ES2729422T3 - Proteínas de unión al antígeno - Google Patents

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Abstract

Una proteína de unión al antígeno que comprende un andamio de inmunoglobulina (Ig) que está enlazado a uno o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina en donde la proteína de unión al antígeno posee por lo menos dos sitios de unión al antígeno, en donde por lo menos uno de los cuales proviene de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina y por lo menos uno de los cuales proviene de un dominio de VH/VL apareado, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina está enlazado al andamio de Ig por un enlazador de péptidos que comprende la SEQ ID NO: 78 o múltiplos de dicho enlazador.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión al antígeno
Antecedentes
Se conocen los anticuerpos para uso en aplicaciones terapéuticas.
Los anticuerpos son glucoproteínas heteromultiméricas que comprenden por lo menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Al margen de IgM, los anticuerpos intactos son usualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 Kda, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de ligamientos disulfuro entre las cadenas pesadas de distintos isotipos de inmunoglobulinas varía. Cada cadena pesada y ligera posee puentes disulfuro intracadena. Cada cadena pesada posee en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de regiones constantes. Cada cadena ligera posee un dominio variable (VL) y una región constante en su otro extremo; la región constante de la cadena ligera está alineada con la primera región constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpos de la mayoría de las especies de vertebrados pueden asignarse a uno de dos tipos llamados Kappa y Lambda en base a la secuencia de aminoácidos de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos humanos se pueden asignar a cinco clases distintas, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA pueden a su vez subdividirse en subclases, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgA1 e IgA2. Las variantes de especies existen con ratones y ratas que tienen por lo menos IgG2a, IgG2b. El dominio variable del anticuerpo confiere especificidad de unión hacia el anticuerpo en donde ciertas regiones exhiben variabilidad particular, llamadas regiones determinantes de complementaridad (CDR). Las porciones más conservadas de la región variable se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras intactas comprenden cada uno cuatro FR conectadas por tres CDR. Las CDR en cada cadena son mantenidas juntas por las regiones FR, y con las CDR de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Las regiones constantes no están directamente implicadas en la unión del anticuerpo al antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras tales como participación en la citotoxicidad mediada por las células dependientes de anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediante la unión al receptor Fcy, tasa de semivida/aclaramiento mediante el receptor Fc neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente del complemento mediante el complemento C1q de la cascada del complemento.
La naturaleza de la estructura de un anticuerpo IgG es tal que hay dos sitios de unión al antígeno, ambos específicos para el mismo epítopo. Son por lo tanto monoespecíficos.
Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que tiene especificidades de unión hacia por lo menos dos epítopos diferentes. Los métodos para elaborar dichos anticuerpos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas H y cadenas L de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas H tienen diferentes especificidades de unión (ver Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 y Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas H y L, se produce una mezcla potencial de diez estructuras de anticuerpos diferentes, de los cuales solamente uno posee la especificidad de unión deseada. Un planteamiento alternativo implica condensar los dominios variables con las especificidades de unión deseadas a la región constante de la cadena pesada que comprende por lo menos parte de la región bisagra, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la región CH1 que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. El ADN que codifica estas fusiones, y si se desea la cadena L, se inserta en vectores de expresión separados y luego se cotransfecta en un organismo hospedante adecuado. Es posible, no obstante, insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas en un vector de expresión. En un planteamiento, un anticuerpo biespecífico está compuesto por una cadena H con una primera especificidad de unión en una rama y un par de cadenas H-L, que proporciona una segunda especificidad de unión en la otra rama, ver WO94/04690. Ver también Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986. Otros planteamientos incluyen moléculas de anticuerpos que comprenden sitios de unión de un solo dominio, como se expone en el documento WO2007/095338.
SHEN ET AL: "Single variable domain antibody as a versatile building block for the construction of IgG-like bispecific antibodies" Journal of Immunological Methods, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, NL Lnkd-D0I:10.1016/J.JIM.2006.09.020. No.1-2,3 enero 2007(2007-01-03), páginas 65-74, XP005820137 ISSN:0022-1759 describe la fusión de una IgG de longitud total con un anticuerpo de un solo dominio mediante un enlazador. Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una proteína de unión al antígeno que comprende un andamio de inmunoglobulina (Ig) que se une a uno o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina en donde la proteína de unión al antígeno posee por lo menos dos sitios de unión al antígeno, en donde por lo menos uno proviene de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina y por lo menos uno proviene de un dominio VH/VL apareado, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina está enlazado al andamio Ig por un enlazador peptídico que comprende la SEQ ID NO: 78 o múltiplos de dicho enlazador.
La invención se refiere a estructuras basadas en IgG que comprenden anticuerpos monoclonales, o fragmentos enlazados a uno o más dominios de anticuerpos, y a métodos para preparar dichas proteínas y sus usos, particularmente usos en terapia.
La invención da a conocer una secuencia de polinucleótidos que codifica una cadena pesada de cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento, y un polinucleótido que codifica una cadena ligera de cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento. Dichos polinucleótidos representan la secuencia codificante que corresponde a las secuencias de polipéptidos equivalentes, no obstante, se ha de entender que dichas secuencias de polinucleótidos podrían clonarse en vectores de expresión junto con un codón de inicio, una secuencia de señal apropiada y un codón de finalización.
La invención también da a conocer una célula hospedante transformada o transfectada recombinante que comprende uno o más polinucleótidos que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento.
La invención da a conocer también un método para la producción de cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento, en donde el método comprende la etapa de cultivar una célula hospedante que comprende un primero y un segundo vector, en donde dicho primer vector comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento y dicho segundo vector comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento, en un medio de cultivo libre de suero.
La invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión al antígeno descrita en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describe en este documento un mAbdAb que comprende la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:85 y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 3, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:86 y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 3, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO 2. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 87, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:2.y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 88, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:85, y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 87, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:85.y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 88,o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:86.y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 87, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:86.y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 88.
Definiciones
La expresión 'andamio de proteína', tal como se emplea en la presente memoria, incluye, entre otros, un andamio de inmunoglobulina (Ig), por ejemplo un andamio de IgG, que puede ser un anticuerpo de cuatro cadenas o de dos cadenas, o que puede comprender solamente la región Fc de un anticuerpo, o que puede comprender una o más regiones constantes de un anticuerpo, en donde las regiones constantes pueden ser de origen humano o primate, o que puede ser una quimera artificial de regiones constantes de humanos o primates. Dichos andamios de proteína pueden comprender sitios de unión al antígeno además de una o más regiones constantes, por ejemplo en donde el andamio de proteína comprende una IgG total. Dichos andamios de proteína serán capaces de enlazarse a otros dominios de proteína que presentan sitios de unión al antígeno, por ejemplo dominios de unión al epítopo o dominios ScFv.
Un "dominio" es una estructura de proteína plegada que posee estructura terciaria independiente del resto de la proteína. En general, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de la función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable del anticuerpo sencillo" es un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de dominios variables del anticuerpo. Por lo tanto incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en donde uno o más bucles se han reemplazado con secuencias que no son características de los dominios variables de los anticuerpos, o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o comprenden extensiones N- o C-terminales, además de fragmentos plegados de dominios variables que retienen por lo menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud total.
La expresión "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable del anticuerpo (Vh, Vhh, Vl) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de un dominio o región V diferente. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (p. ej., homo- o hetero-multímero) con otros dominios variables o regiones variables diferentes en donde las otras regiones o dominios no son requeridos para la unión al antígeno por el dominio variable de inmunoglobulina sencillo (es decir, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es el mismo que un "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" que es capaz de unirse a un antígeno tal como se emplea el término en este documento. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina puede ser un dominio variable del anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpos sencillos de otras especies tal como roedor (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004), tiburón nodriza y Vhh dAb de camélidos. Los Vhh de camélidos son polipéptidos de dominios variables sencillos de inmunoglobulina derivados de las especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. Dichos dominios Vhh se pueden humanizar de acuerdo con técnicas estándar disponibles en el campo, y dichos dominios incluso se consideran "anticuerpos de dominios" de acuerdo con la invención. Tal como se emplea en la presente memoria, "Vh incluye dominios Vhh de camélido. NARV son otro tipo de domino variable sencillo de inmunoglobulina que se identificaron en pez cartilaginoso, incluido el tiburón nodriza. Estos dominios también se conocen como región variable de los receptores de antígenos nuevos (comúnmente abreviado a V(NAR) o NARV). Para más detalles, ver Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) y US20050043519A.
La expresión "dominio de unión al epítopo" se refiere a un dominio que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio V diferente, este puede ser un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina humano, de camélido (nanocuerpo) o dominio variable sencillo de inmunoglobulina de tiburón, o puede ser un dominio no de inmunoglobulina, por ejemplo un dominio derivado de un andamio seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4 (Evicuerpo); lipocalina; moléculas derivadas de proteína A tales como el dominio Z de Proteína A (Afficuerpo, SpA), dominio A (Avímero/Maxicuerpo); proteínas de choque térmico tales como GroEI y GroES; transferrina (trans-cuerpo); proteína de repetición de anquirina (DARPin); aptámero de péptido; dominio de lectina de tipo C (Tetranectina); Y-cristalina humana y ubiquitina humana (afilinas); dominios PDZ; dominios de tipo toxinkunitz de escorpión de inhibidores de proteasa humana; y fibronectina (adnectina); que se han sometido a modificación genética de proteínas con el fin de obtener unión a un ligando distinto del ligando natural.
CTLA-4 (antígeno asociado con linfocitos T citotóxicos 4) es un receptor de la familia CD28 expresado principalmente en células CD4+ T. Su dominio extracelular posee un dominio variable de tipo pliegue de Ig. Los bucles correspondientes a las CDR de los anticuerpos se pueden sustituir con secuencia heteróloga para conferir distintas propiedades de unión. Las moléculas de CTLA-4 modificadas para tener diferentes especificidades de unión también se conocen como Evicuerpos. Para más detalles, ver Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)
Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan moléculas hidrófobas pequeñas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen una estructura secundaria de lámina p rígida con un número de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se puede modificar para unirse a distintos antígenos diana. Las anticalinas tienen un tamaño de 160-180 aminoácidos, y derivan de lipocalinas. Para más detalles, ver Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 y US20070224633
Un anticuerpo es un andamio derivado de Proteína A de Staphylococcus aureus que se puede modificar para unirse al antígeno. El dominio consiste en un paquete de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado bibliotecas por aleatorización de residuos superficiales. Para más detalles ver Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y EP1641818A1
Los avímeros son proteínas de múltiples dominios derivadas de la familia del andamio del dominio A. Los dominios naturales de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura enlazada disulfuro. Se genera diversidad mezclando la variación natural exhibida por la familia de dominios A. Para más detalles ver Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) y Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (junio 2007)
Una transferrina es una glucoproteína de transporte de suero monomérico. Las transferrinas se pueden modificar para unirse a distintos antígenos diana por inserción de secuencias de péptidos en un bucle superficial permisivo. Los ejemplos de andamios de transferrina genéticamente modificados incluyen el Trans-cuerpo. Para más detalles, ver J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
Las proteínas de repetición de anquirina designadas (DARPins) derivan de Anquirina que es una familia de proteínas que median la sujeción de proteínas de membrana integral al citoesqueleto. Una repitición de anquirina sencilla es un motivo de 33 residuos de dos a-hélices y un p-giro. Se pueden modificar genéticamente para unirse a diferentes antígenos diana aleatorizando residuos en la primera a-hélice y un p-giro de cada repetición. Su interface de unión se puede aumentar, aumentando el número de módulos (un método de maduración por afinidad). Para más detalles, ver J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) yJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y US20040132028A1.
La fibronectina es un andamio que se puede modificar para unirse al antígeno. La adnectinas consisten en un esqueleto de la secuencia de aminoácidos naturales del décimo dominio de las 15 unidades de repetición de fibronectina humana de tipo III (FN3). Se pueden modificar tres bucles en un extremo del p-sándwich para permitir que la Adnectina reconozca específicamente una diana terapéutica de interés. Para más detalles, ver Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 y US6818418B1.
Los aptámeros de péptidos son moléculas de reconocimiento combinatorias que consisten en una proteína umbral constante, típicamente tiorredoxina (TrxA) que contiene un bucle de péptido variable restringido insertado en el sitio activo. Para más detalles, ver Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).
Los microcuerpos derivan de microproteínas naturales de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes cisteína - los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxina y knottinas. Las microproteínas tienen un bucle que se puede modificar genéticamente para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar el pliegue total de la microproteína. Para más detalles de los dominios knottina modificados, ver el documento WO2008098796.
Otros dominios de unión al epítopo que incluyen proteínas que han sido utilizadas como andamio para modificar distintas proteínas de unión al antígeno diana son Y-cristalina humana y ubiquitina humana (affilinas), dominios de tipo kunitz de inhibidores de proteasa humana, dominios PDZ de la proteína de unión a Ras AF-6, toxinas de escorpión (caribdotoxina), dominio lectina de tipo C (tetranectinas) y se revisan en el Capítulo 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, editado por Stefan Dubel) y Protein Science 15:14-27 (2006). Los dominios de unión al epítopo de la presente invención podrían derivar de cualquiera de estos dominios de proteína alternativos.
Tal como se emplean en la presente memoria, las expresiones "dominio VH apareado", "dominio VL apareado" y "dominios VH/v L apareados" se refieren a dominios variables de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos solamente cuando se aparean con su dominio variable ligando. Hay solamente un VH y un VL en cualquier apareamiento, y la expresión "dominio VH apareado" se refiere al ligando VH, la expresión "dominio VL apareado" se refiere al ligando VL, y la expresión "dominios VH/VL apareados" se refiere a los dos dominios juntos. En una realización de la invención, el sitio de unión al antígeno se une a un antígeno con un valor Kd de por lo menos 1 mM, por ejemplo un valor Kd de 10 nM, 1nM, 50 0pM, 200 pM, 100 pM, para cada antígeno según lo medido por Biacore™, tal como el método Biacore™ descrito en el Ejemplo 7.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "sitio de unión al antígeno" se refiere a un sitio en una proteína que es capaz de unirse específicamente a un antígeno, este puede ser un dominio sencillo, por ejemplo un dominio de unión al epítopo, o pueden ser dominios VH/VL apareados como se puede hallar en un anticuerpo estándar. En algunos aspectos de la invención, dominios de cadena sencilla Fv (ScFv) pueden proporcionar sitios de unión al antígeno.
Los términos "mAb/dAb" y dAb/mAb" se utilizan en esta memoria para hacer referencia a proteínas de unión al antígeno de la presente invención. Los dos términos se pueden usar de manera intercambiable, y tienen como fin tener el mismo significado que se usa en este documento.
La expresión "cadena pesada constante 1" se usa en este documento para hacer referencia al dominio CH1 de una cadena pesada de inmunoglobulina.
La expresión "cadena ligera constante" se usa en este documento para hacer referencia al dominio constante de una cadena ligera de inmunoglobulina.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a una proteína de unión al antígeno que comprende un andamio de inmunoglobulina (Ig) que se enlaza a uno o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina en donde la proteína de unión al antígeno posee por lo menos dos sitios de unión al antígeno, en donde por lo menos uno de ellos proviene de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina y por lo menos uno de ellos proviene de un dominio VH/VL apareado, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se enlaza al andamio de Ig mediante un enlazador peptídico que comprende SEQ ID NO: 78 o múltiplos de dicho enlazador.
Dichas proteínas de unión al antígeno comprenden un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de Ig tal como IgG, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, que se enlaza a uno o más dominios de unión al epítopo por ejemplo un anticuerpo de dominio, en donde la proteína de unión posee por lo menos dos sitios de unión al antígeno, en donde por lo menos uno de los cuales deriva de un dominio de unión al epítopo, y a métodos para producir y sus usos, particularmente usos en terapia.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención también se denominan mAbdAb o dAbmAb.
En una realización, el andamio de proteína de la proteína de unión al antígeno de la presente invención es un andamio de Ig, por ejemplo un andamio de IgG o un andamio de IgA. El andamio de IgG puede comprender todos los dominios de un anticuerpo (es decir, CH1, CH2, CH3, VH, VL). La proteína de unión al antígeno de la presente invención puede comprender un andamio de IgG seleccionado entre IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgG4PE.
La proteína de unión al antígeno de la presente invención posee dos sitios de unión al antígeno, por ejemplo tiene dos sitios de unión, por ejemplo en donde el primer sitio de unión posee especificidad hacia un primer epítopo en un antígeno y el segundo sitio de unión posee especificidad hacia un segundo epítopo en el mismo antígeno. En otra realización, hay 4 sitios de unión al antígeno, o 6 sitios de unión al antígeno, u 8 sitios de unión al antígeno, o 10 o más sitios de unión al antígeno. En una realización, la proteína de unión al antígeno tiene especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo dos antígenos, o tres antígenos o cuatro antígenos.
En una realización de la presente invención, el dominio de unión al epítopo es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina.
Se ha de entender que cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento será capaz de neutralizar uno o más antígenos.
El término "neutraliza" y sus variaciones gramaticales que se usa en toda la memoria en relación a las proteínas de unión al antígeno de la invención significa que se reduce una actividad biológica de la diana, o bien total o parcialmente, en presencia de las proteínas de unión al antígeno de la presente invención en comparación con la actividad de la diana en ausencia de dichas proteínas de unión al antígeno. La neutralización puede deberse a, entre otras cosas, uno o más de bloquear la unión al ligando, prevenir que el ligando active el receptor, reducir el receptor o afectar la funcionalidad del efector.
Los niveles de neutralización se pueden medir de varias maneras, por ejemplo mediante el uso de cualquiera de los ensayos expuestos en los ejemplos y métodos que siguen, por ejemplo en un ensayo que mide la inhibición de la unión del ligando al receptor. La neutralización del ligando en dichos ensayos se puede medir evaluando la reducción de la unión entre el ligando y su receptor en presencia de la proteína de unión al antígeno neutralizante. Los niveles de neutralización también se pueden medir, por ejemplo en un ensayo TF1 que se puede llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4.3 o 4.4. La neutralización de IL-4, IL-13 o estas dos citocinas en este ensayo se mide evaluando la inhibición de la proliferación de células TF1 en presencia de la proteína de unión al antígeno neutralizante.
Otros métodos para evaluar la neutralización, por ejemplo, evaluando la reducción de unión entre el ligando y su receptor en presencia de proteína de unión al antígeno neutralizante se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inhibición del receptor de ligando ELISA o ensayos Biacore™.
En un aspecto alternativo de la presente invención se dan a conocer proteínas de unión al antígeno que tienen actividad neutralizante por lo menos sustancialmente equivalente a los anticuerpos ejemplificados en este documento, por ejemplo proteínas de unión al antígeno que retienen la actividad neutralizante de BPC2201, BPC2202, BPC2203, BPC2209, BPC2210, BPC2204 a BPC2208 y BPC2220 en el ensayo de unión IL-13/4 expuesto en el Ejemplo 2.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia IL-13, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a IL-13, o que comprende un VH/VL apareado que se une a IL-13. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a iL-13. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a iL-13.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención tiene especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo, en donde es capaz de unirse a dos o más antígenos seleccionados entre IL-13, IL-5 e IL-4, por ejemplo en donde es capaz de unirse a IL-13 e IL-4, o en donde es capaz de unirse a IL-13 e IL-5, o en donde es capaz de unirse a IL-5 e IL-4.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención tiene especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unirse a dos o más antígenos seleccionados entre IL-13, IL-5 e IL-4, por ejemplo en donde es capaz de unirse a IL-13 e IL-4 simultáneamente, o donde es capaz de unirse a IL-13 e IL-5 simultáneamente, o donde es capaz de unirse a IL-5 y IL-4 simultáneamente.
Se ha de entender que cualquiera de las proteínas de unión al antígeno descritas en este documento puede ser capaz de unirse a dos o más antígenos simultáneamente, por ejemplo, según lo determinado por análisis de estequiometría usando un ensayo adecuado tal como aquel descrito en el Ejemplo 3.
Los ejemplos de proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen anticuerpos IL-13 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-4, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-4, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o distinta especificidad a antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/ o al término c y/o al término n de la cadena ligera. Los anticuerpos IL-13 de uso en la presente invención incluyen aquellos que comprenden secuencias de la cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 28 y una secuencia de la cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 27.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-4 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-13, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-13, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden también tener otros dominios de unión al epítopo con la misma o distinta especificidad sujetada al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Los anticuerpos IL-4 de uso en la presente invención incluyen aquellos que comprenden secuencias de la cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO:2 y una secuencia de la cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO:3. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-13 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-5, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-5, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-13 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden además tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con igual o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-5 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-13, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-13, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden además tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con igual o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera. Los anticuerpos IL-5 de uso en la presente invención incluyen aquellos que comprenden secuencias de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 91 y una secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 92
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-4 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-5, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-5, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-4 con un dominio de unión al epítopo IL-5 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden además tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con igual o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-5 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-4, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-4, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden además tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con igual o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
La invención también da a conocer también una proteína de unión triespecífica que es capaz de unirse a IL-4, IL-13 e IL-5. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-5 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-4, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-4, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-13, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-13, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-5 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera.
Dichas proteínas de unión al antígeno pueden además tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con igual o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia IL-18, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a IL-18, o que comprende un VH/VL apareado que se une a IL-18.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a IL-18. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a iL-18.
La invención también da a conocer una proteína de unión triespecífica capaz de unirse a IL-4, IL-13 e IL-18.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-18 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-4, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-4, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-13, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-13, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término n de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena pesada y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término c de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena pesada.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL-18 con un dominio de unión al epítopo IL-4 sujetado al término c de la cadena ligera y un dominio de unión al epítopo IL-13 sujetado al término n de la cadena ligera.
Dichas proteínas de unión al antígeno pueden además tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con igual o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia TNFa, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a TNFa, o que comprende un VH/VL apareado que se une a TNFa.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a TNFa. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a TNFa.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención posee especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unirse a dos o más antígenos seleccionados entre TNFa, EGFR y VEGF, por ejemplo en donde es capaz de unirse a TNFa y EGFR, o en donde es capaz de unirse a TNFa y VEGF, o en donde es capaz de unirse a EGFR y VEGF. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos TNFa que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia EGFR, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-EGFR, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo EGFR sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo EGFR sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo EGFR sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo EGFR sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o diferente especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos EGFR con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos EGFR con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos EGFR con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos EGFR con un dominio de unió al epítopo TNFa sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al epítopo pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o diferente especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos TNFa que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia VEGF, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-VEGF, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
La proteína de unión al antígeno de la presente invención puede tener especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unirse a TNFa, y uno o ambos antígenos seleccionados entre IL-4 y IL-13, por ejemplo en donde es capaz de unirse a TNFa e IL-4, o en donde es capaz de unirse a TNFa e IL-13, o en donde es capaz de unirse a TNFa e IL-13 e IL-4. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-13 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia TNFa, por ejemplo una anti-TNFa adnectina, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera. Otros ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-4 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia TNFa, por ejemplo una anti- TNFa adnectina, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos TNFa con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o distinta especificidad sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo TNFa sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al epítopo pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o diferente especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia CD-20, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a CD-20, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a CD-20.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a CD-20. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a CD-20.
Dichas proteínas de unión al antígeno pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o distinta especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia IL1R1, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a IL1R1, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a IL1R1.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a IL1R1. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a IL1R1.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención tiene especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unir IL1R1 y un segundo antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unir IL1R1 y VEGF. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL1R1 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia VEGF, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-VEGF, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL1R1 con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL1R1 con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL1R1 con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos IL1R1 con un dominio de unión al epítopo VEGF sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al epítopo pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o diferente especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo IL1R1 sujetado al término n de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo IL1R1 sujetado al término n de la cadena ligera. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo IL1R1 sujetado al término c de la cadena pesada. Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención incluyen anticuerpos VEGF con un dominio de unión al epítopo IL1R1 sujetado al término c de la cadena ligera. Dichas proteínas de unión al epítopo pueden también tener uno o más de otros dominios de unión al epítopo con la misma o diferente especificidad de antígenos sujetados al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia EGFR, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a EGFR, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a EGFR.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a EGFR. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a EGFR.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención posee especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unirse a dos o más antígenos seleccionados entre EGFR, IGF-1R, VEGFR2 y VEGf , por ejemplo en donde es capaz de unir EGFR y IGF-1R, o en donde es capaz de unir EGFR y VEGF, o en donde es capaz de unir VEGF y IGF-1R, o en donde es capaz de unir EGFR y VEGFR2, o en donde es capaz de unir IGF-1R y VEGFR2, o en donde es capaz de unir VEGF y VEGFR2, o en donde es capaz de unir EGFR, IGF-1R y VEGFR2, o en donde es capaz de unir VEGF, IGF-1R y VEGFR2, o en donde es capaz de unir EGFR, VEGF y VEGFR2, o en donde es capaz de unir EGFR, VEGF y IGF1R. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos EGFR que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia VEGFR2, por ejemplo una anti-VEGFR2 adnectina, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos EGFR que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia VEGF, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-VEGF, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos VEGF que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia EGFR, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-EGFR, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IGF-1R que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia VEGF, por ejemplo una lipocalina anti-VEGF, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IGF-1R que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia VEGFR2, por ejemplo una adnectina anti-VEGFR2, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia IL-23, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a IL-23, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a IL-23.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a IL-23. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a iL-23.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención tiene especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unir dos o más antígenos seleccionados entre citocinas de tipo TH17, por ejemplo. IL-17, IL-22 o IL-21, por ejemplo en donde es capaz de unir IL-23 e IL-17, o en donde es capaz de unir IL-23 e IL-21, o en donde es capaz de unir IL-23 e IL-22. Los ejemplos de dichas proteínas de unión al antígeno incluyen anticuerpos IL-23 que tienen un dominio de unión al epítopo con una especificidad hacia IL-17, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-IL-17, sujetado al término c o al término n de la cadena pesada o al término c o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia PDGFRa, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a PDGFRa, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a PDGFRa. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a PDGFRa. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a PDGFRa.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia FGFR1, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a FGFR1, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a FGFR1. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a FGFR1. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a FGFR1.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia FGFR3, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a FGFR3, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a FGFR3. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a FGFR3. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a FGFR3.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia VEGFR2, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a VEGFR2, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a VEGFR2. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a VEGFR2. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a VEGFR2.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia VEGFR3, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a VEGFR3, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a VEGFR3. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a VEGFR3. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a VEGFR3.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia cadherina VE, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a cadherina VE, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a cadherina VE.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a cadherina VE. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a cadherina VE. Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia neuropilina, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo que es capaz de unirse a neuropilina, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a neuropilina. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a neuropilina. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a neuropilina.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia Flt-3, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a Flt-3, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a Flt-3.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a Flt-3. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a Flt-3.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia ron, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a ron, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a ron.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a ron. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a ron.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia Trp-1, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a Trp-1, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a Trp-1.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a Trp-1. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a Trp-1.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención posee especificidad hacia más de un antígeno, por ejemplo en donde es capaz de unir dos o más antígenos implicados en el cáncer, por ejemplo en donde es capaz de unir dos o más antígenos seleccionados entre PDGFRa, FGFR1, FGFR3, VEGFR2, VEGFR3, IGF1R, EGFR y VEGF, VE cadherina, neuropilina, Flt-3, ron, Trp-1, CD-20 por ejemplo en donde es capaz de unir PDGFRa y Fg Fr 1, o en donde es capaz de unir PDGFRa y VeGf , o en donde es capaz de unir PDGFRa y FGFR3, o en donde es capaz de unir PDGFRa y VEGFR2, o en donde es capaz de unir PDGFRa y VEGFR3, o en donde es capaz de unir PDGFRa y IGF1R, o en donde es capaz de unir PDGFRa y EGFR, o en donde es capaz de unir PDGFRa y VEGF, o en donde es capaz de unir PDGFRa y VE cadherina, o en donde es capaz de unir PDGFRa y neuropilina, o en donde es capaz de unir PDGFRa y Flt-3, o en donde es capaz de unir PDGFRa y ron, o en donde es capaz de unir PDGFRa y Trp1, o en donde es capaz de unir PDGFRa y CD-20, o en donde es capaz de unir FGFR1 y FGFR3, o en donde es capaz de unir FGFR1 y VEGFR2, o en donde es capaz de unir FGFR1 y VEGR3, o en donde es capaz de unir FGFR1 y IGF1R, o en donde es capaz de unir FGFR1 y EGFR, o en donde es capaz de unir FGFR1 y VEGF, o en donde es capaz de unir FGFR1 y VE cadherina, o en donde es capaz de unir FGFR1 y neuropilina, o en donde es capaz de unir FGFR1 y Flt-3, o en donde es capaz de unir FGFR1 y ron, o en donde es capaz de unir FGFR1 y Trp-1, o en donde es capaz de unir FGFR1 y CD-20, o en donde es capaz de unir FGFR3 y VEGFR2, o en donde es capaz de unir FGFR3 y VEGFR3, o en donde es capaz de unir FGFR3 y IGF1R, o en donde es capaz de unir FGFR3 y EGFR, o en donde es capaz de unir FGFR3 y VEGF, o en donde es capaz de unir FGFR3 y VE cadherina, o en donde es capaz de unir FGFR3 y neuropilina, o en donde es capaz de unir FGFR3 y Flt-3, o en donde es capaz de unir FGFR3 y ron, o en donde es capaz de unir FGFR3 y Trp-1, o en donde es capaz de unir FGFR3 y CD-20, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y VEGFR3, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y IGF1R, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y EGFR, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y VEGF, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y VE cadherina, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y neuropilina, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y Flt-3, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y ron, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y Trp-1, o en donde es capaz de unir VEGFR2 y CD-20, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y IGF-1R, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y EGFR, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y VEGF, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y VE cadherina, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y neuropilina, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y Flt-3, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y Trp-1, o en donde es capaz de unir VEGFR3 y CD-20, o en donde es capaz de unir IGF1R y EGFR, o en donde es capaz de unir IGF1R y VEGF, o en donde es capaz de unir IGF1R y VE cadherina, o en donde es capaz de unir IGF1R y neuropilina, o en donde es capaz de unir IGF1R y Flt-3, o en donde es capaz de unir IGF1R y ron, o en donde es capaz de unir IGF1R y Trp-1, o en donde es capaz de unir IGF1R y CD-20, o en donde es capaz de unir EGFR y VEGF, o en donde es capaz de unir EGFR y VE cadherina, o en donde es capaz de unir EGFR y neuropilina, o en donde es capaz de unir EGFR y Flt-3, o en donde es capaz de unir EGFR y ron, o en donde es capaz de unir EGFR y Trp-1, o en donde es capaz de unir EGFR y CD-20, o en donde es capaz de unir VEGF y VE cadherina, o en donde es capaz de unir VEGF y neuropilina, o en donde es capaz de unir VEGF y Flt-3, o en donde es capaz de unir VEGF y ron, o en donde es capaz de unir VEGF y Trp-1, o en donde es capaz de unir VEGF y CD-20, o en donde es capaz de unir VE cadherina y neuropilina, o en donde es capaz de unir VE cadherina y Flt-3, o en donde es capaz de unir VE cadherina y ron, o en donde es capaz de unir VE cadherina y Trp-1, o en donde es capaz de unir VE cadherina y CD-20, o en donde es capaz de unir neuropilina y Flt-3, o en donde es capaz de unir neuropilina y ron, o en donde es capaz de unir neuropilina y Trp-1, o en donde es capaz de unir neuropilina y CD-20, o en donde es capaz de unir Flt-3 y ron, o en donde es capaz de unir Flt-3 y Trp-1, o en donde es capaz de unir Flt-3 y CD-20, o en donde es capaz de unir ron y Trp-1, o en donde es capaz de unir ron y CD-20, y o en donde es capaz de unir Trp-1 y CD-20.
Dichas proteínas de unión al antígeno pueden también tener uno o más dominios de unión al epítopo con la misma o distinta especificidad de antígenos sujetado al término c y/o al término n de la cadena pesada y/o al término c y/o al término n de la cadena ligera.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia beta-amiloide, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a beta-amiloide, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a beta-amiloide.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a beta-amiloide. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a betaamiloide.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia CD-3, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a CD-3, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a CD-3.
La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a CD-3. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a CD-3.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia gpIIIb/IIa, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a gpIIIb/IIa, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a gpIIIb/IIa. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a gpIIIb/IIa. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a gpIIIb/IIa.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen aquellas que tienen especificidad hacia TGFbeta, por ejemplo que comprenden un dominio de unión al epítopo capaz de unirse a TGFbeta, o que comprenden un VH/VL apareado que se une a TGFbeta. La proteína de unión al antígeno puede comprender un anticuerpo capaz de unirse a TGFbeta. La proteína de unión al antígeno puede comprender un dominio variable sencillo de inmunoglobulina capaz de unirse a TGFbeta.
En una realización de la presente invención se da a conocer una proteína de unión al antígeno de acuerdo con la invención descrita en este documento y que comprende una región constante de modo tal que el anticuerpo presenta menor ADCC y/o activación del complemento o funcionalidad del efector. En dicha realización, la región constante de la cadena pesada puede comprender una región constante naturalmente desactivada de isotipo IgG2 o IgG4 o una región constante de IgG1 mutada. Los ejemplos de modificaciones adecuadas se describen en el documento EP0307434. Un ejemplo comprende las sustituciones de residuos alanina en las posiciones 235 y 237 (numeración de índice de la UE).
En una realización, las proteínas de unión al antígeno de la presente invención retienen la funcionalidad Fc, por ejemplo son capaces de presentar actividad ADCC y CDC. Dichas proteínas de unión al antígeno pueden comprender un dominio de unión al epítopo localizado en la cadena ligera, por ejemplo en el término c de la cadena ligera.
La invención da a conocer también un método para mantener la función de ADCC y CDC de las proteínas de unión al antígeno, posicionando el dominio de unión al epítopo en la cadena ligera del anticuerpo, en particular, posicionando el dominio de unión al epítopo en el término c de la cadena ligera. Dicha función de ADCC y CDC se puede medir con cualquier ensayo adecuado conocido por el experto en la técnica.
La invención da a conocer también un método para reducir la función de CDC de las proteínas de unión al antígeno posicionando el dominio de unión al epítopo en la cadena pesada del anticuerpo, en particular, posicionando el dominio de unión al epítopo en el término c de la cadena pesada. Dicha función de CDC se puede medir por cualquier ensayo adecuado, conocido para el experto en la técnica.
En otra realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención es capaz de unirse a dos o más antígenos seleccionados entre VEGF, IGF-1R y EGFR, por ejemplo es capaz de unirse a EGFR y VEGF, o EGFR y IGF1R, o IGF1R y VEGF, o por ejemplo es capaz de unirse a TNF y IL1-R. En realizaciones de la invención que comprenden un sitio de unión a IGF-1R, el sitio de unión a IGF-1R de la proteína de unión al antígeno de la invención puede comprender un dominio VH/VL apareado en el andamio de la proteína.
En una realización, las proteínas de unión al antígeno comprenden un dominio de unión al epítopo que es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, por ejemplo el dominio de unión al epítopo puede ser un VH humano o un VL humano, o Vhh de camélido (nanocuerpo) o un dAb de tiburón (NARV).
En una realización, las proteínas de unión al antígeno comprenden un dominio de unión al epítopo derivado de un andamio no de inmunoglobulina, por ejemplo un dominio no inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4 (Evicuerpo); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A tales como el dominio Z de la Proteína A (Aficuerpo, SpA), el dominio A (Avímero/Maxicuerpo); proteínas de choque térmico tales como GroEI y GroES; transferrina (trans-cuerpo); proteína de repetición de anquirina (DARPin); aptámero de péptido; dominio lectina de tipo C (Tetranectina); Y-cristalina humana y ubiquitina humana (affilinas); dominios PDZ; dominios de escorpión de tipo toxinkunitz de inhibidores de proteasa humana; y fibronectina (adnectina); que se han sometido a modificación de proteínas con el fin de obtener unión a un ligando distinto del ligando natural.
La proteína de unión al antígeno de la presente invención puede comprender un andamio de proteína sujetado a un dominio de unión al epítopo que es una adnectina, por ejemplo un andamio de IgG con una adnectina sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender un andamio de proteína sujetado a una adnectina, por ejemplo un andamio de IgG con una adnectina sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender un andamio de proteína sujetado a una adnectina, por ejemplo un andamio de IgG con una adnectina sujetado al término c de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de proteína sujetado a una adnectina, por ejemplo un andamio de IgG con una adnectina sujetado al término n de la cadena ligera.
En otras realizaciones, puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es CTLA-4, por ejemplo un andamio de IgG con CTLA-4 sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con CTLA-4 sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con CTLA-4 sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con CTLA-4 sujetado al término c de la cadena ligera.
En otras realizaciones, puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es una lipocalina, por ejemplo un andamio de IgG con una lipocalina sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender, por ejemplo, un andamio de IgG con una lipocalina sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender, por ejemplo, un andamio de IgG con una lipocalina sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con una lipocalina sujetado al término c de la cadena ligera.
En otras realizaciones, puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un SpA, por ejemplo un andamio de IgG con un SpA sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender, por ejemplo, un andamio de IgG, con un SpA sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender, por ejemplo, un andamio de IgG con un SpA sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un SpA sujetado al término c de la cadena ligera.
En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un aficuerpo, por ejemplo un andamio de IgG con un aficuerpo sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un aficuerpo sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un aficuerpo sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un aficuerpo sujetado al término c de la cadena ligera.
En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un afímero, por ejemplo un andamio de IgG con un afímero sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un afímero sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un afímero sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un afímero sujetado al término c de la cadena ligera. En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un GroEI, por ejemplo un andamio de IgG con un GroEI sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un GroEI sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un GroEI sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un GroEI sujetado al término c de la cadena ligera. En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un domino de unión al epítopo que es una transferrina, por ejemplo un andamio de IgG con una transferrina sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con una transferrina sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con una transferrina sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con una transferrina sujetado al término c de la cadena ligera.
En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un GroES, por ejemplo un andamio de IgG con un GroES sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un GroES sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un GroES sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un GroES sujetado al término c de la cadena ligera. En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un DARPin, por ejemplo un andamio de IgG con un DARPin sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un DARPin sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un DARPin sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un DARPin sujetado al término c de la cadena ligera. En otras realizaciones puede comprender un andamio de proteína, por ejemplo un andamio de IgG, sujetado a un dominio de unión al epítopo que es un aptámero de péptido, por ejemplo un andamio de IgG con un aptámero de péptido sujetado al término n de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un aptámero de péptido sujetado al término c de la cadena pesada, o puede comprender por ejemplo un andamio de IgG con un aptámero de péptido sujetado al término n de la cadena ligera, o puede comprender un andamio de IgG con un aptámero de péptido sujetado al término c de la cadena ligera.
En una realización de la presente invención hay cuatro dominios de unión al epítopo, por ejemplo cuatro dominios de anticuerpo, dos de los dominios de unión al epítopo pueden tener especificidad hacia el mismo antígeno, o todos los dominios de unión al epítopo presentes en la proteína de unión al antígeno pueden tener especificidad hacia el mismo antígeno.
Los andamios de proteína de la presente invención se enlazan a los dominios de unión al epítopo mediante el uso de enlazadores. Los enlazadores adecuados que se describen en este documento incluyen secuencias de aminoácidos que pueden tener entre 1 aminoácido y 150 aminoácidos de longitud, o entre 1 aminoácido y 140 aminoácidos, por ejemplo, entre 1 aminoácido y 130 aminoácidos, o entre 1 y 120 aminoácidos, o entre 1 y 80 aminoácidos, o entre 1 y 50 aminoácidos, o entre 1 y 20 aminoácidos, o entre 1 y 10 aminoácidos, o entre 5 y 18 aminoácidos. Dichas secuencias pueden tener su propia estructura terciaria, por ejemplo, un enlazador de la presente invención puede comprender un dominio variable sencillo. El tamaño de un enlazador en una realización es equivalente a un dominio variable sencillo. Los enlazadores adecuados pueden tener un tamaño de 1 a 20 angstroms, por ejemplo menos de 15 angstroms, o menos de 10 angstroms, o menos de 5 angstroms.
En otra realización, por lo menos uno de los dominios de unión al epítopo está directamente sujetado al andamio de Ig con un enlazador que comprende la SEQ ID NO:78. Los enlazadores de uso en las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden comprender solos o además de otros enlazadores, uno o más conjuntos de residuos GS, por ejemplo 'Gs PAS' o 'PASGS' o 'GSPASGS'.
Los ejemplos de dichos enlazadores incluyen (TGLDSP)n(GS)m en donde n=1 y m=1 (SEQ ID NO: 70), (TGLDSP)n(GS)m en donde n=2 y m=1 (SEQ ID NO: 71), (TGLDSP)n(GS)m en donde n=3 y m=1 (SEQ ID NO:72), (TGLDSP)n(GS)m en donde n=4 y m=1, (TGLDSP)n(GS)m en donde n=2 y m=0, (TGLDSP)n(GS)m en donde n=3 y m=0, (TGLDSP)n(GS)m en donde n=4 y m=0.
En una realización, la proteína de unión al antígeno de la presente invención comprende por lo menos un dominio de unión al epítopo capaz de unir albúmina de suero humano.
En una realización, hay por lo menos 3 sitios de unión al antígeno, por ejemplo hay 4, o5 o6 o8 o 10 sitios de unión al antígeno y la proteína de unión al antígeno es capaz de unirse a por lo menos 3 o4 o5 o6 o8 o 10 antígenos, por ejemplo es capaz de unirse a 3 o4 o5 o6 o8 o10 antígenos simultáneamente.
También se describe en este documento un mAbdAb que comprende la secuencia de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO:85 y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO:86 y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO 2. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 87, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:2. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 88, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO:85. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 87, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO:85. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 88,o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:86. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 87, o la secuencia de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:86. y la secuencia de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 88. Cualquiera de los enlazadores utilizados en la s Eq ID NO: 85-88 podría reemplazarse con cualquiera de los otros enlazadores o combinaciones de enlazadores descritos en este documento, en particular la porción 'GS' del enlazador podría eliminarse.
En una realización, la presente invención da a conocer un método para mejorar la potencia de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina cuando se sujeta a un andamio de inmunoglobulina (Ig), en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina posee potencia reducida cuando se sujeta directamente a un andamio de Ig sin un enlazador, en comparación con su potencia como dominio variable sencillo de inmunoglobulina desnudo, que comprende la etapa de añadir un enlazador de péptido entre el andamio de Ig y el dominio variable sencillo de inmunoglobulina en donde el enlazador de péptido comprende la SEQ ID NO: 78 o múltiplos de dicho enlazador. En una realización de este método, el andamio de proteína es un andamio de Ig. El andamio de Ig puede comprender un dominio Fc de un anticuerpo. En dicha realización de este método, el andamio de proteína es un anticuerpo. En otra de dichas realizaciones de este método, el andamio proteína comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la cadena pesada comprende CH1-CH2-CH3, y la cadena ligera comprende CL. También se describe en este documento una realización de este método en donde el andamio de proteína es un receptor soluble, es decir, un receptor condensado al dominio Fc de un anticuerpo, por ejemplo, el receptor soluble se puede seleccionar entre Abatacept (comercializado como Orencia) que es una proteína de fusión compuesta por una inmunoglobulina condensada al dominio extracelular de cTlA-4, una molécula capaz de unirse B7; Etanercept (Enbrel) que es un receptor del factor de necrosis tumoral TNF del tumor humano soluble recombinante p75 (TNFR2) y proteína de fusión de la porción Fc de IgG1 humana producida en un sistema de expresión de células mamíferas, que se está desarrollando para uso en el tratamiento de la artritis reumatoidea (Ra ) y otras afecciones inflamatorias; y Atacicept que es una proteína de fusión recombinante que comprende la porción del receptor del receptor de linfocitos B tAc I, que se une a y es activado por las citocinas BlyS y APRIL. La proteína soluble comprende la fusión del dominio extracelular del receptor TACI con la porción Fc de IgG1 humana. El receptor TACI es miembro de la familia de receptores TNF. Atacicept se une al exceso de BLyS y APRIL, previniendo su unión a células B, regulando de este modo la madurez de las células B y la producción de anticuerpos. Se está desarrollando para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
En una realización, el dominio de unión al epítopo es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, por ejemplo un dAb humano, o un domino variable sencillo VHH de camélido (nanocuerpo). En otra realización, el dominio de unión al epítopo es un dominio no de Ig, por ejemplo los dominios no de Ig descritos en este documento.
En una realización descrita en este documento, el método para mejorar la potencia de un dominio de unión al epítopo en el contexto de una proteína de fusión comprende las siguientes etapas:
(i) Determinar la potencia original del dominio de unión al epítopo desnudo,
(ii) Sujetar el dominio de unión al andamio de proteína, por ejemplo, un anticuerpo,
(iii) Determinar la potencia del dominio de unión al epítopo mientras se sujeta directamente al andamio de proteína (iv) Si la potencia es inferior cuando se sujeta a un andamio de proteína que la potencia original, entonces se debe añadir un enlazador de péptido que comprende por lo menos 10 aminoácidos entre el dominio de unión al epítopo y el andamio de proteína.
En otra realización descrita en este documento, el método para mejorar la potencia de un dAb humano en el contexto de una proteína de fusión comprende las siguientes etapas:
(i) Determinar la potencia original del dAb humano desnudo
(ii) Condensar genéticamente el dAb humano a un anticuerpo,
(iii) Determinar la potencia del dominio de unión al epítopo mientras se sujeta directamente al andamio de proteína (iv) Si la potencia es inferior cuando se sujeta a un andamio de proteína que la potencia original, entonces se debe añadir un enlazador de péptido que comprende por lo menos 10 aminoácidos entre el dominio de unión al epítopo y el andamio de proteína.
La potencia del dominio de unión al epítopo se puede medir con ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo evaluando la afinidad de unión, es decir, la capacidad del dominio de unión al epítopo de unirse al antígeno, que puede evaluarse por ensayos BIAcore™ tales como aquellos descritos en el Ejemplo 7. De manera alternativa, la potencia del dominio de unión al epítopo se puede medir con un ensayo de neutralización adecuado que se basa en células, por ejemplo un ensayo de TF1 que se puede llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4.3 o 4.4. La neutralización de IL-4, IL-13 o ambas citocinas en este ensayo se mide evaluando la inhibición de la proliferación de las células TF1 en presencia de proteína de unión al antígeno neutralizante.
En una realización, el método descrito en este documento es capaz de reparar la potencia del dominio de unión al epítopo para que la potencia, cuando se sujeta a un andamio de proteína esté dentro del 50% de la potencia original según lo medido por BIAcore o por un ensayo de neutralización basado en células adecuado. En otra realización, la potencia reparada está dentro de 40% de la potencia original, o dentro de 30% de la potencia original o dentro de 20% de la potencia original, o dentro de 20% de la potencia original, o dentro de 15% de la potencia original, o dentro de 10% de la potencia original. En otra realización, la afinidad de unión, cuando se sujeta a un andamio de proteína, es sustancialmente la misma que aquella de la afinidad de unión original.
La invención da a conocer también proteínas de unión al antígeno para uso en medicina, por ejemplo para uso en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer o enfermedades inflamatorias tales como asma, artritis reumatoidea o artrosis.
Se describe también en este documento un método para tratar a un paciente que sufre de cáncer o enfermedades inflamatorias tales como asma, artritis reumatoidea o artrosis, que comprende administrar una cantidad terapéutica de una proteína de unión al antígeno de la invención.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención se pueden usar para el tratamiento del cáncer o de enfermedades inflamatorias tales como asma, artritis reumatoidea o artrosis.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención pueden tener una función efectora. Por ejemplo, si el andamio de proteína contiene una región Fc derivada de un anticuerpo con función efectora, por ejemplo si el andamio de proteína comprende CH2 y CH3 proveniente de IgG1. Los niveles de la función efectora pueden variar de acuerdo con técnicas conocidas, por ejemplo por mutaciones en el dominio CH2, por ejemplo en donde el dominio IgG1 CH2 tiene una o más mutaciones en posiciones seleccionadas entre 239 y 332 y 330, por ejemplo las mutaciones seleccionan entre S239D y I332E y A330L de forma tal que el anticuerpo posee una función efectora potenciada y/o por ejemplo alterando el perfil de glucosilación de la proteína de unión al antígeno de la invención de modo tal que haya una reducción en la fucosilación de la región Fc.
Los andamios de proteínas de uso en la presente invención incluyen andamios de anticuerpos totalmente monoclonales que comprenden todos los dominios de un anticuerpo, o los andamios de proteínas de la presente invención pueden comprender una estructura de anticuerpo no convencional, tal como un anticuerpo monovalente. Dichos anticuerpos monovalentes pueden comprender una cadena ligera y pesada apareada en donde la región bisagra de la cadena pesada se modifica como para que la cadena pesada no se homodimerice, tal como el anticuerpo monovalente en WO2007059782. Otros anticuerpos monovalentes pueden comprender una cadena ligera y pesada apareadas que se dimerizan con una segunda cadena pesada que carece de una región variable funcional y una región CH1, en donde la primera y la segunda cadenas se modifican para formar heterodímeros en lugar de homodímeros, lo que resulta en un anticuerpo monovalente con dos cadenas pesadas y una cadena ligera tal como el anticuerpo monovalente descrito en el documento WO2006015371. Dichos anticuerpos monovalentes pueden proporcionar el andamio de proteína de la presente invención al que se pueden enlazar los dominios de unión al epítopo.
Los dominios de unión al epítopo de uso en la presente invención son dominios que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región V o dominio diferente, esto puede ser un dominio de anticuerpo o puede ser un domino derivado de un andamio seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4 (Evicuerpo); lipocalina; moléculas derivadas de proteínas A tales como el dominio Z de Proteína A (Aficuerpo, SpA), dominio A (Avímero/Maxicuerpo); proteínas de choque término tales como GroEI y GroES; transferrina (trans­ cuerpo); proteína de repetición de anquirina (DARPin); aptámero de péptido; dominio lectina de tipo C (Tetranectina); Y-cristalina humana y ubiquitina humana (affilinas); dominios PDZ; dominios de tipo toxinkunitz de escorpión de inhibidores de proteasa humana; y fibronectina (adnectina); que se ha sometido a modificación genética con el fin de obtener la unión a un ligando distinto del ligando natural. En una realización este puede ser un anticuerpo de dominio u otros dominios adecuados tales como un dominio seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4, lipocalina, SpA, un Aficuerpo, un avímero, GroEI, transferrina, GroES y fibronectina. En una realización, este puede seleccionarse entre un domino variable sencillo de inmunoglobulina, un Aficuerpo, una proteína de repetición de anquirina (DARPin) y una adnectina. En otra realización este puede seleccionarse entre un Aficuerpo, una proteína de repetición de anquirina (DARPin) y una adnectina. En otra realización puede ser un anticuerpo de dominio, por ejemplo un anticuerpo de dominio seleccionado entre un anticuerpo de dominio humano, de camélido o tiburón (NARV).
Los dominios de unión al epítopo se pueden enlazar al andamio de proteína en una o más posiciones. Estas posiciones incluyen el término C y el término N del andamio de proteína, por ejemplo en el término C de la cadena pesada y/o el término C de la cadena ligera de una IgG, o por ejemplo el término N de la cadena pesada y/o el término N de la cadena ligera de una IgG.
En una realización, un primer dominio de unión al epítopo se enlaza al andamio de proteína y un segundo dominio de unión al epítopo se enlaza al primer dominio de unión al epítopo, por ejemplo en donde el andamio de proteína es un andamio de IgG, un primer dominio de unión al epítopo se puede enlazar al término c de la cadena pesada del andamio de IgG, y el dominio de unión al epítopo se puede enlazar en su término c a un segundo dominio de unión al epítopo, o por ejemplo un primer dominio de unión al epítopo se puede enlazar al término c de la cadena ligera del andamio de IgG, y un primer dominio de unión al epítopo puede además enlazarse en su término c a un segundo dominio de unión al epítopo, o por ejemplo un primer dominio de unión al epítopo puede enlazarse al término n de la cadena ligera del andamio de IgG, y ese primer dominio de unión al epítopo puede además enlazarse en su término n a un segundo domino de unión al epítopo, o por ejemplo un primer dominio de unión al epítopo puede enlazarse al término n de la cadena pesada del andamio de IgG, y ese primer dominio de unión al epítopo puede además enlazarse en su término n a un segundo dominio de unión al epítopo.
Cuando el dominio de unión al epítopo es un anticuerpo de dominio, algunos anticuerpos de dominio pueden adaptarse a posiciones particulares dentro del andamio.
Los anticuerpos de domino de uso en la presente invención pueden enlazarse en el extremo C-terminal de la cadena pesada y/o de la cadena ligera de IgG convencionales. Además, algunos dominios variable sencillos de inmunoglobulina pueden enlazarse a los extremos C-terminales tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de anticuerpos convencionales.
En las proteínas de unión al antígeno en las que el término N de los dominios variables sencillos de inmunoglobulina se condensa a un dominio constante del anticuerpo (o bien Ch3 o CL), un enlazador peptídico puede ayudar al dominio variable sencillo de inmunoglobulina a unirse al antígeno. De hecho, el extremo N-terminal de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina se localiza próximo a las regiones determinantes de complementaridad (CDR) implicadas en la actividad de unión al antígeno. Por lo tanto, un enlazador de péptidos corto actúa como espaciador entre la unión al epítopo y el dominio constante del andamio de proteína, lo que puede permitir que las CDR del dominio variable sencillo de inmunoglobulina lleguen más fácilmente al antígeno, que puede por consiguiente unirse con gran afinidad.
Los entornos en los que los dominios variables sencillos de inmunoglobulina se unen a IgG suelen diferir dependiendo de a qué cadena de anticuerpos están condensados: cuando están condensados en el extremo C-terminal de la cadena ligera del anticuerpo de un andamio de IgG, se espera que cada dominio variable sencillo de inmunoglobulina esté localizado próximo a la bisagra del anticuerpo y a la porción Fc. Es probable que dichos dominios variables sencillos de inmunoglobulina estén localizados alejados unos de otros. En anticuerpos convencionales, el ángulo entre los fragmentos Fab y el ángulo entre cada fragmento Fab y la porción Fc pueden variar de manera significativa. Es probable que - con mAbdAb - el ángulo entre los fragmentos Fab no difiera en gran medida, mientras que se pueden observar algunas restricciones angulares con el ángulo entre cada fragmento Fab y la porción Fc.
Cuando se condensa al extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de un andamio de IgG, se espera que cada dominio variable sencillo de inmunoglobulina esté localizado próximo a los dominios Ch3 de la porción Fc. No se espera que esto impacte sobre las propiedades de unión de Fc a los receptores de Fc (p. ej., FcyRI, II, III FcRn) ya que estos receptores se involucran con los dominios Ch2 (para las clases de receptores FcyRI, II y III) o con la bisagra entre los dominios Ch2 y Ch3 (p. ej., receptor de FcRn). Otra característica de dichas proteínas de unión al antígeno es que se espera que ambos dominios variables sencillos de inmunoglobulina estén espacialmente cercanos uno al otro, y siempre que se proporcione flexibilidad mediante la provisión de enlazadores apropiados, estos dominios variables sencillos de inmunoglobulina pueden incluir formar especies homodiméricas y en consecuencia propagar la estructura cuaternaria 'cremallera' de la porción Fc, que puede potenciar la estabilidad de la proteína de unión al antígeno.
Dichas consideraciones estructurales pueden auxiliar en la elección de la posición más adecuada para enlazar un dominio de unión al epítopo, por ejemplo un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, a un andamio de proteína, por ejemplo un anticuerpo.
El tamaño del antígeno, su localización (en la sangre o en la superficie de la célula), su estructura cuaternaria (monomérica o multimérica) pueden variar. Los anticuerpos convencionales están diseñados naturalmente para funcionar como constructos adaptadores debido a la presencia de la región bisagra, en donde la orientación de los dos sitios de unión al antígeno en la punta de los fragmentos Fab puede variar ampliamente y por lo tanto adaptarse al rasgo molecular del antígeno y sus alrededores. En contraste, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina enlazados a un anticuerpo u otro andamio de proteína, por ejemplo un andamio de proteína que comprende un anticuerpo sin región bisagra, pueden tener menos flexibilidad estructural o bien directa o indirectamente.
Entender el estado de disolución y el modo de unión en el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es también útil. Los datos acumulados indican que dAb in vitro pueden existir predominantemente en formas monoméricas, homodiméricas o multiméricas en disolución (Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365). Esto es bastante reminiscente a eventos de multidimerización observados in vivo con dominios Ig tales como proteínas Bence-Jones (que son dímeros de cadenas ligeras de inmunoglobulina) (Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301) y fibras amiloides (James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8).
Por ejemplo, puede ser conveniente enlazar dAb que tienden a dimerizarse en disolución al extremo C-terminal de la porción Fc en preferencia al extremo C-terminal de la cadena ligera, ya que enlazar el extremo C-terminal de la porción Fc permitirá que esos dAb se dimericen en el contexto de la proteína de unión al antígeno de la invención.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden comprender sitios de unión a antígenos específicos de un solo antígeno, o pueden tener sitios de unión al antígeno específicos de dos o más antígenos, o de dos o más epítopos en un solo antígeno, o puede haber sitios de unión al antígeno que sean cada uno específico de un epítopo distinto en el mismo antígeno o en antígenos diferentes.
Los sitios de unión al antígeno pueden tener cada uno especificidad de unión hacia un antígeno, tal como proteínas humanas o animales, incluidas citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocinas, receptores de factores de crecimiento, enzimas (p. ej., proteasas), co-factores para enzimas, proteínas de unión al ADN, lípidos y carbohidratos. Las dianas adecuadas, incluidas citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocinas, receptores de factores de crecimiento y otras proteínas incluyen, aunque sin limitarse a ello: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrophin-1, CEA, CD40, ligando de Cd40, CD56, Cd38, CD138, EGF, receptor de eGf , ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPa, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblastos-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-p1, albúmina de suero humano, insulina, IFN-y, IGF-I, IGF-II, IL-1a, IL-1p, receptor IL-1, receptor IL-1 de tipo 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina p, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos-2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora de mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1p, MIP-3a, MIP-3p, MIP-4, factor inhibidor de progenitores mieloides -1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, p-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, SDF1p, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-a, TGF-p, TGF-p2, TGF-p3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-p, receptor de TNF I, receptor de TNF II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, receptor de VEGF 1, receptor de VEGF 2, receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-p, GRO-y, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albúmina del suero, vWF, proteínas amiloides (p. ej., amiloide alfa), MMP12, PDK1, IgE y otras dianas descritas en este documento. Se ha de apreciar que esta lista no es en absoluto exhaustiva.
En algunas realizaciones, un péptido o polipéptido resistente a proteasa se une a una diana en tejido pulmonar, tal como una diana seleccionada del grupo que consiste en TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimasa, FGF, Furina, Endotelina-1, Eotaxinas (p. ej., Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrófilo elastasa, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a4p7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta8, cMET, CD8, vWf , proteínas amiloides (p. ej., amiloide alfa), MMP12, PDK1, e IgE. En particular, las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con IL-13, IL-5 e IL-4, por ejemplo dermatitis atópica, rinitis alérgica, enfermedad de Crohn, EPOC, enfermedades o trastornos fibróticos tales como fibrosis pulmonar idiopática, esclerosis sistémica progresiva, fibrosis hepática, granulomas hepáticos, esquistosomiasis, leishmaniasis, enfermedades de regulación del ciclo celular tales como enfermedad de Hodgkins, leucemia linfocítica crónica de células B, por ejemplo las proteínas pueden ser útiles para tratar el asma.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con factores de crecimiento tales como IGF-1R, VEGF y EGFR, por ejemplo cáncer o artritis reumatoidea: los ejemplos de tipos de cáncer en los que dichas terapias pueden ser útiles son cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y mieloma.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con TNF, por ejemplo artritis, por ejemplo artritis reumatoidea o artrosis.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con IL1-R, por ejemplo artritis, por ejemplo artritis reumatoidea o artrosis.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con CD-20, por ejemplo enfermedades autoinmunes tales como psoriasis, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea, artritis reumatoidea juvenil, lupus eritematoso sistémico, enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo esclerosis múltiple, enfermedades promovidas por neutrófilos, por ejemplo EPOC, vasculitis Wegeners, fibrosis quística, síndrome de Sjogrens, rechazos de trasplantes crónicos, diabetes de tipo 1, enfermedad injerto contra hospedante, asma, enfermedades alérgicas, dermatitis atópica, dermatitis eccematosa, rinitis alérgica, enfermedades autoinmunes como tiroiditis, espondiloartropatía, espondilitis anquilosante, uveítis, policondritis o esclerodermia, o cáncer, p. ej., linfomas de células B o neoplasia de células B maduras tal como CLL o SLL.
Las proteínas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser útiles para tratar enfermedades asociadas con IL-17 e IL-23, por ejemplo psoriasis, enfermedad inflamatoria de los intestinos, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis reumatoidea, artritis reumatoidea juvenil, lupus eritematoso sistémico, enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo esclerosis múltiple, enfermedades promovidas por neutrófilos, por ejemplo EPOC, vasculitis de Wegeners, fibrosis quística, síndrome de Sjogrens, rechazo de trasplante crónico, diabetes de tipo 1, enfermedad injerto contra hospedante, asma, enfermedades alérgicas, dermatitis atópica, dermatitis eccematosa, rinitis alérgica, enfermedades autoinmunes que incluyen tiroiditis, espondiloartropatía, espondilitis anquilosante, uveítis, policondritis o esclerodermia.
La proteína de unión al antígeno de la presente invención se puede producir por transfección de una célula hospedante con un vector de expresión que comprende la secuencia codificante para la proteína de unión al antígeno de la invención. Un vector de expresión o plásmido recombinante se produce disponiendo estas secuencias codificantes para la proteína de unión al antígeno en asociación operativa con secuencias de control reguladoras capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o la segregación de, una célula hospedante. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, p. ej., promotor CMV, y secuencias de señalización que pueden derivar de otros anticuerpos conocidos. De modo similar, se puede producir un segundo vector de expresión que tiene una secuencia de a Dn que codifica una cadena ligera o pesada de la proteína de unión al antígeno complementaria. En determinadas realizaciones, este segundo vector de expresión es idéntico al primero, excepto en lo que respecta a las secuencias codificantes y los marcadores seleccionables, como para asegurar lo más posible que cada cadena de polipéptidos se exprese funcionalmente. De manera alternativa, las secuencias codificantes de la cadena pesada y ligera para la proteína de unión al antígeno pueden residir en un solo vector, por ejemplo en dos cassettes de expresión en el mismo vector.
Una célula hospedante seleccionada se co-transfecta por técnicas convencionales con el primero y el segundo vectores (o simplemente se transfecta con un solo vector) para crear la célula hospedante transfectada de la invención que comprende las cadenas tanto ligera como pesada sintéticas recombinantes. La célula transfectada se cultiva luego por técnicas convencionales para producir la proteína de unión al antígeno genéticamente modificada de la invención. La proteína de unión al antígeno que incluye la asociación tanto de la cadena pesada y/o de la cadena ligera recombinante se estudia a partir de un cultivo con un ensayo apropiado, como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas similares para construir otras proteínas de unión al antígeno.
El experto en la técnica puede seleccionar dichos vectores adecuados para etapas de clonación y subclonación empleados en los métodos y la construcción de las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede emplear la serie de pUC convencional de vectores de clonación. Un vector, pUC19, es comercializado por empresas de suministro como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Además, cualquier vector que sea capaz de replicarse fácilmente, tenga una abundancia de sitios de clonación y genes seleccionables (p. ej., resistencia a los antibióticos) y se manipule fácilmente, se puede usar para clonación. Por consiguiente, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en la presente invención.
Los vectores de expresión pueden además caracterizarse por genes adecuados para ampliar la expresión de secuencias de ADN heterólogas, p. ej. el gen de dihidrofolato reductasa mamífera (DHFR). Otras secuencias de vectores incluyen una secuencia de señalización poli A, tal como la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia promotora de betaglobia (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en este documento se pueden sintetizar por técnicas conocidas por el experto.
Los componentes de dichos vectores, p. ej., replicones, genes de selección, potenciadores, promotores, secuencias de señalización y similares, se pueden obtener de fuentes comerciales o naturales, o sintetizarse con procedimientos conocidos para uso en dirigir la expresión y/o segregación del producto del ADN recombinante en un hospedante seleccionado. Otros vectores de expresión apropiados de los cuales se conocen numerosos tipos en la técnica para expresión de mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos también se pueden seleccionar para este propósito.
La presente invención también abarca una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificantes de las proteínas de unión al antígeno de la presente invención. Las células hospedantes útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación también son convencionales. No obstante, las células de diversas cepas de E. coli se pueden usar para replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la construcción de proteínas de unión al antígeno de la presente invención.
Las células o líneas celulares hospedantes adecuadas para la expresión de las proteínas de unión al antígeno de la invención incluyen células mamíferas tales como NS0, Sp2/0, CHO (p. ej., DG44), COS, HEK, una célula de fibroblasto (p. ej, 3T3) y células de mieloma, por ejemplo se puede expresar en una CHO o una célula de mieloma. Se pueden usar células humanas, permitiendo así que la molécula se modifique con patrones de glucosilación humanos. Alternativamente, se pueden emplear otras líneas de células eucariotas. La selección de células hospedantes mamíferas adecuadas y de métodos para transformación, cultivo, ampliación, cribado y producción y purificación de producto se conocen en la técnica. Ver, p. ej., Sambrook et al., citado anteriormente.
Las células bacterianas pueden resultar útiles como células hospedantes adecuadas para la expresión de los Fab recombinantes u otras realizaciones de la presente invención (ver, p. ej., Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). No obstante, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en células bacterianas de estar en forma no plegada o incorrectamente plegada o en una forma no glucosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana debería cribarse para retención de la capacidad de unión al antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produjo en una forma correctamente plegada, esa célula bacteriana sería un hospedante deseable, o en realizaciones alternativas, la molécula puede expresarse en el hospedante bacteriano y luego re­ plegarse subsiguientemente. Por ejemplo, varias cepas de E. coli utilizadas para expresión se conocen como células hospedantes en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares pueden también emplearse en este método.
Si se desea, las cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células hospedantes, así también como células de insecto, p. ej., Drosophila y Lepidoptera, y sistemas de expresión vírica. Ver, p. ej., Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y referencias allí citadas. Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección requeridos para producir las células hospedantes de la invención y los métodos de cultivo necesarios para producir la proteína de unión al antígeno de la invención a partir de dicha célula hospedante pueden ser todos técnicas convencionales. Típicamente, el método de cultivo de la presente invención es un método de cultivo libre de suero, usualmente con cultivo de células libre de suero en suspensión. Asimismo, una vez producidas, las proteínas de unión al antígeno de la invención se pueden purificar a partir de los contenidos del cultivo celular de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, como precipitación con sulfato de amonio, columna de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Dichas técnicas están dentro del campo y no limitan la presente invención. Por ejemplo, la preparación de anticuerpos alterados se describe en los documentos WO 99/58679 yWO 96/16990.
Incluso otro método de expresión de las proteínas de unión al antígeno puede utilizar expresión en un animal transgénico, como se describe en la patente de EE. UU. núm. 4.873.316. Esto se refiere a un sistema de expresión que usa el promotor de caseína de un animal que cuando se incorpora en forma transgénica a un mamífero permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche.
En otro aspecto de la invención, se da a conocer un método para producir un anticuerpo de la invención, en donde el método comprende la etapa de cultivar una célula hospedante transformada o transfectada con un vector que codifica la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo de la invención y recuperar el anticuerpo así producido.
De acuerdo con la presente invención, se da a conocer un método para producir una proteína de unión al antígeno de la presente invención, en donde el método comprende las etapas de;
(a) proporcionar un primer vector que codifica una cadena pesada de la proteína de unión al antígeno;
(b) proporcionar un segundo vector que codifica una cadena ligera de la proteína de unión al antígeno;
(c) transformar una célula hospedante mamífera (p. ej., CHO) con dichos primero y segundo vectores;
(d) cultivar la célula hospedante de la etapa (c) bajo condiciones favorables para la segregación de la proteína de unión al antígeno de dicha célula hospedante en dicho medio de cultivo;
(e) recuperar la proteína de unión al antígeno segregada de la etapa (d).
Una vez expresada por el método deseado, la proteína de unión al antígeno se examina la actividad in vitro mediante el uso de un ensayo apropiado. Actualmente se emplean formatos de ensayo ELISA convencionales para evaluar la unión cualitativa y cuantitativa de la proteína de unión al antígeno a su diana. A su vez, se pueden utilizar también otros ensayos in vitro para verificar la eficacia de neutralización antes de estudios clínicos humanos subsiguientes que se realizan para evaluar la persistencia de la proteína de unión al antígeno en el cuerpo a pesar de los mecanismos usuales de aclaramiento.
La dosis y duración del tratamiento se refieren a la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana, y el experto en la técnica las puede ajustar dependiendo de la afección que se esté tratando y de la salud general del paciente. Se contempla que la dosificación repetida (p. ej., una vez por semana o una vez cada dos semanas) durante un período de tiempo extenso (p. ej., cuatro a seis meses) puede requerirse para lograr la eficacia terapéutica máxima.
El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que administre el agente al hospedante. La proteína de unión al antígeno y las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir subcutánea, (s.c.), intratecal, intraperitoneal, intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o intranasal.
Los agentes terapéuticos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de la proteína de unión al antígeno de la invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, una suspensión o disolución acuosa que contiene la proteína de unión al antígeno se puede tamponar a pH fisiológico, en una forma lista para inyección. Las composiciones para administración parenteral comúnmente comprenderán una disolución de la proteína de unión al antígeno de la invención o un cóctel de esta disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo un vehículo acuoso. Se puede emplear una diversidad de vehículos acuosos, p. ej., disolución salina al 0,9%, glicina al 0,3% y similares. Estas disoluciones se pueden hacer estériles y en general libres de materia particulada. Estas disoluciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización conocidas convencionales (p. ej., filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como ajuste de pH y agentes tampón, etc. La concentración de la proteína de unión al antígeno de la invención en dicha formulación puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0,5%, habitualmente a o por lo menos aproximadamente 1% hasta tanto como 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente en función de volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.
Por lo tanto, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular que contenga 1 ml de agua tamponada estéril y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, p. ej., aproximadamente 50 ng y aproximadamente 30 mg, o aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg, de una proteína de unión al antígeno de la invención. De modo similar, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa que contenga aproximadamente 250 ml de disolución de Ringer estéril, y aproximadamente 1 a aproximadamente 30 o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de una proteína de unión al antígeno de la invención por ml de disolución de Ringer. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral se conocen o serán obvios para los expertos en la técnica, y se describen en más detalles en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. Para la preparación de formulación de proteínas de unión al antígeno administrares por vía intravenosa de la invención, ver Lasmar U y Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, página 129-137, Vol.3 (3 de abril de 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., Nueva York, NY: Plenum Press (1992),Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its proteinstructure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitolsucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922.Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002) cuyo contenido total se incorpora a la presente memoria por referencia y al que el lector se dirige específicamente.
En una realización, el agente terapéutico de la invención, cuando está en una preparación farmacéutica, está presente en formas de dosis unitaria. El experto en la técnica podrá determinar fácilmente la dosis terapéuticamente eficaz apropiada. Se pueden calcular las dosis adecuadas para los pacientes según su peso, por ejemplo las dosis adecuadas podrán oscilar entre 0,01 y 20 mg/kg, por ejemplo entre 0,1 y 20 mg/kg, por ejemplo entre 1 y 20 mg/kg, por ejemplo entre 10 y 20 mg/kg o por ejemplo entre 1 y 15 mg/kg, por ejemplo entre 10 y 15 mg/kg. Para tratar efectivamente las condiciones de uso en la presente invención en un ser humano, las dosis adecuadas podrán oscilar entre 0,01 y 1000 mg, por ejemplo entre 0,1 y 1000 mg, por ejemplo entre 0,1 y 500 mg, por ejemplo 500 mg, por ejemplo entre 0,1 y 100 mg, o entre 0,1 y 80 mg, o entre 0,1 y 60 mg, o entre 0,1 y 40 mg, o por ejemplo entre 1 y 100 mg, o entre 1 y 50 mg, de una proteína de unión al antígeno de la presente invención, que se puede administrar por vía parenteral, por ejemplo subcutánea, intravenosa o intramuscular. Dicha dosis puede, si es necesario, repetirse en intervalos de tiempo apropiados seleccionados según sea apropiado por un médico.
La proteína de unión al antígeno descrita en este documento se puede liofilizar para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes del uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con inmunoglobulinas convencionales, y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en el campo.
Hay varios métodos conocidos en la técnica que se pueden usar para encontrar dominios de unión al epítopo de uso en la presente invención.
El término "biblioteca" se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta por miembros, cada uno de los cuales posee una secuencia de ácido nucleico o polipéptido individual. En este punto, "biblioteca" es sinónimo de "repertorio". Las diferencias de secuencias entre los miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La biblioteca puede adoptar la forma de una mezcla simple de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede adoptar la forma de organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformados con una biblioteca de ácidos nucleicos. En un ejemplo, cada organismo o célula individual contiene solamente uno o un número limitado de miembros de la biblioteca. Ventajosamente, los ácidos nucleicos se incorporan en los vectores de expresión, con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto, por consiguiente, una biblioteca puede adoptar la forma de una población de organismos hospedantes, en donde cada organismo contiene una o más copias de un vector de expresión que contiene un solo miembro de la biblioteca en la forma de ácido nucleico que se puede expresar para producir su correspondiente miembro de polipéptido. Por lo tanto, la población de organismos hospedantes tiene el potencial de codificar un gran repertorio de diversos polipéptidos.
Un "marco universal" es una secuencia marco de anticuerpo sencillo correspondiente a las regiones de un anticuerpo conservadas en secuencia según lo definido por Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos) o correspondiente al repertorio de inmunoglobulina de la línea germinal humana o a la estructura definida por Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol.
196:910-917. Puede haber un solo marco o un conjunto de dichos marcos, que se descubrió permiten la derivación de prácticamente cualquier especificidad de unión, a través de la variación en las regiones hipervariables solas.
Las alineaciones y homología, similitud o identidad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, tal como se definen en este documento, se preparan en una realización y se determinan usando el algoritmo BLAST 2 Sequences, usando parámetros por defecto (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)).
El dominio(s) de unión al epítopo y los sitios de unión al antígeno pueden cada un tener especificidad de unión hacia un ligando genérico o cualquier ligando diana deseado, tal como proteínas humanas o animales, incluidas citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocinas, receptores de factores de crecimiento, enzimas (p. ej., proteasas), co-factores para enzimas, proteínas de unión al ADN, lípidos y carbohidratos. Las dianas adecuadas, incluidas citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocinas, receptores de factores de crecimiento y otras proteínas incluyen, aunque sin limitarse a ello: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofin-1, CEA, CD40, ligando CD40, CD56, CD38, CD138, EGF, receptor EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPa, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblastos-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-p1, albúmina de suero humano, insulina, IFN-y, IGF-I, IGF-II, IL-1a, IL-1p, receptor de IL-1, receptor de IL-1 tipo 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina p, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos-2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora de mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, c-fms, v-fmsMDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1p, MIP-3a, MIP-3p, MlP-4, factor inhibidor de progenitores mieloides-1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, p-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, pDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, SDFip, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-a, TGF-p, TGF-P2, TGF-P3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-p, receptor de TNF I, receptor de TNF II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, receptor de VEGF 1, receptor de VEGF 2, receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-p, GRO-y, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albúmina del suero, vWF, proteínas amiloides (p. ej., amiloide alfa), MMP12, PDK1, IgE y otras dianas descritas en este documento. Se ha de apreciar que esta lista no es en absoluto exhaustiva.
En algunas realizaciones, la unión es a una diana en tejido pulmonar, tal como una diana seleccionada del grupo que consiste en TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimasa, FGF, Furina, Endotelina-1, Eotaxinas (p. ej., Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrófilo elastasa, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a4p7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas amiloides (p. ej., amiloide alfa), MMP12, PDK1 y IgE.
Cuando se usa un sistema de presentación (p. ej., un sistema de presentación que enlace la función codificante de un ácido nucleico y características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico) en los métodos descritos en este documento, p. ej., en la selección de un dAb u otro dominio de unión al epítopo, será frecuentemente ventajoso ampliar o aumentar el número de copias de los ácidos nucleicos que codifican los péptidos o polipéptidos seleccionados. Esto proporciona una vía eficiente para obtener cantidades suficientes de ácidos nucleicos y/o péptidos o polipéptidos para tandas funcionales de selección, usando los métodos que se describen en este documento u otros métodos adecuados, o para preparar repertorios adicionales (p. ej., repertorios de maduración por afinidad). Por lo tanto, en algunas realizaciones, los métodos para seleccionar dominios de unión al epítopo comprenden el uso de un sistema de presentación (p. ej., que enlaza la función codificante de un ácido nucleico y las características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico, tal como presentación sobre fagos) y además comprenden ampliar o aumentar el número de copias de un ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido seleccionado. Los ácidos nucleicos se pueden ampliar utilizando cualquier método adecuado, como ampliación de fagos, crecimiento celular o reacción en cadena de la polimerasa.
En un ejemplo, los métodos emplean un sistema de presentación que enlaza la función codificante de un ácido nucleico y características físicas, químicas y/o funcionales del polipéptido codificado por el ácido nucleico. Dicho sistema de presentación puede comprender una pluralidad de paquetes genéticos replicables, como bacteriófago o células (bacterias). El sistema de presentación puede comprender una biblioteca, tal como una biblioteca de presentación sobre bacteriófagos. La presentación sobre de bacteriófagos es un ejemplo de un sistema de presentación.
Se ha descrito un número de sistemas de presentación sobre bacteriófagos adecuado (p. ej., sistemas de presentación monovalente y presentación multivalente). (Ver, p. ej., Griffiths et al., patente de EE. UU. núm.
6.555.313 B1 (incorporada a la presente memoria por referencia); Johnson et al., patente de EE. UU. núm.
5.733.743 (incorporada a la presente memoria por referencia); McCafferty et al., patente de EE. UU. núm.
5.969.108 (incorporada a la presente memoria por referencia); Mulligan-Kehoe, patente de EE. UU. núm.
5.702.892 (Incorporada a la presente memoria por referencia); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001).) Los péptidos o polipéptidos exhibidos en un sistema de presentación de bacteriófagos se pueden exhibir en cualquier bacteriófago adecuado, tal como un fago filamentoso (p. ej., fd, M13, F1), un fago lítico (p. ej., T4, T7, lambda), o un fago de ARN (p. ej., MS2), por ejemplo.
En general, se produce o provee una biblioteca de fagos que exhibe un repertorio de péptidos o fagopolipéptidos, como proteínas de fusión con una proteína de recubrimiento de fagos adecuada (p. ej., proteína fd pIII). La proteína de fusión puede exhibir los péptidos o polipéptidos en el extremo de la proteína de recubrimiento de fago, o si se desea en una posición interna. Por ejemplo, el péptido o polipéptido puede estar presente en una posición que es amino-terminal al dominio 1 de pIII. (el dominio 1 de pIII también se denomina N1.) El polipéptido exhibido puede condensarse directamente a pIII (p. ej., término N del dominio 1 de pIII) o condensarse a pIII usando un enlazador. Si se desea, la fusión puede además comprender una etiqueta (p. ej., epítopo myc, etiqueta His). Las bibliotecas que comprenden un repertorio de péptidos o polipéptidos que se exhiben como proteínas de fusión con una proteína de recubrimiento de fago se pueden producir usando cualquier método adecuado, como introduciendo una biblioteca de vectores de fago o vectores de fagémido que codifica los péptidos o polipéptidos en una bacteria hospedante adecuada, y cultivando las bacterias resultantes para producir fago (p. ej., usando un fago cooperador o complementando el plásmido, si se desea). La biblioteca de fago se puede recuperar del cultivo utilizando cualquier método adecuado, como precipitación y centrifugación.
El sistema de presentación puede comprender un repertorio de péptidos o polipéptidos que contenga cualquier cantidad deseada de diversidad. Por ejemplo, el repertorio puede contener péptidos o polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden a los polipéptidos naturales expresados por un organismo, grupo de organismos, tejido deseado o tipo de célula deseado, o puede contener péptidos o polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos aleatorias o aleatorizadas. Si se desea, los polipéptidos pueden compartir un núcleo o andamio común. Por ejemplo, todos los polipéptidos en el repertorio o la biblioteca se pueden basar en un andamio seleccionado de proteína A, proteína L, proteína G, un dominio de fibronectina, una anticalina, CTLA4, una enzima deseada (p. ej., una polimerasa, una celulasa), o un polipéptido de la superfamilia de inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., un dominio variable de anticuerpo). Los polipéptidos en dicho repertorio o biblioteca pueden comprender regiones definidas de secuencias de aminoácidos aleatorias o aleatorizadas y regiones de secuencias de aminoácidos comunes. En determinadas realizaciones todos o prácticamente todos los polipéptidos de un repertorio son de un tipo deseado, tal como una enzima deseada (p. ej., una polimerasa) o un fragmento de unión al antígeno deseado de un anticuerpo (p. ej., Vh humano o Vl humano). En algunas realizaciones, el sistema de presentación de polipéptidos comprende un repertorio de polipéptidos en donde cada polipéptido comprende un dominio variable de anticuerpo. Por ejemplo, cada polipéptido en el repertorio puede contener un Vh, un Vl o un Fv (p. ej., un Fv de cadena sencilla).
La diversidad de secuencias de aminoácidos se puede introducir en cualquier región deseada de un péptido o polipéptido, o de un andamio, usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, la diversidad de las secuencias de aminoácidos se puede introducir en una región diana, tal como una región determinante de complementaridad de un dominio variable de anticuerpo o dominio hidrófobo, preparando una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos diversificados usando cualquier método de mutagénesis adecuado (p. ej., PCR de baja fidelidad, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por oligonucleótidos, diversificación usando codones NNK) o cualquier otro método adecuado. Si se desea, una región de un polipéptido que se ha de diversificar se puede aleatorizar. El tamaño de los polipéptidos que componen el repertorio es en gran medida una cuestión de elección y no se requiere un tamaño de polipéptidos uniforme. Los polipéptidos del repertorio pueden tener por lo menos estructura terciaria (forman por lo menos un dominio).
Selección/Aislamiento/Recuperación
Un dominio de unión al epítopo o una población de dominio se puede seleccionar, aislar y/o recuperar de un repertorio o biblioteca (p. ej., en un sistema de presentación) usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, un dominio se selecciona o aísla en base a una característica seleccionable (p. ej., característica física, característica química, característica funcional). Las características funcionales seleccionables adecuadas incluyen actividades biológicas de los péptidos o polipéptidos en el repertorio, por ejemplo, unión a un ligando genérico (p. ej., un superantígeno), unión a un ligando diana (p. ej., un antígeno, un epítopo, un sustrato), unión a un anticuerpo (p. ej., a través de un epítopo expresado en un péptido o polipéptido) y actividad catalítica. (Ver, p. ej., Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655.)
En algunas realizaciones, el péptido o polipéptido resistente a proteasa se selecciona y/o aísla de una biblioteca o repertorio de péptidos o polipéptidos en donde prácticamente todos los dominios comparten una característica seleccionable común. Por ejemplo, el dominio se puede seleccionar de una biblioteca o repertorio en donde prácticamente todos los dominios se unen a un ligando genérico común, se unen a un ligando diana común, se unen (o son unidos por) un anticuerpo común, o poseen una actividad catalítica común. Este tipo de selección es particularmente útil para preparar un repertorio de dominios que se basen en un péptido o polipéptido parental que tenga una actividad biológica deseada, por ejemplo, cuando se efectúa maduración por afinidad de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina. La selección basada en la unión a un ligando genético común puede producir un conjunto de dominios que contiene todos o prácticamente todos los dominios que eran componentes de la biblioteca o el repertorio original. Por ejemplo, los dominios que se unen a un ligando diana o a un ligando genérico, tal como proteína A, proteína L o un anticuerpo, se pueden seleccionar, aislar y/o recuperar por adsorción o usando una matriz de afinidad adecuada. La adsorción se puede efectuar añadiendo una disolución de un ligando (p. ej., ligando genérico, ligando diana) a un recipiente adecuado (p. ej., tubo, placa de petri) y permitiendo que el ligando se deposite o recubra en las paredes del recipiente. El exceso del ligando se puede lavar, y los dominios se pueden añadir al recipiente, y el recipiente se puede mantener bajo condiciones adecuadas para que los péptidos o polipéptidos se unan al ligando inmovilizado. Los dominios no ligados se pueden eliminar y los dominios ligados se pueden recuperar usando cualquier método adecuado, como raspado o reducción del pH, por ejemplo.
Las matrices de afinidad de ligandos adecuadas en general contienen un soporte sólido o perla (p. ej., agarosa) al cual se le sujeta un ligando en forma covalente o no covalente. La matriz de afinidad se puede combinar con péptidos o polipéptidos (p. ej., un repertorio que se ha incubado con proteasa) usando un procedimiento de lotes, un procedimiento de columna o cualquier otro procedimiento adecuado bajo condiciones adecuadas para unión de dominios al ligando en la matriz. Los dominios que no se unen en la matriz de afinidad se pueden eliminar y los dominios unidos se pueden eluir y recuperar usando cualquier método adecuado, tal como elución con un tampón de pH inferior, con un agente desnaturalizante suave (p. ej., urea), o con un péptido o dominio que compite para la unión al ligando. En un ejemplo, un ligando diana biotinilado se combina con un repertorio bajo condiciones adecuadas para que los dominios en el repertorio se unan al ligando diana. Los dominios diana se recuperan usando avidina o estreptavidina inmovilizada (p. ej., en una perla).
En algunas realizaciones, el ligando genérico o diana es un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno. Los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno que se unen a rasgos estructurales de péptidos o polipéptidos que se conservan en los péptidos o polipéptidos de una biblioteca o repertorio son particularmente útiles como ligandos genéricos. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno adecuados para uso como ligandos para aislar, seleccionar y/o recuperar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden preparar usando cualquier método adecuado.
Bibliotecas/repertorios
Las bibliotecas que codifican y/o contienen dominios de unión a proteasa se pueden preparar u obtener empleando cualquier método adecuado. Se puede diseñar una biblioteca que codifique dominios basados en un dominio o andamio de interés (p. ej., un dominio seleccionado de una biblioteca) o se pueden seleccionar de otra biblioteca, utilizando los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, una biblioteca enriquecida en dominios se puede preparar usando un sistema de presentación de polipéptidos adecuado.
Las bibliotecas que codifican un repertorio de un tipo de dominio deseado pueden producirse fácilmente usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un tipo deseado de polipéptido (p. ej., un dominio variable de inmunoglobulina) y se puede preparar una colección de ácidos nucleicos que contiene una o más mutaciones, por ejemplo ampliando el ácido nucleico usando un sistema de reacción de la polimerasa en cadena (PCR) propenso a error (PCR), por mutagénesis química (Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) o usando cepas de mutadores bacterianos (Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996)). En otras realizaciones, se pueden dirigir regiones particulares del ácido nucleico para diversificación. Los métodos para mutar las posiciones seleccionadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de oligonucleótidos mal apareados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado bibliotecas de anticuerpos sintéticos dirigiendo mutaciones a los bucles de unión al antígeno. Las regiones de anticuerpo H3 y L3 aleatorias o semialeatorias se han anexado a los segmentos del gen V de inmunoglobulina de línea germinal para producir bibliotecas con regiones marco no mutadas (Hoogenboom y Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra). Dicha diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos los demás bucles de unión al antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). En otras realizaciones, se pueden dirigir regiones particulares del ácido nucleico para diversificación, por ejemplo, mediante una estrategia de PCR en dos etapas que emplea el producto de la primera reacción PCR como un "mega-cebador." (Ver, p. ej., Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990).) La diversificación dirigida también se puede llevar a cabo, por ejemplo, por SOE PCR. (Ver, p. ej., Horton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989).)
La diversidad de secuencias en posiciones seleccionadas se puede lograr alterando la secuencia codificante que especifica la secuencia del polipéptido tal que un número de posibles aminoácidos (p. ej., los 20 o a un subconjunto de estos) se puede incorporar en esa posición. Usando la nomenclatura IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos además del codón finalizador TAG. El codón NNK se puede usar para introducir la diversidad requerida. Otros codones que lograrán los mismos fines también pueden ser útiles, incluidos el codón NNN, que conduce a la producción de los codones finalizadores adicionales TGA y TAA. Dicho planteamiento dirigido puede permitir el espacio de secuencia total en un área diana a explorar.
Algunas bibliotecas comprenden dominios que son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (p. ej., anticuerpos o sus porciones). Por ejemplo, las bibliotecas pueden comprender dominios que tienen una conformación de cadena principal conocida. (Ver, p. ej., Tomlinson et al., WO 99/20749). Las bibliotecas se pueden preparar en un plásmido o vector adecuado. Tal como se usa en la presente memoria, vector se refiere a un elemento discreto que se usa para introducir ADN heterólogo en las células para su expresión y/o replicación. Se puede utilizar cualquier vector adecuado, incluidos plásmidos (p. ej., plásmidos bacterianos), vectores víricos o bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episomales. Dichos vectores se pueden usar para clonación y mutagénesis simple, o un vector de expresión se puede usar para promover la expresión de la biblioteca. Los vectores y plásmidos usualmente contienen uno o más sitios de clonación (p. ej., un polienlazador), un origen de replicación y por lo menos un gen marcador seleccionable. Los vectores de expresión pueden además contener elementos para promover la transcripción y traducción de un polipéptido, tal como un elemento potenciador, promotor, señal de terminación de transcripción, secuencias de señalización y similares. Estos elementos se pueden disponer en un modo tal de estar operativamente unidos a una inserción clonada que codifica un polipéptido, tal que el polipéptido se exprese y produzca cuando dicho vector de expresión se mantenga bajo condiciones adecuadas para expresión (p. ej., en una célula hospedante adecuada).
Los vectores de clonación y expresión en general contienen secuencias de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células hospedantes seleccionadas. Típicamente en vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico hospedante e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación en forma autónoma. Dichas secuencias se conocen por variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado para levadura, y varios orígenes víricos (p. ej., SV40, adenovirus) son útiles para vectores de clonación en células mamíferas. En general, el origen de replicación no es necesario para vectores de expresión mamífera, a menos que se usen en células mamíferas para replicar altos niveles de ADN, tal como células COS.
Los vectores de clonación o expresión pueden contener un gen de selección también denominado marcador seleccionable. Dichos genes marcadores codifican una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células hospedantes transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedantes no transformadas con el vector que contienen el gen de selección por lo tanto no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias autoxtróficas del complemento o suministro de nutrientes críticos no disponibles en medio de desarrollo.
Los vectores de expresión adecuados pueden contener un número de componentes, por ejemplo, un origen de replicación, un gen marcador seleccionable, uno o más elementos de control de expresión, tal como un elemento de control de transcripción (p. ej., promotor, potenciador, terminador) y/o una o más señales de traducción, una secuencia de señalización o secuencia líder, y similares. Los elementos de control de expresión y una secuencia de señalización o líder, si están presentes, pueden ser provistos por el vector u otra fuente. Por ejemplo, las secuencias de control de transcripción y/o traducción de un ácido nucleico clonado que codifica una cadena de anticuerpo se pueden usar para dirigir la expresión.
Se puede proveer un promotor para expresión en una célula hospedante deseada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor puede estar operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, cadena de anticuerpo o su porción, de forma tal que dirige la transcripción del ácido nucleico. Existe una variedad de hospedantes de promotores adecuados para procariotas (p. ej., los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, el sistema promotor de fosfatasa alcalina, triptófano (trp), los promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucariotas (p. ej., el promotor 40 temprano o tardío del virus simio, el promotor de repetición terminal larga del sarcoma virus, el promotor del citomegalovirus, promotor tardío de adenovirus, promotor EG-1a).
Además, los vectores de expresión típicamente comprenden un marcador seleccionable para selección de células hospedantes que portan el vector, y, en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o fármacos son marcadores seleccionables comunes y se pueden usar en procariotas (p. ej., gen de p-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y células eucariotas (p. ej., neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o genes de resistencia a higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en una diversidad de hospedantes. Los genes que codifican el producto génico de marcadores auxotróficos del hospedante (p. ej., LEU2, URA3, HIS3) a menudo se utilizan como marcadores seleccionables en levadura. También se contempla el uso de vectores víricos (p. ej., baculovirus) o de fago, y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula hospedante, como los vectores retrovíricos.
Están disponibles los vectores de expresión adecuados para expresión en células procariotas (p. ej., células bacterianas tales como E. coli) o mamíferas e incluyen, por ejemplo, un vector pET (p, ej., pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen y otros), un vector de fago (p. ej., pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T (vector de fusión de Proteína A, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 21:l0l3-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) y similares. Los vectores de expresión que son adecuados para uso en distintos hospedantes de expresión, tales como células procariotas (E. coli), células de insecto (células Drosophila Schnieder S2, Sf9), levadura (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) y células mamíferas (p. ej., células COS).
Algunos ejemplos de vectores son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia nucleotídica correspondiente a un miembro de la biblioteca de polipéptidos. Por lo tanto, la selección con ligandos genéricos y/o diana se puede efectuar por propagación separada y expresión de un solo clon que expresa el miembro de la biblioteca de polipéptidos. Como se describió anteriormente, un sistema de presentación de selección particular es una presentación sobre bacteriófagos. Por ende, se pueden usar vectores de fago o fagémido, por ejemplo los vectores pueden ser vectores de fagémidos que tienen un origen de replicación de E. coli (para replicación bicatenaria) y también un origen de replicación de fago (para producción de a Dn monocatenario). La manipulación y expresión de dichos vectores se conoce en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). En síntesis, el vector puede contener un gen de p-lactamasa para conferir selectividad en el fagémido y un promotor lac en dirección 5' de un cassette de expresión que puede contener una secuencia líder adecuada, un sitio de clonación múltiple, una o más etiquetas de péptidos, uno o más codones finalizadores TAG y la proteína del fago pIII. Por consiguiente, con el uso de diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, iso-propil tio-p-D-galactósido (IPTG) o un fago cooperador, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin expresión, de producir grandes cantidades del miembro de la biblioteca de polipéptidos solamente o de producir fago, algunos de los cuales contienen por lo menos una copia de la fusión polipéptido-plll en su superficie.
Los dominios variables de anticuerpos pueden comprender un sitio de unión al ligando diana y/o un sitio de unión al ligando genérico. En ciertas realizaciones, el sitio de unión al ligando genérico es un sitio de unión para un superantígeno, tal como proteína A, proteína L o proteína G. Los dominios variables se pueden basar en cualquier dominio variable deseado, por ejemplo un VH humano (p. ej., Vh 1a, VH1b, Vh 2, Vh 3, Vh 4, Vh5, Vh 6), un VA humano (p. ej., VAI, VAII, VAIII, VAIV, VAV, VAVI o Vk1) o un Vk humano (p. ej., Vk2, Vk3, Vk4, Vk5, Vk6, Vk7, Vk8, Vk9 o Vk10).
Incluso otra categoría de técnicas implica la selección de repertorios en compartimientos artificiales, lo que permite el enlace de un gen con su producto génico. Por ejemplo, un sistema de selección en donde los ácidos nucleicos que codifican los productos génicos deseables se pueden seleccionar en microcápsulas formadas por emulsiones agua en aceite se describe en los documentos WO99/02671, WO00/40712 y Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Los elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene una actividad deseada se compartimentan en microcápsulas y luego se transcriben y/o traducen para producir sus respectivos productos génicos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Los elementos genéticos que producen productos génicos que tienen actividad deseada se clasifican en forma subsiguiente. Este planteamiento selecciona productos génicos de interés detectando la actividad deseada por una diversidad de medios.
Caracterización de los dominios de unión al epítopo.
La unión de un dominio a su antígeno o epítopo específico se puede ensayar por métodos que serán familiares para aquellos con experiencia en la técnica e incluyen ELISA. En un ejemplo, la unión se ensaya usando ELISA de fago monoclonal.
El ensayo ELISA de fagos se puede realizar de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado: a continuación se expone un protocolo ilustrativo.
La población del fago producido en cada tanda de selección se puede estudiar para unión con ELISA al antígeno o epítopo seleccionado, a fin de identificar anticuerpos de fagos "policlonales". El fago de colonias bacterianas infectadas individuales de estas poblaciones se puede ensayar por ELISA para identificar anticuerpos de fagos "monoclonales". También es conveniente ensayar fragmentos de anticuerpo solubles para unión a antígeno o epítopo, y esto puede efectuarse por ELISA usando reactivos, por ejemplo, contra una etiqueta C- o N-terminal (ver por ejemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y referencias allí citadas.
La diversidad de los anticuerpos monoclonales de fagos seleccionados puede también evaluarse por electroforesis en gel de productos PCR (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), sondaje (Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) o secuenciación del vector ADN.
E. Estructura de los dAb
En el caso de los dAb se seleccionan de repertorios de genes de V seleccionados por ejemplo usando tecnología de presentación sobre fagos como se describe en este documento, entonces estos dominios variables comprenden una región marco universal, de forma tal que pueden ser reconocidos por un ligando genérico específico como se define en este documento. El uso de marcos universales, ligandos genéricos y similares se describe en el documento WO99/20749.
Si se usan repertorios de genes V, la variación en la secuencia de polipéptidos se puede localizar dentro de los bucles estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptidos de cualquiera de los dominios variables se pueden alterar por transposición de ADN o por mutación con el fin de potenciar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. La transposición de ADN se conoce en la técnica y es descrita, por ejemplo, por Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 y en la patente de EE. UU. núm. 6.297.053, ambos documentos se incorporan a la presente invención por referencia. El experto en la técnica conoce otros métodos de mutagénesis. Andamios para uso en la construcción de dAb
i. Selección de la conformación de la cadena principal
Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas comparten todos un pliegue similar para su cadena de polipéptidos. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son altamente diversos en términos de su secuencia primaria, la comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, contrariamente a lo esperado, cinco de los seis bucles de unión al antígeno de los anticuerpos (H1, H2, l 1, L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de la cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). El análisis de las longitudes de los bucles y los residuos clave ha permitido entonces pronosticar las conformaciones de las cadenas principales de H1, H2, L1, L2 y L3 halladas en la mayoría de los anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Si bien la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave en el bucle y el marco del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
Los dAb ventajosamente se ensamblan de bibliotecas de dominios, como bibliotecas de dominios Vh y/o bibliotecas de dominios Vl. En un aspecto, se diseñan bibliotecas de dominios en las cuales se han escogido ciertas longitudes de bucles y residuos clave para asegurar que se conozca la conformación de la cadena principal de los miembros. Ventajosamente, estas son conformaciones reales de las moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas se hallan en la naturaleza, para minimizar las probabilidades de que no sean funcionales, como se analizó anteriormente. Los segmentos del gen V de la línea germinal sirven como un marco básico adecuado para construir bibliotecas de receptores de células T o anticuerpos; otras secuencias son también útiles. Pueden ocurrir variaciones a baja frecuencia, de modo tal que un pequeño número de miembros funcionales puede poseer una conformación de la cadena principal alterada, que no afecta su función.
La teoría de la estructura canónica es también útil para evaluar el número de conformaciones diferentes de la cadena principal codificado por ligandos, para pronosticar la conformación de la cadena principal en base a las secuencias de ligandos y para elegir residuos para diversificación que no afecten la estructura canónica. Se sabe que en el dominio Vk humano, el bucle L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el bucle L2 tiene una estructura canónica simple y ese 90% de dominios Vk humanos adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el bucle L3 (Tomlinson et al. (1995) supra); por lo tanto, en el dominio Vk solo, diferentes estructuras canónicas pueden combinarse para crear un intervalo de conformaciones diferentes de la cadena principal. Dado que el dominio VA codifica un intervalo diferente de estructuras canónicas para los bucles L1, L2 y L3 y que los dominios Vk y VA pueden aparearse con cualquier dominio Vh que puede codificar varias estructuras canónicas para los bucles H1 y H2, el número de combinaciones de estructuras canónicas para estos cinco bucles es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de la cadena principal puede ser esencial para la producción de un amplio intervalo de especificidades de unión. No obstante, se ha descubierto que construyendo una biblioteca de anticuerpos basada en una sola conformación conocida de la cadena principal, contrariamente a lo esperado, no se requiere la diversidad en la conformación de la cadena principal para generar diversidad suficiente para seleccionar prácticamente todos los antígenos. Incluso más sorprendentemente, la conformación individual de la cadena principal no necesita ser una estructura de consenso - una sola conformación natural se puede usar como base para toda la biblioteca. En consecuencia, en un aspecto particular, el dAb posee una única conformación conocida de la cadena principal.
La conformación de la cadena principal única que se escoge puede ser común entre las moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas en cuestión. Una conformación es común cuando se observa que un número significativo de moléculas naturales la adoptan. Por consiguiente, en un aspecto, la aparición natural de las distintas conformaciones de la cadena principal para cada bucle de unión de un dominio de inmunoglobulina se considera por separado y luego se elige un dominio variable natural que posee la combinación deseada de las conformaciones de la cadena principal para los distintos bucles. Si ninguno está disponible, se puede escoger el equivalente más próximo. La combinación deseada de conformaciones de la cadena principal para los distintos bucles se puede crear seleccionando los segmentos del gen de la línea germinal que codifican las conformaciones de la cadena principal deseadas. En un ejemplo, los segmentos génicos de la línea germinal seleccionados se expresan frecuentemente en la naturaleza, y en particular pueden ser los más frecuentemente expresados de todos los segmentos génicos de la línea germinal natural.
En el diseño de bibliotecas, la incidencia de las distintas conformaciones de la cadena principal para cada uno de los seis bucles de unión al antígeno se puede considerar por separado. Para H1, h2, L1, L2 y L3, se elige una conformación determinada adoptada por entre 20% y 100% de los bucles de unión al antígeno de moléculas naturales. Típicamente, su incidencia observada está encima de 35% (es decir, entre 35% y 100%) e, idealmente, encima de 50% o incluso encima de 65%. Dado que la gran mayoría de los bucles H3 no tienen estructuras canónicas, es preferible seleccionar la conformación de la cadena principal que es común entre esos bucles que no exhiben estructuras canónicas. Para cada uno de los bucles, se selecciona por lo tanto la conformación que se observa con más frecuencia en el repertorio natural. En anticuerpos humanos, las estructuras canónicas (CS) más populares para cada bucle son las siguientes: H1 - CS 1 (79% del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46%), L1 - CS 2 of Vk^ (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 de Vk^ (36%) (el cálculo supone una relación k:A de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para bucles H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos) de siete residuos con un puente de sal del residuo 94 al residuo 101 parece ser la más común. Hay por lo menos 16 secuencias de anticuerpos humanos en la biblioteca de datos EMBL con la longitud de H3 requerida y los residuos clave para formar esta conformación y por lo menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de la proteína que se pueden usar como base para el modelado de anticuerpos (2cgr y 1tet). Los segmentos génicos de la línea germinal más frecuentemente expresados en esta combinación de estructuras canónicas son el segmento Vh 3-23 (DP-47), el segmento Jh JH4b, el segmento Vk02/012 (DPK9) y el segmento Jk Jk1. Vh DP45 y DP38 son también adecuados. Estos segmentos pueden por lo tanto usarse en combinación como base para construir una biblioteca con la conformación de una sola cadena principal deseada.
Alternativamente, en lugar de elegir la conformación de una sola cadena principal en base a la aparición natural de distintas conformaciones de la cadena principal para cada uno de los bucles de unión en aislamiento, la aparición natural de combinaciones de conformaciones para la cadena principal se usa como base para elegir la conformación única de la cadena principal. En el caso de anticuerpos, por ejemplo, se puede determinar la aparición natural de combinaciones de estructuras canónicas para cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o los seis bucles de unión al antígeno. Aquí, la conformación elegida puede ser común en anticuerpos naturales y se puede observar más frecuentemente en el repertorio natural. Por lo tanto, en anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando se consideran las combinaciones naturales de los cinco bucles de unión al antígeno, H1, H2, L1, L2 y L3, se determina la combinación más frecuente de estructuras canónicas y luego se combina con la conformación más popular para el bucle H3, como fundamento para escoger la conformación única de la cadena principal.
Diversificación de la secuencia canónica
Habiendo seleccionado varias conformaciones conocidas de la cadena principal o una sola conformación conocida de la cadena principal, se pueden construir dAb variando el sitio de unión de la molécula con el fin de generar un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que se generan variantes que poseen suficiente diversidad en su estructura y/o en su función para que sean capaces de proporcionar una gama de actividades.
La diversidad deseada típicamente se genera variando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones que se han de cambiar se pueden escoger al azar o se pueden seleccionar. La variación puede entonces lograrse por aleatorización, durante la cual el aminoácido residente se reemplaza por cualquier aminoácido o su análogo, natural o sintético, produciendo un número muy grande de variantes o reemplazando el aminoácido residente con uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes.
Se han descrito varios métodos para introducir dicha diversidad. PCR propensa a error (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), mutagénesis química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas de mutación bacteriana (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) se pueden usar para introducir mutaciones aleatorias en los genes que codifican la molécula. Los métodos para mutar posiciones seleccionadas también se conocen en la técnica e incluyen el uso de oligonucleótidos mal apareados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado varias bibliotecas de anticuerpos sintéticos dirigiendo mutaciones a los bucles de unión al antígeno. La región H3 de un Fab de unión al toxoide del tétano humano Fab se ha aleatorizado para crear una gama de nuevas especificidades de unión (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.89: 4457). Las regiones aleatorias o semi-aleatorias H3 y L3 se han anexado a los segmentos del gen V de la línea germinal para producir grandes bibliotecas de regiones marco no mutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. U.U., 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Dicha diversificación se ha extendido para incluir todo o parte de todos los otros bucles de unión al antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra).
Dado que la aleatorización de los bucles posee el potencial de crear aproximadamente más de 1015 estructuras para H3 solo y de modo similar un gran número de variantes para los otros cinco bucles, no es factible usar la tecnología de transformación actual o incluso usar los sistemas libres de células para producir una biblioteca que represente todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las más grandes bibliotecas construidas hasta la fecha, se generaron 6 x 1010 anticuerpos distintos, lo cual representa solamente una fracción de la diversidad potencial de una biblioteca de este diseño (Griffiths et al. (1994) supra).
En una realización, se diversifican solamente aquellos residuos que están directamente implicados en crear o modificar la función deseada de la molécula. Para muchas moléculas, la función se unirá a una diana y por lo tanto la diversidad deberá concentrare en el sitio de unión a la diana, evitando así cambiar residuos que son cruciales para todo el empaquetado de la molécula o para mantener la conformación elegida de la cadena principal.
En un aspecto, se usan bibliotecas de dAb en las que varían solamente aquellos residuos en el sitio de unión al antígeno. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio del cuerpo humano y se sabe que hacen contacto en complejos de anticuerpos/antígenos de alta resolución. Por ejemplo, en L2 se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en anticuerpos naturales y se observa que hacen contacto con el antígeno. En contraste, el planteamiento convencional habría sido diversificar todos los residuos en la región determinante de complementaridad correspondiente (CDR1) según lo definido por Kabat et al. (1991, supra), comparando siete residuos con los dos diversificados en la biblioteca. Esto representa un avance importante en términos de la diversidad funcional requerida para crear una gama de especificidades de unión al antígeno.
En la naturaleza, la diversidad de anticuerpos es el resultado de dos procesos: la recombinación somática de los segmentos génicos de la línea germinal V, D y J para crear un repertorio primario virgen (llamada línea germinal y diversidad de unión) e hipermutación somática de los genes V reordenados resultantes. Se demostró que el análisis de las secuencias de anticuerpos humanos en el repertorio primario se concentra en el centro del sitio de unión al antígeno, mientras que la hipermutación somática propaga la diversidad hacia regiones en la periferia del sitio de unión al antígeno (verTomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Esta complementaridad probablemente ha evolucionado como una estrategia eficiente para buscar el espacio de secuencia y, aunque es aparentemente única a los anticuerpos, puede aplicarse fácilmente a otros repertorios de polipéptidos. Los residuos que varían son un subconjunto de aquellos que forman el sitio de unión hacia la diana. Diferentes subconjuntos de residuos (incluida la superposición) en el sitio de unión a la diana se diversifican en distintas etapas durante la selección, si se desea.
En el caso de un repertorio de anticuerpos, se crea un repertorio 'virgen inicial parte, pero no todos los residuos, en el sitio de unión al antígeno, se diversifican. Como se emplea en este contexto, el término "virgen" o "simulado" se refiere a moléculas de anticuerpo que no tienen diana pre-determinada. Estas moléculas se asemejan a aquellas que son codificadas por los genes de inmunoglobulina de un individuo que no se ha sometido a diversificación inmune, como es el caso con fetos o recién nacidos, cuyos sistemas inmunes todavía no se han sometido a una amplia diversidad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selecciona entonces contra una gama de antígenos o epítopos. Si es necesario, se puede introducir luego más diversidad fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio madurado se puede seleccionar para función modificada, especificidad o afinidad.
Se ha de entender que las secuencias descritas en este documento incluyen secuencias que son sustancialmente idénticas, por ejemplo secuencias que son por lo menos 90% idénticas, por ejemplo que son por lo menos 91%, o por lo menos 92%, o por lo menos 93%, o por lo menos 94% o por lo menos 95%, o por lo menos 96%, o por lo menos 97% o por lo menos 98%, o por lo menos 99% idénticas a las secuencias descritas en este documento. Para ácidos nucleicos, la expresión "identidad sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o sus secuencias designadas, cuando se alinean y comparan de manera óptima, son idénticas, con inserciones y eliminaciones de nucleótidos, en por lo menos aproximadamente 80% de los nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 90% a 95%, o por lo menos aproximadamente 98% a 99,5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas al complemento de la hebra. Para secuencias de aminoácidos y nucleótidos, el término "idéntico/a" indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos cuando están óptimamente alineadas y se comparan con inserciones o eliminaciones apropiadas. Alternativamente, la identidad sustancial existe cuando los segmentos de ADN se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas, al complemento de la hebra.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de veces de posiciones 100), tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden obtener usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitativos que siguen. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad de entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud del espacio de 12 y una penalidad del espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz 62 o una matriz PAM250, y un peso del espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia, es decir, ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en por lo menos una eliminación, sustitución de nucleótidos, incluidas transición y transversión, o inserción, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la secuencia de referencia por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y sustrayendo ese producto de dicho número total de nucleótidos en la secuencia de referencia, o:
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en donde nn es el número de alteraciones de nucleótidos, xn es el número total de nucleótidos en la secuencia de referencia, y y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% o 1,00 para 100%, y en donde cualquier producto no entero de xn y y se redondea para abajo hacia el número entero más próximo antes de sustraerlo de xn. Las alteraciones de la secuencia de polinucleótidos de la secuencia de referencia pueden crear mutaciones sin sentido, con sentido erróneo o de desplazamiento de marco en esta secuencia de codificación y por lo tanto alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.
De modo similar, en otro ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia codificada por la SEQ ID NO: 5, es decir, ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia tal que el % de identidad sea inferior a 100%. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en por lo menos una eliminación, sustitución de aminoácidos, incluidas sustitución o inserción conservadora o no conservadora, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos codificada por la SEQ ID NO: 5 por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y luego sustrayendo ese producto de dicho número total de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos codificada por la SEQ ID NO: 5, o:
na<xa -(xa • y),
en donde na es el número de alteraciones de aminoácidos, xa es el número total de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos codificada por la SEQ ID NO: 5, y y es, por ejemplo 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85% etc., y en donde cualquier producto no entero de xa y y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de sustraerlo de xa.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Diseño y construcción de proteínas de unión al antígeno biespecífico con diversos enlazadores Se modificó una secuencia de ADN anti-IL-13 dAb DNA (DOM10-53-616, SEQ ID NO: 1) por PCR para incluir un sitio BamHI en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3' con el fin de facilitar la clonación. El producto PCR se clonó en un vector de expresión mamífero que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL4, permitiendo que anti IL-13 dAb se condensara al término C de la cadena pesada mediante un enlazador GS (SEQ ID NO: 4, cadena pesada del anticuerpo biespecífico BPC 2201).
Se diseñaron cebadores directos e inversos que codifican el enlazador de TVAAPS con extremos cohesivos BgIII y BamHI para facilitar la clonación en el sitio BamHI del vector anteriormente descrito. Este método permitió la introducción secuencial de secuencias del enlazador de TVAAPSGS entre el término C del dominio CH3 y el término N del anticuerpo del dominio DOM-10-53-616 anti-IL-13. Los vectores de expresión resultantes codifican las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (las cadenas pesadas de BPC2202 y BPC2203 respectivamente).
La secuencia de ADN de una cadena de anticuerpo anti-IL-4 mAb se modificó en el extremo 3' por PCR con en fin de incorporar diversas secuencias enlazadoras. Los fragmentos de PCR resultantes se restringieron con HindIII y BamHI y se clonaron en el vector de expresión que codifica la SEQ ID NO: 4 también restringido con HindIII y BamHI. Los vectores de expresión mamíferos resultantes codifican la cadena pesada del anti-IL-4 mAb condensado a DOM-10-53-616 con diversos enlazadores entre el término C del dominio CH3 y el dominio N del DOM10-53-616 anti IL-13 dAb. Este método generó vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas de BPC2204-2215 y BPC2217-2220 (SEQ ID NO: 7-8 y 11-21 y 23-25).
Se usaron plásmidos que codifican las cadenas pesadas de BPC2201-2210 y BPC2220 (SEQ ID NO 4-8 y 11-16) como constructos base para generar constructos alternativos. En la primera etapa, la secuencia de ADN que codifica el dominio de anticuerpo DOM-10-53-616 anti-IL-13 (SEQ ID NO: 1) se reemplazó con una secuencia de ADN que codifica DOM-9-155-154 anti IL-4 dAb (SEQ ID NO: 26) por clonación de restricción usando BamHI y EcoRI. En la segunda etapa, la secuencia de ADN que codifica el dominio pesado variable del anticuerpo anti-IL4 se reemplazó con una secuencia de ADN que codifica el dominio variable de un anticuerpo anti-IL13 por clonación de restricción usando HindIII y SpeI. Los vectores de expresión resultantes codifican las proteínas de fusión de la cadena pesadaanticuerpo de dominio de SEQ ID NO: 29-33 y 36-41.
Los plásmidos que codifican las cadenas pesadas de BPC2211-2214, 2218 y 2219 (SEQ ID NO 17-20, 24 y 25), se usaron como constructos base para generar constructos alternativos. En la primera etapa, la secuencia de ADN que codifica el anticuerpo de dominio DOM-10-53-616 anti-IL-13 (SEQ ID NO:1) se reemplazó con la secuencia de ADN que codifica DOM-9-155-154 anti IL-4 dAb (SEQ ID NO: 26) por clonación de restricción usando BamHI y EcoRI. En la segunda etapa, la secuencia de ADN que codifica el dominio pesado variable del anticuerpo anti-IL4 se reemplazó con una secuencia de ADN que codifica el dominio variable de un anticuerpo anti-IL13 por clonación de restricción usando HindIII y SpeI. Los vectores de expresión resultantes codifican las proteínas de fusión de la cadena pesadaanticuerpo de dominio SEQ ID NO: 42-45, 49 y 50.
Se diseñaron proteínas de fusión de cadena pesada-anticuerpos de dominio alternativas que contenían distintos enlazadores entre el dominio CH3 de la cadena pesada y el anticuerpo de dominio y se enumeran en las SEQ ID NO: 9, 10, 22, 34-35 y 42-50. Una secuencia de anticuerpos de dominio anti-IL-4 alternativa se expone en SEQ ID NO. 80-82. Una secuencia de anticuerpos de dominio anti-IL-13 alternativa se expone en SEQ ID NO: 83. Los enlazadores se enumeran en las SEQ ID NO: 51-78 y 112-114.
Tabla 1: resumen de los anticuerpos y proteínas de unión al antígeno biespecífico que se han diseñado. Todos estos se han construido y expresado, excepto aquellos identificados con * es decir,. BPC2232, 2233, 2243, 2244, 2245, 2238, 2239 y 2240.
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Los plásmidos de expresión que codifican la cadena pesada y la correspondiente cadena ligera de las proteínas de unión al antígeno biespecífico que se exponen en la Tabla 1 se co-transfectaron transitoriamente en células HEK 293-6E que usan 293-fectin (Invitrogen, 12347019). Se añadió una alimentación de triptona a cada cultivo celular hasta 24 horas después de la transfección, y las células se cosecharon después de 3 a 7 días. En algunos casos, se utilizó el sobrenadante como el artículo de prueba en los ensayos de unión y en BIAcore. En otros casos, la proteína de unión al antígeno biespecífico se purificó usando una columna de Proteína A antes de someterse a los ensayos de unión.
Los sobrenadantes se cuantificaron con el nefelómetro Beckman Coulter IMMAGE o Gyros.
Ejemplo 2 - ELISA de unión a IL-4 e IL-13
Se recubrieron placas de gran unión de 96 pocillos con 5 pg/ml o bien de IL-4 o de IL-13 en agua con bicarbonato y se conservó durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron dos veces con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o disolución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,05% de Tween-20. Se añadieron 200 pl de disolución bloqueante (3% BSA en tampón PBS) en cada pocillo y la placa se incubó durante por lo menos 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó luego otra etapa de lavado. Los sobrenadantes o los anticuerpos purificados (mAb) se diluyeron sucesivamente en las placas en disolución de bloqueo. Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron. Se diluyó anticuerpo conjugado a peroxidasa específico de cadena ligera kappa anti-humano de cabra (Sigma, A7164) en disolución bloqueante hasta 1pg/ml y se añadieron 50 pl a cada pocillo. Las placas se incubaron entre una hora y una hora y media. Después de otra etapa de lavado, se añadieron 50 pl de OPD (dihidrocloruro de a-fenilendiamina) Se añadió disolución de sustrato SigmaFast a cada pocillo y la reacción se detuvo 15 minutos más tarde por adición de 25 pl de ácido sulfúrico 3M. Se leyó la absorbancia a 490 nm usando la lectora de microplacas VersaMax Tunable (Molecular Devices) empleando un protocolo de criterio de valoración básico.
La Figura 1 y la Figura 2 muestran los resultados de la unión de varios ensayos separados de proteínas de unión al antígeno biespecíficos purificados con enlazador de GS y GS(TVAAPSGS)n=1-4 (BPC 2201, 2202, 2203, 2209 y BPC 2210) a IL-4 humana e IL-13 humana respectivamente según lo determinado por ELISA. BPC1001 (una proteína de unión al antígeno biespecífico control positiva que se une a IL-13 e IL-4) demostró unión a IL-4 e IL-13. En contraste, un anticuerpo control negativo (híbrido etiquetado que no reconoce IL-4 o IL-13) no demostró unión a IL-4 o IL-13 humana. En este experimento, las proteínas de unión al antígeno específicas demuestran todas actividad de unión similar a IL-4 humana e IL-13 humana.
La Figura 3 y la Figura 4 exponen los resultados de la unión de varios ensayos separados de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificados con enlazadores de (PAS)n=1 -3GS y (G4 S)n=i-3 (BPC 2204 a BPC 2208 y BPC 2220) a IL-4 humana e IL-13 humana respectivamente según lo determinado por ELISA. BPC1001 (una proteína de unión al antígeno biespecífico control que se une a IL-13 e IL-4) demostró unión a IL-4 e IL-13. En contraste, un anticuerpo control negativo (híbrido etiquetado que no reconoce IL-4 o IL-13) no demostró unión a IL-4 o IL-13 humana. En este experimento, las proteínas de unión al antígeno biespecífico demostraron todas actividad de unión similar a IL-4 humana e IL-13 humana.
La Figura 5 y la Figura 6 muestran los resultados de la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con enlazadores (PAVPPP)n=1 -3GS, (TVSDVP)n=1 -2GS y (TGLDSP)n=1 -3GS (BPC 2211 a BPC 2215 y BPC 2217 a BPC 2219) a IL-4 humana y IL-13 humana respectivamente según lo determinado por ELISA. BPC1001 (una proteína de unión a antígenos biespecífico control positiva que se une a IL-13 e IL-4) demostró unión a IL-4 e IL-13. En contraste, un anticuerpo control negativo (híbrido etiquetado que no reconoce IL-4 o IL-13) no demostró unión a IL-4 o IL-13 humana. En este experimento, las proteínas de unión al antígeno biespecífico demostraron todas actividad de unión similar a IL-4 humana e IL-13.
Las Figuras 7 y 8 muestran los resultados de la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificadas con enlazadores GS y GS(TVAAPSGS)n=1 -4 , (PAS)n=1 -3GS y (G4S)n=1-3 (BPC 2221-2231) a IL-4 humana e IL-13 humana respectivamente según lo determinado por ELISA. BPC1001 (una proteína de unión al antígeno biespecífico control positiva que se une a IL-13 e IL-4) demostró unión a IL-4 e IL-13. En contraste, un anticuerpo control negativo (híbrido etiquetado que no reconoce IL-4 o IL-13) no demostró unión a IL-4 o IL-13 humana. En este experimento, las proteínas de unión al antígeno biespecífico demostraron todas actividad de unión similar a IL-13 humana. En comparación, se observó un aumento importante en la unión de la porción dAb a IL-4 al aumentar el tamaño del enlazador del enlazador GS(TVAAPSGS)1 al enlazador GS(TVAAPs Gs )2 -4.
Las Figuras 9 y 10 muestran los resultados de la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con los enlazadores (PAVPPP)n=1 -3GS y TVSDVPGS y (TGLDSP)n=2 -3GS (BPC 2234 to BPC 2237, BPC 2241 y BPC 2242) a IL-4 humana e IL-13 humana respectivamente según lo determinado por ELISA. BPC1001 (una proteína de unión al antígeno biespecífico control positiva que se une a IL-13 e IL-4) demostró unión a IL-4 e IL-13. En contraste, un anticuerpo control negativo (híbrido etiquetado que no reconoce IL-4 o IL-13) no demostró unión a IL-4 o IL-13 humana. En este experimento, las proteínas de unión al antígeno biespecífico demuestran todas actividad de unión similar a IL-13 humana. En comparación, se observó una tendencia en el ensayo ELISA de unión a IL-4 humana: a medida que aumentaba la longitud del enlazador, mejoraba la actividad de unión de la porción dAb de las proteínas de unión al antígeno biespecífico a IL-4.
Ejemplo 3 -Evaluación de estequiometría de las proteínas de unión al antígeno (usando Biacore™)
Este ejemplo es profético. Ofrece lineamientos para llevar a cabo un ensayo adicional en el que se pueden ensayar las proteínas de unión al antígeno de la invención.
Se inmovilizó IgG anti-humana en un chip biosensor CM5 por acoplamiento de amina primaria. Las proteínas de unión al antígeno se capturan en esta superficie después de lo cual se pasa una sola concentración de IL-13 o IL-4, esta concentración es suficiente para saturar la superficie de unión, y la señal de unión observada alcanzó R-máx total. Luego se calculan las estequiometrías usando la siguiente fórmula:
Estequiometría=Rmáx *Mw (ligando) / Mw (analito)* R (ligando inmovilizado o capturado) En donde las estequiometrías se calculan para más de una unión de analito por vez, los distintos antígenos se pasan secuencialmente a la concentración de antígeno de saturación y las estequiometrías se calculan como anteriormente. El trabajo se realiza en Biacore 3000, a 25°C usando el tampón de corrida HBS-EP.
Ejemplo de referencia 4 -Construcción y ensayo de proteínas de unión al antígeno que comprenden la variante CDRH3 de mAb anti-IL-13 y dAb mutado (BPC1085, BPC1086 & BPC1087)
4.1 Construcción y expresión
Los plásmidos que codifican las cadenas pesadas que consisten en un mAb anti-IL-13 y un dAb anti-IL-4 dAb se usaron como constructos base para generar constructos de plásmidos alternativos. Se requirió una estrategia de clonación de dos etapas. En la etapa 1, la secuencia de ADN que codifica el VH del componente de mAb anti-IL13 de la cadena H se reemplazó con la secuencia de ADN que codifica el VH de otro anticuerpo anti-IL13 humanizado (SEQ ID NO:93) por clonación de restricción, usando HindIII y SpeI. En la etapa 2, el codón que codifica la leucina en la posición Kabat 89 en el componente dAb anti-IL4 (DOM9-155-154, SEQ ID NO: 26) de mAbdAb se mutó por mutagénesis dirigida al sitio a glutamina. Todas las secuencias de ADN de la cadena pesada generadas se exponen en las SEQ ID NO: 98-100. La Tabla 2 expone una lista de las moléculas construidas y expresadas.
Tabla 2 - Resumen de los anticuerpos construidos y expresados
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Los plásmidos de expresión de cadena pesada y ligera que codifican BPC1085, BPC1086 y BPC1087 mAbdAb se co-transfectaron en células HEK 2936E usando 293fectina (Invitrogen, 12347019). Se añadió una alimentación de triptona a cada uno de los cultivos celulares después de 24 horas, y las células se cosecharon después de 72 horas. Los anticuerpos se purificaron usando una columna de Proteína A antes de ensayarse en ensayos de unión.
Se purificaron mAbdAb BPC1085, BPC1086 y BPC1087 usando afinidad de Proteína A. Se usaron columnas de Proteína A de 1 ml (GE Healthcare) en el sistema AKTA Xpress, las columnas se equilibraron en PBS (Gibco/Invitrogen) y los anticuerpos se eluyeron usando Pierce IgG. Las fracciones eluidas se neutralizaron usando tampón Tris 1M (Hidroximetil) Aminometano (en general 5-10% v/v). Las fracciones de anticuerpo eluidas se mezclaron y analizaron para agregación por cromatografía de exclusión de tamaño y se cuantificaron leyendo a OD280 nm con el uso de un espectrofotómetro.
Estos se compararon con mAbdAb equivalentes (2222, 2223, 2230 y 2231) que se describen en la Tabla 3. Estos comprenden:
i) un dAb que es idéntico a aquel utilizado en BPC1085, BPC1086 y BPC1087 excepto por la posición 89 que es 'L' en BPC2222, BPC2223, BPC2230 y BPC2231, y Q' en BPC1085, BPC1086 y BPC1087).
ii) los mismos enlazadores
iii) una secuencia de mAb de IL-13 que es idéntica a aquella utilizada en BPC1085, BPC1086 y BPC1087 excepto por la posición 100B que es 'Y' en BPC2222, BPC2223, BPC2230 y BPC2231, y V' en BPC1085, BPC1086 y BPC1087).
Tabla 3:
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Se purificaron mAbdAb BPC2222, 2223, 2230 y 2231 usando afinidad de Proteína A. Se utilizaron columnas de Proteína A de 1 ml (GE Healthcare) en el sistema AKTA Xpress, las columnas se equilibraron en PBS (Gibco/Invitrogen) y los anticuerpos se eluyeron usando elución de IgG de Pierce. Las fracciones eluidas se neutralizaron usando tampón Tris 1M (Hidroximetil) Aminometano (en general 5-10% v/v). Las fracciones de anticuerpo eluidas se mezclaron y analizaron para agregación por cromatografía de exclusión de tamaño y se cuantificaron leyendo a OD280 nm con el uso de un espectrofotómetro.
BPC2222, 2223, 2230 y 2231 exhibieron agregación entre 30-40%, con el material agregado eluyéndose antes de 10 minutos.
En comparación con BPC2222, 2223, 2230 y 2231, los constructos BPC1085, 1086 y 1087 demostraron niveles inferiores de agregación según lo evaluado por cromatografía de exclusión de tamaño.
4.2 ELISA de unión a IL-4
Se ensayaron mAbdAb BPC1085, BPC1086 y BPC1087 purificados para unión a IL-4 en un ELISA de unión directo de conformidad con el siguiente método.
Se recubrieron placas de gran unión de 96 pocillos con 5 pg/ml de IL-4 humana (preparada en GSK) en NaHCOa y se conservaron a 4°C. Las placas se lavaron dos veces con disolución salina tamponada con Tris con 0,05% de Tween-20 (TBST). Se añadieron 100 pl de disolución de bloqueo (1% BSA en tampón TBST) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante por lo menos una hora a temperatura ambiente. Los mAbdAb purificados se diluyeron sucesivamente en las placas con disolución de bloqueo. Después de incubar durante una hora, las placas se lavaron tres veces. Se diluyó anticuerpo conjugado a peroxidasa específica de cadena ligera kappa anti-humano de cabra (Sigma A7164) en disolución de bloqueo hasta 1 pg/ml y se añadieron 50 pl a cada pocillo. Las placas se incubaron durante una hora. Después de otras tres etapas de lavado, se añadieron 50 pl de disolución de sustrato OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina) SigmaFast a cada pocillo, y la reacción se detuvo durante aproximadamente 5 minutos por adición de 25 pl de ácido sulfúrico 3M. Se leyó la absorbancia a 490 nm usando la lectora de placas VersaMax Tunable (Molecular Devices) empleando un protocolo de criterio de valoración básico.
El experimento se llevó a cabo usando mAbdAb directamente de sobrenadantes de cultivo de tejido, excepto para el control positivo (mAb anti-IL-4) y el control negativo mAb anti-I L13, que fueron material purificado.
Estos datos se muestran en la Figura 11. Los resultados del ELISA confirmaron que estos mAbdAb purificados se unen a IL-4. Los controles positivos anti-IL-4 mAb y BPC2231 también demostraron unión a IL-4, mientras que el control negativo mAb (anti mAb de IL-13) no demostró unión a IL-4. Esto indicó en este ELISA que la potencia de dAb aumentaba cuando la longitud del enlazador se aumentaba de GS(TVAAPSGS) a GS(TVAApSg S)2-4.
4.3 Neutralización de IL-4 en un bioensayo de proliferación de células TF-1
Se ensayaron mAbdAb purificados BPC1085, BPC1086 y BPC1087 para neutralización de IL-4 humana en un bioensayo de células TF-1.
Las células TF-1 proliferan en respuesta a una serie de citocinas diferentes como la IL-4 humana. La respuesta proliferativa de estas células a IL-4 puede por lo tanto medir la bioactividad de IL-4 y subsiguientemente se ha desarrollado un ensayo para determinar la potencia de neutralización de IL-4 (inhibición de bioactividad de IL-4) de mAbdAb. El ensayo se realizó en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos bajo condiciones estériles, y todos los pocillos se ensayaron por duplicado. Aproximadamente 2,2 ng/ml de IL-4 humana que expresa E. Coli se preincubaron con distintas diluciones de mAbdAb (usualmente a partir de 560 nM titulados en diluciones triples hasta 0,009 nM) en un volumen total de 120 pl durante 1 hora a 37°C. Un anticuerpo de especificidad irrelevante se tituló de manera similar como control negativo (mAb anti-IL13). Se añadieron luego 50 pl de estas muestras a 50 pl de células TF-1 (a una concentración de 2x105 células por ml) en una placa de cultivo de tejido estéril de 96 pocillos. Por lo tanto, el volumen del ensayo final de 100 pl contenía diversas diluciones de mAbdAb (en una concentración final de 270 nM titulada en diluciones triples hasta 0,005 nM), IL-4 humana expresada en E. Coli recombinante (en una concentración final de 1,1 ng/ml) y células TF-1 (en una concentración final de 1x105 células por ml). La placa de ensayo se incubó a 37°C durante aproximadamente 4 días en una incubadora de CO2 humidificada. La cantidad de proliferación celular se determinó luego usando el 'Ensayo de proliferación celular no radiactivo CellTitre 96®' de Promega (número de catálogo G4100), como se describe en las instrucciones del fabricante. La absorbancia de las muestras en la placa de 96 pocillos se leyó en una lectora de placas a 570 nm. Estos datos se ingresaron en una planilla de cálculos Excel, se promediaron los valores de los pocillos de prueba duplicados, y se restó el valor promedio de fondo (sin mAb-dAb y sin los pocillos de prueba de IL-4).
La capacidad de los mAbdAb de neutralizar la bioactividad de IL-4 humana expresada en E. Coli recombinante se expresó como esa concentración de mAb-dAb requerida para neutralizar la bioactividad de la cantidad definida de IL-4 humana (1,1ng/ml) por 50% (= ND50). Cuanto menor sea la concentración del mAbdAb requerido, más potente será la capacidad de neutralización. Los datos de ND50 provistos en este documento (Tabla 4) se calcularon usando la función Robosage en Excel. Estos datos se representan gráficamente en la Figura 12.
Se incluyeron un mAb anti-IL-4 y DOM9-155-154 (SEQ ID NO: 26) como controles positivos para neutralización de IL-4 humana y de cynomolgus en los bioensayos de células TF-1. Además, un dAb con especificidad para un antígeno irrelevante (dAb virgen) también se incluyó como control negativo para neutralización de IL-4 humana o de cynomolgus en los bioensayos de células TF-1.
Estos se repitieron varias veces, y la Figura 12 expone los resultados de uno de estos experimentos. Los valores ND50 se calcularon a partir del conjunto de datos. El valor ND50 es la concentración del mAbdAb o mAb o dAb, que es capaz de neutralizar la bioactividad de IL-4 en 50%. El valor ND50 medio y el número de veces ensayadas (n) se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000038_0001
Estos datos confirman que los mAbdAb purificados BPC1085, BPC1086 y BPC1087, neutralizaron la bioactividad de IL-4 humana y cyno. mAb anti-IL-4 y DOM9-155-154 también neutralizaron la bioactividad de IL-4 humana y de cynomolgus, mientras que el dAb negativo (dAb virgen) no exhibió neutralización en el mismo bioensayo. Los tres mAbdAb exhibieron buena potencia, y una clara tendencia a aumentar la potencia de dAb con el aumento de la longitud del enlazador fue obvia en los ensayos de neutralización, a pesar de que el ELISA más bruto no recogió esta diferencia en potencia. Un control negativo de mAb anti-IL-4 no exhibió neutralización en el mismo bioensayo.
4.4 Neutralización de IL-13 humana en un bioensayo de proliferación de células TF-1
Los mAbdAb purificados BPC1085, BPC1086 y BPC1087 se ensayaron para neutralización de IL-13 humana en un bioensayo de células TF-1 como se describe a continuación.
Las células TF-1 proliferan en respuesta a un número de citocinas diferentes como la IL-13 humana. La respuesta proliferativa de estas células a IL-13 puede por lo tanto utilizarse para medir la bioactividad de IL-13, y subsiguientemente se desarrolló un ensayo para determinar la potencia de neutralización de IL-13 (inhibición de bioactividad de IL-13) de los mAbdAb.
El ensayo se llevó a cabo en placas de cultivo de tejido estériles de 96 pocillos bajo condiciones estériles, y todos los pocillos se ensayaron por duplicado. Aproximadamente 14 ng/ml de IL-13 humana expresada en E. Coli recombinante se preincubaron con diversas diluciones de mAbdAb (usualmente a partir de 560 nM titulados en diluciones triples hasta 0,009 nM) en un volumen total de 120 pl durante 1 hora a 37°C. Un anticuerpo y dAb de especificidad irrelevante se titularon de modo similar como controles negativos (mAb anti-IL-4 y DOM9-155-154 respectivamente). Se añadieron luego 50 pl de estas muestras a 50 pl de células TF-1 (en una concentración de 2x105 células por ml) en una placa de cultivo de tejido estéril de 96 pocillos. Por lo tanto, el volumen de ensayo de 100 pl final contenía diversas diluciones de mAbdAb (en una concentración final de 270 nM titulados en diluciones triples hasta 0,005nM), IL-13 humana expresada en E. Coli recombinante (en una concentración final de 7 ng/ml) y células TF-1 (en una concentración final de 1x105 células por ml). La placa de ensayo se incubó a 37°C durante aproximadamente 4 días en una incubadora de CO2 humidificada. La cantidad de proliferación celular se determinó luego usando el 'Ensayo de proliferación celular no radiactivo CellTitre 96®' de Promega (número de catálogo G4100), como se describe en las instrucciones del fabricante. La absorbancia de las muestras en la placa de 96 pocillos se leyó en una lectora de placas a 570 nm. Estos datos se ingresaron en una planilla de cálculos Excel, los valores para los pocillos de prueba duplicados se promediaron, y se sustrajo el valor promedio de fondo (sin mAbdAb y sin los pocillos de prueba de IL-13).
La capacidad de los mAbdAb de neutralizar la bioactividad de IL-13 humana expresada en E. Coli recombinante se expresó como aquella concentración del mAb-dAb requerida para neutralizar la bioactividad de la cantidad definida de IL-13 humana (7 ng/ml) en 50% (= ND50). Cuanto menor sea la concentración del mAbdAb requerido, más potente será la capacidad de neutralización. Los datos de ND50 provistos en este documento (Tabla 5) se calcularon usando la función Robosage en Excel. Estos datos se representan gráficamente en la Figura 13.
Un mAb anti IL-13 se incluyó como control positivo para neutralización de IL-13 humana en los bioensayos de células TF-1. Además, un mAb anti-IL-4 también se incluyó como control negativo.
La Figura 13 muestra el resultado del ensayo de neutralización de células TF-1. Los valores ND50 se calcularon a partir del conjunto de datos. El valor ND50 es la concentración del mAbdAb o mAb o dAb, que es capaz de neutralizar la bioactividad de IL-13 en 50%.
El valor ND50 medio y el número de veces ensayadas se exponen en la Tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000039_0001
Estos datos confirman que los mAbdAb purificados BPC1085, BPC1086 y BPC1087 neutralizaron la bioactividad de IL-13 humana y cyno recombinante. Un control negativo de mAb anti-IL-4 no exhibió neutralización en el mismo bioensayo.
Ejemplo de referencia 5 - mAbdAb que comprenden DOM10-53-616 dAb
5.1 Análisis de expresión de mAb anti-IL13-dAb anti-IL4
Los plásmidos de expresión de la cadena pesada y ligera que codifican BPC2202, BPC2203, BPC2209 y BPC2210 como se describió en el Ejemplo 1 se co-transfectaron en células HEK 2936E empleando 293fectina (Invitrogen, 12347019) y se expresaron a escala pequeña para producir moléculas de anticuerpo. Las moléculas se evaluaron directamente del sobrenadante de cultivo de tejido y se cuantificaron usando la estación de trabajo Gyrolab. BPC2202, BPC2203, BPC2209 y BPC2210 se expresaron bien.
Se intentó preparar mAbdAb equivalentes usando una secuencia de dAb anti-IL-13 alternativa (DOM10-176-535 -SEQ ID NO: 97). No obstante, en la expresión, estas moléculas se agregaron altamente, de modo tal que no hubo suficiente material para usar en otras pruebas.
5.2 Estudios de factores de estrés de mAbdAb que comprenden DOM10-53-616
Se dispusieron BPC2202, BPC2203, BPC2209, BPC2210 en PBS o tampón de acetato 50 mM y se incubaron a 37°C por un máximo de 14 días. Luego se analizó la presencia de un precipitado visual, agregado soluble y mantenimiento de la concentración de la molécula en disolución.
El análisis subsiguiente indicó que en las disoluciones de PBS y de acetato no hubo reducción en la concentración de proteína en disolución para estas moléculas, se cree que esto se debe a la adsorción de la proteína en las paredes del tubo eppendorf.
BPC2210 también exhibió una reducción en la concentración de proteína en la disolución de tampón de acetato, pero tuvo un ligero incremento en la concentración de proteína después de dos semanas de incubación en disolución de PBS (y esto puede haberse debido a la contaminación bacteriana).
Ejemplo 6 - Diseño y construcción de constructos de mAb-dAb anti-IL4/ anti-TNFa con diversas longitudes del enlazador
Se generó una secuencia de ADN de dAb anti-TNFa por PCR usando cebadores de oligonucleótidos superpuestos. El producto PCR se clonó en un vector de expresión mamífera que contenía la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL4, permitiendo que el dAb anti TNFa se condensara al término C de la cadena pesada mediante un enlazador TVa ApSGS (SEQ ID NO. 103 y 104, secuencias de ADN y proteína de la cadena pesada de BPC2626). La cadena pesada de BPC2626 también se usó como constructo base para clonar diferentes enlazadores (TVAAPSGSx2, TVAAPSGSx3, TVAAPSGSx4) y generar las cadenas pesadas de BPC2651, BPC2652 y BPC2653 respectivamente (SEQ ID. NO: 106 y 107, 108 y 109, 110 y 111, secuencias de ADN y proteína de BPC2651, BPC2652 y BPC2653 respectivamente).
Los plásmidos de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera correspondiente de BPC2626, BPC2651, BPC2652 y BPC2653 se co-transfectaron en forma transitoria en células HEK 293-6E usando 293 fectina (Invitrogen, 12347019). Se añadió una alimentación de triptona a cada cultivo celular 24 después de la transfección, y las células se cosecharon después de 3 a 7 días. Los mAbdAb se purificaron usando una columna de Proteína A antes de evaluarse para actividad. Los constructos preparados y expresados se exponen en la Tabla 6.
Tabla 6
Figure imgf000040_0001
6.1 ELISA de unión a TNFa
Se recubrieron placas de gran unión de 96 pocilios con 1 |jg/ml de TNFa (R&D Systems, 210-TA-010/CF) en disolución salina tamponada con fosfato y se conservaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con disolución salina tamponada con Tris que contenía 0,05% de Tween-20. Se añadieron 100 j l de disolución de bloqueo (1% BSA en disolución salina tamponada con Tris que contenía 0,05% de tampón Tween-20) en cada pocillo, y la placa se incubó durante por lo menos 1 hora a temperatura ambiente. Se efectuó luego otra etapa de lavado. Los anticuerpos biespecíficos purificados y un anticuerpo control negativo se diluyeron sucesivamente en las placas con disolución de bloqueo. Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron. Se diluyó anticuerpo conjugado a peroxidasa específico de cadena ligera kappa anti-humano de cabra H23 (Sigma, A7164) en disolución de bloqueo hasta 1jg/ml y se añadieron 50 j l a cada pocillo. Las placas se incubaron durante una hora. Después de otra etapa de lavado, se añadieron 50 j l de disolución de sustrato OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina) SigmaFast a cada pocillo, y la reacción cesó 15 minutos más tarde por adición de 25 j l de ácido sulfúrico 3M. La absorbancia se leyó a 490 nm usando la lectora de microplacas VersaMax Tunable (Molecular Devices) usando un protocolo de criterio de valoración básico.
La Figura 14 muestra los resultados del ELISA de unión a TNFa y confirma que BPC2626, BPC2651, BPC2652 y BPC2653 se unieron a TNFa con un incremento en la actividad de unión correlacionado con el incremento en las longitudes de los enlazadores. El anticuerpo control negativo no exhibió unión a la diana. Se observó una tendencia al aumento de la potencia de dAb con el aumento de la longitud del enlazador.
6.2 - ELISA de unión a IL4
Se ensayó la unión de estos constructos a IL-4 y debido a un problema técnico con el ensayo, la única conclusión a la que se puede arribar es que se unen todos.
Ejemplo de referencia 7 - Afinidad de unión de mAbsdAb con la longitud variable del enlazador (BPC2221-2231) hacia IL-13 e IL-4 según lo evaluado por análisis BIAcore™
Método
Se inmovilizó IgG anti-humana (GE Healthcare/Biacore) en un chip CM5 por acoplamiento de amina primaria; esta superficie se utilizó como superficie de captura para las moléculas de anticuerpo a ensayar. Se usaron IL4 humana e IL13 humana expresadas en E. coli recombinante a 256, 64, 16, 4 y 1nM, con 0 nM (es decir, tampón solo) para duplicar la referencia a las curvas de unión. La regeneración de la superficie de IgG anti-humana fue con una inyección de ácido fosfórico 100 mM seguida de inyección de MgCh 3M. El ensayo se llevó a cabo a 25°C usando HBS-EP como tampón. Los datos se ajustaron a un modelo 1:1 inherente al software de análisis Biacore T100. Los resultados de unión a IL13 humana se exponen en la Tabla 7 y los resultados de la unión a IL4 humana se exponen en la Tabla 8.
Tabla 7
Figure imgf000041_0001
Tabla 8
Figure imgf000041_0002
En términos generales, la calidad de la ejecución fue deficiente para la unión a IL4, el análisis se complicó por el hecho de que a las más altas concentraciones hubo unión no específica a la superficie del chip
Ejemplo de referencia 8 - Afinidad de unión de mAbdab que comprenden 616 dAb hacia IL-13 e IL-4 según lo evaluado por análisis BIAcore™
Los mAbdAb BPC2201-2215, BPC2217-2220 y BPC2243, cada uno de los cuales comprende el anticuerpo de dominio DOM10-53-616 anti-IL-13 (SEQ ID NO:1) se ensayaron con BIAcore. Todos los mAbdAb se unieron a IL-13 e IL-4 pero lo hicieron tan estrechamente que fue imposible medir las constantes de disociación.
Ejemplo 9 - Afinidad de unión de mAbdAb con longitud variable del enlazador (BPC2211-2231 & BPC2234-2237 yBPC2241-2242) hacia IL-13 e IL-4 según lo evaluado por análisis BIAcore™
Método
Se inmovilizó IgG anti-humana (GE Healthcare/Biacore) en un chip CM5 por acoplamiento de amina primaria; esta superficie se usó como una superficie de captura para las moléculas de anticuerpo a ensayar. Se usó IL4 expresada en E. coli recombinante a 256, 64, 16, 4 y 1nM y se usó IL13 expresada en E. coli recombinante a 256 nM solamente, con 0 nM (es decir, tampón solo) utilizado para duplicar la referencia de las curvas de unión tanto de la unión de IL4 como de IL13. La regeneración de la superficie de IgG anti-humana se llevó a cabo con una inyección de ácido fosfórico 100 mM seguida de una inyección de MgCh 3M. El ensayo se llevó a cabo a 25°C usando HBS-EP como el tampón de corrida. Los datos se ajustaron a un modelo 1:1 inherente al software de análisis Biacore T100.
Los resultados de la unión a IL13 humana e IL4 humana se exponen en la Tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000042_0001
Se observó cierta unión no específica con las más altas concentraciones de IL4 expresada en E. coli recombinante, lo cual afectó la calidad de los datos
Ejemplo de referencia 10 - Afinidad de unión de mAbdAb que comprenden mAb de IL-13 CDRH3 original con longitudes variables del enlazador (BPC2222, BPC2223 yBPC2230-2231) hacia IL-13 e IL-4 según lo evaluado por análisis BIAcore™
Método
Se inmovilizó Proteína A en un chip C1 por acoplamiento de amina primaria; esta superficie se utilizó como superficie de captura para las moléculas de anticuerpo a ensayar. IL13 expresada en E. coli recombinante se usó a 256, 64, 16, 4 y 1nM, y se usó IL4 expresada en E. coli recombinante a 64, 16, 4, 1 y 0,25 nM, con 0 nM (es decir, tampón solo) para duplicar la referencia a las curvas de unión tanto de la unión de IL4 como de IL13. La regeneración de la superficie de Proteína A fue con ácido fosfórico 100 mM. El ensayo se realizó a 25°C usando HBS-EP como tampón de corrida. Los datos se ajustaron a un modelo 1:1 inherente al software de análisis Biacore T100.
Los resultados de la unión a IL13 humana se muestran en la Tabla 10 y el resultado de la unión a IL4 humana se muestra en la Tabla 11.
Tabla 10
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Tabla 11
Figure imgf000043_0002
Ejemplo de referencia 11 - Afinidad de unión de mAbdAb que comprenden mAb de IL-13 CDRH3 original con longitudes variables del enlazador (BPC2222, BPC2231) y variante anti-mAb de IL-13 CDRH3 con longitudes variables del enlazador (BPC1085-1087) hacia IL-13 e IL-4 según lo evaluado por análisis BIAcore™
Método
Se inmovilizó Proteína A en un chip CM5 por acoplamiento de amina primaria; esta superficie se usó como superficie de captura para las moléculas de anticuerpo a ensayar. Se empleó IL13 humana expresada en E. coli a 256 nM solamente, se usó IL4 humana expresada en E. coli recombinante a 64, 16, 4 y 1 nM, con 0 nM (es decir, tampón solo) para duplicar la referencia a las curvas de unión para la unión de IL4 e IL13. La regeneración de la superficie de Proteína A fue con NaOH 50 mM. El ensayo se llevó a cabo a 25°C usando HBS-EP como tampón de corrida. Los datos se ajustaron a un modelo 1:1 inherente al software de análisis Biacore T100.
Los resultados de la unión a IL13 humana se exponen en la Tabla, y los resultados de la unión a IL4 humana se exponen en la Tabla 13.
Tabla 12
Figure imgf000043_0003
Las constantes de asociación para BPC108b y BPC1087 están más allá de la sensibilidad de Biacore, pero el hecho de que no pudimos analizar en forma precisa estos datos indica que probablemente la interacción con IL4 sea de gran afinidad con una rápida constante de asociación.
Tabla 13
Figure imgf000044_0001
Ejemplo de referencia 12 - Estudios de factores de estrés de
Se dispuso una serie de mAbdAb en PBS o tampón de acetato 50 mM y se incubó a 37°C por hasta 14 días. Luego se analizó la presencia de un precipitado visual, agregado soluble y mantenimiento de la concentración de la molécula en disolución.
Los resultados indican que los mAbdAb que comprenden el dAb mutado (BPC1085, 1086, 1087) se comportaron de manera similar al dAb no mutado (BPC2222, 2223, 2230, 2231), ambas categorías de mAbdAb parecieron estables tanto en PBS como en tampón de acetato durante el período de incubación de dos semanas a 37°C, como lo indica la ausencia de cambio en la concentración de la proteína en las disoluciones. Además, se observó poco o ningún cambio para los niveles de agregados en las disolución y no se observó precipitación.
Ejemplo de referencia 13 - Efecto de longitud del enlazador en PK de rata y cyno
Se investigó la farmacocinética de BPC1085, BPC1086 y BPC1087 en estudios separados después de la administración IV a ratas. La PK de BPC1085 también se investigó en monos cynomologus después de la administración IV.
Se halló que la PK de las tres moléculas en la rata y de BPC1085 en el mono era coherente con aquella de un mAb estándar.
Ejemplo de referencia 14
Se expresó un panel de mAbdab a una diana diferente con un número de enlazadores con longitudes diferentes. Los sobrenadantes no caracterizados se sometieron a algunos experimentos de unión ELISA y estos resultados preliminares indican tendencias similares a aquellas descritas en este documento entre las distintas longitudes de los enlazadores.
Se expresó un segundo panel de mAbdab a una diana diferente con un número de enlazadores de distintas longitudes. Los sobrenadantes no caracterizados se sometieron a algunos experimentos de unión ELISA y estos resultados preliminares indican variabilidad entre las distintas longitudes de los enlazadores y dAb.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: un gráfico que muestra la unión de las proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con enlazadores GS y GS(TVAAPSGS)n=1 -4 (BPC 2201, 2202, 2203, 2209 y BPC 2210) a IL-4 humana según lo determinado por ELISA.
Figura 2: un gráfico que muestra la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con enlazadores GS y GS(TVAAPSGS)n=1-4 (BPC 2201, 2202, 2203, 2209 y BPC 2210) a IL-13 humana según lo determinado por ELISA.
Figura 3: un gráfico que muestra la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con enlazadores (PAS)n=1-aGS y (G4 S)n=1 -3 (BPC 2204 a BPC 2208 y BPC 2220) a IL-4 humana según lo determinado por ELISA. Figura 4: un gráfico que muestra la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con enlazadores (PAS)n=1 -3GS y (G4 S)n=1 -3 (BPC 2204 a BPC 2208 y BPC 2220) a IL-13 humana según lo determinado por ELISA. Figura 5: un gráfico que muestra la unión de proteínas de unión al antígeno biespecífico purificado con enlazadores (PAVPPP)n=1 -3GS, (TVSDVP)n=1 -2GS y (TGLDSP)n=1 -3GS (BPC 2211 a BPC 2215 y BPC 2217 a BPC 2219) a IL-4 humana según lo determinado por ELISA.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión al antígeno que comprende un andamio de inmunoglobulina (Ig) que está enlazado a uno o más dominios variables sencillos de inmunoglobulina en donde la proteína de unión al antígeno posee por lo menos dos sitios de unión al antígeno, en donde por lo menos uno de los cuales proviene de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina y por lo menos uno de los cuales proviene de un dominio de VH/VL apareado, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina está enlazado al andamio de Ig por un enlazador de péptidos que comprende la SEQ ID NO: 78 o múltiplos de dicho enlazador.
2. La proteína de unión al antígeno según la reivindicación 1, en donde el enlazador es (TGLDSP)n(GS)m, en donde n = 1-10, y m = 0-4.
3. La proteína de unión al antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dAb humano.
4. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína de unión al antígeno tiene especificidad hacia más de un antígeno.
5. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente, en donde el primer sitio de unión tiene especificidad hacia un primer epítopo en un antígeno y el segundo sitio de unión tiene especificidad hacia un segundo epítopo en el mismo antígeno.
6. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína de unión al antígeno es capaz de unirse a IL-13.
7. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína de unión al antígeno es capaz de unirse a IL-13 e IL-4.
8. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente, en donde el andamio de Ig es un andamio de IgG.
9. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente, en donde por lo menos uno de los dominios de unión al epítopo se une a albúmina de suero humana.
10. La proteína de unión al antígeno según cualquier reivindicación precedente para uso en medicina.
11. Una célula hospedante aislada transformada o transfectada que comprende una o más secuencias de polinucleótidos que codifican la proteína de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. Un método para la producción de una proteína de unión al antígeno según las reivindicaciones 1 a 9 en donde el método comprende la etapa de cultivar una célula hospedante según la reivindicación 11 y aislar la proteína de unión al antígeno.
13. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión al antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un método para mejorar la potencia de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina cuando se sujeta a un andamio de inmunoglobulina (Ig), en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina posee potencia reducida cuando se sujeta a un andamio de Ig sin un enlazador, en comparación con su potencia como dominio variable sencillo de inmunoglobulina desnudo, que comprende la etapa de añadir un enlazador de péptidos entre el andamio de Ig y el dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en donde el enlazador de péptidos comprende la SEQ ID NO: 78 o múltiplos de dicho enlazador.
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