ES2802748T3 - Vacuna para la protección frente a Lawsonia intracellularis - Google Patents

Abstract

Una composición no viva que contiene un carbohidrato, encontrándose también el carbohidrato en las células vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con la membrana celular externa de estas células, para su uso como una vacuna para la protección frente a una infección por Lawsonia intracellularis, mediante la administración sistémica de la vacuna, en donde la vacuna comprende un adyuvante.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna para la protección frente a Lawsonia intracellularis

La presente invención se refiere a una vacuna para la protección frente a una infección por Lawsonia intracellularis, siendo una vacuna, en este sentido, una composición que proporciona al menos una disminución en una influencia negativa de la infección por Lawsonia intracellularis, siendo dicha influencia negativa, por ejemplo, daños en un tejido y/o signos clínicos tales como una disminución en la ganancia de peso, diarrea, etc.

La enteropatía proliferativa (denominada también enteritis o ileítis) en muchos animales, en particular en los cerdos, se presenta con un signo clínico y un síndrome patológico con hiperplasia mucosal de las células epiteliales de la cripta inmaduras en el íleo terminal. Otras zonas del intestino que pueden verse afectadas incluyen el yeyuno, el ciego y el colon. Los lechones y los cerdos adultos jóvenes se ven principalmente afectados con una manifestación clínica típica de una rápida pérdida de peso y una deshidratación. La enfermedad clínica natural en los cerdos se produce en todo el mundo. La enfermedad está asociada coherentemente con la presencia de una bacteria curvada intracelular, conocida actualmente como Lawsonia intracellularis.

En general, la vacunación oral frente a Lawsonia intracellularis ha demostrado ser una medida económicamente eficaz para el control de la ileítis y para permitir una mayor explotación del potencial de crecimiento genético del cerdo (Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3.0, julio de 2006; disponible en Boehringer Ingelheim). Adicionalmente, la vacunación oral en lugar de la parenteral reducirá la transmisión de infecciones hematológicas tales como el PRRS a través de agujas multiuso y la reducción de las reacciones en el sitio de inyección y de agujas retenidas en cadáveres. Reducirá el estrés animal y humano, el tiempo, el coste y el esfuerzo en comparación con la vacunación individual (McOrist: "Ileitis - One Pathogen, Several Diseases" en el IPVS Ileitis Symposium en Hamburgo, 28 de junio de 2004).

Generalmente se entiende que la ventaja de una metodología con una vacuna de bacterias vivas atenuadas es que la eficacia de la inmunidad es habitualmente relativamente buena, ya que el sistema inmunitario del hospedador es expuesto a todas las propiedades antigénicas del organismo de una forma más "natural". Específicamente, para agentes bacterianos intracelulares tales como Lawsonia intracellularis, se cree que la metodología con una vacuna de bacterias vivas atenuadas ofrece la mejor protección disponible para los animales vacunados, debido a una respuesta inmunitaria basada en los linfocitos T completa y apropiada. Esto contrasta con la entre variable y mala inmunidad asociada con los tipos de vacuna de subunidad o de bacterias inactivas para bacterias intracelulares. Esto es también específicamente cierto para bacterias intracelulares obligadas tales como Lawsonia intracellularis o las especies de Chlamydia, que causan infecciones patógenas en la mucosa. Algunos estudios indican que las formas vivas completas atenuadas de la bacteria intracelular en cuestión se administran mejor en la mucosa objetivo, que son necesarias en forma de bacterias vivas completas para producir una respuesta inmunitaria totalmente protectora en la mucosa objetivo, pero también que son inmunológicamente superiores en comparación con el uso de componentes bacterianos parciales.

Se ha transformado en un entendimiento general que una vacuna contra Lawsonia intracellularis debe ser administrada por vía oral (véase, entre otros, el Technical Manual 3.0 mencionado anteriormente). Esto se basa en el hecho de que la base de la resistencia del cuerpo a una ileítis es la inmunidad local en el intestino, que es el producto de la inmunidad celular y de la defensa local a través de anticuerpos, especialmente de la IgA. Según el conocimiento actual, los anticuerpos séricos (IgG) no proporcionan ninguna protección, simplemente porque no alcanzan la luz intestinal. Algunos estudios han demostrado que la vacunación oral produce una inmunidad celular, así como la producción local de IgA en el intestino (Murtaugh, en Agrar- und Veterinar-Akademie, Nutztierpraxis Aktuell, Ausgabe 9, de junio de 2004; y Hyland et al. en Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338). Por el contrario, la administración intramuscular no dio lugar a una protección. Además, junto al entendimiento general de que una vacuna con éxito contra una bacteria intracelular debe inducir una inmunidad celular, así como la producción de anticuerpos locales, el profesional experto sabe que únicamente un porcentaje muy bajo de los antígenos digeridos por vía oral son realmente absorbidos por los enterocitos, y que la incorporación de Lawsonia intracellularis en la célula es un proceso activo iniciado por la bacteria. Consecuentemente, una vacuna de bacterias inactivadas proporcionaría al intestino un antígeno inmunógeno insuficiente (Haesebrouck et al. en Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268). Esta es la razón por la cual se cree que únicamente las vacunas con bacterias vivas atenuadas inducen una protección celular suficiente en las células intestinales (véase el Technical Manual 3.0 mencionado anteriormente). Actualmente solo hay una vacuna en el mercado para proteger frente a Lawsonia intracellularis, a saber, Enterisol ® Ileitis, comercializada por Boehringer Ingelheim. Esta vacuna es, de hecho, una vacuna de bacterias vivas para su administración oral.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar una vacuna alternativa para proteger frente a una infección por Lawsonia intracellularis. A tal fin se ha contemplado el uso de una composición que contiene un carbohidrato inactivado, encontrándose también el carbohidrato en las células vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con la membrana celular externa de estas células, para la elaboración de una vacuna para la protección frente a una infección por Lawsonia intracellularis, estando la vacuna en una forma adecuada para su administración sistémica y comprendiendo un adyuvante. Sorprendentemente, frente al persistente entendimiento general sobre cómo combatir Lawsonia intracellularis, se averiguó que mediante el uso de una composición inactivada que contiene un carbohidrato, por ejemplo extraído de la membrana celular externa de Lawsonia intracellularis, como antígeno en una vacuna, se puede inducir una protección frente a Lawsonia intracellularis que es comparable o incluso está mejorada con respecto a la protección proporcionada mediante el uso de la vacuna con bacterias Enterisol ® Ileitis (administrada según las correspondientes instrucciones), cuando el antígeno es administrado sistémicamente, es decir, de una forma tal que alcanza el sistema circulatorio del cuerpo (que comprende el sistema cardiovascular y el linfático), afectando por lo tanto al cuerpo como un todo en lugar de a un lugar específico tal como el tracto gastrointestinal. La administración sistémica puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la administración de los antígenos en el tejido muscular (intramuscular), en la dermis (intradérmica), por debajo de la piel (subcutánea), por debajo de la mucosa (submucosa), en las venas (intravenosa) etc. Aparte de la muy buena protección obtenible, una importante ventaja de la presente vacuna atenuada es que es inherentemente segura cuando se compara con una vacuna de bacterias vivas.

En general, la composición que contiene el carbohidrato puede usarse para la elaboración de una vacuna mediante el uso de métodos conocidos en la técnica que comprenden básicamente la mezcla de la composición que contiene el carbohidrato antigénico (o una composición derivada de la misma, tal como una dilución o un concentrado de la composición original, o un extracto, uno o más componentes purificados, etc.) con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un portador líquido (opcionalmente tamponado) tal como agua o un portador sólido tal como los usados habitualmente para obtener vacunas liofilizadas. Como tal, la elaboración puede tener lugar en un entorno industrial, pero también podrían mezclarse los antígenos con los demás constituyentes de la vacuna in situ (es decir, en una consulta veterinaria, en una granja, etc.), por ejemplo (inmediatamente) antes de la administración real a un animal. En la vacuna, los antígenos podrían estar presentes en una cantidad inmunológicamente eficaz, es decir, en una cantidad capaz de estimular el sistema inmunitario del animal objetivo lo suficiente como para reducir al menos los efectos negativos de la exposición posterior a la vacunación con microorganismos naturales. Opcionalmente pueden añadirse otras sustancias tales como estabilizantes, modificadores de la viscosidad u otros componentes, dependiendo del uso previsto o de las propiedades requeridas de la vacuna. Para una vacunación sistémica son adecuadas muchas formas, en particular las formulaciones líquidas (con los antígenos disueltos, emulsionados o suspendidos), pero también las formulaciones sólidas tales como implantes, o una forma intermedia tal como en forma de un portador sólido para el antígeno suspendido en un líquido. La vacunación sistémica, en particular la vacunación parenteral (es decir, la que no es a través del canal alimentario), y las formas (físicas) adecuadas de las vacunas para la vacunación sistémica se conocen desde hace más de 200 años.

Se aprecia que las subunidades de las células de Lawsonia intracellularis han sido determinadas como antígenos en una vacuna para la protección frente a esta bacteria. Sin embargo, éstas son principalmente proteínas recombinantes, y hasta el momento ninguna de ellas ha demostrado ser capaz de proporcionar una buena protección. Las bacterias inactivadas (que contienen inherentemente el carbohidrato que también se encuentra en las células vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con la membrana celular externa) también se han sugerido como antígenos en vacunas contra Lawsonia intracellularis, pero ninguna vacuna basada en células completa inactivadas ha sido realmente ensayada y determinada como que proporciona una buena protección. Aparte de esto, la administración sistémica no se ha usado junto con estas bacterias inactivadas, debido al entendimiento general de que no hay ninguna expectativa razonable de éxito para la administración sistémica de antígenos para combatir localmente (es decir, en el intestino) Lawsonia intracellularis.

A este respecto, se aprecia que en el documento WO 97/20050 (Daratech PTY Ltd) se menciona el uso de bacterias inactivadas de Lawsonia intracellularis para inmunizar cerdos. Sin embargo, no se menciona la administración sistémica. Tomando como base el conocimiento actual de que la vacunación solo es eficaz tras una administración oral, habitualmente se entiende que la vía oral era la vía de administración elegida para los experimentos descritos en la solicitud de Daratech. Otra solicitud de patente que menciona bacterias inactivadas es el documento WO 2005/011731 (Boehringer Ingelheim). Sin embargo, realmente solo se divulga el uso de una vacuna de bacterias vivas administrada por vía oral. No se muestra que una vacuna de bacterias inactivadas pueda ser eficaz, y mucho menos que la vacuna de bacterias inactivadas pueda ser administrada sistémicamente. El documento EP 843 818 (Boehringer Ingelheim) describe la administración intramuscular de una vacuna de bacterias inactivadas (párrafo [0115] junto con el párrafo [0119]). En el párrafo [0115] se establece que las bacterias fueron destruidas mediante su almacenamiento a 4 °C a unas condiciones atmosféricas normales. Sin embargo, como es bien sabido, en dichas condiciones, la bacteria Lawsonia intracellularis sobrevive. Por lo tanto, este documento no enseña el asunto en cuestión de la presente invención. También se indica que una composición que contiene el carbohidrato, en la que el carbohidrato también se encuentra en las células vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con la membrana celular externa de estas células, se conoce a partir de Kroll et al. (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, junio de 2005, 693-699). Sin embargo, esta composición se usa para diagnóstico. No se ha ensayado como antígeno protector por las razones establecidas anteriormente.

En una realización, la composición que contiene el carbohidrato es el material resultante de la destrucción de las bacterias de Lawsonia intracellularis. Se ha averiguado que una forma muy conveniente de proporcionar el carbohidrato para su uso según la presente invención es simplemente inactivar las células de Lawsonia intracellularis y usar el material resultante como fuente del carbohidrato. En teoría, también se podría extraer el carbohidrato de células vivas (de forma análoga a la creación de células vacías vivas mediante la eliminación de la pared celular), pero requiere técnicas más sofisticadas y, por lo tanto, más caras. Podría usarse el material como un todo, por ejemplo, una suspensión de células completas o un lisado de células de Lawsonia intracellularis, o se podría purificar o incluso aislar el carbohidrato del material. Este método podría llevarse a cabo usando unas técnicas relativamente simples conocidas en la técnica.

En una realización preferente, la composición que contiene el carbohidrato contiene células completas de bacterias inactivadas de Lawsonia intracellularis. Se ha demostrado que ésta es la forma más conveniente de proporcionar el carbohidrato en forma de un antígeno en la vacuna. Por lo demás, la eficacia de la vacuna está incluso adicionalmente aumentada, posiblemente porque esta forma de ofrecer el antígeno al sistema inmunitario del animal objetivo simula mejor el entorno natural del carbohidrato.

En una realización, la vacuna comprende un adyuvante de aceite en agua que contiene gotitas de aceite de un tamaño submicrométrico. En general, un adyuvante es un agente inmunoestimulante no especifico. En principio, cualquier sustancia que es capaz de favorecer o amplificar un proceso en particular en la cascada de acontecimientos inmunológicos, dando finalmente como resultado una mejor respuesta inmunológica (es decir, la respuesta corporal integrada frente a un antígeno, en particular la mediada por linfocitos, y que normalmente implica el reconocimiento de los antígenos por parte de anticuerpos específicos o por linfocitos previamente sensibilizados), puede ser definida como un adyuvante. Se ha demostrado que el uso de un adyuvante de aceite en agua que contiene gotitas de aceite de un tamaño submicrométrico proporciona una protección muy buena frente a Lawsonia intracellularis. De hecho, la aplicación de adyuvantes de aceite en agua como tales es habitual en relación con los antígenos inactivados. Sin embargo, generalmente es sabido que las mejores propiedades inmunoestimulantes se obtienen cuando las gotitas de aceite tienen un diámetro grande. En particular, las gotitas de aceite con un diámetro por debajo de 1 micrómetro se usan en particular cuando se cree que la seguridad es un asunto importante. En ese caso, se podrían usar pequeñas gotitas, dado que se sabe que estas provocan menos daños en los tejidos, signos clínicos, etc. Sin embargo, en el caso de obtener protección para un trastorno relacionado con el intestino a través de una vacunación sistémica (como es el caso en la presente invención), se elegirían gotitas grandes, dado que se esperaría que la respuesta inmunitaria tiene que ser desencadenada de una forma significativa. Por el contrario, averiguamos que usando pequeñas gotitas de aceite en la composición se proporcionaban unos resultados muy buenos con respecto a la protección frente a Lawsonia intracellularis.

En una realización más preferida, el ayudante comprende gotitas de un aceite biodegradable y gotitas de un aceite mineral, teniendo las gotitas del aceite biodegradable un tamaño medio que difiere del tamaño medio de las gotitas del aceite mineral. Se ha demostrado que el uso de una mezcla de aceite biodegradable y aceite mineral proporciona unos resultados muy buenos en relación con la eficacia y la seguridad. Además de esto, la estabilidad de la composición es muy alta, lo que es una importante ventaja económica. Se ha demostrado que la estabilidad es muy buena, en particular cuando el tamaño medio (ponderado en volumen) de cualquiera de las gotitas del aceite biodegradable o de las gotitas del mineral está por debajo de 500 nm (preferentemente alrededor de 400 nm).

En una realización, la vacuna comprende adicionalmente antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae y de circovirus porcino. Hasta la fecha se han sugerido vacunas de combinación de Lawsonia intracellularis en la técnica anterior. Sin embargo, la eficacia de no muchas de estas combinaciones ha sido realmente ensayada. La razón de esto es que generalmente se entiende que la combinación de antígenos con antígenos de Lawsonia intracellularis solo puede dar lugar a una protección exitosa si los antígenos de Lawsonia se proporcionan en forma de células vivas (atenuadas). A este respecto, hacemos referencia al documento WO 2005/011731, que también sugiere todos los tipos de vacunas de combinación basados en Lawsonia intracellularis. Sin embargo, con respecto a la descripción y la estructura de las reivindicaciones de la solicitud de patente, el beneficiario (Boehringer Ingelheim) parece estar convencido de que solo puede esperarse que las vacunas de combinación tengan una probabilidad razonable de éxito cuando los antígenos de Lawsonia están presentes en forma de células vivas. Esto mismo es cierto para el documento WO2006/099561, concedido también a Boehringer Ingelheim. De hecho, basándose en el conocimiento habitual general, este pensamiento es obvio.

La invención se explicará adicionalmente usando los siguientes ejemplos.

El Ejemplo 1 describe un método para obtener una composición sustancialmente exenta de proteínas que contiene el carbohidrato y una vacuna que es elaborada mediante el uso de esta composición.

El Ejemplo 2 describe un experimento en el que se compara una segunda vacuna según la presente invención con la vacuna comercializada actualmente y una vacuna experimental que comprende proteínas de subunidad de Lawsonia intracellularis.

El Ejemplo 3 describe un experimento en el que se comparan dos vacunas diferentes según la presente invención con la vacuna comercializada actualmente.

El Ejemplo 4 describe un experimento en el que se establece el efecto de la dosis de una vacuna según la invención.

Ejemplo 1

En este ejemplo se describe un método para obtener una composición del carbohidrato sustancialmente exenta de proteínas asociadas con la membrana celular externa de las células de Lawsonia intracellularis y una vacuna que puede ser elaborada usando esta composición. En general, un carbohidrato es un compuesto orgánico que contiene carbono, hidrógeno y oxígeno, habitualmente en una proporción de 1:2:1. Algunos ejemplos de carbohidratos son azúcares (sacáridos), almidones, celulosas y gomas. Habitualmente sirven como fuente de energía principal en la dieta de los animales. Lawsonia intracellularis es una bacteria gramnegativa, que por lo tanto contiene una membrana externa que no está formada únicamente por fosfolípidos y proteínas, sino que también contiene carbohidratos, en particular polisacáridos (habitualmente polisacáridos tales como lipopolisacáridos, lipooligosacáridos, o incluso no lipopolisacáridos).

FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS PARA LA PREPARACIÓN DE LA VACUNA

Se recogieron veinte mililitros de agua tamponada (PBS 0,04 M, solución salina tamponada con fosfato) que contiene células de Lawsonia intracellularis a una concentración de 3,7E8 (= 3,7 x 108) células/ml. Las células fueron lisadas manteniéndolas a 100 °C durante 10 minutos. Se añadió proteinasa K (10 mg/ml) en PBS 0,04 M a una concentración final de 1,7 mg/ml. Esta mezcla se incubó a 60 °C durante 60 minutos con objeto de degradar todas las proteínas y mantener intactos los carbohidratos. Posteriormente, la mezcla se incubó a 100 °C durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. El material resultante, que es una composición que contiene el carbohidrato, en particular que contiene los carbohidratos según están presentes en las bacterias vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con su membrana celular externa (véase el siguiente párrafo), se almacenó a 2-8 °C hasta su posterior uso. La composición se formuló en adyuvante fuerte Diluvac. Este adyuvante (véase también el documento EP 0 382 271) comprende un 7,5 por ciento en peso de gotitas de acetato de vitamina E con un tamaño medio ponderado en volumen de aproximadamente 400 nm, se suspendió en agua y se estabilizó con un 0,5 por ciento en peso de Tween 80 (polioxietilén monooleato de sorbitano). Cada mililitro de vacuna contenía el material que había sido extraído a partir de 1,2E8 células de Lawsonia intracellularis.

INMUNOPRECIPITACIÓN DE LOS ANTÍGENOS DE CARBOHIDRATO DE LAWSONIA

Se precipitaron dos lotes de los anticuerpos monoclonales (AcMc) creados frente a las células completas de Lawsonia intracellularis con Na2SO4 saturado a la temperatura ambiente según los procedimientos habituales. El precipitado se sedimentó mediante una centrifugación (10.000 g durante 10 minutos). El sedimento se lavó con Na2SO4 al 20 % y se resuspendió en PBS 0,04 M. Se prelavaron microesferas de Dynal activadas con Tylosyl (DynaBeads, DK) con NaPO4 0,1 M (a pH 7,4), según el manual del fabricante. De cada lote de los AcMc, se tomaron 140 |jg y se añadieron a 2E8 microesferas prelavadas, y se incubaron durante una noche a 37 °C. Las microesferas se sedimentaron mediante una centrifugación, y los AcMc no unidos se eliminaron mediante la aspiración del sobrenadante. Las mediciones espectrofotométricas demostraron que entre un 20 y un 35 % de los AcMc añadidos se habían unido a las microesferas.

Se aplicaron ultrasonidos a dos lotes de 1 ml de células de Lawsonia intracellularis (3,7E8/ml) en PBS 0,04 M durante 1 minuto. Los lisados celulares resultantes se añadieron a los complejos de microesferas activadas con Tylosyl - monoclonal y se incubaron durante una noche a 4 °C. Los complejos de microesferas activadas con Tylosyl - monoclonal se lavaron tres veces con NaPO40,1 M (a pH 7,4). Los compuestos unidos fueron eluidos lavando las microesferas con 0,5 ml de urea 8 M en PBS 0,04 M (E1); 0,5 ml de Glicina 10 mM a pH 2,5 (E2); y 0,5 ml de HCl 50 mM (E3), de una forma secuencial. Después de la elución, E2 y E3 fueron neutralizados con 100 j l y con 200 j l de Tris/HCI 1 M (a pH 8,0).

Se tomaron muestras de cada etapa y se cargaron en geles de SDS-PAGE. Los geles se tiñeron usando azul brillante de Commassie (CBB) y una tinción con plata o se transfirieron. Los transferidos se desarrollaron usando los mismos AcMc mencionados anteriormente. La inspección de los geles y de los transferidos demostró que los AcMc reconocían las bandas con un peso molecular aparente de 21 y de 24 kDa que no se observaban en los geles de CBB, pero que eran visibles en los geles teñidos con plata. También se estableció que la fracción de las células que se unía a los AcMc era resistente a la proteinasa K. Por lo tanto, basándonos en estos resultados puede concluirse que esta fracción contiene carbohidratos (a saber: toda la proteína es lisada, y las facciones de ADN a las que se les aplicaron ultrasonidos no mostraron una banda tan clara en una tinción de plata), y que los carbohidratos están en asociación con (es decir, formando parte de, o unidos a) la membrana celular externa de Lawsonia intracellularis (a saber: los AcMc creados contra esta fracción también reconocieron las células completas de Lawsonia intracellularis). Dado el hecho de que Lawsonia intracellularis es una bacteria gramnegativa, se cree que la composición del carbohidrato comprende polisacárido(s).

Ejemplo 2

Este experimento se llevó a cabo para probar una forma conveniente de formular el antígeno de carbohidrato en una vacuna, a saber, a través de una célula completa inactivada (conocida también como bacterina). Como controles se usaron la vacuna disponible comercialmente Enterisol® ileítis y una vacuna de subunidad experimental que comprende subunidades de proteínas. A continuación de esto, se usaron animales no vacunados como control.

DISEÑO EXPERIMENTAL DEL EJEMPLO 2

Se elaboró una vacuna de células completas inactivadas como sigue. Se recogieron células vivas de Lawsonia intracellularis derivadas de intestinos de cerdos con PPE. Las células se inactivaron con BPL al 0,01 % (betapropiolactona). El material resultante, que inherentemente es una composición no viva que contiene el carbohidrato en el sentido de la presente invención (en particular, puesto que contiene los carbohidratos como están presentes en las bacterias vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con su membrana celular externa), se formuló en adyuvante fuerte Diluvac (véase el Ejemplo 1) a una concentración de aproximadamente 2,8 x 108 células por ml de vacuna.

La vacuna de subunidad contenía P1/2 y P4 recombinante como se sabe a partir del documento EP 1219711 (las proteínas de 19/21 y de 37 kDa, respectivamente), y las proteínas recombinantes expresadas por los genes 5074, 4320 y 5464 según se describe en el documento WO2005/070958. Las proteínas se formularon en adyuvante fuerte Diluvac. La vacuna contenía aproximadamente 50 pgramos de cada proteína por mililitro.

Se usaron cuarenta cerdos SPF de seis semanas de edad. Los cerdos fueron asignados a 4 grupos de diez cerdos cada uno. El grupo 1 fue vacunado una vez por vía oral (en T = 0) con 2 ml de "Enterisol ® ileítis" de bacterias vivas (Boehringer Ingelheim) según las instrucciones del fabricante. Los grupos 2 y 3 fueron vacunados dos veces por vía intramuscular (en T = 0 y en T = 4 semanas) con 2 ml de la vacuna de células completas inactivadas de Lawsonia y con la vacuna de combinación de subunidad recombinante según se ha descrito anteriormente, respectivamente. El grupo 4 se dejó como control sin vacunar. En T = 6 semanas todos los cerdos fueron expuestos por vía oral a un homogeneizado de mucosa infectado con Lawsonia intracellularis. Posteriormente todos los cerdos fueron observados diariamente para evaluar los signos clínicos de la enteropatía proliferativa porcina (PPE). A unos intervalos regulares antes y después de la exposición se recogieron muestras de suero sanguíneo (para la serología) y de heces (para la PCR) de los cerdos. En T = 9 semanas todos los cerdos fueron sacrificados y se les realizó una necropsia. Se recogieron muestras histológicas del íleo y se analizaron al microscopio.

El inóculo de exposición se preparó a partir de mucosa infectada: se mezclaron 500 gramos de mucosa infectada (raspada de intestinos infectados) con 500 ml de solución salina fisiológica. Esta mezcla se homogenizó en una omnimixer durante un minuto a máxima velocidad en hielo. Todos los cerdos fueron expuestos por vía oral a 20 ml del inóculo de exposición en T = 6 semanas.

En T = 0, 4, 6, 7, 8 y 9 semanas se tomó una muestra de heces (en cantidades de gramos) y una muestra de suero sanguíneo de cada cerdo, y se almacenó congelado hasta la prueba. Las muestras de heces se probaron en una prueba de PCR cuantitativa (Q-PCR) y se expresaron como el logaritmo de la cantidad encontrada en picogramos (pg). Las muestras de suero se probaron en la prueba de IFT aplicada habitualmente (prueba del anticuerpo inmunofluorescente para detectar anticuerpos contra células completas de Lawsonia intracellularis células en el suero). Para la puntuación histológica se tomó la pertinente muestra del íleo, se fijó con formalina tamponada al 4 %, se incluyó de forma rutinaria y se cortó en láminas. Estas láminas se tiñeron con Hematoxilina-Eosina (tinción con HE) y con una tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos monoclonales anti-Lawsonia intracellularis (tinción IHQ). Los portaobjetos se analizaron al microscopio. Las puntuaciones de histología son como sigue:

Tinción con HE:

no se detectaron anomalías puntuación = 0

lesión dudosa puntuación = A

lesiones leves puntuación = 1

lesiones moderadas puntuación = 2

lesiones graves puntuación = 3

Tinción IHQ:

no hay bacterias de L. intracelluaris evidentes puntuación = 0 dudosa presencia de bacterias puntuación = A presencia de bacterias individuales/bajas cantidades de bacterias en el portaobjetos puntuación = 1 presencia de una cantidad moderada de bacterias en el portaobjetos puntuación = 2 presencia de grandes cantidades de bacterias en el portaobjetos puntuación = 3 Todos los datos fueron registrados individuales de para cada cerdo. La puntuación por grupo se calculó como la media de los animales positivos para los diferentes parámetros después de la exposición. Se usó la prueba no paramétrica de la U de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística (prueba bilateral y nivel de significación establecido en 0,05).

RESULTADOS DEL EJEMPLO 2

Serología

Antes de la primera vacunación, todos los cerdos eran seronegativos cuando se probaron los títulos de anticuerpo en la IFT. Después de la vacunación con la bacterina de células completas (grupo 2), los cerdos desarrollaron unos elevados títulos de anticuerpos en la IFT, mientras que los controles y los cerdos vacunados con la vacuna de subunidad permanecieron negativos hasta la exposición (Tabla 1). Dos de los cerdos vacunados con Enterisol® (grupo 1) desarrollaron unos títulos moderados en la IFT, mientras que todos los demás cerdos de este grupo permanecieron seronegativos. Después de la exposición, todos los cerdos desarrollaron unos elevados títulos de anticuerpos en la IFT. Los resultados medios están representados en la tabla 1 (con la dilución usada, 1,0 era el nivel de detección del lado inferior).

Tabla 1. Títulos medios de anticuerpos en la IFT (2 log) en el suero de los cerdos después de la vacunación y la ex osición

PCR en tiempo real de las muestras de heces

Antes de la exposición todas las muestras de heces eran negativas. Después de la exposición se encontraron reacciones positivas en todos los grupos. El grupo 1 (p = 0,02), el grupo 2 (p = 0,01) y el grupo 3 (p = 0,03) tenían un nivel de liberación significativamente menor en comparación con el control. En la tabla 2 se proporciona un resumen posterior a la exposición.

Tabla 2.. Resultados medios de la PCR en muestras de heces lo des ués de la vacunación la ex osición

Puntuaciones de la histología

El grupo 2 tenía la menor puntuación de la histología de la HE (p = 0,05), puntuación de la IHQ (p = 0,08) y puntuación de la histología total (p = 0,08). Los demás grupos tenían unas puntuaciones mayores y no eran significativamente diferentes del grupo de control. Véase la tabla 3.

Tabla 3. Puntuación media de la histología para el íleo.

CONCLUSIONES CON RESPECTO AL EJEMPLO 2

A partir de los resultados puede concluirse que la administración sistémica de una vacuna de células completas no vivas de Lawsonia intracellularis que contiene inherentemente el carbohidrato según se encuentra también en asociación con la membrana externa de las células vivas de Lawsonia intracellularis, indujo al menos una protección parcial. Todos los parámetros estudiados y las puntuaciones de la histología eran significativamente o prácticamente significativamente mejores en comparación con los controles.

Ejemplo 3

Este experimento se llevó a cabo para probar una vacuna que comprende una composición que contiene el carbohidrato como antígeno. Una segunda vacuna que se va a probar contenía además células completas inactivadas de Lawsonia intracellularis, antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae y de circovirus porcino (la vacuna "combi"). Como control se usó la vacuna disponible comercialmente Enterisol® ileítis. Junto a esto, los animales no vacunados se usaron como segundo control.

DISEÑO EXPERIMENTAL DEL EJEMPLO 3

La vacuna basada en una composición que contiene el carbohidrato sustancialmente exenta de proteínas se obtuvo según se describe en el Ejemplo 1.

La vacuna combi experimental contenía células completas inactivadas de Lawsonia intracellularis como antígeno (véase el Ejemplo 2 para el método usado para proporcionar las bacterias inactivadas) en una cantidad de 1,7 x 108 células/ml. Junto a esto contenía antígeno del PCV-2 inactivado (20 pgramos de la proteína codificada por el ORF 2 del PCV 2 por ml; estando la proteína expresada en un sistema de expresión de baculovirus como es comúnmente conocido en la materia, por ejemplo, según se describe en el documento WO 2007/028823) y antígeno inactivado de Mycoplasma hyopneumoniae (el mismo antígeno a la misma dosis, como se sabe a partir de la vacuna disponible comercialmente Porcilis Mhyo®, obtenible en Intervet, Boxmeer, Holanda). Los antígenos se formularon en un adyuvante de emulsión doble "X". Este adyuvante es una mezcla de 5 partes en volumen del adyuvante "A" y 1 parte en volumen del adyuvante "B". El adyuvante "A" consiste en gotitas de aceite mineral con un tamaño medio aproximado (ponderado en volumen) de aproximadamente 1 pm, estabilizadas con Tween 80 en agua. El adyuvante "A" comprende un 25 % en peso del aceite mineral y un 1 % en peso de Tween. El resto es agua. El adyuvante "B" consiste en gotitas de acetato de vitamina E biodegradable con un tamaño medio aproximado (ponderado en volumen) de 400 nm, estabilizadas también con Tween 80. El adyuvante "B" comprende un 15 % en peso de acetato de vitamina E y un 6 % en peso de Tween 80. El resto es agua.

Se usaron sesenta y cuatro lechones SPF de 3 días de edad. Los cerdos fueron asignados a cuatro grupos de 14 lechones y un grupo de 8 lechones (Grupo 4). El grupo 1 fue vacunado por vía intramuscular a los 3 días de edad con 2 ml de la vacuna combi, seguido de una segunda vacunación a los 25 días de edad. El grupo 2 fue vacunado por vía intramuscular una vez con 2 ml de la vacuna combi a los 25 días de edad. El grupo 3 fue vacunado por vía oral con 2 ml de Enterisol® ileítis (Boehringer Ingelheim) a los 25 días de edad según las prescripciones. El grupo 4 fue vacunado por vía intramuscular a los 3 y a los 25 días de edad con 2 ml de la vacuna del carbohidrato sin proteínas. El grupo 5 se dejó sin vacunar como grupo de control de la exposición. A los 46 días de edad todos los cerdos fueron expuestos por vía oral a un homogeneizado de mucosa infectado. Posteriormente todos los cerdos fueron observados diariamente para evaluar los signos clínicos de la enteropatía proliferativa porcina (PPE). A unos intervalos regulares antes y después de la exposición se recogieron muestras de suero sanguíneo y muestras de heces de los cerdos para una serología y una PCR, respectivamente. A los 68 días de edad todos los cerdos fueron sacrificados y se les realizó un análisis postmortem. El íleo se analizó histológicamente.

Los demás aspectos del diseño experimental eran iguales a los descritos en el Ejemplo 2, salvo que se indique de otro modo.

RESULTADOS DEL EJEMPLO 3

Serología

Antes de la primera vacunación, todos los cerdos eran seronegativos para los títulos de anticuerpo en la IFT contra Lawsonia. Después de la vacunación con la vacuna combi (grupos 1 y 2) y con la vacuna del carbohidrato sin proteínas (grupo 4), muchos cerdos desarrollaron títulos de anticuerpo en la IFT, mientras que los controles y los cerdos vacunados con Enterisol permanecieron negativos hasta la exposición. Después de la exposición, todos los cerdos (excepto dos del grupo con Enterisol) desarrollaron unos títulos de anticuerpos en la IFT. Para un resumen de los valores medios obtenidos, véase la tabla 4 (debido a la mayor dilución cuando se comparaba con el ejemplo 2, el nivel de detección era de 4,0).

Tabla 4. Títulos medios de anticuerpo de la IFT contra Lawsonia (2 log) del suero de los cerdos después de la vacunación la ex osición

Con respecto a Mhyo, al comienzo del experimento, así como el día de la revacunación (con 25 días de edad), todos los cerdos eran seronegativos para Mhyo. Después de la revacunación, el grupo 1 desarrolló unos mayores títulos de anticuerpos contra Mhyo, comparables a los obtenidos con la vacuna disponible comercialmente.

Con respecto al PCV, a los 3 días de edad los lechones tenían unos elevados títulos de anticuerpos contra el PCV de derivación materna. El día de la revacunación (con 25 días de edad) los vacunados (grupo 1) tenían un título similar en comparación con el grupo 2 y con el grupo de control. El título del PCV a los 25 días de edad era ligeramente menor en comparación con el título a los 3 días de edad. Después de la vacunación a los 25 días de edad, los títulos del grupo 1 (2 vacunaciones el día 3 y 25) y del grupo 2 (una vacunación el día 25) permanecían a un elevado nivel, mientras que los lechones de control mostraban una disminución normal en los anticuerpos de derivación materna. Los títulos del PCV obtenidos son comparables a los títulos obtenibles con las vacunas disponibles comercialmente.

PCR en tiempo real de las muestras de heces

Tres semanas después de la exposición, los cerdos de los grupos 1, 2 y 4 tenían menos Lawsonia (ADN) en sus heces en comparación con los grupos 3 y 5. Únicamente las diferencias entre los grupos 1 y 3 (Enterisol) y los grupos 4 y 3 eran estadísticamente significativas (p < 0,05, prueba de la U de Mann-Whitney). Para los resultados medios, véase la tabla 5.

Tabla 5. Resultados medios de la PCR en las muestras de heces lo des ués de la vacunación y la exposición

Puntuaciones de la histología

Las puntuaciones de la histología de los grupos 1 y 4 eran significativamente menores en comparación con las de los grupos 3 y 5 (p < 0,05, prueba de la U de Mann-Whitney bilateral (véase la tabla 6). El número de cerdos con una PPE confirmada era de 2/13 en el grupo 1, de 6/12 en el grupo 2, de 12/14 en el grupo 3, de 2/7 en el grupo 4 y de 12/14 en el grupo de control 5. Los grupos 1 y 4 tenían una incidencia significativamente menor de la PPE en comparación con los grupos 3 y 5 (p < 0,05, prueba exacta de Fischer bilateral).

Tabla 6. Puntuación media de la histolo ía ara el íleo.

CONCLUSION DEL EJEMPLO 3

A partir de los resultados puede concluirse que la administración sistémica de la bacterina de células completas de Lawsonia combinada con antígeno de PCV y de Mhyo, así como la vacuna que comprende (sustancialmente exenta de proteínas) el carbohidrato, administrada a los 3 días de edad y a los 25 días de edad, inducen, ambas, una protección parcial frente a la infección experimental con Lawsonia intracellularis. Es particularmente sorprendente que la vacuna es eficaz cuando la primera administración tiene lugar antes del destete (menores de 21-25 días). Se aprecia que en los ejemplos 2 y 3, las vacunas, en lo que respecta a los antígenos de Lawsonia, contienen por ml material antigénico derivado de más de 1E8 células de Lawsonia intracellularis. Dado el hecho de que estas vacunas, a pesar de que se han usado unos adyuvantes leves (a saber, unos adyuvantes que contienen pequeñas gotitas y nada de, o poco, aceite mineral), confieren una buena protección frente a la ileítis, en particular cuando se comparan con la vacuna disponible comercialmente Enterisol® Ileitis, la dosis de los antígenos podría ser disminuida. Esto podría realizarse mediante la administración de menos vacuna (reducirse hasta, por ejemplo, 0,2 ml, adecuada para una aplicación, por ejemplo, intradérmica), o reduciendo el contenido antigénico de la vacuna. Tomando como base los análogos en la tecnología de vacunas, se cree que con una dosis antigénica (por vacunación) derivada de, o que contiene, 1 E7 células, en particular 2,5E7 células o mayor, pueden obtenerse unos resultados todavía comparables o incluso mejores que los obtenidos con la vacuna actual disponible comercialmente. Dado el hecho de que la vacuna de combinación proporcionaba unos títulos de anticuerpos de Mhyo y de PCV a un nivel comparable a los niveles obtenibles con las vacunas individuales disponibles comercialmente, se entiende que la vacuna de combinación también proporciona protección frente a Mycoplasma hyopneumoniae y al circovirus porcino.

Ejemplo 4

Este experimento se llevó a cabo para establecer el efecto de la dosis de una vacuna según la invención. También, en este experimento se usaron animales sin vacunar como control.

DISEÑO EXPERIMENTAL DEL EJEMPLO 4

Se elaboraron vacunas con células completas inactivadas según se indica en el ejemplo 2. El material antigénico se formuló en adyuvante fuerte Diluvac a una concentración de aproximadamente 2,0 x 108 células por ml vacuna, respectivamente 5,0 x 107 y 1,25 x 107 células por ml de vacuna. Se usaron sesenta lechones SPF de 3 días de edad. Los cerdos fueron asignados a cuatro grupos de 15 cerdos cada uno. Los lechones de los grupos 1,2 y 3 fueron vacunados por vía intramuscular (en el cuello) a los 3 días de edad y a los 25 días de edad con 2 ml de la vacuna cada vez. El grupo 4 se dejó como control sin vacunar. A los 46 días de edad todos los cerdos fueron expuestos por vía oral a bacterias de Lawsonia según se indica en el ejemplo 2. A los 67 días de edad todos los cerdos fueron sacrificados y analizados. Las pruebas se realizaron según se indica en el ejemplo 2. Junto a esto se realiza una PCR de muestras de mucosa. Para ello se tomó una muestra del íleo de cada animal, cuando fuera aplicable a partir de un área que mostraba engrasamiento.

RESULTADOS DEL EJEMPLO 4

Ganancia de peso

Desde los 14 días y en adelante aparecieron unas diferencias significativas en la ganancia de peso total entre los grupos. El grupo 1 mostraba una ganancia media en el peso total de aproximadamente 5350 gramos. En el grupo 2 esta era de 5150 gramos. El grupo 3 mostró una ganancia en el peso de aproximadamente 4250 gramos, mientras que el grupo 4 mostró una ganancia en el peso de 4550 gramos.

PCR en tiempo real de las muestras de heces

Tres semanas después de la exposición se encontraron reacciones positivas en todos los grupos. El grupo 1 y el grupo 2 tenían un nivel significativamente menor de liberación en comparación con el control. En la tabla 7 se proporciona un resumen posterior a la exposición del número de animales infectados (según se determinó mediante una PCR).

Tabla 7. Resultado de la PCR de las muestras de heces después de la vacunación y la exposición

PCR en tiempo real de las muestras de mucosa

Tres semanas después de la exposición se encontraron reacciones positivas en todos los grupos. El grupo 1 y Grupo 2 tenían un nivel significativamente menor de liberación en comparación con el control. En la tabla 8 se proporciona un resumen posterior a la exposición del número de animales infectados (según se determinó mediante una PCR).

Tabla 8. Resultado de la PCR de las muestras de mucosa des ués de la vacunación la exposición

Puntuaciones de la histología

La puntuación de la histología total y el número de animales que se confirmó que tenían PPE se muestran en la tabla 9.

Tabla 9. Puntuación de la histolo ía media ara el íleo.

CONCLUSIÓN DEL EJEMPLO 4

Al contrario de lo que se esperaba, los resultados indican que hay una disminución muy súbita en el efecto protector alrededor de la dosis más baja usada en estos experimentos. Aunque una dosis de material antigénico derivado de 2,5 x 107 células todavía proporcionaba un efecto protector comparable al de la vacuna disponible comercialmente, el hecho de la reducción entre una dosis que es únicamente 0,6 log mayor es tan significativo (apenas se observa ningún efecto en la ganancia de peso, el número de animales infectados y la PCR de la mucosa; sin embargo, todavía hay una disminución en el número de animales reconocidos con PPE), que proporcionó la percepción de que, en general, una menor dosis eficaz práctica del antígeno puede derivar en: una cantidad de antígenos menor que la obtenida a partir de, o que contiene, 1 x 107 células, que en la práctica, en las actuales circunstancias del mercado, no dará lugar a unos resultados económicamente relevantes. La razón de la existencia de este aparente valor de corte no está clara al 100%. Habitualmente se espera una disminución más gradual en la protección cuando se reduce la dosis. Podría ser que para combatir una infección local en la mucosa del intestino a través de una respuesta inmunitaria de derivación sistémica se requiere una cantidad mínima de antígenos.

Junto con lo anterior, el sorprendente efecto observado en el Ejemplo 3, a saber, que una vacuna basada en un antígeno de carbohidrato y administrada por vía sistémica es eficaz cuando la primera administración tiene lugar antes del destete (menores de 21-25 días), se confirma en este experimento con el uso de otro adyuvante. Por lo tanto, puede entenderse razonablemente que esta característica es genérica para todas las vacunas que comprenden un antígeno de carbohidrato.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición no viva que contiene un carbohidrato, encontrándose también el carbohidrato en las células vivas de Lawsonia intracellularis en asociación con la membrana celular externa de estas células, para su uso como una vacuna para la protección frente a una infección por Lawsonia intracellularis, mediante la administración sistémica de la vacuna, en donde la vacuna comprende un adyuvante.

2. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según la reivindicación 1, caracterizada por que la composición que contiene el carbohidrato es material resultante de la destrucción de bacterias Lawsonia intracellularis.

3. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según la reivindicación 2, caracterizada por que la composición que contiene el carbohidrato contiene células completas de bacterias Lawsonia intracellularis inactivadas.

4. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la vacuna comprende un adyuvante de aceite en agua que contiene gotitas de aceite de un tamaño submicrométrico.

5. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según la reivindicación 4, caracterizada por que el adyuvante comprende gotitas de aceite biodegradable y gotitas de aceite mineral, teniendo las gotitas de aceite biodegradable un tamaño medio que difiere del tamaño medio de las gotitas de aceite mineral.

6. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la vacuna comprende adicionalmente antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae y de circovirus porcino.

7. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la vacuna es para protección mediante administración sistémica solo una vez.

8. Una composición no viva que contiene un carbohidrato para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizada por que la cantidad de antígenos se obtiene de o contiene al menos 1x107 bacterias inactivadas.