ES2830258T3

ES2830258T3 - Métodos de evaluación genómica del ganado

Info

Publication number: ES2830258T3
Application number: ES16856306T
Authority: ES
Inventors: John Dobrinsky; Juan F Moreno; Claas Heuer; David Kendall
Original assignee: Inguran LLC
Current assignee: Inguran LLC
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2021-06-03
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: EP3362578A2; US20170107572A1; CA2963821A1; MX2022001879A; WO2017066622A3; WO2017066622A2; EP3741870A1; DK3362578T3; MX2017004927A; US10323280B2; EP3362578B1; CA3000506A1; BR112017016880B1; EP3362578A4; BR112017016880A2; NZ740961A; NZ757571A; MX2022000289A; US20190323081A1

Abstract

Un método para determinar un valor genómico estimado de cría selectiva (GEBV) o una capacidad de transmisión genómica prevista (GPTA) de un feto mamífero no humano que comprende: extraer ADN de uno o más amniocitos fetales; genotipificar el ADN con el fin de obtener un genotipo para el feto; y determinar un GEBV o una GPTA del feto basándose en el genotipo.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de evaluación genómica del ganado

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Cuando se producen generaciones futuras de animales del mérito genético más elevado o de valor genómico de élite, se debe realizar una selección crítica de los posibles animales de cría selectiva. Tan solo se puede recolectar el germoplasma de los animales de más élite y utilizarse a nivel del núcleo genético. El germoplasma puede incluir, sin carácter limitante, gametos tales como esperma y ovocitos, pero también embriones, fetos, células o tejidos somáticos y neonatales procedentes de animales vivos.

Con este fin, la evaluación genómica en la industria del ganado se ha convertido en una herramienta valiosa a la hora de evaluar animales jóvenes y de incrementar la evolución genética al aumentar la precisión de la selección y reducir el intervalo generacional. Normalmente, los animales jóvenes se evalúan genómicamente poco después de su nacimiento o como adultos jóvenes, por consiguiente, resulta necesario destinar recursos significativos para asistir a la madre durante la gestación fetal aunque el mérito genético de las crías sea desconocido.

La transferencia embriónica es un procedimiento que sigue a la fertilización (ya sea in vivo o in vitro) e implica la transferencia de uno o más embriones, desde un tubo de ensayo o la madre biológica, hasta un animal receptor para su gestación y nacimiento. La transferencia embriónica es otra herramienta para incrementar la evolución genética, ya que aumenta la intensidad de la selección haciendo posible el uso de un menor número de hembras de élite como madres de muchas crías y también puede reducir el intervalo de la generación en el caso de que los donantes hembra de huevos ovulen antes de lo que normalmente podrían para dar a luz. En la industria del ganado, la mayor parte de los gastos de cualquier programa de transferencia embriónica representan el coste y el mantenimiento de los animales receptores en los que se introducen los embriones para su gestación, lo cual puede limitar su aplicación.

La clonación es otra herramienta más que se puede utilizar para incrementar la evolución genética mediante el aumento de la precisión de la selección. Remítase a Bousquet y Blondin, “Potential Uses of Cloning in Breeding Schemes: Dairy Cattle”, Cloning and Stem Cells, vol. 6, n.° 2, resumen (2004). La clonación también se puede utilizar para acelerar la diseminación genética de genes procedentes de animales de mérito genético excepcionalmente elevado para la población comercial. Id. Sin embargo, la aplicabilidad de la clonación ha sido limitada hasta la fecha, debido al lapso de tiempo que debe transcurrir antes de que un animal clonado pueda participar en un programa de cría selectiva. Id. en 193.

Kasinathan, P. et al. (“Genomic selection of in vitro produced and somatic cell nuclear transfer embryos for rapid genetic improvement in cattle production”, (2015)) y Kadarmideen, H. et al. (“Genomic selection of in vitro produced and somatic cell nuclear transfer embryos for rapid genetic improvement in cattle production”, 2015)) se centran ambos en la evaluación genómica de embriones preimplantados, donde las células utilizadas para la evaluación genómica se obtienen in vitro antes de transferir los embriones al receptor.

Por consiguiente, resulta necesario incrementar la evolución genética y/o la diseminación genética mediante el aumento y la mejora del uso de evaluación genómica, transferencia embriónica y clonación en la industria del ganado, así como también reducir el mantenimiento y los costes asociados con el mantenimiento de los animales receptores utilizados en la transferencia embriónica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar un valor genómico estimado de cría selectiva (GEBV, por sus siglas en inglés) o una capacidad de transmisión genómica prevista (GPTA, por sus siglas en inglés) de un feto mamífero no humano que comprende extraer ADN de uno o más amniocitos fetales que genotipifique el ADN con el fin de obtener un fenotipo para el feto, y determinar un GEBV o una GPTA del feto basándose en el genotipo.

En ciertas realizaciones, los amniocitos para su uso en la invención son células madre mesenquimales derivadas del fluido amniótico. Un aspecto determinado de la invención contempla que el ADN se genotipifique utilizando un BovineSNP50 v1 BeadChip, Bovine SNP v2 BeadChip, Bovine 3K BeadChip, Bovide LD BeadChip, Bovine HD BeadChip, Geneseek® Genomic Profiler™ LD BeadChip o Geneseek® Genomic Profiler™ HD BeadChip. Una realización adicional de la invención comprende además verificar el parentesco del feto basándose en el genotipo.

En otras realizaciones de la invención, el GEBV se utiliza para determinar la capacidad de transmisión genómica prevista (GPTA). En realizaciones adicionales, los GEBV se utilizan en el cálculo del índice de rendimiento genómico total (GTPI®, por sus siglas en inglés), que es un índice de selección genómica utilizado en animales relacionados con productos lácteos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra una distribución de EBV para una población de candidatos de selección, que incluye EBV para animales seleccionados para un programa de cría selectiva con el fin de producir progenitores y EBV para animales seleccionados para un programa de producción de embriones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención es un método para determinar un valor genómico estimado de cría selectiva (GEBV) o una capacidad de transmisión genómica prevista (GPTA) de un feto mamífero no humano.

Ciertas realizaciones de la divulgación se pueden utilizar para seleccionar en contra de la producción de animales de valor genético y/o genómico inferior o desfavorable, a la vez que se selecciona la producción de los fenotipos de élite más productivos, con las tasas de denominación más elevadas, disponibles en un sistema de núcleo genético. Por consiguiente, ciertas realizaciones de la divulgación utilizan herramientas genómicas, evaluación genética y genómica exhaustiva para la producción, salud, fertilidad y otros rasgos fisiológicos que se basan en el análisis de los datos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) procedentes de información de referencia histórica, a continuación combinan los genotipos de cría selectiva en un programa de cría selectiva molecular y basado en biotecnología con el fin de maximizar la evolución genética en una línea, manada o núcleo genético. Se crean embriones in vivo e in vitro a partir de hembras y toros de élite para producir descendencia con potencial para el mérito genético más elevado. Estos embriones se transfieren a un grupo altamente seleccionado y cribado de receptores que se mantienen en granjas de receptores. Las hembras subrogadas con un embarazo de valor genético y/o genómico elevado se monitorizan durante el embarazo, se les verifica el sexo del feto y a continuación se someten a rotación para un diagnóstico genético basado en amniocentesis. Después de que se complete la organogénesis y cuando se está desarrollando el feto, se lleva a cabo una aspiración de células y fluido a partir del saco amniótico. Estos fluidos se recolectan en un sistema de recolección por aspiración novedoso y se llevan al laboratorio para ser transferidos a un cultivo celular. Las células y los aspirados se analizan mediante ensayos celulares y/o estrategias genómicas, las células se mantienen en cultivo para uso de confluencia, pasaje, crioconservación o producción. Tras las evaluaciones genéticas y genómicas, la información genética se puede utilizar para determinar el destino del desarrollo y la dirección de producción de cualquier embarazo competente desde un punto de vista del desarrollo. En ciertas realizaciones, los genotipos seleccionados basados en genética y genómica se colocan en un sistema de clonación somática de componentes para propagar las líneas de genotipos de mayor élite. Los criadores selectivos de especies de mamífero no humanas se centran en incrementar la tasa de evolución genética en una línea, manada o núcleo genético, así como también en incrementar la tasa de diseminación genética de genotipos superiores. A favor de estos objetivos, en varios estadios de la producción de animales los criadores selectivos están desarrollando y utilizando herramientas tales como la evaluación genómica, transferencia embriónica y clonación.

La transferencia embriónica se utiliza de manera extensa en la industria moderna del ganado. Como se ha indicado anteriormente, la principal parte de los gastos de cualquier programa de transferencia embriónica representa el coste y el mantenimiento de los animales receptores. Sin embargo, normalmente estos costes se ven compensados por el valor del animal resultante y, por lo general, cuanto mayor sea el mérito genético del animal resultante, mayor será su valor comercial. Por consiguiente, los programas de transferencia embriónica centran su énfasis en la producción de animales de alto mérito genético.

Un aspecto de la presente divulgación permite que un criador selectivo pueda discernir el mérito genético de un feto en las etapas iniciales de la gestación. La terminación de los embarazos de fetos de bajo mérito genético permite que un criador selectivo reduzca el número de animales receptores necesarios en su programa de transferencia embriónica o, como alternativa, incremente el número de fetos de alto mérito genético que se pueden producir utilizando un número dado de receptores durante un periodo determinado de tiempo. En otra realización, después de discernir el mérito genético de un feto, un criador selectivo puede decidir mantener el embarazo pero reemplazar el receptor portador del feto por un receptor nuevo; y en otra realización adicional, el nuevo receptor es portador de un feto.

Otro aspecto de la presente divulgación hace posible que un criador selectivo clone fetos de alto mérito genético en las etapas iniciales de la gestación y sin dañar al feto. Concretamente, el tejido o las células fetales que se obtienen para discernir el mérito genético (mediante amniocentesis, por ejemplo) se utilizan para producir clones mediante transferencia nuclear de células somáticas. A diferencia de la divulgación que se describe en la presente, en la industria del ganado los clones se crean normalmente a partir de células somáticas obtenidas a partir de animales adultos jóvenes y, si derivan de un feto o embrión in vitro, por lo general el embrión o feto se descarta o se ve afectado gravemente después de un proceso de este tipo. Además, incluso sin someterlos a procedimientos de biopsia, los embriones creados mediante una fertilización in vitro (IVF, por sus siglas en inglés) presentan una tasa de supervivencia significativamente más baja que sus homólogos in vivo convencionales. Por consiguiente, el uso de la presente divulgación genera la probabilidad de que los costes asociados con la evaluación genómica se podrán recuperar debido a que la evaluación genómica se lleva a cabo después de que el embrión haya establecido una gestación con éxito en el receptor.

Producción de embriones in vivo e in vitro

En ciertas realizaciones de la divulgación, los embriones se pueden producir in vivo mediante métodos tradicionales para la producción sincronizada de folículos supernumerarios, inseminación artificial (AI, por sus siglas en inglés) y recuperación de embriones intrauterina cateterizada transvaginal no quirúrgica programada. En otros aspectos de la divulgación, los embriones producidos in vitro se pueden producir en el laboratorio mediante el cultivo no habitual de ovocitos, IVF y metodologías de cultivo de embriones. En terneras peripubertales, se recuperan complejos de cúmulo-ovocitos (COC, por sus siglas en inglés) inmaduros de profase I a partir de hembras vivas de pie utilizando un sistema de recuperación de ovocitos transvaginal guiado por ultrasonidos (TVOR, por sus siglas en inglés), que también se denomina captación del óvulo (OPU, por sus siglas). En terneras prepubertales, se emplea OPU laparoscópica guiada por ultrasonidos para la recuperación de COC. Cuando los COC inmaduros se llevan al laboratorio, se colocan en un sistema de cultivo de maduración in vitro (IVM, por sus siglas en inglés) habitual, donde la mayoría de ovocitos capaces de desarrollarse experimentan una meiosis espontánea y programada. Después de un periodo de cultivo durante toda la noche, aquellos ovocitos que evolucionan a través de una meiosis I (y, por consiguiente, se desprenden de su segundo cuerpo polar y evolucionan hacia la metafase de la segunda división meiótica) y son morfológicamente normales (incluyen una membrana plasmática intacta) se utilizan en IVF. Los ovocitos maduros de hembras individuales se colocan en microgotas de IVF tradicionales y se aparean con progenitores específicos, utilizando tratamientos de capacitación de esperma precisos y altamente cribados, y se fertiliza la concentración de esperma por ovocito. Los cigotos (día 1) se colocan en un sistema de cocultivo tradicional y se cultivan hasta estadios uterinos de desarrollo en el día 7-8 de cultivo. Normalmente, los embriones se transportan a una granja de terneras receptoras donde se transfieren sin cirugía. Antes de la transferencia, los embriones pueden ser sometidos a una biopsia o se puede tomar una muestra de ellos para realizar una evaluación genómica y/o un cribado genético. Dentro de ciertos estadios específicos del desarrollo embriónico, los embriones se pueden retirar y utilizar en procedimientos de multiplicación de embriones y/o se pueden preservar criológicamente para un uso posterior. Los embriones destinados a ser transferidos a hembras subrogadas sincronizadas se transportan a la granja en cultivo y se transfieren sin cirugía mediante métodos tradicionales. En ciertas realizaciones, la divulgación contempla el hecho de que las hembras receptoras sean examinadas por veterinarios regularmente y los embarazos en curso son monitorizados de forma periódica y programada mediante una ultrasonografía transrectal a tiempo real.

Transferencia de embriones

Aunque no se requiere necesariamente, ciertas realizaciones de la divulgación engloban una transferencia embriónica. Concretamente, en algunas realizaciones, se obtienen muestras de células fetales a partir de fluido amniótico de un animal receptor en el que se ha introducido un embrión mediante una transferencia embriónica. En otras realizaciones de la divulgación, la transferencia embriónica se utiliza para transferir un embrión clonado a un receptor. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para transferir un embrión a un receptor, incluido cualquier método quirúrgico o no quirúrgico conocido. En realizaciones alternativas, se obtienen muestras de células fetales a partir de fetos que son concebidos y que se gestan completamente in vivo.

Los siguientes métodos quirúrgicos y no quirúrgicos de transferencia embriónica se proporcionan únicamente a modo de ejemplo no limitante.

En el ganado bovino, se puede transferir un embrión mediante una incisión abdominal en la línea media, o una incisión en el costado, a un receptor con anestesia general. Los receptores se sitúan en un potro de herrar que proporciona acceso a ambos costados. El cuerpo lúteo se localiza mediante palpación rectal y el costado ipsilateral respecto al cuerpo lúteo se pinza, se lava con jabón y agua, y se esteriliza con yodo y alcohol. Se administran aproximadamente 60 ml de procaína al 2% a lo largo de la línea de la incisión planeada. Se realiza una incisión cutánea de aproximadamente 15 cm de longitud, en la parte superior del costado, justo antes de la cadera. Se separan las capas musculares y se corta el peritoneo. El cirujano inserta una mano y antebrazo en la incisión, localiza el ovario, por lo general aproximadamente 25 cm tras la incisión, y visualiza o palpa el cuerpo lúteo. La trompa uterina se exterioriza cogiendo y estirando con el dedo pulgar e índice el ligamento ancho del útero, que está situado en una posición media respecto a la trompa uterina. Se realiza una herida por punción con una aguja roma a través de la pared del craneal un tercio de la trompa uterina expuesta. Utilizando aproximadamente 0.1 ml de medio en una pipeta de vidrio pequeña (< 1.5 mm de diámetro exterior), se aspira el embrión a partir del envase de almacenamiento. A continuación, la pipeta se inserta en el lumen del útero y se expele el embrión. A continuación, se cierra la incisión utilizando dos capas de suturas.

Como alternativa, se puede utilizar un método no quirúrgico para transferir un embrión en ganado bovino. En primer lugar, es necesario palpar los ovarios con el fin de seleccionar el lado de la ovulación, ya que las tasas de embarazo se reducen si los embriones se transfieren a la trompa uterina contralateral respecto al cuerpo lúteo. Los receptores deben ser rechazados si no presentan cuerpo lúteo o si se detecta una patología del sistema reproductor. El siguiente paso consiste en hacer pasar el dispositivo de transferencia embriónica, por ejemplo, una pistola de inseminación Cassou estándar, a través del cuello uterino. El tercer paso de una transferencia no quirúrgica consiste en insertar la punta del instrumento en la trompa uterina deseada en una posición ipsilateral respecto al cuerpo lúteo. El paso final del procedimiento consiste en transferir el embrión desde un envase, tal como un cilindro de plástico, en la trompa uterina deseada utilizando el dispositivo de transferencia.

Recolección de fluido amniótico

Ciertas realizaciones de la divulgación engloban métodos para recolectar fluido amniótico. Una vez se ha recolectado el fluido amniótico, un aspecto adicional incluye aislar las células fetales del fluido amniótico y realizar un análisis genómico en el ADN extraído de las células fetales. En la divulgación, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para la recolección de fluido amniótico, que incluye, sin carácter limitante, la recolección transvaginal/transuterina utilizando técnicas de punción manual o bien guiadas por ultrasonidos. Además, el fluido amniótico se puede recolectar en cualquier momento durante la gestación en una madre o receptor de transferencia embriónica, que incluye, desde el día 45 hasta el parto, o entre el día 1 y el día 10, del día 20 al día 30, del 30 al día 280, del día 40 al día 100, del día 50 al día 80, del día 60 al día 70, del día 70 al día 80, del día 80 al día 90, del día 90 al día 100, del día 100 al día 120, del día 70 al día 90, del día 75 al día 80, del día 75 al día 90, del día 70 al día 85 o del día 120 al día 280, de la gestación.

A modo de ejemplo, se puede utilizar el siguiente procedimiento de recolección en la divulgación. Un experto en la técnica sabrá que existen variaciones de este método y que no se debe interpretar que este método limite la funcionalidad ni el alcance de la presente divulgación. Este método es únicamente ilustrativo.

Obtener una madre, o receptor, bovino, con un feto en el día entre 65 y 250 de la gestación. Administrar anestesia epidural caudal estándar con lidocaína al 2%. Elevar los animales aproximadamente 40 cm por la parte delantera utilizando una plataforma con el fin de colocar el sistema reproductor hacia atrás contra la pelvis. Limpiar y desinfectar la región vulvar y las cúpulas vaginales varias veces con yodo. Retraer el útero de forma transrectal con la mano opuesta y yuxtaponer la trompa embarazada contra la pared vaginal. Insertar un transductor de ultrasonidos cubierto con una camisa estéril en la cúpula vaginal con la ayuda de una ligera lubricación aproximadamente al nivel del cuello uterino. Aspirar el fluido fetal mediante la colocación intravaginal de una aguja (0 = 1.3 mm, 68 cm de longitud) instalada en el cuerpo del transductor de ultrasonidos y conectada a un montaje de recolección de sangre con tubo de vacío. El escáner de ultrasonidos puede estar dotado de un transductor de tipo convexo de 5.0 MHz de aproximadamente 1.6 cm de ancho y 58 cm de largo. Hacer avanzar la aguja a través de las paredes uterinas y vaginales moviendo considerablemente el tubo de vacío una distancia de aproximadamente 3 a 4 cm. Si el émbolo de la jeringa encuentra resistencia, volver a posicionar la aguja y tomar otro aspirado. Transferir el aspirado a un tubo de ensayo de 10 ml estéril, colocarlo en hielo y someterlo a un análisis de ADN. Confirmar la colocación correcta de la aguja mediante la observación directa de la ultrasonografía y el remolino de fluido fetal en el tubo de vacío. La viabilidad fetal se puede evaluar entre los días 7 y 10 después del procedimiento de aspiración. Se puede realizar una tomografía del movimiento fetal independiente o del latido del corazón como prueba de viabilidad.

Otro método de recolección en ganado bovino embarazado engloba el uso de un equipo de recuperación de ovocitos transvaginal guiado por ultrasonidos (TVOR), tubo de recuperación de fluido especializado y sistema de recolección con filtro adaptado. En este ejemplo, en todo el ganado bovino destinado para amniocentesis, el embarazo se confirma y el sexo del feto se determina mediante ultrasonografía transrectal en periodos específicos después de la transferencia embriónica, el implante y la finalización de la organogénesis. En el día 45-100, o más específicamente el día 75-80, del primer trimestre de la gestación, el equipo de recuperación de ovocitos transvaginal guiado por ultrasonidos se adapta y se utiliza para visualizar el feto entero y el versículo amniótico en una trompa uterina durante la aspiración. Antes de la recolección, las terneras se contienen en potros de herrar y se sedan antes de someterlas a la amniocentesis. El personal veterinario que realiza la amniocentesis utiliza procedimientos completamente estériles, que incluyen llevar guantes de nitrilo sin polvo en las manos y la esterilización del equipo con etanol. Para garantizar que el área está exenta de contaminación antes de la inserción del transductor, se realiza un vaciado de las heces del recto y, con anestesia epidural, la vulva y el área rectal de la vaca se limpian y raspan extensivamente. El paso de desinfección se completa enjuagando la vulva y el área rectal con una solución de Betadine, y enjuagando y pulverizando el área limpiada con etanol al 70%. El equipo de TVOR se limpia y esteriliza con etanol inmediatamente antes de su introducción en la vagina y se ajusta con una guía de aguja única de acero inoxidable estéril. Se hace avanzar el equipo de TVOR en el interior de la vagina, se posiciona hacia la izquierda o la derecha de la boca del cuello uterino mediante la manipulación por el recto, la trompa uterina embarazada se posiciona contra la sonda, de manera que se evite la interposición de otro tejido en el camino propuesto de la aguja. La ubicación exacta del saco amniótico se determina mediante el reconocimiento de partes del cuerpo fetal, las membranas alantoamnióticas y alantocoriónicas y la pared uterina. Cuando se observa un área no ecogénica que representa el fluido amniótico en la pantalla del monitor, se inserta una aguja estéril con un estilete en la guía de la aguja y se hace avanzar de manera que penetre a través de la pared vaginal, el útero y las membranas fetales posteriores. Tan pronto como se observa que la punta de la aguja ha entrado en el compartimento de fluido fetal, se retira el estilete de la aguja y se coloca la aguja dentro del saco amniótico del feto. Se aspiran unos 5-10 ml iniciales de fluido fetal en el tubo y se expulsan del sistema del tubo para reducir o eliminar la contaminación materna. Se adhiere un filtro de amniocentesis al tubo y se aspiran 30-40 ml adicionales de fluido amniótico. Durante la recolección de fluido, la trompa uterina embarazada se mantiene en la misma posición y la localización exacta de la punta de la aguja se garantiza mediante su visualización en la pantalla de ultrasonidos. Cuando se recolectan muestras de más de 1 ternera el mismo día, la guíaaguja se reemplaza por una estéril y el transductor se limpia y desinfecta exhaustivamente antes de ser utilizado en el siguiente animal. Después de completar la recolección de fluido amniótico en un animal, el fluido recolectado en el sistema de filtros se introduce en hielo y se transporta de nuevo al laboratorio de cultivo celular.

Aislamiento de amniocitos a partir de fluido amniótico

El término “amniocitos”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a células obtenidas a partir de fluido amniótico, así como también a células cultivadas a partir de células obtenidas de fluido amniótico. Los amniocitos, que incluyen fibroblastos fetales y células madre mesenquimales derivadas de fluido amniótico (AFMSC, por sus siglas en inglés), utilizados en la presente divulgación se pueden obtener a partir, por ejemplo, de fluido amniótico procedente de la amniocentesis realizada para el cariotipado fetal, o fluido amniótico obtenido al finalizar el embarazo. A los efectos de la divulgación, los amniocitos se pueden aislar a partir del fluido amniótico mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante una centrifugación seguida de la eliminación del sobrenadante.

Cultivo celular de amniocitos

Un aspecto de la divulgación engloba cultivar amniocitos aislados. Los amniocitos cultivados se pueden utilizar a su vez en varias aplicaciones, que incluyen el genotipado y para la producción de clones. A modo de ejemplo, el siguiente procedimiento de cultivo se puede utilizar en ciertas realizaciones de la divulgación. Un experto en la técnica sabrá que existen variaciones de este método y que no se debe interpretar que este método limite la funcionalidad ni el alcance de la presente divulgación. El método es únicamente ilustrativo.

Los amniocitos se centrifugan (200 g, 10 min) a temperatura ambiente y el pellet se suspende de nuevo cuidadosamente en medio de Chang. Las células se colocan en placas de Petri gelatinizadas de 100 mm y se mantienen sin alteraciones. El medio se cambia cada 3-4 días. Después de 2 semanas en el cultivo, se tripsinizan para dispersar las células y permitir su crecimiento en una monocapa. Los amniocitos se cultivan a 37 °C en una atmósfera de CO²al 5% humidificada. Las células se someten a un pasaje con una proporción de 1:4 cada 5 días hasta que alcanzan un 80% de confluencia. Para pasajes posteriores, se aspira el medio, se lava con PBS y se despega con un 0.05% de tripsina durante 5 min a 37 °C.

Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales derivadas de fluido amniótico

En ciertas realizaciones de la divulgación, se puede utilizar un método de cultivo de dos etapas para aislar, cultivar y enriquecer células madre mesenquimales derivadas de fluido amniótico (AFMSC) a partir de fluido amniótico obtenido mediante amniocentesis. Supuestamente, las células madre mesenquimales de mamífero son células multipotentes que tienen el potencial de diferenciarse en múltiples linajes que incluyen hueso, cartílago, músculo, tendón, grasa de ligamento y varios tejidos conectivos diferentes. Morfológicamente, las células madre mesenquimales en su estado no diferenciado tienen forma de husillo y se parecen a los fibroblastos. Las células madre mesenquimales han sido identificadas principalmente en la médula ósea, pero también se han encontrado en sangre periférica fetal y adulta, hígado fetal, bazo fetal, placenta y sangre del cordón umbilical al final del embarazo. Cabe destacar que las células madre mesenquimales se pueden encontrar en el fluido amniótico de mamífero. En condiciones de cultivo específicas, las AFMSC de mamífero han sido inducidas para que se diferencien en adipocitos, osteocitos y células neuronales.

El protocolo de cultivo de dos etapas comprende una primera etapa de cultivo de amniocitos y una segunda etapa de cultivo de células madre mesenquimales. El método empieza preparando cultivos primarios utilizando un protocolo citogenético de cultivo de amniocitos de laboratorio. Se recolectan células de fluido amniótico no adherentes en el medio sobrenadante. Para cultivar células madre mesenquimales, las células no adherentes se centrifugan y a continuación se colocan en un frasco de cultivo con un medio esencial mínimo modificado alfa suplementado con suero bovino fetal. Para el crecimiento de células madre mesenquimales, el cultivo se incuba con CO²humidificado.

A modo de ejemplo, se puede utilizar el siguiente procedimiento de cultivo específico en ciertas realizaciones de la divulgación. Un experto en la técnica sabrá que existen variaciones de este método y que no se debe interpretar que este método limite la funcionalidad ni el alcance de la presente divulgación. Este método es únicamente ilustrativo.

Para cultivar amniocitos, preparar cuatro cultivos primarios in situ en placas de grado de cultivo tisular de 35 mm utilizando medio de Chang (Irvine Scientific, Santa Ana, Calif.). Recolectar las células de fluido amniótico no adherentes en el medio sobrenadante el 5 ° día después del cultivo primario de amniocitos y conservarlas hasta que se complete el análisis cromosómico fetal.

Para cultivar células madre mesenquimales, centrifugar el tubo que contiene las células no adherentes, a continuación colocarlas en 5-15 ml de medio esencial mínimo modificado alfa (a-MEM) suplementado con un 10-20% de suero bovino fetal (FBS) y 1-20 ng/ml de b-FGF en un frasco de cultivo de 25 cm2 e incubarlas a 37°C con un 5% de CO²para el crecimiento de las células madre mesenquimales.

Se puede utilizar citometría de flujo, RT-PCR e inmunocitoquímica para analizar las características fenotípicas de las células madre mesenquimales cultivadas. Se pueden utilizar tinciones de Von Kossa, Oil Red O y TuJ-1 para evaluar los potenciales de diferenciación de las células madre mesenquimales.

El siguiente método de cultivo adicional se presenta únicamente a modo de ejemplo. La divulgación contempla una técnica estéril, que incluye llevar guantes de nitrilo sin polvo para procesar el fluido amniótico. En ciertas realizaciones de la divulgación, todo el proceso se lleva a cabo en una vitrina de seguridad con flujo laminar para cultivos celulares y se utiliza únicamente etanol de grado alimentario en manos lavadas y con guantes siempre que sea necesario o posible.

El fluido y los amniocitos se aspiran con una pipeta en tubos cónicos de 15 ml. El filtro de la recolección se enjuaga con medio de cultivo para eliminar todas las células adheridas y se repite según sea necesario para eliminar la cantidad máxima de amniocitos del filtro. Los tubos cónicos se centrifugan hasta que se forma un pellet celular, el sobrenadante se aspira y las células se suspenden de nuevo en medio de cultivo celular. La suspensión celular se mezcla completamente y se pipetea en pocillos y/o placas de cultivo. Los cultivos celulares se colocan en una incubadora de cultivos celulares y se cultivan a 38.7 °C en un 5% de CO²/aire durante 5 días sin alteraciones. El día 5 del cultivo, las placas de cultivo celular se retiran del cultivo y el medio de cultivo celular y todas las células flotantes se aspiran y se colocan en un tubo de centrífuga de 15 ml. Las células remanentes situadas en las placas de cultivo celular originales, principalmente fibroblastos fetales y AFMSC, se alimentan con medio de cultivo fresco y se vuelven a colocar en las incubadoras de cultivos celulares y se cultivan hasta obtener una confluencia de un 80-90%. Después de conseguir la confluencia, las células se someten a un pasaje y/o crioconservación. Los amniocitos flotantes aspirados pueden iniciar un cultivo celular específico para amniocitos 0 se pueden utilizar en la evaluación de diagnóstico fetal y/o evaluación genómica y determinación del perfil. Tanto los cultivos de fibroblastos fetales colocados en placas originales como los cultivos celulares de amniocitos flotantes originales se pueden cultivar para pasajes y crioconservación indefinidos. Los fibroblastos y/o amniocitos fetales crioconservados se pueden calentar y someter a pasajes o ser utilizados en procedimientos de clonación.

Extracción y amplificación de ADN

Otro aspecto de la divulgación engloba genotipificar amniocitos. Concretamente, una vez que los fibroblastos o las células madre mesenquimales fetales han sido aislados del fluido amniótico, se puede extraer su ADN y utilizarlo para genotipificar. En una realización específica, el ADN de fibroblastos o células madre mesenquimales fetales cultivados se puede utilizar para genotipificar. El ADN de los fibroblastos o células madre mesenquimales fetales se puede extraer en primer lugar y a continuación se puede amplificar (mediante PCR) de modo que haya una cantidad suficiente de ADN para genotipificar. Como alternativa, en algunas realizaciones de la divulgación, el a Dn se puede extraer directamente de los amniocitos, incluidos los fibroblastos y las células madre mesenquimales, que se encuentran en el fluido amniótico. La divulgación engloba realizaciones en las que la cantidad de ADN que se extrae es muy baja, estando comprendida en el intervalo de 1 ng/gl a 10 ng/gl (basándose en ensayos de ADN bicatenario). La visualización utilizando geles de agarosa al 1% ha demostrado que el ADN extraído en algunos ejemplos es más grande, PM > 23000 con poco ADN fragmentado.

Para el análisis genómico, se deben extraer aproximadamente 1-200 ng de ADN bicatenario por cada muestra de ADN con una concentración por muestra de 1 -50 ng/gl. En ciertas realizaciones de la divulgación, solo son necesarios de 1 ng/gl a 10 ng/gl de ADN para el análisis genómico. En una realización particular, son necesarios menos de 15 ng de ADN total para el análisis genómico. En algunas realizaciones de la divulgación, el ADN se utiliza en el genotipado para verificación parental y evaluación genómica. La evaluación genómica para la producción, salud, fertilidad y otros rasgos fisiológicos que se utilizan en ciertas realizaciones de la divulgación se basa en el análisis de datos de SNP procedentes de datos históricos de una población de referencia mediante estudios de asociación de todo el genoma (GWAS, por sus siglas en inglés). Esta evaluación de células fetales también permite una modelización de generación rápida ya que permite la preselección del feto como un progenitor para la siguiente generación de apareamientos. Las células remanentes en el cultivo permanecen en el cultivo celular para el pasaje y la recolección y crioconservación finales para un uso productivo biológico, citogenético y de diagnóstico posterior tal como la clonación.

A modo de ejemplo, el siguiente procedimiento de extracción y amplificación de ADN se puede utilizar en ciertas realizaciones de la divulgación. Un experto en la técnica sabrá que existen variaciones de este método y que no se debe interpretar que este método limite la funcionalidad ni el alcance de la presente divulgación. Este método es únicamente ilustrativo.

Se extrae el ADN de fibroblastos del contenido de una botella de cultivo de 25 cm2 mediante el procedimiento de precipitación salina, con pequeñas modificaciones (Miller et al., 1988; Biase et al., 2002). Se utilizan 50 nanogramos de ADN genómico en 25 gL de mezcla de PCR (1 U de polimerasa Taq, dNTP 100 gM, MgCl²1 mM, 5 pmol de cada cebador) y se amplifican 36 veces utilizando las siguientes condiciones: 93 °C durante 3 min, 93 °C durante 40 s, 58 °C durante 40 segundos, 72 °C durante 40 segundos y 72 °C durante 5 min. Los cebadores están diseñados para amplificar un fragmento de 410 pb del gen NeoR (sentido: 5'-GAG-GCT-ATT-CGG-CTA-TGA-CTG-3' y antisentido: 5' -TCG-a Ca -AGA-CCG-GCT-TCC-a Tc -3') y un fragmento de 262 pb de ADN de satélite bovino I (Gaillard et al., 1981) (sentido: 5'-AGG-TCG-CGA-GAT-TGG-TCG-CTA-GGT-CAT-GCA-3' y antisentido: 5 '-AAG-ACC-TCG-AGA-GAC-CCT-CTT-CAA-CAC-GT-3').

En ciertas realizaciones de la divulgación, el ADN de amniocitos y células madre mesenquimales se puede extraer utilizando el kit genómico Purelink con n° de cat. K1820-00 (Invitrogen). En realizaciones adicionales, una vez que se ha extraído el ADN, este se puede someter a un protocolo de amplificación de todo el genoma utilizando el kit de amplificación de ADN Illustra Genomiphi V2 (GE Lifesciences), que utiliza la ADN-polimerasa phi29 para amplificar el genoma.

En otras realizaciones de la divulgación, se emplea el siguiente procedimiento de extracción de ADN.

Las células expuestas a los medios de cultivo suelen contener suero de ternera fetal. Debido a los elevados niveles de DNasa que se encuentran habitualmente en el suero de ternera fetal y la presencia de cationes que podrían catalizar la escisión hidrolítica del enlace de tipo fosfodiéster en el ADN, se añade un volumen equivalente de una solución que contiene Tris-EDTA a las células recolectadas para quelar los cationes esenciales para la actividad de la DNasa. Después de añadir el Tris-EDTA, la suspensión celular se almacena a continuación en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml a 4 °C hasta que se requiera la extracción del ADN.

Los tubos de 1.5 ml que contienen la suspensión celular se centrifugan a > 10000 x g en una microcentrífuga durante 45 segundos para obtener pellets celulares. La solución en suspensión se pipetea cuidadosamente de modo que no se retiren los pellets celulares. Se dejan aproximadamente 50 gl de la solución en suspensión en el tubo. A continuación, los tubos se agitan con vórtex durante 10 segundos para suspender de nuevo los pellets celulares. A continuación, se añaden 300 de solución de lisis para células y tejidos (Epicentre; Madison Wisconsin) que contiene 1 pl de Proteinasa K (Epicentre; Madison Wisconsin) a cada tubo y se mezclan. A continuación, los tubos se incuban a 65 °C durante 30 minutos a la vez que se garantiza que se agitan con vórtex durante 15 minutos. A continuación, las muestras se enfrían hasta 37 °C. Después, se añade 1 pl de RNasa A con una concentración de 5 mg/pl (Epicentre; Madison Wisconsin) a cada muestra y a continuación se mezcla. Posteriormente, las muestras se incuban a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, las muestras se colocan en un refrigerador a 4 °C durante 5 minutos. A continuación, se añaden 175 pl de reactivo de precipitación de proteínas MPC (Epicentre; Madison Wisconsin) a cada muestra y a continuación las muestras se agitan con vórtex enérgicamente durante 10-15 segundos. A continuación, las muestras se centrifugan para formar pellets de los residuos durante 8 minutos a > 10 000 x g. A continuación, el sobrenadante se transfiere a un tubo limpio de microcentrífuga. Se añaden 600 pl de isopropanol frío (-20°C) al sobrenadante. A continuación, cada tubo se invierte 30 40 veces. A continuación, se forman pellets del ADN mediante centrifugación durante 8 minutos en una microcentrifuga a > 10000 x g. Se vierte el isopropanol sin disgregar el pellet de ADN. El pellet se enjuaga una vez con etanol al 70% y a continuación se vierte cuidadosamente el etanol sin que se altere el pellet de ADN. A continuación, el etanol residual se elimina con una pipeta y se deja secar al aire el pellet de ADN en el tubo de microcentrífuga. Una vez seco, se suspende de nuevo el pellet de a Dn en 20 pl de Tris-EDTA.

Genotipado de ADN

En un aspecto de la divulgación, el ADN extraído y/o amplificado procedente de amniocitos y células madre mesenquimales se puede genotipificar utilizando chips o matrices de SNP, que se pueden adquirir fácilmente para varias especies de animales de empresas tales como Illumina y Affymetrix. A los efectos de la divulgación, el término “genotipado” incluye, sin carácter limitante, la obtención de datos sobre la variación del número de copias (CNV, por sus siglas en inglés) y SNP a partir del ADN. A los efectos de la divulgación, el término “genotipo” incluye, sin carácter limitante, los datos sobre la variación del número de copias (CNV) y/o SNP obtenidos a partir del ADN. Se contemplan los chips de baja densidad y alta densidad para su uso en la divulgación, incluidas las matrices de SNP que comprenden de 3000 a 800000 SNP. A modo de ejemplo, un chip de SNP de “50 K” mide aproximadamente 50000 SNP y se utiliza habitualmente en la industria del ganado para establecer el mérito genético o los valores genómicos estimados de cría selectiva (GEBV). En ciertas realizaciones de la divulgación, se puede utilizar cualquiera de los siguientes chips de SNP: BovineSNP50 v1 BeadChip (Illumina), Bovine SNP v2 BeadChip (Illumina), Bovine 3K BeadChip (Illumina), Bovide LD BeadChip (Illumina), Bovine HD BeadChip (Illumina), Geneseek® Genomic Profiler™ LD BeadChip o Geneseek® Genomic Profiler™ HD BeadChip.

Determinación de GEBV a partir de los datos de SNP

La base y el algoritmo para utilizar SNP en la determinación de GEBV se encuentran en Meuwissen et al., “Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps”, Genetics 157, 1819 1829 (2001). La implementación de los datos genómicos en las predicciones para los rasgos deseables se encuentra en Van Raden, “Efficient Methods to Compute Genomic Predictions”, Dairy Science 91,44144423 (2008).

En los Estados Unidos, el ganado se suele clasificar utilizando índices de selección que incorporan datos relacionados con varios rasgos importantes desde un punto de vista comercial. Con la aparición de la evaluación genómica, en la actualidad se utilizan habitualmente datos genómicos para producir estos rasgos. Para calcular la puntuación de un animal para un índice de selección genómica, se deben calcular en primer lugar los valores de GEBV del animal para cada rasgo en el índice, lo cual se puede conseguir utilizando la información proporcionada en Meuwissen et al. y VanRaden, mencionados anteriormente. A continuación, se determina el peso económico de cada rasgo en el índice. Finalmente, para determinar la puntuación del animal para el índice de selección, se multiplica el GEBV de cada rasgo por su peso económico y a continuación se suman todos estos valores.

Un índice genómico utilizado habitualmente en los Estados Unidos para el ganado productor de lácteos es el índice de rendimiento genómico total (GTPI®, por sus siglas en inglés), que comprende los siguientes rasgos: proteína; eficacia de alimentación; forma láctea; compuesto de piernas y pezuñas; puntuación de células somáticas; sencillez del parto de las crías hembra; grasa; compuesto de las ubres; vida productiva; índice de fertilidad; y crías hembra mortinatas. En ciertas realizaciones, la eficacia de la alimentación equivale al valor en dólares de la leche producida menos los costes de alimentación para leche extra y menos costes de mantenimiento extra, y el índice de fertilidad es una función de la tasa de concepción de las terneras, la tasa de concepción de las vacas y la tasa de embarazo de las crías hembra. En otras realizaciones de la divulgación, el GEBV se utiliza para determinar la capacidad de transmisión genómica prevista (GPTA, por sus siglas en inglés).

A modo de ejemplo, además de determinar un GEBV para un rasgo, se puede detectar la presencia o ausencia de cualquiera de las siguientes enfermedades y/o rasgos utilizando datos de SNP o datos genómicos: síndrome de Demetz; enfermedad de la ternera blanca; síndrome de Weaver (halotipo BHW); halotipo HHD; halotipo HH1; síndrome de trisomía braquignatia letal; haplotipo HH0; cardiomiopatía hereditaria bovina; cardiomiopatía dilatada bovina; lipofuscinosis ceroide neuronal; enanismo condrodisplásico bovino; orejas hendidas/orejas melladas; epilepsia idiopática; estrabismo convergente bilateral con exoftalmos; halotipo BHP; halotipo HHP; halotipo JHP; hidrocefalia/agua en el cerebro neuropática; displasia ectodérmica/defecto de anodontia e hipotricosis congénita; ictiosis fetal; deficiencia de zinc hereditaria bovina/rasgo letal A46; síndrome de Marfan; musculación doble; defectos oculares múltiples; carcinoma bovino de células escamosas oculares; dientes rosados; parálisis posterior/parálisis de extremidades traseras; halotipo BHM; encelopatía espongiforme bovina/enfermedad de las vacas locas; enfermedad del pie de mula (halotipo HHM); deficiencia de miofosforilasa; hidropesía; color del pelaje negro/rojo (halotipo HBR; halotipo HHR); deficiencia de BAND3; ataxia de Charolais; desmielinización espinal bovina (halotipo b HD); color del pelaje Dun en ganado Dexter; ataxia y convulsiones familiares bovinas; ternera bulldog; trombopatía hereditaria simental; GHRD; displasia tubular renal (RTD, por sus siglas en inglés)/nefritis intersticial crónica; cara blanca de Hereford; halotipo HHC; duplicaciones del desarrollo; riñón negro; ganado negro japonés/cardiomiopatía; síndrome de la cola torcida; pseudomiotonía congénita; artrogriposis hereditaria bovina múltiple congénita; ganado fajado; síndrome de hipoplasia generalizada capreoliforme; aracnodactilia contractural congénita; pancitopenia neonatal bovina; síndrome de la cola de rata; queilognatosquisis; síndrome de Fleckvieh blanco alemán; haplotipo JH1; síndrome de gigantismo fetal; enanismo y laxitud de las articulaciones congénitos/enfermedad de la ternera abellotada; halotipo HH2; halotipo HH3; halotipo HH4; enanismo de Holstein bull-dog; halotipo AH1; halotipo HH5; halotipo JH2 y síndrome de artrogiposis letal.

Clonación

Un aspecto adicional de la divulgación engloba clonar embriones y/o fetos que han sido evaluados genómicamente utilizando las técnicas divulgadas en la presente. Por lo general se sobreentiende que la clonación es la creación de un organismo/animal vivo que es en esencia genéticamente idéntico a la unidad o forma individual a partir de la cual se ha producido. En aquellas realizaciones de la divulgación que engloban embriones y/o fetos clonados, se puede utilizar cualquier método mediante el cual se pueda clonar un animal que sea conocido en la técnica. Por lo tanto, se contempla el hecho de que los embriones clonados y los fetos clonados se produzcan mediante cualquier método convencional, por ejemplo, incluidas las técnicas de clonación descritas en la presente, así como también aquellas descritas en la solicitud de patente internacional PCT/US01/41561. En un aspecto de la divulgación, una base para clonar un embrión o un feto es su mérito genómico. En un aspecto adicional, el mérito genético del embrión o feto se determina mediante un análisis genómico tal y como se divulga en la presente.

La clonación de embriones mediante transferencia nuclear ha sido desarrollada en varias especies. Por lo general, esta técnica implica la transferencia de un núcleo celular (obtenido a partir de una célula donante) a una célula enucleada, por ejemplo, un ovocito en metafase II. Este ovocito tiene la capacidad de incorporar el núcleo transferido y fomentar el desarrollo de un nuevo embrión (Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989; Campbell et al., Nature 380:64-66, 1996; Wilmut et al., Nature 385:810-813, 1997). Las indicaciones morfológicas de esta reprogramación son la dispersión de los nucléolos (Szollosi et al., J. Cell Sci. 91:603-613, 1988) y el hinchamiento de los núcleos transferidos (Czolowska et al., 1984; Stice y Robl, Biol. Reprod 39:657-664, 1988; Prather et al., J. Exp. Zool. 225:355-358, 1990; Collas y Robl. Biol. Reprod 45:455-465, 1991). La evidencia más concluyente de que el citoplasma de los ovocitos tiene la capacidad de reprogramarse es el nacimiento de crías a partir de embriones de trasplante nuclear en varias especies, que incluyen ovejas (Smith y Wilmut, Biol. Reprod. 40:1027 1035, 1989; Campbell et al., Nature 380:64-66, 1996; Wells et al., Biol. Reprod. 57:385-393, 1997), ganado bovino (Wells et al., Biol. Reprod. 60:996-1005, 1999; Kato et al., Science 282:2095-2098, 1998; Prather et al., Biol. Reprod. 37:859-866, 1987; Bondioli et al., Theriogenology 33:165-174, 1990), ganado porcino (Prather et al., Biol. Reprod. 41:414-418, 1989) y conejos (Stice y Robl, Biol. Reprod. 39:657-664, 1988).

La clonación mediante transferencia nuclear implica retirar el núcleo del ovocito receptor y aislar un núcleo de una célula donante. A continuación, el núcleo donante se une con el ovocito receptor y se utiliza una fusión celular inducida eléctricamente para introducir los núcleos de la célula embriónica donante en una célula receptora. En ciertas realizaciones, el proceso de clonación embriónica sigue un procedimiento básico de cinco pasos tal como se indica a continuación: (1) seleccionar un ovocito o embrión receptor adecuado para la transferencia nuclear; (2) enuclear, es decir, retirar el material nuclear del ovocito receptor; (3) introducir el núcleo limitado por la membrana de la célula donante en el ovocito receptor enucleado; (4) orientar el núcleo limitado por la membrana donante y el ovocito receptor para la fusión celular; y (5) fusionar la membrana que rodea el núcleo donante con la membrana del ovocito receptor y activar el ovocito receptor mediante dielectroforesis.

En ciertas realizaciones de la divulgación, el ovocito utilizado como célula receptora es una célula que se desarrolla a partir de una ovogonia y, tras la meiosis, se convierte en un óvulo maduro. En ciertas realizaciones relacionadas con animales bovinos, se pueden madurar ovocitos en estadio de metafase II tanto in vivo como in vitro. En algunas realizaciones, los ovocitos en metafase II maduros se pueden extirpar quirúrgicamente a partir de terneras o vacas superovuladas o no superovuladas de 35 a 48 horas después del inicio del estro o después de una inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG) o una hormona similar. Como alternativa, en otras realizaciones, los ovocitos inmaduros se pueden recuperar mediante una aspiración de los folículos ováricos obtenidos de vacas o terneras sacrificadas y a continuación se pueden madurar in vitro mediante un tratamiento hormonal y un cultivo adecuados.

En ciertas realizaciones de la divulgación, la micromanipulación de las células se puede llevar a cabo utilizando una pipeta para la manipulación de células, con un diámetro externo de aproximadamente 120 micrómetros y un diámetro interno de aproximadamente 25 a 35 micrómetros, y una pipeta de enucleación y transferencia afilada biselada con un diámetro externo de aproximadamente 25 a 35 micrómetros. Los ovocitos maduros se pueden tratar en primer lugar con citocalasina B con una concentración de aproximadamente 7.5 microgramos por mililitro, o un inhibidor microtubular que tenga una eficacia similar con una concentración suficiente para permitir que la pipeta de enucleación y transferencia se inserte a través de la zona pelúcida para hacer posible la retirada de una porción del citoplasma sin que de hecho se rompa en ningún momento la membrana plasmática. El ovocito maduro se puede mantener en el lugar correcto mediante una succión suave con la pipeta de manipulación de células. La pipeta de enucleación y transferencia se puede insertar a continuación a través de la zona pelúcida del ovocito en el punto de protuberancia en metafase II o adyacente al primer cuerpo polar, es decir, en una posición que se pretende que sea adyacente a los cromosomas en metafase. La pipeta no penetra la membrana plasmática. La aspiración aplicada a través de la pipeta traza una protuberancia celular en la pipeta que incluye, en el caso de la protuberancia en metafase II, toda la protuberancia y el citoplasma colindante o, en el caso del primer cuerpo polar, el cuerpo polar más el citoplasma colindante. Este proceso está diseñado para arrastrar todos los cromosomas en metafase hacia el interior de la pipeta. A medida que se retira la pipeta, manteniendo la succión, la membrana plasmática se estira y a continuación se sella en sí misma dejando una membrana plasmática competente en el ovocito enucleado.

En algunas realizaciones de la divulgación, las células donantes pueden tratarse o no tratarse con citocalasina B, dependiendo del tamaño de la pipeta de transferencia. La pipeta de transferencia que contiene el núcleo unido a la membrana aspirado se puede insertar a través de la zona pelúcida del ovocito enucleado receptor y a continuación el núcleo unido a la membrana se puede depositar en la zona pelúcida con su membrana alrededor de la membrana plasmática del ovocito receptor.

En algunas realizaciones de la divulgación, la fusión del núcleo unido a la membrana con el ovocito receptor enucleado y la activación simultánea del ovocito receptor se pueden llevar a cabo mediante un paso único de dielectroforesis utilizando un equipo de electrofusión comercializado. Antes de realizar la electrofusión del núcleo embrionario donante y el ovocito receptor enucleado conjuntamente, es necesario orientar las membranas celulares en el campo eléctrico. El término “orientación”, tal como se utiliza en la presente, se define como la colocación de las dos células de manera que el plano de contacto de las dos membranas, es decir, la membrana plasmática del cuerpo portador del núcleo donante y la membrana plasmática del ovocito receptor, las cuales se fundirán conjuntamente, sea perpendicular al campo eléctrico. Se ha observado que la orientación aleatoria da como resultado una reducción significativa de la tasa de fusión con éxito. Si las células se orientan de modo que las membranas de fusión sean paralelas, o con un ángulo de aproximadamente 45°, respecto al campo eléctrico, la tasa de fusión con éxito se reducirá. La alineación se debe llevar a cabo eléctrica o mecánicamente. Si el tamaño de las dos células no es muy desproporcionado, un pequeño voltaje de corriente alterna de la alineación (~5 voltios por mililitro a 1000 KHz) durante un periodo de tiempo corto (10 segundos) provocará que las células se reorienten con sus membranas opuestas. Puede que sea necesario utilizar pulsos repetidos. Si el tamaño de las células varía significativamente, puede ser necesaria una manipulación mecánica para orientar adecuadamente las membranas.

En algunas realizaciones de la divulgación, la inserción de un núcleo unido a la membrana en un ovocito bovino enucleado se puede llevar a cabo mediante un método dielectroforético de fusión celular, utilizando una corriente DC y utilizando un medio de fusión celular no conductivo, es decir, no iónico tal como una solución de manitol o un medio de fusión celular de Zimmerman. El fenómeno de fusión es el resultado de la rotura de la membrana celular y la formación de poros entre células opuestas orientadas adecuadamente. Los poros, o pequeños canales, creados entre las dos células son termodinámicamente inestables debido a la curvatura superficial elevada de los canales y la alta tensión asociada en la membrana. Esta inestabilidad provoca que los canales se fusionen y agranden hasta que las membranas forman una única célula.

Los clones embriónicos de una sola célula producidos tal como se describe en la presente se cultivan preferentemente, ya sea in vivo o in vitro, hasta el estadio de mórula o blástula. Por ejemplo, los clones se pueden cultivar en oviductos de oveja o en un medio de cultivo adecuado. A continuación, los embriones se pueden transferir al útero del ganado bovino, u otros animales adecuados, en un estadio adecuado del estro. Los procedimientos para la transferencia embriónica son muy conocidos y se practican en el campo de la transferencia embriónica. Un porcentaje de estas transferencias embriónicas iniciará embarazos en las madres subrogadas. Las terneras vivas que nazcan de estos embarazos serán genéticamente idénticas donde las células donantes eran de un único embrión o un clon de este.

En una realización de la divulgación, la clonación se puede llevar a cabo en un paso utilizando el núcleo de una célula somática, tal como un fibroblasto fetal, o una célula madre, tal como una célula madre mesenquimal. La célula somática o célula madre se fusiona con un ovocito enucleado. Después del cultivo, muchos de los híbridos citoplasmáticos (o cíbridos) se desarrollan hasta obtener mórulas que se pueden implantar en receptores para la gestación.

En una realización adicional, se pueden llevar a cabo dos o más ciclos de clonación con el fin de incrementar la eficacia de la producción de animales clonados. La clonación de dos pasos, por ejemplo, implica un primer ciclo de clonación (por ejemplo, mediante transferencia nuclear) utilizando una célula donante, cultivar el cíbrido resultante in vivo y/o in vitro para producir un feto clonal y a continuación utilizar una célula fetal del feto clonal para una segunda ronda de clonación (por ejemplo, también mediante transferencia nuclear). En un ejemplo, se fusiona un fibroblasto con un ovocito enucleado y se cultiva hasta aproximadamente el estadio de mórula. Las mórulas viables resultantes de este procedimiento se transfieren a los receptores. Se puede permitir que la mayoría de estos embarazos del primer ciclo intenten completar el periodo de gestación, por ejemplo, para utilizarlos como control experimental interno. Después de que el embrión se haya desarrollado en un feto (por lo general durante un periodo de tiempo suficiente para presentar una diferenciación en tejidos y órganos), al menos uno y hasta varios de estos fetos del primer ciclo se extirpan quirúrgicamente para proporcionar tejido para la producción de cultivos tisulares. A modo de ejemplo, los fetos de ganado bovino se pueden utilizar por lo general después de que hayan alcanzado una edad gestacional de al menos 30 días; en realizaciones específicas, los fetos de ganado bovino se pueden sacrificar con una edad gestacional de aproximadamente 45 días. Como alternativa, en lugar de sacrificar los fetos, se pueden retirar los amniocitos del receptor mediante amniocentesis tal como se describe en la presente. Se puede utilizar cualquier tejido o células fetales para producir cultivos celulares. En realizaciones representativas, los cultivos de células fetales se producen a partir de fibroblastos fetales, células gonadales, células madre mesenquimales o células procedentes de la cresta genital. Los cultivos de células fetales se propagan y las muestras se conservan (por ejemplo, congeladas) para su uso futuro. En ciertas realizaciones, el tejido fetal se utiliza directamente para la segunda ronda de clonación (sin la intervención de una etapa de almacenamiento y, en algunos casos, sin el desarrollo de un cultivo celular in vitro).

Los cultivos de células fetales (por ejemplo, cultivos de fibroblastos) se pueden utilizar como donantes nucleares para el segundo ciclo de clonación. En este segundo ciclo (el segundo “paso” de la clonación de dos pasos), las células cultivadas fetales se fusionan con ovocitos enucleados para producir mórulas de segunda generación. Estas mórulas se transfieren a receptores y se permite que los embarazos resultantes completen su periodo de gestación para producir una progenie viva. Se permite que los embarazos resultantes de la transferencia de embriones clonados de segunda generación de origen fetal maduren durante todo el periodo de gestación y den como resultado el nacimiento de terneras vivas.

En ciertas realizaciones, tanto la célula donante como el ovocito deben ser activados. Una célula donante activada (por ejemplo, no quiescente) es una célula que se está dividiendo de forma activa (por ejemplo, que no se encuentra en un estadio de mitosis en reposo). En particular, una célula donante activada es una que participa en el ciclo celular mitótico, tal como la fase G1, fase S o fase G2/M. El ciclo celular mitótico tiene las siguientes fases: G1, S, G2 y M. La fase G2/M se refiere a la fase de transición entre la fase G2 y la fase M. El evento de compromiso en el ciclo celular, denominado START (o punto de restricción), tiene lugar durante la fase G1. “START”, tal como se utiliza en la presente, se refiere al estadio G1 tardío del ciclo celular antes del compromiso de una célula para proceder a lo largo del ciclo celular. La decisión de si la célula experimentará otro ciclo celular se toma en el START. Una vez que la célula ha pasado a través del START, esta pasa a través del resto de la fase G1 (es decir, el estadio de síntesis de pre-ADN). La fase S es el estadio de síntesis de ADN, que va seguido de la fase G2, el estadio entre la síntesis y la mitosis. La mitosis tiene lugar durante la fase M. Si antes del START la célula no experimenta otro ciclo celular, la célula se detiene. Además, se puede inducir una célula para que salga del ciclo celular o se vuelva quiescente o inactiva. Se hace referencia a una célula “quiescente” o “inactiva” como una célula en la fase G0. Una célula quiescente es una que no se encuentra en ninguna de las fases mencionadas anteriormente del ciclo celular mosaico. Preferentemente, la divulgación utiliza una célula donante que es una célula en la fase G1 del ciclo celular mitótico.

En ciertas realizaciones de la divulgación, las células donantes están sincronizadas. El uso de células donantes en ciertas fases del ciclo celular, por ejemplo, la fase G1, hace posible la sincronización de las células donantes. Se pueden sincronizar las células donantes privando a las células donantes de una cantidad suficiente de nutrientes (por ejemplo, reduciéndola) en el medio que les permite dividirse. Una vez que las células donantes han dejado de dividirse, entonces las células donantes se exponen a un medio (suero) que contenga una cantidad suficiente de nutrientes para permitirles que se dividan (por ejemplo, mitosis). Las células donantes empiezan la mitosis sustancialmente a la vez y, por consiguiente, están sincronizadas. Por ejemplo, se priva a las células donantes de una concentración suficiente de suero colocando las células en suero bovino fetal (FBS) al 0.5% durante aproximadamente una semana. A partir de entonces, las células se colocan en FBS aproximadamente al 10% y empezarán a dividirse aproximadamente a la vez. Entrarán en la fase G1 aproximadamente a la vez y, por consiguiente, estarán listas para el proceso de clonación.

Los métodos para determinar en qué fase del ciclo celular se encuentra una célula son conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, se describen en la Pat. de EE. UU. N° 5843705 de DiTullio etal., Campbell, K. H. S. et al., Embryo Transfer Newsletter, vol. 14(1 ):12-16 (1996), Campbell, K. H. S. et al., Nature, 380:64-66 (1996), Cibelli, J. B. et al., Science, 280:1256-1258 (1998), Yong, Z. y L. Yuqiang, Biol. of Reprod, 58:266-269 (1998) y Wilmut, I. et al., Nature, 385:810-813 (1997). Por ejemplo, tal como se describe más adelante, hay varios marcadores presentes en diferentes estadios del ciclo celular. Tales marcadores pueden incluir las ciclinas D 1,2, 3 y el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA, por sus siglas en inglés) para G1, y BrDu para detectar la actividad sintética de ADN. Además, las células pueden ser inducidas para que entren en el estadio G0 cultivando las células en un medio privado de suero. Como alternativa, las células en el estadio G0 pueden ser inducidas para que entren en el ciclo celular, es decir, en el estadio G1 mediante una activación con suero (por ejemplo, exponiendo las células a suero después de que las células hayan sido privadas de cierta cantidad de suero).

En ciertas realizaciones, el genoma de la célula donante puede ser un genoma de origen natural, por ejemplo, para la producción de animales clonados, o el genoma se puede alterar genéticamente para que comprenda una secuencia transgénica, por ejemplo, para la producción de animales clonados transgénicos.

En algunas realizaciones de la divulgación, los ovocitos utilizados en la presente divulgación son ovocitos activados. Los ovocitos activados son aquellos que se encuentran en un estadio de división de la división celular meiótica e incluyen la metafase I, anafase I, anafase II y preferentemente la telofase II. Se considera que los ovocitos en metafase II se encuentran en un estadio de reposo. Los ovocitos se pueden encontrar en el estadio de reposo de la metafase II y a continuación se pueden activar utilizando métodos descritos en la presente. El estadio en el que se encuentra el ovocito se puede identificar mediante una inspección visual del ovocito con un aumento suficiente. Los ovocitos que se encuentran en la telofase II se identifican, por ejemplo, mediante la presencia de una protrusión de la membrana plasmática de un segundo cuerpo polar. Los métodos para identificar el estadio de la división celular meiótica son conocidos en la técnica.

Por lo general, los ovocitos se activan incrementando su exposición a los niveles de calcio, en ciertas realizaciones. El incremento de los niveles de calcio, por ejemplo, entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 60% por encima de los niveles de línea base, induce la activación o división celular meiótica del ovocito. Los niveles de línea base son aquellos niveles de calcio que se encuentran en un ovocito inactivo. El hecho de aumentar los niveles de calcio, acoplado con la reducción de los niveles de fosforilación, facilita adicionalmente la activación del ovocito. Existen varios métodos que hacen posible la activación del ovocito. En particular, un ionóforo de calcio (por ejemplo, la ionomicina) es un agente que incrementa la permeabilidad de la membrana del ovocito y permite que el calcio entre en el ovocito. A medida que la concentración de calcio libre en la célula se incrementa durante la exposición al ionóforo, el ovocito se activa tras la reducción de la actividad de MPF (factor de fomentación de la maduración). Tales métodos de activación se describen en la Pat. de EE. UU. N° 5496 720. El etanol ejerce un efecto similar. Antes o después de la enucleación, un ovocito en metafase II puede ser activado con etanol de acuerdo con el tratamiento de activación con etanol que se describe en Presicce y Yang, Mol. Reprod. Dev, 37.61-68 (1994); y Bordignon & Smith, Mol. Reprod. Dev., 49:29-36 (1998). La exposición de calcio al ovocito también se produce mediante estimulación eléctrica. La estimulación eléctrica permite que entren mayores niveles de calcio en el ovocito.

Tal como se contempla en la presente, los ovocitos se pueden obtener a partir de un animal donante durante el ciclo reproductor del animal. Por ejemplo, los ovocitos se pueden aspirar a partir de los folículos de los ovarios en momentos determinados durante el ciclo reproductor (estimulado o no estimulado con hormonas exógenas). Además, en momentos determinados tras la ovulación, un porcentaje significativo de los ovocitos, por ejemplo, se encuentra en la telofase. Adicionalmente, se pueden obtener los ovocitos y a continuación inducirlos para que maduren in vitro hasta el estadio de metafase II detenido. Los ovocitos en metafase II detenida, producidos in vivo o in vitro, pueden ser inducidos a continuación in vitro para que entren en la telofase. Por lo tanto, los ovocitos en telofase pueden ser obtenidos fácilmente para su uso en ciertas realizaciones de la presente divulgación. En particular, los ovocitos se pueden recolectar a partir de un animal hembra después de superovulaciones. Los ovocitos se pueden recuperar quirúrgicamente haciendo fluir los ovocitos a partir del oviducto de un donante hembra. En la presente se describen métodos para inducir superovulaciones en, por ejemplo, cabras y la recolección de los ovocitos.

En ciertas realizaciones de la divulgación, el estadio celular de los ovocitos activados se correlaciona con en el estadio del ciclo celular de la célula donante activada. Esta correlación entre el estado meiótico del ovocito y el estado mitótico de la célula donante también se denomina en la presente “sincronización”. Por ejemplo, un ovocito en telofase fusionado con el genoma de una célula donante en G1 antes del START proporciona una sincronización entre el ovocito y los núcleos donantes en ausencia de condensación de la cromatina prematura (PCC, por sus siglas en inglés) y rotura de la envoltura nuclear (NEBD, por sus siglas en inglés).

En algunas realizaciones, la divulgación utiliza un ovocito que está enucleado. Tal como se contempla en la presente, un ovocito enucleado es uno que carece de genoma o uno que está “funcionalmente enucleado”. Un ovocito funcionalmente enucleado contiene un genoma que no es funcional, por ejemplo, no se puede replicar ni puede sintetizar ADN. Remítase, por ejemplo, a Bordignon, V. y L. C. Smith, Molec. Reprod. Dev., 49:29-36 (1998). Preferentemente, el genoma del ovocito se elimina del ovocito. Un genoma puede ser funcionalmente enucleado del ovocito mediante irradiación, mediante irradiación de rayos X, mediante irradiación láser, mediante la eliminación física del genoma o mediante medios químicos. Se pueden utilizar otros métodos conocidos de enucleación en la presente divulgación para enuclear el ovocito.

El ovocito también se puede volver funcionalmente inactivo, por ejemplo, irradiando el material nuclear endógeno en el ovocito. Los métodos para utilizar irradiación son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Bradshaw et al., Molecul. Reprod. Dev., 41:503-512 (1995).

Para eliminar físicamente el genoma de un ovocito, se puede insertar una micropipeta o aguja en la zona pelúcida del ovocito para eliminar el material nuclear del ovocito. En un ejemplo, los ovocitos en telofase que tienen dos cuerpos polares pueden ser enucleados con una micropipeta o aguja eliminando el segundo cuerpo polar en el citoplasma colindante. Concretamente, los ovocitos en el estadio de telofase de la meiosis pueden ser enucleados en cualquier punto desde la presencia de una protrusión en la membrana plasmática del segundo cuerpo polar hasta la formación del segundo cuerpo polar en sí. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente, se considera que los ovocitos que muestran una protrusión en la membrana plasmática, normalmente con un husillo que la rodea, hasta la extrusión de un segundo cuerpo polar son ovocitos en telofase.

El ovocito se puede volver funcionalmente inactivo también mediante métodos químicos. Los métodos para inactivar químicamente el ADN son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la inactivación química se puede llevar a cabo utilizando el método de etopósido-cicloheximida que se describe en Fulka y Moore, Molecul. Reprod. Dev., 34:427-430 (1993). Ciertas realizaciones de la presente divulgación contemplan la enucleación del genoma de un ovocito mediante el tratamiento del ovocito con un compuesto que inducirá la segregación del genoma del ovocito (por ejemplo, cromatina nuclear) en los cuerpos polares durante la maduración meiótica, con lo que el ovocito quedará sin un genoma funcional y esto dará como resultado la formación de un citoplasma receptor para su uso en procedimientos de transferencia nuclear. Los ejemplos de agentes que ejercerán tal segregación diferencial incluyen agentes que alterarán 1) estructuras citoesqueléticas, que incluyen, sin carácter limitante, Taxol® (por ejemplo, paclitaxel), demecolcina, faloidina, colchicina, nocodozol y 2) el metabolismo, que incluyen, sin carácter limitante, cicloheximida y tunicamicina. Además, en el método preferido también se incluye la exposición de los ovocitos a otros agentes o condiciones (por ejemplo, aumento o reducción de temperatura, pH, osmolalidad) que inducen preferentemente la segregación desigual del genoma del ovocito de modo que se extruya de los confines del ovocito (por ejemplo, en cuerpos polares). Remítase, por ejemplo, a los métodos para incluir cambios en el citoesqueleto y el metabolismo de las células, métodos que son conocidos por los expertos en la técnica, en Andreau, J. M. y Timasheff, S. N., Proc. Nat. Acad. Sci. 79:6753 (1982), Obrig, T. G. et al., J. Biol. Chem.

246:174 (1971), Duskin, D. y Mahoney, W. C., J. Biol. Chem. 257:3105 (1982), Scialli, A. R. et al., Teratogen, Carcinogen, Mutagen 14:23 (1994), Nishiyarna, I y Fujii, T., Exp. Cell Res. 198:214 (1992), Small, J. V. et al., J. Cell Sci. 89:21 (1988), Lee, J. C. et al., Biochem. 19:6209 (1980).

La combinación del ovocito enucleado activado y el genoma de la célula donante activada se puede producir de varias maneras para formar el embrión de transferencia nuclear. Un genoma de una célula donante activada se puede inyectar en el ovocito activado empleando un microinyector (es decir, una micropipeta o aguja). El genoma nuclear de la célula donante activada, por ejemplo, una célula somática, se extrae utilizando una micropipeta o aguja. Una vez extraído, el genoma nuclear del donante se puede colocar a continuación en el ovocito activado insertando la micropipeta, o aguja, en el ovocito y liberando el genoma nuclear de la célula donante. McGrath, J. y D. Solter, Science, 226:1317-1319 (1984).

En ciertas realizaciones, la presente divulgación incluye combinar el genoma de una célula donante activada con un ovocito activado mediante fusión, por ejemplo, electrofusión, fusión vírica, fusión liposomal, fusión con un reactivo bioquímico (por ejemplo, la proteína fitoeniaglutinina (PHA)) o fusión química (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o etanol). El núcleo de la célula donante se puede depositar dentro de la zona pelúcida que contiene el ovocito. Los pasos de fusión del núcleo con el ovocito se pueden llevar a cabo a continuación aplicando un campo eléctrico que también dará como resultado una segunda activación del ovocito. Los ovocitos en telofase utilizados ya están activados, por lo tanto, cualquier activación posterior o simultánea respecto a la introducción del genoma de una célula somática se consideraría como un segundo evento de activación. Respecto a la electrofusión, las cámaras tales como el sistema de manipulación embriónica BTX® 200 para llevar a cabo la electrofusión se pueden adquirir de proveedores comerciales, por ejemplo, BTX®, San Diego. La combinación del genoma de la célula donante activada con el ovocito activado da como resultado un embrión de transferencia nuclear.

A continuación, un embrión de transferencia nuclear de la presente divulgación se transfiere a un animal hembra receptor y se permite que se desarrolle o geste para obtener un animal clonado. Las condiciones adecuadas para la gestación son aquellas condiciones que permiten que el embrión se desarrolle y madure para obtener un feto y, en última instancia, un animal vivo. Por ejemplo, el embrión de transferencia nuclear se puede transferir a través de la fimbria al lumen oviductal de cada animal hembra receptor. Además, los métodos para transferir un embrión a un receptor son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en Ebert et al., Bio/Technology, 12:699 (1994). El embrión de transferencia nuclear se puede mantener en un sistema de cultivo hasta al menos la primera escisión (estadio de 2 células) y hasta el estadio de blastocito, preferentemente los embriones se transfieren en el estadio de 2 células o 4 células. Los expertos en la técnica conocen varios medios de cultivo para el desarrollo embriónico. Por ejemplo, el embrión de transferencia nuclear se puede cocultivar con una monocapa de células epiteliales oviductales derivada del tipo de animal que ha de ser proporcionado por el médico practicante.

Otro aspecto de la presente divulgación incluye métodos para enuclear un ovocito activado que comprenden poner en contacto el ovocito con un compuesto que desestabiliza (por ejemplo, altera o disasocia) el aparato del husillo meiótico. La alteración del aparato del husillo meiótico da como resultado la alteración de los microtúbulos, cromosomas y centriolos. Un compuesto de este tipo hace que el núcleo sea no friccional. Algunos ejemplos de tales compuestos son cochicina, pactiltaxel, nocodazol y, preferentemente, demecolcina.

Este aspecto de la divulgación se puede utilizar para la enucleación en combinación con los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, se puede preparar un ovocito activado para la transferencia nuclear activando el ovocito (por ejemplo, exponiendo el ovocito a etanol o un ionóforo) y a continuación sometiendo el ovocito activado a un compuesto que desestabilice los husillos meióticos (por ejemplo, demecolcina). Una vez se ha preparado el ovocito activado, a continuación este se puede combinar con el genoma de una célula donante activada para que dé como resultado un embrión de transferencia nuclear.

El siguiente procedimiento de clonación se proporciona únicamente a modo de ejemplo.

Complejos de cúmulo-ovocitos (COC). Los COC contienen ovocitos inmaduros que se encuentran en la profase de la primera división meiótica. Estos se pueden obtener a partir de los ovarios recolectados de animales sacrificados en un matadero o se pueden obtener in vivo mediante la recuperación de ovocitos transvaginal (TVOR) guiada por ultrasonidos a tiempo real, que también se conoce como captación del óvulo (OPU). Los COC derivados de OPU se pueden producir a partir de una OPU aleatoria o programada junto con el desarrollo de ondas foliculares en los ovarios. Como alternativa, se pueden llevar a cabo OPU programadas en hembras donantes estimuladas con hormonas con un programa regular. Todos los COC, independientemente de su fuente, se colocan en una maduración in vitro (IVM).

Formación de citoplastos. Después de completar la maduración in vitro (IVM) de los COC, los COC se procesan para la enucleación, lo cual implica la eliminación de la cromatina (placa de metafase) de ovocitos maduros. Al menos 20 h después de la IVM, los COC se colocan en TL-Hepes de pH estable con 1mg/ml de hialuronidasa, donde se mezclan y pipetean cuidadosamente para eliminar las inversiones de cúmulo. Cuando los ovocitos están exentos de células del cúmulo, se evalúan con estereomicroscopía para analizar su morfología, la presencia de un espacio perivitelino con un primer cuerpo polar extruido, y se determina la integridad del citoplasma. Los ovocitos con una zona pelúcida normal, un espacio perivitelino distintivo con la formación de cuerpos polares normales y un citoplasma homogéneo se consideran de forma subjetiva ovocitos maduros (MO, por sus siglas en inglés). Todos los MO se incuban en un inhibidor de microfilamentos tal como citocalasina-b para despolimerizar de forma eficaz la actina filamentosa y relajar la membrana plasmática del MO. Los MO se incuban con un fluorocromo específico para ADN activado con luz ultravioleta (UV) Hoechst 33342 para iluminar los cromosomas en metafase con microscopía de fluorescencia y hacer posible su eliminación mediante micromanipulación. Con una luz incandescente baja y luz UV controlada cuando sea necesario en un microscopio compuesto invertido, se utilizan agujas biseladas especiales para penetrar a través de la zona pelúcida y en su interior pero no penetrar la membrana plasmática del MO, justo debajo del área de los cromosomas en metafase fluorescentes. La cromatina se aspira cuidadosamente hacia el exterior del MO con la menor cantidad de citoplasma posible como un carioplasto limitado por la membrana plasmática, con lo que en efecto se deja el ovocito maduro previo como un citoplasma enucleado y transformado desprovisto de toda la cromatina. Estas enucleaciones continúan hasta que todos los MO han sido manipulados para obtener citoplastos con membrana plasmática intacta.

Preparación de células somáticas congeladas. Utilizando una técnica de cultivo celular aséptica, descongelar un criovial de células somáticas de genotipo específico en un baño de agua de 37 °C durante 1 minuto, 1 -2 días antes de la clonación, dependiendo de cómo crezca la línea celular in vitro. Utilizando una técnica de recuperación celular aséptica en una vitrina de cultivo celular de flujo laminar, transferir el contenido calentado del criovial a un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 10 ml de medio de cultivo celular (DMEM; medio de cultivo celular DMEM que contiene glutamina, penicilina-estreptomicina y un 20% de suero bovino fetal) al tubo de centrífuga, mezclar cuidadosamente haciéndolo girar a medida que se añaden las gotas del medio. Centrifugar el tubo de células a 200 x rpm durante 5-10 minutos. Las células se cultivan en una placa de cultivo tisular Nunc de 4 pocillos y una placa de cultivo celular de 100 mm. En la placa Nunc de 4 pocillos, añadir 0.5 ml de DMEM en cada pocillo y 2 ml de DMEM en el pocillo central. En la placa de cultivo celular de 100 mm, añadir 12 ml de DMEM a la placa. Después de completar la centrifugación, retirar el sobrenadante sin que se altere el pellet. El pellet se suspende de nuevo cuidadosamente en 0.5 ml de medio de cultivo. Después de mezclar, se añaden 50 pl de suspensión celular en cada uno de los dos primeros pocillos Nunc, 25 pl en el tercer pocillo y 15 pl en el cuarto pocillo, el resto de las células en suspensión se coloca en la placa de 100 mm. Todos los cultivos celulares se colocan en la incubadora y se cultivan a 38.7 °C en un 5% de CO²y aire. El día de su uso en la clonación, estas células se levantan del cultivo celular mediante un tratamiento con proteasa y las células disociadas y libres se colocan en una placa de cultivo organizada para su uso en la clonación por transferencia nuclear de células somáticas.

Reconstitución de clones. Después de enuclear todos los MO, se preparan los citoplastos para la reconstitución de los clones. La reconstitución de los clones es el proceso mediante el cual una célula somática se coloca dentro de la zona pelúcida de un citoplasto y se fusiona posteriormente con un citoplasto mediante una fusión con pulsos eléctricos, tras lo cual los clones reconstituidos se procesan para la activación de la reprogramación de la célula somática y la activación de un desarrollo dirigido maternalmente y en última instancia la activación de un genoma embriónico figurativo. Concretamente, cuando se mantiene un citoplasto en un plano en el que la incisión con una aguja para la enucleación se encuentra en un buen plano focal, la punta de la enucleación capta una célula somática y atraviesa la incisión real de la enucleación en la zona pelúcida. A continuación, la célula somática se coloca al lado de la membrana plasmática. Todas las reconstituciones se completan en serie.

Activación de ovocitos. Después de completar la reconstitución de los clones, todos los citoplastos reconstituidos se colocan en una cámara de electrofusión que contiene un medio de fusión basado en un poliol conductivo. Cuando los citoplastos reconstituidos están alineados uniformemente en la cámara, los citoplastos se tratan con un pulso de corriente directa de 100 voltios durante 40 ps. Después de la electrofusión, los citoplastos se lavan y se cultivan, lo que permite que los cíbridos completen el proceso de fusión. Por lo general, es necesario que transcurran 15-30 minutos para que las células somáticas se fusionen con los citoplastos y la cromatina se incorpore en el citoplasma. Después de completar el proceso de fusión, los cíbridos se colocan en un medio de cultivo que contiene ionomicina, una molécula ionófora para el calcio utilizada para inducir la activación partenogenética de un ovocito maduro y provocar un incremento similar al de la fertilización en el calcio intracelular. La ionomicina induce los segundos sistemas mensajeros de ovocitos que ponen en marcha la activación del genoma materno e inducen la liberación de gránulos corticales en el exterior de la membrana plasmática. Este proceso no es distinto a lo que sucede con el ovocito tras la fusión del esperma y la activación del genoma materno en el inicio de la fertilización del ovocito maduro. Para fomentar la eficacia y la finalización de la activación partenogenética tras el tratamiento con ionomicina, los embriones clonados se incuban durante aproximadamente 5 horas en el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (CHX), el cual induce la reanudación de los procesos de meiosis mediante la inactivación del factor fomentador de la maduración (MPF) y la actividad de proteína cinasa activada por el mitógeno (MAPK) (Tian et al., 2002). Por lo general, los ovocitos bovinos requieren varias horas de tratamiento con CHX después de la activación inducida por la ionomicina para conseguir una liberación adecuada de la detención de la metafase meiótica y completar la activación. Durante este tiempo, también se produce la reorganización y reprogramación de la cromatina somática para el desarrollo embriónico.

Cultivo de embriones clonados. Todos los embriones clonados reconstituidos intactos se colocan en un cultivo a largo plazo en un medio de cultivo de embriones específico bovino suplementado con albúmina de suero bovino. El día 5, los embriones con más de 8 células y que muestran signos de una compactación temprana se suplementan con FBS al 10%. El día 6-8, los embriones clonados en estadio avanzado de blastocito se envasan en medio de transporte y se llevan a las instalaciones de una granja de receptores donde se transfieren de forma no quirúrgica a receptores que son terneras subrogadas.

Gestión de las terneras receptoras. Los embriones clonados destinados para la transferencia a hembras subrogadas sincronizadas se transportan a la granja en tubos de cultivo y se transfieren de forma no quirúrgica mediante métodos tradicionales a receptores específicos. Las hembras receptoras son examinadas de forma regular por veterinarios y los embarazos en curso son monitorizados de manera regular y programada mediante ultrasonografía transrectal a tiempo real de forma mensual hasta el final del embarazo. Todas las hembras portadoras de crías clonadas se someten a un protocolo de gestión de la gestación y el embarazo, que finaliza con una cesárea programada y cuidados intensivos para la descendencia viva.

El siguiente ejemplo adicional de clonación se proporciona únicamente a modo de ejemplo.

Enucleación de ovocitos. Los ovocitos maduros in vivo se recolectan a partir de las hembras donantes. Los ovocitos con células del cúmulo unidas o desprovistos de cuerpos polares se descartan. Los ovocitos exentos de cúmulo se dividen en dos grupos: ovocitos con solo un cuerpo polar evidente (estadio de metafase II) y el protocolo de telofase II activado (ovocitos con un cuerpo polar y evidencia de un segundo cuerpo polar extruido). Los ovocitos en telofase II se cultivan en M199 10% de FBS durante de 3 a 4 horas. Los ovocitos que se activan durante este período, lo cual se pone de manifiesto mediante un primer cuerpo polar y un segundo cuerpo polar parcialmente extruido, se agrupan como ovocitos en telofase II activados con calcio e inducidos por el cultivo (Telofase II-Ca+2) y se enuclean. Los ovocitos que no se han activado se incuban durante 5 minutos en PBS que contiene un 7% de etanol antes de su enucleación. Los ovocitos en estadio de metafase II (un cuerpo polar) se enuclean con una pipeta de vidrio de 25-30 micras aspirando el primer cuerpo polar y el citoplasma adyacente que rodea al primer cuerpo polar (aproximadamente un 30% del citoplasma) que supuestamente contiene placa de metafase.

Los ovocitos en estadio de telofase se preparan mediante dos procedimientos. Los ovocitos se incuban inicialmente en solución salina tamponada con fosfato (PBS, exenta de Ca+2/Mg+2) suplementada con un 5% de FBS durante 15 minutos y se cultivan en M199 10% de FBS a 38° C durante aproximadamente tres horas hasta que se alcanza la configuración de husillo de la telofase o la extrusión del segundo cuerpo polar. Todos los ovocitos que responden al cultivo secuencial con un tratamiento de concentración de calcio extracelular diferencial se separan y se agrupan como Telofase II-Ca2+. Los otros ovocitos que no responden se incuban adicionalmente en etanol al 7% en M199 10% de FBS durante 5-7 minutos (Telofase II-ETOH) y se cultivan en M199 10% de FBS durante de 2 a 4 horas. A continuación, los ovocitos se cultivan en M199 10% de FBS que contiene 5 pg/ml de citocalasina-B durante 10-15 minutos a 38° C. Los ovocitos se enuclean con una pipeta de vidrio de 30 micras (DO) aspirando el primer cuerpo polar y aproximadamente un 30% del citoplasma adyacente que contiene la metafase II o aproximadamente un 10% del citoplasma que contiene el husillo de telofase II. Después de la enucleación, los ovocitos se reconstruyen inmediatamente.

Reconstrucción del embrión. Las células somáticas se recolectan el día 7 mediante tripsinización (0.025% de tripsina/ EDTA 0.5 mM) (Sigma) durante 7 minutos. Las células individuales se suspenden de nuevo en M199 10% de FBS equilibrado suplementado con L- glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina. La inyección de las células donantes se lleva a cabo en el mismo medio que para la enucleación. Las células donantes se clasifican en pequeñas, medianas y grandes antes de su selección para la inyección en citoplastos enucleados. Las células individuales pequeñas (10-15 micras) se seleccionan con una pipeta de vidrio de 20-30 micras de diámetro. La pipeta se introduce a través de la misma ranura de la zona realizada durante la enucleación y las células donantes se inyectan entre la zona pelúcida y la membrana ovoplasmática. Los embriones reconstituidos se incuban en M199 durante 30-60 minutos antes de su fusión y activación.

Fusión y activación. Todos los embriones reconstruidos (con o sin pretratamiento con etanol) se lavan en tampón de fusión (manitol 0.3 M, CaCl²0.05 mM, MgSO40.1 mM, K²HPO⁴⁹mM, glutationa 0.1 mM, 0.1 mg/ml de BSA en agua destilada) durante 3 minutos antes de someterlos a electrofusión. La fusión y la activación se llevan a cabo a temperatura ambiente, en una cámara con dos electrodos de acero inoxidable dispuestos con una separación de 200 micras (sistema de manipulación de embriones BTX® 200, BTX®-Genetronics, San Diego, Calif.) rellenada con tampón de fusión. Los embriones reconstruidos se colocan con una pipeta en grupos de 3-4 y se alinean manualmente de manera que la membrana citoplasmática de los ovocitos receptores y las células CFF155-92-6 donantes se encuentren en paralelo respecto a los electrodos. La fusión y la activación de las células se inducen simultáneamente 32-42 horas después de la inyección de GnRH con un pulso de alineación inicial/mantenimiento de 5-10 V AC durante 7 segundos, seguido de un pulso de fusión de 1.4 a 1.8 KV/cm DC durante 70 microsegundos utilizando un manipulador Electrocell y Enhancer 400 (BTX®-Genetronics). Los embriones se lavan en medio de fusión durante 3 minutos, a continuación se transfieren a M199 que contiene 5 pg/ml de citocalasina-B (Sigma) y un 10% de FBS y se incuban durante 1 hora. Los embriones se retiran del medio de M199/citocalasina-B y se cocultivan en gotas de 50 microlitros de M199 más 10% de FBS con células epiteliales oviductales de cabra recubiertas con aceite de parafina. Los cultivos de embriones se mantienen en una incubadora humidificada a 39 °C con un 5% de CO²durante 48 horas antes de transferir los embriones a hembras receptoras.

Aumento de la evolución genética en un núcleo genético, línea o manada utilizando clones generados a partir de amniocitos

Ciertos aspectos de la divulgación engloban un método para incrementar la evolución genética en un núcleo genético, línea o manada utilizando clones generados a partir de amniocitos. Dentro de un núcleo genético (o línea o manada), una vez seleccionados, los progenitores que producen la siguiente generación se aparean entre sí, a la vez que se evitan apareamientos entre individuos estrechamente relacionados, con el objetivo de incrementar el mérito genético de la siguiente generación. Un incremento en el mérito genético de la siguiente generación constituye una evolución genética. Un incremento en el mérito genético, en este contexto, significa que para un rasgo o conjunto de rasgos determinado, los individuos en la generación sucesiva expresarán el rasgo o conjunto de rasgos deseado más intensamente que sus progenitores. Con respecto a los rasgos no deseados, un incremento en el mérito genético significa que los individuos en la generación sucesiva expresarán el rasgo o conjunto de rasgos menos intensamente que sus progenitores.

El cambio genético, incluido el cambio genético deseable (es decir, evolución genética por año) (“dG”) se puede medir como la diferencia entre el nivel genético promedio de toda la progenie nacida en un año y toda la progenie nacida el siguiente año. La diferencia es el resultado de que los progenitores seleccionados tengan un mérito genético más elevado que el mérito genético promedio de todos los candidatos de la selección (los animales disponibles para la selección como progenitores de la siguiente generación). En condiciones ideales, esto depende de la heredabilidad (h2) del rasgo y la diferencia entre el rendimiento promedio de los progenitores seleccionados y el de los candidatos de la selección. La heredabilidad de un rasgo (h2) es la proporción de diferencias observables (varianza fenotípica, ^o2^p) en un rasgo entre los individuos dentro de una población que se debe a diferencias genéticas aditivas (A), en lugar de medioambientales (E) (h2 = ^o2^a/^o2^p= ^ü2^a/(^o2^a+^o2^e)). La diferencia entre el rendimiento promedio de progenitores seleccionados y el de todos los candidatos de la selección (de los cuales los progenitores seleccionados representan un subconjunto) también se conoce como el diferencial de la selección.

La evolución genética por años el resultado de la superioridad genética de los machos seleccionados y de las hembras seleccionadas. Esta se expresa en la siguiente ecuación:

d G = { ( R m * i ) machos ( R i h * í ) hembras } O h A L machos "I" L hembras X

donde R = precisión de la selección, i = intensidad de la selección, ^oh= variación genética y L = intervalo de la generación, para progenitores macho o hembra.

H = objetivo de la cría selectiva que combina el mérito genético (g) de los rasgos (de 1 a m) que debe ser producido ponderado según los valores económicos (v) de los rasgos (H=v¹g¹+ v²g²+ vmgm). El valor económico es positivo si la selección es para valores fenotípicos más grandes y negativo si la selección es para valores fenotípicos más pequeños. I = índice que combina toda la información del rasgo en el individuo y sus parientes, y es la mejor estimación del valor de H para el individuo.

En una población grande, la intensidad de la selección depende de cuántos animales se evalúan y de cuántos se seleccionan; cuanto menor sea la proporción seleccionada, mayor será la intensidad de la selección y mayor será la evolución genética, siendo todo lo demás igual. Por lo tanto, con el fin de maximizar la evolución genética, se deben clasificar todos los animales evaluados en función del GEBV, por ejemplo, y a continuación seleccionar el mínimo número de machos y hembras principales que se requieren para mantener el tamaño de la línea, cría selectiva y/o manada y para evitar problemas de endogamia. Esto garantiza que el GEBV promedio de los animales seleccionados sea sustancialmente más elevado que el GEBV promedio de todos los animales evaluados. En particular mediante el uso de inseminación artificial (AI, por sus siglas en inglés), es necesario seleccionar menos machos que hembras y la intensidad de la selección para los machos es más elevada que para las hembras.

El intervalo de la generación para los machos (o hembras) es la edad promedio de los progenitores macho (o progenitores hembra) cuando nace la progenie. La tasa anual de evolución genética depende del intervalo de la generación y de la superioridad de los GEBV de los progenitores en comparación con los de los candidatos de la selección. En general, los machos contribuyen más a la evolución genética por año que las hembras.

El término “línea”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a animales que tienen un origen común y características de identificación similares. La expresión “núcleo genético”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una o más poblaciones de animales macho y hembra que se utilizan para generar candidatos de la selección en un programa de cría selectiva. La expresión “programa de cría selectiva”, tal como se utiliza la presente, se refiere a un sistema para generar evolución genética en una población de animales.

La divulgación engloba un método en el que se obtienen GEBV para un núcleo genético, línea o manada a partir del ADN extraído de amniocitos en lugar de a partir de muestras tisulares obtenidas de adultos. El método engloba por lo general los pasos de extraer ADN a partir de un primer amniocito derivado de un feto del núcleo genético, línea o manada; genotipificar el ADN para obtener un genotipo del feto; determinar un GEBV del feto basándose en el genotipo; seleccionar el feto como un progenitor para el núcleo genético, línea o manada basándose en el GEBV; y clonar el feto para producir un clon. Tal y como se demuestra en el Ejemplo 3 más adelante, el uso de amniocentesis para obtener amniocitos para la evaluación genómica da como resultado independientemente un incremento en los candidatos de la selección en el núcleo genético, línea o manada y, de este modo, incrementa la intensidad de la selección y la evolución genética. Esto se debe a que los fetos que tienen puntuaciones genómicas bajas pueden ser abortados antes de su nacimiento, lo que permite que las hembras receptoras puedan ser recicladas más pronto y de este modo se obtienen candidatos adicionales. Además, el uso de la clonación da como resultado independientemente una reducción del número de animales seleccionados y de este modo se incrementa la intensidad de la selección y la evolución genética. Esto se debe a que se pueden utilizar múltiples copias de un único progenitor hembra con una puntuación genómica superior para producir la totalidad, o una porción más grande, del número requerido de terneras de reemplazo para la siguiente generación (en lugar de tener que seleccionar múltiples hembras diferentes con el fin de producir un número suficiente de reemplazos).

Una vez producidas, las hembras clonadas se pueden utilizar como progenitores para la siguiente generación utilizando OPU e IVF, incluida la superovulación. Por consiguiente, los pasos anteriores se pueden repetir, es decir, los embriones resultantes de IVF, una vez transferidos a los receptores, se pueden evaluar genómicamente utilizando sus amniocitos y se puede determinar si serán progenitores y, por lo tanto, se clonarán o, como alternativa, serán abortados.

En ciertos aspectos de esta realización, se contempla que la IVF se lleve a cabo utilizando esperma con selección de género. La expresión “esperma con selección de género” incluye una muestra de esperma que ha sido procesada para alterar la relación de esperma con cromosomas portadores de X respecto a esperma con cromosomas portadores de Y. Tal como se contempla en la presente, el “esperma con selección de género” se puede crear o bien separando el esperma portador de X e Y entre sí mediante, por ejemplo, técnicas muy conocidas utilizando citometría de flujo o, como alternativa, exterminando o incapacitando de otro modo el esperma portador del cromosoma del género no deseado mediante, por ejemplo, ablación láser. En ciertas realizaciones, al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 98% o 99% del esperma es una muestra de esperma con selección de género, que contiene un cromosoma X. En otras realizaciones, al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 98% o 99% del esperma es una muestra de esperma con selección de género, que contiene un cromosoma Y.

Otra realización de la divulgación que utiliza la alta capacidad de evaluación conseguida utilizando amniocentesis engloba incrementar el número de animales seleccionados y a continuación agrupar los animales seleccionados en dos categorías diferentes: un grupo de animales se utiliza en un programa de cría selectiva para generar progenitores de AI y el otro grupo de animales se convierte en donantes de ovocitos para la producción in vitro de embriones lecheros comerciales que están destinados a ser transferidos a hembras en granjas de producción. En una realización específica, el programa de cría selectiva genera candidatos de la selección tanto para el programa de cría selectiva como para el programa de embriones. En una realización adicional de la divulgación, los animales seleccionados para el programa de cría selectiva comprenden animales que tienen valores de GEBV y GPTA más elevados que los animales seleccionados para el programa de embriones. En una realización más específica, los animales seleccionados para el programa de cría selectiva comprenden el primer 1% de candidatos de la selección en cuanto a los valores de GEBV o GPTA. En una realización adicional, los animales seleccionados para el programa de embriones comprenden el siguiente 29% de los candidatos de la selección en cuanto a los valores de GEBV o GPTA. Estos porcentajes relativos se pueden ajustar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de las necesidades de cada programa. En una realización específica, los animales seleccionados para el programa de cría selectiva comprenden el primer 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 % o 10% de los candidatos de la selección en cuanto a los valores de GEBV o GPTA. Las hembras seleccionadas para el programa de embriones se someten a superovulación y sus ovocitos se recolectan utilizando cualesquiera métodos conocidos en la técnica. Estos ovocitos se utilizan a continuación para producir embriones hembra mediante IVF utilizando esperma con selección de género y a continuación los embriones se transfieren a animales hembra al nivel de la granja lechera comercial para convertirse posteriormente en animales de producción. Tal y como se muestra en el Ejemplo 4, más adelante, este ejemplo de la divulgación es capaz de producir animales de producción/vacas lecheras comerciales que exceden el valor de EBV (o GEBV o GPTA) promedio de los candidatos de la selección. En una realización específica de la divulgación, los candidatos de la selección comprenden progenie de progenitores en un núcleo genético, línea o manada. A los efectos de la divulgación, la expresión “animal de producción” comprende un animal que produce, o ha producido, leche para la venta comercial.

EJEMPLO 1 - CLONACIÓN UTILIZANDO CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES CULTIVADAS

Paso 1. Producción de un embrión donante mediante IVF. Se recuperaron COC inmaduros en profase I a partir de terneras Holstein peripubertales utilizando un sistema TVOR. Los COC inmaduros se llevaron al laboratorio y se colocaron en un sistema de cultivo de IVM. Después de un periodo de cultivo durante toda la noche, los ovocitos que evolucionaron a través de la meiosis I y eran morfológicamente normales, se utilizaron en IVF. Los ovocitos maduros se colocaron en gotas de IVF y se fertilizaron con una concentración específica de esperma capacitado procedente de un toro Holstein. Los cigotos (día 1) se colocaron en un sistema de cocultivo tradicional y se cultivaron hasta los estadios uterinos del desarrollo el día 7-8 de cultivo. Se transportó un embrión a una granja de terneras receptoras, donde se transfirió de forma no quirúrgica a una hembra receptora sincronizada. El embarazo se monitorizó de modo regular y programado mediante una ultrasonografía transrectal a tiempo real.

Paso 2. Amniocentesis para obtener amniocitos. El día 76 del embarazo, se realizó una amniocentesis en la hembra receptora. La ternera se contuvo en potros de herrar y se sedó antes de llevar a cabo la amniocentesis. Se vaciaron las heces del recto del receptor y, con anestesia epidural, la vulva y el área rectal del receptor se limpiaron y se rasparon. El paso de desinfección se completó enjuagando la vulva y el área rectal con una solución de Betadine, y a continuación enjuagando y pulverizando el área limpiada con etanol al 70%. El equipo de TVOR se limpió y esterilizó con etanol inmediatamente antes de su introducción en la vagina y se ajustó con una guía de aguja única de acero inoxidable estéril. Se hizo avanzar el equipo de TVOR en el interior de la vagina, se posicionó hacia la izquierda o la derecha de la boca del cuello uterino mediante la manipulación por el recto, la trompa uterina embarazada se posicionó contra la sonda, de manera que se evitara la interposición de otro tejido en el camino propuesto de la aguja. La ubicación exacta del saco amniótico se determinó mediante el reconocimiento de partes del cuerpo fetal, las membranas alantoamnióticas y alantocoriónicas y la pared uterina. Cuando se observó un área no ecogénica que representaba el fluido amniótico en la pantalla del monitor, se insertó una aguja estéril con un estilete en la guía de la aguja y se hizo avanzar de manera que penetrara a través de la pared vaginal, el útero y las membranas fetales posteriores. Tan pronto como se observó que la punta de la aguja había entrado en el compartimento de fluido fetal, se retiró el estilete de la aguja y se colocó la aguja dentro del saco amniótico del feto. Se aspiraron unos 5-10 ml iniciales de fluido fetal en el tubo y se expulsaron del sistema del tubo para reducir o eliminar la contaminación materna. Se adhirió un filtro de amniocentesis al tubo y se aspiraron 30-40 ml adicionales de fluido amniótico. Durante la recolección de fluido, la trompa uterina embarazada se mantuvo en la misma posición y la localización exacta de la punta de la aguja se garantizó mediante su visualización en la pantalla de ultrasonidos. El fluido recolectado en el sistema de filtros se introdujo en hielo y se transportó de nuevo al laboratorio de cultivo celular.

Paso 3. Procesamiento del fluido de la amniocentesis. En condiciones estériles, el fluido y los amniocitos recolectados se aspiraron con una pipeta en tubos cónicos de 15 ml. El filtro de la recolección se enjuagó con medio de cultivo para eliminar todas las células adheridas y se repitió según fuera necesario para eliminar la cantidad máxima de amniocitos del filtro. A continuación, los tubos cónicos se centrifugaron hasta que se formó un pellet celular. El sobrenadante se aspiró y las células se suspendieron de nuevo en medio de cultivo celular. La suspensión celular se mezcló exhaustivamente y se pipeteó en placas de cultivo. Los cultivos celulares se colocaron en una incubadora de cultivos celulares y se cultivaron a 38.7 °C en un 5% de CO²/aire durante 5 días sin alteraciones. El día 5 del cultivo, las placas de cultivo celular se retiraron del cultivo y el medio de cultivo celular y todas las células flotantes (células madre mesenquimales) se aspiraron y se colocaron en tubos de centrífuga de 15 ml. Se inició un cultivo celular por separado con las células madre mesenquimales flotantes aspiradas. Las células restantes (fibroblastos) se alimentaron en un medio de cultivo fresco y se colocaron de nuevo en incubadoras de cultivo celular y se cultivaron hasta obtener una confluencia de un 80-90%. Después de alcanzar la confluencia (día 20), se levantaron los fibroblastos para almacenarlos criológicamente.

Paso 4. Extracción de ADN a partir de los fibroblastos cultivados y análisis genómico. Los fibroblastos congelados se transportaron a las instalaciones para la extracción de ADN y análisis genómico. Tras la descongelación, se añadió un volumen equivalente de una solución que contenía Tris-EDTA. A continuación, la suspensión celular se conservó en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml a 4 °C hasta que se necesitó para la extracción de ADN. Los tubos de 1.5 ml que contenían la suspensión celular se centrifugaron a > 10000 x g en una microcentrífuga durante 45 segundos para obtener pellets de las células. La solución en suspensión se pipeteó cuidadosamente de modo que no se retiraran las células del pellet. Se dejaron aproximadamente 50 pl de solución en suspensión en cada tubo. A continuación, los tubos se agitaron con vórtex durante 10 segundos para suspender de nuevo los pellets celulares. A continuación, se añadieron 300 pl de solución de lisis para células y tejidos (Epicentre; Madison Wisconsin; n° de catálogo MTC096H) que contenía 1 pl de Proteinasa K (Epicentre; Madison Wisconsin; con una concentración de 50 ug/pl; n° de catálogo MPRK092) a cada tubo y se mezclaron. Los tubos se incubaron a 65 °C durante 30 minutos y se agitaron con vórtex durante 15 minutos. Las muestras se enfriaron hasta 37 °C. Después, se añadió 1 pl de RNasa A con una concentración de 5 mg/pl (Epicentre; Madison Wisconsin; con una concentración de 5 mg/ml; n° de catálogo MPRK092) a cada muestra y a continuación se mezcló. Posteriormente, las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, las muestras se colocaron en un refrigerador a 4 °C durante 5 minutos. Se añadieron 175 pl de reactivo de precipitación de proteínas MPC (Epicentre; Madison Wisconsin; n° de catálogo MMP095H) a cada muestra y a continuación las muestras se agitaron con vórtex enérgicamente durante 10 15 segundos. Las muestras se centrifugaron para formar pellets de los residuos durante 8 minutos a > 10000 x g. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio de microcentrífuga. Se añadieron 600 pl de isopropanol frío (-20°C) al sobrenadante. A continuación, cada tubo se invirtió 30-40 veces. Se formaron pellets del ADN mediante centrifugación durante 8 minutos en una microcentrífuga a > 10000 x g. Se vertió el isopropanol sin disgregar el pellet de ADN. El pellet se enjuagó una vez con etanol al 70% y a continuación se vertió cuidadosamente el etanol sin que se alterase el pellet de ADN. El etanol residual se eliminó con una pipeta y se dejó secar al aire el pellet de ADN en el tubo de microcentrífuga. Una vez seco, se suspendió de nuevo el pellet de ADN en 20 pl de Tris-EDTA. La extracción proporcionó menos de 10 ng/pl de ADN bicatenario.

A continuación, el ADN extraído se analizó utilizando un bovine SNP BeadChip de Illumina. Los datos generados por el SNP BeadChip se utilizaron para confirmar la paternidad del embrión donante y proporcionar una puntuación de GTPI de 2451.

Paso 5. IVM de los COC empleados en la clonación. Los COC se obtuvieron a partir de donantes de un matadero y se colocaron en un sistema de cultivo de IVM. Después de completar la IVM, los COC se procesaron para la enucleación. 20 h después de la IVM, los COC se colocaron en TL-Hepes de pH estable con 1 mg/ml de hialuronidasa, donde se mezclaron y se pipetearon cuidadosamente para eliminar las inversiones de cúmulo. Después de que los ovocitos quedaran exentos de células del cúmulo, estos se evaluaron con esteromicroscopía para analizar su morfología, la presencia de un espacio perivitelino con un primer cuerpo polar extruido y la integridad del citoplasma. Se consideró que los ovocitos con una zona pelúcida normal, un espacio perivitelino distintivo con la formación de cuerpos polares normales y un citoplasma homogéneo eran MO. Los MO se incubaron en un inhibidor de microfilamentos y Hoechst 33342. Con una luz incandescente baja y luz UV controlada en un microscopio compuesto invertido, se utilizó una aguja biselada para penetrar a través de la zona pelúcida y en la membrana plasmática de cada MO, justo debajo del área de los cromosomas en metafase fluorescentes. La cromatina se aspiró con éxito hacia el exterior de los MO para obtener citoplastos enucleados.

Paso 6. Preparación de células madre mesenquimales para la clonación. Las células madre mesenquimales cultivadas del embrión donante se levantaron del cultivo y se colocaron en tubos de microcentrífuga de 15 ml. Se añadieron 10 ml de medio de cultivo DMEM gota a gota a cada tubo a la vez que se hacía girar este. Los tubos se centrifugaron a 200 x rpm durante 5-10 minutos. Las células se cultivaron en una placa de cultivo tisular Nunc de 4 pocillos y en una placa de cultivo celular de 100 mm. En la placa Nunc de 4 pocillos, se añadieron 0.5 ml de DMEM a cada pocillo y se añadieron 2 ml de DMEM al pocillo central. En la placa de cultivo celular de 100 mm, se añadieron 12 ml de DMEM a la placa. Después de completar la centrifugación, el sobrenadante se retiró sin que se alterara el pellet. El pellet se suspendió de nuevo cuidadosamente en 0.5 ml de medio de cultivo. Después de mezclar, se añadieron 50 |ul de suspensión celular a cada pocillo de los dos primeros pocillos Nunc, 25 |ul al tercer pocillo y 15 |ul al cuarto pocillo. El resto de las células en suspensión se colocó en la placa de 100 mm. Todos los cultivos celulares se colocaron en la incubadora y se cultivaron a 38.7 °C en un 5% de CO²y aire. El día del uso en la clonación, estas células se levantaron del cultivo celular mediante un tratamiento con proteasa y las células libres y disociadas se colocaron en una placa de cultivo organizado para su uso en la transferencia nuclear de células somáticas.

Paso 7. Reconstrucción de los clones. Los citoplastos se prepararon para la reconstrucción de los clones. A la vez que se mantenía cada citoplasto en un plano donde la incisión de la aguja para la enucleación estaba en un buen plano focal, se utilizó una punta de enucleación para captar una célula madre mesenquimal y a continuación realizar la incisión en sí a partir de la enucleación en la zona pelúcida. A continuación, la célula madre mesenquimal se colocó al lado de la membrana plasmática en cada citoplasto. Las reconstrucciones se completaron en serie.

Paso 8. Activación de los ovocitos. Después de completar la reconstrucción del clon, los citoplastos reconstruidos se colocaron en una cámara de electrofusión que contenía un medio de fusión basado en un poliol conductivo. Cuando los citoplastos reconstruidos se alinearon de manera uniforme en la cámara, los citoplastos se trataron con un pulso de corriente directa de 100 V durante 40 |us. Después de la electrofusión, los citoplastos se lavaron y se cultivaron para permitir que los cíbridos completaran el proceso de fusión. Después de que se completara el proceso de fusión, los cíbridos se colocaron en un medio de cultivo que contenía ionomicina. Posteriormente, los embriones clonados se incubaron durante aproximadamente 5 horas en CHX.

Paso 9. Cultivo de embriones clonados. Todos los embriones clonados reconstruidos intactos se colocaron en un cultivo a largo plazo en medio de cultivo de embriones específico bovino suplementado con albúmina de suero bovino. El día 5, los embriones con más de 8 células y que mostraban signos de compactación temprana se suplementaron con FBS al 10%. El día 6-8, los embriones clonados en estadio de blastocito avanzado se envasaron en medio de transporte y se llevaron a las instalaciones de una granja de receptores donde se transfirieron de forma no quirúrgica a receptores que eran terneras subrogadas.

Paso 10. Gestión de las terneras receptoras y nacimiento. Los embriones clonados se transportaron a la granja en tubos de cultivo y se transfirieron de forma no quirúrgica mediante métodos tradicionales a receptores hembra sincronizados específicos. Las hembras receptoras fueron examinadas de manera regular por veterinarios y los embarazos en curso se monitorizaron de manera regular y programada mediante una ultrasonografía transrectal a tiempo real mensualmente hasta el final del embarazo. Un embarazo con éxito dio como resultado el nacimiento de una ternera clonada. El análisis genómico de una muestra tisular obtenida de la ternera confirmó que la ternera era un clon del embrión donante.

EJEMPLO 2 - CLONACIÓN UTILIZANDO FIBROBLASTOS CULTIVADOS

Los materiales y métodos empleados en el Ejemplo 1 se utilizaron para obtener embriones clonados a partir de un segundo donante de embriones, con las siguientes excepciones: 1) la extracción de ADN y el análisis genómico (tal como se han descrito en el Paso 4 anteriormente) se realizaron utilizando células madre mesenquimales obtenidas el día 5 del cultivo (como se obtuvieron en el Paso 3 anteriormente); y 2) los embriones clonados se crearon utilizando fibroblastos crioconservados (como se obtuvieron en el Paso 3 anteriormente) en lugar de células madre mesenquimales. Además, cada criovial de fibroblastos se descongeló en un baño de agua a 37 °C durante 1 minuto, 1 -2 días antes de la clonación, se transfirió a un tubo de centrífuga de 15 ml y a continuación se procesó de acuerdo con el Paso 5 anterior.

EJEMPLO 3 - CLONACIÓN DE AMNIOCITOS PARA INCREMENTAR LA EVOLUCIÓN GENÉTICA

En el siguiente ejemplo, se evaluaron los efectos de la amniocentesis y la clonación sobre la evolución genética en una manada, línea o núcleo genético utilizando los siguientes parámetros y asunciones.

Parámetros

• ap = Desviación estándar fenotípica

• l f = Heredabilidad

• °A ~ * Gp (desviación estándar genética/genómica aditiva)

• p = Proporción de animales seleccionados

• r = Precisión de la selección

• z = Cuantil

• i = zlp (Intensidad de la selección)

• AG = i * ^ * a P* r

Asunciones

# desviación estándar genómica aditiva

sA = 76

# Capacidad para ios receptores

N - 6000

# número de individuos seleccionados

Nsel = 150

# clonación - esto proporciona el número de clones por hembra

Nclones =10

# longitud de la gestación en días

GL =285

# Día de gestación en la amniocentesis

AD = 74

# por zona en el establo: cuántos días del año no está un animal embarazado

# Días hasta el embarazo para el receptor

DP = 32

# Días desde la toma de la muestra hasta los resultados de la prueba genómica (GTPI)

gsO = 21

# Resultados de la prueba genómica de precisión

r = 0.8

Escenarios

Se determinó la evolución genética de la manada, línea o núcleo genético en cuatro escenarios. La evaluación genómica (GTPI) (que da como resultado un incremento en la precisión de la selección) se lleva a cabo en los cuatro escenarios. Sin embargo, en los escenarios 1 y 3, la evaluación genómica se realiza utilizando muestras tisulares posteriores al nacimiento, mientras que en los escenarios 2 y 4, la evaluación genómica se realiza utilizando amniocitos obtenidos a partir de amniocentesis. Además, en los escenarios 1 y 2, no se llevó a cabo ninguna clonación, mientras que en los escenarios 3 y 4 se llevó a cabo una clonación. A continuación, se muestra un resumen de los cuatro escenarios.

1. Sin amniocentesis; sin clonación.

2. Amniocentesis; sin clonación.

3. Sin amniocentesis; clonación utilizando una muestra tisular posterior al nacimiento.

4. Amniocentesis; clonación utilizando amniocitos obtenidos a partir de amniocentesis.

Cálculo de la evolución genética por generación para los escenarios

# función que computa deltaG para los parámetros dados anteriores

deltaG = función (N, Nsel, r, sA) {

p = Nsel / N

i = dnorm(qnorm(l-p)) / p

G = i * sA *r

return(list(G = G, N = N))

}

Glist <- list()

GClist <- list()

Glist[[l JJ = dcltaG(N = N * (365 / (GL DP gsO)),

Nsel = Nsel,

r = r,

sA = sA)

Glist[[2]] = deltaG(N = N * (365 / (AD DP gsO)),

Nsel = Nsel,

r = r,

sA = sA)

# y con clones

GClist[[l]] = deltaG(N = N * (365 / (GL DP gsO)),

Nsel = Nsel / Nclones,

r = r,

sA - sA)

GClist[[2]] = deltaG(N = N * (365 / (AD DP gsO)),

Nsel = Nsel / Nclones,

r = r,

sA = sA)

Tabla 1. Resultados

Escenario Amnio Clonación Animales evaluados delta.G

1 No No 6479 179.87

2 Sí No 17244 206.12

3 No Sí 6479 237.66

4 Sí Sí 17244 258.82

Resultados:

El uso de la amniocentesis para obtener amniocitos para la evaluación genómica dio como resultado independientemente un incremento en los candidatos de la selección y, de este modo, incrementa la intensidad de la selección. Esto se debe a que los fetos que tienen unas puntuaciones genómicas bajas pueden ser abortados antes del nacimiento, lo que permite que las hembras receptoras se pueden reciclar antes y de este modo se obtienen candidatos adicionales. Además, el uso de la clonación da como resultado independientemente una reducción en el número de animales seleccionados y de este modo se incrementa la intensidad de la selección. Esto se debe a que se pueden utilizar múltiples copias de una única hembra con una puntuación genómica superior para producir la totalidad, o una mayor porción, del número requerido de terneras de reemplazo para la siguiente generación (en lugar de tener que seleccionar múltiples hembras diferentes con el fin de producir un número suficiente de reemplazos). Un incremento en la intensidad de la selección da como resultado un incremento en la evolución genética, siendo todo lo demás equivalente.

El uso de la amniocentesis y la clonación conjuntamente (escenario 4) dio como resultado el incremento más grande en la evolución genómica. Remítase a la Tabla 1. El uso de la clonación únicamente (escenario 3) fue superior al uso de la amniocentesis únicamente (escenario 2). La evolución genética más baja se obtuvo cuando no se utilizó amniocentesis ni clonación (escenario 1).

EJEMPLO 4 - USO DE IVF Y TRANSFERENCIA EMBRIÓNICA PARA INCREMENTAR EL MÉRITO GENÉTICO DE ANIMALES DE PRODUCCIÓN

El elevado número de individuos que pueden ser evaluados mediante los métodos descritos en el Ejemplo 3 anteriormente incrementa la intensidad de la selección cuando se asume que el número de animales seleccionados por generación es constante. Otra estrategia para utilizar esta elevada capacidad de evaluación consiste en incrementar el número de animales seleccionados, pero agruparlos en dos categorías diferentes: un grupo se utiliza en un programa de cría selectiva para generar progenitores de AI (programa de cría selectiva = BP). El otro grupo de animales se convierte en donantes de ovocitos para la producción in vitro de embriones lecheros comerciales que están destinados a ser transferidos a hembras en granjas de producción/comerciales (programa de embriones = EP).

Parámetros asumidos

Número de animales evaluados utilizando amniocentesis: 17244

EBV promedio de los candidatos de la selección: 2600

Desviación estándar genética aditiva ( ^o ^a): 76

Número de animales seleccionados para el programa de cría selectiva: 150

Número de animales seleccionados para el programa de embriones: 5000

Resultado

La figura 1 muestra el intervalo a lo largo de la distribución de valores de cría selectiva para todos los candidatos de la selección. Los animales para el programa de cría selectiva constituyen el primer 1% de candidatos de la selección en cuanto a EBV, mientras que los del programa de embriones constituyen el siguiente 29% de los candidatos de la selección en cuanto a EBV. Esto conduce a dos puntos de truncamiento de la distribución. El primero define el límite inferior para los animales de EP (2640.15) y el segundo, el límite superior de EP e inferior de BP (2780.74). Los valores promedio de EBV resultantes en los dos grupos de la selección son 2684.76 y 2806.12 para el grupo de EP y BP, respectivamente. El uso de amniocentesis junto con un programa de producción de embriones para granjas lecheras comerciales es, por lo tanto, capaz de proporcionar vacas lecheras comerciales que exceden el valor promedio de EBV de los candidatos de la selección (dados los parámetros asumidos y el concepto general del programa). Se asume que cualquier donante de EP seleccionado proporciona 200 crías a través de un programa intensivo de IVF. Los 5000 animales de EP en este ejemplo, por consiguiente, serán capaces de generar 1000000 de vacas lecheras comerciales.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar un valor genómico estimado de cría selectiva (GEBV) o una capacidad de transmisión genómica prevista (GPTA) de un feto mamífero no humano que comprende:

extraer ADN de uno o más amniocitos fetales;

genotipificar el ADN con el fin de obtener un genotipo para el feto; y

determinar un GEBV o una GPTA del feto basándose en el genotipo.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de aislar dicho uno o más amniocitos fetales a partir de fluido amniótico.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de clonar el feto utilizando un amniocito fetal.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicho uno o más amniocitos fetales comprenden células madre mesenquimales derivadas del fluido amniótico.

5. El método de la reivindicación 1, donde el genotipo es un genotipo de SNP.

6. El método de la reivindicación 5, donde el ADN se genotipifica utilizando una matriz o chip de SNP.

7. El método de la reivindicación 6, donde el ADN se genotipifica utilizando un BovineSNP50 v1 BeadChip, Bovine SNP v2 BeadChip, Bovine 3K BeadChip, Bovide LD BeadChip, Bovine HD BeadChip, Geneseek® Genomic Profiler™ LD BeadChip o Geneseek® Genomic Profiler™ HD BeadChip.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de calcular un índice de selección utilizando el GEBV o la GPTA.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de calcular el índice de rendimiento genómico total (GTPI®) utilizando el GEBV o la GPTA.

10. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de verificar la paternidad del feto utilizando el genotipo.

11. El método de la reivindicación 1, donde el feto mamífero no humano es un bóvido.