ES2811198B2 - Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel - Google Patents

Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel Download PDF

Info

Publication number
ES2811198B2
ES2811198B2 ES201930784A ES201930784A ES2811198B2 ES 2811198 B2 ES2811198 B2 ES 2811198B2 ES 201930784 A ES201930784 A ES 201930784A ES 201930784 A ES201930784 A ES 201930784A ES 2811198 B2 ES2811198 B2 ES 2811198B2
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nanoparticles
paper
modified
pss
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES201930784A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2811198A1 (es
Inventor
La Rica Quesada Roberto De
Patiño Francy Alejandra Alba
Jaume Cristina Adrover
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitat de les Illes Balears
Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA
Original Assignee
Universitat de les Illes Balears
Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to ES201930784A priority Critical patent/ES2811198B2/es
Application filed by Universitat de les Illes Balears, Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA filed Critical Universitat de les Illes Balears
Priority to JP2022507629A priority patent/JP2022547397A/ja
Priority to CA3144417A priority patent/CA3144417A1/en
Priority to US17/641,400 priority patent/US20220299504A1/en
Priority to EP20768572.8A priority patent/EP4028764A1/en
Priority to AU2020344799A priority patent/AU2020344799A1/en
Priority to PCT/EP2020/075013 priority patent/WO2021048087A1/en
Priority to KR1020227004939A priority patent/KR20220058533A/ko
Priority to CN202080062863.5A priority patent/CN114340794A/zh
Publication of ES2811198A1 publication Critical patent/ES2811198A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2811198B2 publication Critical patent/ES2811198B2/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
    • D21H17/20—Macromolecular organic compounds
    • D21H17/33—Synthetic macromolecular compounds
    • D21H17/34—Synthetic macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D21H17/35—Polyalkenes, e.g. polystyrene
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H19/00—Coated paper; Coating material
    • D21H19/10—Coatings without pigments
    • D21H19/14—Coatings without pigments applied in a form other than the aqueous solution defined in group D21H19/12
    • D21H19/20—Coatings without pigments applied in a form other than the aqueous solution defined in group D21H19/12 comprising macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D21H19/22—Polyalkenes, e.g. polystyrene
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B01L2300/126—Paper

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel
La invención se refiere a un procedimiento para almacenar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel sin unión irreversible y, particularmente, para almacenar nanopartículas decoradas con proteína dentro de sustratos de papel modificados con un polímero. La invención también se refiere a un reservorio que se obtiene mediante el proceso y que contiene nanopartículas decoradas con proteína capaces de establecer interacciones biológicas entre ligando y receptor y su uso en biosensores hechos de papel.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El papel de filtro es el sustrato predilecto para desarrollar biosensores desechables debido a su ligero peso, bajo precio y alta disponibilidad (Reboud et al. Paper-based microfluidics for DNA diagnostics of malaria in low resource underserved rural communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2019, 116, 4834-4842; Roig-Sanchez et al. Nanocellulose films with multiple functional nanoparticles in confined spatial distribution Nanoscale Horiz., 2019, 4, 634--641; Tenda et al., Paper-Based Antibody Detection Devices Using Bioluminescent BRET-Switching Sensor Proteins. Angew. Chemie - Int. Ed. 2018, 57, 15369-15373). Se comercializa en un gran abanico de tamaños de poro y es de fácil modificación con biomoléculas mediante adsorción física o métodos de unión covalente (Chu et al. Paper-based chemiluminescence immunodevice with temporal controls of reagent transport technique. Sensors Actuators, B Chem. 2017, 250, 324-332; Wang et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst 2012 137, 3821). Su matriz porosa también sirve para almacenar reactivos, como encimas y sus sustratos, y para fabricar reservorios integrados en dispositivos analíticos basados en papel (Calabria et al. Smartphone-based enzymatic biosensor for oral fluid L-lactate detection in one minute using confined multilayer paper reflectometry. Biosens. Bioelectron. 2017, 94, 124-130). Estos reservorios han de preservar las propiedades fisioquímicas de sus elementos reactivos durante un tiempo y, a la vez, asegurar una liberación eficiente de sus contenidos a otras áreas del papel al añadir líquidos. Las nanopartículas plasmónicas son unidades estructurales extremadamente útiles para la fabricación de biosensores mediante el uso de un amplio repertorio de mecanismos de transducción de señales, desde la colorimetría (Russell and de la Rica Paper transducers to detect plasmon variations in colorimetric nanoparticle biosensors. Sensors Actuators, B Chem. 2018, 270, 327-332), pasando por la espectroscopia SERS (Catala et al. Online SERS Quantification of Staphylococcus aureus and the Application to Diagnostics in Human Fluids Adv. Mater. Technol. 2016, 1600163), hasta la fluorimetría (Ellairaja et al. Novel Pyrimidine Tagged Silver Nanoparticle Based Fluorescent Immunoassay for the Detection of Pseudomonas aeruginosa. J. Agric. Food Chem. 2017, 65, 1802-1812) y la electroquímica (Liang et al. An origami paper device for complete elimination of interferents in enzymatic electrochemical biosensors. Electrochem. Commun. 201782, 43-46).
Sin embargo, las nanopartículas tienden a adsorberse sobre sustratos de papel tras el secado, lo que dificulta su almacenamiento en reservorios fabricados en este material (Ruivo et al. Colorimetric detection of D-dimer in a paper-based immunodetection device. Anal. Biochem. 2017, 538, 5-12). Tradicionalmente, este inconveniente se ha solventado mediante la fabricación de reservorios hechos de fibra de vidrio en vez de papel convencional (Deraney et al., Multiplexed, Patterned-Paper Immunoassay for Detection of Malaria and Dengue Fever. Anal. Chem. 2016, 88, 6161-6165). Pero este procedimiento no es del todo compatible con ciertos diseños de biosensores, como los dispositivos analíticos basados en papel de origami. Estos biosensores están fabricados en su totalidad a base de papel con el objetivo de simplificar su fabricación y facilitar el contacto entre sus partes sin el uso de adhesivos adicionales (Liu et al. Aptamer-based origami paper analytical device for electrochemical detection of adenosine. Angew. Chemie - Int. Ed. 2012, 51, 6925-6928; Liu and Crooks, Threedimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 17564-17566).
Anteriormente, se ha utilizado PSS para evitar la floculación de nanopartículas, normalmente en forma de capas alternadas de PSS y un polímero cargado positivamente como el cloruro de polidialildimetilamonio (McLintock et al., Universal surface-enhanced Raman tags: Individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). ACS Nano 2014, 8, 8600-8609). También se ha usado como apoyo para el crecimiento de nanopartículas (Cai et al., Coating sulfonated polystyrene microspheres with highly dense gold nanoparticle shell for SERS application. Colloid Polym. Sci. 2013, 291, 2023-2029) y para su transferencia a un sustrato receptor con litografía blanda (Basarir, Fabrication of gold patterns via multilayer transfer printing and electroless plating. ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 1324-1329). El PSS combinado con PEDOT se utiliza frecuentemente para modificar celulosa y hacerla conductora (Khan et al., Nano-gold assisted highly conducting and biocompatible bacterial cellulose-PEDOT:PSS films for biology-device interface applications. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 107, 865-873).
La liberación de nanopartículas almacenadas en sustrato de papel no modificado no ha sido descrita todavía en su totalidad (Chen et al. Three-dimensional origami paperbased device for portable immunoassay applications. Lab Chip 2019, 19, 598-607) y algunos estudios han indicado su elevada ineficiencia (Ruivo et al., 2017).
Así pues, sería deseable descubrir un procedimiento para el almacenamiento de nanopartículas en sustratos de papel y su muy eficiente liberación bajo demanda para que así puedan ser implementadas en dispositivos analíticos en 2D y 3D fabricados únicamente con papel.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un reservorio que comprende de nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel, el cual comprende los pasos siguientes:
i. el tratamiento del sustrato de papel con polímero hidrofílico cargado negativamente sobre el sustrato de papel; y
ii. la aplicación de nanopartículas decoradas con proteínas sobre el sustrato de papel modificado con PSS obtenido en el paso (i).
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el polímero es poliestireno sulfonato (PSS).
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que la proteína es una proteína capaz de establecer interacciones entre ligando y receptor, preferiblemente en el que la proteína es avidina o un anticuerpo y, más preferiblemente, en el que la proteína es avidina.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que las nanopartículas son nanopartículas modificadas con PEG.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que las nanopartículas modificadas con PEG son nanopartículas de oro modificadas con PEG.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el tratamiento del paso (i) se realiza depositando una gota de polímero, preferiblemente PSS, sobre partes del sustrato de papel.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que las partes del sustrato de papel del paso (i) se cortan en forma de cuadrados.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el volumen del polímero añadido, preferiblemente del PSS añadido, es lo suficientemente grande como para formar un volumen de papel con polímero modificado más grande que el volumen que ocuparán las nanopartículas modificadas con PEG.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el volumen del polímero añadido, preferiblemente de PSS añadido, es de 50 ^L y la cantidad de nanopartículas modificadas con PEG, preferiblemente de nanopartículas de oro modificadas con PEG, es de 1 ^L.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, que además comprende el paso (iii) de dejar secar el papel tras el paso (ii), y caracterizado por que el paso (iii) de secado se realiza a una temperatura de 15 °C a 25 °C.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, que además comprende el paso (iv) de liberación de nanopartículas del reservorio.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el paso de liberación (iv) es un paso de transferencia a un sustrato de papel receptor, preferiblemente a un sustrato de papel receptor húmedo.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se realiza mediante presión, preferiblemente mediante presión con un dedo, una prensa o una abrazadera, y más preferiblemente, ejerciendo presión en el punto de la mancha durante 4 minutos como mínimo.
La transferencia de nanopartículas al reservorio puede ser ajustada para que suceda de manera preferente en los bordes o uniformemente por el reservorio mediante el afinamiento del % de PSS y de la concentración de nanopartículas; por ejemplo, un % de PSS de entre 1.9 y 7.5 % y una concentración de nanopartículas de 72 nM favorece la transferencia en los bordes, mientras que un % de PSS de 30 % y una concentración de nanopartículas de 210 nM o más produce una transferencia homogénea de nanopartículas hacia los sustratos receptores.
Por consiguiente, en otra realización la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se ajusta mediante el afinamiento del contenido de PSS y de la concentración de nanopartículas, preferiblemente de nanopartículas modificadas con PEG o de nanopartículas de oro modificadas con PEG.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se ajusta mediante el afinamiento del contenido de PSS a entre 1.9 y 7.5 % y la concentración de nanopartículas de oro modificadas con PEG a 72 nM.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se ajusta mediante el afinamiento del contenido de PSS a un 30 % y la concentración de nanopartículas de oro modificadas con PEG a, como mínimo, 210 nM.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, caracterizado por que el sustrato de papel receptor del paso (iv) ha sido modificado con un ligando biológico, preferiblemente albúmina de suero bovino (ASB) modificada con biotina y saturada con tampón fosfato salino con Tween-20 (PBST), que interacciona específicamente con una proteína receptora unida a las nanopartículas.
En otra realización, la invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente, que además comprende el paso (v) de retirar el reservorio tras la ejecución del paso (iv) y de retirar los reactivos en exceso, y preferiblemente, caracterizado por que el paso (v) se realiza mediante de 3 a 5 lavados con PBST.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un reservorio que comprende nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del reservorio de nanopartículas decoradas con proteína descrito anteriormente en la preparación de biosensores fabricados íntegramente en papel.
La presente invención introduce una nueva estrategia para la fabricación de reservorios de nanopartículas en papel de filtro. Esta consiste en modificar los sustratos de papel con poliestireno sulfonato cargado negativamente (PSS) para evitar la unión irreversible de nanopartículas modificadas con PEG a la matriz de celulosa (Figura 1A). Los reservorios preparados de esta manera pueden liberar nanopartículas con gran eficiencia.
De acuerdo con la invención, el PSS sirve para evitar la unión irreversible de nanopartículas a matrices de celulosa. Además de permitir bajo demanda la liberación de nanopartículas de las matrices de celulosa, el PSS también posibilita la transferencia de nanopartículas del reservorio seco a un sustrato de papel receptor húmedo mediante la simple presión del reservorio contra el receptor (Figura 1B). Así, los reservorios expuestos son de gran utilidad para el desarrollo de biosensores con esquemas simplificados de manipulación de líquidos, pues no hay necesidad de añadir un volumen controlado de tampón al reservorio para transferir su contenido al área de detección. Además, las nanopartículas modificadas con proteína (avidina) mantienen su habilidad de reconocer específicamente su ligando meta (biotina) que se encuentra inmovilizado en el papel receptor de manera dependiente de la dosis, lo cual demuestra la idoneidad de esta estrategia para el desarrollo de biosensores (Figura 1C).
Aquí se introduce un procedimiento para el almacenamiento de nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel que también permite su liberación bajo demanda. Este consiste en depositar nanopartículas en partes del filtro de papel modificado anteriormente con poliestireno sulfonato (PSS). Las nanopartículas de oro modificadas con avidina son fácilmente transferibles del reservorio seco al trozo de papel receptor húmedo mediante la simple presión con un dedo. Asimismo, las nanosondas pueden establecer interacciones bioespecíficas entre la avidina y la biotina con moléculas unidas a sustrato, lo cual hace que estos reservorios sean idóneos para la fabricación de biosensores basados en nanopartículas. El ajuste del % de PSS y de la concentración de nanopartículas en los reservorios permite una transferencia uniforme entre diferentes capas de papel sin que se formen «anillos de café». Estas características hacen que el procedimiento de la invención sea ideal para desarrollar biosensores de origami hechos íntegramente de papel de filtro y para incorporar mecanismos de generación de señales basados en nanosondas.
Los reservorios que propone esta invención son fáciles de fabricar, tienen una vida útil elevada y evitan los inconvenientes típicos de los biosensores de papel, como la generación de señales colorimétricas arrodaladas. Estas características hacen que sean idóneos para la fabricación de biosensores hechos íntegramente de papel.
En resumen, la presente invención describe un procedimiento para almacenar nanopartículas modificadas con PEG y con proteína en papel de filtro cuando el papel de filtro ha sido tratado anteriormente con PSS. Este tratamiento con PSS evita interacciones irreversibles con el papel, lo que permite la completa liberación de nanopartículas al añadir una solución acuosa. También permite la transferencia de nanopartículas del reservorio a un sustrato receptor mediante la presión con un dedo de un papel contra el otro. Afinar el % de PSS evita la formación de «anillos de café» tanto en el reservorio como en el sustrato receptor. De esta manera, se obtienen señales colorimétricas homogéneamente distribuidas gracias a interacciones biomoleculares entre las nanosondas y las moléculas unidas a sustrato. La presencia de PSS en el reservorio no interfiere en la generación de interacciones entre avidina y biotina y, además, preserva las nanosondas durante un mes como mínimo. Estas características hacen que los reservorios de esta propuesta sean idóneos para la fabricación de biosensores íntegramente de papel y que incorporen nanosondas decoradas con biomoléculas.
A lo largo de la presente invención el término «polímero hidrofílico cargado negativamente» se refiere a polímeros que establecen interacciones favorables termodinámicamente con agua y que contienen grupos que pueden ser desprotonados para producir grupos negativamente cargados. Entre los ejemplos se incluyen el poliestireno sulfonato (PSS), el ácido poliglutámico y ácidos nucleicos.
«Una proteína capaz de establecer interacciones entre ligando y receptor» se refiere a una proteína que interacciona con otra molécula mediante interacciones biomoleculares específicas. Entre los ejemplos se incluyen interacciones entre avidina y biotina, entre estreptavidina y biotina, entre anticuerpos y antígenos, entre agonista y receptor, entre enzima y sustrato, y entre enzima e inhibidor.
«Nanopartículas modificadas con PEG» se refiere a nanopartículas modificadas con polietilenglicol (PEG). Entre los ejemplos se incluyen nanopartículas de óxidos metálicos o de metales modificadas con PEG (oro, plata, platino, óxido de hierro o de zinc, etc.), nanopartículas semiconductoras modificadas con PEG (como puntos cuánticos y nanopartículas de upconversion, entre otras), liposomas y nanopartículas de proteínas modificadas con corteza de PEG, y nanopartículas de polímeros con PEG en sus capas externas.
Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que aparecen en este escrito se usan con el significado común que entiende cualquier persona conocedora de la técnica a la que pertenece esta invención. Para poner en práctica esta invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este escrito. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones el término «comprender» y sus variaciones se usan sin la intención de excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los ejemplos y dibujos siguientes se presentan a modo de ilustración sin intención de limitar la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Representación esquemática del reservorio de nanopartículas y del procedimiento de transferir su contenido a un sustrato de papel receptor; (A) El reservorio de papel (i) contiene poliestireno sulfonato (PSS) y nanopartículas de oro decoradas con proteínas receptoras (ii); el sustrato receptor (iii) contiene ligandos adsorbidos físicamente (iv); (B) Tras colocar el reservorio seco (i) en el sustrato de papel húmedo (ii) y presionar, con un dedo por ejemplo, se transfieren las nanopartículas del primero al segundo; (C) Tras limpiar los reactivos en exceso, la nanopartícula permanece unida al sustrato receptor (ii) mediante interacciones bioespecíficas entre ligando y receptor (v).
FIG. 2. Fabricación de reservorios de nanopartículas con diferentes % de PSS; (A) Imágenes escaneadas de los reservorios antes (arriba) y después (abajo) de 3 lavados con 1 mL de PBST; (B) Perfiles de intensidad de píxel (IP) de los reservorios; (C) Señales colorimétricas (S) en el reservorio antes (círculos) y después (cuadrados) de 3 lavados con PBST. Las barras de error son la desviación típica (n = 3). Las líneas de tendencia son una guía para la vista.
FIG. 3. Fabricación de reservorios con 30 % de PSS y diferentes concentraciones de nanopartículas decoradas con avidina; (A) Imágenes escaneadas de los reservorios antes (arriba) y después (abajo) de 3 lavados con 1 mL de PBST; (B) Perfiles de intensidad de píxel (IP) de los reservorios; (C) Señales colorimétricas (S) en el reservorio antes (círculos) y después (cuadrados) de 3 lavados con PBST. Las barras de error son la desviación típica (n = 3). Las líneas de tendencia son una guía para la vista.
FIG. 4. Transferencia de nanopartículas decoradas con avidina de reservorios con diferentes % de PSS a sustratos receptores modificados con proteínas biotiniladas; (A) Imágenes escaneadas de los sustratos receptores después de presionar los reservorios durante 4 minutos, de retirarlos y de lavarlos 3 veces con 1 mL de PBST; (B) Perfiles de intensidad de píxel (IP) de los sustratos receptores; (C) Señales colorimétricas (S) en el sustrato de papel receptor. Las barras de error son la desviación típica (n = 3). Las líneas de tendencia son una guía para la vista.
FIG. 5. Transferencia dependiente del tiempo de nanopartículas decoradas con avidina de reservorios con un 30 % de PSS a sustratos receptores modificados con proteínas biotiniladas; (A) Imágenes escaneadas de los sustratos receptores después de presionar los reservorios durante diferentes periodos de tiempo; (B) Perfiles de intensidad de píxel (IP) de los sustratos receptores; (C) Señales colorimétricas (S) en el sustrato de papel receptor. Las líneas de tendencia son una guía para la vista.
FIG. 6. Transferencia de nanopartículas decoradas con avidina almacenadas en diferentes concentraciones a sustratos de papel con diferentes tamaños de poro (22, 11 y 3 ^m en papel de Whatman 41, 6 y 1 respectivamente) modificados con proteínas biotiniladas; (A) Imágenes escaneadas de los sustratos receptores modificados con ASB biotinilada (biotina) o ASB sin modificar (controlada); (B) Señales colorimétricas en sustratos receptores en papel de Whatman #41 (triángulos), #6 (círculos) y #1 (cuadrados); los experimentos controlados con ASB sin biotinilación están indicados con líneas de puntos; (C) Perfiles de intensidad de píxel (IP) en diferentes sustratos receptores en papel de Whatman #41. Las barras de error son la desviación típica (n = 3). Las líneas de tendencia son una guía para la vista.
FIG. 7. Variación de la señal colorimétrica (intensidad de píxel, IP) resultante de las interacciones bioespecíficas entre avidina y biotina cuando se realiza el ensayo con reservorios secos de nanopartículas almacenados durante diferentes periodos de tiempo. El porcentaje de la señal ha sido calculado con respecto a los reservorios almacenados durante 1 h. Las barras de error son la desviación típica (n = 3).
FIG. 8 Detección de E. coli (A) y de glicoproteína B de citomegalovirus (B) con nanopartículas decoradas con anticuerpos almacenadas en reservorios de papel (escala semilogarítmica). Las barras de error son la desviación típica (n = 3).
EJEMPLOS
Síntesis y modificación de nanopartículas de oro con polietilenglicol y avidina: Se sintetizaron nanopartículas de oro bloqueadas con citrato y de un diámetro de aproximadamente 40 nm mediante el método de Turkevich, como se ha descrito anteriormente (Russell et al., Augmented Reality for Real-Time Detection and Interpretation of Colorimetric Signals Generated by Paper-Based Biosensors. ACS Sensors 2017, 2, 848-853). Seguidamente, se modificaron las nanopartículas con 0.1 mM de moléculas de polietilenglicol (PEG) tiolado finalizados en grupos carboxilo (polietilenglicol mercaptoetil eter ácido acético) por la noche. Después, las nanopartículas modificadas con PEG fueron concentradas y lavadas 5 veces con agua vía centrifugación a 8000 rpm durante 6 min. Finalmente, las nanopartículas fueron resuspendidas en 0.5 M ácido 2-morfolino etano sulfónico (MES, Sigma) ajustado a pH 5.5. A continuación, para transformar los grupos carboxilo de alrededor de las nanopartículas en ésteres de sulfo-NHS se añadieron 1 mg de N-(3Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida clorhidrato) y 2 mg de sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida por 20 min. Seguidamente, se precipitaron las nanopartículas por medio de centrifugación y se sustituyó el sobrenadante por una solución con 1 mg-mL-1 de avidina en 0.1 M de tampón de fosfato pH 7.4. Tras 1 h, se bloquearon los ésteres de sulfo-NHS sin reacción con 0.1 M de glicina y 10 mg-mL-1 de albúmina de suero bovino (ASB) por 30 min. Después, se lavaron las nanopartículas 5 veces con tampón fosfato salino (PBS) con un 0.1 % de Tween-20 (PBST). Las nanopartículas cubiertas con avidina fueron guardadas a 4oC hasta su uso. Se obtuvieron nanopartículas modificadas con anticuerpos mediante la incubación durante 1 h de anticuerpos biotinilados con las nanopartículas cubiertas con avidina, seguida por el lavado de los reactivos en exceso vía 3 pasos de centrifugación.
Densitometría: Las nanopartículas de oro sobre sustratos de papel generan señales colorimétricas dependientes de la concentración que pueden ser calculadas con densitometría, como se expone a continuación. En primer lugar, se escanearon los sustratos de papel con una impresora-escáner MFC-1910W (Brother). Se obtuvieron con ImageJ los perfiles de intensidad de píxel (PI). En escala de grises, la intensidad de píxel de blanco puro es de 255, mientras que la intensidad de píxel de negro puro es de 0. Se obtuvo la señal colorimétrica S de la siguiente manera. Primero, se midió la intensidad de píxel en escala de grises en un área circular dentro del área de interés con la función Histogram de ImageJ. La señal colorimétrica S fue tomada como el valor absoluto tras extraer la señal de fondo. Nótese que la extracción del perfil de intensidad de la señal de fondo produce señales invertidas comparadas con los datos brutos.
Fabricación de los reservorios de nanopartículas: Se usó papel de filtro Whatman números 41, 1 y 6 (con diámetros respectivos de 20-25, 11 y 3 ^m). Se cortó el papel en cuadrados y se modificó con 50 ^L de sulfonato poliestireno (PSS, 30 %, Sigma) que fueron diluidos con agua a un diferente % (v/v) cuando se requería. Tras el secado, se añadió 1 ^L de nanopartículas de oro modificadas con PEG y con avidina, y se dejó secar a temperatura ambiente. Para estudiar la liberación de las nanopartículas de los reservorios, se colocaron los sustratos de papel secos modificados con nanopartículas encima de un papel de filtro doblado y se añadió 3 veces 1 mL de PBST. Para evaluar la presencia de nanopartículas tras este paso se dejó secar el papel y se examinó mediante densitometría cualquier cambio de color en el reservorio de nanopartículas.
Transferencia de nanopartículas y bioreconocimiento: la transferencia de nanopartículas del reservorio al sustrato de papel receptor se estudió mediante el siguiente procedimiento. Se modificaron los sustratos de papel receptores con 2 ^L de ASB biotinilada (100 ^g-mL-1 en PBS) o con antígenos en las diferentes concentraciones expuestas en la Figura 8. Se obtuvo ASB biotinilada mediante un EZ-Link™ sulfo-NHS-biotinylation kit (Thermo Scientific). Se realizaron experimentos controlados con ABS no biotinilada para evaluar la contribución de las interacciones no específicas a las señales colorimétricas. Tras el secado, se añadió 1 mL de PBS con un suplemento de 5 mg-mL-1 de ASB (PBS-ASB). A continuación, se colocó el reservorio encima del papel receptor húmedo y se facilitó la transferencia de nanopartículas ejerciendo presión en el centro de la mancha durante 4 min. Posteriormente, se retiró el reservorio y se lavó 3 veces el sustrato receptor con PBST para eliminar interacciones no específicas. Tras el secado, se evaluó la señal colorimétrica mediante densitometría tal y como se detalló anteriormente.
La modificación de sustratos de papel con PSS facilita el almacenamiento de nanopartículas en la matriz de celulosa a la vez que permite su liberación con gran eficiencia. Para su estudio, se cortó el papel de filtro en cuadrados y posteriormente se añadieron 50 ^L de PSS en diferentes diluciones y se dejaron secar. Los sustratos de papel con un tamaño de poro de 22 ^m (Whatman #41) permanecieron mayormente llanos con todas las distintas concentraciones de PSS, por lo que, consecuentemente, fueron usados para la fabricación de los reservorios de nanopartículas. Estos se obtuvieron tras pipetear 1 ^L de nanopartículas de oro en el centro del papel modificado con PSS y tras dejarlo secar a temperatura ambiente. Las suspensiones de nanopartículas de oro con más disponibilidad se sintetizan mediante el método de Turkevich, el cual las deja bloqueadas con moléculas de citrato cargadas negativamente. Para evitar la agregación de nanopartículas en soluciones con concentraciones altas de cationes o proteínas, se suelen sustituir las moléculas de citrato por ligandos de polietilenglicol tiolado (de la Rica et al., Enzyme-responsive nanoparticles for drug release and diagnostics. Adv. Drug Deliv. Rev. 2012, 64, 967­ 978). Esto no solo evita la agregación de partículas sino que también permite la introducción de grupos reactivos, como grupos carboxilo, para una unión más covalente con biomoléculas. Con esto en mente, se ha estudiado la fabricación de reservorios que contengan sondas de nanopartículas modificadas con PEG y con avidina vía la formación de enlaces avida. La Figura 2A (arriba) muestra imágenes de los reservorios de nanopartículas preparados con diferentes % de PSS y 72 nM de nanopartículas de oro modificadas con avidina. En estas imágenes, el diámetro de la mancha tiende a reducirse al aumentar el % de PSS en el papel. Simultáneamente, la intensidad del color aumenta al aumentar el % de PSS. Esto también se puede observar en los perfiles de intensidad de píxel obtenidos de estas imágenes, disponibles en la Figura 2B. En escala de grises, la intensidad de píxel es la más alta cuando el color es blanco (255) y la más baja cuando el color es negro (0). En la Figura 2B, la intensidad de píxel a lo largo del reservorio se reduce al aumentar el % de PSS. El diámetro de la mancha sigue el mismo patrón. Todo esto indica que las nanopartículas se encuentran en concentraciones mayores y dentro de un volumen más reducido en la matriz del papel al aumentar el % de PSS. Por consiguiente, la formación de estos reservorios de nanopartículas más pequeños y más concentrados está relacionada con una difusión más lenta de las nanopartículas en la matriz de celulosa. Es bien sabido que la viscosidad de una solución aumenta al aumentar la concentración de PSS (Boris and Colby, Rheology of sulfonated polystyrene solutions. Macromolecules 1998, 31, 5746-5755). Ya que el coeficiente de difusión es inversamente proporcional a la viscosidad según la ecuación de Stokes-Einstein, una elevada concentración de PSS reduce la difusión radial y provoca manchas más pequeñas que contienen nanopartículas a una concentración mayor. Nótese que aunque el PSS da un color amarillento al sustrato de papel, su contribución a la intensidad de píxel no es del todo responsable de los cambios de color observados en el reservorio. Por ejemplo, en la Figura 2B la intensidad de píxel fuera del área de nanopartículas se ve reducido de 254 a 234 debido a la modificación con el 30 % de PSS, pero todavía se reduce más en el centro del reservorio, donde se encuentran las nanopartículas (IP « 62). Esto significa que la contribución principal al cambio de color es a causa de una mayor concentración de nanopartículas en el reservorio y no del PSS añadido. En la Figura 2B, también se observa que la intensidad de píxel es más baja en el borde del reservorio que en el centro. Esto se debe a una mayor concentración de nanopartículas en el borde de las manchas a causa de una distribución desigual de los solutos durante el procedimiento del secado (conocido como «anillos de café») (Zhang et al. Converting color to length based on the coffeering effect for quantitative immunoassays using a ruler as readout. Lab Chip 2018, 18, 271-275). Finalmente, se ha determinado si las nanopartículas pueden ser liberadas eficientemente del reservorio, pues este es un requerimiento importante para la integración de reservorios en biosensores. Para ello, se añadió a los reservorios 1 mL de PBST en 3 ocasiones. En la Figura 2A (abajo) el color no sufre ningún cambio con la ausencia de PSS, lo cual demuestra que, sin el polímero, las nanopartículas se unen irreversiblemente a la matriz de celulosa. Sin embargo, al aumentar el % de PSS, el color de dentro de la mancha desaparece paulatinamente, lo cual indica que las nanopartículas salen del reservorio más eficientemente cuando el % de PSS en el reservorio es mayor. Estos experimentos demuestran que el PSS evita la formación de interacciones irreversibles entre las nanopartículas y la matriz de celulosa. En la Figura 2C, la cuantificación de señales con densitometría indica la falta de color en el reservorio cuando el % de PSS utilizado para la fabricación del reservorio es de 15 % o más, lo que sugiere, bajo esta condición, la liberación completa de nanopartículas modificadas con avidina. En resumen, los resultados presentes en la Figura 2 demuestran que es posible almacenar nanopartículas modificadas con PEG y con proteína en un trozo de papel seco que haya sido previamente modificado con PSS y, que las nanopartículas pueden ser liberadas bajo demanda mediante la agregación de una solución acuosa.
A continuación, se ha demostrado que la concentración de nanopartículas tiene un impacto en la fabricación de un reservorio que está basado en papel y que contiene nanopartículas de oro modificadas con avidina. Para ello, se pipetearon 1 ^L de nanopartículas con diferentes concentraciones en sustratos de papel modificados con un 30 % de PSS (Figura 3A). El análisis del perfil revela que la formación de «anillos de café» en el reservorio presentes en la Figura 2 puede evitarse cuando las nanopartículas se distribuyen con una concentración de 140 nM o más, pues la intensidad de píxel es la misma tanto en el centro como en el borde de la mancha (Figura 3B). Con el objetivo de estudiar el efecto de la concentración de nanopartículas en la liberación de los contenidos de la matriz de celulosa modificada con PSS, se lavaron los reservorios con PBST como antes y se midió la señal colorimétrica que queda vía densitometría. En la fila inferior de la Figura 3A y en la Figura 3C, las señales colorimétricas que quedan son bajas en todas las concentraciones analizadas. Solo se detecta un ligero aumento en el color en la concentración más alta de nanopartículas analizada. Esto indica que un 30 % de PSS es efectivo para evitar las interacciones irreversibles con el papel incluso cuando el reservorio contiene altas concentraciones de nanopartículas de oro. En resumen, los experimentos en la Figura 3 indican que los mejores parámetros de fabricación para la obtención de reservorios con los métodos propuestos son un 30 % de PSS y nanopartículas de oro con una concentración de 140-210 nM. Bajo estas condiciones, las nanopartículas dentro del reservorio se distribuyen uniformemente (no aparecen «anillos de café») y la liberación de coloides del reservorio es completa (no quedan restos de color en el reservorio de papel).
Tras el estudio de las mejores condiciones para el almacenamiento y la liberación de nanopartículas en celulosa, se examinó la habilidad de transferencia de los coloides del reservorio seco a un papel receptor húmedo mediante presión del reservorio contra el papel (Figura 1B). Al mismo tiempo, se examinó si la avidina de alrededor de las nanopartículas todavía podía unirse a las moléculas biotiniladas en el sustrato de papel. En otras palabras, se ha estudiado si la presencia de PSS interfirió con la interacción biológica del modelo de la invención. Para llevar a cabo esta investigación, los reservorios secos fueron presionados contra el sustrato de papel receptor modificado con ASB biotinilada y saturados con PBST. Este proceso transfirió el líquido del papel receptor húmedo al reservorio de papel seco. La rehidratación resultante del reservorio permitió que las nanopartículas fueran transferidas del reservorio al sustrato receptor. Tras separar el reservorio, se lavó 3 veces el sustrato de papel receptor y se evaluó la presencia de nanopartículas unidas al sustrato mediante interacciones entre avidina y biotina. La Figura 4A muestra imágenes del sustrato receptor cuando el reservorio estaba fabricado con la misma concentración de nanopartículas (72 nM) pero diferente % de PSS. En estas imágenes, el color de la mancha se distribuye más uniformemente y es más intenso a medida que el % de PSS aumenta. Así, con un bajo % de PSS solo se genera un anillo de nanopartículas, el cual se va rellenando para dar una mancha coloreada con un alto % de PSS. La Figura 4B también muestra que las nanopartículas decoradas con avidina tienden a acumularse en la periferia de la mancha receptora cuando la concentración de PSS es baja. A medida que el % de PSS aumenta, el diámetro del anillo de nanopartículas se reduce y se observan más nanopartículas en el centro de la mancha. En la Figura 4C, la señal colorimétrica aumenta al aumentar el % de PSS porque se transfieren más nanopartículas en el área de interés. Se propusieron dos mecanismos para que la transferencia de nanopartículas provocara la formación de anillos. El primero de estos mecanismos implica que, con un % de PSS bajo, las nanopartículas se dispersan radialmente y se acumulan en los bordes al ser transferidas, mientras que con un % de PSS alto, las nanopartículas se dispersan radialmente en menor medida y se transfieren uniformemente al papel receptor. Esto provocaría una mayor concentración de nanopartículas en el centro de la mancha al aumentar el % de PSS, tal y como se observa en la Figura 4. En la segunda hipótesis, las nanopartículas son transferidas preferentemente desde los bordes del reservorio al sustrato de papel receptor. Así, se genera en primer lugar un anillo que, posteriormente, se va rellenando con más nanopartículas. Para discernir qué mecanismo gobierna sobre la transferencia de nanopartículas del reservorio al papel receptor, se repitieron los mismos experimentos con reservorios fabricados con la concentración más elevada de PSS (30 %) pero con diferente tiempo de contacto entre las capas del papel. En la Figura 5 A y B las nanopartículas se transfieren como un anillo cuando se utilizan cortos tiempos de transferencia incluso cuando el % de PSS es elevado. En la Figura 5 C, la señal colorimétrica aumenta al aumentar el tiempo. Estos resultados invalidan el primer mecanismo, pues no se observan nanopartículas en el centro del reservorio durante las primeras fases del proceso de nanopartículas. Así pues, se propone que las nanopartículas y el PSS se transfieren preferentemente desde los bordes del reservorio. Esto genera una barrera de difusión que da lugar a la transferencia posterior de polímeros y nanomateriales en el área central del papel receptor, tal y como propone la segunda hipótesis descrita anteriormente. A continuación, se demuestra que la concentración de nanopartículas y el tipo de papel son relevantes para la generación de señales específicas y no específicas para las aplicaciones de biosensores.
La Figura 6 muestra el efecto que tiene el tamaño del poro del papel receptor en la generación de señales colorimétricas cuando los reservorios llevan un 30 % de PSS y diferentes concentraciones de nanopartículas de oro con avidina injertada. Se evaluaron las interacciones no específicas con ASB no biotiniladas (filas inferiores en la Figura 6A). En la Figura 6B, la densitometría muestra que, aunque los 3 tipos de papel generan señales colorimétricas similares en sustratos biotinilados, los papeles de Whatman 6 y 1 dan lugar a más interacciones no específicas que en el papel de Whatman 41. Esto se atribuye a la mayor área específica de los tipos de papel 6 y 1 debido a su tamaño de poro más pequeño (de 11 y 3 ^m, respectivamente), el cual favorece las interacciones no específicas entre las nanopartículas y el sustrato receptor. En la Figura 6C, la intensidad de píxel de la señal colorimétrica se distribuye uniformemente (sin formación de anillos) cuando la concentración de nanopartículas en el reservorio es de 140 nM o más en papel de Whatman 41. Estos resultados, junto a los obtenidos en la Figura 4, indican que los reservorios basados en papel y que contienen un 30 % de PSS y 140 nM de sondas de nanopartículas son los mejores candidatos para la generación uniforme y muy intensa de señales plasmónicas en biosensores.
Además de ser capaces de transferir nanopartículas modificadas con biomoléculas, los reservorios que contienen nanosondas biomoleculares deberían ser capaces de almacenarlas en condiciones de sequedad durante largos periodos de tiempo. Esto es especialmente importante de cara a la incorporación de los reservorios en biosensores destinados a aplicaciones en campo, ya que no siempre es posible almacenarlos en condiciones ideales (baja temperatura, condiciones de sequedad). Para evaluar la vida útil de los reservorios que se proponen, se almacenaron durante un mes sustratos de papel modificados con 30 % de PSS y 140 nM de nanopartículas de oro modificadas con avidina. Se guardaron los reservorios en un sobre a temperatura ambiente. Con el objetivo de preservar las sondas, no se añadieron conservantes ni se tomaron medidas adicionales, tales como liofilización o almacenamiento con gel de sílica. Posteriormente, se experimentó tanto con ASB biotinilada como sin biotinilar para evaluar la habilidad de las nanopartículas de establecer interacciones bioespecíficas tras haber sido almacenadas en los reservorios de papel durante distintos periodos de tiempo. La Figura 7 muestra el % de la señal colorimétrica que queda comparada con reservorios que se usaron a una hora de su fabricación. En esta figura, la señal nunca baja del 85 % del original, lo cual demuestra que el método propuesto es de gran utilidad para la fabricación de biosensores con una larga vida útil sin la necesidad de imponer unas condiciones de almacenamiento sujetas a niveles de temperatura o humedad precisos.
Finalmente, se ha demostrado que los reservorios que contienen nanopartículas modificadas con anticuerpos podrían usarse para detectar específicamente antígenos inmovilizados en sustratos de papel con diferentes concentraciones. Para ello, se modificó el sustrato de papel receptor con una gota de E. coli o bien de glucoproteína B y se dejó secar. Tras bloquear y añadir PBST, se colocaron los reservorios encima y se presionaron contra los sustratos receptores durante 5 min. Tras retirar y lavar el reservorio, se calculó el aumento de la intensidad de píxel. En la Figura 8, las curvas de calibrado muestran que la señal colorimétrica aumenta al crecer la concentración de antígenos, lo cual demuestra que los reservorios de esta propuesta se pueden utilizar para almacenar y liberar nanopartículas modificadas con anticuerpos, y que los anticuerpos retienen sus funciones de bioreconocimiento tras haber sido almacenados en el reservorio.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la obtención de un reservorio que comprende de nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel, el cual comprende los pasos siguientes:
i. tratamiento del sustrato de papel con polímero hidrofílico cargado negativamente sobre el sustrato de papel; y
¡i. aplicación de nanopartículas decoradas con proteína sobre el sustrato de papel modificado con PSS obtenido en el paso (i).
2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el polímero es poliestireno sulfonato (PSS).
3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que la proteína es una proteína capaz de establecer relaciones entre ligando y receptor.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que la proteína es avidina o un anticuerpo.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que la proteína es avidina.
6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que las nanopartículas son nanopartículas modificadas con PEG.
7. El procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que las nanopartículas modificadas con PEG son nanopartículas de oro modificadas con PEG.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado por que el tratamiento del paso (i) se realiza depositando una gota de polímero sobre partes del sustrato de papel.
9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado por que los trozos del sustrato de papel del paso (i) se cortan en forma de cuadrados.
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado por que el volumen del polímero añadido es lo suficientemente grande como para formar un volumen de papel con polímero modificado más grande que el volumen que ocuparán las nanopartículas.
11. El procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por que el volumen del polímero añadido es de 50 pL y la cantidad de nanopartículas modificadas con PEG es de 1 pL.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que además comprende el paso (iii) de dejar secar el papel tras el paso (ii).
13. El procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado por que el paso (iii) de dejar secar el papel se realiza a una temperatura de 15°Ca250C.
14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que además comprende el paso (iv) de liberación de las nanopartículas del reservorio.
15. El procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por que el paso de liberación (iv) es un paso de transferencia a un sustrato de papel receptor.
16. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-15, caracterizado por que el paso de liberación (iv) es un paso de transferencia a un sustrato de papel receptor húmedo.
17. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se lleva a cabo mediante presión.
18. El procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se lleva a cabo mediante presión con un dedo, una prensa o una abrazadera.
19. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, caracterizado por que el paso de transferencia (iv) se ajusta mediante el afinamiento del contenido de PSS y de la concentración de nanopartículas.
20. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado por que el sustrato de papel receptor del paso (iv) ha sido modificado con un ligando biológico que interacciona específicamente con una proteína receptora unida a las nanopartículas.
21. Un reservorio que comprende de nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel obtenido mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-20.
22. Uso del reservorio de nanopartículas decoradas con proteína según la reivindicación 21 en la preparación de biosensores fabricados íntegramente de papel.
ES201930784A 2019-09-09 2019-09-09 Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel Active ES2811198B2 (es)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201930784A ES2811198B2 (es) 2019-09-09 2019-09-09 Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel
CA3144417A CA3144417A1 (en) 2019-09-09 2020-09-08 Process for storing and releasing protein-decorated nanoparticles on paper substrates
US17/641,400 US20220299504A1 (en) 2019-09-09 2020-09-08 Process for storing and releasing protein-decorated nanoparticles on paper substrates
EP20768572.8A EP4028764A1 (en) 2019-09-09 2020-09-08 Process for storing and releasing protein-decorated nanoparticles on paper substrates
JP2022507629A JP2022547397A (ja) 2019-09-09 2020-09-08 紙基材上でタンパク質装飾ナノ粒子を貯蔵及び放出する方法
AU2020344799A AU2020344799A1 (en) 2019-09-09 2020-09-08 Process for storing and releasing protein-decorated nanoparticles on paper substrates
PCT/EP2020/075013 WO2021048087A1 (en) 2019-09-09 2020-09-08 Process for storing and releasing protein-decorated nanoparticles on paper substrates
KR1020227004939A KR20220058533A (ko) 2019-09-09 2020-09-08 페이퍼 기판에 단백질-장식된 나노입자를 저장 및 방출하는 방법
CN202080062863.5A CN114340794A (zh) 2019-09-09 2020-09-08 在纸基材上储存和释放蛋白质修饰的纳米粒子的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201930784A ES2811198B2 (es) 2019-09-09 2019-09-09 Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2811198A1 ES2811198A1 (es) 2021-03-10
ES2811198B2 true ES2811198B2 (es) 2021-09-15

Family

ID=72432905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES201930784A Active ES2811198B2 (es) 2019-09-09 2019-09-09 Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220299504A1 (es)
EP (1) EP4028764A1 (es)
JP (1) JP2022547397A (es)
KR (1) KR20220058533A (es)
CN (1) CN114340794A (es)
AU (1) AU2020344799A1 (es)
CA (1) CA3144417A1 (es)
ES (1) ES2811198B2 (es)
WO (1) WO2021048087A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113447470B (zh) * 2021-06-28 2022-10-21 电子科技大学 一种表面增强拉曼散射基底、检测芯片及制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007353319A1 (en) * 2006-11-15 2008-11-20 Invitrogen Dynal As Methods for reversibly binding a biotin compound to a support
WO2013158827A1 (en) * 2012-04-18 2013-10-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the detection and quantification of analytes using three-dimensional paper-based devices
WO2013185167A1 (en) * 2012-06-13 2013-12-19 Monash University Metallic nanoparticle treated cellulosic substrate as a sers biodiagnostic platform
CN103995031A (zh) * 2014-06-10 2014-08-20 江南大学 一种植物病毒纸质检测传感器的制备方法及检测方法
WO2016127039A2 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High-resolution optical molecular imaging systems, compositions, and methods
US11602746B2 (en) * 2015-04-21 2023-03-14 Texas Tech University System Chemically patterned microfluidic paper-based analytical device (C-μPAD) for multiplex analyte detection
KR102347989B1 (ko) * 2017-04-14 2022-01-10 삼성디스플레이 주식회사 전자 장치
CN108755243B (zh) * 2018-05-31 2020-07-28 西安交通大学 一种多物理场刺激下的纸基折叠促动器的制备方法
CN108978349A (zh) * 2018-09-27 2018-12-11 佛山九陌科技信息咨询有限公司 一种抗紫外线离型纸及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3144417A1 (en) 2021-03-18
US20220299504A1 (en) 2022-09-22
WO2021048087A1 (en) 2021-03-18
ES2811198A1 (es) 2021-03-10
KR20220058533A (ko) 2022-05-09
EP4028764A1 (en) 2022-07-20
CN114340794A (zh) 2022-04-12
JP2022547397A (ja) 2022-11-14
AU2020344799A1 (en) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. An overview for the nanoparticles‐based quantitative lateral flow assay
JP6379149B2 (ja) 被覆ナノ粒子を使用した高感度免疫学的検定
Kurdekar et al. Comparative performance evaluation of carbon dot-based paper immunoassay on Whatman filter paper and nitrocellulose paper in the detection of HIV infection
Zeng et al. A review on functionalized gold nanoparticles for biosensing applications
US11598771B2 (en) Self-referencing sensor for chemical detection
Knopp et al. Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles
Lee et al. Optical recognition of salivary proteins by use of molecularly imprinted poly (ethylene-co-vinyl alcohol)/quantum dot composite nanoparticles
US10048257B2 (en) Signal amplification microspheres, their use in one-step and multi-step analytical amplification procedures and methods for their production
US9322823B2 (en) Method and apparatus for chemical detection
US20210396747A1 (en) Ultrabright fluorescent nanoconstructs as universal enhancers
JP5960374B2 (ja) 金被覆銀ナノプレートの懸濁液
WO2013185167A1 (en) Metallic nanoparticle treated cellulosic substrate as a sers biodiagnostic platform
ES2811198B2 (es) Procedimiento para almacenar y liberar nanopartículas decoradas con proteína en sustratos de papel
Safarpour et al. A novel enhanced dot blot immunoassay using colorimetric biosensor for detection of Toxoplasma gondii infection
Mahmoudi et al. (Nano) tag–antibody conjugates in rapid tests
Singh Nanosensor Platforms for Detection of Milk Adulterants
JPWO2019171906A1 (ja) 支持体に固定化された複合物を備えたデバイス、およびバイオセンサ
Li et al. Low-fouling and highly sensitive fluorescence immunoassay of protein in serum based on the antifouling magnetic beads
Fan et al. One-Component Dual-Readout Aggregation-Induced Emission Nanobeads for Qualitative and Quantitative Detection of C-Reactive Protein at the Point of Care
Çoban et al. Role of Nanoparticular/Nanovesicular Systems as Biosensors
Goodrum et al. Gold-nanoparticle-embedded membrane (GEM) for highly sensitive multiplexed sandwich immunoassays
Zhao et al. Development of a Dual Fluorescence Signal-Enhancement Immunosensor Based on Substrate Modification for Simultaneous Detection of Interleukin-6 and Procalcitonin
Abdelmonem Nanoparticles: Synthesis, Surface Modification and Functionalization for Biological and Environmental Applications

Legal Events

Date Code Title Description
BA2A Patent application published

Ref document number: 2811198

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: A1

Effective date: 20210310

FG2A Definitive protection

Ref document number: 2811198

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: B2

Effective date: 20210915