ES2732100T3

ES2732100T3 - Compositions and methods for the treatment of disorders due to expansion of nucleotide repeats

Info

Publication number: ES2732100T3
Application number: ES16722555T
Authority: ES
Inventors: Bello Ana Maria Buj; Scrudato Mirella Lo
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Universite D'Evry Val D'Essonne
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Universite D'Evry Val D'Essonne
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2019-11-20
Anticipated expiration: 2036-04-27

Abstract

Una pareja de moléculas de ARNgm, en donde dicha pareja comprende una primera y una segunda moléculas de ARNgm que son capaces de unir mediante apareamiento de bases un complemento de secuencia a una secuencia diana de ADN genómico que está localizada en el lado 5' y 3' de una expansión de repeticiones de nucleótidos localizada dentro de una región no codificante de un gen de interés, respectivamente, resultando apropiada de esta manera para escindir dicha expansión de nucleótidos con un sistema CRISPR/Cas9, en donde el gen de interés es el gen DMPK, en donde la pareja de moléculas de ARNgm es una pareja de: - un ARNgm que comprende una secuencia guía seleccionada de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 y - un ARNgm que comprende una secuencia guía seleccionada de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.A pair of mRNA molecules, wherein said pair comprises a first and a second mRNA molecules that are capable of linking a sequence complement to a genomic DNA target sequence that is located on the 5 'and 3 side by base pairing. 'of an expansion of nucleotide repeats located within a non-coding region of a gene of interest, respectively, thus being appropriate to cleave said nucleotide expansion with a CRISPR / Cas9 system, where the gene of interest is the gene DMPK, wherein the mRNA molecule pair is a pair of: - an mRNA comprising a selected guide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and - an mRNA comprising a selected guide sequence of SEQ ID NO : 3 and SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos por expansión de repeticiones de nucleótidos Compositions and methods for the treatment of disorders due to expansion of nucleotide repeats

Campo de la invenciónField of the Invention

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos por expansión de repeticiones de nucleótidos tales como la distrofia miotónica.The present invention relates to compositions and methods for the treatment of expansion disorders of nucleotide repeats such as myotonic dystrophy.

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

Las expansiones de repeticiones de nucleótidos, especialmente las expansiones de repeticiones de trinucleótidos, están implicadas en más de dos docenas de trastornos neurológicos y del desarrollo. Un enfoque que se ha propuesto para tratar estas enfermedades es acortar las repeticiones a longitudes no patológicas utilizando nucleasas altamente específicas (véase, para una revisión, Richard G.F., Trends Genet. 31(4):177-186, abril de 2015).Nucleotide repeat expansions, especially trinucleotide repeat expansions, are involved in more than two dozen neurological and developmental disorders. One approach that has been proposed to treat these diseases is to shorten repetitions to non-pathological lengths using highly specific nucleases (see, for a review, Richard G.F., Trends Genet. 31 (4): 177-186, April 2015).

Se han utilizado en tales estrategias nucleasas altamente específicas, tales como meganucleasas, y las nucleasas ZFN, TALEN y CRISPR-Cas9. Sin embargo, estas últimas fueron consideradas por el experto en la materia como inapropiadas para la escisión de expansiones de repeticiones de trinucleótidos (véase Richard, citado supra). Globalmente, los TALEN se han considerado una herramienta más prometedora para el acortamiento de las repeticiones de nucleótidos.Highly specific nuclease strategies, such as meganucleases, and the ZFN, TALEN and CRISPR-Cas9 nucleases have been used in such strategies. However, the latter were considered by the person skilled in the art as inappropriate for the cleavage of trinucleotide repeat expansions (see Richard, cited supra). Globally, TALENs have been considered a more promising tool for shortening nucleotide repeats.

Contra este fuerte prejuicio los presentes inventores demuestran que el sistema CRISPR-Cas9 puede implementarse para escindir expansiones de repeticiones de nucleótidos del ADN genómico, proporcionando de esta manera una potente e inesperada herramienta para el tratamiento de los trastornos por expansión de repeticiones de nucleótidos.Against this strong prejudice the present inventors demonstrate that the CRISPR-Cas9 system can be implemented to cleave nucleotide repeat expansions of genomic DNA, thus providing a powerful and unexpected tool for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders.

Compendio de la invenciónCompendium of the invention

Los inventores han demostrado que, frente al fuerte prejuicio desarrollado anteriormente, el sistema CRISPR-Cas9 puede resultar eficiente para el tratamiento de los trastornos por expansión de repeticiones de nucleótidos.The inventors have shown that, in the face of the strong prejudice developed above, the CRISPR-Cas9 system can be efficient for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders.

En un aspecto, en la presente memoria se describen moléculas de ARN guía monocatenario (ARNgm) útiles para escindir específicamente una expansión de repeticiones de nucleótidos, especialmente una expansión de repeticiones de trinucleótidos, de una región no codificante de un gen de interés. Las moléculas de ARNgm descritas en la presente memoria son capaces de unir mediante apareamiento de bases un complemento de secuencia a una secuencia (protoespaciador) diana de ADN genómico que se encuentra situada 5' o 3' respecto a la expansión de nucleótidos diana y son capaces de atraer una endonucleasa Cas9 a, o a un sitio próximo a, el sitio de hibridación entre el ARNgm y el a Dn genómico. Las moléculas de ARNgm de la invención comprenden la totalidad de los elementos de secuencia apropiados para inducir roturas en la doble cadena mediadas por Cas9 en la vecindad del sitio de complementariedad. En particular, la presente solicitud describe parejas de ARNgm apropiadas para realizar una escisión de la expansión de repeticiones de nucleótidos presente en la región no codificante del gen de interés, en el que la pareja de ARNgm comprende un primer ARNgm que es complementario a una secuencia de ADN genómico situada 5' respecto a la expansión de repeticiones de nucleótidos y un segundo ARNgm que es complementario a una secuencia de ADN genómico situado 3' respecto a la expansión de repeticiones de nucleótidos.In one aspect, single-stranded guide RNA (mRNA) molecules useful for specifically cleaving an expansion of nucleotide repeats, especially an expansion of trinucleotide repeats, from a non-coding region of a gene of interest are described herein. The mRNA molecules described herein are capable of linking by base pairing a sequence complement to a target genomic DNA sequence (proto-spacer) that is located 5 'or 3' relative to the expansion of target nucleotides and are capable of attracting a Cas9 endonuclease to, or near to, the hybridization site between the mRNA and the genomic Dn. The mRNA molecules of the invention comprise all of the sequence elements suitable for inducing Cas9-mediated double chain tears in the vicinity of the complementarity site. In particular, the present application describes appropriate mRNA pairs to perform a cleavage of the expansion of nucleotide repeats present in the non-coding region of the gene of interest, in which the mRNA pair comprises a first mRNA that is complementary to a sequence. of genomic DNA located 5 'with respect to the expansion of nucleotide repeats and a second mRNA that is complementary to a genomic DNA sequence located 3' with respect to the expansion of nucleotide repeats.

En una realización particular, la molécula de ARNgm comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 a NO:4. En otra realización particular, la molécula de ARNgm presenta la secuencia mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO:5 a NO:8.In a particular embodiment, the mRNA molecule comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to NO: 4. In another particular embodiment, the mRNA molecule has the sequence shown in any of SEQ ID NO: 5 to NO: 8.

Otro aspecto descrito en la presente memoria es la utilización del sistema CRISPR-Cas9 para escindir una expansión de repeticiones de nucleótidos. En particular, la expansión de repeticiones de nucleótidos se encuentra dentro del ADN genómico de una célula diana, más particularmente dentro de una región no codificante de un gen presente en dicho ADN genómico.Another aspect described herein is the use of the CRISPR-Cas9 system to cleave an expansion of nucleotide repeats. In particular, the expansion of nucleotide repeats is within the genomic DNA of a target cell, more particularly within a non-coding region of a gene present in said genomic DNA.

Según un aspecto adicional, en la presente memoria se describe un método para escindir una expansión de repeticiones de nucleótidos respecto de una región no codificante de un gen en el ADN genómico de una célula, implementando dicho método el sistema CRISPR-Cas9. El método puede comprender la introducción en la célula de una pareja de moléculas de ARNgm y un gen codificante de una endonucleasa Cas9.According to a further aspect, a method for cleaving an expansion of nucleotide repeats with respect to a non-coding region of a gene in the genomic DNA of a cell is described herein, said method implementing the CRISPR-Cas9 system. The method may comprise the introduction into the cell of a pair of mRNA molecules and a gene encoding a Cas9 endonuclease.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe un método para el tratamiento de un trastorno por expansión de repeticiones de nucleótidos, en el que dicha repetición se escinde respecto de un gen de interés, que comprende tal expansión de repeticiones de nucleótidos, utilizando al menos una pareja de moléculas de ARNgm tal como se ha descrito anteriormente y una endonucleasa Cas9.In another aspect, a method for the treatment of a nucleotide repeat expansion disorder is described herein, in which said repeat is cleaved from a gene of interest, comprising such an expansion of nucleotide repeats, using the less a pair of mRNA molecules as described above and a Cas9 endonuclease.

Más específicamente, los usos y métodos de la invención pueden comprender la introducción en una célula, tal como una célula de un sujeto que lo necesita:More specifically, the uses and methods of the invention may comprise the introduction into a cell, such as a cell of a subject in need thereof:

(i) Una primera molécula de ARNgm, (i) A first mRNA molecule,

(ii) Una segunda molécula de ARNgm, y(ii) A second mRNA molecule, and

(iii) Una endonucleasa CRISPR/Cas9,(iii) A CRISPR / Cas9 endonuclease,

en donde dichos primer y segundo ARNgm son complementarios a una secuencia situada 5' y 3' respecto a dicha expansión de repeticiones de nucleótidos, respectivamente, resultando apropiados de esta manera para escindir dicha expansión de repeticiones de nucleótidos.wherein said first and second mRNAs are complementary to a sequence located 5 'and 3' with respect to said expansion of nucleotide repeats, respectively, being appropriate in this way to cleave said expansion of nucleotide repeats.

En una realización particular, la expansión de repeticiones de nucleótidos se encuentra dentro de un intrón o una región 3' no traducida del gen de interés. En una realización más particular, la expansión de repeticiones de nucleótidos se encuentra dentro de la región 3' no traducida del gen de interés.In a particular embodiment, the expansion of nucleotide repeats is within an intron or a 3 'untranslated region of the gene of interest. In a more particular embodiment, the expansion of nucleotide repeats is within the 3 'untranslated region of the gene of interest.

En una realización particular adicional, el gen de interés es FMR1, AFF2 o FMR2, AFF3, FXN, ATXN80S/ATXN8, ATXN10, PPP2R2B, BEAN1/TK2, NOP56, C9ORF72, ZN9/CNBP o DMPK. En una realización particular, el gen de interés es DMPK. En una variante de esta realización, la expansión de repeticiones de nucleótidos se encuentra en la región 3' no traducida del gen codificante DMPK.In a further particular embodiment, the gene of interest is FMR1, AFF2 or FMR2, AFF3, FXN, ATXN80S / ATXN8, ATXN10, PPP2R2B, BEAN1 / TK2, NOP56, C9ORF72, ZN9 / CNBP or DMPK. In a particular embodiment, the gene of interest is DMPK. In a variant of this embodiment, the expansion of nucleotide repeats is in the 3 'untranslated region of the DMPK coding gene.

En algunas otras realizaciones específicas, el trastorno por expansión de repeticiones de nucleótidos es la distrofia miotónica, en particular la distrofia miotónica de tipo 1 (DM1) o de tipo 2 (DM2), más particularmente DM1.In some other specific embodiments, the nucleotide repeat expansion disorder is myotonic dystrophy, in particular myotonic dystrophy type 1 (DM1) or type 2 (DM2), more particularly DM1.

En algunas realizaciones, la molécula de ARNgm comprende una secuencia de ARN guía que presenta 15 a 40 nucleótidos, en particular 20 a 30 nucleótidos, en particular 22 a 26 nucleótidos, tal como 22, 23, 24, 25, 26 nucleótidos y una secuencia de ARN de andamiaje. En una realización particular, la molécula de ARNgm comprende una secuencia de ARN guía que consiste en 24 nucleótidos.In some embodiments, the mRNA molecule comprises a guide RNA sequence that has 15 to 40 nucleotides, in particular 20 to 30 nucleotides, in particular 22 to 26 nucleotides, such as 22, 23, 24, 25, 26 nucleotides and a sequence. RNA scaffolding. In a particular embodiment, the mRNA molecule comprises a guide RNA sequence consisting of 24 nucleotides.

En algunas realizaciones, las moléculas de ARNgm están diseñadas para unir mediante apareamiento de bases el complemento a la secuencia diana de ADN genómico (de otro modo denominada secuencia diana). Esta secuencia diana se denomina protoespaciador y se encuentra situada contiguamente a un motivo de nucleótidos denominado PAM (por sus siglas en inglés, motivo contiguo a protoespaciador) que resulta reconocido por la endonucleasa Cas9 implementada.In some embodiments, mRNA molecules are designed to bind base complement the complement to the genomic DNA target sequence (otherwise called the target sequence). This target sequence is called a proto-spacer and is located adjacent to a nucleotide motif called PAM (for its acronym in proto-spacer) that is recognized by the implemented Cas9 endonuclease.

En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas9 y/o las moléculas de ARNgm se expresan a partir de uno o varios vectores, tales como uno o varios plásmidos o vectores víricos. Por ejemplo, la endonucleasa Cas9 puede expresarse a partir de un primer vector, y la primera y segunda moléculas de ARNgm puede expresarse a partir de un único segundo vector o a de un segundo vector y la otra molécula a partir de un tercer vector. En otra realización, todos los elementos necesarios para la implementación del sistema CRISPR-Cas9 están contenidos en un único vector. In some embodiments, the Cas9 endonuclease and / or mRNA molecules are expressed from one or more vectors, such as one or several plasmids or viral vectors. For example, the Cas9 endonuclease can be expressed from a first vector, and the first and second mRNA molecules can be expressed from a single second vector or a second vector and the other molecule from a third vector. In another embodiment, all the elements necessary for the implementation of the CRISPR-Cas9 system are contained in a single vector.

En un aspecto adicional, en la presente memoria se describe un kit que comprende una endonucleasa Cas9 y una primera y segunda moléculas de ARNgm tal como se ha indicado anteriormente. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un kit que comprende un vector codificante de una endonucleasa Cas9 y un vector que codifica la primera y/o la segunda moléculas de ARNgm tal como se ha indicado anteriormente, o un único vector que expresa la endonucleasa Cas9 y una o ambas moléculas de ARNgm. Tal como se ha mencionado anteriormente, el vector o vectores en el kit pueden ser un vector plásmido o un vector vírico. Además, el kit según la invención puede incluir cualquier reactivo adicional (tal como uno o más tampones y/o uno o más reactivos de transfección) o dispositivos útiles en la implementación de los métodos y usos descritos en la presente memoria.In a further aspect, a kit is described herein comprising a Cas9 endonuclease and a first and second mRNA molecules as indicated above. In another aspect, a kit is described herein comprising a vector encoding a Cas9 endonuclease and a vector encoding the first and / or second mRNA molecules as indicated above, or a single vector expressing the Cas9 endonuclease and one or both mRNA molecules. As mentioned above, the vector or vectors in the kit can be a plasmid vector or a viral vector. In addition, the kit according to the invention may include any additional reagents (such as one or more buffers and / or one or more transfection reagents) or devices useful in the implementation of the methods and uses described herein.

Otros aspectos y realizaciones de la invención resultarán evidentes en la siguiente descripción detallada.Other aspects and embodiments of the invention will be apparent in the following detailed description.

Leyendas de las figurasLegends of the figures

Figura 1. Casetes de expresión de Cas9 y ARNgm. A y B: Cas9 de Neisseria meningitidis (NMCas9) se clonó bajo un promotor sintético específico muscular (C5-12) o un promotor ubicuo (EFS: EF-1a más corto). Int: intrón quimérico; NLS: señal de localización nuclear; HA: epítopo hemaglutinina de influenza humana; 3XFLAG: 3 epítopos FLAG en tándem; SVpoliA: señal de poliadenilación del virus 40 del simio. C y D: casete de expresión para dos ARNgm, ambos bajo el control del promotor U6 pero que contiene diferentes sitios de clonación para el protoespaciador de ARNgm, BbsI y BspMI. Una secuencia codificante de GFP nuclear (AcGFP) bajo el promotor desmina (Des) también se encuentra presente en el constructo D.Figure 1. Cas9 and mRNA expression cassettes. A and B: Cas9 of Neisseria meningitidis (NMCas9) was cloned under a specific muscle-specific promoter (C5-12) or a ubiquitous promoter (SAI: shorter EF-1a). Int: chimeric intron; NLS: nuclear location signal; HA: human influenza hemagglutinin epitope; 3XFLAG: 3 FLAG epitopes in tandem; SVpoliA: polyadenylation signal of simian virus 40. C and D: expression cassette for two mRNAs, both under the control of the U6 promoter but containing different cloning sites for the mRNA, BbsI and BspMI proto - spacer. A nuclear GFP (AcGFP) coding sequence under the demin (Des) promoter is also present in the D construct.

Figura 2. Detección de NMCas9 en líneas celulares. Análisis de transferencia western de NMCas9 (PM: 130,6 KDa) expresado en células HeLa (carriles 1 a 4) y C2C12 (carriles 5 a 7) transfectadas con plásmido de control ((-); carril 1: pC512-Int-smSV40; carriles 2 y 5: pEFS-Int-SVpolyA)) o con un plásmido que aloja NMCas9 (carriles 3 y 6: pC512-Int-NMCas9-smSVpolyA, ver la fig. 1 constructo A; carriles 4 y 7: pEFS-Int-NMCas9-SVpolyA, ver la fig. 1 constructo B). La detección específica de la proteína se llevó a cabo con un anticuerpo dirigido contra los 3 epítopos FLAG en tándem situados en el extremo C-terminal de la proteína. HeLa: línea celular de carcinoma epitelial humano; C2C12: línea celular de mioblastos de ratón; C5-12: promotor específico muscular sintético; EFS: promotor ubicuo más corto EF-1a.Figure 2. Detection of NMCas9 in cell lines. Western blot analysis of NMCas9 (PM: 130.6 KDa) expressed in HeLa cells (lanes 1 to 4) and C2C12 (lanes 5 to 7) transfected with control plasmid ((-); lane 1: pC512-Int-smSV40 ; lanes 2 and 5: pEFS-Int-SVpolyA)) or with a plasmid that houses NMCas9 (lanes 3 and 6: pC512-Int-NMCas9-smSVpolyA, see Fig. 1 construct A; lanes 4 and 7: pEFS-Int -NMCas9-SVpolyA, see fig. 1 construct B). Specific protein detection was carried out with an antibody directed against the 3 tandem FLAG epitopes located at the C-terminal end of the protein. HeLa: human epithelial carcinoma cell line; C2C12: mouse myoblast cell line; C5-12: synthetic muscle specific promoter; SAI: shortest ubiquitous promoter EF-1a.

Figura 3. Región genómica circundante a las repeticiones de CTG del gen DMPK. La secuencia de las dianas de ADN genómico (protoespaciadores) 1, 7, E y N está subrayada; los PAM (motivos contiguos a protoespaciador) respectivos están circundados por un rectángulo. La repetición de CTG se destaca en negrita. Las posiciones de los cebadores utilziados para amplificar por PCR esta región también están subrayados. Cromosoma: 19; cadena: menos; posición: 46.272.967(inicio) - 46.273.898(final); referencia genómica humana: feb.2009 (GRCh37/hg19).Figure 3. Genomic region surrounding the CTG repeats of the DMPK gene. The sequence of genomic DNA targets (proto-spacers) 1, 7, E and N is underlined; the respective PAMs (contiguous motospaciador motives) They are surrounded by a rectangle. The repetition of CTG is highlighted in bold. The positions of the primers used to amplify this region by PCR are also underlined. Chromosome: 19; chain: less; position: 46,272,967 (start) - 46,273,898 (end); Human genomic reference: Feb. 2009 (GRCh37 / hg19).

Figura 4. Detección de la región genómica que contiene la deleción de CTG. La región 3'UTR de DMPK se amplificó por PCR a partir de ADNg extraído de células HeLa o HEK 293T (no mostradas) con los cebadores F1- y R1-DMPK-3'UTR (mostrados en la fig. 3). Las células han sido transfectadas únicamente con EFS-NMCas9 (Cas9) o cotransfectadas con EFS-NMCas9 y los ARNgm indicados (Cas9 ARNgm no específicos, p’->8’; Cas9 ARNgm, p->8) y se recolectaron 48 horas después. Los productos de PCR de longitud completa y los que contiene la deleción de CTG se indican con una flecha verde y una flecha roja, respectivamente. Los tamaños esperados de los productos de PCR se muestran en la Tabla 2. Los ARNgm no específicos presentan como diana una secuencia desplazada cuatro nucleótidos en comparación con la que secuencia diana del ARNgm correspondiente (N²⁴del ARNgm no específico corresponde a N²⁰del ARNgm).Figure 4. Detection of the genomic region that contains the CTG deletion. The 3'UTR region of DMPK was amplified by PCR from gDNA extracted from HeLa or HEK 293T cells (not shown) with primers F1- and R1-DMPK-3'UTR (shown in Fig. 3). Cells have been transfected only with EFS-NMCas9 (Cas9) or co-transfected with EFS-NMCas9 and the indicated mRNAs (Cas9 non-specific mRNA, p '->8'; Cas9 mRNA, p-> 8) and collected 48 hours later . Full length PCR products and those contained in the CTG deletion are indicated by a green arrow and a red arrow, respectively. The expected sizes of the PCR products are shown in Table 2. Non-specific mRNAs have a four nucleotide shifted sequence as a target compared to which the corresponding mRNA target sequence (N ²⁴ of the nonspecific mRNA corresponds to N ²⁰ of the mRNA ).

Figura 5. La deleción de la expansión de repeticiones de CTG de células primarias procedentes de pacientes de DM1. Se transfectaron células primarias fetales procedentes de un individuo de control (Ctrl) y de un paciente de DM1 que alojaba 200 repeticiones de CTG (DM200), con un plásmido de control de GFP, carril 1, o se cotransfectaron con los ARNgm y (constructo pAAV-Des-AcGFP-U6sgRNA-NM-7E-DMPK) y EFS-NMCas9 (constructo pEFS-Int-NMCas9-SVpolyA), carriles 2 y 3. Se recolectaron las células dos días después de la transfección y se extrajo el ADNg a partir de las células separadas como positivas para GFP. La región 3’UTR de DMPK se amplificó por PCR tal como en la fig. 4. Los productos de PCR de longitud completa y parcial y los productos de PCR que contienen las deleciones de CTG se indican con una flecha verde, una flecha azul y una flecha roja, respectivamente. Los tamaños esperados de productos de PCR se muestran en la Tabla 2.Figure 5. Deletion of the expansion of CTG repeats of primary cells from DM1 patients. Fetal primary cells from a control individual (Ctrl) and a DM1 patient that housed 200 CTG repeats (DM200) were transfected with a GFP control plasmid, lane 1, or co-transfected with mRNAs and (construct pAAV-Des-AcGFP-U6sgRNA-NM-7E-DMPK) and EFS-NMCas9 (pEFS-Int-NMCas9-SVpolyA construct), lanes 2 and 3. The cells were harvested two days after transfection and the gDNA was extracted at from separate cells as positive for GFP. The 3’UTR region of DMPK was amplified by PCR as in fig. 4. Full and partial length PCR products and PCR products containing CTG deletions are indicated by a green arrow, a blue arrow and a red arrow, respectively. The expected sizes of PCR products are shown in Table 2.

Figura 6. Secuenciación de la región genómica que contiene la deleción de CTG. El ADNg extraído a partir de las células HEK 293T transfectadas con EFS-NMCas9 (constructo pEFS-Int-NMCas9-SVpoliA) y las parejas de ARNgm indicadas (p:1 y N; 8: 7 y N) se amplificaron por PCR y se subclonaron en un plásmido. Los clones individuales se secuenciaron mediante secuenciación estándar (Beckman Coulter Genomics) y se alinearon sus secuencias con la secuencia original de tipo silvestre para mostrar las posiciones de corte. La mayoría de los clones presentaban un corte entre el 3° y 4° nucleótido de las dianas contiguas a la secuencia de PAM (indicadas mediante las flechas negras).Figure 6. Sequencing of the genomic region that contains the CTG deletion. The gDNA extracted from HEK 293T cells transfected with EFS-NMCas9 (pEFS-Int-NMCas9-SVpoliA construct) and the indicated mRNA pairs (p: 1 and N; 8: 7 and N) were amplified by PCR and were subcloned into a plasmid. The individual clones were sequenced by standard sequencing (Beckman Coulter Genomics) and their sequences were aligned with the original wild-type sequence to show the cutting positions. Most of the clones had a cut between the 3rd and 4th nucleotide of the targets adjacent to the PAM sequence (indicated by black arrows).

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

Los inventores en la presente memoria muestran que el sistema CRISPR-Cas9 puede utilizarse eficientemente para escindir repeticiones de nucleótidos del ADN genómico, proporcionando de esta manera una potente herramienta para el tratamiento de los trastornos por expansión de repeticiones de nucleótidos tal como la distrofia miotónica.The inventors herein show that the CRISPR-Cas9 system can be efficiently used to cleave nucleotide repeats from genomic DNA, thereby providing a potent tool for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders such as myotonic dystrophy.

Por consiguiente, en un primer aspecto se describe en la presente memoria:Accordingly, in a first aspect it is described herein:

(i) Una molécula de ARNgm que es capaz de unir mediante apareamiento de bases el complemento de secuencia a una secuencia diana (protoespaciador) en el ADN genómico, que está situado 5’ respecto a una repetición de nucleótidos localizada dentro de una región no codificante de un gen de interés,(i) An mRNA molecule that is capable of linking the sequence complement to a target sequence (proto-spacer) in the genomic DNA by base pairing, which is located 5 'relative to a nucleotide repeat located within a non-coding region of a gene of interest,

(ii) Una molécula de ARNgm que es capaz de unirse mediante apareamiento de bases al complemento de secuencia a una secuencia diana (protoespaciador) en el ADN genómico que está situado 3’ respecto a una repetición de nucleótidos localizada dentro de una región no codificante de un gen de interés, y(ii) An mRNA molecule that is capable of binding by base pairing to the sequence complement to a target sequence (proto-spacer) in the genomic DNA that is located 3 'relative to a nucleotide repeat located within a non-coding region of a gene of interest, and

(iii) Una pareja de moléculas de ARNgm cada una de las cuales es capaz de unirse mediante apareamiento de bases secuencias que complementan las secuencias diana en el ADN genómico que están situadas 5’ y 3’, respectivamente, respecto a una repetición de nucleótidos situada dentro de una región no codificante de un gen de interés.(iii) A pair of mRNA molecules each of which is capable of binding by base pairing sequences that complement the target sequences in the genomic DNA that are located 5 'and 3', respectively, relative to a nucleotide repeat located within a non-coding region of a gene of interest.

Sistema CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9 system

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente (CRISPR, por sus siglas en inglés) de tipo II es una tecnología de endonucleasa guiada por ARN que ha emergido recientemente como prometedora herramienta de edición genómica. Existen dos componentes diferenciados en este sistema: (1) un ARN guía y (2) una endonucleasa, en este caso la nucleasa asociada a CRISPR (Cas, por sus siglas en inglés), Cas9. El ARN guía es una combinación de ARN de CRISPR bacteriano (ARNcr) y un ARNcr trans-activador (ARNtracr) construido en un ARN guía monocatenario (ARNgm) quimérico (Jinek et al., Science 337(6096):816-21, 7 de agosto de 2012). El ARNgm combina la especificidad de reconocimiento del ARNcr con las propiedades de andamiaje del ARNtracr en un único transcrito. Al expresarse el ARNgm y Cas9 en la célula, la secuencia diana genómica puede modificarse o interrumpirse permanentemente.The regularly grouped and spaced short palindromic repetition (CRISPR) type II system is an RNA-guided endonuclease technology that has recently emerged as a promising genomic editing tool. There are two differentiated components in this system: (1) a guide RNA and (2) an endonuclease, in this case the nuclease associated with CRISPR (Cas, for its acronym in English), Cas9. The guide RNA is a combination of bacterial CRISPR RNA (rRNA) and a trans-activator rRNA (RNAcr) constructed in a chimeric single stranded guide RNA (mRNA) (Jinek et al., Science 337 (6096): 816-21, 7 August 2012). MRNA combines the specificity of recognition of the rRNA with the scaffolding properties of the tRNA in a single transcript. By expressing mRNA and Cas9 in the cell, the genomic target sequence can be modified or permanently interrupted.

El complejo ARNgm/Cas9 es atraído a la secuencia diana por el apareamiento de bases entre la secuencia guía ARNgm y el complemento de la secuencia diana en el ADN genómico (protoespaciador). Para la unión con éxito de Cas9, la secuencia diana genómica también debe contener la secuencia de motivo contiguo a protoespaciador (PAM) correcta inmediatamente después de la secuencia diana. La unión del complejo ARNgm/Cas9 localiza Cas9 en la secuencia diana genómica de manera que la endonucleasa Cas9 pueda cortar ambas cadenas de ADN, provocando una rotura de doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés). Cas9 cortará 3-4 nucleótidos cadena arriba de la secuencia de PAM. De acuerdo con el sistema implementado en la presente invención, el DSB a continuación puede ser reparada mediante la ruta de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés).The mRNA / Cas9 complex is attracted to the target sequence by base pairing between the mRNA guide sequence and the complement of the target sequence in the genomic DNA (proto-spacer). For successful binding of Cas9, the genomic target sequence must also contain the correct proto-spacer motif (PAM) sequence immediately after the target sequence. The binding of the mRNA / Cas9 complex locates Cas9 in the genomic target sequence so that the Cas9 endonuclease can cut both strands of DNA, causing a double chain break (DSB). Cas9 will cut 3-4 nucleotides upstream of the PAM sequence. In accordance with the system implemented in the present invention, the DSB can then be repaired by the non-homologous end junction repair path (NHEJ).

La presente invención implementa este potente sistema de una manera innovadora, a fin de escindir secuencias de repeticiones que se ha informado que están asociadas a varias enfermedades o trastornos.The present invention implements this powerful system in an innovative manner, in order to cleave repetition sequences that have been reported to be associated with various diseases or disorders.

Endonucleasa Cas9Cas9 endonuclease

Los mecanismos de reconocimiento de ADN del sistema CRISPR-Cas de tipo II implican un ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 para cortar el ADN diana de una manera específica de secuencia, dependiente de la presencia de un motivo contiguo a protoespaciador (PAM) en el ADN diana.The DNA recognition mechanisms of the CRISPR-Cas type II system involve a guide RNA that directs the Cas9 endonuclease to cut the target DNA in a sequence specific manner, depending on the presence of a proto-spacer motif (PAM) in the Target DNA

La secuencia de PAM varía dependiendo de la especie de bacteria a partir de la que se ha obtenido la endonucleasa Cas9. Entre las secuencias de PAM de consenso se incluyen PAM tanto primarias como secundarias, las cuales puede considerarse que identifican secuencias de interés dentro del gen diana de interés. La tabla a continuación proporciona una lista de secuencias de PAM para algunas endonucleasas Cas9 obtenidas de diferentes especies.The PAM sequence varies depending on the species of bacteria from which the Cas9 endonuclease has been obtained. Consensus PAM sequences include both primary and secondary PAMs, which can be considered to identify sequences of interest within the target gene of interest. The table below provides a list of PAM sequences for some Cas9 endonucleases obtained from different species.

En una realización particular de la invención, la endonucleasa Cas9 utilizada en la invención se deriva de S. pyogenes, S. thermophilus, N. meningitidis, S. mutans, C. jejuni, F. novicida, S. aureus, P. multocida, P. bettyae, H. parainfluenzae, H. pittmaniae o L. crispatus. En una realización específica, en la que la expansión de repeticiones de nucleótidos para escindir se encuentra presente en la región 3' no traducida del gen DMPK, la endonucleasa Cas9 se obtiene de N. meningitidis, S. aureus, S. thermophilus o C. jejuni (Zhang et al., Mol. Cell 50(4):488-503, 23 de mayo de 2013; Hou et al., 24 de sept. de 2013, 110(39):15644-9).In a particular embodiment of the invention, the Cas9 endonuclease used in the invention is derived from S. pyogenes, S. thermophilus, N. meningitidis, S. mutans, C. jejuni, F. novicida, S. aureus, P. multocida, P. bettyae, H. parainfluenzae, H. pittmaniae or L. crispatus. In a specific embodiment, in which the expansion of nucleotide repeats for cleavage is present in the 3 'untranslated region of the DMPK gene, the Cas9 endonuclease is obtained from N. meningitidis, S. aureus, S. thermophilus or C. jejuni (Zhang et al., Mol. Cell 50 (4): 488-503, May 23, 2013; Hou et al., Sept. 24, 2013, 110 (39): 15644-9).

ARN guíaGuide RNA

En la presente memoria se describen ARN guía monocatenarios (o ARNgm) que están diseñados específicamente para la escisión de una expansión de repeticiones de trinucleótidos.Single-stranded guide RNA (or mRNA) that are specifically designed for the cleavage of an expansion of trinucleotide repeats are described herein.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el ARNgm es la parte del sistema CRISPR-Cas9 que proporciona especificidad de reconocimiento de ADN genómico al sistema. La secuencia de ADN genómico diana comprende 15 a 40 nucleótidos, en particular 20 a 30 nucleótidos, en particular 22 a 26 nucleótidos, tal como 22, 23, 24, 25, 26 nucleótidos, dependiendo de la endonucleasa Cas9 específica utilizada en el sistema, seguido de un motivo contiguo a protoespaciador (PAM) tal como se descrito anteriormente. En una realización particular, la molécula de ARNgm comprende una secuencia de ARN guía que es complementaria a la secuencia del complemento de una secuencia genómica de 15 a 40 nucleótidos, en particular de 20 a 30 nucleótidos, en particular de 22 a 26 nucleótidos, tal como 22, 23, 24, 25, 26 nucleótidos, más específicamente de 24 nucleótidos, que precede a un PAM dentro de la región no codificante diana del gen de interés. En una realización particular, la secuencia de ARN guía es idéntica, o al menos 80% idéntica, preferentemente al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99% idéntica a dicha secuencia genómica y es capaz de hibridarse con la secuencia de complemento de dicha secuencia genómica de 15 a 40 nucleótidos, en particular de 20 a 30 nucleótidos, en particular de 22 a 26 nucleótidos, tal como 22, 23, 24, 25, 26 nucleótidos, más específicamente a 24 nucleótidos que preceden a PAM dentro de la región no codificante diana del gen de interés. Tal como es conocido por el experto en la materia, el ARNgm no contiene el motivo PAM y, en consecuencia, no une el complemento de secuencia a PAM. La secuencia diana puede encontrarse en cualquiera de las cadenas del ADN genómico, dentro de una región no codificante de un gen de interés. As mentioned above, mRNA is the part of the CRISPR-Cas9 system that provides genomic DNA recognition specificity to the system. The target genomic DNA sequence comprises 15 to 40 nucleotides, in particular 20 to 30 nucleotides, in particular 22 to 26 nucleotides, such as 22, 23, 24, 25, 26 nucleotides, depending on the specific Cas9 endonuclease used in the system, followed by a motif adjacent to the proto-spacer (PAM) as described above. In a particular embodiment, the mRNA molecule comprises a guide RNA sequence that is complementary to the complement sequence of a genomic sequence of 15 to 40 nucleotides, in particular 20 to 30 nucleotides, in particular 22 to 26 nucleotides, such such as 22, 23, 24, 25, 26 nucleotides, more specifically 24 nucleotides, which precedes a PAM within the non-coding region of the target gene of interest. In a particular embodiment, the guide RNA sequence is identical, or at least 80% identical, preferably at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or at least 99% identical to said genomic sequence. and is capable of hybridizing with the complement sequence of said genomic sequence of 15 to 40 nucleotides, in particular 20 to 30 nucleotides, in particular 22 to 26 nucleotides, such as 22, 23, 24, 25, 26 nucleotides, more specifically 24 nucleotides that precede PAM within the non-coding target region of the gene of interest. As is known to the person skilled in the art, the mRNA does not contain the PAM motif and, consequently, does not bind the sequence complement to PAM. The target sequence can be found in any of the genomic DNA chains, within a non-coding region of a gene of interest.

En una realización particular, el PAM y al menos 4 nucleótidos cadena arriba de PAM se encuentran en la región no codificante del gen de interés. En una realización particular adicional, la secuencia diana entera y el PAM se encuentran en la región no codificante del gen de interés.In a particular embodiment, the PAM and at least 4 upstream PAM nucleotides are in the non-coding region of the gene of interest. In a further particular embodiment, the entire target sequence and the PAM are in the non-coding region of the gene of interest.

Se encuentran disponibles herramientas bioinformáticas para identificar las secuencias de ADN genómico diana que comprenden el PAM o los PAM apropiados, dependiendo del origen de la endonucleasa Cas9 utilizado en la práctica de la invención, y la secuencia de hibridación, tales como las proporcionadas mediante las herramientas de internet siguientes: CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html), CasFinder (http://arep.med.harvard.edu/CasFinder/), y CRISPOR (http://tefor.net/crispor/crispor.cgi). El experto en la materia también puede hacer referencia a Doench et al., Nat. Biotechnol. 32(12):1262-7, dic. de 2014, o Prykhozhij et al., PLoS One 10(3):e0119372, 5 de marzo de 2015, y pueden encontrar más información y recursos sobre el sistema CRISPR-Cas9 y sobre la identificación de ADN genómico diana que comprende el PAM o los PAM apropiados en el sitio de internet siguiente: http://www.cnb.csic.es/~montoliu/CRISPR/. Las secuencias de PAM pueden identificarse alternativamente mediante la utilización de dicha secuencia como pregunta en herramientas de alineación de secuencias, tales como el algoritmo BLAST o FASTA, dentro de un gen de interés.Bioinformatic tools are available to identify the genomic target DNA sequences comprising the appropriate PAM or PAM, depending on the origin of the Cas9 endonuclease used in the practice of the invention, and the hybridization sequence, such as those provided by the tools. Internet links: CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html), CasFinder (http: // arep .med.harvard.edu / CasFinder /), and CRISPOR (http://tefor.net/crispor/crispor.cgi). The person skilled in the art can also refer to Doench et al., Nat. Biotechnol. 32 (12): 1262-7, Dec. of 2014, or Prykhozhij et al., PLoS One 10 (3): e0119372, March 5, 2015, and can find more information and resources on the CRISPR-Cas9 system and on the identification of target genomic DNA comprising PAM or Appropriate PAMs on the following website: http://www.cnb.csic.es/~montoliu/CRISPR/. PAM sequences can alternatively be identified by using said sequence as a question in sequence alignment tools, such as the BLAST or FASTA algorithm, within a gene of interest.

Tal como es bien conocido, un ARNgm es una fusión de un ARNcr y un ARNtracr que proporciona tanto especificidad de reconocimiento de diana (proporcionada por el apareamiento de bases de la secuencia guía con la secuencia del complemento de la secuencia diana de ADN genómico) como andamiaje/capacidad de unión a una nucleasa Cas9. En una realización, la fracción ARNtracr y la endonucleasa Cas9 seleccionada se derivan del mismo subgrupo filogénico. Se describe un árbol filogénico de ortólogos de Cas9 representativos en particular en Fonfara et al., Nucleic Acids Res. 42(4):2577-90, feb. de 2014. A título de realización ilustrativa, pueden citarse componentes derivados de un sistema CRISPR-Cas de tipo II bacteriano II-A, II-B o II-C. Por ejemplo, el ARNtracr puede obtenerse de N. meningitidis, C. jejuni o P. multocida y la endonucleasa Cas9 implementada se deriva de N. meningitidis. En una realización específica, la fracción de ARNtracr y la endonucleasa Cas9 seleccionada se corresponden, en el sentido de que ambas se derivan de la misma especie para funcionar juntas. Por ejemplo, el ARNtracr y la endonucleasa Cas9 se derivan ambas de S. pyogenes, S. thermophilus, N. meningitidis, S. mutans, C. jejuni, F. novicida, S. aureus, P. multocida, P. bettyae, H. parainfluenzae, H. pittmaniae o L. crispatus en una realización particular de la invención. Más particularmente, tanto la fracción de ARNtracr como la endonucleasa Cas9 se obtienen de N. meningitidis. As is well known, an mRNA is a fusion of an rRNA and an RNAcrcr that provides both target recognition specificity (provided by base pairing of the guide sequence with the complement sequence of the genomic DNA target sequence) and scaffolding / binding capacity to a Cas9 nuclease. In one embodiment, the RNAtracr fraction and the selected Cas9 endonuclease are derived from the same phylogenic subgroup. A phylogenetic tree of orthologs of Cas9 representative in particular is described in Fonfara et al., Nucleic Acids Res. 42 (4): 2577-90, feb. 2014. By way of illustration, components derived from a bacterial type II CRISPR-Cas system II-A, II-B or II-C may be cited. For example, the RNAcrcr can be obtained from N. meningitidis, C. jejuni or P. multocida and the implemented Cas9 endonuclease is derived from N. meningitidis. In a specific embodiment, the tRNA fraction and the selected Cas9 endonuclease are matched, in the sense that both are derived from the same species to function together. For example, RNAcrcr and Cas9 endonuclease are derived both from S. pyogenes, S. thermophilus, N. meningitidis, S. mutans, C. jejuni, F. novicida, S. aureus, P. multocida, P. bettyae, H Parainfluenzae, H. pittmaniae or L. crispatus in a particular embodiment of the invention. More particularly, both the RNAcrcr fraction and the Cas9 endonuclease are obtained from N. meningitidis.

Se encuentran disponibles kits y herramientas de biología molecular, tales como los plásmidos apropiados, para producir fácilmente un ARNgm de la especificidad deseada en términos de tanto la secuencia diana de a Dn genómico como de la endonucleasa Cas9. Por ejemplo, se encuentran disponibles varios plásmidos y herramientas de Addgene. En una realización particular, el ARNgm o la pareja de ARNgm se expresan a partir de un plásmido bajo el control de un promotor U6. En una realización particular, ambos ARNgm de la pareja de ARNgm de la invención se expresan a partir de un único casete de expresión que contiene los dos andamiajes de ARNgm, cada uno bajo el control de un promotor, en particular el promotor U6, en el mismo vector (por ejemplo, en el mismo plásmido o en el mismo genoma vírico recombinante, tal como en un genoma de VAA). En una realización particular, los dos andamiajes de ARNgm se proporcionan en posición inversa o en tándem, en particular en tándem. En otra realización, el gen codificante de la endonucleasa Cas9 se liga operablemente a un promotor, tal como un promotor inducible o constitutivo, en particular un promotor ubicuo o específico de tejido, en particular un promotor específico muscular. Entre los promotores ubicuos se incluyen, por ejemplo, el promotor EFS, CMV o CAG. Entre los promotores específicos musculares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el promotor creatín-quinasa muscular (m Ck , por sus siglas en inglés), el promotor desmina o el promotor C5.12 sintético, tal como es bien conocido de la técnica. Además, el promotor utilizado para la expresión de la endonucleasa Cas9 puede ser un promotor inducible, tal como un promotor inducible por tetraciclina, por tamoxifeno o por ecdisona.Molecular biology kits and tools, such as appropriate plasmids, are readily available to easily produce an mRNA of the desired specificity in terms of both the genomic Dn target sequence and the Cas9 endonuclease. For example, several plasmids and Addgene tools are available. In a particular embodiment, the mRNA or the mRNA pair is expressed from a plasmid under the control of a U6 promoter. In a particular embodiment, both mRNAs of the mRNA pair of the invention are expressed from a single expression cassette containing the two mRNA scaffolds, each under the control of a promoter, in particular the U6 promoter, in the same vector (for example, in the same plasmid or in the same recombinant viral genome, such as in a VAA genome). In a particular embodiment, the two mRNA scaffolds are provided in reverse or tandem position, particularly in tandem. In another embodiment, the Cas9 endonuclease coding gene is operably linked to a promoter, such as an inducible or constitutive promoter, in particular a ubiquitous or tissue specific promoter, in particular a specific muscle promoter. Ubiquitous promoters include, for example, the EFS, CMV or CAG promoter. Specific muscle promoters include, but are not limited to, the muscle creatine kinase promoter (m Ck), the desmin promoter or the synthetic C5.12 promoter, as is well known in the art. . In addition, the promoter used for the expression of Cas9 endonuclease can be an inducible promoter, such as a tetracycline, tamoxifen or ecdysone inducible promoter.

En una realización particular, cada uno de la primera y segunda moléculas de ARNgm es complementario a una región situada 5' y 3' respecto a la expansión de repeticiones de nucleótidos que debe extraerse, respectivamente. De esta manera, las moléculas de ARNgm se diseñan para unirse específicamente a regiones situadas cadena arriba y cadena debajo de la expansión de repeticiones de nucleótidos, encontrándose el PAM, y al menos 4 nucleótidos situados cadena arriba del PAM, en la región no codificante del gen de interés y preferentemente en donde la secuencia diana entera y el PAM se encuentran dentro de una región no codificante del gen de interés. La distancia de la secuencia diana (región de homología PAM) de la región escindida puede no ser crítica, aunque a fin de minimizar la desestabilización de la estructura génica, la secuencia diana puede seleccionarse de manera que se encuentre a menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o menos de 10 nucleótidos del extremo considerado de la expansión de repeticiones de nucleótidos. Por ejemplo, considerando el ARNgm que se diseña para dirigir la inducción de un DSB situado 5' respecto a la expansión de repeticiones de nucleótidos, el nucleótido más 3' del PAM de la secuencia diana se encuentra a menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o a menos de 10 nucleótidos del nucleótido más 5' del primer (en dirección 5' a 3') nucleótido de la expansión de repeticiones de nucleótidos que debe escindirse. Además, considerando el ARNgm que está diseñado para dirigir la inducción de un DSB 3' respecto a la expansión de repeticiones de nucleótidos, el nucleótido más 5' de la región de homología de la secuencia diana se encuentra a menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o a menos de 10 nucleótidos del nucleótido más 3' del último (en dirección 5' a 3') nucleótido de la expansión de repeticiones de nucleótidos que debe escindirse. Preferentemente, en la práctica de la presente invención, al diseñar el ARNgm o los ARNgm descritos en la presente memoria, el experto en la materia evitará la escisión de elementos reguladores conocidos presentes en la secuencia de ADN genómico no codificante en torno a la expansión de repeticiones de nucleótidos que debe escindirse, tal como regiones para el procesamiento/estabilidad del ARN, tal como poliA, regiones de corte y empalme en intrones, etc.In a particular embodiment, each of the first and second mRNA molecules is complementary to a region located 5 'and 3' with respect to the expansion of nucleotide repeats to be extracted, respectively. In this way, mRNA molecules are designed to specifically bind to regions located upstream and chain below the expansion of nucleotide repeats, the PAM being found, and at least 4 nucleotides located upstream of the PAM, in the non-coding region of the gene of interest and preferably where the entire target sequence and PAM are within a non-coding region of the gene of interest. The distance of the target sequence (PAM homology region) from the cleaved region may not be critical, although in order to minimize the destabilization of the gene structure, the target sequence may be selected so that it is less than 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 or less than 10 nucleotides of the considered end of the expansion of nucleotide repeats. For example, considering the mRNA that is designed to direct the induction of a 5 'DSB relative to the expansion of nucleotide repeats, the nucleotide plus 3' of the PAM of the target sequence is less than 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 or less than 10 nucleotides of the nucleotide plus 5 'of the first (in the 5' to 3 'direction) nucleotide of the expansion of nucleotide repeats that must be split. In addition, considering the mRNA that is designed to direct the induction of a 3 'DSB with respect to the expansion of nucleotide repeats, the nucleotide plus 5' of the homology region of the target sequence is less than 500, 400, 300 , 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 or less than 10 nucleotides of the nucleotide plus 3 'of the last (in the 5' to 3 'direction) nucleotide of the expansion of nucleotide repeats that It must be split. Preferably, in the practice of the present invention, when designing the mRNA or mRNAs described herein, the person skilled in the art will avoid cleavage of regulatory elements known present in the non-coding genomic DNA sequence around the expansion of nucleotide repeats to be cleaved, such as regions for RNA processing / stability, such as polyA, intron splicing regions, etc.

En una realización particular, las moléculas de ARNgm están diseñadas para escindir una expansión de repeticiones de trinucleótidos situada dentro de la región 3' no traducida del gen DMPK. En una variante particular de la presente realización, la invención se refiere a una molécula de ARNgm que comprende una secuencia guía seleccionada del grupo que consiste en GCGCUCCCUGAACCCUAGAACUGU (SEQ ID NO:1), ACGGGGCUCGAAGGGUCCUUGUAG (SEQ ID NO:2), UGGGGAGCGUCUGGCGCGAUCUCU (SEQ ID NO:3) y GUCGGGGUCUCAGUGCAUCCAAAA (SEQ ID NO:4).In a particular embodiment, mRNA molecules are designed to cleave an expansion of trinucleotide repeats located within the 3 'untranslated region of the DMPK gene. In a particular variant of the present embodiment, the invention relates to an mRNA molecule comprising a guide sequence selected from the group consisting of GCGCUCCCUGAACCCUAGAACUGU (SEQ ID NO: 1), ACGGGGCUCGAAGGGUCCUUGUAG (SEQ ID NO: 2), UGGGGAGCGUCUGGCGUCUGGCGUCUGGCUGUCGG ID NO: 3) and GUCGGGGUCUCAGUGCAUCCAAAA (SEQ ID NO: 4).

La invención se refiere además a un vector tal como se ha definido anteriormente, que comprende una secuencia codificante de una molécula de ARNgm que comprende una secuencia guía seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 a NO:4.The invention further relates to a vector as defined above, which comprises a sequence encoding an mRNA molecule comprising a guide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to NO: 4.

En otra realización particular, la pareja de moléculas de ARNgm es una pareja de un ARNgm que comprende una secuencia guía seleccionada de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 y de un ARNgm que comprende una secuencia guía seleccionada de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.In another particular embodiment, the mRNA molecule pair is a pair of an mRNA comprising a guide sequence selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and from an mRNA comprising a selected guide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

En una realización particular adicional, el ARNgm utilizado para inducir DSB cadena arriba (o 5') de la región de repeticiones de trinucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:In a further particular embodiment, the mRNA used to induce DSB upstream (or 5 ') of the trinucleotide repeat region is selected from the group consisting of:

- SEQ ID NO:5 (también denominada ARNgm 1 en la parte experimental, secuencia de unión a ADN, es decir, la secuencia guía, subrayada):- SEQ ID NO: 5 (also called mRNA 1 in the experimental part, DNA binding sequence, that is, the guide sequence, underlined):

GCGCUCCCUGAACCCUAGAACUGUGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUUG CUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCU UCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUUGCGCUCCCUGAACCCUAGAACUGUGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUUG CUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCU UCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUU

- SEQ ID NO:6 (también denominada ARNgm 7 en la parte experimental, secuencia de unión a ADN subrayada): GACGGGGCUCGAAGGGUCCUUGUAGGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUU GCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGC UUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUU- SEQ ID NO: 6 (also called mRNA 7 in the experimental part, underlined DNA binding sequence): GACGGGGCUCGAAGGGUCCUUGUAGGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUU GCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUGUUUUUGUU

En una realización particular adicional, el ARNgm utilizado para inducir DSB cadena abajo (o 3') de la región de repeticiones de trinucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:In a further particular embodiment, the mRNA used to induce DSB downstream (or 3 ') of the trinucleotide repeat region is selected from the group consisting of:

- SEQ ID NO:7 (también denominado ARNgm E en la parte experimental, secuencia de unión a ADN subrayada): GUGGGGAGCGUCUGGCGCGAUCUCUGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUU GCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGC UUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUU- SEQ ID NO: 7 (also called ARNgm E in the experimental part, DNA binding sequence underlined): GUGGGGAGCGUCUGGCGCGAUCUCUGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUU GCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGC UUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUU

- SEQ ID NO:8 (también denominado ARNgm N en la parte experimental, secuencia de unión a ADN subrayada): GUCGGGGUCUCAGUGCAUCCAAAAGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUUG CUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCU UCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUU- SEQ ID NO: 8 (also referred ARNgm N in the experimental part, DNA binding sequence underlined): GUCGGGGUCUCAGUGCAUCCAAAAGUUGUAGCUCCCUUUCGAAAGAACCGUUG CUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCU UCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUAUUUUUUUU

La invención se refiere además a un vector tal como se ha definido anteriormente, que comprende una secuencia que codifica una molécula de ARNgm que presenta una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n O:5 a 8.The invention further relates to a vector as defined above, which comprises a sequence encoding an mRNA molecule that has a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to 8.

En otra realización, la pareja de moléculas de ARNgm de la invención es una pareja seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7, y SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:8. En una realización preferente, la pareja de moléculas de ARNgm se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7, y SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:8.In another embodiment, the mRNA molecule pair of the invention is a couple selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8. In a preferred embodiment, the mRNA molecule pair is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el ARNgm de la invención puede expresarse a partir de un casete de expresión. La expresión del ARNgm puede controlarse en particular mediante un promotor, tal como un promotor U6. Por consiguiente, la invención incluye además un casete para la expresión de un ARNgm, que comprende una secuencia codificante de ARNgm situada bajo el control de un promotor, tal como el promotor U6 mostrado en la SEQ ID NO:9.As mentioned above, the mRNA of the invention can be expressed from an expression cassette. The expression of mRNA can be controlled in particular by a promoter, such as a U6 promoter. Accordingly, the invention further includes a cassette for the expression of an mRNA, comprising a mRNA coding sequence located under the control of a promoter, such as the U6 promoter shown in SEQ ID NO: 9.

En una realización particular, el casete de expresión comprende la siguiente secuencia para la expresión del ARNgm mostrado en la SEQ ID NO:5 a partir de un promotor U6:In a particular embodiment, the expression cassette comprises the following sequence for the expression of the mRNA shown in SEQ ID NO: 5 from a U6 promoter:

AGGTCGGGC AGG AAG AGGGCCT ATTT CCCATG ATT CCTTC A T ATTT GC AT AT ACG ATAC AAG G C TG TTAG AG AG ATAATTAG AATTAATTTG ACTG TAAACACAAAG ATA TTAGTACAAAATACG TG ACG TAG AAAG TAATAATTTCTTG G G TAG TTTG CAG TTT T A A A A TT AT GTTTT A A A A T GG AC TAT C AT ATGCTT ACCGTAACTT G AA A G T ATTT C G ATTT CTT GGCTTT AT AT AT CTT GTGGA A AGG ACG A A AC ACCGCGCTCCCT G A AC CCTAGA ACT GTGTTGT AGCTCCCTTT CG A A AG A ACCGTT GCT AC A AT A AGGCCGT CTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCAT CGTTT ATTTTTTTT A A (SEQ ID NO: 10)AGGTCGGGC AGG AAG AGGGCCT ATTT CCCATG ATT CCTTC AT ATTT GC AT AT ACG ATAC AAG GC TG TTAG AG AG ATAATTAG AATTAATTTG ACTG TAAACACAAAG ATA TTAGTACAAATACG TG ACG TAG AAAG TAATAATTTCTTGGG ATGT ATGTGG ATGT ATGTGT ATGTGG AA AGT ATTT CG ATTT CTT GGCTTT AT AT AT CTT GTGGA A AGG ACG AA AC ACCGCGCTCCCT GA AC CCTAGA ACT GTGTTGT AGCTCCCTTT CG AA AG A ACCGTT GCT AC A AT A AGGCCGT CTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTWTWTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGG

En una realización particular, el casete de expresión comprende la siguiente secuencia para la expresión del ARNgm mostrado en la SEQ ID NO:6 a partir de un promotor U6:In a particular embodiment, the expression cassette comprises the following sequence for the expression of the mRNA shown in SEQ ID NO: 6 from a U6 promoter:

AGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG AT AC AAGGCTGTT AGAG AG A TA ATTAG A A TT A A TTT GACT G TAAACAC AA AG AT A TTAG TAC A A A ATACG T G ACGT AG A A AGT A ATA ATTTCTT GGGT AGTTT GCAGTTT T A A A A TT ATGTTTT A A A A T GGACT ATC AT AT GCTT ACCGT A ACTTG A A AGTATTTC GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACGGGGCTCGAA GGGTCCTTGTAGGTTGTAGCTCCCTTTCGAAAGAACCGTTGCTACAATAAGGCCG TCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCA TC G TTTATTTTTTTTAA (SEQ ID NO: 11)AGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG AT AC AAGGCTGTT AGAG AG TA ATTAG AA TT AA TTT STAP G TAAACAC AA AG AT A TTAG TAC AAA ATACG TG ACGT AG AA AGT ATA ATTTCTT GGGT AGTTT GCAGTTT TAAAA TT ATGTTTT AAAAT GGACT ATC AT AT GCTT ACCGT A ACTTG AA AGTATTTC GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACGGGGCTCGAA GGGTCCTTGTAGGTTGTAGCTCCCTTTCGAAAGAACCGTTGCTACAATAAGGCCG TCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCA TC G TTTATTTTTTTTAA (SEQ ID NO: 11)

En una realización particular, el casete de expresión comprende la siguiente secuencia para la expresión del ARNgm mostrado en la SEQ ID NO:7 a partir de un promotor U6:In a particular embodiment, the expression cassette comprises the following sequence for the expression of the mRNA shown in SEQ ID NO: 7 from a U6 promoter:

AG GTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG AT AC A AGGCT GTT AG AG AG AT A ATTAG A ATT A A TTT GACT GT A A ACAC A A AG AT A TTAG TACAAAATACG TG ACG TAG AAAG TAATAATTTCTTG G G TAG TTTG CAG TTT T A A A A T T ATG TTTT AAAATG G AC TATC ATATG CTT ACCG TAACTTG AAAG TATTTC GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGGGGAGCGTCT GGCGCGATCTCTGTTGTAGCTCCCTTTCGAAAGAACCGTTGCTACAATAAGGCCG TCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCA TCGTTT ATTTTTTTT A A (SEQ ID NO :12).AG GTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG AT AC A AGGCT GTT AG AG AG AT A ATTAG A ATT AA TTT GACT GT AA ACAC AA AG AT A TTAG TACAAAATACG TG ACG TAG AAAG TAATAATTTCTTG GG TAG TATT ATTTATGATG ATG TAGTT TAGTT ATG ATG TAG TATT ATG ATG ATG TAGTT ATG ATG TAG ATT TAGTG ATG TAG ATTTATGATG ATG TAG ATTTTATGATG ATG TAGTT TAGTT TAGTT ATGTG TAGTT TAGTT ATGTG TAGTT ATTTGATG TAGTT ATGTG TAGTT TAGTG TAGTT ATTTGTG TAGTT TAGA TAGTT ATTTGTGGGGGCGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG AG GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGGGGAGCGTCT GGCGCGATCTCTGTTGTAGCTCCCTTTCGAAAGAACCGTTGCTACAATAAGGCCG TCTGAAAAGATGTGCCGCAACTGTGTGTTTTTTTTTGTGTGTGTGTTGTGT

En una realización particular, el casete de expresión comprende la siguiente secuencia para la expresión del ARNgm mostrado en la SEQ ID NO:8 a partir de un promotor U6: In a particular embodiment, the expression cassette comprises the following sequence for the expression of the mRNA shown in SEQ ID NO: 8 from a U6 promoter:

AGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG

AT ACAAGGCTGTT AG AG AG ATAATTAG A A TT AA TTT G ACT GTAAACAC AA AG A T A AT ACAAGGCTGTT AG AG AG ATAATTAG A A TT AA TTT G ACT GTAAACAC AA AG A T A

TTAGTACAAAATACGTGACG TAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTG CAGTTT TTAGTACAAAATACGTGACG TAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTG CAGTTT

TAAAATTATG TTTTAAAATG G ACTATCATATG CTTACCG TAACTTG AAAG TATTTC TAAAATTATG TTTTAAAATG G ACTATCATATG CTTACCG TAACTTG AAAG TATTTC

GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGGGGTCTCAG GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGGGGTCTCAG

T GCATCC A A A AGTT GT AGCTCCCTTTCGA A AGA ACCGTT GCT ACA AT A AGGCCGT T GCATCC A A A AGTT GT AGCTCCCTTTCGA A AGA ACCGTT GCT ACA AT A AGGCCGT

CTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCAT CTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCAT

CGTTT ATTTTTTTT A A (SEQ ID NO :13).CGTTT ATTTTTTTT A A (SEQ ID NO: 13).

En las SEQ ID NO:11 y 12 tal como se han representado anteriormente, se introdujo la base G subrayada debido a que se requiere una G para iniciar la transcripción a partir del promotor U6. Sin embargo, el experto en la materia entenderá que otros promotores pueden no requerir una G en esta posición inmediatamente antes de la secuencia codificante guía, o pueden requerir una o más otras bases nucleótidas, tal como es bien conocido en la técnica. In SEQ ID NO: 11 and 12 as depicted above, the underlined G base was introduced because a G is required to initiate transcription from the U6 promoter. However, the person skilled in the art will understand that other promoters may not require a G in this position immediately before the guide coding sequence, or they may require one or more other nucleotide bases, as is well known in the art.

Métodos y usos de la invenciónMethods and uses of the invention

La presente invención contempla diversas maneras de alcanzar una secuencia diana de ADN genómico con una endonucleasa Cas9 y moléculas de ARNgm. En algunas realizaciones, la endonucleasa Cas9 se introduce dentro de una célula en una forma polipeptídica. En una variante, la endonucleasa Cas9 se conjuga o se fusiona con un péptido de penetración celular, que es un péptido que facilita la incorporación de una molécula en una célula. Las moléculas de ARNgm pueden administrarse además en la célula como oligonucleótido aislado, directamente o utilizando reactivos de transfección, tal como derivados lipídicos, liposomas, fosfato de calcio, nanopartículas, microinyección o electroporación.The present invention contemplates various ways of achieving a genomic DNA target sequence with a Cas9 endonuclease and mRNA molecules. In some embodiments, the Cas9 endonuclease is introduced into a cell in a polypeptide form. In a variant, the Cas9 endonuclease is conjugated or fused with a cell penetration peptide, which is a peptide that facilitates the incorporation of a molecule into a cell. The mRNA molecules can also be administered in the cell as an isolated oligonucleotide, directly or using transfection reagents, such as lipid derivatives, liposomes, calcium phosphate, nanoparticles, microinjection or electroporation.

En otra realización, la presente invención contempla introducir la endonucleasa Cas9 y/o moléculas de ARNgm en la célula diana en forma de un vector que expresa dicha endonucleasa y/o moléculas de ARNgm. Los métodos de introducción y expresión de genes en una célula son conocidos en la técnica. El vector de expresión puede transferirse dentro de una célula anfitriona por medios físicos, químicos o biológicos. El vector de expresión puede introducirse en la célula utilizando métodos físicos conocidos, tales como la precipitación con fosfato de calcio, la lipofección, el bombardeo con partículas, la microinyección y la electroporación. Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula anfitriona incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y derivados lipídicos y liposomas. En otras realizaciones, la endonucleasa Cas9 y/o las moléculas de ARNgm se introducen por medios biológicos, en particular mediante un vector vírico. Entre los vectores víricos representativos útiles en la práctica de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un vector derivado de adenovirus, retrovirus, en particular lentivirus, poxvirus, virus del herpes simplex tipo 1 y virus adenoasociados (VAA). La selección del vector vírico apropiado evidentemente dependerá de la célula diana y del tropismo vírico.In another embodiment, the present invention contemplates introducing the Cas9 endonuclease and / or mRNA molecules into the target cell in the form of a vector expressing said endonuclease and / or mRNA molecules. Methods of introducing and expressing genes in a cell are known in the art. The expression vector can be transferred into a host cell by physical, chemical or biological means. The expression vector can be introduced into the cell using known physical methods, such as calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection and electroporation. Chemical means for introducing a polynucleotide into a host cell include colloidal dispersion systems, such as complexes of macromolecules, nanocapsules, microspheres, beads and lipid derivatives and liposomes. In other embodiments, the Cas9 endonuclease and / or mRNA molecules are introduced by biological means, in particular by a viral vector. Representative viral vectors useful in the practice of the invention include, but are not limited to, a vector derived from adenovirus, retrovirus, in particular lentivirus, poxvirus, herpes simplex virus type 1 and adeno-associated virus (VAA). The selection of the appropriate viral vector will obviously depend on the target cell and the viral tropism.

En una realización, la endonucleasa Cas9 y las moléculas de ARNgm se proporcionan dentro de diferentes vectores (tales como dos vectores: uno que contiene un gen codificante de la endonucleasa Cas9, y un segundo codificante de ambas moléculas de ARNgm, o tres vectores, uno codificante de la endonucleasa Cas9 y unvector para cada molécula de ARNgm). En otra realización, la totalidad de los vectores del sistema CRISPR-Cas9, incluyendo la endonucleasa Cas9 y ambas moléculas de ARNgm requeridas para la escisión de la expansión de repeticiones de trinucleótidos, se expresan a partir de un único vector de expresión.In one embodiment, the Cas9 endonuclease and mRNA molecules are provided within different vectors (such as two vectors: one containing a Cas9 endonuclease coding gene, and a second coding for both mRNA molecules, or three vectors, one encoder of the Cas9 endonuclease and unvector for each mRNA molecule). In another embodiment, all of the vectors of the CRISPR-Cas9 system, including the Cas9 endonuclease and both mRNA molecules required for cleavage of trinucleotide repeat expansion, are expressed from a single expression vector.

El sistema de la presente invención se utiliza para escindir una expansión de repeticiones de nucleótidos dentro de una región no codificante de un gen de interés. En una realización, el motivo de nucleótidos repetidos es un binucleótido, trinucleótido, tetranucleótido, pentanucleótido o hexanucleótido repetido, tal como una repetición CAG, CTG, CGG, GAA, AGG, CCG, CCTG, ATTCT, TGGAA, GGCCTG o GGGGCC. En una realización particular, la repetición se encuentra dentro de un gen de interés seleccionado de FMR1, AFF2 o FMR2, AFF3, FXN, ATXN80S/ATXN8, ATXN10, PPP2R2B, BEAN1/TK2, NOP56, C9ORF72, ZN9/CNBP o DMPK. En una realización particular, la expansión de repeticiones de nucleótidos es una repetición de trinucleótido, tal como una repetición CAG, CTG, CGG, GAA, AGG o CCG. En una realización particular adicional, la repetición de nucleótidos, en particular la repetición de trinucleótidos, se encuentra presente dentro de la región 3' no traducida del gen DMPK. En una realización particular, la expansión de repeticiones de nucleótidos (p.ej., una expansión de repeticiones de trinucleótidos) comprende entre 20 y 10000 repeticiones del motivo nucleótido, más particularmente de 50 a 5000 repeticiones. Por ejemplo, la expansión de repeticiones de nucleótidos que debe escindirse (p.ej., una expansión de repeticiones de trinucleótidos) puede comprender cualquier número de repeticiones, tal como al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o al menos más de 2000 repeticiones del motivo de nucleótidos. Más específicamente, el número de repeticiones es un número patológicos de repeticiones, que significa que dicha repetición de nucleótidos (p.ej., una repetición de trinucleótidos) está asociada, o puede estar asociada, a un estado de enfermedad. En una realización particular, la repetición es una repetición de CTG dentro de la región 3' no traducida del gen DMPK y es patológica a partir de 50 o más repeticiones.The system of the present invention is used to cleave an expansion of nucleotide repeats within a non-coding region of a gene of interest. In one embodiment, the repeated nucleotide motif is a binucleotide, trinucleotide, tetranucleotide, pentanucleotide or repeated hexanucleotide, such as a CAG, CTG, CGG, GAA, AGG, CCG, CCTG, ATTCT, TGGAA, GGCCTG or GGGGCC repeat. In a particular embodiment, the repeat is within a gene of interest selected from FMR1, AFF2 or FMR2, AFF3, FXN, ATXN80S / ATXN8, ATXN10, PPP2R2B, BEAN1 / TK2, NOP56, C9ORF72, ZN9 / CNBP or DMPK. In a particular embodiment, the expansion of nucleotide repeats is a trinucleotide repeat, such as a CAG, CTG, CGG, GAA, AGG or CCG repeat. In a further particular embodiment, nucleotide repeat, in particular trinucleotide repeat, is present within the 3 'untranslated region of the DMPK gene. In a particular embodiment, the expansion of nucleotide repeats (eg, an expansion of trinucleotide repeats) comprises between 20 and 10,000 repetitions of the nucleotide motif, more particularly 50 to 5000 repetitions. For example, the expansion of nucleotide repeats that must be cleaved (e.g., an expansion of trinucleotide repeats) may comprise any number of repetitions, such as at least 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 or at least more than 2000 repetitions of the nucleotide motif. More specifically, the number of repetitions is a pathological number of repetitions, which means that said nucleotide repeat (eg, a trinucleotide repeat) is associated, or may be associated, to a state of illness In a particular embodiment, the repetition is a repeat of CTG within the 3 'untranslated region of the DMPK gene and is pathological from 50 or more repetitions.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren a administrar en un sujeto una cantidad eficaz de una composición de manera que el sujeto presenta una reducción de por lo menos un síntoma de la enfermedad o una mejora de la enfermedad, por ejemplo, resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, entre los resultados clínicos beneficiosos o deseados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el alivio de uno o más síntomas, la reducción de la extensión de la enfermedad, la estabilización (es decir, el no agravamiento) del estado de la enfermedad, el retardo o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, y la remisión (parcial o total), detectable o no detectable. El tratamiento puede referirse a la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Alternativamente, el tratamiento resulta “eficaz” en el caso de que la progresión de la enfermedad se reduzca o se detenga. “Tratamiento” también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en caso de no recibir tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen los pacientes en los que ya se ha diagnosticado un trastorno asociado a la expresión de una secuencia polinucleótida, así como aquellos que es probable que desarrollen tal trastorno debido a susceptibilidad genética u otros factores. Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “tratar” y “tratamiento” también se refieren a la prevención de una enfermedad o trastorno, que significa retardar o evitar la aparición de tal enfermedad o trastorno.As used herein, the terms "treat" and "treatment" refer to administering in an individual an effective amount of a composition so that the subject exhibits a reduction of at least one symptom of the disease or a disease improvement, for example, beneficial or desired clinical outcomes. For the purposes of the present invention, beneficial or desired clinical outcomes include, but are not limited to, relief of one or more symptoms, reduction of the extent of the disease, stabilization (i.e., non-aggravation ) of the disease status, the delay or slowing of the disease progression, the improvement or palliation of the disease status, and the remission (partial or total), detectable or undetectable. Treatment may refer to prolongation of survival compared to expected survival if not receiving treatment. Alternatively, the treatment is "effective" in the event that the progression of the disease is reduced or stopped. "Treatment" may also mean prolongation of survival compared to expected survival in case of no treatment. Those who need treatment include patients in whom a disorder associated with the expression of a polynucleotide sequence has already been diagnosed, as well as those who are likely to develop such a disorder due to genetic susceptibility or other factors. As used herein, the terms "treat" and "treatment" also refer to the prevention of a disease or disorder, which means delaying or preventing the occurrence of such disease or disorder.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un “trastorno por expansión de repeticiones de nucleótidos” es una enfermedad o trastorno que está causado o ligado a una expansión de repeticiones de nucleótidos donde las repeticiones de nucleótidos en determinados genes exceden el umbral estable normal, que difiere según gen. Entre los trastornos por expansión de repeticiones de nucleótidos se incluyen el síndrome del X frágil (FXS, por sus siglas en inglés) y el síndrome de temblor y ataxia asociado al X frágil (FXTAS, por sus siglas en inglés), ataxia espinocerebelar tipos 8, 10, 12, 31 y 36, distrofia miotónica de tipo 1 y de tipo 2, ataxia de Friedreich, enfermedad similar a Huntington de tipo 2 (HDL-2) y esclerosis lateral amiotrófica (C9-ELA).As used herein, a "nucleotide repeat expansion disorder" is a disease or disorder that is caused or linked to an expansion of nucleotide repeats where nucleotide repeats in certain genes exceed the normal stable threshold, which differs according to gene. Nucleotide repeat expansion disorders include fragile X syndrome (FXS) and fragile X-associated tremor and ataxia syndrome (FXTAS), spinocerebellar ataxia types 8 , 10, 12, 31 and 36, myotonic dystrophy type 1 and type 2, Friedreich ataxia, Huntington-like disease type 2 (HDL-2) and amyotrophic lateral sclerosis (C9-ELA).

En una realización particular, los métodos de la presente invención se refieren al tratamiento de un trastorno por expansión de repeticiones de nucleótidos en el que la expansión de repeticiones de nucleótidos asociada al trastorno se localiza dentro de una región no codificante de un gen. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, expansiones de repeticiones de nucleótidos localizadas dentro de un intrón, una región 5' no traducida o una región 3' no traducida de un gen codificante de proteína.In a particular embodiment, the methods of the present invention relate to the treatment of a nucleotide repeat expansion disorder in which the expansion of nucleotide repeats associated with the disorder is located within a non-coding region of a gene. These include, for example, expansions of nucleotide repeats located within an intron, a 5 'untranslated region or a 3' untranslated region of a protein coding gene.

En una realización particular, el trastorno de expansión de repeticiones de nucleótidos es la distrofia miotónica, asociada a una expansión de repetición trinucletoide (tal como un CTG) dentro de la región 3' no traducida del gen DMPK.In a particular embodiment, the nucleotide repeat expansion disorder is myotonic dystrophy, associated with a trinucletoid repeat expansion (such as a CTG) within the 3 'untranslated region of the DMPK gene.

En una realización particular, la expansión de repetición de nucleótidos dentro del gen DMPK se escinde utilizando una pareja apropiada de moléculas de ARNgm y una endonucleasa Cas9 apropiada, correspondiente a los ARNgm seleccionados.In a particular embodiment, the nucleotide repeat expansion within the DMPK gene is cleaved using an appropriate pair of mRNA molecules and an appropriate Cas9 endonuclease, corresponding to the selected mRNAs.

La molécula de ARNgm, la pareja de moléculas de ARNgm, el vector (codificante de una o más moléculas de ARNgm y/o una endonucleasa Cas9) y la célula según la invención pueden formularse y administrarse para tratar una diversidad de estados de enfermedad por expansión de repeticiones de nucleótidos por cualesquiera medios que produzcan el contacto de la molécula de ARNgm, la pareja de moléculas de ARNgm, el vector y la célula con su sitio de acción en el sujeto que lo necesita.The mRNA molecule, the pair of mRNA molecules, the vector (encoding one or more mRNA molecules and / or a Cas9 endonuclease) and the cell according to the invention can be formulated and administered to treat a variety of disease states by expansion of nucleotide repeats by any means that produce the contact of the mRNA molecule, the pair of mRNA molecules, the vector and the cell with their site of action in the subject in need.

La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un ARNgm o una pareja de ARNgm de la invención, o el vector de la invención (codificante de un ARNgm de la invención, o una pareja de ARNgm solos o junto con una secuencia codificante de una endonucleasa Cas9), o la célula de la invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del terapéutico (el o los ARNgm, el vector o la célula de la invención) y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listada en la Farmacopea estadounidense o europea u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales y seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los originados en petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similar. El agua es un portador preferente en el caso de que la composición farmacéutica se administre por vía intravenosa. También pueden utilizarse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Entre los excipientes farmacéuticos adecuados se incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.The present invention further provides pharmaceutical compositions comprising an mRNA or an mRNA pair of the invention, or the vector of the invention (encoding an mRNA of the invention, or a mRNA pair alone or together with an endonuclease coding sequence. Cas9), or the cell of the invention. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the therapeutic (the mRNA (s), the vector or the cell of the invention) and a pharmaceutically acceptable carrier. In a specific embodiment, the term "pharmaceutically acceptable" refers to that approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the US or European Pharmacopoeia or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals and humans. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids, such as water and oils, including those originating in petroleum or animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is a preferred carrier in the event that the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dry skim milk, glycerol, propylene glycol, water, ethanol and the like.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones deliberación sostenida y similares. La formulación oral puede incluir portadores estándares, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del terapéutico, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador, de manera que proporcione la forma para la administración apropiada en el sujeto.The composition, if desired, may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained deliberation formulations and the like. The oral formulation may include standard carriers, such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, stearate. magnesium, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, etc. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences," by EW Martin. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the therapeutic, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier, so as to provide the form for proper administration in the subject.

En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa en seres humanos. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición puede incluir además un agente solubilizador y un anestésico local, tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.In a preferred embodiment, the composition is formulated according to routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration in humans. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. If necessary, the composition may further include a solubilizing agent and a local anesthetic, such as lignocaine to relieve pain at the injection site.

La cantidad del terapéutico de la invención que resultará eficaz en el tratamiento de una expansión de repeticiones de nucleótidos puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares. Además, pueden utilizarse opcionalmente ensayos in vivo y/o in vitro para ayudar a predecir los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa para la utilización en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad, y debería decidirse de acuerdo con el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. La dosis de uno o más ARNgm, vector o célula administrada en el sujeto que lo necesita variará según varios factores, entre ellos, aunque sin limitación, la vía de administración, la enfermedad específica tratada, la edad del sujeto o el nivel de expresión necesario para obtener el efecto terapéutico requerido. El experto en la materia puede determinar fácilmente, basándose en sus conocimientos en el campo, el intervalo de dosis requerido basándose en estos factores y otros factores.The amount of the therapeutic of the invention that will be effective in treating an expansion of nucleotide repeats can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vivo and / or in vitro assays can optionally be used to help predict optimal dose ranges. The precise dose for use in the formulation will also depend on the route of administration and the severity of the disease, and should be decided according to the criteria of the professional and the circumstances of each patient. The dose of one or more mRNA, vector or cell administered in the subject in need will vary according to several factors, including, but not limited to, the route of administration, the specific disease treated, the age of the subject or the level of expression required. to obtain the required therapeutic effect. The person skilled in the art can easily determine, based on his knowledge in the field, the dose range required based on these factors and other factors.

Objetos no limitativos de la invenciónNon-limiting objects of the invention

La presente solicitud proporciona los siguientes objetos no limitativos:This application provides the following non-limiting objects:

1. Una pareja de moléculas de ARNgm, en donde dicha pareja comprende una primera y una segunda moléculas de ARNgm que es capaz de unir mediante apareamiento de bases un complemento de secuencia a una secuencia diana de ADN genómico localizadas en los lados 5' y 3' de una expansión de repeticiones de nucleótidos localizada dentro de uan región no codificante de un gen de interés, respectivamente, resultando apropiada de esta manera para escindir dicha expansión de nucleótidos con un sistema CRISPR/Cas9.1. A pair of mRNA molecules, wherein said pair comprises a first and second mRNA molecules that is capable of linking a sequence complement to a genomic DNA target sequence located on the 5 'and 3 sides by base pairing. 'of an expansion of nucleotide repeats located within a non-coding region of a gene of interest, respectively, thereby being appropriate to cleave said nucleotide expansion with a CRISPR / Cas9 system.

2. Un ARNgm que comprende una secuencia que es capaz de unir mediante apareamiento de bases el complemento de secuencia a una secuencia diana de ADN genómico localizada en el lado 5' o 3' de una expansión de repeticiones de nucleótidos dentro de una región no codificante de un gen de interés.2. An mRNA comprising a sequence that is capable of linking the sequence complement to a target genomic DNA sequence located on the 5 'or 3' side of an expansion of nucleotide repeats within a non-coding region. of a gene of interest.

3. La pareja de moléculas de ARNgm según el objeto 1, o el ARNgm según el objeto 2, en donde dicha repetición de nucleótidos está localizada dentro de un intrón o dentro de la región 5' o 3' no traducida (5'UTR o 3'UTR, por sus siglas en inglés) de dicho gen de interés.3. The pair of mRNA molecules according to object 1, or mRNA according to object 2, wherein said nucleotide repeat is located within an intron or within the 5 'or 3' untranslated region (5'UTR or 3'UTR) of said gene of interest.

4. La pareja de moléculas de ARNgm o el ARNgm según el objeto 3, en donde la repetición de nucleótidos está localizada dentro de la 3'-UTR de dicho gen de interés.4. The pair of mRNA or mRNA molecules according to object 3, wherein the nucleotide repeat is located within the 3'-UTR of said gene of interest.

5. Un vector codificante del ARNgm o una pareja de moléculas de ARNgm según cualquiera de los objetos 1 a 4, siendo el vector preferentemente un plásmido o un vector vírico, tal como un vector VAAr.5. An mRNA coding vector or a pair of mRNA molecules according to any of objects 1 to 4, the vector being preferably a plasmid or a viral vector, such as a VAAr vector.

6. Una célula diana, que se transfecta o transduce con el vector según el objeto 5.6. A target cell, which is transfected or transduced with the vector according to object 5.

7. Un método para la producción de un ARNgm o pareja de ARNgm, que comprende cultivar la célula diana según el objeto 6 bajo condiciones que permiten la producción de dicho ARNgm o pareja de ARNgm, y la recuperación de dicho ARNgm o dicha pareja de moléculas de ARNgm a partir de dicha etapa de cultivo.7. A method for the production of an mRNA or mRNA pair, which comprises culturing the target cell according to object 6 under conditions that allow the production of said mRNA or mRNA pair, and the recovery of said mRNA or said pair of molecules. of mRNA from said culture stage.

8. Un método in vitro para escindir una repetición de nucleótidos localizada dentro de una región no codificante de un gen en una célula, que comprende introducir en dicha célula una pareja de moléculas de ARNgm según cualquiera de los objetos 1 y 3 a 4, o un vector según el objeto 5, y una endonucleasa CRISPR/Cas9.8. An in vitro method for cleaving a nucleotide repeat located within a non-coding region of a gene in a cell, comprising introducing into said cell a pair of mRNA molecules according to any of objects 1 and 3 to 4, or a vector according to object 5, and a CRISPR / Cas9 endonuclease.

9. El método según el objeto 8, en donde la endonucleasa Cas9 se deriva de S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus, N. meningitidis, S. mutans, C. jejuni, F. novicida, P. multocida, P. bettyae, H. parainfluenzae, H. pittmaniae o L. crispatus, preferiblemente de N. meningitidis. 9. The method according to object 8, wherein the Cas9 endonuclease is derived from S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus, N. meningitidis, S. mutans, C. jejuni, F. novicida, P. multocida, P Bettyae, H. parainfluenzae, H. pittmaniae or L. crispatus, preferably of N. meningitidis.

10. Una pareja de ARNgm según cualquiera de los objetos 1 y 3 a 4, o un vector según el objeto 5, para el uso en combinación con una endonucleasa Cas9 en un método para el tratamiento de un trastorno por expansión de repeticiones de nucleótidos, en donde las moléculas de ARNgm de la pareja de ARNgm se diseñan para escindir una expansión de repeticiones de nucleótidos asociada a dicho trastorno respecto de una región no codificante de un gen de interés. 10. An mRNA pair according to any of objects 1 and 3 to 4, or a vector according to object 5, for use in combination with a Cas9 endonuclease in a method for the treatment of a nucleotide repeat expansion disorder, wherein the mRNA molecules of the mRNA pair are designed to cleave an expansion of nucleotide repeats associated with said disorder from a non-coding region of a gene of interest.

11. La pareja de ARNgm para el uso según el objeto 10, en donde la expansión de repeticiones de nucleótidos es una expansión de repeticiones de binucleótidos, trinucleótidos, tetranucleótidos, pentanucleótidos o hexanucleótidos, en particular una expansión de repeticiones de trinucleótidos.11. The mRNA pair for use according to object 10, wherein the expansion of nucleotide repeats is an expansion of binucleotide, trinucleotide, tetranucleotide, pentanucleotide or hexanucleotide repeats, in particular an expansion of trinucleotide repeats.

12. La pareja de ARNgm para el uso según el objeto 10 o 11, en donde la expansión de repeticiones de nucleótidos se localiza dentro de la 3'-UTR de dicho gen de interés.12. The mRNA pair for use according to object 10 or 11, wherein the expansion of nucleotide repeats is located within the 3'-UTR of said gene of interest.

13. La pareja de ARNgm para el uso según cualquiera de los objetos 10 a 12, en donde dicho trastorno es síndrome de X frágil y síndrome de temblor y ataxia asociado al X frágil, ataxia espinocerebelar de tipo 8, 10, 12, 31 y 36, distrofia miotónica de tipo 1 y 2, ataxia de Friedreich, enfermedad similar a Huntington tipo 2 y esclerosis lateral amiotrófica tipo C9-ELA.13. The mRNA pair for use according to any of objects 10 to 12, wherein said disorder is fragile X syndrome and fragile X tremor and ataxia syndrome, spinocerebellar ataxia type 8, 10, 12, 31 and 36, myotonic dystrophy of type 1 and 2, Friedreich's ataxia, Huntington-like disease type 2 and amyotrophic lateral sclerosis type C9-ELA.

14. El ARNgm según los objetos 2 a 4, o la pareja de ARNgm para el uso según cualquiera de los objetos 10 a 13, en donde el gen de interés es FMR1, AFF2 o FMR2, AFF3, FXN, ATXN80S/ATXN8, ATXN10, PPP2R2B, BEAN1/TK2, NOP56, C9ORF72, ZN9/CNBP o DMPK.14. The mRNA according to objects 2 to 4, or the mRNA pair for use according to any of objects 10 to 13, wherein the gene of interest is FMR1, AFF2 or FMR2, AFF3, FXN, ATXN80S / ATXN8, ATXN10 , PPP2R2B, BEAN1 / TK2, NOP56, C9ORF72, ZN9 / CNBP or DMPK.

15. La pareja de ARNgm para el uso según cualquiera de los objetos 10 a 14, en donde el trastorno es distrofia miotónica tipo 1 y el gen de interés es el gen DMPK.15. The mRNA pair for use according to any of objects 10 to 14, wherein the disorder is type 1 myotonic dystrophy and the gene of interest is the DMPK gene.

EjemplosExamples

Materiales y métodosMaterials and methods

Construcción de plásmidosPlasmid Construction

La lista de plásmidos utilizados y construidos en el presente estudio se proporciona en la Tabla 3. Se han llevado a cabo experimentos de clonación en Escherichia coli DH10B químicamente competentes (Invitrogen). Los casetes de expresión para la proteína Cas9 de Neisseria meningitides (NM) se listan como pC512-Int-NMCas9-smSVpolyA y pEFS-Int-NMCas9-SVpolyA. Ambos contienen la secuencia optimizada humana de NMCas9 bajo el control del promotor específico muscular sintético C5-12 o el promotor EFS ubicuo (versión más corta del promotor EF-1a). La secuencia de NMCas9 contiene además dos señales de localización nuclear (SLN), uno por extremo, el epítopo hemaglutinina (HA) de influenza humana y tres epítopos FLAG en tándem (3XFLAG) en el extremo C-terminal. La secuencia de NM Cas9 se amplificó por PCR a partir de plásmido JDS246NMCas9 (proporcionado por Jean Paul Concordet) y se clonó en los plásmidos de VAA pC512-Int-smSVpoliA y pEFS-Int-SVpolyA, cada uno de los cuales contiene el promotor indicado, un intrón quimérico y una señal de poliadenilación de SV40 (sm: versión más corta). The list of plasmids used and constructed in the present study is provided in Table 3. Chemically competent Escherichia coli DH10B cloning experiments (Invitrogen) have been carried out. Expression cassettes for the Neisseria meningitides (NM) Cas9 protein are listed as pC512-Int-NMCas9-smSVpolyA and pEFS-Int-NMCas9-SVpolyA. Both contain the optimized human sequence of NMCas9 under the control of the specific C5-12 synthetic muscle promoter or the ubiquitous EFS promoter (shorter version of the EF-1a promoter). The NMCas9 sequence also contains two nuclear localization (SLN) signals, one per end, the human influenza hemagglutinin (HA) epitope and three tandem FLAG epitopes (3XFLAG) at the C-terminal end. The NM Cas9 sequence was amplified by PCR from plasmid JDS246NMCas9 (provided by Jean Paul Concordet) and was cloned into the VAA plasmids pC512-Int-smSVpoliA and pEFS-Int-SVpolyA, each of which contains the indicated promoter , a chimeric intron and an SV40 polyadenylation signal (sm: shorter version).

Casete de expresión para el ARN guía monocatenario (ARNgm) NM, pBlue_Double_U6sgRNAs_NM, se diseñó con el fin de contener dos veces en tándem la secuencia optimizada humana para el andamiaje (parte constante) del ARNgm NM bajo el control del promotor U6. El constructo contiene dos sitios de clonación por restricción diferentes donde se introduce la cadena del ARNgm específico para la diana genómica (protoespaciador), Bbsl y BspMI. La secuencia del andamiaje de ARNgm fue proporcionada por Jean Paul Concordet y modificada en los sitios de clonación del protoespaciador. El constructo Double_U6sgRNAs_NM se sintetizó sintéticamente y fue clonada en el plásmido pBluescript SK(+) por GeneCust.Expression cassette for the single stranded guide RNA (mRNA) NM, pBlue_Double_U6sgRNAs_NM, was designed in order to contain twice in tandem the human optimized sequence for the scaffolding (constant part) of the NMRM NM under the control of the U6 promoter. The construct contains two different restriction cloning sites where the specific mRNA chain for the genomic target (proto-spacer), Bbsl and BspMI is introduced. The mRNA scaffolding sequence was provided by Jean Paul Concordet and modified at the proto-spacer cloning sites. The Double_U6sgRNAs_NM construct was synthesized synthetically and was cloned into plasmid pBluescript SK (+) by GeneCust.

Los protoespaciadores ARNgm 1, 7, E y N se diseñaron tal como se describe en la sección “Diseño de los ARNgm” (ver posteriormente). En primer lugar, se clonaron los ARNgm 1 y 7 en el sitio Bbsl del plásmido pBlue_Double_U6sgRNAs_NM para originar los plásmidos pBlue-U6gRNA-NM-1-DMPK y pBlue-U6gRNA-NM-7-DMPK. Se clonaron los ARNgm E y N en el sitio BsbMI de este último, originando las siguientes combinaciones: pBlue-U6gRNA-NM-1N-DMPK, pBlue-U6gRNA-NM-7E-DMPK y pBlue-U6gRNA-NM-7N-DMPK. Con el fin de seleccionar mediante separación las células transfectadas con los ARNgm, los constructos indicados anteriormente se digirieron enzimáticamente en SnaBI y se clonaron en un plásmido que contenía un GFP nuclear, pAAV-Des-AcGFP.The mRNA proto-spacers 1, 7, E and N were designed as described in the section "Design of mRNAs" (see below). First, mRNAs 1 and 7 were cloned into the Bbsl site of plasmid pBlue_Double_U6sgRNAs_NM to originate plasmids pBlue-U6gRNA-NM-1-DMPK and pBlue-U6gRNA-NM-7-DMPK. The mRNA E and N were cloned into the latter's BsbMI site, originating the following combinations: pBlue-U6gRNA-NM-1N-DMPK, pBlue-U6gRNA-NM-7E-DMPK and pBlue-U6gRNA-NM-7N-DMPK. In order to select cells transfected with mRNAs by separation, the constructs indicated above were enzymatically digested in SnaBI and cloned into a plasmid containing a nuclear GFP, pAAV-Des-AcGFP.

Diseño de los ARNgmMRNA design

La región genómica de la 3'UTR de DMPK circundante a las repeticiones de CTG se cribó manualmente para la presencia de motivos contiguos a protoespaciador (PAM) específicos para Neisseria meningitidis (NM). Aparte de la secuencia de consenso del NM PAM (NNNNGATT) [Zhang Y. et al., Mol. Cell., 2013], también se consideraron las siguientes variantes, sometidas a ensayo por Esvelt y colaboradores en Escherichia coli [Esvelt K.M. et al., Nature Methods, 2013]: NNNNGNTT, NNNNGANT, NNNNg Tt N. Considerando ambos, las posiciones de las dianas y los PAM dentro de la región 3' UTR y también el número de potenciales fuera-de-diana (calculado por CasOFFinder fijando el número de corte de no correspondencias en < 6), se seleccionaron cuatro ARNgm, dos con diana en la región cadena arriba de la repetición de CTG (ARNgm 1 y 7) y los otros con diana en la región cadena debajo de la repetición de CTG (ARNgm E y N). Sólo uno de ellos es respecto a un PAM de consenso (ARNgm N); en efecto los demás son respecto, dos a la variante NNNNGANT (ARNgm 1 y 7) y uno respecto a la variante NNNNGNTT (ARNgm E) (fig. 3). Se diseñaron ARNgm de manera que su diana fuese una secuencia genómica de 24 nt y con el fin de clonarla en el sitio BsbI (ARNgm 1 y 7) o en el sitio BspMI (ARNgm E y N) del plásmido pBlue_Double_U6sgRNA_NM. Además, se añadió el nucleótido G al 5' de ARNgm 7 y E (ya presente en el 5' del otro ARNgm) para optimizar la transcripción controlada por U6. Todos los ARNgm se sintetizaron sintéticamente como cebadores directos e inversos simples (ver la lista de cebadores) y después se hibridaron in vitro antes de la ligación con el plásmido pBlue_Double_U6sgRNA_NM (o derivados) digeridos con los enzimas de restricción apropiados.The genomic region of the 3'UTR of DMPK surrounding the CTG repeats was manually screened for the presence of proto-spacer (PAM) motifs specific to Neisseria meningitidis (NM). Apart from the consensus sequence of the NM PAM (NNNNGATT) [Zhang Y. et al., Mol. Cell., 2013], the following variants were also considered, tested by Esvelt et al in Escherichia coli [Esvelt KM et al., Nature Methods, 2013]: NNNNGNTT, NNNNGANT, NNNNg Tt N. Considering both the positions of the targets and the PAMs within the 3 'UTR region and also the number of out-of-target potentials (calculated by CasOFFinder by setting the non-matching cutoff number at <6), four mRNAs were selected, two with target in the upstream region of the CTG repeat (mRNA 1 and 7) and the others with target in the chain region below the CTG repeat (mRNA E and N). Only one of them is with respect to a consensus MAP (mRNA N); in fact the others are respect, two to the NNNNGANT variant (mRNA 1 and 7) and one to the NNNNGNTT variant (mRNA E) (fig. 3). MRNA were designed so that their target was a genomic sequence of 24 nt and in order to clone it in the BsbI site (mRNA 1 and 7) or in the BspMI site (ARNgm E and N) of the plasmid pBlue_Double_U6sgRNA_NM. In addition, nucleotide G at 5 'of mRNA 7 and E (already present at 5' of the other mRNA) was added to optimize transcription controlled by U6. All mRNAs were synthesized synthetically as simple direct and inverse primers (see the primer list) and then hybridized in vitro before ligation with the plasmid pBlue_Double_U6sgRNA_NM (or derivatives) digested with the appropriate restriction enzymes.

Cultivo celular y ensayo de transfección para someter a ensayo la actividad de nucleasaCell culture and transfection assay to test nuclease activity

Se sembraron células 1 día antes de la transfección, se recolectaron 2 días después de la transfección y se mantuvieron a -80°C hasta la extracción del ADN genómico, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó una temperatura estándar de 37°C y 5% de CO²para cultivar y mantener las células en cultivo. Se proporcionan los datos para los ensayos de transección posteriormente.Cells were seeded 1 day before transfection, collected 2 days after transfection and kept at -80 ° C until genomic DNA extraction, unless otherwise indicated. A standard temperature of 37 ° C and 5% CO ^{2 was used} to grow and maintain the cells in culture. The data for the transection tests are provided below.

Se cultivaron células HeLa y células HEK 293T en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) rico en glucosa y con GlutaMAX (Invitrogen), complementado con suero de feto bovino al 10% (FBS, Invitrogen). Las células se sembraron en placa de 12 pocillos, 0,5-1,0x105/pocillo para las células HeLa, 0,25x105 células/pocillo para las HEK 293T, en un volumen final=1 ml (~80% de confluencia el día de la transfección). Las reacciones de transfección se prepararon de la manera siguiente: 3 j l de reactivo de transfección FuGENE HD y 1 |jg de ADN total (proporción FuGENE-ADN de 3:1) en 50 j l de medio sin suero. La proporción de NMCas 9 y ARNgm era de 3:1.HeLa cells and HEK 293T cells were cultured in Dulbecco's modified glucose medium (DMEM) rich in glucose and with GlutaMAX (Invitrogen), supplemented with 10% bovine fetal serum (FBS, Invitrogen). Cells were seeded in 12-well plate, 0.5-1.0x105 / well for HeLa cells, 0.25x105 cells / well for HEK 293T, in a final volume = 1 ml (~ 80% confluence per day of transfection). Transfection reactions were prepared as follows: 3 µl of FuGENE HD transfection reagent and 1 µg of total DNA (FuGENE-DNA ratio of 3: 1) in 50 µl of serum-free medium. The ratio of NMCas 9 and mRNA was 3: 1.

Se cultivaron mioblastos fetales humanos primarios en medio de crecimiento de células musculares esqueléticas (PromoCell) complementadas con FBS al 15%. Con el fin de alcanzar ~50% de confluencia, el día de la transfección se sembraron ~0,3-0,5x105 células/placa Petri de 10 cm (volumen final=8 ml). Las células se transfectaron con reactivo de transfección JetPEI (transfección Polyplus) en una proporción 2:1 con el ADN en un volumen final de 500 j l de NaCl 150 mM (12 j l de reactivo de transfección para 6 jg de ADN total; proporción NMCas9-ARNgm de 1:1). Las reacciones de transfección se incubaron durante 30 min a TA y se cambió el medio de cultivo antes de su adición. Primary human fetal myoblasts were grown in skeletal muscle cell growth medium (PromoCell) supplemented with 15% FBS. In order to reach ~ 50% confluence, ~ 0.3-0.5x105 cells / 10 cm Petri dish (final volume = 8 ml) were seeded on the day of transfection. The cells were transfected with JetPEI transfection reagent (Polyplus transfection) in a 2: 1 ratio with the DNA in a final volume of 500 µl of 150 mM NaCl (12 µl of transfection reagent for 6 µg of total DNA; NMCas9 ratio) MRNA of 1: 1). Transfection reactions were incubated for 30 min at RT and the culture medium was changed before its addition.

Ensayo de PCR para someter a ensayo la deleción genómicaPCR assay to test genomic deletion

Se extrajo el ADN genómico de células HeLa y de células HEK 293T utilizando el kit de purificación de ADN genómico GeneJET (Thermo Scientific) y se eluyeron en un volumen final de 150 jl.Genomic DNA was extracted from HeLa cells and HEK 293T cells using the GeneJET genomic DNA purification kit (Thermo Scientific) and eluted in a final volume of 150 ml.

Se extrajo el ADN genómico de mioblastos fetales humanos primarios separados y no separados, utilizando el kit QlAamp DNA Micro and Mini (QIAGEN) y se eluyeron en un volumen final de 30 y 200 jl, respectivamente.Genomic DNA was extracted from separate and non-separated primary human fetal myoblasts using the QlAamp DNA Micro and Mini kit (QIAGEN) and eluted in a final volume of 30 and 200 µl, respectively.

Se llevó a cabo la PCR utilizando la ADN polimerasa Taq de alta fidelidad Platinum (Invitrogen), DMSO al 10%, 100 150 ng de ADNg total y los cebadores F1- y R1-DMPK-3'UTR. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis: 15-20 j l de cada reacción de PCR se cargaron en un gel de agarosa al 1,5% que contenía la tinción de ADN GelRed (la tanda de electroforesis se realizó a 90-100 voltios durante 1 h 15-30 min). Tras adquirir las imágenes de los geles de electroforesis tras la exposición a UV, se ajustó el brillo y el contraste.PCR was carried out using Plaq high-fidelity Taq DNA polymerase (Invitrogen), 10% DMSO, 100 150 ng of total gDNA and primers F1- and R1-DMPK-3'UTR. The PCR products were separated by electrophoresis: 15-20 jl of each PCR reaction was loaded on a 1.5% agarose gel containing the GelRed DNA stain (the electrophoresis batch was performed at 90-100 volts during 1 h 15-30 min). After acquiring the images of the electrophoresis gels after UV exposure, the brightness and contrast were adjusted.

Se llevó a cabo la secuenciación de los productos de PCR que contenían la deleción de la repetición de CTG, subclonando en orden para secuenciar clones individuales. Se llevó a cabo la PCR tal como se ha indicado anteriormente con los cebadores F1-DMPK-3UTR-KpnI y R1-DMPK-3UTR-XbaI. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa a baja temperatura de fusión al 2% y se extrajeron en gel bandas de ADN respecto a los productos de PCR que contenían la deleción de las repeticiones de CTG, se digirieron con Kpnl y Xbal y se clonaron en el plásmido pBluescript II SK(+) digerido con los mismos enzimas de restricción. Los plásmidos se extrajeron de los clones positivos y se enviaron para secuenciación con el cebador pBlue_MCS_before2.Sequencing of the PCR products containing the deletion of the CTG repeat was carried out, subcloning in order to sequence individual clones. PCR was carried out as indicated above with primers F1-DMPK-3UTR-KpnI and R1-DMPK-3UTR-XbaI. The PCR products were separated by electrophoresis on an agarose gel at a low 2% melting temperature and DNA bands were gelled on the PCR products containing the deletion of the CTG repeats, digested with Kpnl and Xbal and were cloned into plasmid pBluescript II SK (+) digested with the same restriction enzymes. Plasmids were extracted from positive clones and sent for sequencing with primer pBlue_MCS_before2.

Transferencia westernWestern transfer

Las células se lisaron sobre hielo en 100 j l de tampón de lisis que contenía NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, fluoruro sódico 100 mM, pirofosfato sódico 4 mM, ortovanatado sódico 2 mM, Triton X-100 al 1% e IGEPAL al 0,5% complementado con un cóctel inhibidor de proteasas completo (Roche). Las concentraciones del extracto de proteínas totales se determinaron mediante el kit de ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad). Las proteínas se separaron mediante electroforesis en SDS-PAGE en gel premoldeado al 10% (Bio-Rad) y después se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Con el fin de evitar la unión no específica, las membranas se sumergieron en una solución de bloqueo (solución Odyssey al 50%, solución TBST al 50% [Tween al 0,1% en Tris-HCl 1 M, pH 7,6) durante 2 horas antes de la incubación durante la noche con anticuerpos dirigidos contra epítopo Flag (anticuerpo monoclonal M2 anti-Flag, 1:3.000, Sigma). El día después, se lavó el exceso de anticuerpos en TBST y la membrana se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa (anticuerpo de cabra antiratón-Alexa Fluor 680, 1:10.000, Invitrogen) durante 1 hora. Las bandas de proteínas se visualizaron mediante fluorescencia de infrarrojos utilizando el sistema de adquisición de imágenes Odyssey (LICOR Biotechnology, Inc.).The cells were lysed on ice in 100 μl of lysis buffer containing 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 100 mM sodium fluoride, 4 mM sodium pyrophosphate, orthovated 2 mM sodium, 1% Triton X-100 and 0.5% IGEPAL supplemented with a complete protease inhibitor cocktail (Roche). Total protein extract concentrations were determined by the Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad). The proteins were separated by electrophoresis in SDS-PAGE in 10% pre-molded gel (Bio-Rad) and then transferred to a nitrocellulose membrane. In order to avoid non-specific binding, the membranes were immersed in a blocking solution (50% Odyssey solution, 50% TBST solution [0.1% Tween in 1M Tris-HCl, pH 7.6) for 2 hours before overnight incubation with antibodies directed against Flag epitope (M2 anti-Flag monoclonal antibody, 1: 3,000, Sigma). The day after, the excess antibody was washed in TBST and the membrane was incubated with a secondary antibody conjugated to Alexa (goat anti-mouse antibody-Alexa Fluor 680, 1: 10,000, Invitrogen) for 1 hour. Protein bands were visualized by infrared fluorescence using the Odyssey image acquisition system (LICOR Biotechnology, Inc.).

ResultadosResults

Constructos de expresión de Cas9 y ARNgmCas9 and mRNA expression constructs

Entre todos los sistemas de CRISPR/Cas9 disponibles, los presentes inventores seleccionaron uno originado en la bacteria Neisseria meningitidis (NM) debido a que NMCas9 es de pequeño tamaño y puede caber dentro de un vector virus adenoasociado (VAA). Además, los presentes inventores encontraron mediante cribado manual la presencia de sitios diana potenciales para NMCas9 dentro de la región 3' no traducida (3'-UTR) del gen DMPK humano. Los presentes inventores generaron dos constructos de VAA que contenían la secuencia codificante de NMCas 9 optimizada humana (3,25 Kb) bajo el promotor ubicuo EFS (versión más corta del factor 1 alfa de elongación) o el promotor específico muscular C5-12. Los presentes inventores incluyeron además otras secuencias reguladoras en los constructos, un intrón quimérico situado cadena debajo de cada promotor para estabilizar el ARNm de Cas9, y una señal de poliadenilación del virus 40 del simio (poliA de SV40). Se fusionó Cas9 con dos señales de localización nuclear (NLS), uno en cada extremo, con el fin de transportar la proteína hasta dentro del núcleo y HA (derivado de hemaglutinina de influenza humano) y epítopos Flag, los cuales resultan útiles para la detección de proteínas. El esquema de los constructos se representa en la fig. 1, A y B.Among all available CRISPR / Cas9 systems, the present inventors selected one originating from the Neisseria meningitidis (NM) bacteria because NMCas9 is small in size and can fit into an adeno-associated virus (VAA) vector. In addition, the present inventors found by manual screening the presence of potential target sites for NMCas9 within the 3 'untranslated region (3'-UTR) of the human DMPK gene. The present inventors generated two VAA constructs containing the human optimized NMCas 9 coding sequence (3.25 Kb) under the ubiquitous EFS promoter (shorter version of the elongation factor 1 alpha) or the C5-12 specific muscle promoter. The present inventors also included other regulatory sequences in the constructs, a chimeric intron located below each promoter to stabilize the Cas9 mRNA, and a simian virus 40 polyadenylation signal (SV40 polyA). Cas9 was fused with two nuclear localization signals (NLS), one at each end, in order to transport the protein into the nucleus and HA (derived from human influenza hemagglutinin) and Flag epitopes, which are useful for detection of proteins The scheme of the constructs is represented in fig. 1, A and B.

Los presentes inventores sometieron a ensayo la funcionalidad de los casetes de expresión de Cas9 in vitro en las líneas celulares (fig. 2) e in vivo en ratones C57B1/6 de tipo salvaje (datos no mostrados). Brevemente, las células se transfectaron con constructos de Cas9 y, dos días después de la transfección, se lisaron para la extracción de las proteínas totales o se fijaron para experimentos de marcaje. Se detectó NMCas9 en células HeLa y C2C12 en el tamaño molecular esperado mediante análisis de transferencia western (fig. 2) y en el núcleo de las células mediante inmunofluorescencia (datos no mostrados) con anticuerpos dirigidos contra el epítopo Flag.The present inventors tested the functionality of Cas9 expression cassettes in vitro in cell lines (fig. 2) and in vivo in wild-type C57B1 / 6 mice (data not shown). Briefly, the cells were transfected with Cas9 constructs and, two days after transfection, lysed for total protein extraction or fixed for labeling experiments. NMCas9 was detected in HeLa and C2C12 cells in the expected molecular size by western blot analysis (fig. 2) and in the nucleus of the cells by immunofluorescence (data not shown) with antibodies directed against the Flag epitope.

Con el fin de delecionar la repetición de CTG de la región 3'UTR del gen DMPK humano, los presentes inventores diseñaron ARNgm situados cadena arriba y cadena debajo de esta región de repetición de CTG, que podría controlar el corte doble de ADN mediado por NMCas9 después de la secuencia del codón de parada de DMPK y antes de la señal de poliA. De esta manera, los presentes inventores diseñaron un casete de expresión que contenía dos andamiajes de ARNgm, cada una bajo el control del promotor U6 y localizado en tándem en el mismo plásmido (fig.In order to delete the CTG repeat of the 3'UTR region of the human DMPK gene, the present inventors designed mRNAs located upstream and downstream of this CTG repeat region, which could control the double cut of DNA mediated by NMCas9 after the DMPK stop codon sequence and before the polyA signal. Thus, the present inventors designed an expression cassette containing two scaffolds of mRNA, each under the control of the U6 promoter and located in tandem in the same plasmid (fig.

1, constructo C). Los presentes inventores seleccionaron cuatro protoespaciadores ARNgm que minimizaban los efectos fuera-de-diana (ver las dianas genómicas respectivas en la fig. 3 y en la Tabla 1) y se clonaron en los sitios de clonación BsI y Bspml que precedían a los andamiajes de ARNgm.1, construct C). The present inventors selected four mRNA proto-spacers that minimized out-of-target effects (see the respective genomic targets in Fig. 3 and Table 1) and were cloned into the BsI and Bspml cloning sites that preceded the scaffolding of MRNA

Tabla 1: secuencias de ADN de protoespaciador y de motivo contiguo a protoespaciador (PAM)Table 1: proto-spacer and contiguous to proto-spacer (PAM) DNA sequences

# Referencia del genoma humaNO:feb. de 2009 (GRCh37/hg19)# Reference of the human genome: Feb. from 2009 (GRCh37 / hg19)

Los presentes inventores generaron tres parejas de ARNgm diferentes que potencialmente podrían controlar la deleción de la expansión de repeticiones de CTG (p, y y 6, Tabla 2).The present inventors generated three different mRNA pairs that could potentially control the deletion of the expansion of CTG repeats (p, y and 6, Table 2).

Tabla 2: parejas de ARNgm y tamaño de deleción esperadoTable 2: mRNA pairs and expected deletion size

+ Considerando un número de no correspondencias < 6, comprobado mediante Cas-OFFinder http://www.rgenome.net/cas-offinder/+ Considering a number of non-correspondences <6, checked by Cas-OFFinder http://www.rgenome.net/cas-offinder/

+++ Con cebadores F1-DMPK-3UTR y R1-DMPK-3UTR+++ With F1-DMPK-3UTR and R1-DMPK-3UTR primers

* Tamaño calculado para un número de repeticiones de CTG (n CTG)=20* Size calculated for a number of CTG repetitions (n CTG) = 20

(861* para células HeLa [n CTG=10]; 846* para células 293T [n CTG=5])(861 * for HeLa cells [n CTG = 10]; 846 * for 293T cells [n CTG = 5])

#tamaño calculado considerando un corte preciso entre el 3° y 4° nucleótido cadena arriba de la secuencia de PAM # size calculated considering a precise cut between the 3rd and 4th nucleotide upstream of the PAM sequence

Estos constructos también se subclonaron en un plásmido de VAA que alojaba la secuencia para una proteína fluorescente verde (fig. 1, constructo D y materiales y métodos).These constructs were also subcloned into a VAA plasmid that housed the sequence for a green fluorescent protein (Fig. 1, construct D and materials and methods).

Deleción mediada por Cas9 de la expansión de repeticiones de CTG en el gen DMPK humanoCas9-mediated deletion of the expansion of CTG repeats in the human DMPK gene

Con el fin de someter a ensayo si los ARNgm diseñados eran capaces de dirigir NMCas9 a las regiones diana de ADN genómico correspondientes, los presentes inventores cotransfectaron células HeLa (o HEK 293T) con el plásmido que contenía el casete de expresión EFS-NMCas9 y cada uno de los tres plásmidos que alojaban una pareja de ARNgm y controles apropiados (Tabla 2 y figura 4). A continuación, se extrajo el ADN de las células y se utilizó como molde en una reacción de PCR para amplificar una región de 891 pb de longitud que incluía todas las dianas de ADN genómico (cebadores F1- y R1-DMpK-3'UTR, fig. 3). El gel de agarosa de los productos de PCR se muestra en la fig.In order to test whether the designed mRNAs were capable of directing NMCas9 to the corresponding genomic DNA target regions, the present inventors co-transfected HeLa cells (or HEK 293T) with the plasmid containing the EFS-NMCas9 expression cassette and each one of the three plasmids that housed a pair of mRNA and appropriate controls (Table 2 and Figure 4). Next, the DNA was extracted from the cells and used as a template in a PCR reaction to amplify a region of 891 bp in length that included all genomic DNA targets (primers F1- and R1-DMpK-3'UTR, fig. 3). The agarose gel of the PCR products is shown in fig.

4. Las parejas de ARNgm (p, y y 6) resultó en la amplificación por PCR del fragmento de ADN de 891 pb y un fragmento más pequeño correspondiente a la región de ADN esperada después de la escisión mediada por CRlSPR/Cas9 (fig.4. The mRNA pairs (p, y and 6) resulted in PCR amplification of the 891 bp DNA fragment and a smaller fragment corresponding to the expected DNA region after CRlSPR / Cas9 mediated cleavage (fig.

4, flecha roja). Estos productos de PCR de tamaño más pequeño se subclonaron y se secuenciaron para verificar su identidad. Estos productos de PCR de tamaño más pequeño se subclonaron y se secuenciaron para verificar su identidad. Los resultados de la secuenciación de los productos de PCR obtenidos con las parejas de ARNgm p (1 más N) y 6 (7 más N) se representan en la fig. 6 y demuestran que, en la mayoría de los clones, los sitios de corte de NMCas9 se localizan en el nucleótido N3 o N4 de la secuencia diana contiguos al PAM (#n). Por tanto, estos resultados demuestran la eficacia de los ARNgm diseñados en el control de la deleción mediada por NMCas9 del ADN genómico flanqueante de la repetición de CTG de DMPK. 4, red arrow). These smaller PCR products were subcloned and sequenced to verify their identity. These smaller PCR products were subcloned and sequenced to verify their identity. The sequencing results of the PCR products obtained with the mRNA pairs p (1 plus N) and 6 (7 plus N) are shown in fig. 6 and demonstrate that, in most clones, the NMCas9 cleavage sites are located in nucleotide N3 or N4 of the target sequence adjacent to the PAM (#n). Therefore, these results demonstrate the efficacy of mRNAs designed in the control of NMCas9-mediated deletion of genomic DNA flanking the repeat CTG of DMPK.

Los presentes inventores también sometieron a ensayo la eficacia de este sistema CRISPR/Cas9 en el locus DMPK humano en presencia de una expansión de CTG patológica. Con este fin, células primarias derivadas de un paciente de DM1 portador de una repetición de 200 CTG (DM200) se cotransfectaron con los plásmidos EFS-NMCas9 y ARNgm Y (ARNgm 7 más E, constructo D) y se utilizaron células primarias procedentes de un individuo normal (Ctrl) como control (fig. 1). Se extrajo ADN genómico de las células Ctrl y DM200 separadas si GFP-positivas con el fin de incrementar la proporción de ADN originado de células que expresaban los ARNgm. Se llevó a cabo una PCR tal como se ha indicado anteriormente y resultó en la amplificación de pequeños fragmentos de ADN en células Ctrl y DM200 que correspondían en tamaño a los fragmentos originados de la región de ADN genómico escindida esperada (fig. 5, flecha roja).The present inventors also tested the efficacy of this CRISPR / Cas9 system in the human DMPK locus in the presence of a pathological CTG expansion. To this end, primary cells derived from a DM1 patient carrying a 200 CTG repeat (DM200) were co-transfected with plasmids EFS-NMCas9 and mRNA Y (mRNA 7 plus E, construct D) and primary cells from a normal individual (Ctrl) as a control (fig. 1). Genomic DNA was extracted from separate Ctrl and DM200 cells if GFP-positive in order to increase the proportion of DNA originating from cells expressing mRNAs. PCR was carried out as indicated above and resulted in the amplification of small DNA fragments in Ctrl and DM200 cells that corresponded in size to the fragments originating from the region of expected excised genomic DNA (Fig. 5, red arrow ).

Los presentes inventores observaron, además, productos de PCR de longitud completa y de longitud parcial correspondientes a ADN genómico no cortado (fig. 5, flechas verde y azul, respectivamente). Los últimos es probable que sean una amplificación parcial de la región del ADN genómico completo del paciente de DM1, ya que las repeticiones de 200 CTG no pueden amplificarse fácilmente mediante PCR.The present inventors also observed full length and partial length PCR products corresponding to uncut genomic DNA (Fig. 5, green and blue arrows, respectively). The latter are likely to be a partial amplification of the entire genomic DNA region of the DM1 patient, since repetitions of 200 CTG cannot be easily amplified by PCR.

Globalmente estos resultados demuestran que el sistema Cas9-ARNgm descrito resulta adecuado para escindir las repeticiones de CTG de la región 3'UTR del gen DMPK humano. Overall these results demonstrate that the Cas9-mRNA system described is suitable for cleaving CTG repeats from the 3'UTR region of the human DMPK gene.

Claims

REIVINDICACIONES

i. A pair of mRNA molecules, wherein said pair comprises a first and a second mRNA molecules that are capable of linking a sequence complement to a genomic DNA target sequence that is located on the 5 'and 3 side by base pairing. 'of an expansion of nucleotide repeats located within a non-coding region of a gene of interest, respectively, thus being appropriate to cleave said nucleotide expansion with a CRISPR / Cas9 system,

where the gene of interest is the DMPK gene ,

where the mRNA molecule pair is a pair of:

- an mRNA comprising a selected guide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and

- an mRNA comprising a selected guide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

2. The mRNA pair according to claim 1, wherein the mRNA molecule pair is a pair of:

- an mRNA selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, and

- an mRNA selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.

3. An mRNA comprising a sequence that is capable of linking the sequence complement to a target genomic DNA sequence that is located on the 5 'or 3' side of an expansion of nucleotide repeats within a region not coding for a gene of interest, where the gene of interest is the DMPK gene,

wherein said mRNA comprises a guide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

4. The mRNA according to claim 3, wherein said mRNA is selected from the group consisting of SEQ

ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8.

5. An mRNA coding vector or a pair of mRNA molecules according to any one of claims 1 to 4, the vector being preferably a plasmid or a viral vector, such as a VAAr vector.

6. A target cell, which is transfected or transduced with the vector according to claim 5.

7. A method for the production of an mRNA or an mRNA pair, comprising culturing the target cell according to claim 6 under conditions that allow the production of said mRNA or mRNA pair, and recovering said mRNA or said pair of molecules of molecules. MRNA from said culture stage.

8. An in vitro method for cleaving a nucleotide repeat located within a non-coding region of a DMPK gene in a cell, comprising introducing into said cell a pair of mRNA molecules according to claim 1 or 2, or a vector according to claim 5, and a CRISPR / Cas9 endonuclease derived from N. meningitidis.

9. An mRNA pair according to claim 1 or 2, or a vector according to claim 5, for use in combination with a Cas9 endonuclease derived from N. meningitidis in a method for treating type 1 myotonic dystrophy.

10. The mRNA pair for use according to claim 9, wherein the expansion of nucleotide repeats is an expansion of binucleotide, trinucleotide, tetranucleotide, pentanucleotide or hexanucleotide repeats located within the 3'-UTR of the DMPK gene , in particularly an expansion of trinucleotide repeats.