+/SDC1+. Según otra realización, la célula CD30+ en circulación con un inmunofenotipo FGF2+/SDC1+ es un linfoma de Hodgkin en circulación y una célula de Reed-Sternberg (HRS).
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior salvo que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor afirmado o mencionado en este intervalo queda englobado dentro de la invención. En la invención también se incluyen los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños, que pueden incluirse independientemente en intervalos más pequeños, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, en la invención también se incluyen los intervalos que excluyen cualquiera de estos límites.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "y" y "el/la" incluyen las referencias en plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completa de cómo producir y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención y tampoco pretenden representar que los experimentos presentados a continuación sean todos o los únicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio ponderal, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Bioinformática
La plataforma del programa informático BioXM (Sophic Alliance, Rockville, MD) se utilizó para extraer posibles biomarcadores del linfoma de Hodgkin utilizando el índice de genes del cáncer del National Cancer Institute (NCI), que contiene 7.000 genes de cáncer y 2.200 genes de biomarcadores. Estos genes fueron anotados y validados a partir de 18 millones de resúmenes de Medline y 24.000 genes Hugo de más de 80 bases de datos, utilizando una combinación de métodos algorítmicos (Biomax Informatics, Múnich, Alemania) que incluía el procesamiento del lenguaje natural (NLP), códigos de función de biomarcadores, el Tesauro del cáncer del NCI y los códigos de evidencia de Karp (Karp PD et al., Pacif Sympo Biocomp; 2004: 190-201). La identificación de posibles biomarcadores se realizó iniciando consultas en BioXM con una combinación de términos de búsqueda, incluida la enfermedad de Hodgkin, linfoma, cáncer, biomarcador, sobreexpresión, regulación positiva o regulación negativa, y expresada diferencialmente. La búsqueda guiada por bioinformática generó 151 posibles biomarcadores potenciales de LH (Tabla 5).
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Líneas celulares y cultivo celular
Las líneas celulares de linfoma de Hodgkin KM-H2 (establecidas a partir de un paciente con LH de celularidad mixta), HD-MY-Z (establecido a partir del derrame pleural de un paciente con LH de tipo esclerosante nodular), HDLM-2 (establecido a partir de un derrame pleural de un paciente con LH de tipo esclerosante nodular, estadio IV), L-591 (una línea celular derivada de LH positiva para el virus de Epstein-Barr (VEB)) y SUP-HD1 (establecida a partir de un derrame pleural de un paciente con Lh del tipo esclerosante nodular) se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y cultivos celulares (Braunschweig, Alemania). Las células L-428 (establecido a partir de un paciente con LH de tipo esclerosante nodular), L-1236 (establecido a partir de la sangre periférica de un paciente con LH avanzado) y L-540 (establecido a partir de la médula ósea de un paciente con LH del tipo esclerosante nodular, estadio IVB, estadio preterminal) fueron obsequios generosos proporcionados por el Dr. Volker Diehl (Universidad de Colonia, Alemania). Las células U-H01 (establecida a partir de un paciente con LH de tipo esclerosante nodular) y DEV (una línea celular derivada de un meduloblastoma humano) fueron obsequios del Dr. S. Bruderlein (Hospital Universitario de Ulm, Alemania) y la Dra. Debora De Jong (Países Bajos), respectivamente. Las células KM-H2, L-428, HD-MY-Z y L-1236 se cultivaron en RPMI 1640 al 90 % suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %. las células SUP-HD1 se cultivaron en medio 5A de McCoy al 80 % que contenía FBS al 20 %. Las células HDLM-2, L-540 y L-591 se cultivaron en RPMI 1640 al 80 % suplementado con FBS al 20 %. Se cultivaron células U-H01 en MDM de Iscove y RPMI 1640 (a 4:1) suplementado con FBS al 20 %. Todos los medios de cultivo contenían L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C con CO2 al 5 %. Las características clínicas de cada línea celular se documentaron previamente y se presentan en la Tabla 4. Las células VEP, KM-H2 y SUP-HD1 se obtuvieron de casos de recaída. Las células HD-My -Z, L1236, L428 y U-H01 procedían de pacientes refractarios.
Tabla 6. Características de las líneas celulares de LH*
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Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc
El ARN total de líneas celulares y sangre periférica (LSP) de pacientes con LH se aisló usando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se extrajo el ARN de secciones de tejido archivadas fijadas con formalina embebidas en parafina (FFEP) utilizando RNeasy (Qiagen, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se recortó el exceso de parafina del bloque de muestra y se cortaron secciones de 5-20 pm de espesor con un bisturí. Las secciones se colocaron inmediatamente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y se cerró la tapa. A continuación, se añadieron 320 pl de solución de desparafinización al tubo de microcentrífuga, el tubo se agitó durante 10 segundos, seguido de centrifugación para llevar la muestra al fondo del tubo. La muestra se incubó a 56 °C durante 3 minutos y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 240 pl de Tampón PKD al tubo, el tubo se agitó vorticialmente y luego se centrifugó durante 1 minuto a 11.000 x g a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se añadieron 10 pl de proteinasa K a la parte inferior, se limpió la fase y se mezcló con un pipeteado suave. La muestra que contenía proteinasa K se incubó a 56 °C durante 15 minutos, después a 80 °C durante 15 minutos. Después de la incubación a 80 °C, la fase inferior incolora se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml y se incubó en hielo durante 3 minutos. Después de la incubación, el tubo se centrifugó durante 15 minutos a 20.000 x g (13.500 rpm) y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml sin alterar el sedimento. A continuación, se añadieron al sobrenadante tampón de refuerzo de desoxirribonucleasa equivalente a una décima parte del volumen total de la muestra (aproximadamente 25 pl) y 10 pl de solución madre de desoxirribonucleasa I, se mezcló mediante inversión y el tubo se centrifugó para recoger el líquido residual de los lados de los tubos. El tubo que contiene el sobrenadante, el tampón de refuerzo de desoxirribonucleasa y la desoxirribonucleasa I se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 500 pl de tampón RBC al tubo y se mezclaron, seguido de la adición de 1.200 pl de etanol al 100 %. La muestra se mezcló pipeteando, seguido de la transferencia de 700 |jl de la muestra a una columna de centrifugación RNeasy MinElute colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Se cerró la tapa del tubo de recogida y se centrifugó el tubo durante 15 segundos a > 8.000 x g (> 10.000 rpm). Se descartó el flujo continuo y se repitió la etapa de la columna de centrifugado MinElute hasta que toda la muestra pasó a través de la columna de centrifugación RNeasy MinElute. A continuación, se añadieron 500 j l de tampón RPE a la columna de centrifugación MinElute, se cerró la tapa, el tubo de recogida se centrifugó durante 15 segundos a > 8.000 x g (> 10.000 rpm) y se desechó el flujo continuo. De nuevo, se añadieron 500 j l de tampón RPE a la columna de centrifugación RNeasy MinElute, se cerró la tapa y se centrifugó el tubo de recogida durante 15 segundos a > 8.000 x g (> 10.000 rpm) para lavar la membrana de la columna de centrifugado. El tubo de recogida y el flujo continuo se descartaron después de la centrifugación. La columna de centrifugación RNeasy se colocó en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, se abrió la tapa, el tubo de recogida se centrifugó a velocidad máxima durante 5 minutos y se desechó el flujo continuo. Finalmente, la columna de centrifugación RNeasy MinElute se colocó en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml, se añadieron 30 j l de agua libre de ribonucleasa directamente a la membrana de la columna de centrifugación, se cerró la tapa del tubo de recogida y se centrifugó el tubo durante 1 minuto para eluir el ARN. La concentración de ARN se determinó espectrofotométricamente en A260 (ThermoElectro Corporation). La integridad del ARN total se comprobó mediante resolución en un gel de agarosa al 2 % en condiciones desnaturalizantes. El ADNc se generó usando el kit de síntesis de ADNc Superscript III RT First-Strand (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usaron cebadores oligo-dT para generar ADNc a partir de líneas celulares y ARN derivado de linfocitos de sangre periférica (LSP), y se usaron hexámeros aleatorios para generar ADNc a partir de ARN obtenido de secciones FFEP. En resumen, se combinaron 5 jg de ARN total, 1 j l de cebador (oligo (dT) 50 jM, o hexámeros aleatorios 50 ng/jl) y 1 j l de tampón de hibridación en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml sobre hielo. El volumen total en el tubo de PCR se ajustó a 8 j l mediante la adición de agua libre de ribonucleasa/desoxirribonucleasa. El tubo se incubó en un termociclador a 65 °C durante 5 minutos, incubado inmediatamente en hielo durante 1 minuto, luego se centrifuga para recoger el contenido del tubo. A continuación, se añadieron 10 j l de mezcla de reacción First-Strand Reaction a 2X y 2 j l de mezcla enzimática SuperScript III/RNaseOUT al tubo de PCR en hielo, el tubo se agitó vorticialmente y el contenido del tubo se recogió por centrifugación. Los tubos de PCR que contenían cebadores Oligo(dT) se incubaron durante 50 minutos a 50 °C; los tubos de PCR que contenían hexámeros aleatorios se incubaron de 5 a 10 minutos a 25 °C, seguido de 50 minutos a 50 °C. A continuación, los tubos de PCR se incubaron a 85 °C durante 5 minutos y se colocaron inmediatamente en hielo. Finalmente, las reacciones de síntesis de ADNc se almacenaron a -20 °C o se usaron inmediatamente en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Los conjuntos de cebadores utilizados para cada gen se generaron utilizando herramientas de cebadores en línea (Universidad de Massachusetts; http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) (Tabla 7). Los cebadores se diseñaron para tener longitudes de 18 a 27 nucleótidos (nt) con Tf = 60 °C y un contenido de GC del 45 al 65 %, y se sintetizaron mediante un servicio de cebadores personalizado proporcionado por Invitrogen. Se confirmó que cada par de cebadores generaba una única banda discreta mediante pCr de punto final (ciclador térmico Peltier con motor de ADN BioRad) utilizando ADNc generados a partir de tejido de bazo normal. Las condiciones de PCR de punto final consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y extensión del cebador a 72 °C durante 1 minuto. Los pares de cebadores se diseñaron para generar un fragmento de PCR de 150-170 pares de bases (pb) para el ADNc derivado de linfocitos de sangre periférica (LSP) y de línea celular, y de 70-100 pb para el ADNc derivado de fijado con formalina y embebido en parafina (FFEP) (Tabla 5). Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 2 % y se visualizaron con tinción con bromuro de etidio usando un BioRad Imager. Para qRT-PCR, cada reacción consistió en 43 ng de ADNc, 10 mmoles de cebadores y 10 j l de mezcla Power SYBR Green PCR Master Mix a 2X (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un volumen final de 20 jl, que se colocó en una placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos diseñada para su uso con el sistema de PCR ABI7900 (Applied Biosystems). La reacción se realizó usando el modo estándar (desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 minuto). Cada reacción de qRT-PCR se realizó por triplicado y cada conjunto de datos se analizó con el programa informático ABI7900. La cantidad de ARNm diana se normalizó a los niveles de expresión del gen constitutivo de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Para líneas celulares, se utilizó CD19 como control. Para el análisis de LSP, los niveles de expresión de CD14/63, CD38/19 y CD4/8 se compararon con su expresión en monocitos, linfocitos B CD19+, linfocitos T colaboradores y/o linfocitos T citotóxicos, respectivamente, de donantes sanos (Miltenyi Biotech). Se usó ADNc normal combinado (n = 20) como control para el análisis de expresión génica del ADNc derivado de tejido de FFEP. Se utilizó el método AACt para calcular el múltiplo de variación en relación con los controles.
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continuación
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Selección de muestras clínicas
Los criterios de selección de las muestras de sangre periférica se basaron en la respuesta a la terapia de primera línea (Tabla 8). Veinticinco muestras de pacientes con linfoma de Hodgkin clásico esclerosante nodular (NS-LHc) registradas en la base de datos del Centro Médico de la Universidad de Hackensack se clasificaron en: 1) buen pronóstico, sin quimioterapia previa, sin tratar, sin recaídas/sin enfermedad> 4 años (n=12); 2) mal pronóstico, sin quimioterapia previa (sin tratar), refractario primario o recaída temprana (n=7); 3) expuesto a quimioterapia (pretratado), múltiples recaídas (n=6). Los nódulos linfáticos fijados con formalina, embebidos en parafina (FFEP) y frescos congelados (FC) de diferentes etapas y subtipos de LH se obtuvieron de la Universidad Thomas Jefferson, el Repositorio de Tejidos del Centro Médico de la Universidad de Hackensack y Proteogenex (Culver City, CA). Las muestras biológicas con las características clínicas relevantes se agruparon en buen pronóstico (BP, sin recaída/sin enfermedad> 4 años, n=20) y mal pronóstico (MP, reducción de la supervivencia-muerte 2 a 3 años después del diagnóstico). Se obtuvo una matriz de tejido de linfoma de US Biomax (Rockville, MD).
T l r rí i l i n ^ r r r n i
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ABVD: Adriamicina, Bleomicina, Vinblastina, Dacarbazina; acc: acelerado; BCPAT: acondicionamiento de BEAM pre-autotrasplante; RC: Remisión completa; EQ: expuesto a quimioterapia; SQ: sin quimioterapia previa; BEACOPP: Bleomicina, Etopósido, Adriamicina, Ciclofosfamida, Vincristina, Procarbazina, Prednisona; CPPV: Clorambucilo, Procarbazina, Prednisona, Vinblastina; DICE: Dexametasona, Ifosfamida, Cisplatino, Etopósido; EPOCH: Etopósido, Vincristina y Doxorrubicina con Ciclofosfamida en bolo; ESHAP: Etopósido, Metilprednisolona, Ara-C y Cisplatino; FMPAL: Fludarabina, Melfalán, Pre-alotrasplante; GVD: Gemcitabina, Vinorrelbina, Vincristina liposomal; HCVAD: Hiper Ciclofosfamida, Vincristina, Adriamicina y Dexametasona; ICE: Ifosfamida, Carboplatino, Etopósido; IGEV: Ifosfamida, Gemcitabina y Vinorelbina; SSP: Supervivencia sin progresión; PT: Postrasplante; Rec: Recaída; Ref: Refractario; R: Rituximab; Rad: Radiación; SK: Sloane Kettering; Std: Estándar; WU: Universidad de Washington
Inmunohistoquímica
Los nódulos linfáticos congelados frescos y fijados con formalina, embebidos en parafina (FFEP) de diferentes estadios y subtipos de LH se adquirieron de US Biomax y Proteogenex. Las secciones de FFEP (5 |jm) montadas en portaobjetos se desparafinaron dos veces con el agente de limpieza Histochoice (Amresco, Solon, OH) durante 10 minutos cada una, luego se hidrataron secuencialmente en etanol al 100 %, 90 %, 80 %, 70 % y 50 % seguido de equilibrio en PBS durante 5 minutos cada una. Todas las recuperaciones de antígenos se llevaron a cabo en un baño de agua a 95 °C durante 20-30 minutos (dependiendo del antígeno) usando tampón de pH alto (pH 9) (DAKO) para FGF2, SDC1, MMP9 y CD68, o tampón de pH bajo (pH 6) (DAKO) para CD30, TGFp1 y CD20. Las secciones se enfriaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se lavaron dos veces con PBS durante 5 minutos. Las peroxidasas endógenas se inactivaron incubando las secciones en solución de H2O2 al 3 % en PBS durante 10 minutos seguido de lavados rápidos en PBS a temperatura ambiente. Un bolígrafo PAP hidrófobo (Vector Labs, Burlingame, CA) se utilizó para hacer una presa alrededor de las secciones, que luego se bloquearon a temperatura ambiente durante 2 horas con BSA al 1 % que contenía suero porcino al 5 % en PBS, seguido de incubación durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C. Se usaron anticuerpos monoclonales para CD30 (clon Ber-H2, DAKO), SDC1 (clon BB4, Abd Serotec), CD68 (clon PG-M1, DAKO) y CD20 (clon L26, DAKO) a diluciones de 1:20, 1:40, 1:50 y 1:100, respectivamente. Se usaron anticuerpos policlonales de conejo para FGF2 (Santa Cruz), TGFp1 (Santa Cruz) y MMP9 (DAKO) a diluciones de 1:200, 1:200 y 1:100, respectivamente. Las secciones teñidas se lavaron tres veces en PBS/Tween-20 al 0,1 % durante 5 minutos cada una y luego una vez en PBS durante 5 minutos. La detección de la señal se llevó a cabo utilizando un kit de marcaje de estreptavidina-biotina (LSAB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (DAKO), con modificaciones menores. En resumen, las secciones se incubaron en inmunoglobulina de anti-conejo en cabra y de anti-ratón en cabra aislada por afinidad marcada con biotina en PGS que contenía proteína estabilizante y azida sódica 0,15 mol/l (anticuerpo de enlace biotinilado) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces en PBS al 0,1%. que contiene proteínas estabilizantes y agentes antimicrobianos durante 5 minutos cada uno. A continuación, las secciones se incubaron en estreptavidina-HRP durante 30 minutos y se lavaron tal como se describe anteriormente. Las señales se visualizaron incubando los portaobjetos en una solución de 1 ml de tampón de sustrato con 1 gota de cromógeno y se enjuagaron inmediatamente con agua del grifo. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina (Vector Labs) durante 22 segundos y se lavaron inmediatamente con agua del grifo antes de montarlas con Aqua Mount (Vector Labs). Se generaron fotomicrografías de tejidos teñidos con una cámara Axio Cam MRc acoplada a un microscopio Axio Imager (Carl Zeiss, Thornwood, Nueva York). Los portaobjetos de control positivo incluyeron amígdalas para CD20, CD68 y SDC1 y ALCL para CD30 (en matriz de linfoma). Para la puntuación cualitativa, a ninguna tinción se le asignó una puntuación de 0, tinción débil 1, tinción moderada 2 y tinción intensa, 3.
Inmunofluorescencia
Se realizó un análisis de inmunofluorescencia doble en secciones de tejido de 8 |jm frescas congeladas (FC) fijadas con formalina, embebidas en parafina (FFEP) y en medio de temperatura de corte óptima (TCO) de 5 jm que se montaron en portaobjetos helados cargados positivamente (Histoserv, Germantown, MD). Las secciones de FFEP se procesaron de manera similar a la preparación utilizada para IHQ. Las secciones FC incluidas en la TCO se descongelaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se enjuagaron brevemente en PBS y luego se fijaron en formaldehído al 3,7 % (Electron Microscopy Sciences, PA) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las etapas restantes para la detección de la señal de inmunofluorescencia se llevaron a cabo utilizando un sistema de detección de amplificación de señal de tiramida (AST) (Invitrogen), un método de detección mediado por enzimas que utiliza peroxidasa de rábano picante (HRP) para generar un marcaje de alta densidad de una proteína o ácido nucleico diana in situ, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, la solución madre de tiramida se preparó disolviendo el material sólido proporcionado (Componente A) en 150 j l de DMSO (Componente B) e invirtiendo el vial varias veces para disolver cualquier tiramida que recubre los lados del vial. Se preparó una solución al 1% (10 mg/ml) de reactivo de bloqueo (BSA) en PBS. La solución madre de conjugado de HRP se preparó reconstituyendo el material proporcionado en 200 j l de PBS. Se preparó tampón de amplificación/H2O2 al 0,0015 % añadiendo peróxido de hidrógeno al 30 % (Componente F) al tampón de amplificación (Componente E) para obtener una concentración final de H2O2 al 0,0015 %. Las células o el tejido se enjuagaron con PBS que se calentó a 37 °C y se fijaron con formaldehído al 3,7% o paraformaldehído, en PBS a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, las células o el tejido se enjuagaron con PBS, se permeabilizaron con una solución de Triton® X-100 al 0,1-0,2 % durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, o con acetona a <-20 °C durante 10 minutos y se volvió a enjuagar con PBS. Después de enjuagar con PBS, las células o el tejido se incubaron con reactivo de bloqueo al 1 % durante 60 minutos a temperatura ambiente o 37 °C. Las células o el tejido se marcaron con anticuerpo primario diluido en reactivo de bloqueo al 1 % durante 60 minutos a temperatura ambiente y se enjuagaron tres veces con PBS. A continuación, se preparó una solución de trabajo del conjugado de HRP diluyendo la solución madre a 1:100 en una solución de bloqueo al 1 % y se aplicaron 100 j l de la solución de trabajo del conjugado de HRP a las células o tejido y se incubaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Las células o el tejido se enjuagaron tres veces con PBS. A continuación, se preparó una solución de trabajo de tiramida diluyendo la solución madre de tiramida a 1:100 en tampón de amplificación/H2O2 al 0,0015 % justo antes del marcaje y se aplicaron 100 j l de la solución de trabajo de tiramida a las células o tejido y se incubaron durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Las células o el tejido se enjuagaron tres veces con PBS. Las células o el tejido se montaron y examinaron mediante microscopía de fluorescencia. Se detectaron señales monoclonales y policlonales con los colorantes Alexa Fluor® de alto rendimiento Alexa Flúor 488 y Alexa Flúor 546, respectivamente. Los anticuerpos utilizados fueron los mismos que para la inmunohistoquímica, excepto que se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo SDC1 (Sigma-Aldrich) para la doble tinción de CD30-SDC1. Los portaobjetos se contratiñeron con Hoechst 33342, se visualizaron con un microscopio invertido Leica DMI 6000B y se analizaron con el programa informático Leica MM AF, versión 1.5 (Leica Microsystems). Los portaobjetos se revisaron y verificaron de forma independiente por dos patólogos.
Estadísticas
Los análisis de datos se realizaron utilizando SAS 9.1.3, StatView 5 o JMP 4. Se utilizaron análisis de contingencia y razón de verosimilitud para determinar la independencia de la estadificación y el pronóstico. El múltiplo de variación medio para cada muestra se determinó a partir de triplicados de los datos de qRT-PCR. El análisis de varianza (ANOVA) y la estadística F se utilizaron para determinar las diferencias entre las medias del grupo de mal pronóstico y otros grupos de pronóstico. Se utilizó la diferencia mínima significativa protegida de Fisher (PLSD) para determinar las diferencias significativas por pares entre las medias de los grupos.
Ejemplo 1: Características de las muestras clínicas
Las características de las muestras clínicas para LSP se enumeran en la Tabla 8. Las muestras clínicas retrospectivas de LSP recolectadas de 25 pacientes con NS-LHc (edad promedio: 34,48 años, intervalo: 20-79, 13 mujeres y 12 hombres) se clasificaron en tres grupos según su respuesta a la terapia de primera línea: (1) buen pronóstico antes del tratamiento: sin quimioterapia previa, supervivencia sin recaída/sin progresión > 4 años (BP, n=12); (2) mal pronóstico antes del tratamiento: sin quimioterapia previa, refractarios primarios o recidivantes tempranos (MP(SQ), n=6); y (3) mal pronóstico tras el tratamiento: expuestos a quimioterapia, recaídas múltiples en 4 años (MP(EQ), n=7). Entre los pacientes sin quimioterapia previa al tratamiento (n=18), el 68 % fueron diagnosticados durante los primeros estadios de la enfermedad (I y II), el 10 % (n = 2) en el estadio III y el 15 % (n=3) en el estadio IV. De los diagnósticos de etapa temprana (I y II, n=13), más del 30 % (n=4) fueron refractarios primarios o desarrollaron recaídas tempranas poco después de la terapia de primera línea. Las restantes muestras de MP(EQ) procedían de estadios avanzados (III y IV). También, el 56 % (n=14) de los pacientes eran más jóvenes que la edad promedio (34,48 años) en el momento del diagnóstico.
Ejemplo 2: Bioinformática y minería de datos para posibles biomarcadores
Para mejorar la especificidad de posibles biomarcadores de malos pronósticos, se utilizó un enfoque basado en bioinformática. Los enfoques guiados por bioinformática tienen la ventaja única de evitar los desafíos que surgen del coste, tiempo y trabajo necesarios para identificar posibles biomarcadores de enfermedades humanas.
Se seleccionaron posibles biomarcadores para LH del Índice de genes del cáncer y se cribaron usando una biblioteca de líneas celulares de LH. La plataforma del programa informático BioXM (Sophic Alliance, Rockville, MD) se utilizó para extraer datos publicados de más de 7.000 genes de cáncer y 2.200 genes de biomarcadores. Estos genes fueron anotados y validados a partir de 18 millones de resúmenes de Medline y 24.000 genes HUGO utilizando una combinación de métodos algorítmicos (Biomax Informatics, Múnich, Alemania), incluido el procesamiento del lenguaje natural (PLN), códigos de función de biomarcadores, el Tesauro del cáncer del NCI y los códigos de evidencia de Karp (Karp PD et al., Pacif Sympo Biocomp; 2004: 190-201). La recopilación de los resultados dio como resultado la identificación de 151 genes de biomarcadores de LH candidatos (Tabla 5).
Ejemplo 3: El pronóstico clínico de los pacientes con LH no se asocia con la estadificación del tumor, la edad, el volumen o la terapia de primera línea
En este estudio, se realizaron análisis de contingencia en 25 pacientes con NS-LHc para determinar si existe una asociación entre el pronóstico clínico y la estadificación del tumor, la edad del paciente, la enfermedad voluminosa o la terapia de primera línea. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 1. Los análisis de contingencia de 25 pacientes con NS-LHc no identificaron asociaciones entre los pronósticos clínicos (buen pronóstico (BP), n=12, frente al mal pronóstico (MP), n=13) y características clínicas principales tales como el estadio clínico (p > 0,4), el grupo de edad (p > 0,11), la enfermedad voluminosa (con o sin inclusión de datos no especificados, p > 0,18) y terapia de primera línea (p > 0,27) (Figura 1, Tabla 8). El mismo análisis del conjunto de datos con el grupo MP(eQ) excluido tampoco pudo identificar ninguna relación entre el resultado y el fenotipo clínico. Este resultado difiere de las tendencias establecidas que se utilizan en los esquemas de estratificación de los sistemas de puntuación de pronóstico actuales. Sin limitarse a la teoría, estos resultados sugieren que puede haber vías moleculares indeterminadas que están alteradas en subconjuntos de pacientes con NS-LHc que están predispuestos a una enfermedad refractaria primaria o experimentan múltiples recaídas poco después de los tratamientos de primera línea, es decir, la alteración de la señalización molecular específica puede contribuir al pronóstico clínico. Ejemplo 4: FGF2 y SDC1 están sobreexpresados por las líneas celulares de LH
En este estudio, se utilizaron diez líneas celulares de LH para identificar genes identificados por bioinformática sobreexpresados por células de linfoma de Hodgkin. Las líneas celulares de LH establecidas representan LH de mal pronóstico porque se generaron a partir de células primarias de Hodgkin y Reed-Sternberg (HRS) aisladas de sitios extranodulares de derrame pleural, médula ósea o sangre periférica. El LH extranodular implica diseminación linfática y hematógena a través de la circulación.
Se aisló ARN de las diez líneas celulares de LH enumeradas en la Tabla 6 y se examinó mediante qRT-PCR para determinar la expresión alterada de un conjunto de genes identificados por bioinformática que representan múltiples vías de señalización como la apoptosis, proliferación, angiogénesis y metástasis (Tabla 5). Los resultados de este estudio se representan en la Figura 2. Los datos de detección de expresión para estos genes mostraron una sobreexpresión consistente y sólida de FGF2 y SDC1 en ocho de diez líneas celulares de LH que se obtuvieron originalmente de HRS primario, en comparación con su expresión por linfocitos B primarios (Figura 2A).
Ejemplo 5: Las células CD30+ sobreexpresan FGF2 y SDC1 en pacientes con LH de mal pronóstico (MP) En este estudio, se emplearon inmunohistoquímica y qRT-PCR para determinar si los genes FGF2 y SDC1 están sobreexpresados por células CD30+ en pacientes con LH de mal pronóstico (MP). CD30 y CD15 son marcadores que se sabe que se expresan en células de Reed-Sternberg (HRS) de linfoma de Hodgkin clásico.
Para determinar si FGF2 y SDC1 se sobreexpresan específicamente en muestras de pacientes con LH, se analizaron 48 LH y 116 subtipos principales de secciones de tejido de linfoma no de Hodgkin (LNH) en un formato de micromatriz de tejido mediante métodos inmunohistoquímicos. La puntuación cualitativa de la inmunotinción mostró que FGF2 y SDC1 se sobreexpresaban predominantemente en LH en comparación con LNH o nódulos linfáticos normales (p <0,05) (Figura 2B).
Además, se analizaron 67 muestras de LH archivadas con datos de resultados clínicos mediante qRT-PCR y métodos inmunohistoquímicos para determinar el perfil de expresión génica de FGF2 y SDC1 en tejidos de LH. La Figura 2 muestra los resultados de este estudio. Los datos de PCR mostraron que, en comparación con los controles normales de los nódulos linfáticos, todos los tejidos de LH sobreexpresaron FGF2 y SDC1. Los tejidos de pacientes con malos pronósticos (n=9) mostraron aumentos de 246 y 91 veces en los niveles de FGF2 y SDC1, respectivamente, mientras que los tejidos de los pacientes con buenos pronósticos (n=20) tuvieron solo aumentos respectivos de 10 y 2 veces. Por lo tanto, el grupo de mal pronóstico expresó 24 veces más FGF2 y 56 veces más SDC1 que el grupo de buen pronóstico (Figura 2C). La expresión de CD30 se incrementó 59 veces en el grupo de mal pronóstico y 3 veces en el grupo de buen pronóstico. Sin limitarse a la teoría, estos datos sugieren que la diferencia de veces entre los grupos de malos pronósticos y buenos pronósticos se debe en gran medida a las células CD30 positivas (CD30+) en el grupo de malos pronósticos. La inmunotinción de FGF2 y SDC1 fue intensa en el grupo de malos pronósticos, pero de débil a moderada en el grupo de buenos pronósticos (Figura 2D). En los tejidos de LH del grupo de malos pronósticos, se observaron células CD30+FGF2+SDC1+ en grupos en tejidos de 1H de montaje completo (datos no mostrados). La inmunotinción de los mismos tejidos indicó que la expresión de CD20 (antígeno de linfocito B) se redujo significativamente en todos los tejidos de LH en comparación con los controles normales (Figura 2E). Sin limitarse a la teoría, estos datos sugieren que el aumento en la tinción y la expresión génica de FGF2 y SDC1 en el grupo de malos pronósticos es una consecuencia de un mayor número de células CD30+ en lugar de linfocitos B CD20+.
Ejemplo 6: Las células CD30+ coexpresan FGF2 y SDC1 en tejidos ricos en macrófagos del grupo de malos pronósticos (MP) de pacientes con LH
En este estudio, se realizó un análisis de inmunofluorescencia doble en tejidos ricos en macrófagos congelados frescos embebidos en FFEP y TCO de diferentes etapas y subtipos de LH para determinar si los genes FGF2 y SDC1 están sobreexpresados por células CD30+ en pacientes con LH de mal pronóstico (MP). CD30 y CD15 son marcadores que se sabe que se expresan en células de Reed-Sternberg (HRS) de linfoma de Hodgkin clásico.
El análisis de doble inmunofluorescencia de tejidos de LH mostró que todas las secciones del grupo de mal pronóstico tenían grupos de células CD30+ que coexpresaban FGF2 o SDC1 (Figura 3A). La mayoría de los tejidos mostraron tinción débil o nula con FGF2 o SDC1 o tinción débil tanto para FGF2 como para SDC1 (gráfico de la Figura 3B). Todas las células FGF2+/SDC1+ con fluorescencia intensa (n=6) se asociaron con el grupo de mal pronóstico y, a menudo, se agruparon en varias regiones dentro de los tejidos del montaje completo de LH. Se observaron agrupaciones de células FGF2-/SDC1+ y FGF2+/SDC1- en cada uno de los restantes tejidos de LH de mal pronóstico (n=3). También, se observaron agrupaciones de células FGF2+/SDC1- o FGF-/SDC1- en tejidos de LH de buen pronóstico (gráfico de la Figura 3B). Estos resultados sugieren que la coexpresión de FGF2 y SDC1 en células CD30+ o en grupos de células puede desencadenar una señalización molecular que contribuye a un mal pronóstico clínico. Un análisis de Kaplan-Meier también indicó que el inmunofenotipo FGF2+/SDC1+ de las células CD30+ está asociado con una supervivencia más corta (no mostrado).
Recientemente se demostró que los macrófagos asociados a tumores CD68+ están asociados con resultados adversos, incluida la supervivencia acortada (Steidl C et al., N Engl J Med 2010, 362(10): 875-885), que es una consecuencia del LHc refractario primario y recidivante temprano. Por lo tanto, los presentes inventores evaluaron el número de macrófagos asociados a tumores CD68+ en los grupos de buen pronóstico y de mal pronóstico. Más macrófagos asociados a tumores CD68+ estaban presentes en el grupo MP que en el grupo BP o entre los controles normales (Figura 3C). La inmunotinción de CD68 también fue más intensa en el grupo MP que en los otros grupos (Figura 3C). El análisis de los macrófagos asociados a tumores CD68+ y los datos de tinción IHQ se verificaron mediante qRT-PCR, lo que demostró que la expresión de CD68 en el grupo de mal pronóstico fue 77 veces mayor que en el grupo de buen pronóstico y 224 veces mayor que en los nódulos linfáticos normales (Figura 3C, gráfico). Sin limitarse a la teoría, estos resultados sugieren que una gran población de macrófagos tumorales promueve un resultado clínico deficiente al potenciar las células tumorales CD30+ agresivas en un subconjunto de pacientes con LH, y algunas de estas células CD30+ expresan FGF2 y SDC1.
Ejemplo 7: Los marcadores metastásicos TGFB1 y MMP9 están sobreexpresados en el grupo de pacientes de l H y en las líneas celulares de LH con mal pronóstico (MP)
El mal pronóstico en el LH se correlaciona típicamente con la presencia de células tumorales en sitios extraganglionares distantes del tumor primario. Para investigar el potencial metastásico de los tejidos de LH que tienen una abundancia de células CD30+/FGF2+/SDC1+ y un resultado clínico deficiente, se inmunotiñeron secciones de tejido para la expresión de marcadores metastásicos TGFpl y MMP9 (Figura 4A).
Los tejidos de LH del grupo de mal pronóstico se tiñeron intensamente para MMP9 y TGFpl en comparación con el grupo de resultado bueno y con los ganglios linfáticos normales (Figura 4A). El análisis cuantitativo por qRT-PCR de la expresión génica de MMP9 y TGFpl en el grupo de mal pronóstico mostró aumentos de 45 y 52 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de buen pronóstico (después de la normalización frente a los nódulos linfáticos normales). El aumento medio en la expresión de MMP9 en el grupo de mal pronóstico fue de 1457 veces, mientras que el grupo de buen pronóstico tuvo niveles que aumentaron 26 veces en comparación con los ganglios linfáticos normales, lo que sugiere que los tejidos del LH de mal pronóstico tienen un alto potencial metastásico. Debido a que las líneas celulares de LH representan potencialmente un mal pronóstico, la expresión de MMP9 y TGFp1 en estas líneas celulares se analizó mediante PCR. Los resultados mostraron que las líneas celulares de LH expresaban más MMP9 y TGFp1 que los linfocitos B normales (Figura 4A). El análisis de doble inmunofluorescencia mostró que una subpoblación de células CD30+ sobreexpresa TGFp1 y MMP9 (Figura 4B y y4C), lo que sugiere que las células CD30+/TGFp1+ y CD30+/MMP9+ pueden potenciar un entorno metastásico que permite que las células tumorales CD30+ de LH salgan del microambiente del tumor local.
Los resultados de este estudio mostraron que los marcadores metastásicos establecidos MMP9 y TGFp1 estaban sobreexpresados por subconjuntos de células CD30+/FGF2+/SDC1+ en muestras de tejido de pacientes con MP. Se sabe que las células de Reed-Sternberg (HRS) del linfoma de Hodgkin clásico producen TGFp1 activado en muestras de tumores primarios (Newcom SR, Gu L, J Clin Pathol 1995, 48(2): 160-163), mientras que la sobreexpresión de MMP9 se asocia con pronósticos clínicos adversos en el LH (Kuittinen O et al., Eur J Haematol 2002, 69(4): 205-212). Sin limitarse a la teoría, estos datos sugieren que las células HRS que albergan el inmunofenotipo FGF+/SDC1+ y expresan tanto MMP9 como TGFp1 son las células con más probabilidades de ser eliminadas del microambiente tumoral y que la interacción molecular de FGF2, SDC1, MMP9 y TGFp1 pueden desempeñar un papel en la metástasis de LH.
Ejemplo 8: FGF2 y SDC1 se sobreexpresan en posibles células CD15+/CD30+ en circulación en pacientes con LH de mal pronóstico (MP)
Para determinar si una subpoblación de células tumorales CD30+ (es decir, HRS) se estaba desprendiendo potencialmente del microambiente tumoral local y entrando en la circulación, los presentes inventores analizaron muestras de LSP recolectadas de pacientes con LH antes de los tratamientos de primera línea (sin quimioterapia previa: SQ) o después del tratamiento para múltiples recaídas (expuestos a quimioterapia: EQ). CD30 y CD15 son marcadores que se sabe que se expresan en células de Reed-Sternberg (HRS) de linfoma de Hodgkin clásico.
En pacientes con LH basal, los resultados de la qRT-PCR mostraron que las células del grupo de mal pronóstico sobreexpresaban CD15 y CD30 en 41 y 113 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de buen pronóstico después de la normalización con respecto a los linfocitos B purificados (Figura 5A). En este análisis, el aumento significativo en la expresión del marcador observado para los grupos de mal pronóstico se eliminó en el grupo de mal pronóstico expuestos a la quimioterapia (Figura 5A). Sin limitarse a la teoría, estos datos sugieren que los tratamientos de quimioterapia destruyeron las células CD15+/CD30+ en la circulación. Se observó una diferencia moderada en la expresión del marcador entre el grupo de buen pronóstico SQ y el grupo de control normal (n = 10).
Para determinar si las células en circulación que sobreexpresan CD15+/CD30+ se originaron a partir de otros tipos de células en la sangre, se analizaron los niveles de expresión de marcadores específicos de células establecidos, incluyendo CD14 (monocitos, macrófagos, neutrófilos, granulocitos y células dendríticas), CD63 (activación de basófilos), CD4 (linfocitos T colaboradores), CD8 (linfocitos T citotóxicos), CD38 y CD19 (linfocitos B) (Figura 5B). Entre los pacientes con LH SQ, en comparación con el grupo de buen pronóstico, se vio una regulación negativa significativa de la expresión de CD14 (-7,150 veces), CD63 (-966 veces), CD4 (-1,287 veces), CD8 (-2625 veces), CD38 (-253 veces) y CD19 (-10,954 veces) para el grupo de mal pronóstico (Figura 5B). Los niveles de expresión de CD8, CD38 y CD19 en pacientes con LH expuestos a quimioterapia fueron similares a los niveles en el grupo de pacientes de buen pronóstico SQ, aunque la regulación negativa de la expresión de CD8 y CD19 fue significativamente menor (-125 veces para CD8 y -19,085 veces para CD19) que en muestras normales. Aunque la regulación a la baja de CD14, CD63, CD4 y CD38 entre el grupo de pacientes de LH con buen pronóstico SQ fue similar a los controles normales, CD8 y c D19 estaban significativamente regulados negativamente (CD8 en -125 veces y CD19 en -19,085 veces) en los pacientes de buen pronóstico SQ en comparación con las muestras normales (Figura 5B). Las firmas de regulación negativa de los marcadores celulares en el grupo de mal pronóstico SQ fueron directamente opuestas a las de la firma de regulación positiva CD15+/CD30+. Sin limitarse a la teoría, estos datos sugieren que las células CD15+/CD30+ en el grupo de mal pronóstico SQ provenían potencialmente de las células tumorales de LH en circulación (Figura 5A y 5B). En estas células en circulación, los genes FGF2 y SDC1 se sobreexpresaron 17 y 9.764 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de buen pronóstico (Figura 5C). Esta diferencia de veces se redujo en los pacientes con LH recidivante en el grupo de EQ en relación con el grupo SQ con buen pronóstico, lo que indica que FGF2 y SDC1 son biomarcadores basales sólidos para predecir los resultados clínicos de los pacientes con LH SQ.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en un sujeto tratado con un primer régimen de tratamiento que comprende:
(a) proporcionar una muestra aislada del sujeto y una muestra aislada de un sujeto de control con buen pronóstico clínico;
(b) aislar el ARN total que comprende ARN de CD30, ARN del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2), ARn de TGFp1, ARN de MMP9 y ARN de Sindecan-1 (SDC1) de la muestra aislada del sujeto y de la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico;
(c) amplificar el ARN total de la etapa (b);
(d) medir un nivel de expresión del Ar N de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFp1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto y en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico;
(e) comparar el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFpl, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la etapa (d) en la muestra aislada del sujeto con el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFpl, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la etapa (d) en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN CD30, el ARN de fGf2, el ARN de TGFpl, el ARN de MMP9 y el ARN de SDc 1 en la muestra aislada del sujeto en comparación con el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFpl, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico es indicativo de recurrencia de LH en el sujeto;
(f) predecir la recurrencia del linfoma de Hodgkin (LH) en el sujeto basándose en la etapa (e).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra aislada del sujeto y la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico se seleccionan del grupo que consiste en una biopsia de tumor, sangre, un nódulo linfático y leucocitos de sangre periférica (LSP).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la amplificación se realiza mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
4. Un método para predecir un mal pronóstico clínico en un sujeto con linfoma de Hodgkin (LH) que comprende: (a) proporcionar una muestra aislada del sujeto con LH y una muestra aislada de un sujeto de control con buen pronóstico clínico;
(b) aislar el ARN total que comprende ARN de CD30, ARN del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2), ARn de TGFpl, ARN de MMp9 y ARN de Sindecan-1 (SDC1) de la muestra aislada del sujeto con LH y de la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico;
(c) amplificar el ARN total de la etapa (b);
(d) medir un nivel de expresión del Ar N de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFp1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto y en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico;
(e) comparar el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFp1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la etapa (d) en la muestra aislada del sujeto con LH con el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFp1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la etapa (d) en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico, en donde un mayor nivel de expresión del ARN CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFp1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto con LH en comparación con el nivel de expresión del ARN de CD30, el ARN de FGF2, el ARN de TGFp1, el ARN de MMP9 y el ARN de SDC1 en la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico es indicativo de mal pronóstico clínico para el sujeto con LH; y
(f) predecir un resultado clínico deficiente para el sujeto con LH según la etapa (e).
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la muestra aislada del sujeto y la muestra aislada del sujeto de control de buen pronóstico clínico se seleccionan del grupo que consiste en una biopsia de tumor, sangre, un nódulo linfático y leucocitos de sangre periférica (LSP).
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la amplificación se realiza mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
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