ES2788975B2 - Composicion para envases bioactivos - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para envases bioactivos

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a una composición para envases bioactivos. Más particularmente, se refiere a una composición para envases bioactivos que comprende aceites esenciales, a su método de obtención, a films y otros formatos y a sus usos.

Antecedentes

Los aceites esenciales son excelentes agentes antimicrobianos. Se ha descrito que el aceite de canela presenta actividad antibacteriana contra mohos, levaduras, bacterias gram positivas y gram negativas. El cinamaldehído es uno de los principales componentes del aceite de canela y la efectividad de este aceite se basa principalmente en el potente efecto inhibidor de este compuesto. Por otro lado, la actividad antimicrobiana del aceite de clavo es atribuible principalmente al eugenol, pero otros compuestos como los lípidos y los ácidos oleicos que se encuentran en sus aceites esenciales también son responsables de su actividad antimicrobiana (Souza, A. C., Goto, G. E. O., Mainardi, J. A., Coelho, A. C. V., & Tadini, C. C. (2013). Cassava starch composite films incorporated with cinnamon essential oil: Antimicrobial activity, microstructure, mechanical and barrier properties. LWT-Food Science and Technology, 54(2), 346-352; Hosseini, M. H., Razavi, S. H., & Mousavi, M. A. (2009). Antimicrobial, physical and mechanical properties of chitosan-based films incorporated with thyme, clove and cinnamon essential oils. Journal o f foodprocessing andpreservation, 33(6), 727-743; Ooi, L. S., Li, Y., Kam, S. L., Wang, H., Wong, E. Y., & Ooi, V. E. (2006). Antimicrobial activities of cinnamon oil and cinnamaldehyde from the Chinese medicinal herb Cinnamomum cassia Blume. The American journal o f Chinese medicine, 34(03), 511-522). El aceite de clavo inhibe las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, así como la levadura (Goni, P., López, P., Sánchez, C., Gómez-Lus, R., Becerril, R., Nerín, C. (2009). Antimicrobial activity in the vapour phase of a combination of cinnamon and clove essential oils. Food chemistry, 116(4), 982-989; Matan, N., Rimkeeree, H., Mawson, A. J., Chompreeda, P., Haruthaithanasan, V., Parker, M. (2006). Antimicrobial activity of cinnamon and clove oils under modified atmosphere conditions. International journal of food microbiology, 107(2), 180-185).

También se han descrito propiedades antioxidantes y antibacterianas de la vainillina. Su propiedad antibacteriana se atribuye al grupo aldehído en su estructura que suprime el crecimiento de microorganismos. Varios factores pueden afectar la actividad antimicrobiana de la vainillina, como el momento de la exposición, la concentración y el organismo objetivo (Fitzgerald, D. J., Stratford, M., Gasson, M. J., Ueckert, J., Bos, A., Narbad, A. (2004). Mode of antimicrobial action of vanillin against Escherichia coli, Lactobacillus plantarum and Listeria innocua. Journal o f applied microbiology, 97(1), 104-113).

Sin embargo, es necesario solucionar cómo utilizar estas propiedades de los aceites esenciales para diseñar un envase o film antibacteriano con las propiedades de resistencia, durabilidad y color adecuados para su uso en el sector alimentario.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona composiciones, films y envases que incorporan aceites esenciales en combinación con otras sustancias de manera que sean adecuados para ser utilizados como envases bioactivos en el sector de la alimentación. Más en concreto, las composiciones de la invención permiten obtener films resistentes, duraderos y con el color adecuado para que sean agradables al consumidor.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende al menos dos polisacáridos, al menos un aceite esencial, y un agente plastificante,

donde el primer polisacárido es almidón y el segundo polisacárido se selecciona entre agar y carragenato.

En un segundo aspecto la invención se refiere a un film (o película), un recubrimiento (o coating) y un envase que comprende una composición como se ha definido en el primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto la invención se refiere a la composición del primer aspecto de la invención para su uso como antimicrobiano, y al uso de la composición como película de envasado de alimentos.

En otro aspecto la invención se dirige a un método para la obtención de las composiciones de la invención. En otro aspecto, la invención se dirige a un método para la obtención de películas (o films) mediante un proceso de casting a partir de las composiciones de la invención. En otro aspecto, la invención se dirige a la obtención de recubrimientos (o coatings) que comprende incorporar las composiciones de la invención a un material soporte.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra los componentes de los aceites de canela, clavo, romero y limón.

La figura 2 muestra fotografías de las placas en las que se testó la actividad antimicrobiana de las formulaciones de almidón_ agar y almidón_carragenato contra Bacillus cereus (A) Escherichia coli (B) y Staphylococcus aureus (C). canela 4% (a), clavo 4% (b), romero 4% (c) control (d).

La figura 3 muestra fotografías de las placas en las que se testó la actividad antimicrobiana de las formulaciones de almidón_ agar y almidón_carragenato contra Bacillus cereus (A) Escherichia coli (B) y Staphylococcus aureus (C). canela limón (a), canela vainillina (b), canela romero (c), control (d).

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende al menos dos polisacáridos, al menos un aceite esencial, y un agente plastificante,

donde el primer polisacárido es almidón y el segundo polisacárido se selecciona entre agar y carragenato.

En una realización particular, el aceite esencial se selecciona de entre canela, clavo, vainillina, romero, limón, y mezclas de los mismos.

Las composiciones de la invención son líquidas, y a su vez son útiles para la formación de films o de recubrimientos.

En una realización particular, el peso total de los polisacáridos en las composiciones de la invención está entre 20% y 40% en peso respecto al peso seco de la composición. Así, las composiciones de la invención son adecuadas para obtener films con un espesor adecuado de entre 50 y 80 micrómetros.

En una realización particular, la proporción de los polisacáridos en las composiciones de la invención es de entre 15/85 y 25/75 almidón / carragenato o agar. De este modo los films que se obtienen son películas resistentes y presentan superficies lisas. Cuando estas proporciones varían las superficies presentan arrugas y las películas son quebradizas.

En una realización particular, las composiciones de la invención comprenden el plastificante en una proporción de entre 35% y 55% (peso/peso seco del contenido total de polisacáridos). De este modo, las composiciones de la invención son más adecuadas para obtener films con buena flexibilidad y se evita que los films se agrieten durante el secado. En una realización particular, el plastificante es glicerol.

En una realización preferida, las composiciones de la invención comprenden el total de los polisacáridos en una proporción de entre 20% y 40% (peso/peso seco de la composición) y el plastificante en una proporción de entre 35% y 55% (peso/peso seco del contenido total de polisacáridos). Con esta combinación de características de las composiciones de la invención, se favorece la obtención de films con mejor resistencia y consistencia.

Además de la consistencia y de la resistencia de los films obtenidos empleando las composiciones de la invención, es relevante también el color de los mismos. En el caso de los envases activos la aceptación por parte de los consumidores es un aspecto esencial que se debe tener en cuenta a la hora de diseñar nueva formulación/material/envase. En este sentido el color es una característica importante/interesante de los materiales que debe tenerse en cuenta, con este objetivo se determinó el color en las formulaciones preparadas (ver ejemplo 2).

Así, en una realización particular, la invención se dirige a las composiciones de la invención que comprenden almidón:agar. Esta combinación de polímeros evita que los productos obtenidos a partir de las composiciones de la invención, como films, recubrimientos o envases, presenten color incluso cuando la composición comprende aceites esenciales e incluso cuando uno de esos aceites esenciales es vainillina.

En una realización particular, las composiciones de la invención pueden comprender además emulsificantes, conservantes, aromatizantes y plastificantes adicionales.

De entre los aceites esenciales testados los que mostraron más efectividad frente a las bacterias estudiadas fueron clavo y canela (ver ejemplo 4). En una realización particular la invención se dirige a las composiciones de la invención donde el aceite esencial se selecciona de entre clavo y canela.

Por otra parte, S. aureus y B. cereus fueron las bacterias más sensibles a las composiciones que incorporaban aceite de clavo o aceite de canela para todas las concentraciones estudiadas, mientras que la bacteria Gram negativa E. coli O157: H7 fue la más resistente (ver tablas 6a y 6b).

Además, se demostró que combinaciones de canela o clavo con otros aceites esenciales potencian la efectividad frente a todas las bacterias (ver tablas 7a y 7b). Las composiciones de la invención que incorporaban combinaciones de clavo y canela, clavo y vainillina, y canela y vainillina mostraron la mejor efectividad antimicrobiana contra los microorganismos probados. Pero más aún, las combinaciones de canela y vainillina, y clavo y vainillina tienen un efecto sinérgico, ya que las mismas composiciones incorporando únicamente vainillina no son efectivas frente a ninguna de las bacterias testadas, pero la combinación bien con canela o con clavo es más efectiva que con uno de esos aceites esenciales solo.

En una realización particular, el aceite esencial en las composiciones de la invención se selecciona de entre las siguientes mezclas: canela y vainillina, clavo y vainillina, y clavo y canela. La presencia de estos aceites esenciales y estas combinaciones de aceites hacen que las composiciones tengan un mayor efecto antibacteriano. En particular, tienen un mayor efecto antibacteriano frente a S. aureus, B. cereus y E. coli O157:H7.

En una realización preferida, los aceites esenciales en las composiciones de la invención se seleccionan de entre las mezclas de canela y vainillina, y clavo y vainillina.

En una realización particular, la invención se dirige a composiciones donde los polisacáridos son almidón y agar o almidón y carragenato, y el aceite esencial es una mezcla de canela y vainilla.

En una realización particular, los aceites esenciales o sus mezclas están en una proporción de entre 25% y 75% en peso respecto al peso de la composición en seco. En una realización preferida, los aceites esenciales o sus mezclas están en una proporción de entre 50% y 75% en peso respecto al peso de la composición en seco.

También se demostró que la incorporación de clavo a las composiciones de la invención favorecía que los productos resultantes, como el film, fuesen más insolubles lo que favorece que el efecto antimicrobiano permanezca más tiempo en la superficie donde se aplique dicho film. Así, en una realización aún más preferida las composiciones de la invención comprenden clavo.

En una realización particular, las composiciones de la invención se caracterizan por: una mezcla de polisacáridos de entre el 1,40% y el 2,75% total en peso respecto al peso de la composición, uno o más aceites esenciales de entre el 1,70% y el 5,10% total en peso respecto al peso de la composición, uno o más plastificantes de entre el 0,5% y el 1,3% total en peso respecto al peso de la composición, y agua hasta completar el 100% en peso de la composición.

La invención proporciona composiciones optimizadas que son adecuadas para la obtención de films o de recubrimientos con buenas propiedades de flexibilidad y resistencia, presentan un color adecuado para el uso por el consumidor, y elevada eficacia antibacteriana. Así en otro aspecto la invención se dirige al uso de las composiciones de la invención como película (o film) de envasado de alimentos o como conservante. En una realización particular, para el envasado de pan o pescado.

En otro aspecto la invención se dirige a un film (o película), recubrimiento (coating) o envase que comprende una composición de la invención. En una realización particular, el film tiene un espesor de entre 50 y 80 micrómetros.

En otro aspecto la invención se dirige a las composiciones de la invención, un film según la presente invención, un recubrimiento según la presente invención o envase según la presente invención, para su uso como antibacteriano. En una realización particular, como antibacteriano frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas. En una realización más particular, las bacterias son Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

En otro aspecto la invención se dirige a las composiciones de la invención, un film según la presente invención, un recubrimiento según la presente invención o envase según la presente invención, para su uso en la inhibición del crecimiento de patógenos alimentarios.

En otro aspecto, la invención se dirige a un método para la obtención de las composiciones de la invención que comprende: a) preparar disoluciones acuosas de al menos dos polisacáridos, donde el primer polisacárido es almidón y el segundo polisacárido se selecciona entre agar y carragenato, y mezclarlas, b) calentar la mezcla entre 60 y 90°C, c) añadir un agente plastificante y al menos un aceite esencial.

En una realización particular, la concentración de las disoluciones de polisacáridos que se preparan en la etapa a) es de entre 1,5% y 3% peso/peso de disolución. En otra realización particular, las disoluciones de polisacáridos se mezclan en la etapa a) en una proporción 20/80 almidón / carragenato o agar.

En una realización particular, el agente plastificante se añade en la etapa c) en una proporción del 40% en peso/ peso en seco del total de los polisacáridos.

En una realización particular, el aceite esencial se añade entre un 1% y un 5% en peso respecto al peso de la composición resultante de la etapa c). En una realización preferida, se añade entre el 3% y el 5% en peso respecto al peso de la composición resultante de la etapa c).

En otro aspecto, la invención se dirige a un método para la obtención de películas (o films) que comprende un proceso de casting a partir de las composiciones de la invención. Los procesos de casting son conocidos por el experto en la materia, y se describen ampliamente en la bibliografía como por ejemplo en Yam, K. L. (Ed.). (2010). The Wiley encyclopedia o f packaging technology. John Wiley & Sons., pg: 458.

En otro aspecto, la invención se dirige a la obtención de recubrimientos (o coatings) que comprende incorporar las composiciones de la invención a un material soporte. Los procesos para obtener recubrimientos a partir de composiciones son conocidos por el experto en la materia, y se describen ampliamente en la bibliografía como por ejemplo en Hong, S.I., & Krochta, J. M. (2004). Whey Protein Isolate Coating on LDPE Film as a Novel Oxygen Barrier in the Composite Structure. Packaging Technology and Science, 17, 13-21; o en Cha, D.S., & Chinnan, M. S. (2004). Biopolymer-Based Antimicrobial Packaging: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44, 223-237. En una realización particular, el material soporte es polietileno de baja densidad.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben de considerarse una limitación de la misma.

MATERIALES Y MÉTODOS

Evaluación del color de los films

El color de las películas biodegradables se determinó usando un colorímetro (Spectrophotometer CM-700d de KONICA MINOLTA).

Las medidas de color se analizaron en el espacio de color CIELAB, que está organizado con tres ejes en forma esférica: L*, a* y b*, donde L* representa la luminosidad, a* representa la posición entre rojo y verde, y b* representa la posición entre amarillo y azul.

Se analizó muestras de formulaciones de almidón: carragenato y almidón: agar solos sin la adición de aceites esenciales como control y formulaciones de almidón: carragenato y almidón: agar con canela vainillina (CIVA). Se registraron diez mediciones para cada muestra.

Las diferencias en el color AE se determinaron usando la siguiente ecuación.

Donde L es la luminosidad de las muestras a tiempo t; L*0 es la luminosidad de la muestra control al día 0; a* es el color rojo de la muestra a tiempo t; a*e es el color rojo de la muestra control a tiempo 0; b* es el color amarillo de la muestra a tiempo t; ¿?¿es el color amarillo de la muestra control al día 0.

Evaluación de la actividad antibacteriana

La actividad antibacteriana de las formulaciones de almidón carragenato y almidón-agar incorporadas con aceites esenciales se midió mediante el método de difusión de disco. Se usaron cepas gram positivas de Staphylococcus aureus (CECT 240), Bacillus cereus (CECT 148) y cepas gram negativas de Escherichia coli O157: H7 (CECT 5947) como agentes patógenos de prueba. Estos microorganismos se inocularon en caldo de soja tripticasa (TSB) y posteriormente se incubaron a 37 ° C ± 2 ° C durante 24 horas.

Los inóculos obtenidos se ajustaron a 1,5 x 108 ufc / ml (equivalente a 0,5 McFarland Standard). A partir de esta dilución, se tomaron 0,1 ml de solución para extender sobre el agar Mueller Hinton (MHA). A continuación, se colocaron varios discos de las películas con un diámetro de 12 mm sobre la superficie del agar y posteriormente se incubaron a 37 ° C ± 2 ° C durante 24 horas. Antes del ensayo antimicrobiano, las películas se cortaron en discos de 12 mm de diámetro utilizando un cortador estéril y se expusieron a radiación UV durante 5 minutos para la esterilización. Todos los ensayos microbiológicos se realizaron en una cabina microbiológica Telstar Bio IIA (Telstar Technologies, S.L. España).

El efecto inhibidor de las películas se determinó midiendo las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos. Los datos se expresaron como zonas de inhibición (mm), incluido el área del disco. Se realizaron dos repeticiones para cada muestra y se presentó el valor promedio. Se usó un disco de película sin ningún aceite esencial como control negativo.

Análisis por cromatografía de gases- espectrometría de masas (GC-MS) de aceites esenciales seleccionados

Los aceites de canela, clavo, romero y limón se deshidrataron con sulfato de sodio y luego se filtraron con filtros de PTFE de 0,22 p,m. Los aceites esenciales se disolvieron en metanol para obtener una concentración de 10 mg / ml y se almacenaron en viales oscuros sellados a 4 ° C hasta su análisis.

El análisis por GC-MS se realizó utilizando un cromatógrafo de gases Thermo Scientific Trace Serie 1300 con un detector de masas Trace ISQ LT y un inyector automático AI 1310. La separación se realizó en una columna ZB-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 p,m). Se usó helio como gas portador con un caudal de 1 ml/min y la temperatura de la entrada del inyector y la línea de transferencia del detector se ajustaron a 300 ° C. La detección se realizó en modo split (relación 1:20). La temperatura del horno se programó de la siguiente manera: 50 ° C por 6.00 min, luego 280 ° C a 10 ° C / min, con un tiempo de retención de 7 min. Los espectros de masas se obtuvieron utilizando un detector selectivo de masas bajo ionización por impacto de electrones a una tensión de 70 eV y la adquisición de datos se realizó en modo full scan en un intervalo m / z de 35-550.

Se usó el software Xcalibur 3.0.63 (Thermo Fisher Scientific Inc) para procesar las áreas de los picos. La identificación se llevó a cabo utilizando la biblioteca espectral de masas NIST / EPA / N1H 11 (versión 2.0) y la 8a edición de Wiley RegistryTM.

Solubilidad de las películas

Los discos de las películas biodegradables (1 x 3 cm2) se cortaron, se pesaron y se sumergieron en agua destilada a temperatura ambiente, y se agitaron lenta y periódicamente. Después de 1 hora, las películas se secaron durante 24 h a 60 ° C y sus porcentajes de solubilidad en agua (% SW) se calcularon usando la siguiente ecuación Eq. (1):

Donde Wo es el peso seco inicial y Wd es el peso seco final de las películas después del proceso de secado. Las pruebas% SW para cada formulación se realizaron por duplicado. Mediciones de espesor

El espesor de las muestras se determinó usando un micrómetro digital manual (Mitutoyo-Japón). Las mediciones se repitieron en 3 regiones diferentes de cada muestra.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los datos se realizó con el programa Statgraphics Centurion XVI versión 16.1.15 (StatPoint Technologies, Inc). Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) con la prueba de rango múltiple de Duncan para determinar cualquier diferencia significativa entre los tratamientos. Las diferencias se consideraron significativas cuando p< 0.05.

Ejemplo 1. Preparación de las formulaciones

Se prepararon dos soluciones formadoras de película usando almidón de arroz en combinación con carragenato y agar (almidón de arroz-carragenato y almidón de arroz-agar).

Se llevaron a cabo experimentos preliminares para determinar el porcentaje de polisacárido en las soluciones filmogénicas, y además para determinar la concentración apropiada de plastificante (glicerol).

Ejemplo 1.1. Formulación de Almidón: carragenato

Las soluciones formadoras de película se prepararon usando almidón de arroz en combinación con carragenato. Antes de mezclar, las soluciones de carragenato y de almidón se prepararon por separado.

La solución de carragenato (2% p/p) se preparó en agua destilada bajo agitación magnética durante 25 minutos a 80 ° C ± 2 ° C. Las formulaciones de almidón de arroz (2% p / p) se prepararon en agua destilada bajo agitación magnética durante 20 min a temperatura ambiente, y luego se calentaron a 85 ° C ± 2 ° C durante 30 minutos hasta la gelatinización. Después, se mezclaron las soluciones de almidón de arroz y carragenato en una proporción de 20:80, respectivamente, se añadió glicerol como plastificante a una concentración del 40% (p/ p base seca en base al peso de los polisacáridos) y la dispersión resultante se mezcló durante 5 minutos más.

Para preparar formulaciones con efecto antimicrobiano, los aceites esenciales de canela, clavo de olor, limón y romero se agregaron a las soluciones de película para alcanzar concentraciones finales de 2% y 4% (peso / peso total de la composición) (Tabla 1) y Tween 80 como emulsionante en cantidades proporcionales a los aceites esenciales (0.2 y 0.4 respectivamente). La homogeneización se llevó a cabo usando un ultra-turrax (IKA T25 digital) durante 5 minutos. Las burbujas de aire se eliminaron en baño de ultrasonido a 40°C.

En el caso de la vainillina, se incorporó a la suspensión de almidón de arroz-carragenato después de que la temperatura de la solución alcanzara 80°C. Las burbujas de aire se eliminaron también mediante sonicación.

En base a los resultados obtenidos con las formulaciones individuales, se desarrollaron varias combinaciones de acuerdo con la Tabla 1. Las formulaciones de almidón-carragenato sin aceites esenciales también se prepararon para una comparación posterior.

Las soluciones formadoras de película se moldearon en placa de Petri de polipropileno (90 mm) y luego se secaron durante 15 horas a 30 ° C y 53% ± 1 de humedad relativa (HR). Se usó una solución saturada de nitrato de magnesio hexahidratado (Mg (NO3) 2. 6H2O) para cumplir con la HR requerida. Las películas secas se pelaron de las superficies de la placa y se almacenaron dentro de desecadores a 25 ° C hasta su evaluación.

En el caso del empleo de la formulación como "coating" o recubrimiento la solución se aplicó sobre un film de polietileno de baja densidad (LDPE) y se dejó secar.

Ejemplo 1.2. Formulación de almidón: agar

Las soluciones de almidón de arroz se prepararon en combinación con agar. Las soluciones de agar y de almidón se prepararon por separado y luego se mezclaron.

Se preparó una solución de agar (2% p/p) en agua destilada bajo agitación magnética durante 20 minutos a 80 ° C ± 2. Se preparó una solución de almidón de arroz (2% p/p) en agua destilada bajo agitación magnética durante 20 min. a temperatura ambiente, y luego se calentó a 85 ° C ± 2 durante 30 minutos hasta la gelatinización.

Posteriormente, las soluciones de almidón de arroz y de agar se mezclaron en una proporción de 20:80 respectivamente se añadió glicerol como plastificante a una concentración del 40% (p/ p base seca en base al peso de los polisacáridos) y la dispersión resultante se mezcló durante 5 minutos más.

La adición de los aceites esenciales se llevó a cabo de la misma manera que en las formulaciones de almidón-carragenato siguiendo el diseño experimental descrito en la Tabla 1. Las soluciones formadoras de película se moldearon en placa de Petri de polipropileno (90 mm) y luego se secaron durante 15 horas a 30 ° C y 53% ± 1 de humedad relativa (HR). Se usó una solución saturada de nitrato de magnesio hexahidratado para cumplir con la HR requerida. Las películas secas se pelaron de las superficies de la placa y se almacenaron dentro de desecadores a 25 ° C hasta su evaluación.

Cuando la formulación se usó como "coating" o recubrimiento la solución se aplicó sobre un film de LDPE y se dejó secar.

Tabla 1 Concentración de aceites esenciales incorporados en las formulaciones de almidón: agar y almidón: carragenato

Ejemplo 1.3. Estudio de la concentración óptima de plastificante

En las dos formulaciones estudiadas, almidón-carragenato y almidón-agar se realizaron estudios preliminares para determinar la concentración apropiada de plastificante para la formulación de la película. Se probaron varias proporciones (20%, 30%, 40% y 50%). Con la que se consiguieron los mejores resultados resultó ser con la concentración del 40% ya que se conseguía el efecto plastificante, y el film no era quebradizo. Este efecto también se consiguió con la proporción del 50%. La adición de glicerol al 40% (en base al contenido total de polisacáridos) como plastificante permitió obtener películas con buena flexibilidad y permitió que las películas no se agrietaran sobre las placas durante el secado. Por lo tanto, se seleccionó glicerol al 40% como plastificante.

De la misma manera, se llevaron a cabo experimentos preliminares para determinar el porcentaje de polisacáridos en las soluciones filmogénicas, siendo el 2% la concentración seleccionada. Aunque se probaron varias proporciones (0.5%; 1%; 1.5%; 2%; 3%), se observó que concentraciones inferiores al 1.5% no daban lugar a una correcta formación del film. Así se seleccionó la del 2% porque con ella se obtuvieron films con un espesor adecuado, y junto con la proporción del plastificante seleccionada, los films presentaban una resistencia y consistencia adecuadas.

En el caso del empleo como "coating" el recubrimiento quedó perfectamente fijado y adherido al soporte empleado, en nuestro caso un film de LDPE.

Tanto para los films de almidón(A)-carragenato(C), como los films de almidón(A)-agar(B) se probaron diferentes proporciones (A: 80 C: 20), (A: 50 C: 50), (A: 20 C: 80), (A: 60 C: 40) y (A: 80 B: 20), (A: 50 B: 50), (A: 20 B: 80), (A: 60 B: 40); para seleccionar las proporciones más adecuadas se tuvieron en cuenta los siguientes criterios, que los films resultantes no fuesen quebradizos, que se obtuviesen films resistentes y con una superficie lisa; en ambos casos, con los films de almidón(A)-carragenato(C) y con los films de almidón(A)-agar(B), se consiguió con las proporciones A: 20 C: 80 y A: 20 B: 80.

El espesor del film varió de 59 a 73 p,m en las películas de almidón: carragenato, mientras que en las películas de almidón: agar varió de 56 a 78 p,m. Del mismo modo, con la adición de aceites esenciales aumentó el grosor de las películas en ambas formulaciones (Tabla 6 y Tabla 7).

Una de las composiciones acuosas preparadas contenía: a) un 2% peso total de los polisacáridos respecto al peso de la composición, donde un 0,4% era almidón y un 1,6% era carragenato o agar; b) un 2% o un 4% en peso de los aceites esenciales seleccionados respecto al peso de la composición; c) un 0,8% en peso de plastificantes respecto al peso de la composición; d) agua hasta completar el 100% en peso de la composición.

Ejemplo 2. Evaluación del color de las películas formadas en los ejemplos 1.1 y 1.2.

La variación de color de las formulaciones preparadas en los ejemplos 1.1. y 1.2. se realizaron por evaluación visual. Algunas de esas formulaciones se evaluaron realizando la medición indicada en el apartado de Materiales y Métodos y se recogen en la siguiente tabla:

Mediante evaluación visual se comprobó que las mezclas de almidón-agar fueron más transparentes que las mezclas de almidón-carragenato, el uso de carragenato oscurece las películas. De la misma manera, la incorporación de aceites esenciales conduce a un cambio en el color de las películas. Por ejemplo, la adición de vainillina afecta significativamente el color de las películas, especialmente las mezclas de almidón: carragenato se hicieron más oscuras. En general, en términos de coloración, la incorporación de aceites esenciales causa más efecto en las películas de almidón: carragenato que en las películas de almidón: agar.

En concreto, las formulaciones de almidón: carragenato incorporados con CIVA presentaron un color más oscuro (AE 29,61) que las formulaciones de almidón: agar incorporadas con los mismos aceites esenciales CIVA (AE 12,46).

Está ultima formulación no se vio afectada por la vainillina que habitualmente causa el oscurecimiento de las películas.

Ejemplo 3. Composición química de los aceites esenciales

Los componentes de los aceites de corteza de canela, brote de clavo, limón y romero se analizaron mediante GC/MS. La identificación de los compuestos se realizó comparando los espectros de masas del pico obtenido en las muestras de los aceites esenciales con el de la biblioteca de espectros de masas NIST/ EPA/N1H 11 (versión 2.0) y Wiley RegistryTM 8a edición.

Los resultados mostraron que los aceites son mezclas complejas de numerosos compuestos. Los principales componentes de los aceites son estudiados se muestran en la figura 1: canela trans cinamaldehído; clavo - eugenol; romero - eucaliptol; limón - limoneno; que son responsables de su actividad antimicrobiana.

Ejemplo 4. Actividad Antibacteriana

El efecto inhibidor de las formulaciones de almidón:carragenato incorporadas con algunos aceites esenciales contra las tres bacterias seleccionadas, se muestra en la Tabla 6 y la Tabla 7. El método de difusión en agar se usó para evaluar la actividad antimicrobiana de las películas. La película de almidón:carragenato sin aceites esenciales y vainillina no previno el crecimiento de las bacterias patógenas estudiadas.

No se observó ningún efecto inhibidor contra las tres bacterias patógenas usando aceites de romero, limón y vainillina. Lo contrario sucedió en el caso de formulaciones que contenían clavo y canela, que inhibieron el crecimiento de las tres bacterias de prueba, excepto en el caso de las formulaciones que contienen canela al 2%, donde no se observó efecto inhibitorio contra E. coli O157:H7 (Tabla 6). La actividad antimicrobiana fue más fuerte en las concentraciones más altas de aceites esenciales. A medida que aumenta la concentración de aceites esenciales (clavo o canela), la zona de inhibición también aumenta significativamente (P<0.05) en las tres bacterias evaluadas. Los resultados mostraron que la efectividad de las formulaciones de almidón:carragenato que contenían clavo y canela por separado fue similar (P > 0.05) contra S. aureus, E. coli O157: H7 y B. cereus en las dos concentraciones estudiadas.

La figura 2 muestra la actividad antimicrobiana de los aceites de clavo, canela y romero a una concentración del 4% frente a las tres bacterias evaluadas.

S. aureus y B. cereus fueron las bacterias más sensibles al aceite de clavo y al aceite de canela para todas las concentraciones estudiadas, mientras que la bacteria gram negativa E. coli O157: H7 fue la más resistente.

Por su actividad antimicrobiana, se seleccionaron el aceite de canela y de clavo para hacer varias combinaciones (Tabla 7). Se observó la eficacia antimicrobiana en todas las formulaciones incorporadas con clavo: clavo romero (CLRO), clavo limón (CLLE), clavo canela (CLCI) y clavo vainillina (CLVA). En relación con las películas CLRO y CLLE no se observó un efecto inhibidor mucho mayor para S. aureus y E. coli O157:H7 que cuando el clavo 2% se incorporó solo en la formulación de almidón-carragenato (P>0.05). Sin embargo, cuando el clavo se combina con romero (P<0.05) se observa un mayor efecto inhibidor de B.

cereus. Cabe señalar que tanto el clavo 4% incorporado solo y la canela 4% incorporada sola en las formulaciones de almidón: carragenato, mostraron la inhibición más fuerte contra los tres microorganismos en comparación con las combinaciones de CLRO y CLLE (P<0.05). De las combinaciones hechas con clavo, CLCI y CLVA mostraron la mejor efectividad antimicrobiana contra los microorganismos probados (ver figura 2).

En el caso de las formulaciones de canela, no se observó inhibición con canela romero (CIRO) y canela limón (CILE), mientras que en la formulación de canela vainillina (CIVA) se observó inhibición contra las tres bacterias evaluadas (Figura 3).

Las combinaciones más efectivas fueron CLCI, CLVA y CIVA. Los resultados mostraron que la formulación de CIVA exhibió una actividad antimicrobiana significativamente mayor (P<0.05) que las otras combinaciones contra S. aureus, B. cereus y E. coli O157:H7. Por lo tanto, la formulación de almidón:carragenato incorporada con CIVA fue la más eficiente, seguida de CLCI y CLVA (Tabla 7).

Las formulaciones que contenían vainillina sola no tuvieron efecto antibacteriano, sin embargo, en combinación con canela o clavo mostraron una efectividad antibacteriana. De la misma manera, las formulaciones de almidón-carragenato incorporadas con CLVA y CIVA mostraron un efecto inhibitorio mayor que las formulaciones incorporadas solo con canela o clavo.

En cuanto a las formulaciones de almidón-agar, no se observó ningún efecto inhibitorio contra las tres bacterias usando aceite de romero, aceite de limón y vainillina. Solo los aceites de canela y clavo mostraron actividad inhibitoria contra S. aureus, E. coli O157: H7 y B. cereus (ver figura 3). Sin embargo, el aceite de canela a una concentración del 2% no muestra actividad inhibitoria contra E. coli O157: H7. A medida que las concentraciones de aceites de clavo de olor y canela aumentan, la zona de inhibición de las tres bacterias también aumenta significativamente (P< 0.05). Excepto en el caso de las formulaciones de clavo en las que no hubo diferencias significativas (P> 0.05) en la inhibición de S. aureus en las dos concentraciones estudiadas (Tabla 6). La formulación de almidón-agar sin aceites esenciales no inhibió el crecimiento de los tres microorganismos probados.

No se observaron diferencias significativas (P>0.05) entre las formulaciones de almidón-agar que contenían 2% de canela y almidón-agar con 2% de clavo en la inhibición de S. aureus y B.cereus, sin embargo, las formulaciones que contenían 4% de canela mostraron más inhibición que las formulaciones de clavo a la misma concentración contra los microorganismos mencionados.

En relación a la inhibición del microorganismo E. coli O157: H7, la formulación activa que contenía un 2% de clavo fue la más eficaz. A la misma concentración, el aceite de canela no fue efectivo. En la concentración más alta estudiada (4%) no se observaron diferencias significativas (P>0.05) entre las formulaciones de clavo de olor y canela en la inhibición de E. coli (Tabla 6). La figura 2 muestra la actividad antimicrobiana de los aceites de clavo de olor, canela y romero en la concentración más alta (4%) contra las tres bacterias evaluadas.

Las mismas combinaciones descritas con los aceites de clavo de olor y canela en las formulaciones de almidón-carragenato se llevaron a cabo en las formulaciones de almidónagar. Las formulaciones que contenían clavo de olor en diferentes combinaciones (CLRO, CLLE, CLCI, CLVA) revelaron un efecto inhibitorio contra los microorganismos analizados. Especialmente CLCI tuvo un fuerte efecto contra S. aureus, E. coli O157: H7 y B. cereus (P <0.05). CLRO y CLLE fueron las formulaciones menos efectivas. No se encontraron diferencias significativas (P> 0.05) para estas dos películas formulaciones (Tabla 7).

El aceite de canela en combinación con la vainillina mostró un efecto inhibitorio contra las tres bacterias probadas; sin embargo, CILE y CIRO no inhibieron el crecimiento de ninguna de las tres bacterias (Figura 3). Al igual que en las formulaciones de almidón-carragenato, en las formulaciones de almidón-agar, las combinaciones más efectivas fueron CLCI, CLVA y CIVA. De estos, las formulaciones CIVA mostraron la actividad antimicrobiana más fuerte contra las tres cepas de bacterias (P < 0.05).

En general, S. aureus y B. cereus resultaron ser las bacterias más sensibles en todas las formulaciones (almidón-agar y almidón-carragenato), mientras que la bacteria gram negativa E. coli O157: H7 fue la más resistente.

La menor susceptibilidad de E. coli O157:H7 está relacionada con la estructura de su pared celular. Las bacterias Gram-negativas además de una membrana celular interna tienen una membrana externa única que es rica en lipopolisacáridos. Esta membrana externa excluye la penetración de ciertos agentes en la célula, por lo que las bacterias gram negativas a menudo son más resistentes que las bacterias gram positivas (Santos et al., 2016).

Si se comparan las dos formulaciones (formulación de almidón carragenato y almidón-agar) incorporadas con canela, no se encontraron diferencias significativas (P > 0.05) en la actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli O157: H7 en las concentraciones estudiadas. En el caso de la actividad antimicrobiana contra B.cereus, las formulaciones de almidón-agar incorporadas con canela al 4% fueron más eficientes (p <0.05) que las formulaciones de almidón-carragenato con el mismo aceite esencial.

Las formulaciones de almidón-agar y almidón-carragenato incorporadas con clavo de olor no mostraron diferencias significativas (P > 0.05) en su efectividad contra S. aureus, E. coli O157: H7 y B.cereus en las dos concentraciones estudiadas.

Los resultados también mostraron que las formulaciones de almidón-carragenato y almidónagar exhibieron actividad antimicrobiana similar en todas las combinaciones probadas (CLRO, CLLE, CLCI, CIRO, CILE, CLVA, CIVA), con diferencias no significativas (P > 0.05) en la efectividad contra S. aureus, E. coli O157:H7 y B.cereus. Solo las formulaciones de almidón carragenato que contenían CIVA mostraron una actividad antimicrobiana significativamente mayor (P < 0.05) contra E.coli O157:H7 que las formulaciones de almidón-agar que contienen los mismos aceites esenciales (CIVA). Sin embargo, en ambas formulaciones, las que contenían CIVA mostraron la mejor actividad antimicrobiana contra los tres microorganismos.

Tabla 6a Actividad antimicrobiana de aceites esenciales y vainillina incorporada en la formulación almidón: carragenato.

a-b Diferentes letras superíndices en la misma columna bajo el mismo agente antimicrobiano indican diferencias significativas (p< 0.05) ± media de la desviación estándar (n = 2)

Tabla 6b Actividad antimicrobiana de aceites esenciales y vainillina incorporada en la formulación almidón: agar

a-bD i erentes letras superíndices en la misma columna bajo el mismo agent antimicrobiano indican diferencias significativas (p< 0.05) ± media de la desviación estándar (n = 2)

Tabla 7a Combinación de agentes antimicrobianos en la formulación almidón: carragenato

Diferentes letras superíndices en la misma columna indican diferencias significativas

(p< 0.05) ± media de la desviación estándar (n=2)

Tabla 7b Combinación de agentes antimicrobianos en la formulación almidón: agar

Diferentes letras superíndices en la misma columna indican diferencias significativas (p< 0.05) ± media de la desviación estándar (n=2)

Ejemplo 5. Solubilidad en agua

La solubilidad en agua de las películas biodegradables es un parámetro importante en el desarrollo de materiales de envasado. Una menor solubilidad de las películas biodegradables indica una mayor resistencia al agua, esta característica es necesaria para el almacenamiento de productos alimenticios, así como para el aumento de la vida útil de los mismos.

Se determinó la solubilidad en agua de las películas que mostraron actividad antimicrobiana y los valores obtenidos se recogen en la tabla 8.

En la formulación de almidón:agar, el porcentaje de solubilidad en agua (% SW) aumentó con la incorporación de algunos aceites esenciales como la canela y combinaciones de aceites esenciales como CLLE, CLVA, CIRO y CIVA. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas (P> 0.05) en comparación con las mezclas de almidón:agar sin aceites esenciales, excepto en el caso de CLLE y CIVA (P<0.05).

Se observó una reducción del %SW en formulaciones de almidón:agar incorporadas con clavo de olor, y combinaciones de CLRO y CLCI. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas (P> 0.05) en casi todos los casos en comparación con las películas de almidónagar.

Con respecto a las formulaciones de almidón:carragenato, el %SW aumentó con la incorporación de canela, clavo 2%, CLCI y CIRO. Sin embargo, este aumento es significativo (P<0.05) sólo con la incorporación de canela o clavo de olor. Con la incorporación de CLVA y CIVA, se mantuvo la solubilidad de la película. Probablemente esto se deba a interacciones específicas entre el almidón y el carragenato que podrían estabilizar la estructura de la película. Con la incorporación del 4% de clavo, CLRO y CLLE, se observó una reducción significativa (P<0.05) del %SW en casi todos los casos.

No se observaron diferencias significativas (P<0.05) entre la solubilidad de las formulaciones de almidón:agar y almidón:carragenato sin aceites esenciales. La incorporación de canela en ambas formulaciones inesperadamente aumenta el %SW. A pesar de su naturaleza hidrofóbica, su incorporación en ambas formulaciones aumentó su solubilidad.

En general, en ambas formulaciones, la solubilidad de las películas aumenta con la incorporación de aceites esenciales. Esto puede atribuirse a la acción de los aceites esenciales en la matriz de los polisacáridos que causa la ruptura de la película. Esto induce una difusión más rápida del agua en las películas y una mayor solubilidad.

Por otro lado, la incorporación de aceites esenciales como el clavo produjo películas de baja solubilidad. Esto significa que las películas de almidón-agar o almidón-carragenato pueden liberar los aceites esenciales lentamente y mantenerlos durante un largo tiempo en la superficie de los alimentos.

Tabla 8 Valores de solubilidad en agua de las formulaciones de almidón-agar y almidón-carragenato incorporadas con aceites esenciales.

*Control sin aceite esencial

a-f Diferentes letras superíndices en la misma columna indican diferencias significativas (p< 0.05).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Composición para envases bioactivos que comprende dos polisacáridos, un aceite esencial, y un agente plastificante,

donde el primer polisacárido es almidón y el segundo polisacárido se selecciona entre agar y carragenato, donde el total de los polisacáridos está en una proporción de entre 20% y 40% (peso/peso seco de la composición) y el plastificante en una proporción de entre 35% y 55% (peso/peso seco del contenido total de polisacáridos), donde el aceite esencial se selecciona de entre las siguientes mezclas: canela y vainillina, clavo y vainillina, donde el aceite esencial está en una proporción de entre 25% y 75% en peso/peso seco de la composición.

2. Composición según la reivindicación 1, donde los polisacáridos son almidón y agar.

3. Composición según la reivindicación 1, donde los polisacáridos de la composición son almidón y agar o almidón y carragenato, y el aceite esencial es una mezcla de canela y vainilla.

4. Uso de las composiciones según las reivindicaciones 1 a 3, como película de envasado de alimentos o como conservante.

5. Film o recubrimiento (coating) que comprende una composición como se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3.

6. Film según la reivindicación 5, que tiene un espesor de entre 50 y 80 micrómetros.

7. Uso de una composición según las reivindicaciones 1 a 3, un film o un recubrimiento según las reivindicaciones 5-6 como antibacteriano.

8. Uso de una composición según las reivindicaciones 1 a 3, un film o un recubrimiento según las reivindicaciones 5-6 como antibacteriano según la reivindicación 7, frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas.

9. Uso de una composición según las reivindicaciones 1 a 3, un film o un recubrimiento según las reivindicaciones 5-6 como antibacteriano según la reivindicación 7, donde las bacterias son Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.

10. Uso de una composición según las reivindicaciones 1 a 3, un film o un recubrimiento según las reivindicaciones 5-6, en la inhibición del crecimiento de patógenos alimentarios.