ES2774703T3 - Método y dispositivo para analizar una muestra fluídica con partículas dispersadas - Google Patents

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Abstract

Método para analizar una muestra (20) fluídica con partículas (24a-24p) dispersadas, que comprende: irradiar la muestra con luz, de manera que los fotones (a-d) de la luz transfieren momento a las partículas (24a-24p), y medir al menos una propiedad de las partículas (24a-24p) que se ve alterada por dicha transferencia de momento, en el que la luz es un haz (3) de propagación con una distribución (31) de intensidad que tiene gradientes (31a-31p) que apuntan a más de un punto dentro de cada plano (36) normal al sentido (3a) de propagación, a la vez que varían constantemente a lo largo del sentido (3a) de propagación, y hacer fluir la muestra (20) fluídica en un sentido sustancialmente opuesto al sentido (3a) de propagación, caracterizado porque la muestra (20) se mantiene en una cámara (2) que es alargada a lo largo de un eje (2a), el haz (3) es un haz de láser con un modo electromagnético transversal distinto de TEM00 que pasa al interior de la cámara con un sentido (3a) de propagación a lo largo de dicho eje (2a) alargado, y la cámara (2) tiene una sección transversal interna cónica que se expande sustancialmente en el sentido (3a) de propagación del haz (3).

Description

DESCRIPCIÓN
Método y dispositivo para analizar una muestra fluídica con partículas dispersadas
La invención se refiere a un método óptico para analizar una muestra fluídica con partículas dispersadas y a un dispositivo que es particularmente adecuado para realizar este método.
Antecedentes
Las nanopartículas, especialmente en los campos biotecnológico y farmacéutico, presentan un potencial significativo para futuras aplicaciones. Sin embargo, las poblaciones de partículas indefinidas y heterogéneas requieren herramientas analíticas y equipos avanzados de manipulación y separación para una aplicación enfocada y controlada. Desde que se descubrió que los fotones pueden usarse para manipular partículas en el régimen de tamaño de nano a microscópico a través de transferencia de momento, se han centrado esfuerzos de investigación en diferentes aplicaciones e innovaciones que usan este enfoque. Una metodología especial en este campo, la cromatografía de fuerza óptica (OFC), se da a conocer en (T. Imasaka, “Optical chromatography. A new tool for separation of particles.”, Analusis 26.5: 53-53 (1998)). Este método logra la caracterización y separación de mezclas heterogéneas en un medio líquido mediante la aplicación de fuerzas ópticas que contrarrestan fuerzas de arrastre fluídicas bien definidas dentro de un capilar. Desde entonces, la tecnología ha madurado para dar muchos instrumentos de laboratorio, un ejemplo de los cuales es el dispositivo de citología de fuerza láser que se comercializa por LumaCyte Inc. y patentado, por ejemplo, en el documento US 8.753.891 B2.
Hasta la fecha, la desventaja de la OFC es que presenta limitaciones de concentración y rendimiento. Todas las partículas tienen que alinearse a lo largo de una única línea correspondiente al haz de láser. Esto crea limitaciones de intervalo dinámico y graves problemas con la interacción entre partículas dentro del área de separación. Al final, la aplicación de OFC está limitada a muestras altamente diluidas y determinadas aplicaciones de partículas individuales.
(Higurashi et al., “Optically induced rotation of dissymmetrically shaped fluorinated polyimide micro-objects in optical traps”, Journal of Applied Physics 82 (6), 2773, ISSN: 0021-8979, doi: 10.1063/1.366163) da a conocer un método para analizar una muestra fluídica con partículas dispersadas que comprende irradiar la muestra con un haz de luz de propagación y medir propiedades de las partículas dispersadas que se ven alteradas por tal irradiación.
El documento US 6.696.022 B1 da a conocer una cámara cónica que está configurada para aplicar fuerzas de cizalladura a un polímero, para estirarlo para dar una conformación lineal larga para su análisis adicional.
Objetivo de la invención
Por tanto, el objetivo de la presente invención es aliviar el problema de interacciones entre partículas en OFC, permitiendo el uso de OFC también en muestras menos diluidas.
Este objetivo se logra mediante un método según la reivindicación principal y un dispositivo según una reivindicación independiente adicional. En las reivindicaciones dependientes se detallan realizaciones ventajosas adicionales. Divulgación de la invención
Los inventores han desarrollado un método para analizar una muestra fluídica con partículas dispersadas. Se irradia la muestra con luz, de manera que los fotones de la luz transfieren momento a las partículas. Se mide al menos una propiedad de las partículas que se ve alterada por dicha transferencia de momento.
Según la invención, la luz es:
• un haz de propagación con una distribución de intensidad que presenta gradientes que apuntan a más de un punto dentro de cada plano normal al sentido de propagación, a la vez que varían constantemente a lo largo del sentido de propagación, y/o
• un haz de trampa de vórtice en 3D que se configura para confinar las partículas en un volumen tridimensional por medio de gradientes de alta intensidad.
Los inventores han encontrado que el motivo fundamental para las limitaciones mencionadas de la OFC radica en el tipo de haz que se estaba usando desde la concepción original del método por Imasaka. La disposición óptica usa un perfil de haz de láser TEM00 convencional para la inducción de fuerzas. En una sección transversal perpendicular al sentido de propagación, un haz TEM00 sólo tiene un único máximo en el centro del haz. Este único máximo define una única línea a lo largo del eje de propagación en la que todas las partículas se alinearán debido a las fuerzas de gradiente que apuntan al único máximo si van a experimentar una transferencia de momento. El espacio de trabajo está básicamente limitado a una dimensión.
Por el contrario, los perfiles del haz según la presente invención proporcionan una alta intensidad en regiones volumétricas tridimensionales que pueden servir como espacio de trabajo en el que las partículas pueden experimentar una transferencia de momento. El espacio de trabajo puede tener, por ejemplo, forma cónica. Las partículas presentan más grados de libertad dentro de este espacio de trabajo tridimensional: pueden moverse casi libremente dentro del espacio de trabajo e incluso adelantar a otras partículas. Esto aumenta a su vez el intervalo dinámico, la sensibilidad y el rendimiento de las mediciones de propiedades que se ven alteradas por la transferencia de momento. Por ejemplo, a través de este movimiento sin obstáculos, pueden medirse las trayectorias de velocidad de partículas inducidas por fuerza láser hacia su posición de equilibrio y atribuirse directamente a tamaños de partícula correspondientes.
Un haz con gradientes que apuntan a más de un punto dentro de cada plano normal al sentido de propagación puede ser, por ejemplo, un haz de láser con un modo electromagnético transversal distinto de TEM00. Aunque un modo de este tipo presente un perfil de intensidad con varios máximos dispares que están distribuidos a través de su sección transversal, es decir, las partículas no pueden moverse desde un máximo hasta el siguiente, cada uno de estos máximos ya dará a las partículas un espacio de trabajo volumétrico.
Un haz de este tipo puede ejercer una fuerza neta sobre las partículas en un sentido preferido que presenta una componente a lo largo del sentido de propagación. En ausencia de cualquier fuerza contrarrestante, por ejemplo, una fuerza de arrastre fluídica, las partículas pueden moverse constantemente en este sentido preferido hasta que finalmente golpeen una pared del recipiente que contiene la muestra fluídica. Por el contrario, un haz de trampa de vórtice en 3D confina las partículas por medio de “paredes inmateriales” que consisten en gradientes de alta intensidad. Las partículas pueden moverse libremente en el interior del volumen tridimensional definido por el haz de trampa de vórtice, pero no pueden abandonar este volumen. Este volumen puede configurarse para estar alejado de cualquier pared del recipiente, por lo que las partículas pueden estudiarse en ausencia de cualquier artefacto provocado por las paredes del recipiente.
Si se usa un modo electromagnético transversal, en una realización especialmente ventajosa de la invención, este modo presenta al menos un máximo en un plano normal al sentido de propagación que es anular alrededor del eje de propagación. Cuando este máximo anular se “extruye” a lo largo del eje de propagación (incluyendo una posible expansión del haz), forma un espacio de trabajo tridimensional en el que las partículas presentan un grado de libertad adicional en el sentido acimutal a lo largo de la circunferencia del anillo. Por ejemplo, la irradiación también puede transferir un momento angular a las partículas, enviando las partículas, por ejemplo, en una trayectoria helicoidal en el interior del espacio de trabajo tridimensional.
Un ejemplo de un haz que transfiere un momento angular a las partículas es un modo TEM01* cilíndrico. Por tanto, en una realización especialmente ventajosa de la invención, se usa un modo de este tipo para efectuar tanto la construcción del espacio de trabajo tridimensional como la transferencia de un momento angular a las partículas al mismo tiempo.
Una ventaja principal de la presente invención es que los efectos de interacciones entre partículas se eliminan de una configuración de medición en la que se estudia el efecto de una transferencia de momento a partículas. Esto elimina una fuente principal de error específicamente del análisis del movimiento que realiza la partícula en respuesta a la transferencia de momento. Por tanto, en una realización especialmente ventajosa adicional de la invención, el método comprende además medir al menos uno de: una velocidad constante que alcanza una partícula mientras se irradia, un comportamiento de disminución o crecimiento de la velocidad de una partícula después de interrumpir o iniciar la irradiación, o un momento orbital o una rotación inducido por la irradiación.
Una fuente similar de error se elimina de mediciones en las que la fuerza resultante de la transferencia de momento se contrarresta por una fuerza de arrastre fluídica. Por tanto, el método comprende además hacer fluir la muestra fluídica en un sentido sustancialmente opuesto al sentido de propagación.
Para un análisis cuantitativo del comportamiento de las partículas, es mejor si se conoce la fuerza de arrastre fluídica para cada partícula en la cámara que contiene la muestra fluídica. Para ello, preferiblemente, la distribución espacial de la velocidad de flujo se configura para satisfacer una ecuación de continuidad predeterminada. En una realización a modo de ejemplo, la velocidad de flujo puede variar a través de la sección transversal del flujo de manera parabólica, mientras que es la más alta en el centro de dicha sección transversal.
Puede usarse el equilibrado de la fuerza ejercida por la transferencia de momento frente a una fuerza de arrastre fluídica, por ejemplo, para separar partículas que se mueven a una velocidad diferente en el sentido de propagación que el resto de las partículas a partir de dicho resto de las partículas. Por ejemplo, puede haber sólo una fracción de partículas que realice un movimiento neto en el sentido de propagación, mientras que otras partículas permanecen quietas o se mueven en el sentido opuesto. Esta separación de partículas funciona de manera similar a la OFC previa, con una diferencia importante: la precisión con la que partículas, por ejemplo, de diferentes tamaños pueden distinguirse unas de otras se mejora en gran medida porque las diferencias en el movimiento de partículas que se provocan por diferencias reales entre las partículas ya no están implicadas con los efectos de las interacciones entre partículas.
Para realizar un seguimiento de partículas, preferiblemente, se captura luz que se ha dispersado por las partículas en un sentido sustancialmente perpendicular al sentido de propagación. La luz dispersada puede atribuirse directamente a partículas individuales, y puede monitorizarse un gran número de partículas simultáneamente adquiriendo una imagen de un área que contiene las partículas.
Los métodos de dimensionamiento y caracterización pueden clasificarse en términos generales en métodos de agrupación, métodos de recuento y métodos de separación. Al proporcionar tanto separación como seguimiento, la presente invención proporciona un método combinado de separación-recuento. Un método de agrupación principal en uso en la actualidad es la dispersión de luz dinámica, DLS, que presenta las ventajas de que:
• es un método fácil de usar,
• se necesita una mínima cantidad de información de muestra,
• puede usarse en un intervalo de concentración de muestra altamente flexible,
• pueden medirse tamaños de muestra muy bajos (hasta 0,3 nm), y
• es una técnica conocida en la que están disponibles protocolos normalizados, al precio de que
• muestras con un alto índice de polidispersidad, PDI, tienden a cubrir pequeñas partículas debido a enromes diferencias de intensidad de dispersión;
• muestras con PDI alto provocan errores de método más grandes a través del cálculo de promedio;
• una mezcla de materiales influirá en la medición y conducirá a errores;
• apenas pueden detectarse bajas concentraciones de poblaciones de partículas;
• una medición de concentración sólo es posible de una manera indirecta, por ejemplo, mediante transmisión de muestra; y
• no es un principio de medición “observable por el usuario”.
En comparación con DLS, la combinación de separación y seguimiento según la presente invención presenta varias ventajas:
• la influencia de un PDI alto es insignificante, por lo que es posible explorar a través de todos los valores de tamaño;
• las mediciones son mediciones observables en tiempo real y directas, lo que aumenta la confianza del cliente; • la sensibilidad de detección puede ajustarse en cada valor de tamaño hasta la detección de partículas individuales;
• puede medirse un intervalo de tamaños de partícula extendido, al menos entre 20 nm y 100 pm;
• sólo se necesita un pequeño volumen de muestra, por ejemplo, entre 5 pl y 100 pl;
• la concentración total de partículas y la concentración de partículas para cada valor de tamaño puede derivarse directamente;
• las partículas pueden separarse y dimensionarse en la misma etapa de medición;
• pueden realizarse operaciones adicionales, tales como atrapamiento, clasificación o mediciones de fluorescencia, en la misma plataforma;
• pueden llegar a detectarse y clasificarse las propiedades intrínsecas de las partículas (por ejemplo, diferentes razones de proteína con respecto a lípido).
El bajo coste a pagar por estas ventajas es que la trayectoria física de la medición es más compleja. La distribución de tamaño no se obtiene directamente mediante movimiento browniano, sino mediante diferencias en las fuerzas inducidas por transferencia de momento óptico. Además, se necesita un poco más de información (es decir, el índice de refracción) sobre la muestra.
Un método de recuento principal en uso en la actualidad es el análisis de seguimiento de nanopartículas, NTA; método que correlaciona la tasa de movimiento browniano con el tamaño de partícula. Este método presenta las ventajas de que:
• una visualización directa de las partículas permite una alta confianza del cliente y una evaluación visual preliminar de la muestra;
• ninguna intensidad de dispersión puede influir en la medición de tamaño porque sólo se detecta movimiento browniano;
• el enfoque de “uno en uno” resuelve mejor la polidispersidad;
• es posible una medición de tamaño pura sin una contribución de un índice de refracción;
• la agregación y la floculación de las partículas son observables en tiempo real; y
• es posible una medición de la concentración;
al precio de que:
• el método está limitado a una distribución de tamaño amplia. Debido al enfoque de “uno en uno”, no pueden medirse todos los valores de tamaño, por lo que el PDI no puede deducirse por completo;
• la detección bidimensional del movimiento browniano tridimensional introduce errores de medición intrínsecos; • los cortos intervalos de seguimiento degradan adicionalmente la precisión;
• el perfil del haz gaussiano influye en la medición de partículas de diferentes tamaños, lo que conduce a errores adicionales; y
• muestras con PDI alto pueden cubrir pequeñas partículas debido a enormes diferencias de intensidad de dispersión.
En comparación con el NTA, la combinación de separación y seguimiento según la presente invención presenta varias ventajas:
• las partículas se transportan a través de la ventana de medición de manera automática, permitiendo altas estadísticas de medición de partículas;
• es posible la detección de partículas grandes y pequeñas, independientemente de sus razones de concentración, por lo que pueden evaluarse todos los valores de tamaño y puede deducirse un PDI completo;
• las fuerzas inducidas de manera óptica pueden tener un sentido preferido, de manera que, en comparación con el movimiento browniano estadístico en tres dimensiones, está disponible un parámetro de medición unidimensional claro. Por tanto, pueden derivarse la distancia, la velocidad y la (des)aceleración mediante algoritmos de seguimiento;
• puede ajustarse la sensibilidad de detección en cada valor de tamaño, hasta la detección de partículas individuales;
• pueden detectarse y clasificarse propiedades intrínsecas de las partículas (por ejemplo, razones de proteína con respecto a lípido); y
• pueden realizarse operaciones adicionales, tales como atrapamiento, clasificación o mediciones de fluorescencia, en la misma plataforma.
De manera similar a la comparación con DLS, el principal precio a pagar es que se necesita el conocimiento sobre el índice de refracción de la muestra, y la trayectoria física de la medición es más compleja.
Los principales métodos de separación en uso en la actualidad son fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico, AF4, y cromatografía de exclusión molecular, SEC, con cromatografía de permeación en gel, GPC, como su realización más destacada. Estos métodos de separación presentan la ventaja de que:
• GPC/SEC pueden separar partículas muy pequeñas (moléculas de unos pocos DA);
• GPC/SEC pueden ampliarse a escala hasta un rendimiento mucho mayor;
• AF4 no tiene fase estacionaria, por lo que no es posible ninguna interacción con la matriz;
• las tecnologías están bien establecidas, por lo que están disponibles normas y protocolos aprobados;
al precio de que:
• se necesitan operarios altamente cualificados;
• la degradación por cizalladura, la obstrucción de la columna y las interacciones no deseadas con la fase estacionaria introducen artefactos en las mediciones de GPC/SEC;
• la interacción con la matriz provoca problemas de recuperación;
• la separación y la detección deben realizarse mediante dispositivos independientes, lo que hace que el análisis sea más complejo;
• GPC/SEC apenas pueden separar moléculas y polímeros más grandes (el intervalo termina a aproximadamente 20 nm);
• en AF4, la interacción con la membrana y las condiciones de partida de la separación inicial son críticas;
• las membranas de AF4 son piezas consumibles, son difíciles de instalar y presentan una baja reproducibilidad debido a variaciones de fabricación en los tamaños de poro; y
• GPC/SEC son muy costosas.
En comparación con GPC/SEC y AF4, la combinación de separación y seguimiento según la presente invención presenta varias ventajas:
• es aplicable a muestras homogéneas y heterogéneas. Las partículas pueden estar presentes en disolución, o como un sistema coloidal, tal como una emulsión o una dispersión;
• a diferencia de GPC/SEC, no es necesaria una fase estacionaria;
• a diferencia de AF4, no es necesaria una membrana;
• el método es muy sensible y puede usarse para muestras de concentración muy baja, hasta la filtración de partículas individuales; y
• puede observarse directamente la operación y evaluarse el rendimiento.
El pequeño precio a pagar es que el volumen de separación depende del índice de refracción del disolvente, y la separación depende del contraste óptico (un contraste óptico mayor conduce a un mejor rendimiento de separación). En una realización especialmente ventajosa adicional de la invención, se ilumina de manera irregular al menos una partícula que es más grande que la longitud de onda de la luz, y se detecta una compresión de la partícula provocada por la iluminación irregular. Esta compresión también puede medirse con mayor precisión: dado que hay más espacio disponible en el volumen de trabajo tridimensional, el patrón de iluminación sobre la partícula en cuestión no se cambia de manera involuntaria por otras partículas que sombrean la luz, y la partícula en cuestión tampoco interacciona directamente con las otras partículas.
Las principales ventajas del método según la invención son las siguientes:
• Dado que las partículas pueden moverse sin obstáculos dentro del haz, además de una simple posición de equilibrio entre la fuerza inducida de manera óptica y una fuerza de arrastre fluídica, se hace posible el seguimiento de velocidad de partículas no en equilibrio.
• Dado que el volumen del espacio de trabajo tridimensional es muchas veces más grande que el “volumen” del simple canal unidimensional formado por el modo TEM00, puede usarse un área de separación correspondientemente más grande para filtrar, separar y concentrar partículas. Esto permite a su vez usar concentraciones de partículas del orden de 108 partículas/ml, mientras que la técnica anterior sólo permitía el estudio de partículas individuales en muestras de baja concentración. •
• Al adaptar el flujo microfluídico de la muestra al confinamiento cónico de partículas, las mediciones presentan una alta sensibilidad en regiones tanto de alta intensidad como de baja intensidad, y el intervalo dinámico puede mejorarse adicionalmente.
• El espacio de trabajo tridimensional mucho más grande permite un rendimiento mucho mayor porque las partículas no necesitan alinearse una tras otra. Rendimientos del orden de 106 partículas/minuto están al alcance.
• La tendencia de las partículas a agregarse se reduce en gran medida en el espacio de trabajo tridimensional. La invención también proporciona un dispositivo para realizar el método según la invención. Este dispositivo comprende una cámara para contener una muestra. La cámara es alargada a lo largo de un eje y está configurada para hacer pasar un haz de luz a lo largo de dicho eje. Según la invención, la cámara presenta una sección transversal interna cónica que se expande sustancialmente en el sentido de propagación del haz.
Los inventores han encontrado que este diseño adapta ventajosamente fuerzas de arrastre microfluídicas en la cámara a las fuerzas inducidas por transferencia de momento desde los fotones de la luz hasta las partículas. Diferentes posiciones de equilibrio a lo largo del eje de propagación del haz corresponden a diferentes distancias a lo largo del eje perpendicular a este eje de propagación. Por consiguiente, las partículas más grandes experimentan fuerzas de arrastre más pequeñas en regiones de baja intensidad óptica debido a perfiles de flujo determinados de manera microfluídica. Esto crea un espacio de trabajo bien definido, eficiente y altamente sensible para mejorar adicionalmente la sensibilidad y el intervalo dinámico.
La cámara puede diseñarse, por ejemplo, usando dinámica de fluidos computacional y fabricarse usando técnicas de microfabricación correspondientes.
En una realización especialmente ventajosa de la invención, el dispositivo comprende además un láser configurado para hacer pasar un haz al interior de la cámara. Preferiblemente, el haz se expande en el sentido de propagación a medida que se expande la sección transversal interna de la cámara. Entonces, la forma de la cámara se adapta de manera óptima a la forma del espacio de trabajo tridimensional creado en la misma.
En una realización especialmente ventajosa adicional de la invención, la trayectoria óptica entre el láser y la cámara comprende una placa de media onda en serie con un elemento óptico difrangente. Esta configuración puede usarse para dar forma al modo TEM01* que es el más útil en el contexto del método presentado anteriormente.
En una realización especialmente ventajosa adicional de la invención, el dispositivo comprende además al menos un primer detector sensible a la posición para luz que se ha dispersado por partículas en la muestra sustancialmente perpendicular al sentido de propagación y un segundo detector para luz que ha atravesado totalmente la muestra a lo largo del sentido de propagación. Entonces, el primer detector puede usarse para realizar un seguimiento de partículas individuales a medida que se mueven a través de la cámara bajo la combinación de transferencia de momento de los fotones y fuerzas de arrastre microfluídicas. El segundo detector puede usarse al mismo tiempo para controlar el estado de la cámara y evaluar el perfil del haz.
El espacio de trabajo tridimensional junto con el diseño microfluídico de la cámara de muestra potencia la OFC de una “existencia específica para aplicaciones especializadas” a una plataforma multiparamétrica de caracterización, separación y manipulación de partículas. Esta plataforma puede hacerse funcionar en tres modos de funcionamiento principales:
• caracterización de partículas;
• separación de partículas; y
• atrapamiento y análisis de partículas individuales.
Todos estos modos de funcionamiento funcionan libres de etiquetas, libres de contacto (es decir, sin una fase estacionaria) y de manera no invasiva como una configuración discontinua o de flujo continuo en un entorno líquido con una aceptación de volumen de muestra ultrabajo de hasta 5 |il para extracciones de productos biológicos poco frecuentes o productos farmacéuticos costosos. A continuación, se resumen los tres modos de funcionamiento y se referencian con respecto a tecnologías competidoras disponibles comercialmente en la actualidad:
La caracterización de partículas compite, por ejemplo, con DLS, NTA y MALS.
Los tamaños de partícula y las distribuciones de tamaño pueden medirse en un intervalo entre 20 nm y 100 |im mediante “seguimiento de velocidad de partículas” y “detección de distancia en equilibrio” mejorada. Por medio de la dispersión de partículas, pueden visualizarse partículas de cualquier “pin de tamaño” seleccionado hasta una sensibilidad de partículas individuales.
La separación de partículas compite, por ejemplo, con AF4, GPC/SEC, FPLC, FACS y AUC. Las partículas pueden separarse haciendo referencia al tamaño, o haciendo referencia a propiedades intrínsecas, tales como diferencias en composiciones de partícula. De esta manera, por ejemplo, pueden clasificarse poblaciones de células de una manera similar a FACS o separación ultracentrífuga. Por tanto, el método puede proporcionar un filtro óptico que funciona de manera similar a un filtro mecánico con un tamaño de membrana ajustable.
El atrapamiento y el análisis de partículas individuales compite, por ejemplo, con AFM, aspiración con micropipeta, dispositivos de estiramiento óptico, trampas ópticas y plataformas microfluídicas de tipo laboratorio en un chip. Debido al movimiento sin obstáculos de las partículas en el espacio de trabajo tridimensional, pueden deducirse propiedades de partículas viscoelásticas y la rigidez celular a partir del comportamiento observado de las partículas. Puede estudiarse la deformabilidad de partículas, tales como glóbulos rojos. También pueden analizarse células o partículas individuales atrapadas, o aisladas de otra forma, usando otros métodos ópticos, tales como microscopía fluorescente y de luz transmitida, o espectroscopía Raman.
El método y el dispositivo pueden usarse, por ejemplo, en la industria farmacéutica para:
• diseño de fármacos (por ejemplo, caracterización de vacunas, desarrollo de fármacos basados en proteínas y anticuerpos);
• caracterización y segregación de nanopartículas farmacéuticamente activas, tales como oligonucleótidos de protamina recubiertos con alérgenos de cacahuete para vacunaciones de inmunización para seres humanos;
• desarrollo de vacunas (por ejemplo, mediciones de tamaño y cuantificación relacionada con el tiempo de la formación de vesículas de membrana externa que proporcionan el potencial para vacunaciones);
• desarrollo de formulaciones (por ejemplo, control de emulsificación para administración terapéutica, o parámetros físicos de microemulsiones);
• control de calidad en línea (por ejemplo, control de formación de micropartículas, evaluación de la densidad de empaquetamiento, evaluación de desviación para pilas microfluídicas industriales, o Doxil, preparación liposómica para quimioterapia).
El método y el dispositivo pueden usarse, por ejemplo, en el diagnóstico médico y clínico para estudiar:
• deformabilidad de eritrocitos (por ejemplo, glicosilación de hemoglobina para el diagnóstico de diabetes mellitus), o • medición de propiedades viscoelásticas de células (por ejemplo, las células cancerosas presentan un ablandamiento celular con respecto a células normales).
El método y el dispositivo pueden usarse, por ejemplo, en las industrias alimentarias para el desarrollo de aditivos alimentarios de tamaño nanométrico (por ejemplo, nanoencapsulación de aromas y nutrientes mediante mediciones de estabilidad estérica).
El método y el dispositivo pueden usarse, por ejemplo, en la industria cosmética y de perfumes para:
• caracterizar formulaciones de cremas liposómicas (por ejemplo, investigación y desarrollo de niosomas);
• caracterizar partículas usadas en protector solar, maquillaje y cremas, o
• caracterizar nanopartículas usadas para retención de fragancias.
El método y el dispositivo pueden usarse, por ejemplo, en biotecnología para
• estudiar vesículas extracelulares en bacterias (por ejemplo, detección, cuantificación y dimensionamiento); o • investigación y caracterización del microbioma.
Descripción de las figuras
A continuación, se ilustra la invención usando las figuras sin pretenderse ninguna limitación en cuanto al alcance. Las figuras muestran:
Figura 1: ilustración esquemática de una realización prototípica del dispositivo 1;
Figura 2: ilustración de algunos modos electromagnéticos transversales que pueden usarse;
Figura 3: modelo de óptica de rayos de un espacio de trabajo con forma cónica en 3D;
Figura 4: dibujo a modo de ejemplo de la imagen microscópica que puede esperarse durante la separación de partículas;
Figura 5: dibujos a modo de ejemplo de imágenes microscópicas a partir de las cuales puede realizarse un seguimiento de las velocidades de las partículas.
La figura 1 ilustra una realización prototípica del dispositivo 1. El dispositivo 1 comprende una cámara 2 para alojar una muestra 20 fluídica. La muestra 20 se bombea mediante una bomba 15 de jeringa microfluídica desde una jeringa de 1 ml a una velocidad de 0,1-10 pl/min a través de un bucle 16 de muestra de 20 pl en el interior de una cámara 2 capilar de sílice fundida de 10 pl de aproximadamente 600 pm de diámetro y atraviesa la cámara 2 de derecha a izquierda. Después de haber atravesado la cámara 2, la muestra 20 se recoge mediante un colector 17 de muestra. La cámara 2 es alargada con un eje 2a.
Se hace pasar luz emitida a partir de un láser 4 de DPSS a 532 nm a través de un filtro 8 espacial que comprende un objetivo 8a y un diafragma 8b. Por medio de una primera lente 7a, la luz se convierte en un haz paralelo que pasa a través de una placa 5 de media onda de sílice fundida y un elemento 6 óptico difrangente antes de concentrarse de nuevo por medio de una segunda lente 7b. De esta manera, se forma un haz 3 que consiste sustancialmente en un modo TEM01* cilíndrico con un tamaño de anillo definido; en otras palabras, el perfil de haz de láser en la región focal del objetivo 8a se convierte en vórtice en un modo anular.
La cámara 2 es transparente y puede observarse por medio de un detector 10 sensible a la posición que comprende un objetivo 10a y una cámara 10b. Este detector 10 sensible a la posición puede capturar luz que se ha dispersado por la muestra 20 en la cámara 2 en un sentido perpendicular al sentido 3a de propagación, así como luz auxiliar que se ha transmitido a través de la cámara 2 en el mismo sentido a partir de una fuente 9 de luz auxiliar.
Después de haber pasado la cámara 2, una porción del haz 3 se divide por medio de un divisor 11 de haz y se alimenta a un segundo detector 12 que comprende una lente 12a y una cámara 12b. El divisor 11 de haz sirve para reducir la intensidad porque el láser 4 es muy intenso (por ejemplo, potencia CW de 3 W). Por tanto, la mayor parte de la intensidad se descarta en un sumidero 13 de haz.
La información de imágenes a partir de ambas cámaras 10b y 12b se registra mediante el ordenador 14 que también controla el láser 4 y la bomba 15 de jeringa microfluídica.
La figura 2 ilustra la distribución 31 de intensidad del haz 3 de láser en un plano 36 perpendicular al sentido 3a de propagación para dos modos a modo de ejemplo que pueden usarse en el contexto de la presente invención.
La figura 2a ilustra un modo TEM01* cilíndrico. La intensidad en diversas áreas de la sección transversal se indica mediante la densidad de los puntos con los que se llena cada área. Dentro del círculo 32 y fuera del círculo 35, la intensidad se desvanece, por lo que estas áreas no están llenas con puntos. Moviéndose radialmente hacia fuera a partir del círculo 32, se encuentra una región de intensidades comparativamente bajas que da paso a una región de intensidades comparativamente altas que está limitada por los círculos 33a y 33b. Dentro de esta última región, el máximo de intensidad anular se indica mediante el círculo 34. Entre los círculos 33b y 35, existe una región adicional de intensidades comparativamente bajas. En la figura 2a se muestran diversos gradientes 31a-31p a modo de ejemplo que apuntan desde las intensidades menores hasta las intensidades mayores.
Cuando la región de alta intensidad entre los círculos 33a y 33b se “extruye” a lo largo del sentido 3a de propagación fuera del plano 36 que corresponde al plano del dibujo, formará un espacio de trabajo tridimensional contiguo en el que las partículas 24a-24p comprendidas en una muestra 20 fluídica pueden moverse impulsadas por la transferencia de momento desde el haz 3. Específicamente, dentro de este espacio, las partículas 24a-24p pueden superarse entre sí y también moverse en un sentido acimutal alrededor de una circunferencia del anillo (por ejemplo, a lo largo del círculo 34 que representa el máximo). En combinación con el movimiento hacia delante a lo largo del sentido 3a de propagación, el movimiento de las partículas 24a-24p puede ser, por tanto, por ejemplo un movimiento helicoidal.
La figura 2b ilustra otro modo que puede usarse en el contexto de la presente invención. Este es el modo TEM02 cilíndrico. El perfil 31 de intensidad se divide básicamente en un primer lóbulo con una región 37a de menor intensidad y una región 38a de mayor intensidad incrustada en la misma, un segundo lóbulo con una región 37b de menor intensidad y una región 38b de mayor intensidad incrustada en la misma, un tercer lóbulo con una región 37c de menor intensidad y una región 38c de mayor intensidad incrustada en la misma, y un cuarto lóbulo con una región 37d de menor intensidad y una región 38d de mayor intensidad incrustada en la misma.
Cada región 38a-38d de mayor intensidad, cuando se extruye en el sentido 3a de propagación fuera del plano 36, forma un espacio de trabajo propio para cualquier partícula 24a-24p comprendida en la muestra 20. Sin embargo, las partículas 24a-24p no podrán moverse desde una región 38a-38d de este tipo hasta otra.
La figura 3 ilustra cómo se equilibran las fuerzas de dispersión Fdisp frente a fuerzas de arrastre fluídicas Farrastre en la cámara 2, en la que se usa un modelo de óptica de rayos para entender las fuerzas de dispersión Fdisp. A lo largo del sentido 3a de propagación del haz 3 con su perfil 31 de intensidad, la sección 21a, 21b transversal de la cámara 2 se expande sustancialmente a medida que se expande el haz 3. Esto provoca que la velocidad 26 de flujo de la muestra 20, que fluye desde una entrada 22 en el lado izquierdo hasta una salida 23 en el lado derecho en un sentido opuesto al sentido 3a de propagación del haz 3, varíe de manera parabólica con un máximo en el centro de la sección 21a, 21b transversal, mientras que la intensidad del haz 3 con su perfil 31 de intensidad presenta un mínimo en el centro de la sección 21a, 21b transversal.
Las partículas 24c-24p presentan tamaños variables, y experimentan una fuerza de dispersión Fdisp y una fuerza de arrastre Farrastre que aumentan ambas con el tamaño de partícula. Por consiguiente, las ubicaciones en la cámara 2 en las que ambas fuerzas están en equilibrio son diferentes para las partículas 24c-24d de diferentes tamaños. Esto puede usarse para separar las partículas según su tamaño.
En el lado derecho de la figura 3, se ilustra de manera esquemática cómo el perfil 31 de intensidad del haz 3 ejerce fuerzas sobre partículas 24a y 24b a modo de ejemplo mediante transferencia de momento de cuatro fotones a-d a modo de ejemplo. Se muestra en qué sentidos se dispersan los fotones a-d en el proceso, y qué fuerza ejerce cada fotón a-d sobre las partículas 24a-24b tras el impacto. En sentido estricto, una mayor intensidad del haz 3 de láser significa que más fotones por segundo inciden sobre la partícula 24a, 24b. En el modelo de óptica de rayos parcial de la figura 3, esto se modela ejerciendo fotones procedentes de una región de mayor intensidad de la distribución 31 de intensidad una fuerza mayor.
Pueden entenderse que la fuerza total ejercida sobre las partículas 24a, 24b por todos los fotones incidentes presenta una componente Fdisp en un sentido paralelo al sentido 3a de propagación, así como una componente Fgrad en un sentido hacia el máximo de intensidad, perpendicular al sentido 3a de propagación.
En la configuración descrita en las figuras 1 y 3, la transferencia de fuerza a una partícula puede ser del orden de 1 pN a 1 nN. El líquido de la muestra 20 puede ser, por ejemplo, agua, EtOH o isopropanol. Pueden introducirse fuerzas adicionales en el entorno líquido por medio de gradientes de concentración.
La figura 4 ilustra imágenes microscópicas que pueden esperarse en la cámara 10b del dispositivo 1 mostrado en la figura 1 cuando la muestra 20 comprende partículas 24a-24g de diferentes tamaños. En el ejemplo mostrado en la figura 4, la muestra 20 es una muestra muy altamente diluida de perlas de poliestireno en agua. Las perlas comprenden una primera porción de perlas que tienen cada una un tamaño de 940 nm, de las cuales se marcan cinco ejemplos 24a-24e en la figura 4, y una segunda porción de perlas que tienen cada una un tamaño de 200 nm, de las cuales se marcan tres ejemplos 24f-24h en la figura 4.
Dado que las perlas 24a-24e más grandes experimentan una fuerza mayor a partir de la irradiación con el haz 3 de láser, se acumulan en una primera región 25a en el lado izquierdo de la cámara 2. Las perlas 24f-24h más pequeñas, por el contrario, se acumulan en una segunda región 25b en el lado derecho de la cámara 2. Las anchuras de las regiones 25a y 25b son una medida de las dispersidades dentro de los grupos 24a-24e y 24f-24h de perlas.
Los tamaños de las partículas mostradas en la figura 4 no están dibujados a escala relativa, es decir, las perlas 24f-24h de 200 nm de tamaño no están dibujadas a menos de un cuarto del tamaño de las perlas 24a-24e de 940 nm de tamaño. El motivo de esto es que en una imagen de la luz dispersada por las partículas 24a-24h, ambos tipos de partículas aparecerán con aproximadamente el mismo tamaño.
La figura 5 ilustra imágenes microscópicas que pueden esperarse en la cámara 10b del dispositivo 1 mostrado en la figura 1 cuando se realiza un seguimiento de tres partículas 24a-24c a modo de ejemplo de diferentes tamaños a lo largo de un periodo de tiempo de varias tramas de imagen i) a iv) mientras que se someten a una fuerza de dispersión a partir del haz 3 de láser dirigida de derecha a izquierda y una fuerza de arrastre a partir del flujo fluídico dirigida de izquierda a derecha. A diferencia de la figura 4, la diferencia de tamaño entre las partículas 24a, 24b y 24c se ha dibujado en una escala exagerada en la figura 5 para visualizar mejor la distinción entre estas partículas. La partícula 24a es la partícula más grande y se mueve más rápido de derecha a izquierda en la secuencia de tramas i) a iv). La partícula 24b es la partícula más pequeña y se mueve más despacio. La partícula 24c presenta un tamaño entre los tamaños de la partícula 24a y la partícula 24b. Llega al lado izquierdo de la cámara 2 al mismo tiempo que la partícula 24a, pero comenzó más a la izquierda en la trama i) que la partícula 24a. Por tanto, la partícula 24c se mueve más despacio que la partícula 24a, pero más rápido que la partícula 24b.
La velocidad de las partículas 24a-24c puede correlacionarse de manera matemática con su tamaño, por lo que al realizar un seguimiento de las partículas 24a-24c individuales puede determinarse su tamaño.
Lista de signos de referencia
1 dispositivo
cámara
a eje de cámara 2
haz
a sentido de propagación del haz 3
láser
placa de media onda
elemento difrangente
a, 7b lentes
filtro espacial
a objetivo en el filtro 8 espacial
b diafragma en el filtro 8 espacial
fuente de luz auxiliar
0 detector sensible a la posición
0a objetivo en el detector 10
0b cámara en el detector 10
1 divisor de haz
2 detector para luz transmitida
2a lente en el detector 12
2b cámara en el detector 12
3 sumidero de haz
4 ordenador
5 bomba de jeringa microfluídica
6 bucle de muestra
7 colector de muestra
0 muestra fluídica
1a, 21b secciones transversales de la cámara 2
2 entrada de la cámara 2
3 salida de la cámara 2
4a-24p partículas
5a, 25b regiones en las que se recogen las partículas 24a-24h de diferentes tamaños 6 distribución espacial de velocidad de flujo en la cámara 2
1 distribución de intensidad del haz 3
1a-31p gradientes de la distribución 31 de intensidad
32 límite interno de la región de menor intensidad 33a límite interno de la región de mayor intensidad 33b límite externo de la región de mayor intensidad 34 máximo de intensidad anular
35 límite externo de la región de menor intensidad 36 plano normal al sentido 3a de propagación 37a-37d regiones de menor intensidad
38a-38d regiones de mayor intensidad
a-d fotones
Fa-Fd fuerzas ejercidas por los fotones a-d
Farrastre fuerza de arrastre fluídica
Fgrad fuerzas de gradiente hacia intensidades menores Fdisp fuerza de dispersión inducida de manera óptica x, z ejes de coordenadas

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método para analizar una muestra (20) fluídica con partículas (24a-24p) dispersadas, que comprende:
    irradiar la muestra con luz, de manera que los fotones (a-d) de la luz transfieren momento a las partículas (24a-24p), y medir al menos una propiedad de las partículas (24a-24p) que se ve alterada por dicha transferencia de momento, en el que la luz es un haz (3) de propagación con una distribución (31) de intensidad que tiene gradientes (31a-31p) que apuntan a más de un punto dentro de cada plano (36) normal al sentido (3a) de propagación, a la vez que varían constantemente a lo largo del sentido (3a) de propagación, y hacer fluir la muestra (20) fluídica en un sentido sustancialmente opuesto al sentido (3a) de propagación, caracterizado porque la muestra (20) se mantiene en una cámara (2) que es alargada a lo largo de un eje (2a), el haz (3) es un haz de láser con un modo electromagnético transversal distinto de TEM00 que pasa al interior de la cámara con un sentido (3a) de propagación a lo largo de dicho eje (2a) alargado, y la cámara (2) tiene una sección transversal interna cónica que se expande sustancialmente en el sentido (3a) de propagación del haz (3).
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el modo electromagnético transversal tiene al menos un máximo (34) en un plano (36) normal al sentido (3a) de propagación que es anular alrededor del eje (3a) de propagación.
  3. 3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el modo electromagnético transversal es un modo TEM01* cilíndrico.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que medir la al menos una propiedad de las partículas (24a-24p) comprende: medir al menos uno de: una velocidad constante que alcanza una partícula (24a-24p) mientras se irradia, un comportamiento de disminución o crecimiento de la velocidad de una partícula (24a-24p) después de interrumpir o iniciar la irradiación, o un momento orbital o una rotación inducido por la irradiación.
  5. 5. Método según la reivindicación 1, en el que la distribución (26) espacial de la velocidad de flujo se configura para satisfacer una ecuación de continuidad predeterminada.
  6. 6. Método según la reivindicación 1 ó 5, en el que la velocidad de flujo varía a través de la sección (21a, 21b) transversal del flujo de manera parabólica y es la más alta en el centro de dicha sección (21a, 21b) transversal.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además: separar partículas (24a-24e) que se mueven a una velocidad diferente en el sentido (3a) de propagación que el resto (24f-24h) de las partículas a partir de dicho resto (24f-24h) de las partículas.
  8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además: capturar luz que se ha dispersado por las partículas (24a-24p) en un sentido sustancialmente perpendicular al sentido (3a) de propagación.
  9. 9. Dispositivo (1) para realizar el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una cámara (2) para contener una muestra (20) y un láser (4) configurado para hacer pasar un haz (3) al interior de la cámara (2), en el que la cámara (2) es alargada a lo largo de un eje (2a) y el sentido (3a) de propagación del haz (3) de láser es a lo largo de dicho eje (2a) alargado, caracterizado porque la cámara (2) tiene una sección transversal interna cónica que se expande sustancialmente en el sentido (3a) de propagación del haz (3).
  10. 10. Dispositivo (1) según la reivindicación 9, en el que el haz (3) se expande en el sentido (3a) de propagación a medida que se expande la sección (21a, 21b) transversal interna de la cámara (2).
  11. 11. Dispositivo (1) según la reivindicación 9 ó 10, que comprende además una placa (5) de media onda en serie con un elemento (6) óptico difrangente en la trayectoria óptica entre el láser (4) y la cámara (2).
  12. 12. Dispositivo (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende además al menos un primer detector (10) sensible a la posición para luz que se ha dispersado por partículas (24a-24p) en la muestra (20) sustancialmente perpendicular al sentido (3a) de propagación y un segundo detector (12) para luz que ha atravesado totalmente la muestra (20) a lo largo del sentido (3a) de propagación.
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