ES2729627T3 - Procedimiento de identificación de la composición cuantitativa de células sanguíneas en una muestra - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de un leucocitograma epigenético o un citograma de linfocitos T epigenético, que comprende las etapas de a) determinar y proporcionar factores de corrección específicos del ensayo de qPCR, con el fin de normalizar los ensayos de qPCR como se realizan y corregir las diferencias en la eficacia de los ensayos b) detectar epigenéticamente células sanguíneas en una muestra biológica, que comprende la conversión con bisulfito de al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas a detectar; y c) cuantificar dichas células sanguíneas según lo detectado, que comprende la evaluación de la cantidad relativa de ADN convertido con bisulfito mediante qPCR, y la normalización de dicha cantidad utilizando un estándar de normalización, en el que dicho estándar de normalización es una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas a detectar, y al menos una región de control que no es específica de la célula, en el que dichas regiones están presentes en el mismo número de copias en dicha molécula y/o una muestra de células sanguíneas naturales de composición conocida, en el que se detectan regiones marcadoras del tipo celular que discriminan un tipo celular específico y/o al menos una subpoblación específica de células de otras células de un leucocitograma, o un citograma de linfocitos T, y en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición de CpG dentro de cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con las SEQ ID No 1 a 684 es indicativo de un tipo de célula respectivo como se indica en la tabla 4, en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de una cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con la SEQ ID No 685 o 686 es indicativo de un granulocito neutrófilo, en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de una cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con las SEQ ID No 687 a 689 es indicativo de un granulocito eosinófilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de identificación de la composición cuantitativa de células sanguíneas en una muestra

La presente invención proporciona un leucocitograma epigenético o un citograma de linfocitos T epigenético que identifica la imagen cuantitativa e integral de la composición celular en una muestra biológica, en el que ventajosamente se usa un estándar de normalización. El estándar de normalización es una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas y/o inmunitarias que se van a detectar, y al menos una región de control que no es específica de la célula, en la que dichas regiones están presentes en el mismo número de copias en dicha molécula y/o una muestra de células sanguíneas naturales de composición conocida. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes de la invención

Un "recuento de células sanguíneas", "hemograma completo" o "perfil de células sanguíneas" comúnmente se refiere a un conjunto de pruebas para determinar el número, la proporción y el aspecto de las células sanguíneas y/o sus subgrupos celulares (por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, células CD19 o CD3, y sus subgrupos, tales como las células CD3+CD4+ y/o CD3+/CD8+). Dicho recuento sanguíneo se usa en el diagnóstico clínico como una prueba de detección general para detectar trastornos o una determinación del estado de salud general de un individuo. En general, un "hemograma" incluye ensayos dirigidos al hematocrito, a la cuantificación de la hemoglobina, de células sanguíneas totales y al índice de glóbulos rojos (por ejemplo, el volumen corpuscular medio, la hemoglobina corpuscular media, la concentración de hemoglobina corpuscular media, distribución de los glóbulos rojos).

Los glóbulos blancos (también conocidos como leucocitos) son parte del sistema inmunitario celular (los presentes autores definen explícitamente todas las células inmunitarias, incluidos los linfocitos B como sistema inmunitario celular) y desempeñan un papel clave en la defensa de los mamíferos frente a los efectos patológicos causados por organismos extraños (en particular, por ejemplo: virus, bacterias, parásitos, etc.), pero también frente a anomalías de las propias células enfermas, como las células tumorales. Además, las células inmunitarias están sujetas a enfermedades, ya sea como enfermedades inmunitarias primarias (congénitas), tales como el síndrome de IPEX o como enfermedades inmunitarias secundarias (adquiridas), como por ejemplo el SIDA, VIH. En las primeras, el propio sistema inmunitario está alterado, mientras que en las últimas, los factores externos (como las infecciones por virus, radiación, quimioterapias o factores ambientales) llevan a un debilitamiento del sistema inmunitario. Existen varios tipos de leucocitos y o bien provienen del linaje mieloide, por ejemplo, los granulocitos neutrófilos, eosinófilos y basófilos, los mastocitos y los macrófagos - o bien provienen del linaje mieloide, incluyendo todas las subpoblaciones de linfocitos - tales como por ejemplo los linfocitos T, los linfocitos B, las células NK. Dado que la composición del sistema inmunitario y sus miembros celulares, se ha sometido a muchos análisis, las anomalías de este recuento normal de células inmunitarias (o la proporción) se pueden reconocer fácilmente, se usa para diagnóstico y puede usarse para la toma de decisiones clínicas. Por lo tanto, la proporción y el recuento de estas células se analizan habitualmente en entornos clínicos, tanto como herramienta de diagnóstico o de análisis rutinario, así como en investigaciones o ensayos clínicos, con el fin de detectar cualquier anomalía o cambio evidente que pueda estar causados por una enfermedad o un tratamiento de la enfermedad u otros factores internos o externos. Por ejemplo, los hemogramas se utilizan para diagnosticar la aparición/ocurrencia de leucopenias o linfopenias o leucocitosis o linfocitosis, como la granulocitosis. Además, los hemogramas se hacen para controlar el éxito del tratamiento de todas las enfermedades que son resultado de, la causa o cuyo tratamiento puede dar como resultado cambios en el recuento general o específico de leucocitos o linfocitos. Por ejemplo, para diagnosticar o controlar infecciones, anemia, leucemia o efectos de las quimioterapias, se utiliza un denominado hemograma "diferencial" completo para analizar e identificar las células inmunitarias y sus subpoblaciones. En algunos trastornos inmunitarios primarios y secundarios, este procedimiento puede ser la única herramienta de diagnóstico disponible. El hemograma diferencial incluye ensayos dirigidos a una cuantificación del total de glóbulos blancos, granulocitos neutrófilos, linfocitos, monocitos, granulocitos eosinófilos y granulocitos basófilos.

Habitualmente, para células solubles, es decir, principalmente sangre, pero también tejidos solubilizados o fluidos corporales dicho perfil de células inmunitarias específicas se mide por citometría de flujo o por inmunohistoquímica (IHQ) para tejidos sólidos. Ambas tecnologías funcionan sobre la base de epítopos de proteínas expuestos en membranas celulares que son específicos para cada subtipo de subpoblación celular. Recientemente, la investigación se centró en el papel biológico de las subpoblaciones de leucocitos, y esto da como resultado una fuerte demanda para aplicaciones clínicas y de investigación que permiten identificar tales poblaciones.

Técnicamente, en diagnósticos rutinarios, el hematocrito, la hemoglobina, así como el recuento total de glóbulos blancos, se determinan mediante un contador de células automático basado en la detección de luz y la impedancia eléctrica. Un hemograma diferencial de glóbulos blancos, que incluye los granulocitos neutrófilos, eosinófilos, basófilos, los monocitos y los mastocitos se determina mediante un recuento manual al microscopio o un recuento automático de frotis de sangre.

Los procedimientos adicionales, que permiten la detección de poblaciones de linfocitos T son los análisis multimétricos del MHC, el ensayo de captura de citocina, las detecciones de linfocitos T (ensayo ELISPOT) o la detección y localización meramente cualitativas de células inmunitarias (análisis inmunohistoquímicos). Al igual que la citometría de flujo, estos ensayos se basan en una detección de proteínas; no se utilizan marcadores independientes del nivel de expresión. Cabe destacar que todos estos ensayos, así como todos los ensayos basados en la detección de ARNm, varían de una célula a otra. Esto se debe a que incluso las células que son indudablemente positivas para una determinada proteína presentan cantidades de proteína variables en el tiempo. Por lo tanto, debe determinarse un umbral de "positividad" para todos y cada uno de los marcadores de proteínas en función de las propiedades de afinidad y unión inespecífica del anticuerpo dado, así como de la cantidad promedio de expresión en superficie de la proteína diana.

Aunque casi todas las células de un individuo contienen exactamente el mismo complemento/composición del código de ADN, los organismos superiores deben imponer y mantener diferentes patrones de expresión génica en los diversos tipos de tejido. La mayoría de la regulación genética es transicional, dependiendo del estado actual de la célula y de los cambios en los estímulos externos. La regulación persistente, por otro lado, es la función principal de la epigenética: patrones reguladores hereditarios que no alteran el código genético básico del ADN. La metilación del ADN es la forma arquetípica de regulación epigenética; sirve como la memoria estable para las células y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la identidad a largo plazo de diversos tipos de células. Recientemente, se descubrieron otras formas de regulación epigenética. Además de la "quinta base" 5-metilcitosina (mC), se pueden encontrar una sexta (5-hidroximetilcitosina, hmC), una séptima (5-formilcitosina, fC) y una octava (5-carboxicitosina, cC) (Michael J. Booth y col. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 de mayo de 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937). La principal diana de las modificaciones de ADN mencionadas es la secuencia de dos nucleótidos citosina-guanina (un 'sitio CpG'); en este contexto, la citosina (C) puede experimentar una modificación química simple para llegar a estar formilada, metilada, hidroximetilada o carboxilada. En el genoma humano, la secuencia de CG es mucho más rara de lo esperado, salvo en ciertos grupos relativamente densos llamados 'islas CpG'. Las islas CpG se asocian frecuentemente con los promotores de genes, y se ha estimado que más de la mitad de los genes humanos tienen islas CpG (Antequera y Bird, Proc Natl Acad Sci e E.UU. 90: 11995­ 9, 1993).

Para una de las modificaciones de la citosina recientemente descritas, la 5-hidroximetilación, se demostró la utilidad de la secuenciación de bisulfito oxidativo para mapear y cuantificar 5hmC en islas CpG (Michael J. Booth y col. Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 de mayo de 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937).

En el contexto de la presente invención, el término "cromatina convertible por bisulfito" significará una estructura de cromatina (por ejemplo, una estructura suficientemente abierta) que permite que el bisulfito modifique químicamente las citosinas. Por consiguiente, el término "convertibilidad del ADN por bisulfito" se relaciona con la extensión de las bases de citosina en dicha cromatina y/o del respectivo ácido nucleico que es parte de dicha cromatina, que puede ser (o ha sido) convertido utilizando un tratamiento con bisulfito. El término también se refiere a la extensión de las bases de citosina en un ácido nucleico de referencia (como un plásmido) que se puede convertir (o se ha convertido) utilizando un tratamiento con bisulfito. A su vez, el término "cromatina no convertible con bisulfito" o "ácido nucleico no convertible con bisulfito" se refiere a la extensión de las bases de citosina que no pueden (o no podrían) convertirse con un tratamiento con bisulfito.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se descubrieron recientemente tres nuevas modificaciones de la citosina. Por lo tanto, se espera que los descubrimientos científicos futuros conduzcan a una interpretación más precisa de los patrones epigenéticos de convertibilidad con bisulfito descritos en el pasado. Estos resultados pasados de la modificación de la citosina abarcan citosinas convertibles con bisulfito (no metilada, no modificada) y no convertibles con bisulfito (metiladas, modificadas). Ambos términos se deben reinterpretados, tal como se describe. De acuerdo con los nuevos descubrimientos científicos (i), la citosina no convertible con bisulfito abarca 5-metilcitosina (mC) y 5-hidroximetilcitosina (hmC), y (ii) la citosina convertible con bisulfito abarca 5-formilcitosina (fC), 5-carboxicitosina (cC) así como citosina no modificada.

Adicionalmente, las invenciones anteriores se basan en (i) la proporción de citosina convertible con bisulfito frente a la cantidad total de cromatina (independiente del tipo celular, locus de ADN convertible con bisulfito al 100%) o (ii) en la proporción de citosina convertible con bisulfito (fC, cC, citosina no modificada) frente a citosina no convertible con bisulfito (hmC y mC). Estas proporciones se utilizan para caracterizar el tipo de célula, la diferenciación celular, la etapa celular así como etapas celulares patológicas. Por lo tanto, las nuevas técnicas darán como resultado nuevas proporciones más específicas y podrían complementar los patrones actuales de las modificaciones epigenéticas específicos de células, específicos del estado celular y patológicos y, por lo tanto, definir nuevos biomarcadores posibles. Las nuevas proporciones que se descubrirán como biomarcadores se pueden definir como:

Proporción de biomarcadores = a/b

a = I (C y/o mC y/o hmC y/o fC y/o cC)

b = I (C y/o mC y/o hmC y/o fC y/o cC),

por lo que a y b se diferencian entre sí por uno a cuatro tipos de modificaciones. El descubrimiento de nuevas modificaciones en el ADN ciertamente ampliará esta enumeración.

Para los fines de la presente divulgación, las modificaciones epigenéticas en la secuencia de ADN se refieren a la terminología de (i) citosina convertible con bisulfito (5-formilcitosina, (fC) y/o 5-carboxicitosina (cC)) y (ii) citosina no convertible con bisulfito ((incluida 5-metilcitosina (mC), 5-hidroximetilcitosina, (hmC)). Como ambos tipos de metilación, mC y hmC no son convertibles con bisulfito, no es posible distinguir entre estos dos. Asimismo, fC, CC así como la citosina no modificada son convertibles con bisulfito y tampoco pueden distinguirse entre sí.

Además, aparte de las modificaciones del ADN, también las histonas experimentan modificaciones postraduccionales que alteran su interacción con el ADN y las proteínas del núcleo. Las modificaciones incluyen metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, sumoilación, citrulinación y ADP-ribosilación. El núcleo de las histonas H2A, H2B y H3 también se puede modificar. Las modificaciones de histonas actúan en diversos procesos biológicos tales como la regulación genética, la reparación del ADN, la condensación cromosómica (mitosis) y la espermatogénesis (meiosis). También para estas modificaciones, un patrón específico de modificación es específico para diferentes tipos de células, etapas celulares, estados de diferenciación y dicho patrón puede analizarse para determinar la convertibilidad con bisulfito o procedimientos similares para identificar ciertas células y estadios celulares. La presente invención también abarca el uso de estas modificaciones.

Se espera que en el futuro se descubran otras variantes de modificaciones del ADN. Cada tipo de modificación será convertible o no con bisulfito. Estas modificaciones novedosas también pueden usarse como lectura de biomarcadores. Adicionalmente, se espera que se establezcan nuevos procedimientos para la modificación con bisulfito, dando como resultado un conjunto diferente de ADN convertible y no convertible.

La variedad de indicaciones para las cuales el informe del estado de las células inmunitarias es clínica o analíticamente útil es muy grande. Para casi todas las enfermedades, el estado las células inmunitarias es directamente relevante o, como en el caso del cáncer, se vuelve relevante debido al impacto de los medicamentos que pueden causar trastornos inmunitarios secundarios y anomalías. Esta amplia importancia del estado inmunitario general en entornos de enfermedades da como resultado una importante demanda de procedimientos para medir estos parámetros, es decir, los subtipos y subpoblaciones de leucocitos.

La forma actual de abordar esta demanda es mediante procedimientos de citometría de flujo e inmunohistoquímica, que están bien establecidos y se han desarrollado en sistemas de alto rendimiento para uso en hospitales, son procedimientos estándar en los laboratorios de referencia y, para aplicaciones más simples, están a disposición de los facultativos. Sin embargo, ciertos problemas y requisitos limitan la aplicabilidad de la citometría de flujo y la inmunohistoquímica.

a) Para la citometría de flujo, las células necesitan estar intactas. Esto significa que la muestra de sangre debe medirse en un estado "reciente", cualquier retraso en la medición puede llevar a la desviación de los resultados. Como regla de oro, las muestras deben medirse en 8 horas, después de ese marco temporal, los granulocitos (una parte celular principal en la sangre) comienzan a desintegrarse. Como alternativa a la gestión de sangre reciente, es posible crioconservar muestras de sangre, pero hay problemas importantes asociados con el rendimiento y la reproducibilidad. Como consecuencia, se evita la citometría de flujo en ensayos clínicos rutinarios y se omiten muchos análisis potencialmente significativos, mientras que en los ensayos clínicos, en los que los marcadores inmunitarios son candidatos de biomarcadores principales para las predicciones del tratamiento, a menudo se dejan fuera o, si así lo exigen los reglamentos, es necesario configurar instalaciones adicionales.

b) La expresión de antígeno no es un proceso digital (encendido - apagado), sino analógico (bajo, medio, alto). Por lo tanto, se deben determinar los umbrales que definen señales positivas frente a negativas. Para ciertos marcadores, esto no es problemático, para otros, los umbrales son muy difíciles e imprecisos.

c) Para la citometría de flujo, también se plantea el problema de que muchos tipos de células no se identifican simplemente por una molécula de superficie (grupo de diferenciación - CD, del inglés clusterofdifferentiation), pero algunos tipos de células se caracterizan por proteínas solubles intra o extracelulares, por ejemplo, factores de transcripción o citocinas. Los marcadores actuales para los linfocitos Tfh, Th1, Th2 y Treg pertenecen a esta categoría de tipos de células, la aplicación de procedimientos completamente estandarizados es aún más difícil. Esto se debe a que los marcadores específicos del tipo celular deben capturarse para asociarse a la célula.

d) Además, la citometría de flujo depende de la solubilidad del sustrato analizado (suspensiones celulares). Con respecto a esto, las células tisulares se pueden solubilizar por digestión enzimática, pero esto a menudo lleva a la pérdida de sus moléculas de superficie, lo que hace que los marcadores del CD, como dianas principales para el análisis de citometría de flujo, sean inútiles.

e) A menudo, ni los marcadores de superficie ni los intra o extracelulares son específicos del tipo celular al 100 %. Se ha documentado la expresión "defectuosa" de ciertos productos genéticos (Wiezcorek y col., Cancer Res. 15 de enero de 2009; 69 (2): 599-608), lo que hace que la cuantificación sea algo imprecisa.

f) Dado que la inmunohistoquímica se basa en el mismo principio que la citometría de flujo, los problemas de especificidad se solapan. Sin embargo, el principal problema con esta tecnología es que se considera solo semicuantitativo. En particular, un problema particular es que un recuento global de células no es factible debido a la presencia de diversas capas de células diferentes, que son difíciles de distinguir y contar correctamente.

En lo que se refiere al aspecto e), los inventores han publicado previamente una publicación que demuestra que la citometría de flujo detecta epítopos expresados en superficie, pero no puede distinguir entre la expresión del epítopo específico del tipo celular y la inducción independiente del tipo celular de las expresiones del epítopo, así como no puede detectar células específicas que actualmente no expresan o expresan menos ciertos marcadores de superficie. La estimulación in vitro linfocitos T CD4+CD25+CD45RA+, por ejemplo, lleva a un elevado nivel de expresión de FOXP3, por lo que el gen FOXP3 todavía está metilado y, por lo tanto, inactivado (Baron y col., Epigenetics. eneromarzo de 2006;1(1): 55-60). Adicionalmente, para los linfocitos Th17 diferenciados in vitro no se observó desmetilación del promotor de IL-17A a pesar de los altos niveles de transcritos de IL-17A (Janson PCJ y col. Profiling of CD4+ T cells with epigenetic immune lineage analysis. The Journal of Immunology. 2010, 92-102). Por otro lado, se desvela que la metilación está conectada con la expresión del marcador (Hamerman, Page, Pullen. Distinct methylation states of the CD8p gene in peripheral T cells and Intraepithelial Lymphocytes. The Journal of Immunology 1997, P1240-1246; Janson P.C.J. y col. Profiling of CD4+ T cells with epigenetic immune lineage analysis. The Journal of Immunology.

2010. 92-102; Melvin y col. Hypomethylation in IFN-Gamma Gen correlates with expression of IFN-G, including CD8 cells., Eur J Immunol. Feb de 1995;25(2):426-30; Landolfi MM y col. CD2-CD4-CD8'lymph node T lymphocytes in MRL lpr/lpr mice are derived from a CD2+CD4+CD8+thymic precursor J Immunol. 15 de julio de 1993; 151(2):1086-96; y Carbone AM y col. Demethylation in CD8 suggests that CD4+ derives from CD8+ cells. Role of methylation pattern during cell development. Science. 25 de nov de 1988;242(4882):1174-6).

En vista de las demandas mencionadas anteriormente tanto en el diagnóstico clínico como en la investigación farmacéutica, se desea un nuevo procedimiento para proporcionar una cuantificación precisa y completa de una variedad de tipos de células en una muestra, con el fin de establecer un hemograma más preciso y, por lo tanto, notablemente mejorado. Otros objetos y ventajas se harán evidentes para el experto en la materia al leer la presente divulgación, y en particular los ejemplos a continuación.

En un primer aspecto del mismo, este objeto se resuelve por la presente invención mediante un procedimiento para producir un hemograma epigenético, que comprende las etapas para detectar epigenéticamente células sanguíneas en una muestra biológica y cuantificar dichas células sanguíneas según se detectó utilizando un estándar de normalización, en el que dicho estándar de normalización es una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas que se van a detectar, y al menos una región de control que no es específica de la célula, en la que dichas regiones están presentes en el mismo número de copias en dicha molécula y/o una muestra de células sanguíneas naturales de composición conocida.

La clave y la base de la presente invención es el uso de una variedad de diferentes marcadores de ADN convertibles con bisulfito específicos del tipo celular. Estos marcadores se emplean para la identificación y cuantificación de un solo tipo de célula sanguínea e inmunitaria.

En principio, previamente se demostró cómo se realiza una cuantificación de los tipos de células y el recuento de células sanguíneas basándose en procedimientos epigenéticos conocidos ((Wiezcorek y col., Cancer Res. 15 de enero de 2009;69(2):599-608, Sehouli y col. Epigenetics. febrero de 2011;6(2):236-46.). En resumen, una región génica específicamente modificada de tipo celular se cuenta (y amplifica) específicamente y, por lo tanto, se cuantifica junto con las especies opuestas de la región génica específica del tipo celular. Para proporcionar una cuantificación independiente, estas dos mediciones se ponen después en relación para proporcionar la parte percentil del tipo de célula en la muestra dada (sangre):

Número de copias del ADN convertible con bisulfito de la región genómica específica del tipo celular/(número de copias del ADN convertible con bisulfito de la región genómica específica del tipo celular) (número de copias del a Dn no convertible con bisulfito de la región genómica específica del tipo celular) = % del tipo de célula

Como alternativa, el número de copias del ADN convertible con bisulfito de una región génica específica del tipo celular se mide y se divide entre el número de copias del ADN convertible con bisulfito de una región génica no específica del tipo celular en la muestra dada. Este último se puede determinar midiendo todas las copias de ADN utilizando una región génica convertible completamente con bisulfito o una región génica inespecífica de la célula o una región que se sabe que no es uniformemente convertible con bisulfito o convertible con bisulfito en todos los tipos de células.

Número de copias del ADN convertible con bisulfito de la región genómica específica del tipo celular/Número de copias de ADN convertible con bisulfito de la región genómica inespecífica del tipo celular = % del tipo de célula

Por lo tanto, cuando se conoce un solo marcador genómico específico convertible con bisulfito, el sistema previamente establecido permite la cuantificación relativa (percentil (%)) de cualquier tipo de célula en una muestra dada. Para ello, se puede usar cualquier estandarización dada de números de copias o equivalentes de copias. La proporción de percentil resultante del tipo de célula en cuestión se correlaciona con la proporción de células medida con un procedimiento diferente. En el presente documento, "correlacionar" significa que, según la correlación de Spearman, la proporción más baja medida por la tecnología epigenética se corresponde con la parte más baja medida, por ejemplo, por citometría de flujo. Tal sistema ha demostrado ser muy estable, técnicamente robusto y fiable. Por lo tanto, siempre que se logre un marcador de ADN convertible con bisulfito altamente específico para la célula, en teoría, debería ser posible realizar una determinación concisa y precisa de la cantidad de células que poseen la región marcadora genómica específica convertible con bisulfito.

Se sabe que la eficiencia y el rendimiento de los sistemas de PCR en tiempo real (RT) difieren según los componentes de la RT-PCR, incluyendo los cebadores, las sondas y la pureza del ADN. Por lo tanto, se emplean estándares para explicar el problema para saber en qué valor de Cp (punto de cruce) o Ct (ciclo de umbral) se puede detectar una cantidad dada (conocida) de ADN estándar. Una serie de dilución de dicho ADN estándar proporciona una curva estándar y permite la normalización de sistemas de RT-PCR de rendimiento diferente/eficientes. Dado que la cuantificación se realiza en un sistema equivalente, las diferencias en el rendimiento se normalizan. Sin embargo, el problema abordado se refiere a una (RT-)PCR que se realiza en el ADN con el objetivo de detectar ADN alterado biológica y/o químicamente. La complejidad de este ADN alterado biológica y/o químicamente difiere del ADN genómico normal/natural (comenzando por el simple hecho de que la complejidad de las moléculas de ADN difiere, ya que un plásmido consiste en ADN de cadena doble de cuatro bases (CTGA), mientras que el ADN genómico consiste en cadena doble de cinco bases (CTGACm), y el ADN convertido con bisulfito es de cadena simple y de solo tres bases (TGA)). Por lo tanto, la eficacia de la amplificación difiere entre el ADN diana (es decir, el ADN genómico cromosómico humano o el ADN convertido con bisulfito) y el ADN estándar, si el estándar es un plásmido o ADN genómico, pero lo más importante, la "diferencia de eficacia de amplificación" entre el estándar (plásmido) y el ADN diana difiere de la diana de amplificación a la diana de amplificación. (es decir, par de cebadores, sonda etc.). Esto lleva a una serie de observaciones, cuando la qPCR se realiza en ADN amplificado y tratado con bisulfito, como, por ejemplo:

Cuando se midan diferentes células sanguíneas en una muestra, independientemente del procedimiento utilizado, el número total de células debe ser equivalente. Sin embargo, en una muestra dada que se distribuye equitativamente para el rendimiento de diferentes ensayos de qPCR, a pesar del uso de estándares individuales para cada reacción, el número total de copias detectadas es diferente. Esto lleva al siguiente problema (aquí se muestra con CD3 como ejemplo) en caso de (por ejemplo) muestras de sangre que se miden utilizando diferentes sistemas de RT-PCR:

Tabla 1: Cálculo del número total de copias de ADN y del contenido de células cuantitativo después de la qPCR epigenética utilizando ADN de una muestra de sangre amplificado y tratado con bisulfito. (CP) punto de cruce, (CN-BC) número de copias de la región de ADN del marcador de CD3+ tratado con bisulfito, (CN-NBC) número de copias de la región de ADN del marcador de CD3+ no tratado con bisulfito, (CN-GAPDH) número de copias de la región de ADN del marcador de GADPH convertido con bisulfito.

Como se indica en la Tabla 1, el número total de copias de ADN de CD3+ difiere entre los dos sistemas de estandarización usados: ADN convertido con bisulfito frente a ADN no convertido con bisulfito y región del marcador de CD3+ convertido con bisulfito frente a región del marcador de GADPH (célula general) convertido con bisulfito. Para la primera muestra de sangre (WBL02), número de copias de ADN de CD3+ calculadas a través del número de copias de ADN de GAPDH convertido con bisulfito (1420 copias) es más pequeño que el calculado a través del número de copias de ADN de CD3+ convertidas con bisulfito frente a las no convertidas con bisulfito (1678 copias). Para la segunda muestra (WBL03) la situación es similar. Las diferencias se vuelven más obvias cuando se usan este número de copias calculado para la cuantificación de células CD3+ en estas dos muestras de sangre. Para la muestra WBL02, la cuantificación a través del número de copias de ADN convertido con bisulfito frente al no convertido con bisulfito da como resultado el 36,6 % de células CD3+, mientras que la cuantificación a través del número de copias de ADN de CD3+ convertidas con bisulfito frente al número de copias de ADN de GADPH convertido con bisulfito da como resultado el 50,1 % de células CD3+. Tanto los resultados como los procedimientos difieren fuertemente.

Como se mencionó, incluso si se realiza la normalización en un estándar plasmídico convertido con bisulfito, los diferentes rendimientos/eficacias de los diferentes ensayos no llevan al mismo número de copias.

Este problema se hace particularmente evidente, cuando los tipos de células purificadas se miden con "sus" marcadores epigenéticos específicos del tipo celular, y se comparan con la cantidad total de células en la muestra (medida por un marcador no específico del tipo celular (GAPDH)) y se mide por ADN no convertible con bisulfito de una región marcadora específica del tipo celular (aquí FOXP3).

Tabla 2: Evaluación de la cantidad cuantitativa de linfocitos T reguladores (Treg) en dos muestras de Treg purificadas. Se aisló el ADN, se trató con bisulfito y se evaluó la cantidad relativa de ADN convertido con bisulfito y no convertido con bisulfito mediante qPCR. El número de copias de ADN convertido con bisulfito en las regiones de FOXP3 específicas de la célula se establecieron en relación con el número de copias de ADN convertido con bisulfito en la región de GAPDH no específica de la célula, así como con el ADN no convertido con bisulfito en las regiones de FOXP3 específicas del tipo celular para obtener el número cuantitativo de Treg. (CP) punto de cruce), (CN-BC) número de copias de la región de ADN de FOXP3 específico del tipo celular y convertido con bisulfito, (CN-NBC) número de copias de la región de ADN de FOXP3 específica del tipo celular y no convertida con bisulfito (CN-GAPDH) número de copias de la región de ADN de GAPDH convertido con bisulfito.

Como puede verse en la Tabla 2, de nuevo, los resultados para ambos procedimientos de cuantificación difieren fuertemente (el 97 % frente al 102 % y el 97 % frente al 106 %).

Por último, cuando diferentes fracciones de células, por ejemplo, los leucocitos sanguíneos, se miden y, cuando se agregan, deben formar todas las células de la muestra como están presentes, el problema anterior hace que sea imposible proporcionar un "hemograma completo" correcto. Como ejemplo de esto, para dos muestras de sangre se cuantificaron los leucocitos (Tabla 3, muestra 04 y muestra 08). En el presente documento, el término leucocitos resume los cinco tipos de glóbulos blancos: granulocitos, monocitos, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos T CD3+. Por consiguiente, se esperaba que los recuentos de una sola célula sumaran el 100 %, que representa un leucocitograma (completo). Sin embargo, cuando se utilizan análisis de qPCR epigenéticos, este no suele ser el caso (véase la Tabla 3). La suma de cantidades individuales de leucocitos a menudo difiere del 100 %.

Tabla 3: Evaluación de la composición celular cuantitativa de dos muestras de sangre. Se aisló el ADN, se trató con bisulfito y se evaluó la cantidad relativa de ADN convertido con bisulfito mediante qPCR. El número de copias de ADN convertido con bisulfito en regiones específicas de las células se estableció en relación con el número de copias de la región de ADN para GAPDH inespecífica de la célula y convertidas con bisulfito para obtener el número cuantitativo de leucocitos. (CN-BC) número de copias de la región de ADN marcadora específica del tipo celular convertido con bisulfito, (CN-GAPDH) número de copias de la región marcadora de ADN de GADPH convertido con bisulfito.

Al resumir los problemas mencionados anteriormente de la cuantificación de células epigenéticas, una herramienta precisa de recuento de células sanguíneas proporciona lo siguiente:

1. permite la evaluación de un recuento preciso y completo de células sanguíneas e inmunitarias,

2. supera las diferencias en el rendimiento y/o la eficacia del ensayo entre los estándares utilizados y la muestra biológica a analizar,

3. es independiente de la integridad de la membrana de las células a contar (células intactas o no intactas), y 4. es independiente del tipo de muestra que contiene las células (reciente, congelada, embebida, almacenada, fluidos, tejidos sólidos).

El documento WO 2013/1014122 A1 desvela marcadores epigenéticos para linfocitos citolíticos naturales. De manera similar,

Wieczorek y col., "Quantitative DNA methylation analysis of FOXP3 as a new method for counting regulatory T cells in peripheral blood and solid tissue", Cancer Res, vol. 69, n.° 2, 15 de enero de 2009, páginas 599-608, desvela marcadores epigenéticos para linfocitos T reguladores (Tregs) y procedimientos de cuantificación relacionados. Sehouli y col. "Epigenetic quantification of tumor-infiltrating T lymphocytes", Epigenetics, vol. 6, n.° 2, 1 de febrero de 2011 también desvela marcadores epigenéticos para linfocitos T reguladores (Treg) y procedimientos de cuantificación relacionados y menciona que la cuantificación epigenética de Treg es al menos equivalente a los enfoques de FACS para la cuantificación celular. Además, se desvela el uso de plásmidos que contienen secuencias idénticas a las variantes TpG y CpG de las regiones en marcadores específicos de células junto con GAPDH (región de control no específico de células) para la normalización de los datos de cuantificación.

La presente invención proporciona una herramienta de este tipo y os respectivos procedimientos. De acuerdo con la presente invención, la evaluación del leucocitograma epigenético o del citograma de linfocitos T epigenético comprende la medición de la cantidad absoluta de células mediante la normalización de los resultados de qPCR en un estándar de normalización no convertido o convertido con bisulfito. Los estándares de normalización consisten en una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas que se van a detectar, y al menos una región de control que no es específica de la célula, en la que dichas regiones están presentes en el mismo número de copias en dicha molécula y/o una muestra natural de células sanguíneas de composición conocida, y en la que se detectan regiones marcadoras del tipo celular que discriminan un tipo específico de célula específico y/o al menos una subpoblación específica de células de otras células de un leucocitograma, o un citograma de linfocitos T, y en la que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con la SEQ ID NO 1 a 684 es indicativa de un tipo de célula respectivo como se indica en la tabla 4 o en la que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con la SEQ ID NO 685 o 686 es indicativa de un granulocito neutrofílico, o en la que una conversión de bisulfito de al menos una posición CpG dentro de cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con la SEQ ID NO 687 a 689 es indicativa de un granulocito eosinófilo.

En una primera etapa de una realización preferida del procedimiento, los factores de corrección específicos del ensayo de qPCR se determinan para lograr la normalización y la comparabilidad de todos los ensayos de qPCR, así como para corregir las diferencias en las eficacias del ensayo. En una segunda etapa, se aísla el ADN de la muestra biológica, se purifica y se trata con bisulfito. A esto le sigue la qPCR específica para regiones marcadoras genómicas inespecíficas y/o específicas del tipo celular convertidas con bisulfito. Los resultados de la amplificación de qPCR se normalizan luego con dicho estándar de normalización, que representa la cantidad relativa de copias de ADN del marcador y, por lo tanto, la cantidad relativa de células específicas. El estándar de normalización contiene regiones marcadoras genómicas convertidas con bisulfito o contiene regiones marcadoras naturales no convertidas con bisulfito. Antes de iniciar la qPCR, en el último caso, el ácido nucleico se tratará con bisulfito en paralelo a la muestra biológica que se analiza. En una etapa siguiente, tras la qPCR, la cantidad relativa normalizada de copias del ADN del marcador se corrige mediante un factor de corrección específico del ensayo como se describe en el presente documento para corregir las diferencias en las eficacias del ensayo que indican la cantidad absoluta de las células.

El presente procedimiento permite una cuantificación de células sanguíneas no intactas pero también intactas en muestras biológicas, como, por ejemplo, muestras secas, congeladas, embebidas, almacenadas, así como muestras de fluidos corporales recientes, manchas de sangre seca, coágulos de sangre y muestras de tejidos. La muestra no contiene células purificadas o enriquecidas. Además, el procedimiento de la presente invención proporciona un hemograma, en el que la identidad y la cantidad de células se basa en una información clara de sí/no en el nivel genómico que es independiente de los niveles de expresión de proteínas.

La presente divulgación proporciona así un recuento de células inmunitarias para ser utilizado como una herramienta analítica y de diagnóstico para uso médico y como base para decisiones terapéuticas.

Preferentemente, el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende además el uso de un estándar de normalización no convertido o convertido con bisulfito para la normalización, por ejemplo, de los resultados de qPCR. La expresión estándar de normalización "no convertido con bisulfito" abarca moléculas de ADN naturales que contienen las modificaciones biológicas originales/primarias, tales como formilación, carboxilación, metilación o hidroximetilación y que no está tratada con bisulfito, y por lo tanto no está convertida con bisulfito. El término estándar de normalización "convertido con bisulfito" abarca moléculas de ADN que contienen secuencias de marcador (genómico) correspondientes a regiones marcadoras específicas y no específicas del tipo de célula ya convertidas con bisulfito.

La molécula de ácido nucleico no convertida con bisulfito o convertida con bisulfito se selecciona preferentemente de un plásmido, un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial humano (HAC), un cromosoma artificial derivado de PI (PAC), un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y un producto de PCR. El estándar de normalización convertido con bisulfito es un plásmido, cromosomas artificiales de levadura (YAC), un cromosoma artificial humano (HAC), un cromosoma artificial derivado de PI (PAC), un cromosoma artificial bacteriano (BAC) o un producto de PCR.

La muestra de células sanguíneas naturales es preferentemente una muestra de sangre de composición celular conocida y/o de composición conocida de los tipos de células sanguíneas, y preferentemente se produce de antemano, es decir, la cantidad y el número de tipos de células sanguíneas que se combinan están predeterminados.

En una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, el estándar de normalización, es decir, el plásmido, YAC, hAc , PAC, BAC y el producto de PCR, contiene regiones marcadoras genómicas específicas e inespecíficas de las células (que se analizarán de acuerdo con el hemograma epigenético) en el mismo número de copias conocido en dicha molécula. En una realización, cada uno de estos estándares es una única molécula que contiene el mismo número de todas las regiones marcadoras genómicas específicas e inespecíficas del tipo celular de interés en el hemograma epigenético que se establecerá. La muestra de células sanguíneas naturales (preferentemente de mamíferos, como la humana) utilizada como el estándar de normalización no convertida con bisulfito contiene células en una composición y cantidad conocidas, por lo que las células se pueden purificar previamente y mezclar previamente para obtener una muestra de composición conocida, que también está predeterminada.

Durante el procesamiento analítico, el estándar de normalización no convertido con bisulfito se trata con bisulfito en paralelo y de la misma manera que el tratamiento con bisulfito de la muestra biológica a analizar.

A continuación, la qPCR en la muestra biológica desconocida, así como en el estándar de normalización no convertido con bisulfito tratado con bisulfito (ahora), se realiza utilizando cebadores específicos que ayudan a detectar regiones genómicas convertidas con bisulfito específicas o no específicas del tipo celular. En cambio, el estándar de normalización convertido con bisulfito (obviamente) no se tratará con bisulfito, ya que ya contiene secuencias marcadoras específicas que se corresponden con secuencias marcadoras convertidas con bisulfito reconocidas por los cebadores de qPCR que son específicos para regiones genómicas convertidas con bisulfito.

En una realización preferida, el estándar de normalización comprende una cantidad predeterminada de células sanguíneas de los tipos que se detectarán y analizarán de acuerdo con el hemograma. Preferentemente, se utiliza un estándar de normalización que consiste en un número de copias definido y la misma cantidad estequiométrica de células específicas y/o de regiones marcadoras específicas del tipo celular y/o inespecíficas del tipo celular. Se prefiere un único plásmido que contenga el mismo número de copias y/o la cantidad estequiométrica de regiones marcadoras específicas del tipo celular y/o inespecíficas del tipo celular para todos los tipos celulares de interés para el hemograma.

Una realización preferida del procedimiento según la invención comprende además la etapa de corregir dicho hemograma epigenético producido con un factor de corrección específico del ensayo. Dicho factor de corrección específico del ensayo (para las células detectadas y analizadas) se determina comparando la cantidad cuantitativa conocida de células en dicha muestra de células naturales de mamíferos provista de la cantidad relativa de números de copias de ADN de marcador específico del tipo celular convertido con bisulfito de dicha muestra de células naturales de mamíferos evaluada por la qPCR utilizando el estándar de normalización. Utilizando este enfoque, el presente procedimiento permite una cuantificación precisa de las células, así como tener en cuenta cualquier variación específica del ensayo que pueda haber ocurrido. Dependiendo del tipo de estándar de normalización que se use, los factores de corrección específicos del ensayo pueden diferir. Cuanto más se adapte el estándar de normalización y su procesamiento analítico a la muestra biológica y su procesamiento, más se aproximarán a 1 los factores de corrección específicos del ensayo, o incluso se pueden despreciar. En una realización preferida, se utiliza un estándar de normalización no convertido con bisulfito, ya que se asemeja a la complejidad y la impureza de las muestras de células naturales, y por lo tanto, la eficiencia de qPCR entre una muestra biológica y un estándar debe alinearse. Lo más preferido es el uso de una muestra de células naturales de mamíferos de composición y cantidad de células conocidas tal como se describe en el presente documento.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención comprende entonces la etapa de determinar la cantidad relativa (de copias) de ADN inespecífico y específico del tipo celular dentro de la muestra biológica de composición desconocida. Esto se logra por qPCR de ADN aislados, purificados y convertidos con bisulfito de dicha muestra biológica bajo el uso de cebadores específicos para secuencias de ADN marcadoras específicas e inespecíficas del tipo celular convertidas con bisulfito. Los resultados de la amplificación por qPCR para todos los tipos de células diana se normalizan en dicho estándar no convertido o convertido con bisulfito que indica la cantidad relativa de células diana. Según los estándares y los ensayos utilizados, se aplican factores de corrección de ensayo específicos sobre la cantidad relativa de células diana para recibir la cantidad absoluta y el porcentaje del contenido de células según dicho hemograma según lo establecido. Por lo tanto, se determina la composición celular absoluta y completa de dicha muestra biológica. Dependiendo del estándar de normalización utilizado, el factor de corrección del ensayo difiere de 1, o es aproximadamente 1, y luego puede despreciarse. Otros procedimientos para determinar la cantidad relativa (de copias) de ADN específico e inespecífico del tipo celular comprenden un procedimiento seleccionado de digestos enzimáticos específicos o tecnologías de exclusión de colorantes, secuenciación del bisulfito, secuenciación de próxima generación, secuenciación de nanoporos, secuenciación de una sola molécula en tiempo real, análisis de modificaciones epigenéticas en regiones promotoras, uso de cebadores específicos para el ADN convertido con bisulfito, uso de oligonucleótidos de bloqueo específicos para el ADN convertido con bisulfito, uso de sondas de oligonucleótidos desactivadas y marcadas con fluorescencia, uso de cebadores para la extensión del cebador de un solo nucleótido específica para el ADN convertido con bisulfito, análisis de PCR digital o cuantitativo, y precipitación selectiva específica (ácido nucleico y/o cromatina).

Se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que la determinación de la cantidad relativa de células diana se basa en comparar las cantidades de copias de dichas regiones específicas de células convertidas con bisulfito según se determina con las cantidades de copias de las regiones convertidas de bisulfito que son inespecíficas para un tipo de célula como se determina, identificando así la cantidad relativa de un tipo de célula específico en relación con todas las células presentes en la muestra.

En una realización de acuerdo con la presente invención, la cantidad relativa de células diana se determina basándose en la comparación de las cantidades de copias de dichas regiones específicas de células convertidas con bisulfito según lo determinado con las cantidades de copias de regiones específicas de células no convertidas con bisulfito según se determine, identificando así la cantidad relativa de células diana en relación con todas las otras células presentes en la muestra.

En una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, además, se genera una base de conocimientos que comprende información sobre los factores de corrección de ensayo específicos de células estimados/calculados durante evaluaciones previas de ensayos epigenéticos. Estos valores pueden usarse ventajosamente para seleccionar estándares de normalización particularmente adecuados.

En una realización particularmente preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invención, se detectan regiones marcadoras del tipo celular que discriminan un tipo de célula específico y/o al menos una subpoblación específica de células de otras células de un leucocitograma, o un citograma de linfocitos T. Preferentemente, a) el leucocitograma consiste en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos B, monocitos y/o granulocitos, b) el citograma de linfocitos T consiste en CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD8-CD4- y/o CD8+CD4+.

Preferentemente, dentro del hemograma, se pueden determinar los subhemogramas determinados (o subpoblaciones). Se prefiere un citograma de linfocitos T colaboradores que comprende, por ejemplo, Th1, Th2, Th9, Th17, Th19, Th 21, Th22, Tfh, linfocitos CD4+ citolíticos naturales (n Kt ), CD4+ sin exposición previa, CD4+ de memoria, CD4+ efectores y/o linfocitos T CD4+ reguladores, o un citograma de linfocitos T citotóxicos que comprende, por ejemplo, CD8+ sin exposición previa, CD8+ efectores, CD8+ de memoria, linfocitos citolíticos naturales (NKT) CD8+ y/o linfocitos T CD8+ reguladores. Además, se pueden determinar subpoblaciones de monocitos, que comprenden los monitos clásicos (CD14-), los monocitos intermedios (CD14+) y/o los monocitos no clásicos (CD14++) o un dendritograma que comprende células dendríticas mieloides y células dendríticas plasmocitoides. Los estudios científicos futuros pueden descubrir e identificar subgrupos de leucocitos y células sanguíneas desconocidas y podrán asignar nuevas funciones a ciertas células sanguíneas y/o asignarán células sanguíneas conocidas a diferentes subpoblaciones de leucocitos.

Para determinar la cantidad relativa de ADN o ácido nucleico convertible con bisulfito y/o no convertible con bisulfito comprende un procedimiento seleccionado de digestos enzimáticos específicos o tecnologías de exclusión de colorantes, secuenciación del bisulfito, secuenciación de próxima generación, secuenciación de nanoporos, secuenciación de una sola molécula en tiempo real, análisis de modificaciones epigenéticas en regiones promotoras, uso de cebadores específicos para el ADN convertido con bisulfito, uso de oligonucleótidos de bloqueo específicos para el ADN convertido con bisulfito, uso de sondas de oligonucleótidos desactivadas y marcadas con fluorescencia, uso de cebadores para la extensión del cebador de un solo nucleótido específica para el ADN convertido con bisulfito, análisis de PCR digital o cuantitativo, y precipitación selectiva específica (ácido nucleico y/o cromatina).

Adicionalmente se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicho estándar de normalización no está convertido con bisulfito y contiene al menos una posición CpG convertible con bisulfito.

Adicionalmente se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha cuantificación de los tipos de células en dicha muestra biológica se basa en la normalización de la cantidad relativa de cromatina específica e inespecífica del tipo celular usando el estándar de normalización no convertido con bisulfito o usando el estándar de normalización convertido con bisulfito.

Aún más preferido es un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha normalización que utiliza el estándar de normalización no convertida con bisulfito es indicativa de la cantidad absoluta y/o el porcentaje de contenido de células dentro de dicha muestra biológica

Aún más preferido es un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha muestra biológica es una muestra de composición celular desconocida.

La muestra biológica analizada en el contexto de la presente invención es cualquier muestra que contenga células para analizar, es decir, células de la sangre y/o del sistema inmunitario, tales como las células de un leucocitograma, seleccionado de los linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos B, monocitos y/o granulocitos y combinaciones de los mismos; un citograma de linfocitos T, seleccionado de CD3+CD4+, CD4+ de memoria, linfocitos CD4+ efectores, CD4+ sin exposición previa, CD3+CD8+, CD8+ de memoria, linfocitos CD8+ efectores, CD8+ sin exposición previa, CD3+CD8-CD4-, CD3+CD8+CD4+, linfocitos T citolíticos naturales, iTreg, Treg, Tfh, Th1, Th2, TH9, Th17, Th19, Th21, Th22, linfocitos T colaboradores de memoria y/o efectores, y combinaciones de los mismos.

La expresión "región(es) específica(s)" en el presente documento significará regiones génicas en el genoma de las células y/o ácidos nucleicos que se seleccionan para discriminar a nivel epigenético un tipo de célula y/o de subpoblaciones de células de todos los otros tipos de células y/o subpoblaciones de células. Estas regiones incluyen los genes de ciertos marcadores (tales como, por ejemplo, ciertos marcadores de proteínas), como regiones 5' no traducidas, regiones promotoras, intrones, exones, límites intrón/exón, regiones 3', Islas CpG, y en particular incluyen regiones específicas amplificadas después del tratamiento con bisulfito (amplicones) que son "informativas" sobre el tipo de una célula y/o las subpoblaciones de células. Los ejemplos de estas regiones específicas de células se conocen de las referencias, como, por ejemplo, el gen CD3 y, 6 y £ (documento WO 2010/069499); el gen de la granulisina (documento WO 2010/125106); el gen CCR6 (documento WO 2011/135088); el gen FOXP3 (documento WO 2004/050706 y Wieczorek y col. Quantitative DNA methylation analysis of FOXP3 as a new method for counting regulatory T cells in peripheral blood and solid tissue. Cancer Res. 15 de enero de 2009; 69(2):599-608.)

Las regiones marcadoras específicas de la célula generalmente son regiones de ADN que contienen CpG individuales o islas CpG que son convertibles con bisulfito solo en un tipo de célula específico y, por lo tanto, son indicativas del tipo de célula específica. Adicionalmente, estas regiones marcadoras específicas de la célula discriminan un tipo de célula de todas las demás células sanguíneas, así como de otras células tisulares.

De acuerdo con la presente invención, las células del hemograma epigenético se identifican y cuantifican analizando la convertibilidad con bisulfito de al menos en la posición CpG en dichas regiones genómicas específicas de la célula.

Por lo tanto, se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de una región como se indica en la siguiente tabla 4 es indicativa del respectivo tipo de célula sanguínea tal como se indica en dicha tabla. Estas son, por ejemplo, las siguientes regiones marcadoras genómicas para los tipos de células dados:

Tabla 4C: marcadoras d e Untadlos T CDS positivos ■ los marcadoras para un leucocítograma o un citograma d e LinfocítosT son de acuerdo con la ínvendón

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Tabla 41: Marcadores c e MDSC (células supresoras derivadas del mieioide) - los marcadores para un leucocitograma o un citograma de Lintocitos T son de acuerdo con la invención

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En la tabla 4, regiones que contienen CpG que son específicas para los tipos de células sanguíneas granulocitos, monocitos, linfocitos CD4+, linfocitos T citotóxicos, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos T citolíticos naturales se enumeran, así como sus SEQ ID NO para el llamado "fragmento de descubrimiento" (región preferida) y la "región de interés" discriminante (región más preferida). Los fragmentos de descubrimiento comprenden al menos un CpG que es específico para el tipo de célula tal como se indica, y por lo tanto es adecuado para distinguir este tipo de célula de todos los otros tipos de células del hemograma. Las secuencias discriminantes de la región de interés (RDI) son regiones que se ubican alrededor de la región de descubrimiento y que forman la base para el diseño del ensayo específico para un tipo de célula específico como se indica, y contienen CpG relevantes adicionales, es decir, una secuencia de CpG que también se puede usar para distinguir entre los tipos de células como se indica.

En la tabla 4A a 4J, se enumeran las regiones que contienen CpG que son específicas para los respectivos tipos de células sanguíneas tal como se muestra en cada encabezado de la tabla. La secuencia proporcionada en la columna "fragmento de descubrimiento" es la región preferida y comprende al menos un CpG que es específico para el tipo celular de la respectiva tabla (identificable por los datos mostrados). En el contexto de las diversas realizaciones y aspectos de la invención también se incluye una región 500 pares de bases cadena arriba y cadena abajo de (por lo tanto, "alrededor") la secuencia del "fragmento de descubrimiento" en el genoma humano para cada marcador. La región de 500 pares de bases cadena arriba y cadena abajo del "fragmento de descubrimiento" son la RDI discriminante del marcador de las tablas 4A a 4J.

También se desvela una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de cualquiera de los "fragmentos de descubrimiento" o la RDI (500 pb cadena arriba y cadena abajo para cada "fragmento de descubrimiento" en el genoma humano) de cualquiera de las Tablas 4 y 4A a 4J como se muestra anteriormente, que es indicativo de un tipo de célula respectivo tal como se indica en las tablas 4. El citograma de linfocitos T en todas las realizaciones y aspectos de la invención, por lo tanto, puede contener cualquiera de los tipos de células enumerados en las tablas 4 y 4A a 4J anteriores, y cualquier combinación de estos tipos de células.

Una región adicional para los granulocitos neutrófilos (nGRC) proviene de la Lipocalina-2, región genómica de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (LCN2)(ID de Ensembl: ENSG00000148346); designado en el presente documento como AMP1730. La secuencia genómica de AMP 1730 y la RDI 1132 discriminante son las Se Q ID NO: 686 y 685 respectivamente. Véase también la Figura 2.

Las regiones adicionales para los granulocitos eosinófilos (eGRC) provienen de la región genómica del proteoglicano 2 (PRG2) (ID de Ensembl: ENSG00000186652), en el presente documento designado como AMP 2034 y 2035, respectivamente. Las secuencias genómicas de AMP 2034 y 2035, y la RDI1403 discriminante son las SEQ ID NO: 687, 688 y 689, respectivamente. Véase también la Figura 3.

Preferentemente, las regiones génicas específicas de la célula como se describen en el presente documento se seleccionan para discriminar un tipo de célula o subpoblación de células de todos los otros tipos de células, tal como el leucocitograma o el citograma de linfocitos T tal como se describe en el presente documento. Por lo tanto, los marcadores del tipo celular altamente específicos se utilizan como base para la identificación y cuantificación que no se basan en los niveles de expresión de proteínas sino en la información epigenética específica del tipo de célula. El procedimiento proporciona una información clara de sí/no y es independiente del umbral, ya que la región genómica rica en CpG específica de la célula es convertible con bisulfito o no, es detectable por qPCR o no, así como las copias genómicas no varían. El procedimiento también detecta e identifica, así como cuantifica un número potencialmente ilimitado de subpoblaciones de células, y el límite de detección para, por ejemplo, linfocitos T reguladores está al 0,3 %.

Se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que las células que se detectan y, por lo tanto, para el hemograma epigenético se seleccionan de un leucocitograma y/o de un citograma de linfocitos T.

Preferentemente, dichas regiones marcadoras analizadas son específicas para las células de un hemograma preseleccionado, y estas células se seleccionan preferentemente de linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos B, monocitos, granulocitos y combinaciones de los mismos, para un leucocitograma, seleccionado de CD3+CD4+, CD4+ de memoria, linfocitos CD4+ efectores, CD4+ sin exposición previa, CD3+CD8+, CD8 positivo, CD8+ de memoria, linfocitos CD8+ efectores, CD8+ sin exposición previa, CD3+CD8"CD4", CD3+CD8+CD4+, linfocitos T citolíticos naturales, iTreg, Treg, Tfh, Th1, Th2, TH9, Th17, Th19, Th21, Th22, linfocitos T colaboradores de memoria y efectores, y combinaciones de los mismos, para un citograma de linfocitos T, seleccionado de granulocitos basófilos, eosinófilos, neutrófilos y/o células supresoras granulocíticas derivadas del mieloide y combinaciones de los mismos.

En contraste con la expresión "regiones específicas de la célula", la expresión "regiones no específicas de la célula" en el presente documento significará regiones génicas en el genoma de las células y/o ácidos nucleicos que se seleccionan para ser inespecíficos, es decir, son específicos para más de uno, preferiblemente todos, los tipos de células y/o las subpoblaciones de células. Estas regiones celulares no específicas también incluyen los genes de ciertos marcadores (como, por ejemplo, por ejemplo, ciertos marcadores de proteínas), como regiones 5' no traducidas, regiones promotoras, intrones, exones límites intrón/exón, regiones 3', islas CpG, y en particular incluyen regiones específicas amplificadas después del tratamiento con bisulfito (amplicones) que son "informativas" para más de un tipo de célula y/o subpoblación de células. Los ejemplos de estas regiones no específicas de las células se conocen de la bibliografía, y se seleccionan de, por ejemplo, regiones que comprenden un gen de mantenimiento, tales como GAPDH, ACTB (beta-actina), UBC (ubiquitina C), proteínas ribosómicas (por ejemplo, RPS27A, RPS20, RPL11, RPL38, RPL7, RPS11, RPL26L1), CALR (calreticulina), ACTG1 (gamma actina) r Ps 20 (proteína ribosómica S20), HNRPD (ribonucleoproteína D), NACA (subunidad alfa del complejo asociado al polipéptido naciente), NONO (proteína de unión al octámero), PTMAP7 (pro-timosina), GFRA4 (receptor de GDNF alfa-4), CDC42 (proteína de unión a GTP), EIF3H (factor de iniciación de la traducción), UBE2D3 (enzima conjugadora de ubiquitina), y genes como se describe en, por ejemplo, She y col. (Definition, conservation and epigenetics of housekeeping and tissueenriched genes. BMC Genomics. 17 de junio de 2009; 10:269), y el documento WO 2011/095564.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención generalmente identifica la composición celular cuantitativa de una muestra biológica. Se prefiere un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha muestra biológica es una muestra de composición celular desconocida. No obstante, también se pueden cuantificar muestras de composición celular conocida, o incluso de composición parcialmente conocida.

Las muestras biológicas a analizar se pueden almacenar recientes y congeladas, embebidas en parafina o estabilizadas con heparina, citrato o EDTA, ya que las células en las muestras no necesitan estar intactas. El presente procedimiento es muy robusto y permite, en contraste con la citometría de flujo, una evaluación paralela e independiente de la identidad y la cantidad de células, así como la composición de la muestra. Se proporciona una muy buena correlación con FACS, también.

La muestra biológica que se analizará puede ser cualquier muestra que comprenda uno o más tipos de células o que se sospeche que comprende uno o más tipos de células que se van a cuantificar. Los materiales/muestras biológicas preferidos se seleccionan de una muestra de sangre, en particular, muestras de sangre periférica, capilar o venosa, coágulos de sangre, o muestras que se considera que contienen células sanguíneas como, por ejemplo, líquido sinovial, líquido linfático, esputo, orina, muestras de tumores, así como otras muestras de fluidos y tejidos, preparaciones histológicas, DBS, células generadas artificialmente y mezclas de las mismas (por ejemplo, muestras de cultivos celulares).

Otro aspecto más de la presente invención se refiere entonces a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, que comprende además la etapa de concluir sobre el estado inmunitario de un mamífero basándose en dicho hemograma epigenético tal como se produce.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere entonces a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, que comprende además la etapa de controlar dicha composición celular en dicha muestra biológica como se identifica comparando dicha composición y/o hemograma como se identifica con la composición en una muestra biológica anterior tomada del mismo mamífero, y/o con la composición en una muestra de control. En este aspecto, por ejemplo, las modificaciones y los cambios de la composición celular en un paciente pueden controlarse durante un tratamiento médico.

Otro aspecto más de la presente invención se relaciona entonces con un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o una predisposición para una enfermedad, que comprende un procedimiento de acuerdo con la presente invención como se describe anteriormente, y que comprende además la etapa de concluir sobre la enfermedad o una predisposición para dicha enfermedad basándose en modificaciones y cambios de la composición celular en dicha muestra biológica como se identifica al comparar dicha muestra con una muestra de un sujeto sano o a intervalos de referencia médica. Preferentemente, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, en particular una muestra de sangre completa o periférica, y dichas regiones específicas de células en el genoma de células en dicha muestra se seleccionan de regiones específicas para los tipos de células sanguíneas. La enfermedad a diagnosticar puede seleccionarse del grupo que consiste en enfermedades o afecciones inmunitarias, rechazo de trasplantes, enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedades neurológicas, alergia, deficiencias inmunitarias primarias y secundarias y neoplasias hematológicas tales como, por ejemplo, neoplasias linfáticas, neoplasias de linfocitos B maduros, neoplasias de linfocitos T y de linfocitos citolíticos naturales maduros, linfomas de Hodgkin, procesos linfoproliferativos después de los trasplantes, VIH y SIDA, enfermedad del injerto contra el huésped, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de estómago, leucemia/linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de piel, cáncer endocrino, cáncer de riñón, cáncer urinario, cáncer de páncreas, otros cánceres gastrointestinales, cáncer de ovarios, cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello, adenomas, defectos de nacimiento, miopatías, retraso mental, obesidad, diabetes, diabetes gestacional, esclerosis múltiple y asma.

En una realización preferida de la presente invención, el uso diagnóstico del hemograma epigenético también se basa en el uso de proporciones de diferentes poblaciones y/o/frente a diferentes subpoblaciones (subhemogramas) y/o/frente a células pertenecientes a un subhemograma según dicho hemograma epigenético. Tales proporciones son, por ejemplo, pero sin limitación, la población de linfocitos T reguladores en relación con los linfocitos T CD3+, o los linfocitos T reguladores en relación con la población de linfocitos T CD4+, o de linfocitos T reguladores en relación con la población linfocitos T CD8+, o de linfocitos T CD3+ con linfocitos T CD4+ colaboradores, o de linfocitos T CD3+ con Linfocitos T citotóxicos CD8+, o de linfocitos T CD4+ colaboradores con linfocitos T citotóxicos CD8+, o de Th1 con Th2, o de Th1 con Th17, o de Th2 con Th17, o linfocitos T CD4+ colaboradores de memoria o sin exposición previa con linfocitos T CD3+, o linfocitos T citotóxicos CD8+ con linfocitos T CD3+, todas como subpoblaciones del citograma de linfocitos T; o linfocitos T CD3+ relacionados con granulocitos neutrófilos, o macrófagos con linfocitos T CD4+ colaboradores; linfocitos T CD4+ relacionados con granulocitos neutrófilos o linfocitos T CD8+ relacionados con los granulocitos neutrófilos como relaciones entre células de diferentes subhemogramas; o linfocitos T CD3+ relacionados con granulocitos o linfocitos B con linfocitos T CD3+, o monocitos con linfocitos T CD3+, o monocitos con linfocitos B, todos como proporciones fuera de las poblaciones del leucocitograma.

Pero también se pueden usar como procedimiento de diagnóstico otras proporciones de subpoblaciones evaluadas según la presente invención y según el hemograma epigenético. La enfermedad puede seleccionarse del grupo que consiste en enfermedades o afecciones inmunitarias, rechazo de trasplantes, enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedades neurológicas, alergia, deficiencias inmunitarias primarias y secundarias y neoplasias hematológicas tales como, por ejemplo, neoplasias linfáticas, neoplasias de linfocitos B maduros, neoplasias de linfocitos T y de linfocitos citolíticos naturales maduros, linfomas de Hodgkin, procesos linfoproliferativos después de los trasplantes, VIH y SIDA, enfermedad del injerto contra el huésped, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de estómago, leucemia/linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de piel, cáncer endocrino, cáncer de riñón, cáncer urinario, cáncer de páncreas, otros cánceres gastrointestinales, cáncer de ovarios, cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello, adenomas, defectos de nacimiento, miopatías, retraso mental, obesidad, diabetes, diabetes gestacional, esclerosis múltiple y asma. El uso diagnóstico abarca, pero sin limitación, el diagnóstico de una enfermedad y/o el seguimiento de una enfermedad y/o la predisposición a una enfermedad y/o el control de un efecto de una sustancia química o biológica.

Tal como se indica, las proporciones mencionadas anteriormente según lo evaluado de acuerdo con la presente invención tienen el potencial de indicar, por ejemplo, el riesgo de desarrollar una determinada enfermedad durante el tiempo de vida de un sujeto. Se descubrió un papel clínico en la evaluación del riesgo para la proporción de linfocitos T reguladores frente a linfocitos T CD3+. Particularmente preferido en el contexto de la presente invención es que un aumento en la proporción de linfocitos T reguladores frente a linfocitos T CD3 indica un riesgo de desarrollar cáncer (enfermedad cancerosa) durante el tiempo de vida. El cáncer se selecciona de, pero no se limita a la lista, tal como se indica anteriormente en el presente documento, en el que se espera un alto impacto de una elevada proporción de linfocitos T reguladores frente a linfocitos T CD3+ para el desarrollo de cáncer de pulmón, que es particularmente preferido. Además, las proporciones tienen el potencial de predecir el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped, en la que una mayor proporción de linfocitos T reguladores frente linfocitos T CD4+ dentro de las primeras dos semanas después del trasplante de células madre predice el desarrollo de una enfermedad de injerto contra huésped.

Se desvela un kit de diagnóstico y su uso, que comprende materiales para realizar el procedimiento de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, opcionalmente con instrucciones de uso. El kit de diagnóstico contiene en particular oligonucleótidos (por ejemplo, para producir amplicones) específicos para regiones de interés, reactivos de bisulfito y/o componentes para PCR. El kit de diagnóstico y su uso abarcan, sin limitación, el diagnóstico de una enfermedad y/o el seguimiento de una enfermedad y/o la predisposición y/o la evaluación de un riesgo de enfermedad y/o el seguimiento de un efecto de una sustancia química o biológica.

Como se ha mencionado anteriormente, actualmente, en ambos, el diagnóstico clínico e investigación, y el desarrollo de fármacos, se desea un nuevo procedimiento para proporcionar una cuantificación precisa y completa de los leucocitos y sus subpoblaciones, incluso si las muestras biológicas ya no están intactas. La presente invención, supera la mayoría de los problemas de los procedimientos cuantitativos rutinarios actuales, citometría de flujo e inmunohistoquímica, pero más importante, supera varios problemas bioquímicos y técnicos de la qPCR con respecto a la cuantificación absoluta de células diana. La presente invención, por lo tanto, proporciona un procedimiento para detectar y cuantificar eficazmente las diferentes poblaciones celulares. En particular, el presente procedimiento por primera vez permite un procedimiento independiente de la expresión para la evaluación de una imagen completa de las células sanguíneas. Además, la presente invención permite un marco temporal flexible que no depende del procesamiento rápido de la muestra, sino que permite el almacenamiento de la muestra a largo plazo y la coordinación individual entre la recolección de la muestra y el procesamiento de la muestra.

La presente invención se explicará ahora con más detalle en los siguientes ejemplos y figuras, sin embargo, sin limitarse a los mismos.

La Figura 1 muestra una vista general esquemática del hemograma epigenético. El hemograma comprende el leucocitograma, que incluye linfocitos B, monocitos, granulocitos linfocitos T CD3+ y linfocitos citolíticos naturales (células NK). Cada subpoblación establece un citograma adicional, respectivamente, es decir, el citograma de linfocitos B, el monocitograma, el granulocitograma, el citograma de linfocitos T y el citograma de linfocitos citolíticos naturales. Por estos cinco subcitogramas, se representan los tipos de células correspondientes. Cada uno de estos cinco subcitogramas se puede dividir en subpoblaciones adicionales, por ejemplo, el citograma de linfocitos T se puede dividir en el citograma de linfocitos T CD4.+ colaboradores y el citograma de linfocitos T citotóxicos CD8+.

La Figura 2 muestra una matriz que indica la no convertibilidad con bisulfito de la región marcadora genómico específico del tipo celular. Se analizaron diferentes tipos de células, lo que indica que las CpG en la región genómica AMP1730 son completamente convertibles por tratamiento con bisulfito correspondiente con el 0% de no convertibilidad con bisulfito. La fracción total de granulocitos se corresponde con granulocitos neutrófilos. Los granulocitos neutrófilos representan aproximadamente el 90 % de los granulocitos, los eosinófilos aproximadamente el 7 %, y los basófilos aproximadamente el 3 % (véase el Ejemplo 4).

La Figura 3 muestra una matriz que indica la no convertibilidad con bisulfito de las regiones marcadoras genómicas específicas del tipo celular. Se analizaron diferentes tipos de células, lo que indica que los CpG dentro de la región genómica AMP2034 y 2035 son, al contrario de otros tipos de células dados, convertible con bisulfito en gran medida e indicativo para este tipo de célula específico (véase el Ejemplo 5).

La Figura 4 muestra los resultados del molde de prueba según se amplificó de acuerdo con el Ejemplo 7.noMet (Molde de TpG): ADN de prueba convertido con bisulfito; Met (Molde de CpG): ADN de prueba no convertido con bisulfito; SCM: sin control de molde; panel izquierdo: concentración de Mg2+ 3,2 mM; panel derecho: concentración de Mg2+ 3,6 mM.

Las SEQ ID NO. 1 a 689 muestran secuencias como se usan en el contexto de la presente invención.

Ejemplos

Los presentes ejemplos se han realizado en una muestra de composiciones de leucocitos y linfocitos T conocidas y desconocidas.

Ejemplo 1 - Evaluación de factores de corrección de ensayo específicos de células utilizando una muestra de composición conocida

Los inventores proporcionaron una muestra de sangre humana de leucocitos y de linfocitos T de composición conocida. La composición de esta muestra de sangre se analizó mediante citometría de flujo. La muestra contenía el 61 % de granulocitos, el 12 % de monocitos, el 3 % de linfocitos B, el 4 % de linfocitos citolíticos naturales y el 19 % de linfocitos T (Tabla 5). La población de linfocitos T consistió en el 13 % de linfocitos T CD4.+ colaboradores, el 1,4 % de linfocitos T reguladores, el 5 % de linfocitos CD8+ citotóxicos y el 2 % de linfocitos CD8+ sin exposición previa.

En una etapa siguiente, esta muestra de composición conocida de leucocitos y linfocitos T se analizó para determinar la cantidad relativa de cromatina convertible con bisulfito en regiones génicas específicas del tipo celular, dando como resultado un único, patrón específico discriminante del tipo celular de la cromatina convertible con bisulfito, por ejemplo, para los granulocitos, una región en el gen para la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos para los monocitos, una región en el gen del receptor tipo inmunoglobulina leucocitaria, para linfocitos B en una región del gen para el receptor de baja afinidad para IgE, para los linfocitos citolíticos naturales una región en el gen para la isoforma a de proteína 5 de tipo proteína de unión a oxisterol, para linfocitos T, en una región en el gen CD3D/G, para los linfocitos T CD4+ colaboradores, en una región en el gen CD4, para los linfocitos T reguladores, en una región en el gen FOXP3, para los linfocitos T citotóxicos CD8+ en una región en el gen CD8A/B, para los linfocitos CD8+ sin exposición previa, una región en el gen de la endosialina. Los análisis se realizaron mediante qPCR utilizando un estándar de normalización convertido con bisulfito que indica la cantidad relativa de número de copias de genes que contienen dicho patrón de convertibilidad con bisulfito específico y único del tipo celular. Este número relativo de copias de genes específicos de células indican la cantidad relativa de dichas células específicas.

Este número relativo de células específicas (dichos leucocitos y linfocitos T) se comparó con el resultado de la citometría de flujo. Ambos resultados se establecieron en relación y se determinó un factor de corrección (Tabla 1). La citometría de flujo reveló el 61 % y la qPCR el 91,6 % de los granulocitos, y por lo tanto el factor de corrección de ensayo específico de los granulocitos fue de 1,502.

Los factores de corrección se determinaron por separado para cada conjunto de evaluaciones y se incorporaron a la base de datos para los factores de corrección específicos del ensayo. Además de la determinación individual y separada de los factores de corrección (para cada conjunto de evaluaciones), también se puede utilizar el promedio de los factores de corrección pasados.

(continuación)

Tabla 5. Evaluación de factores de corrección de ensayo específicos de células. La composición celular de la muestra de sangre humana se evaluó mediante citometría de flujo y qPCR para los leucocitos, así como para los linfocitos T. La qPCR se realizó utilizando un estándar de normalización convertido con bisulfito. Los factores de corrección para seguir las qPCR en muestras de composición desconocida se determinaron mediante la proporción de qPCR/FC. Factor de corrección (factor C), (FC) Citometría de flujo, (GRK01) número de muestra interno. (qPCR) reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real.

Ejemplo 2 - Evaluación de la composición celular absoluta en una muestra de sangre desconocida de voluntarios sanos usando un factor de corrección de ensayo determinado utilizando una muestra de composición conocida (como se muestra en el Ejemplo 1)

Se obtuvieron muestras de sangre humana de composición de leucocitos y linfocitos T de composición desconocida de voluntarios sanos para la evaluación de la composición absoluta de leucocitos y linfocitos T mediante qPCR. Como en el ejemplo 1, se aisló el ADN de las muestras de sangre, se convirtió con bisulfito y se evaluó la cantidad relativa de ADN convertido con bisulfito mediante qPCR bajo el uso de estándares de normalización convertidos con bisulfito. La cantidad de ADN convertible con bisulfito en regiones génicas específicas de la célula se estableció en relación con el ADN convertible con bisulfito de la región de ADN no específica de la célula (siempre, patrón constante de convertibilidad con bisulfito independiente de la célula) para obtener una cantidad relativa de células evaluadas.

Los factores de corrección de ensayo específicos de células se determinaron en un conjunto experimental paralelo para ensayos de granulocitos, monocitos, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T, linfocitos T CD4+ colaboradores, linfocitos T reguladores y linfocitos T citotóxicos CD8+ utilizando la citometría de flujo en una muestra de sangre humana (metodología, véase el ejemplo 1, la muestra de sangre humana difiere para el Ejemplo 2 en comparación con el Ejemplo 1). Las cantidades relativas de células evaluadas según se obtuvieron se corrigieron utilizando los factores de corrección de ensayo específicos de la célula. Por ejemplo, la qPCR para la muestra de monocitos del paciente S04 dio una cantidad relativa de monocitos del 7,94 %, pero la corrección reveló una cantidad de células absoluta del 3,69 % de monocitos.

Se esperaría que la suma de las células que pertenecen a un leucocitograma sea del 100%, y que la suma de las células que pertenecen a un citograma de linfocitos T tenga exactamente la misma cantidad de células que la determinada para los linfocitos T en el leucocitograma. Se sabe que incluso la cuantificación por citometría de flujo no está exenta de limitaciones, tal como se ha descrito anteriormente.

Los errores de medición de la citometría de flujo se reflejan en las correcciones de qPCR. Por otra parte, la qPCR basada en epigenética, tal como se describe en el presente documento, detectó tipos celulares independientemente de la expresión del marcador. Incluso si un marcador específico de célula se expresa en una cantidad muy baja, o no está presente en absoluto, la qPCR epigenética puede detectar estas células (por ejemplo, como se encuentra para las células Th17, véase anteriormente). Además, determinadas células expresan marcadores específicos de la célula, incluso si estas células no entraron en un estado celular específico que se sabe que está asociado con la expresión del marcador (por ejemplo, como se descubrió para los linfocitos T reguladores, véase la descripción anterior). Tales células no se detectan por qPCR basado en epigenética. Adicionalmente, para este ejemplo, la selección de linfocitos T (linfocitos T CD4+ colaboradores, linfocitos CD8+ citotóxicos) no representa el conjunto completo de linfocitos T (véase la Figura 1). Los citogramas representan el estado actual del conocimiento científico y no pueden excluir la existencia de tipos de células adicionales o la definición incorrecta de sus subpoblaciones.

15,97

Tabla 6. Evaluación de la composición celular absoluta de la sangre de voluntarios sanos. La composición celular de muestras de sangre humana se evaluó mediante qPCR para los leucocitos y los linfocitos T. La qPCR se realizó utilizando un estándar de normalización convertido con bisulfito. Los factores de corrección para los qPCR se determinaron en un conjunto paralelo de experimentos (no se describen en detalle en el presente documento, ejemplo de evaluación del factor C, véase el Ejemplo 1). Factor de corrección (factor C), (FC) Citometría de flujo, (S04) (S08) números de muestra internos. (qPCR) reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real.

Ejemplo 3 - Evaluación de la composición celular absoluta en una muestra de sangre desconocida de voluntarios con enfermedad autoinmune usando un factor de corrección de ensayo determinado utilizando una muestra de composición conocida (como se muestra en el Ejemplo 1)

Se obtuvieron muestras de sangre humana de composición de leucocitos y linfocitos T desconocida de voluntarios con enfermedades autoinmunes para la evaluación de la composición absoluta de leucocitos y linfocitos T a través de qPCR. Como en el ejemplo 1, se aisló el ADN de las muestras de sangre, se convirtió con bisulfito y se evaluó la cantidad relativa de ADN convertido con bisulfito mediante qPCR. La cantidad de ADN convertible con bisulfito en regiones génicas específicas de la célula se estableció en relación con el ADN convertible con bisulfito de la región de ADN no específica de la célula (siempre, patrón constante de convertibilidad con bisulfito independiente de la célula) para obtener una cantidad relativa de células evaluadas.

Los factores de corrección de ensayo específicos de células se determinaron en un conjunto experimental paralelo para ensayos de granulocitos, monocitos, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T, linfocitos T CD4+ colaboradores, linfocitos T reguladores y linfocitos T citotóxicos CD8+ utilizando la citometría de flujo en una muestra de sangre humana (metodología, véase el ejemplo 1, la muestra de sangre humana difiere para el Ejemplo 3 en comparación con el Ejemplo 1). Las cantidades relativas obtenidas de células evaluadas se corrigieron utilizando estos factores de corrección de ensayo específicos de células. Por ejemplo, qPCR para linfocitos T evaluó una cantidad relativa de linfocitos T del 8,49 % para el paciente M06 y del 23,94 % para el paciente M10. La corrección reveló una cantidad absoluta de células del 5,4 % y del 15,3 % de linfocitos T, respectivamente.

En comparación con los datos de pacientes sanos, véase el Ejemplo 2, para el paciente M06 con enfermedad autoinmune se observó una disminución obvia en 4 de los 5 subtipos de leucocitos dentro del leucocitograma. Para el paciente M10, se observó una disminución obvia en el número absoluto de linfocitos B y monocitos únicamente.

Adicionalmente, también para los subtipos de linfocitos T, se observaron diferencias entre ambos pacientes. El análisis de qPCR de tres subtipos de linfocitos T para el paciente M06 reveló una fuerte disminución de linfocitos T CD4+ colaboradores así como de linfocitos CD8.+ citotóxicos mientras que la disminución en el nivel de linfocitos T reguladores fue menos pronunciada. Para el paciente M10, los tres niveles celulares disminuyeron simultáneamente en aproximadamente un 50-60 % en comparación con el promedio de los dos pacientes sanos en el Ejemplo 2.

Todas estas diferencias podrían estar relacionadas, por ejemplo, con una medicación diferente y/o un estadio de la enfermedad de ambos pacientes y ofrecer un instrumento clínico rutinario para el diagnóstico de la enfermedad, para la predicción así como para el acompañamiento del seguimiento.

Factor C ^qPCR- qPCR- qPCR- qPCR-Factor C_{M06 M10} M06 M10

Tabla 8. Evaluación de la composición celular absoluta de la sangre de pacientes con enfermedades autoinmunes. La composición celular de muestras de sangre humana se evaluó mediante qPCR para los leucocitos y los linfocitos T. La qPCR se realizó utilizando un estándar de normalización convertido con bisulfito. Se observó una disminución obvia del nivel de ciertas poblaciones celulares que se conoce para las enfermedades autoinmunes. Los factores de corrección para los qPCR se determinaron en un conjunto paralelo de experimentos (no se describen en detalle en el presente documento, ejemplo de evaluación del factor C, véase el Ejemplo 1). Factor de corrección (factor C), (FC) Citometría de flujo, (S04) (S08) números de muestra internos. (qPCR) reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real.

Ejemplo 4 - Detección de granulocitos neutrófilos basados en AMP1730 en el gen para la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (LCN2) (véase la Figura 2)

La Figura 2 muestra una matriz que indica la no convertibilidad con bisulfito en la región marcadora genómica específica del tipo celular. Se analizaron diferentes tipos de células, lo que indica que las CpG en la región genómica AMP1730 son completamente convertibles por tratamiento con bisulfito correspondiente con el 0% de no convertibilidad con bisulfito. Dentro de los granulocitos de basófilos y eosinófilos, las CpG específicas de AMP1730 no son convertibles con bisulfito. Por lo tanto, la expresión "Granulocitos (totales)" "dentro de la figura se corresponde con los granulocitos neutrófilos. Los granulocitos neutrófilos representan aproximadamente el 90 % de los granulocitos, los eosinófilos aproximadamente el 7 %, y los basófilos aproximadamente el 3 %.

AMP1730 - ensayo de granulocitos neutrófilos

Tabla 7 - Calidad discriminatoria de AMP1730: Se realizó la qPCR usando cebadores específicos de ensayo para AMP1730 se realizó en las células indicadas como "muestra" para analizar la cantidad de convertibilidad con bisulfito de las CpG presentes en la región genómica dada por AMP1730. ADN de muestras de células purificadas se aisló, se trató con bisulfito y se realizó el ensayo de qPCR con el uso de un estándar de normalización convertido con bisulfito. La cantidad relativa de células se evaluó comparando el número de copias del ADN de AMP1730 convertible con bisulfito con el ADN de AMP1730 no convertible con bisulfito, llamado "Sistema TpG/CpG" (número de copias convertible/(número de copias convertible número de copias no convertible) = % de tipo de célula). Las células se purificaron y se clasificaron mediante citometría de flujo. Dentro de la muestra de neutrófilos, más del 95 % de las células se detectaron como neutrófilos usando AMP1730. (bGRAN) basófilos, (eGRAN) eosinófilos (nGRAN) neutrófilos, (MOC) monocitos, (THC) linfocitos T CD3+CD4+, (CTL) linfocitos T citotóxicos CD3+CD8+, (NKC) linfocitos citolíticos naturales CD3-, (NKT) linfocitos citolíticos naturales CD3+, (BLC) linfocitos B.

Ejemplo 5 - Detección de granulocitos eosinófilos basada en AMP 2034 y/o 2035 (PRG2)

La matriz que indica la no convertibilidad con bisulfito de las regiones marcadoras genómicas específicas del tipo celular. Se analizaron diferentes tipos de células, lo que indica que los CpG dentro de la región genómica AMP2034 y 2035 son, al contrario de otros tipos de células dados, convertible por bisulfito en gran medida e indicativo para este tipo de célula específico (véase la Figura 3).

Ejemplo 6: evaluación del factor de corrección de ensayo específico de la célula utilizando una molécula de ácido nucleico no convertida con bisulfito (estándar de plásmido) como estándar de normalización

Los inventores desarrollaron estándares de plásmido genómico no convertidos con bisulfito como estándar de normalización. Uno de estos estándares de plásmidos genómicos comprende regiones marcadoras que son específicas para linfocitos T reguladores estables (región TSDR) (linfocitos Treg) así como regiones marcadoras que son inespecíficas del tipo celular (GAPDH, gen de mantenimiento, que detecta todas las células, el 100 % de las células). Este estándar de plásmido se usa para determinar el factor de corrección del ensayo específico de Treg que permite evaluar la cantidad absoluta de Treg estables dentro de una muestra de sangre desconocida.

En una primera etapa, se proporcionó una muestra de sangre humana de composición desconocida, se aisló el ADN y se trató con bisulfito. A continuación, se evaluó la cantidad de copias de TSDR y de copias de GAPDH convertidas con bisulfito (Tabla 8, sección 2). Estos análisis de qPCR se realizaron utilizando un estándar de normalización convertido con bisulfito (Tabla 8, sección 1) que indica el número de copias de ADN convertidas con bisulfito que contienen la región marcadora TSDR, así como la región marcadora GAPDH (Tabla 8, sección 2). La cantidad relativa de Treg estables se calcula como el número de copias de TSDR convertidas con bisulfito relacionadas con las copias de GAPDH convertidas con bisulfito en porcentaje.

n.° de copias de TSDR convertidas con bisulfito / n.° de copias de GAPDH convertidas con bisulfito x 100 = % de Treg

67,70 / 6026,67 x 100 = 1,123%

La región específica del tipo celular para linfocitos T reguladores estables, TSDR, se encuentra en el cromosoma X. Para las mujeres se conoce un silenciamiento epigenético de un alelo del cromosoma X. Este efecto se deduce utilizando un factor 2 al calcular la cantidad relativa de Treg estables (resultado final = 2,25% de Treg estables) (Tabla 8, sección 2).

En una segunda etapa, se evaluó el factor de corrección de ensayo específico de Treg basado en dicho estándar de plásmido genómico. Dicho estándar de plásmido se convirtió con bisulfito y se evaluó el número de copias de plásmido mediante qPCR utilizando cebadores específicos para las regiones marcadoras convertidas con bisulfito para linfocitos Treg y para GAPDH. Estos análisis de qPCR también se realizaron utilizando el estándar de normalización convertido con bisulfito (Tabla 8, sección 1). La eficiencia de qPCR para los linfocitos Treg y GAPDH debe ser igual, ya que el nuevo estándar de plásmido genómico no convertido con bisulfito (el sustrato) contiene una cantidad equimolar de copias genómicas específicas de linfocitos Treg y específicas de GAPDH. Por lo tanto, la desviación evaluada del números de copias de Treg y de los números de copias de GAPDH se corresponde con las diferencias en las eficacias de ensayo.

Número de copias de Treg (TSDR) = 6760 frente a número de copias de GAPDH = 6273,33

Esta desviación define el factor de corrección del ensayo específico del tipo celular. Por ejemplo:

Número de copias de Treg (TSDR) / Número de copias de GAPDH / 100 = 6760/6273,33 = 1,077.

Para los linfocitos Treg, se evaluó un factor de corrección del ensayo de 1,1 (promedio, n=3) (Tabla 8, sección 3). La corrección de la cantidad relativa de linfocitos Treg por el factor 1,1 da como resultado una cantidad absoluta de 2,05 % de linfocitos Treg dentro de la muestra de sangre desconocida WB01.

cantidad relativa de linfocitos Treg / factor específico de corrección de ensayo = cantidad absoluta de Treg

2,25 % /1,1 = 2,05 % de linfocitos Treg

Tabla 8: Evaluación del factor de corrección del ensayo específico de Treg utilizando una molécula de ácido nucleico no convertida con bisulfito como un estándar de plásmido.

Ejemplo 7 - Desarrollo de un ensayo de qPCR específico de la célula para la detección y discriminación de granulocitos neutrófilos

Detección de convertibilidad diferencial con bisulfito específica del tipo celular:

El ADN de los granulocitos neutrófilos (neutrófilos), monocitos, linfocitos CD4+, linfocitos CD8+, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales, y linfocitos T citolíticos naturales purificados se trató con bisulfito, y el ADN convertido con bisulfito se analizó en diversos motivos de dinucleótidos CpG. Después, los inventores compararon la convertibilidad con bisulfito (hallando C para la citosina que fue metilada en la secuencia original (genómica) frente a T para la citosina que no estaba metilada en la secuencia original) de estos dinucleótidos CpG (véase la Tabla 4, posición 259).

Sorprendentemente, se descubrió que las áreas específicas en la región genómica de la lipocalina-2 se metilaron de forma diferencial en los granulocitos neutrófilos en comparación con todos los otros tipos de células sanguíneas probadas. Estas áreas fueron definidas como fragmentos de descubrimiento, tales como, por ejemplo, la SEQ ID 517 para neutrófilos (Tabla 4, posición 259).

Validación de la convertibilidad con bisulfito:

A continuación, tras el descubrimiento de la convertibilidad diferencial con bisulfito, los inventores analizaron regiones genómicas más grandes mediante secuenciación con bisulfito. Este último procedimiento sirvió para explorar y prolongar las zonas descubiertas parcialmente metiladas y se llevó a cabo, por ejemplo, con el fragmento de descubrimiento convertido con sulfito de manera diferencial, la SEQ ID 517, dentro del gen lipocalina-2 como se describe en el presente documento (véase la Tabla 4, fragmento de descubrimiento de la SEQ ID 517 y región de interés (RDI) discriminante de la 518).

Dentro de la RDI discriminante definida como la SEQ ID 518, se identificó una región de interés preferida que incluye las posiciones CpG preferentes a analizar (amplicón (AMP) 1730, véase la Figura 2 y la SEQ ID 685).

Desarrollo del ensayo de qPCR específico del tipo celular:

En AMP 1730, se realizó un análisis detallado para desarrollar un ensayo de qPCR altamente específico basado en el uso de cebadores y sondas de amplificación. Se diseñaron y probaron cebadores de amplificación (directo e inverso) para AMP 1730 específicos para neutrófilos convertidos con bisulfito, así como sondas (datos no mostrados).

Para desarrollar un sistema de cebador "perfecto" particularmente preferido para el ensayo, se desarrollaron cebadores que no corresponden al 100% con la secuencia original convertida con bisulfito, pero incluyen desajustes específicos que aumentan sorprendentemente la especificidad. Los desajustes en la secuencia del cebador están subrayados y en negrita.

Sistema TpG (detección de posiciones TpG en ADN convertido con bisulfito):

Cebador directo: q1730 nm2Fw2_M1: ACCAAAAATACAACACTTCAA;

Cebador inverso: q1730 nm2R2: GGTAATTGTTAGTAATTTTTGTG;

Sonda de hidrólisis: q1730 nm2P4: FAM-CACTCTCCCCATCCCTCTATC-BHQ1.

Sistema CpG (que detecta las posiciones CpG en el ADN convertido con bisulfito):

Cebador directo: q1730_m2F1: TACCAAAAATACAACACTCCG

Cebador inverso: q1730_m2R2_M1: AGGTAATTGTTAGT AATTTTTACG

Sonda de hidrólisis: q1730 m2P1: HEX-CTCACTCTCCCCGTCCCTCTATC-BHQ1

La especificidad técnica del sistema de PCR específico de TpG se probó según los moldes de prueba (véase la Figura 4). Se descubrió que el sistema de PCR específico de TpG y CpG son altamente específicos para el molde convertido con bisulfito y el no convertido con bisulfito, respectivamente. Adicionalmente, el sistema de PCR específico de TpG y específico de CpG no muestra reactividad cruzada con los moldes de CpG y TpG, respectivamente (Fig. 4 que se muestra para el sistema de PCR específico de TpG). Con el fin de aumentar aún más la especificidad del sistema de cebador de qPCR, la concentración de Mg2+ aumentó de 3,2 mM (generalmente aplicada) a 3,5 mM (véase la Fig.4).

La especificidad biológica del sistema qPCR específico de los neutrófilos se probó utilizando ciertas fracciones de células clasificadas, así como utilizando muestras de sangre completa (véase la Tabla 9). Se descubrió que el ensayo de qPCR establecido era altamente específico para los neutrófilos.

La cantidad relativa de neutrófilos en la muestra se calculó a partir del número de copias del marcador específico de neutrófilos convertido con bisulfito y la suma de copias del marcador de neutrófilos convertidas con bisulfito y no convertidas con bisulfito en la muestra de la siguiente manera:

% de neutrófilos = n.° de copias de neutrófilo convertidas con bisulfito / n.° de copias de neutrófilos no convertidas con bisulfito x 100;

% de neutrófilos = 253,67 / (253,67 152,67) x 100 = 62,43

El presente ensayo es especial en el sentido de que la amplificación del ADN diana de los neutrófilos convertido con bisulfito utilizando cebadores ajustados "comunes" y los protocolos de PCR estándar no proporciona un resultado suficiente. Solo después de usar los cebadores de amplificación que se diseñaron con una mutación (una "falta de coincidencia") en los sitios estratégicos como se identifica en el presente documento, junto con el uso de una concentración de Mg2+ mucho mayor en la PCR permite la amplificación eficaz de la región diana de los neutrófilos.

En una siguiente etapa, se puede diseñar un estándar de plásmido genómico y se puede evaluar el factor de corrección del ensayo específico de la célula (véase el Ejemplo 6).

Ejemplo 8: evaluación del factor de corrección del ensayo específico de la célula utilizando una molécula de ácido nucleico no convertida con bisulfito (estándar de plásmido genómico) como estándar de normalización para cuantificar el número absoluto de células por microlitro

Los inventores desarrollaron estándares de plásmido genómico no convertidos con bisulfito como estándar de normalización. Uno de estos estándares de plásmidos genómicos comprende una región marcadora que es específica para los linfocitos T, así como una región marcadora que no es específica para el tipo celular (GAPDH, gen de mantenimiento, que detecta todas las células, el 100 % de las células). Cada plásmido individual contiene el mismo número de copias de estas dos regiones marcadoras (equimolar); dos de estos plásmidos se corresponden con el número de copias de ADN por una sola célula inmunitaria y, por lo tanto, se cuentan como una sola célula. Se utiliza una solución madre que contiene números definidos de dichas moléculas de plásmido genómico para determinar el factor de corrección del ensayo específico de linfocitos T, así como para evaluar el número absoluto de linfocitos T por microlitro dentro de una muestra de sangre desconocida.

En una primera etapa, Se aisló ADN de cuatro muestras de sangre humana de composición desconocida. Este ADN aislado, así como los plásmidos genómicos del estándar de plásmido genómico se trataron con bisulfito. A continuación, la cantidad de copias de las regiones marcadoras específicas de linfocitos T y específicas de GAPDH convertidas con bisulfito se evaluó mediante qPCR (Tabla 10, sección B, C). Estos análisis de qPCR se realizaron utilizando un estándar de normalización convertido con bisulfito (Tabla 10, sección A) que indica el número relativo de ADN convertido con bisulfito, así como el número relativo de copias de plásmidos genómicos que contienen la región marcadora específica de linfocitos T y la región marcadora específica de GAPDH (Tabla 10 sección B, C).

La cantidad relativa de linfocitos T en porcentaje dentro de las muestras de sangre desconocidas se calcula como el número de copias de marcador específico de linfocitos T convertidas con bisulfito en relación con las copias de GAPDH convertidas con bisulfito (Tabla 10, sección B).

% de linfocitos T = n.° de copias de marcador específico de linfocitos T convertidas con bisulfito x 100

n.° de copias de GAPDH convertidas con bisulfito

(por ejemplo, RD260314):

1896,7 / 6570,0 x 100 = 28,87 %

En una etapa siguiente, se evaluó el factor de corrección de ensayo específico de linfocitos T basado en dicho estándar de plásmido genómico (Tabla GR, sección C). Como se ha descrito anteriormente, dicho estándar de plásmido genómico se convirtió con bisulfito y se evaluó el número de copias de plásmido mediante qPCR utilizando cebadores específicos para las regiones marcadoras convertidas con bisulfito para linfocitos T y para GAPDH. Estos análisis de qPCR también se realizaron utilizando el estándar de normalización convertido con bisulfito (Tabla 10, sección A). La eficiencia de qPCR para los linfocitos T y GAPDH debe ser igual, ya que el nuevo estándar de plásmido genómico no convertido con bisulfito contiene una cantidad equimolar de copias de regiones marcadoras específicas de linfocitos T y específicas de GAPDH. Por lo tanto, la desviación evaluada del número de copias genómicas de linfocitos T y del número de copias de GAPDH se corresponde con las diferencias en las eficacias del ensayo de qPCR.

por ejemplo, número medio de copias de linfocitos T = 6058 frente a número medio de copias de GAPDH medios = 5483

Esta desviación define el factor de corrección específico del ensayo de tipo celular:

Número medio de copias de linfocitos T / número de copias de GAPDH = 6058/5483 = 1,1.

Para los linfocitos T, se evaluó un factor de corrección del ensayo de 1,1 (promedio, n=2) (Tabla 10, sección C). La corrección de la cantidad relativa de linfocitos T por el factor 1,1 da como resultado una cantidad absoluta, por ejemplo, del 26,24 % de linfocitos T dentro de la muestra de sangre desconocida RD260314 (Tabla 10, sección D). cantidad absoluta de linfocitos T = cantidad relativa de linfocitos T / factor de corrección de ensayo específico, por ejemplo:

28,87 % / 1,1 = 26,24 % de linfocitos Treg

Adicionalmente, se evaluó el número absoluto de linfocitos T por microlitro en muestras de sangre desconocidas (Tabla 10, sección E). Como se ha descrito anteriormente, dicho estándar de plásmido genómico (solución madre de 6250 copias por microlitro) se convirtió en bisulfito y el número de copias de plásmido se evaluó mediante qPCR utilizando cebadores específicos para la región marcadora convertida con bisulfito para linfocitos T (sección C). Estas qPCR se realizaron utilizando el estándar de normalización convertido con bisulfito (sección A).

La cantidad de linfocitos T por microlitro en muestras de sangre desconocidas se calcula a partir de la relación del número inicial conocido de plásmidos genómicos de la solución madre (6250 copias) y el número de copias de marcadores específicos de linfocitos T en muestras de sangre desconocidas evaluado por qPCR (véase la sección B) frente al número de copias del estándar de plásmido genómico evaluado por PCR (véase la sección C).

Linfocitos T/|jl = n.° de copias de plásmido/ul x n.° de copias de marcador específico de linfocitos T convertido con bisulfito

n.° medio de copias de plásmido evaluado por qPCR x 2

(por ejemplo, RD260314):

(6250 x 1896,7) / (6058,3 x 2) = 978 linfocitos T /jl

(Véase la Tabla 10 a continuación).

Tabla 10: Evaluación del factor de corrección del ensayo específico de Treg utilizando una molécula de ácido nucleico no convertida con bisulfito como un estándar de plásmido.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de producción de un leucocitograma epigenético o un citograma de linfocitos T epigenético, que comprende las etapas de

a) determinar y proporcionar factores de corrección específicos del ensayo de qPCR, con el fin de normalizar los ensayos de qPCR como se realizan y corregir las diferencias en la eficacia de los ensayos

b) detectar epigenéticamente células sanguíneas en una muestra biológica, que comprende la conversión con bisulfito de al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas a detectar; y

c) cuantificar dichas células sanguíneas según lo detectado, que comprende la evaluación de la cantidad relativa de ADN convertido con bisulfito mediante qPCR, y la normalización de dicha cantidad utilizando un estándar de normalización,

en el que dicho estándar de normalización es una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una región marcadora que es específica para cada una de las células sanguíneas a detectar, y al menos una región de control que no es específica de la célula,

en el que dichas regiones están presentes en el mismo número de copias en dicha molécula y/o una muestra de células sanguíneas naturales de composición conocida,

en el que se detectan regiones marcadoras del tipo celular que discriminan un tipo celular específico y/o al menos una subpoblación específica de células de otras células de un leucocitograma, o un citograma de linfocitos T, y en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición de CpG dentro de cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con las SEQ ID No 1 a 684 es indicativo de un tipo de célula respectivo como se indica en la tabla 4, en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de una cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con la SEQ ID No 685 o 686 es indicativo de un granulocito neutrófilo, en el que una conversión con bisulfito de al menos una posición CpG dentro de una cualquiera de las regiones marcadoras del tipo celular de acuerdo con las SEQ ID No 687 a 689 es indicativo de un granulocito eosinófilo.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha muestra de células sanguíneas naturales es una muestra de sangre de composición celular conocida, y/o de composición de sangre y de tipos de células inmunitarias conocida.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho factor de corrección de ensayo para cada ensayo específico e inespecífico del tipo celular se obtiene comparando la composición cuantitativa de dicha muestra de células sanguíneas naturales con la cantidad relativa de cromatina convertible con bisulfito de dicha muestra de células sanguíneas naturales usando el estándar de normalización, y/o en el que dicha corrección de la cantidad relativa de células dentro de dicha muestra biológica se obtiene utilizando el factor de corrección del ensayo, y es indicativo de la cantidad absoluta y del porcentaje del contenido de células dentro de la muestra biológica.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha al menos una región de control no específica de la célula se selecciona de un gen expresado en todas las células a detectar, como, por ejemplo, un gen de mantenimiento.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho estándar de normalización no está convertido con bisulfito y contiene al menos una posición CpG convertible con bisulfito.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha cuantificación de los tipos de células en dicha muestra biológica se basa en la normalización de la cantidad relativa de cromatina específica e inespecífica del tipo celular usando el estándar de normalización no convertido con bisulfito o usando el estándar de normalización convertido con bisulfito.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha normalización que utiliza el estándar de normalización no convertido con bisulfito es indicativo de la cantidad absoluta y/o del porcentaje de contenido de células dentro de dicha muestra biológica.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biológica es una muestra de composición celular desconocida.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que

a) dicho leucocitograma se selecciona de linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos B, monocitos y/o granulocitos, y combinaciones de los mismos, y

b) dicho citograma de linfocitos T se selecciona de CD3+CD4+, CD4+ de memoria, linfocitos CD4+ efectores, CD4+ sin exposición previa, CD3+CD8+, CD8+ de memoria, linfocitos CD8+ efectores, CD8+ sin exposición previa, CD3+CD8-CD4-, CD3+CD8+CD4+, linfocitos T citolíticos naturales, iTreg, Treg, Tfh, Th1, Th2, TH9, Thl7, Thl9, Th21, Th22, linfocitos T colaboradores de memoria y/o efectores, y combinaciones de los mismos.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha al menos una posición CpG a analizar está presente en una región marcadora de una región 5 ' cadena arriba del inicio de la transcripción, una región promotora, una región 5' o 3' no traducida, un intrón un límite exón/intrón, y/o en una región 3' cadena abajo de la parada de la transcripción.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha determinación de la cantidad relativa de ADN o ácido nucleico convertible con bisulfito y/o no convertible con bisulfito comprende un procedimiento seleccionado de digestos enzimáticos específicos o tecnologías de exclusión por colorantes, secuenciación del bisulfito, secuenciación de próxima generación, secuenciación de nanoporos, secuenciación de una sola molécula en tiempo real, análisis de modificaciones epigenéticas en regiones promotoras, uso de cebadores específicos para el ADN convertido con bisulfito, uso de oligonucleótidos de bloqueo específicos para el ADN convertido con bisulfito, uso de sondas de oligonucleótidos desactivadas y marcadas con fluorescencia, uso de cebadores para la extensión del cebador de un solo nucleótido específico para el ADN convertido con bisulfito, análisis de PCR digital o cuantitativo, y precipitación selectiva específica (ácido nucleico y/o cromatina).

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además la etapa de concluir sobre el estado inmunitario de un mamífero basándose en dicho hemograma epigenético tal como se produce.

13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además la etapa de controlar dicha composición celular en dicha muestra biológica como se identifica comparando dicha composición y/o hemograma como se produce con la composición en una muestra anterior tomada del mismo mamífero, y/o con la composición en una muestra de control.

14. Un procedimiento de diagnóstico de una enfermedad o una predisposición para una enfermedad, que comprende realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y que comprende además la etapa de concluir sobre la enfermedad o una predisposición para dicha enfermedad basándose en modificaciones y cambios de la composición celular en dicha muestra biológica como se identifica al comparar dicha muestra con una muestra de un sujeto sano o a intervalos de referencia médica, en el que la enfermedad a diagnosticar se selecciona del grupo que consiste en rechazos de trasplantes, enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedades neurológicas, alergia, deficiencias inmunitarias primarias y secundarias y neoplasias hematológicas tales como, por ejemplo, neoplasias linfáticas, neoplasias de linfocitos B maduros, neoplasias de linfocitos T y de linfocitos citolíticos naturales maduros, linfomas de Hodgkin, procesos linfoproliferativos después de los trasplantes, VIH y SIDA, enfermedad del injerto contra el huésped, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de estómago, leucemia/linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de piel, cáncer endocrino, cáncer de riñón, cáncer urinario, cáncer de páncreas, otros cánceres gastrointestinales, cáncer de ovarios, cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello, adenomas, defectos de nacimiento, miopatías, retraso mental, obesidad, diabetes, diabetes gestacional, esclerosis múltiple y asma.