ES2708807T3 - Biomarcadores de la lipogénesis de novo y métodos que los emplean - Google Patents
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Abstract
Un método para calcular la lipogénesis de novo en un sujeto, que comprende: medir los niveles de tres o más biomarcadores en una muestra biológica, en el que los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en el nivel total de ácido mirístico (14:0), el nivel total de ácido miristoleico (14:1n5), el nivel total de palmitato (16:0), el nivel total de palmitoleato (16:1n7), el nivel total de ácido sapiénico (16:1n10), el nivel total de escualeno, el nivel total de linoleato (18:2n6), el nivel total de ácido araquidónico (20:4n6), el nivel total de ácido docosaheaenoico (22:6n3), el nivel de ácido mirístico (14:0) en una o más clases de lípidos, el nivel de ácido miristoleico (14:1n5) en una o más clases de lípidos, el nivel de palmitato (16:0) en una o más clases de lípidos, el nivel de palmitoleato (16:1n7) en una o más clases de lípidos, el nivel de ácido sapiénico (16:1n10) en una o más clases de lípidos, el nivel de escualeno en una o más clases de lípidos, el nivel de linoleato (18:2n6) en una o más clases de lípidos, el nivel de ácido araquidónico (20:4n6) en una o más clases de lípidos, y el nivel de ácido docosaheaenoico (22:6n3) en una o más clases de lípidos en una muestra recolectada de un sujeto; y usar uno de los siguiente modelos para generar una puntuación de índice de lipogénesis de novo para calcular la lipogénesis de novo en el sujeto: (i) DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6) (ii) DNL = (a(16:0)+b(16:1n7))/c(18:2n6) (iii) DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5) (iv) DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)-f(20:4n6)-g(22:6n3) (v) DNL = a(16:0)+b(16:1n10)-c(18:2n6), o (vi) DNL = a(16:0)+b(16:1n10)-c(escualeno) en los que a, b, c, d, e, f, y g son números constantes; (16:0), (16:1n7), (18:2n6), (14:0), (14:1n5), (20:4n6), (22:6n3), (16:1n10), y escualeno son valores medidos del analito de biomarcador; y DNL es la puntuación del índice de lipogénesis de novo predicha.
Description
DESCRIPCION
Biomarcadores de la lipogenesis de novo y metodos que los emplean
Campo
En la presente se describen biomarcadores, metodos para identificar biomarcadores correlacionados con la lipogenesis de novo y metodos basados en estos biomarcadores.
Antecedentes
La lipogenesis de novo ("de novo lipogenesis", DNL) es el proceso fisiologico que consiste en sintetizar acidos grasos a partir de un sustrato, un proceso que en los seres humanos se produce principalmente en el tngado. El proceso ha resultado diffcil de evaluar in vivo, debido a que la cantidad de grasa en la sangre no esta en una proporcion directa con la DNL. La lipogenesis aporta una minona de los acidos grasos presentes en seres humanos; la mayona de los acidos grasos provienen de la dieta, pero el proceso de la lipogenesis puede ser un indicador importante del estado de salud. Una medicion basada en la sangre de la lipogenesis permitina medir el impacto de la dieta, el estilo de vida y las terapias sobre la DNL y la evaluacion de la contribucion de la DNL a enfermedades. Los niveles absolutos de los acidos grasos individuales en sangre no son indicativos de DNL, debido a que la mayona de los acidos grasos en seres humanos provienen de la dieta, incluyendo los acidos grasos que tambien son los productos directos de la lipogenesis. Asf, una medicion directa de un acido graso individual en sangre no puede diferenciar entre un acido graso de la dieta y un acido graso derivado de DNL. Ademas, el nivel absoluto de todos los lfpidos en sangre puede ser alto o bajo dependiendo de procesos biologicos no relacionados con la DNL (por ejemplo, una eliminacion lenta del VLDL).
Para solucionar esta limitacion, los procedimientos actuales para medir la lipogenesis de novo implican el uso de isotopos estables, en particular a traves de la ingestion de agua pesada. Por tanto, este metodo no se emplea de modo general en la clmica.
Las enfermedades que implican a la DNL incluye diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica ("non-alcoholic steatohepatitis", NASH), cancer, enfermedad cardiovascular (hipertrigliceridemia), y trastornos de la piel. Resulta deseable emplear metodos mmimamente invasivos o no invasivos para medir el nivel de acidos grasos en sangre y/o la piel que son indicativos de la lipogenesis de novo en seres humanos, y normalizar el efecto del contenido total de lfpidos en sangre en la evaluacion empleando estos valores medidos para determinar la cantidad de lipogenesis de novo en un individuo.
Lyons Jones et al., Am. J. Med. Genet., parte A, 161A:1860-1865 (2013) describen metodos para evaluar el metabolismo de lfpidos en la gastrosquisis. Peter et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (2011), 96(7):E1126-E1130 investigan la relacion entre la expresion de glucoquinasa y marcadores de la lipogenesis, y el uso del mdice de DNL de los acidos grasos C16:0/Cl8:2. El documento US2009/0239253 describe el uso de diversos acidos grasos en metodos para evaluar la lipogenesis.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para determinar el nivel de lipogenesis de novo en un sujeto como se reivindica en la reivindicacion 1. Tambien se describe un metodo para determinar el nivel de lipogenesis de novo en un sujeto, comprendiendo dicho metodo analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la lipogenesis de novo (DNL) en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; y comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para determinar el nivel de lipogenesis de novo en el sujeto.
Tambien se describe un metodo para determinar si un sujeto esta predispuesto o esta en riesgo de desarrollar enfermedades que estan relacionadas con la lipogenesis de novo (por ejemplo, diabetes, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, hipertrigliceridemia), comprendiendo dicho metodo analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la lipogenesis de novo (DNL) en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; y comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para determinar si el sujeto esta predispuesto a desarrollar dicha enfermedad relacionado con la lipogenesis de novo.
Tambien se describe un metodo para controlar el inicio/avance/regresion de una enfermedad o un trastorno relacionado con la DNL en un sujeto, comprendiendo dicho metodo analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la DNL en la muestra, en el que dichos
uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; y comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia de avance de la DNL y/o regresion de la DNL para controlar el inicio/avance/regresion de la enfermedad o el trastorno relacionado con la DNL en el sujeto.
Tambien se describe un metodo para predecir si un sujeto padece una enfermedad o un trastorno relacionado con la DNL, que comprende analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la DNL en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; y comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para predecir si el sujeto padece una enfermedad o un trastorno relacionado con la DNL.
Las mediciones de dichos uno o mas biomarcadores de DNL, o sus combinaciones, pueden usarse para generar un mdice de DNL que puede emplearse para evaluar la DNL en un sujeto. El metodo comprende analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones, generar un modelo matematico que comprende los niveles medidos de dichos uno o mas biomarcadores (mdice de DNL), calcular una puntuacion del mdice de DNL basandose en el mdice de DNL, y comparar la puntuacion del mdice de DNL con niveles de referencia de DNL para evaluar la DNL en el sujeto.
Tambien se describe un metodo para controlar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad o un trastorno relacionado con la DNL, comprendiendo dicho metodo analizar una primera muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la DNL en la muestra, obteniendose dicha primera muestra del sujeto en un primer momento, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; tratar el sujeto para una enfermedad o un trastorno relacionado con la DNL; analizar una segunda muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores, obteniendose dicha segunda muestra del sujeto en un segundo momento despues del tratamiento; comparar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores en la primera muestra con el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la segunda muestra para evaluar la eficacia del tratamiento para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con la DNL.
Tambien se describen metodos para evaluar la lipogenesis en la piel y su relacion con la funcion de la piel (por ejemplo, para evaluar la produccion de sebo, el riesgo de acne, etc.), comprendiendo dicho metodo analizar una muestra de piel, epidermica, de celulas de la piel o de sebo procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la DNL en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; y comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para evaluar la lipogenesis en la piel.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un ejemplo de un algoritmo medico para la gestion de pacientes que ilustra si el mdice de DNL seria util en la practica cimica para determinar niveles aberrantes de lipogenesis de novo, el tratamiento recomendado, el control de la lipogenesis de novo y el control del efecto de una intervencion de tratamiento sobre la lipogenesis de novo.
La figura 2 es una grafica que muestra las puntuaciones del mdice de DNL de celulas tratadas con un inhibidor de DNL empleando la fraccion de fosfolfpidos de celulas. La caja representa el 50% intermedio de la distribucion, y las “prolongaciones” superiores e inferiores representan la extension completa de los datos. El guion se refiere al promedio y el cfrculo a los valores atfpicos. El eje de ordenadas indica la mediana del valor escalado.
La figura 3 es una grafica de cajas que muestra las puntuaciones del mdice de DNL de celulas tratadas con un inhibidor de DNL empleando la fraccion de trigliceridos de celulas.
La figura 4 es una grafica de cajas que muestra las puntuaciones del mdice de DNL de celulas tratadas con las dosis indicadas de un inhibidor de DNL.
La figura 5 es una grafica de cajas que muestra las puntuaciones del mdice de DNL de seres humanos con NASH o NAFLD comparados con sujetos control normales.
La figura 6 muestra el area bajo la curva ("area under the curve", AUC) de tres modelos para predecir la diabetes. Las curvas caractensticas de la actuacion del receptor muestran la mayor capacidad del mdice de DNL para predecir la diabetes, ademas de la respuesta aguda a la insulina ("acute insulin response", AIR), y la sensibilidad a la insulina (Si).
La figura 7 es una grafica de cajas que muestra las puntuaciones del mdice de DNL de sebo de una piel tratada con un placebo o con un inhibidor de la DNL usando el mdice DNL de sebo 1 y el mdice de DNL 2.
La figura 8 es una grafica que muestra la correlacion de las puntuaciones del mdice de DNL empleando el mdice de DNL 1, el mdice de DNL 2 y el mdice de DNL 3 de muestras de plasma humano con la contribucion fraccionaria de la lipogenesis de novo (fDNL) en los pacientes.
La figura 9 son graficas de cajas que muestran la distribucion de valores para las puntuaciones del mdice de DNL para pacientes con NASH y sin NASH. Los pacientes con NASH estan a la izquierda y los pacientes sin NASH estan a la derecha. A. fndice de DNL 1, el valor de p para la asociacion con las puntuaciones del mdice de DNL 1 y el diagnostico de NASH fue de 0,027. B. fndice de DNL 2, el valor de p para la asociacion con las puntuaciones del mdice de DNL 2 y el diagnostico de NASH fue de 0,002. C. fndice de d Nl 3, el valor de p para la asociacion con las puntuaciones del mdice de DNL 3 y el diagnostico de NASH fue de 0,004.
La figura 10 son graficas de cajas que muestran la distribucion de valores para las puntuaciones del mdice de DNL para pacientes con grados de esteatosis. A. Es la grafica del mdice de DNL 1; B. Es la grafica del mdice de DNL 2; C. Es la grafica del mdice de DNL 3. La puntuacion del mdice de DNL esta en el eje de ordenadas y el grado de esteatosis en el eje de abscisas. El valor de p para la asociacion con las puntuaciones del mdice de DNL 1 y el diagnostico de NASH fue <0,001. El valor de p para la asociacion con las puntuaciones del mdice de DNL 2 y el diagnostico de NASH fue <0,001. El valor de p para la asociacion con las puntuaciones del mdice de DNL 3 y el diagnostico de NASH fue <0,001.
Descripcion detallada de la invencion
En la presente se describen biomarcadores de la DNL; metodos para determinar la DNL; metodos para diagnosticar enfermedades relacionadas con la DNL; metodos para determinar la predisposicion a enfermedades relacionadas con la DNL; metodos para controlar el avance/regresion de enfermedades relacionadas con la DNL; metodos para predecir enfermedades o trastornos relacionados con la DNL; metodos para generar un mdice de DNL; metodos para controlar la eficacia de tratamientos para enfermedades relacionadas con la DNL; asf como otros metodos basados en biomarcadores del DNL.
Sin embargo, antes de describir con mas detalle esta invencion, primero se definiran los siguientes terminos y expresiones.
Definiciones:
La “lipogenesis de novo” o “DNL” se refiere al proceso fisiologico que consiste en sintetizar acidos grasos a partir de un sustrato.
La “DNL fraccionaria” o “fDNL” es una medicion de la fraccion de los acidos grasos recien sintetizados en VLDL-triacilglicerol. El metodo emplea isotopos estables.
El “mdice de DNL” se refiere a una medicion de la lipogenesis de novo basada en los biomarcadores de la DNL y en algoritmos medicos descritos en la presente que permiten la evaluacion de la lipogenesis de novo in vivo. El “mdice de DNL” se refiere a una ecuacion matematica que emplea los biomarcadores de la DNL. La “puntuacion del mdice de DNL” se refiere al valor obtenido del mdice de DNL o como resultado de emplear el mdice de DNL.
Un “algoritmo medico” o “algoritmo de gestion del paciente” se refiere a cualquier calculo, formula, estudio estadfstico, nomograma o tabla de consulta util en la asistencia sanitaria. Los algoritmos medicos incluyen estrategias de arboles de decision para el tratamiento (por ejemplo, si los smtomas A, B, y C son evidentes, entonces usar el tratamiento X) y para el diagnostico (por ejemplo, si los smtomas E, F, y G son evidentes, entonces el diagnostico es Z o el ensayo de diagnostico que se debe realizar es Y) en la asistencia sanitaria. Los algoritmos medicos pueden incluir nomogramas de diagnostico o diagramas de flujo de diagnostico en forma, por ejemplo, de un arbol de decision binario.
Una “enfermedad relacionada con la DNL” o “trastorno relacionado con la DNL”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la diabetes y trastornos relacionados, que incluyen la prediabetes, la resistencia a la insulina, y la diabetes de tipo 2, asf como la obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica ("non-alcoholic steatohepatitis", NASH), cancer, y enfermedad cardiovascular, que incluye hipertrigliceridemia, aterosclerosis, cardiomiopatfa, y trastornos de la piel.
Una “enfermedad cardiovascular” se refiere a cualquier enfermedad del corazon o los vasos sangumeos. La enfermedad cardiovascular o cardfaca incluye, pero no se limita, por ejemplo, a angina, arritmia, enfermedad de la arteria coronaria ("coronary artery disease", CAD), enfermedad cardfaca coronaria, cardiomiopatfa (que incluye cardiomiopatfa dilatada, cardiomiopatfa restrictiva, cardiomiopatfa ventricular derecha arritmogenica, y cardiomiopatfa diabetica), ataque al corazon (infarto de miocardio), insuficiencia cardfaca, cardiomiopatfa hipertrofica, regurgitacion mitral, prolapso de la valvula mitral, estenosis pulmonar, etc. La enfermedad de los vasos sangumeos incluye, pero no se limita, por ejemplo, a enfermedad vascular periferica, enfermedad de las arterias,
enfermedad de la arteria carotida, trombosis de venas profundas, enfermedades venosas, aterosclerosis, etc.
La “diabetes” se refiere a un grupo de enfermedades metabolicas caracterizadas por unos niveles altos de azucar en sangre (glucosa) que surgen como consecuencia de defectos en la secrecion o la accion de la insulina, o de ambos. La “diabetes de tipo 2” se refiere a uno de los dos tipos principales de diabetes, el tipo en el que las celulas beta del pancreas producen insulina, al menos en los estadios tempranos de la enfermedad, pero el cuerpo es incapaz de utilizarla de modo eficaz porque las celulas del cuerpo son resistentes a la accion de la insulina. En estadios posteriores de la enfermedad, las celulas beta pueden dejar de producir insulina. La diabetes de tipo 2 tambien se conoce como diabetes resistente a la insulina, diabetes no dependiente de insulina y diabetes de aparicion en la etapa adulta.
La “prediabetes” se refiere a uno o mas trastornos diabeticos tempranos, que incluyen una utilizacion alterada de la glucosa, unos niveles anomalos o alterados de glucosa en ayunas, una tolerancia alterada a la glucosa, una sensibilidad alterada a la insulina y la resistencia a la insulina.
La “resistencia a la insulina” se refiere al trastorno en el que las celulas se convierten en resistentes a los efectos de la insulina —una hormona que regula la captacion de glucosa hacia el interior de las celulas— o cuando la cantidad de insulina producida es insuficiente para mantener un nivel normal de glucosa. La capacidad de las celulas para responder a la accion de la insulina para estimular el transporte del azucar glucosa desde la sangre hacia los musculos y otros tejidos disminuye (es decir, disminuye la sensibilidad a la insulina). Con el tiempo, el pancreas produce mucha mas insulina de lo normal y las celulas continuan siendo resistentes. Siempre que se produzca la suficiente insulina para superar esta resistencia, los niveles de glucosa en sangre permanecen normales. Cuando el pancreas ya no es capaz de seguir este ritmo, la glucosa en sangre empieza a aumentar, dando como resultado una diabetes. La resistencia a la insulina vana desde normal (sensible a la insulina) a resistente a la insulina ("insulin resistant", IR).
La “sensibilidad a la insulina” o “Si” se refiere a la capacidad de las celulas para responder a los efectos de la insulina para regular la captacion y la utilizacion de glucosa. La sensibilidad a la insulina vana de normal a resistente a la insulina (IR).
La “utilizacion de glucosa” se refiere a la absorcion de glucosa desde la sangre por el musculo y las celulas grasas, y a la utilizacion del azucar para el metabolismo celular. La captacion de glucosa hacia el interior de las celulas es estimulada por la insulina.
La “obesidad” se refiere a un trastorno cronico definido por una cantidad en exceso de grasa corporal. La cantidad normal de grasa corporal (expresada como porcentaje de peso corporal) es de entre 25-30% en mujeres y de 18 23% en hombres. Las mujeres con mas del 30% de grasa corporal y los hombres con mas del 25% de grasa corporal se consideran obesos.
Los “trastornos de la piel” se refieren a trastornos que afectan a la produccion o a la calidad del sebo, e incluyen acne, eccema seborreico y piel aceitosa, o trastornos que afectan al estrato corneo, que incluyen psoriasis, rosacea, piel seca, caspa, funcion de barrera tudrica, etc. Los trastornos de la piel relacionados con la lipogenesis de novo tambien pueden incluir canceres, tales como melanomas.
El “mdice de masa corporal" ("Body Mass Index", BMI) se refiere al calculo que emplea la altura y el peso de un individuo para calcular la cantidad de grasa corporal del individuo. Un exceso de grasa corporal (por ejemplo, obesidad) puede conducir a enfermedades y otros problemas de salud. El BMI es la medicion elegida por muchos medicos e investigadores que estudian la obesidad. El BMI se calcula empleando una formula matematica que considera la altura y el peso del individuo. El BMI es igual al peso de la persona en kilogramos dividido entre la altura en metros al cuadrado (BMI = kg/m2). Se considera que los sujetos que tienen un BMI menor que 19 tienen un peso demasiado bajo, mientras que se considera que los que tienen un BMI de entre 19 y 25 tienen un peso normal, se considera en general que los que tienen un BMI de entre 25 y 29 tienen sobrepeso, y generalmente se considera que los individuos con un BMI de 30 o mas son obesos. La obesidad morbida se refiere a un sujeto que tiene un BMI de 40 o mayor.
Una “muestra” o “muestra biologica” o “especimen” significa un material biologico aislado de un sujeto. La muestra biologica puede contener cualquier material biologico adecuado para detectar los biomarcadores deseados y puede comprender material celular y/o no celular procedente del sujeto. La muestras pueden aislarse a partir de cualquier tejido o fluido biologico adecuado, tal como, por ejemplo, sangre, plasma sangumeo, suero, piel, tejido epidermico, tejido adiposo, tejido aortico, tejido hepatico, orina, sebo o muestras de celulas.
Un “sujeto” significa cualquier animal, pero preferiblemente es un mairnfero, tal como, por ejemplo, un ser humano, mono, primate no humano, rata, raton, vaca, perro, gato, cerdo, caballo o conejo.
El “nivel” de uno o mas biomarcadores significa la cantidad o concentracion absoluta o relativa del biomarcador en la muestra.
Un “nivel de referenda” de un biomarcador significa un nivel del biomarcador que es indicativo de un estado de enfermedad o fenotipo concretos, o la ausencia de estos, asf como de combinaciones de estados de enfermedad, fenotipos o la ausencia de estos. Un nivel de referencia “positivo” de un biomarcador significa un nivel que es indicativo de un estado de enfermedad o fenotipo concretos. Un nivel de referencia “negativo” de un biomarcador significa un nivel que es indicativo de la ausencia de un estado de enfermedad o fenotipo concretos. Por ejemplo, un “nivel de referencia DNL-positivo” de un biomarcador significa un nivel del biomarcador que es indicativo de un aumento en la medicion de la DNL en un sujeto, y un “nivel de referencia DNL-negativo” de un biomarcador significa un nivel del biomarcador que es indicativo de una medicion disminuida de la DNL en un sujeto. Como otro ejemplo, un “nivel de referencia DNL-positivo al avance” de un biomarcador significa un nivel del biomarcador que es indicativo del avance de la DNL en un sujeto, y un “nivel de referencia DNL-negativo a la regresion” de un biomarcador significa un nivel del biomarcador que es indicativo de la regresion de la DNL. Un “nivel de referencia” de un biomarcador puede ser una cantidad o concentracion absoluta o relativa del biomarcador, la presencia o ausencia del biomarcador, un intervalo de cantidad o concentracion del biomarcador, una cantidad o concentracion minima y/o maxima del biomarcador, una cantidad o concentracion promedio del biomarcador y/o la mediana de una cantidad o concentracion del biomarcador; y, ademas, los “niveles de referencia” de combinaciones de biomarcadores tambien pueden ser proporciones de cantidades o concentraciones absolutas o relativas de dos o mas biomarcadores con respecto a los demas. Los niveles de referencia positivos y negativos apropiados de biomarcadores para un estado de enfermedad o fenotipo concreto, o su ausencia, pueden determinarse midiendo los niveles de los biomarcadores deseados en uno o mas sujetos apropiados, y estos niveles de referencia pueden adaptarse a poblaciones espedficas de sujetos (por ejemplo, un nivel de referencia puede hacerse corresponder con la edad, de modo que puedan realizarse comparaciones entre los niveles de biomarcadores en muestras de sujetos de cierta edad y los niveles de referencia para un estado de enfermedad o fenotipo concreto, o su ausencia, en cierto grupo de edad; de modo similar, un nivel de referencia puede hacerse corresponder con el genero o etnia/raza).
Un “marcador DNL-positivo” se refiere a un biomarcador de la lipogenesis de novo, cuyo nivel se correlaciona positivamente con la DNL (es decir, el nivel del biomarcador aumenta a medida que aumenta la DNL).
Un “marcador DNL-negativo” se refiere a un biomarcador de la lipogenesis de novo, cuyo nivel se correlaciona negativamente con la DNL (es decir, el nivel del biomarcador disminuye a medida que disminuye la DNL).
I. Biomarcadores
Los biomarcadores para su uso en los metodos descritos en la presente relacionados con la DNL incluyen los acidos grasos 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones y subconjuntos. Los biomarcadores pueden medirse dentro de una clase de lfpidos espedfica (por ejemplo, triacilgliceridos (TG), fosfolfpidos (PL), esteres de colesterilo (CE), digliceridos (DG), acidos grasos libres (FA), lisofosfatidilcolinas (LY), fosfatidilcolinas (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), esfingomielinas (SM), esteres cerosos (WE), etc.) o como parte de un analisis de acidos grasos totales (que incluye todas las clases de lfpidos en el analisis). Los acidos grasos pueden medirse en cualquier muestra biologica. Los acidos grasos 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12 o complejos de lfpidos intactos (por ejemplo, especies de triacilgliceridos o fosfolfpidos) que contienen estos acidos grasos son marcadores positivos de la DNL (es decir, un aumento en la DNL esta asociado con niveles elevados de los biomarcadores), y los acidos grasos 18:2n6, 20:4n6, 22:6n3, o complejos de lfpidos intactos que contienen estos acidos grasos o escualeno son marcadores negativos de la DNL (es decir, un aumento en la DNL esta asociado con niveles reducidos de los biomarcadores). En una realizacion, los biomarcadores incluyen 16:0, 16:1n7, y 18:2n6, y sus combinaciones.
Ademas, los metodos descritos en la presente que emplean los biomarcadores 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3, y sus combinaciones, pueden usarse en combinacion con mediciones de diagnostico clmicas de las enfermedades relacionadas con la DNL. Las combinaciones con diagnosticos clmicos pueden facilitar los metodos descritos o confirmar los resultados de los metodos descritos (por ejemplo, facilitar o confirmar el diagnostico, controlar el avance o la regresion y/o determinar la predisposicion a enfermedades relacionadas con la DNL). Los metodos descritos en la presente que emplean los biomarcadores 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3, y sus combinaciones, pueden usarse en combinacion con la informacion del paciente, tal como, por ejemplo, genero, raza, edad, historia medica, historia medica familiar, factores de riesgo, etc.
Los metodos para medir los acidos grasos descritos en la presente como componentes de una clase de lfpidos complejos intactos (por ejemplo, especies de triacilgliceridos o fosfolfpidos, tales como PC16:0|16:1n7) tambien se contemplan. La clase de lfpidos puede ser, por ejemplo, los lfpidos neutros, fosfolfpidos, acidos grasos libres, acidos grasos totales, trigliceridos, esteres de colesterilo, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, digliceridos, lisofosfatidilcolinas o esteres cerosos. En algunas realizaciones, la clase de lfpidos se selecciona del grupo que consiste en lfpidos neutros, fosfolfpidos, acidos grasos libres, acidos grasos totales, trigliceridos, esteres de colesterol, fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas. En algunas realizaciones, la clase de lfpidos se selecciona del grupo que consiste en lfpidos neutros, fosfolfpidos, acidos grasos totales y esteres de colesterol. En algunas realizaciones, la clase de lfpidos se selecciona del grupo que consiste en acidos grasos libres, acidos grasos totales, esteres de colesterol, fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas. En algunas realizaciones, la clase de lfpidos se
selecciona del grupo que consiste en trigliceridos, acidos grasos libres, y esteres cerosos. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los acidos grasos libres. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los acidos grasos totales. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los trigliceridos. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los esteres de colesterilo. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son las fosfatidilcolinas. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son las fosfatidiletanolaminas. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los fosfoffpidos. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los ffpidos neutros. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los digliceridos. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son las esfingomielinas. En algunas realizaciones, la clase de ffpidos son los esteres cerosos. Los prefijos “TG”, “FA”, “PC”, “PE”, y “CE” se corresponden con acidos grasos presentes dentro de los trigliceridos, acidos grasos libres, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas y esteres de colesterol, respectivamente. Asf, “TG14:0” indica el acido graso 14:0 presente dentro de trigliceridos.
II. Evaluacion de la DNL
Los biomarcadores de DNL pueden usarse para evaluar (o ayudar a evaluar) la DNL en un sujeto. Se entendera que los biomarcadores identificados pueden usarse para evaluar la DNL en cualquier sujeto y esto incluye la evaluacion de la DNL en un sujeto sano (por ejemplo, como parte de una evaluacion de la salud ffsica rutinaria), en un sujeto asintomatico, en un sujeto que se sospecha que padece o que esta en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la DNL, o en un sujeto en respuesta a una composicion o a una intervencion terapeutica. Tambien se entendera que un sujeto puede someterse a una o mas evaluaciones de la DNL.
En un ejemplo de metodo, la evaluacion de la DNL en un sujeto comprende (1) analizar una muestra biologica obtenida de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la DNL en la muestra, y (2) comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con uno o mas niveles de referencia de dichos uno o mas biomarcadores para determinar el nivel de la DNL en el sujeto. Dichos uno o mas biomarcadores pueden seleccionarse del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3, y sus combinaciones. Por ejemplo, el nivel o niveles de un biomarcador, dos o mas biomarcadores, tres o mas biomarcadores, cuatro o mas biomarcadores, cinco o mas biomarcadores, seis o mas biomarcadores, etc., incluyendo una combinacion de todos los biomarcadores listados, puede usarse para evaluar la DNL. La determinacion de los niveles de combinaciones de los biomarcadores puede permitir lograr una mayor sensibilidad y especificidad en los metodos descritos en la presente. Por ejemplo, un analisis apareado de dos biomarcadores o de proporciones de los niveles de ciertos biomarcadores (y compuestos que no son biomarcadores) en muestras biologicas puede lograr una mayor sensibilidad y especificidad en la evaluacion de la DNL.
Ademas, la presente descripcion proporciona metodos para evaluar la DNL en la piel y su relacion con la funcion de la piel (por ejemplo, para evaluar la produccion de sebo, el riesgo de acne, etc.). En un ejemplo de metodo, la evaluacion de la DNL en un sujeto comprende analizar una muestra de piel o epidermica o de celulas de la piel procedente de dicho sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores de DNL en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones; y comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para evaluar la lipogenesis en la piel. Por ejemplo, el nivel o niveles de un biomarcador, dos o mas biomarcadores, tres o mas biomarcadores, cuatro o mas biomarcadores, cinco o mas biomarcadores, seis o mas biomarcadores, etc., incluyendo una combinacion de todos los biomarcadores listados, puede usarse para evaluar la DNL. En una realizacion, dichos uno o mas biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, y escualeno. En otra realizacion, dichos uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, y escualeno se emplean en combinaciones con uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3, y sus combinaciones. En otra realizacion, dichos uno o mas biomarcadores comprenden 16:0, 16:1n7, y 18:2n6. En otra realizacion, dichos uno o mas biomarcadores comprenden 16:0, 16:1n10, y 18:2n6. En otra realizacion, dichos uno o mas biomarcadores comprenden 16:0, 16:1n10, y escualeno. En otra realizacion, dichos uno o mas biomarcadores comprenden 16:0, 16:1n7, 18:2n6, 14:0, y 14:1n5. En otra realizacion, dichos uno o mas biomarcadores comprenden 16:0, 16:1n7, 18:2n6, 14:0, 14:1n5, 20:4n6, y 22:6n3. La determinacion de los niveles de combinaciones de los biomarcadores puede permitir lograr una mayor sensibilidad y especificidad en los metodos descritos en la presente. Por ejemplo, un analisis apareado de dos biomarcadores o de proporciones de los niveles de ciertos biomarcadores (y compuestos que no son biomarcadores) en muestras biologicas puede lograr una mayor sensibilidad y especificidad en la evaluacion de la DNL.
Puede utilizarse cualquier metodo para analizar la muestra biologica para determinar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra. Los metodos adecuados incluyen cromatograffa (por ejemplo, HPLC, cromatograffa de gases, cromatograffa de gases capilar, cromatograffa ffquida), espectrometna de masas (por ejemplo, MS, MS-MS), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), union de anticuerpos, otras tecnicas inmunoqmmicas, y sus combinaciones.
El nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores puede compararse con niveles de referencia de DNL empleando diversas tecnicas, que incluyen una comparacion sencilla (por ejemplo, una comparacion manual). El
nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra biologica tambien puede compararse con niveles de referencia empleando uno o mas analisis estadfsticos (por ejemplo, ensayo de la t, ensayo de T de Welch, ensayo de suma de rangos de Wilcoxon, analisis de correlacion, bosque aleatorio, puntuacion T, puntuacion Z) o usando un modelo matematico (por ejemplo, un modelo estad^stico). Por ejemplo, puede emplearse un modelo matematico que comprende la medicion de un unico analito de biomarcador o la medicion de multiples analitos de biomarcadores para evaluar la DNL en un sujeto. Cuando se analizan los efectos que producen dos o mas biomarcadores de DNL, se pueden evaluar los efectos de estos biomarcadores individualmente u obtener el efecto neto de estos biomarcadores, por ejemplo, usando diversas formulas matematicas o modelos para cuantificar el efecto de cada biomarcador. Una formula que contiene los niveles de uno o mas biomarcadores de DNL como variables incluye cualquier formula matematica, modelo, ecuacion o expresion establecido basandose en principios matematicos o estadfsticos o metodos que emplean los valores de uno o mas biomarcadores como variables.
Los resultados del metodo pueden emplearse junto con otros metodos (o sus resultados) utiles para evaluar la DNL en un sujeto. Por ejemplo, las mediciones de fDNL, sensibilidad a la insulina y/o respuesta aguda a la insulina ("acute insulin response", AIR), asf como la informacion del paciente, tal como, por ejemplo, la edad, BMI, genero, raza u otros factores de riesgo, pueden usarse con los biomarcadores.
Los biomarcadores proporcionados en la presente pueden utilizarse en una formula o modelo matematico o estadfstico (“mdice de DNL”) para generar una puntuacion numerica (“puntuacion del mdice de DNL”) que es un indicador de la DNL en el sujeto. La puntuacion del mdice de DNL coloca al sujeto en un intervalo de DNL de bajo a normal a alto. Los metodos para generar un mdice de DNL pueden comprender obtener muestras biologicas procedentes de una o mas cohortes de referencia (por ejemplo, individuos sanos, individuos con una enfermedad relacionada con la DNL), medir los niveles de uno o mas biomarcadores de DNL en las muestras, y utilizar los niveles medidos en un modelo matematico formado por dichos niveles medidos de dichos uno o mas biomarcadores. Por ejemplo, pueden usarse metodos, tales como el analisis de multiples variables de la varianza, regresion de multiples variables, regresion multiple, para determinar las relaciones entre variables dependientes y variables independientes en el mdice de DNL. El metodo puede emplear cualquier numero de marcadores seleccionados de 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3, y sus combinaciones. Multiples biomarcadores pueden correlacionarse con la DNL, mediante cualquier metodo, incluidos metodos estadfsticos, tales como el analisis de regresion.
En algunas realizaciones, se establece una formula que contiene uno o mas biomarcadores de DNL como variables empleando un analisis de regresion, por ejemplo, regresiones lineales multiples. En una realizacion, los biomarcadores pueden usarse en un modelo estadfstico para generar un mdice de DNL. Por ejemplo, sin limitacion, pueden usarse las siguientes ecuaciones en un mdice de DNL para generar una puntuacion del mdice de DNL: Puntuacion de mdice de DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6) (empleando datos de porcentaje de moles o normalizando para el total o TG)
Puntuacion de mdice de DNL = (a(16:0)+b(16:1n7))/c(18:2n6) (proporcion normalizante)
Puntuacion de mdice de DNL = a(marcador DNL-positivo)-b(marcador DNL-negativo)
Puntuacion de mdice de DNL = a(16:0)+b(16:1n10)-c(18:2n6)
Puntuacion de mdice de DNL = a(16:0)+b(16:1n10)-c(escualeno)
Puntuacion de mdice de DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)
Puntuacion de mdice de DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)
Puntuacion de mdice de DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)-f(20:4n6)-g(22:6n3)
en las que a, b, c, d, e, f, g son coeficientes que actuan como factores escalantes que pueden calcularse a partir de niveles humanos convencionales de cada uno de los marcadores. Ademas, el resultado de la ecuacion (puntuacion del mdice de DNL) puede escalarse (por ejemplo, de 1-10) para proporcionar una utilidad clmica optima. Los metabolitos de biomarcadores pueden expresarse en terminos cuantitativos o relativos (por ejemplo, porcentaje de moles, % moles); sin embargo, los coeficientes y la forma de la ecuacion deben ajustarse a la forma de los datos proporcionados. Las formulas pueden usar uno o mas biomarcadores de DNL como variables, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o mas biomarcadores. Las constantes de estas formulas pueden establecerse utilizando un conjunto de datos obtenidos a partir de valores de DNL conocidos o a partir de cohortes con enfermedades asociadas a DNL. Los niveles de biomarcadores de DNL usados en estas formulas pueden ser los niveles en un momento concreto o los cambios en los niveles a lo largo de un periodo de tiempo.
En otro aspecto, el mdice de DNL puede incorporar variables tales como, por ejemplo, el genero y/o la raza. En otro aspecto, el mdice de DNL puede incorporar mediciones de otros acidos grasos o lfpidos.
La puntuacion del mdice de DNL puede usarse para clasificar al sujeto segun el nivel de DNL (por ejemplo, normal,
bajo, alto). Los ejemplos de usos no limitantes de la puntuacion del mdice de DNL incluyen: la evaluacion de la DNL; la clasificacion de la DNL; la predisposicion a desarrollar enfermedades relacionadas con la DNL; el diagnostico de enfermedades relacionadas con la DNL; el control del avance/regresion de enfermedades relacionadas con la DNL; y el control de la eficacia de un tratamiento para enfermedades relacionadas con la DNL.
En otro aspecto, los biomarcadores de DNL o el mdice de DNL pueden incluirse en un algoritmo medico para la gestion de pacientes, en el que el mdice y la puntuacion de DNL son una unidad metrica util para ser integrada en la practica clmica. El algoritmo medico puede usar el valor medido de uno o mas analitos de biomarcadores de DNL o la puntuacion del mdice de DNL calculada para guiar el posterior ensayo, evaluacion y tratamiento de un sujeto que se presenta en una clmica o ante un medico. Un ejemplo no limitante y sencillo de algoritmo se presenta en la figura 1. El sujeto (101) puede presentarse en la clmica con smtomas o puede ser asintomatico (l02). El sujeto puede presentar factores de riesgo, tal como una historia personal o una historia familiar de lipogenesis de novo aberrante o puede no presentar factores de riesgo (102). Si el sujeto no presenta factores de riesgo y es asintomatico, entonces no se determinara el mdice de DNL y el paciente se controlara una vez al ano (103) a menos que se desarrollen smtomas o factores de riesgo. Si el sujeto es sintomatico y/o presenta factores de riesgo (por ejemplo, una historia personal o familiar), entonces se analizara una muestra procedente del sujeto (104) para determinar la puntuacion del mdice de DNL de dicho sujeto (105). De modo similar, si el sujeto es asintomatico y presenta factores de riesgo (por ejemplo, una historia personal o familiar de estos), entonces se analizara una muestra procedente del sujeto (104) para determinar la puntuacion del mdice de DNL de dicho sujeto (105). Si la puntuacion del mdice de DNL (105) no esta por encima de un valor umbral o valor de referencia que indica la presencia de DNL o una predisposicion a una enfermedad relacionada con la DNL, entonces el sujeto se controlara periodicamente (106). Si la puntuacion del mdice de DNL (105) esta por encima de un valor umbral o valor de referencia que indica la presencia de DNL o una predisposicion a una enfermedad relacionada con la DNL, entonces el sujeto se remitira a mas ensayos y evaluaciones (107) para determinar si dicho sujeto debe tratarse (por ejemplo, con farmacos y/o cambios en el estilo de vida). Si se determina, basandose en los ensayos y evaluaciones adicionales, que es necesario el tratamiento (108), entonces se prescribira una intervencion terapeutica (109) y despues puede controlarse la respuesta de dicho paciente a la terapia (110). Dicho sujeto volvera periodicamente para la determinacion de su estado de DNL mediante la medicion de biomarcadores de la DNL (104) y el calculo de una puntuacion de DNL (105). La puntuacion de DNL se comparara con la puntuacion de DNL anterior para determinar si el tratamiento es eficaz. Si se determina que no es necesaria una intervencion de tratamiento (108), dicho sujeto se controlara periodicamente (106).
III. Control del avance/regresion de la enfermedad
El uso de biomarcadores de la DNL en un mdice de DNL permite controlar el avance/regresion de enfermedades relacionadas con la DNL (por ejemplo, diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica ("non-alcoholic steatohepatitis", NASH), cancer, y enfermedad cardiovascular, etc.) en un sujeto. Un metodo para controlar el avance/regresion de una enfermedad relacionada con la DNL, tal como diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, y trastornos de la piel en un sujeto comprende (1) analizar una primera muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para la DNL seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones en la primera muestra obtenida del sujeto en un primer momento, (2) analizar una segunda muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores, obteniendose dicha segunda muestra del sujeto en un segundo momento, y (3) comparar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores en la segunda muestra con (a) el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la primera muestra y/o (b) con niveles de referencia de DNL para controlar el avance/regresion de la enfermedad relacionada con la DNL en el sujeto. Los resultados del metodo son indicativos del desarrollo de la enfermedad relacionada con la DNL (es decir, el avance o la regresion, si se han producido cambios) en el sujeto.
Despues de obtenerse la primera muestra pueden obtenerse una o mas muestras adicionales del sujeto en un momento posterior. En un aspecto, dichas una o mas muestras adicionales se obtienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, o mas dfas despues de la primera muestra. En otro aspecto, dichas una o mas muestras adicionales se obtienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas semanas despues de la primera muestra o despues del inicio del tratamiento con la composicion. En otro aspecto, dichas una o mas muestras adicionales pueden obtenerse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o mas meses despues de la primera muestra o despues del inicio del tratamiento con la composicion.
En una realizacion, los resultados del metodo pueden basarse en la puntuacion del mdice de DNL que es indicativa del nivel de DNL en el sujeto y que puede controlarse a lo largo del tiempo. Comparando la puntuacion del mdice de DNL de una muestra recogida en un primer momento con la puntuacion del mdice de DNL de una muestra recogida en al menos un segundo momento puede determinarse el avance o la regresion de la enfermedad relacionada con DNL. Por ejemplo, dicho metodo para controlar el avance/regresion de la prediabetes y/o diabetes de tipo 2 en un sujeto comprende (1) analizar una primera muestra biologica procedente de un sujeto para determinar una puntuacion del mdice de DNL para la primera muestra obtenida del sujeto en un primer momento, (2) analizar una segunda muestra biologica procedente de un sujeto para determinar una segunda puntuacion del mdice de DNL, obteniendose dicha segunda muestra del sujeto en un segundo momento, y (3) comparar la puntuacion del mdice de
DNL en la primera muestra con la puntuacion del mdice de DNL en la segunda muestra para controlar el avance/regresion de la prediabetes y/o la diabetes de tipo 2 en el sujeto.
El uso de los biomarcadores y del mdice de DNL descritos en la presente para el control del avance puede guiar o ayudar a que el medico decida poner en marcha medidas preventivas, tales como restricciones dieteticas, ejercicio o un tratamiento con farmacos de estadio temprano.
IV. Determinacion de la predisposicion a una enfermedad
El uso de biomarcadores de la DNL en un mdice de DNL, tal como se describe en la presente, tambien puede usarse para determinar si un sujeto que no muestra ningun smtoma de una enfermedad relacionada con la d Nl , tal como diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular y trastornos de la piel, esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL. Estos metodos para determinar si un sujeto que no tiene smtomas de una enfermedad relacionada con la DNL, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, y trastornos de la piel, esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL comprenden (1) analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones en la muestra, y (2) comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para determinar si el sujeto esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL. Los biomarcadores tambien pueden usarse en un modelo matematico o estadfstico o una formula (mdice de DNL) para determinar la predisposicion a una enfermedad relacionada con la DNL. Los resultados del metodo pueden emplearse junto con otros metodos (o sus resultados) utiles en la determinacion clmica para saber si un sujeto esta predispuesto a desarrollar la enfermedad. Despues de determinar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra, el nivel o niveles se comparan con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos para predecir si el sujeto esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL, tal como diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, o trastornos de la piel. Los niveles de uno o mas biomarcadores en una muestra que se corresponden con niveles de referencia DNL-positivos (por ejemplo, niveles que son los mismos que los niveles de referencia, sustancialmente los mismos que los niveles de referencia, por encima y/o por debajo del mmimo y/o maximo de los niveles de referencia y/o dentro del intervalo de los niveles de referencia) son indicativos de que el sujeto esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL. Los niveles de uno o mas biomarcadores en una muestra que se corresponden con niveles de referencia DNL-negativos (por ejemplo, niveles que son los mismos que los niveles de referencia, sustancialmente los mismos que los niveles de referencia, por encima y/o por debajo del mmimo y/o maximo de los niveles de referencia y/o dentro del intervalo de los niveles de referencia) son indicativos de que el sujeto no esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL. Ademas, los niveles de uno o mas biomarcadores que estan diferencialmente presentes (en especial a un nivel que sea estadfsticamente significativo) en la muestra, comparados con unos niveles de referencia DNL-negativos, pueden ser indicativos de que el sujeto esta predispuesto a desarrollar la enfermedad relacionada con la DNL. Los niveles de uno o mas biomarcadores que estan diferencialmente presentes (en especial a un nivel que sea estadfsticamente significativo) en la muestra, comparados con unos niveles de referencia DNL-positivos, son indicativos de que el sujeto no esta predispuesto a desarrollar la enfermedad relacionada con la DNL.
En otra realizacion, los biomarcadores pueden utilizarse en un modelo matematico o estadfstico o una formula (mdice de DNL) para determinar la predisposicion a una enfermedad relacionada con la DNL, comprendiendo dicho metodo (1) analizar una muestra biologica procedente de un sujeto para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores en la muestra, en el que dichos uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones en la muestra, (2) emplear un modelo matematico que comprende los niveles medidos de dichos uno o mas biomarcadores para generar un mdice de DNL, (3) calcular una puntuacion del mdice de DNL a partir de dicho mdice de DNL, y (4) comparar la puntuacion del mdice de DNL de la muestra con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores para determinar si el sujeto esta predispuesto a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL.
Ademas, tambien es posible determinar unos niveles de referencia espedficos para evaluar si un sujeto que no padece una enfermedad relacionada con la DNL, tal como diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular o trastornos de la piel, esta predispuesto o no a desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL. Por ejemplo, es posible determinar unos niveles de referencia de los biomarcadores para evaluar diferentes grados de riesgo (por ejemplo, bajo, intermedio, alto) en un sujeto para desarrollar una enfermedad relacionada con la DNL. Dichos niveles de referencia pueden usarse para la comparacion con los niveles de dichos uno o mas biomarcadores en una muestra biologica procedente de un sujeto.
V. Control de la eficacia terapeutica
Los biomarcadores proporcionados tambien permiten la evaluacion de la eficacia del tratamiento de una enfermedad relacionada con la DNL, tal como diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular o trastornos de la piel. Estas evaluaciones pueden usarse, por ejemplo, en estudios de eficacia, para controlar los efectos de modificaciones en el estilo de vida, asf como para dirigir la seleccion de composiciones para tratar la enfermedad relacionada con la DNL. Por ejemplo, el uso de biomarcadores de DNL en un mdice de DNL para la diabetes tambien permite evaluar la eficacia de un tratamiento para la diabetes, asf como evaluar la eficacia relativa de dos tratamientos para la diabetes. Los tratamientos que pueden controlarse para la eficacia terapeutica pueden incluir la dieta, modificaciones en el estilo de vida, tratamiento con una composicion u otras terapias usadas para tratar trastornos relacionados con la DNL.
Asf, tambien se describen metodos para evaluar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad relacionada con la DNL, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, o trastornos de la piel, que comprenden (1) analizar, procedente de un sujeto (o un grupo de sujetos) que padece una enfermedad relacionada con la DNL, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, o trastornos de la piel, y que en la actualidad o previamente se ha sometido a tratamiento para dicha enfermedad, una muestra biologica (o un grupo de muestras) para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para el trastorno seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones, y (2) comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con (a) el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en una muestra biologica previamente tomada del sujeto, en la que la muestra biologica previamente tomada se obtuvo del sujeto antes de comenzar el tratamiento, (b) unos niveles de referencia DNL-positivos de dichos uno o mas biomarcadores, (c) unos niveles de referencia DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores, (d) unos niveles de referencia DNL-positivos al avance de dichos uno o mas biomarcadores y/o (e) unos niveles de referencia DNL-positivos a la regresion de dichos uno o mas biomarcadores. Los resultados de la comparacion son indicativos de la eficacia del tratamiento para la enfermedad relacionada con la DNL.
La segunda muestra puede obtenerse del sujeto en cualquier momento despues de haber obtenido la primera muestra. En un aspecto, la segunda muestra se obtiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, o mas dfas despues de la primera muestra o despues del inicio de la terapia. En otro aspecto, la segunda muestra se obtiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas semanas despues de la primera muestra o despues del inicio de la terapia. En otro aspecto, la segunda muestra pueden obtenerse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o mas meses despues de la primera muestra o despues del inicio de la terapia.
El cambio (si se produce) en el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores a lo largo del tiempo puede ser indicativo del avance o la regresion de la enfermedad relacionada con la DNL en el sujeto. Para caracterizar el desarrollo de una enfermedad relacionada con la DNL concreta en el sujeto, el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la primera muestra, el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la segunda muestra y/o los resultados de la comparacion de los niveles de los biomarcadores en la primera y segunda muestra pueden compararse con unos niveles de referencia DNL-positivos y/o DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores. Si las comparaciones indican que el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores aumentan o disminuyen a lo largo del tiempo (por ejemplo, en la segunda muestra comparada con la primera muestra) para hacerse mas similares a los niveles de referencia DNL-positivos (o menos similares a los niveles de referencia DNL-negativos), entonces los resultados son indicativos del avance de la enfermedad relacionada con la DNL. Si las comparaciones indican que el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores aumentan o disminuyen a lo largo del tiempo para hacerse mas similares a los niveles de referencia DNL-negativos (o menos similares a los niveles de referencia DNL-positivos), entonces los resultados son indicativos de la regresion de la enfermedad relacionada con la DNL.
En otra realizacion, los biomarcadores pueden usarse en un modelo matematico o estadfstico o una formula (mdice de DNL) para determinar la eficacia de un tratamiento para una enfermedad relacionada con la DNL, comprendiendo dicho metodo (1) analizar, procedente de un sujeto (o un grupo de sujetos) que padece una enfermedad relacionada con la DNL, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular, o trastornos de la piel, y que en la actualidad o previamente se ha sometido a tratamiento para dicha enfermedad, una muestra biologica (o un grupo de muestras) para determinar el nivel o niveles de uno o mas biomarcadores para el trastorno seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 y sus combinaciones, (2) emplear un modelo matematico que comprende los niveles medidos de dichos uno o mas biomarcadores para generar un mdice de DNL, (3) calcular una puntuacion del mdice de DNL a partir de dicho mdice de DNL, y (4) comparar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en la muestra con (a) el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en una muestra biologica previamente tomada del sujeto, en la que la muestra biologica previamente tomada se obtuvo del sujeto antes de comenzar el tratamiento, (b) unos niveles de referencia DNL-positivos de dichos uno o mas biomarcadores, (c) unos niveles de referencia DNL-negativos de dichos uno o mas biomarcadores, (d) unos niveles de referencia DNL-positivos al avance de dichos uno o mas biomarcadores y/o (e) unos niveles de referencia DNL-positivos a la regresion de dichos uno o mas biomarcadores. Los resultados de la comparacion son indicativos de la eficacia del tratamiento para la enfermedad relacionada con la DNL.
Al igual que con los otros metodos descritos en la presente, las comparaciones realizadas en los metodos para controlar la eficacia terapeutica de un tratamiento para una enfermedad relacionada con la DNL, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular o trastornos de la piel, en un sujeto pueden realizarse empleando diversas tecnicas, que incluyen comparaciones simples, uno o mas analisis estadfsticos, y sus combinaciones.
Los resultados del metodo pueden emplearse junto con otros metodos (o sus resultados) descritos en la presente y/u otros metodos utiles en el control cffnico del avance/regresion de la enfermedad o el trastorno en un sujeto. Tal como se describio anteriormente en conexion con los metodos para diagnosticar (o para ayudar a diagnosticar) una enfermedad o un trastorno, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular o trastornos de la piel, puede usarse cualquier metodo adecuado para analizar las muestras biologicas para determinar el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores en las muestras. Ademas, el nivel o niveles de dichos uno o mas biomarcadores, que incluyen una combinacion de todos los biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3, o cualquiera de sus fracciones, puede determinarse y usarse en metodos para controlar el avance/regresion de la enfermedad relacionada con la DNL en un sujeto. Dichos metodos pueden realizarse para controlar el desarrollo de la enfermedad o trastorno en sujetos, por ejemplo, el desarrollo de la prediabetes hacia la diabetes de tipo 2 en un sujeto que padece prediabetes, o pueden emplearse en sujetos que no padecen una enfermedad o trastorno (por ejemplo, sujetos sospechosos de estar predispuestos a desarrollar la enfermedad o el trastorno) para controlar los niveles de predisposicion a la enfermedad o el trastorno. Los biomarcadores proporcionados tambien permiten la identificacion de sujetos en los que el tratamiento de una enfermedad relacionada con la DNL, tal como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular o trastornos de la piel, resulta eficaz (es decir, los pacientes responden a la terapia). Estas evaluaciones pueden usarse, por ejemplo, en la seleccion de composiciones para tratar la enfermedad o el trastorno en ciertos sujetos.
VI. Metodos para emplear los biomarcadores para otras enfermedades o trastornos
En otro aspecto, al menos algunos de los biomarcadores descritos en la presente para la DNL tambien pueden ser biomarcadores para otras enfermedades o trastornos que en la actualidad no se conoce que esten asociados con la DNL. Es decir, los metodos descritos en la presente con respecto a la DNL tambien pueden usarse para el diagnostico (o para ayudar al diagnostico) de una enfermedad o trastorno sospechoso de estar relacionado con la DNL, en metodos para controlar el avance/regresion de dicha enfermedad o trastorno, en metodos para determinar la predisposicion a dicha enfermedad o trastorno, y en metodos para evaluar la eficacia de composiciones para tratar dicha enfermedad o trastorno. Estos metodos pueden llevarse a cabo como se describe en la presente con respecto a la resistencia a la insulina.
Ejemplos
I. Metodos generales
Brevemente, los ffpidos procedentes de muestras de plasma o de muestras de sebo se extrajeron en presencia de patrones internos autenticos mediante el metodo de Folch et al. [Folch, J., M. Lees, y G. H. Sloane-Stanley, 1957, A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 226: 497-509] empleando cloroformo:metanol (2:1 en v/v). Las muestras de sebo se recogieron empleando Sebutape segun se ha descrito [Pierard, G. E., Pierard-Franchimont, C. y Kligman, A. M., Kinetics of sebum excretion evaluated by the Sebutape—Chromameter technique, Skin Pharmacology, revista oficial de the Skin Pharmacology Society, 6, 38-44 (1993)]. El extracto de ffpidos totales se transesterifico en acido sulfurico al 1% en metanol en un vial sellado bajo una atmosfera de nitrogeno a 100 °C durante 45 min. El extracto resultante se neutralizo con carbonato de potasio al 6%, y los esteres mefflicos de acidos grasos ("fatty acid methyl esters", FAME) se extrajeron con hexano y se prepararon para una cromatograffa de gases. Los esteres metfficos de acidos grasos se separaron y se cuantificaron mediante una cromatograffa de gases capilar (Agilent Technologies, modelo 6890) equipada con una columna capilar 30 m DB-88MS (Agilent Technologies) y un detector de ionizacion de llama. Se obtuvieron resultados cuantitativos comparando cada acido graso con su control de patron interno. Todos los ensayos presentados en la presente han pasado por protocolos de control de calidad internos.
En estos ejemplos se emplearon los datos de porcentaje de moles (% moles) para todos los analisis. Los datos de % moles son simplemente datos de la composicion de acidos grasos, y cada acido graso se expresa como un porcentaje del conjunto total. La conversion de concentraciones de acidos grasos cuantitativas en concentraciones de % moles normaliza el efecto de los cambios en los niveles de ffpidos en plasma totales (por ejemplo, mayor o menor contenido en triacilgliceridos). Como alternativa, estos acidos grasos pueden medirse como componentes de ffpidos complejos intactos (por ejemplo, especies de triacilgliceridos o fosfoffpidos, tales como PC16:0|16:1n7). Ejemplo 1: fndice de lipogenesis de novo (DNL)
Varios acidos grasos se ven afectados por la lipogenesis de novo, algunos de modo positivo (concretamente, son sintetizados de novo), y algunos de modo negativo (concretamente, son diluidos por la lipogenesis de novo o son inhibidores del proceso). Por ejemplo, los acidos grasos palmitato y palmitoleato (16:0 y 16:1n7) son productos de la DNL humana (Aarsland A., Wolfe R. R., Hepatic secretion of VLDL fatty acids during stimulated lipogenesis in men, J. Lipid Res., 1998, 39:1280-1286; Wu J. H., Lemaitre R. N., Imamura F., King I. B., Song X., Spiegelman D., Siscovick D. S., Mozaffarian D., Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and risk of coronary heart disease: the Cardiovascular Health Study, Am. J. Clin. Nutr., 2011, 94:431-438). El miristato y el miristoleato son los analogos de 14 carbonos de 16:0 y 16:1n7 y tambien son producidos a traves de la lipogenesis de novo solo que en mucha menos abundancia. Sin embargo, el acido linoleico (18:2n6) se deriva exclusivamente de la dieta (es el acido graso poliinsaturado mas abundante en el suministro alimentario). El acido graso 18:2n6 se correlaciona en gran medida, pero de un modo negativo, con otros miembros del conjunto, lo cual sugiere que el agrupamiento representa el equilibrio de los acidos grasos derivados de la DNL y derivados de la dieta en la circulacion. Estudios previos han mostrado unos niveles disminuidos de 18:2n6 en lfpidos originados de la DNL (Aarsland A., Wolfe R. R., Hepatic secretion of VLDL fatty acids during stimulated lipogenesis in men, J. Lipid Res., 1998, 39:1280-1286).
Los acidos grasos relacionados con la DNL incluyen: (A) marcadores positivos: 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, y (B) marcadores negativos: 18:2n6, 20:4n6, 22:6n3.
Los biomarcadores mas constantes de la DNL son: 16:0, 16:1n7 y 18:2n6. Estos marcadores se seleccionaron como ejemplos de biomarcadores para medir los niveles en muestras y para el uso de dichos niveles medidos en un mdice para medir la DNL. Los biomarcadores pueden medirse dentro de una clase espedfica de lfpidos (por ejemplo, triacilgliceridos (TG), fosfolfpidos (PL), esteres de colesterilo (CE)) o como parte de un analisis de acidos grasos totales (que incluye todas las clases de lfpidos en el analisis). Los acidos grasos pueden medirse en tejidos o fluidos, y son biomarcadores de la DNL particularmente utiles cuando se miden en suero o plasma. En este ejemplo, los valores medidos de estos biomarcadores se emplean en un modelo estadfstico para generar un mdice de DNL que es util para informar al medico acerca del estado de DNL del paciente, para controlar la respuesta a una intervencion terapeutica, para evaluar la predisposicion a enfermedades, tales como la diabetes y trastornos relacionados, obesidad, esteatosis hepatica, esteatohepatitis no alcoholica (NASH), cancer, enfermedad cardiovascular (hipertrigliceridemia) y trastornos de la piel.
Se genero un ejemplo de mdice de DNL, DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6), en el que los datos (es decir, los valores para los niveles medidos de los ejemplos de biomarcadores, 16:0, 16:1n7, 18:2n6) se escalaron a % moles. El escalado y los coeficientes vanan en la forma final de la ecuacion para producir un peso casi equivalente para cada compuesto en la ecuacion. Por ejemplo, si el biomarcador 16:0 esta presente como 30% de los acidos grasos, y el biomarcador 16:1n7 esta presente como 1% de los acidos grasos, el coeficiente para 16:1n7 debe ser aproximadamente 30 para igualar la contribucion de cada componente de acido graso de la ecuacion.
Los biomarcadores se midieron usando una plataforma de analisis de acidos grasos convencional (GC-FID o GC-MS). La plataforma produce datos sobre cada componente del mdice de DNL en un solo ensayo. Como alternativa, puede usarse una plataforma de LC-MS para identificar las especies de lfpidos que mejor reflejan la DNL y puede desarrollarse un ensayo de LC-MS espedfico de biomarcador/optimizado para un biomarcador.
Se derivaron los calculos iniciales de los valores para escalar la ecuacion. La concentracion promedio (expresada en % moles) de cada biomarcador principal de acido graso de la DNL en el suero humano (promedio /- DE) es la siguiente:
16:0: 21,6+/-2,4
16:1n7: 2,1+/-1,1
18:2n6: 31,9+/-4,6
Los coeficientes escalantes pueden obtenerse de una manera tan simple como dividiendo cada componente de acido graso entre su concentracion promedio (o multiplicando por la inversa de su concentracion). Asf, un ejemplo de un mdice de DNL (basado en las concentraciones promedio de los biomarcadores medidas e indicadas anteriormente) es: puntuacion del mdice de DNL = 0,0463(% moles de 16:0)+0,476(% moles de 16:1n7)-0,0313(% moles de 18:2n6). Los coeficientes escalantes pueden calcularse para cualquier acido graso que incluye, por ejemplo, 16:1n10, 18:1n10, 18:1n12, escualeno, 16:0, 16:1n7, 14:0, 14:1n5, 18:2n6, 20:4n6, y 22:6n3 en cualquier tipo de muestra.
Los metodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para generar un mdice de DNL para cualquier tipo de muestra y usando cualquier combinacion de biomarcadores de acidos grasos de la DNL.
Para los ejemplos 2-3 se uso el siguiente mdice de DNL: puntuacion del mdice de DNL = 0,0463(% moles de 16:0)+0,476(% moles de 16:1n7)-0,0313(% moles de 18:2n6).
Ejemplo 2: Efectos de la inhibicion de la lipogenesis de novo sobre la puntuacion del mdice de DNL
Se realizaron dos experimented con celulas tratadas con inhibidores qmmicos de la acetil:CoA carboxilasa (ACC). La ACC es una enzima que cataliza la reaccion que produce malonil-CoA, que es el sustrato requerido para la lipogenesis de novo. Si se inhibe la ACC, no se produce malonil-CoA lo cual, a su vez, inhibe la lipogenesis de novo. En el primer experimented las celulas en cultivo se trataron con el inhibidor o solo con el vehteulo durante 24 h o 48 h. Tras el tratamiento, las celulas se recolectaron y se midieron los biomarcadores. Los niveles de los biomarcadores se usaron en el mdice de DNL para producir la puntuacion del mdice de DNL. La puntuacion del mdice de DNL fue significativamente menor en las celulas tratadas con el inhibidor que en las control tratadas solo con el vehteulo, lo cual indica que la lipogenesis de novo disminuyo en las celulas tratadas con el inhibidor de ACC. Se calculo la puntuacion del mdice de DNL empleando dos fracciones de lfpidos, la fraccion de PL y la fraccion de TG, y se obtuvieron resultados similares. Los datos se presentan graficamente en la figura 2 (fraccion de PL) y la figura 3 (fraccion de TG).
En el segundo experimento, se trataron celulas de sebocitos en cultivo con una de tres dosis (baja, intermedia, alta) de un inhibidor de ACC o con un vehteulo control por sf solo. Despues del tratamiento, las celulas se recolectaron y se midieron los biomarcadores. Los niveles de los biomarcadores se usaron en el mdice de DNL para producir la puntuacion del mdice de DNL. Las celulas tratadas con el inhibidor mostraron una reduccion significativa y dependiente de la dosis en la puntuacion del mdice de DNL, comparada con la puntuacion del mdice de DNL obtenida con las celulas tratadas solo con vehteulo. Los datos se presentan graficamente en la figura 4.
Ejemplo 3: Aplicacion del mdice de DNL a sujetos con trastornos hepaticos
La esteatohepatitis no alcoholica (NASH) es una enfermedad que comienza con la acumulacion de grasa (que se cree que en parte es grasa de la DNL) en el tgado y avanza hacia la inflamacion y la fibrosis. Se recogio plasma sangumeo de un total de 60 sujetos con una estadificacion de la enfermedad confirmada mediante biopsia (19 sujetos con NASH, 2 sujetos con NAFLD, y 39 sujetos normales). Se midieron los biomarcadores 16:0, 16:1n7 y 18:2n6, y las mediciones se usaron en el mdice de DNL para generar una puntuacion del mdice de DNL para cada sujeto. Existe un claro aumento en las puntuaciones del mdice de DNL en pacientes con NASH y NAFLD con relacion a sus controles normales. Los resultados se ilustran graficamente en la figura 5.
Ejemplo 4: Desarrollo y aplicacion del mdice de DNL en sujetos resistentes a la insulina y diabeticos
En otro ejemplo, se generaron modelos del mdice de DNL y se aplicaron a una cohorte formada por 749 sujetos, 102 de los cuales avanzaron hasta la diabetes dentro de 5 anos. La cohorte estaba formada por 55% mujeres, 45% hombres; 42% blancos, 34% hispanos no blancos, 24% afroamericanos; edad promedio 55 anos. Se obtuvieron mediciones de la sensibilidad a la insulina (Si) y de respuesta aguda a la insulina (AIR) de todos los participates en la lmea de base realizando un ensayo de tolerancia a la glucosa intravenoso con toma de muestras frecuente ("frequently sampled intravenous glucose tolerance test", FSIGTT) con un analisis del modelo mmimo. De los 102 participates que desarrollaron diabetes, estos sujetos eran mayores y teman un BMI y unos valores de la lmea de base de glucosa en sangre en ayunas mayores, y la Si y la AIR fueron significativamente diferentes de los individuos que no desarrollaron diabetes.
Se cuantificaron los acidos grasos como se describio en el ejemplo 1 en el suero recolectado en la lmea de base para los 749 sujetos. Las concentraciones de acidos grasos difieren a traves de los grupos de raza/etnicos; los datos se presentan en la tabla 1. Los biomarcadores de acidos grasos usados como variables en el ejemplo de mdice de DNL se indican en negrita.
Tabla 1 - Concentracion promedio de biomarcadores de la DNL segun la etnia
comparaciones apareadas (ensayos de la t) con correccion de Bonferroni a p < 5,4 * 10-4;
6 significativamente diferente de los afroamericanos;
A significativamente diferente de los hispanos;
1 significativamente diferente de los caucasicos,
Antes del analisis, los valores de % moles para los metabolitos se normalizaron a un promedio 0 y una varianza 1. La Si y la AIR tambien se transformaron como AIR = sign(AIR)*sqrt(abs(AIR)); y Si = loge (Si+1). El mdice de DNL se calculo como DNL = 0,0464 (16:0)+0,489 (16:1n7)-0,0335 (18:2n6).
El acido palmftico (16:0) y el acido palmitoleico (16:1n7) estaban muy inversamente asociados con la sensibilidad a la insulina (coeficientes estandarizados p0 de -0,39 y -0,25, p<0,001) y resultaron predictores positivos significativos de la diabetes incidente (RR 1,64 y 1,77, p<0,0001); el acido linoleico (18:2n6) estaba muy asociado positivamente con la sensibilidad a la insulina (coeficientes estandarizados p0 de 0,38, p<0,001) y resulto un predictor inverso significativo de la diabetes (RR 0,61, p<0,001). Los datos se presentan en la tabla 2. Los biomarcadores de acidos grasos usados como variables en el ejemplo de mdice de DNL se indican en negrita.
Tabla 2 - Asociaciones univariables de biomarcadores de la DNL con la sensibilidad a la insulina y la diabetes
RR, riesgo relativo; IC, intervalo de confianza; Si, sensibilidad a la insulina
Las concentraciones se expresan como porcentaje de moles de los acidos grasos totales medidos
6 p < 0,0014 se considera significativo basandose en un ajuste de comparacion multiple mediante el metodo de Bonferroni
Se emplearon los biomarcadores de la DNL en el mdice de DNL. La asociacion del mdice de DNL se evaluo mediante regresion logfstica. Se evaluaron dos modelos, uno para el mdice de DNL no ajustado (puntuacion del mdice de DNL = 0,0464 (16:0)+0,489 (16:1n7)-0,0335 (18:2n6)), y uno para el mdice de DNL ajustado para Si y AIR. El mdice de DNL no ajustado fue un predictor significativo de la diabetes incidente (tabla 3; OR: 1,5982, valor de P:<0,001). El mdice de DNL sigue siendo significativo despues del ajuste para Si y AIR, con una oportunidad relativa de 1,3987 (valor de p: 0,0054). Los datos indican que el mdice de DNL es un predictor de la diabetes incidente que es independiente de la sensibilidad a la insulina (Si) y de la funcion de las celulas beta (AIR).
Tabla 3 - Asociacion del mdice de DNL con la diabetes incidente (oportunidad relativa por 1 desviacion estandar)
El area bajo la curva (AUC) se evaluo para los modelos para la prediccion de la diabetes. La ilustracion grafica de la curva caractenstica de receptor-operador ("receiver-operator characteristic curve", ROC) se muestra en la figura 6. El AUC para el modelo 1, que incluye solo AIR y Si, fue de 0,816. El AUC para el modelo 2, que es el mdice de DNL ajustado para Si y AIR, fue de 0,837. Asf, la inclusion del mdice de DNL en el modelo matematico proporciona una mayor discriminacion del riesgo de diabetes que la base patogenica muy conocida de la diabetes (resistencia a la insulina, funcion de las celulas beta y obesidad), tal como se muestra por un aumento significativo en la ROC entre los modelos 1 y 2.
Por tanto, los marcadores de la lipogenesis de novo (18:2n6, 14:0, 16:0, 14:1n5, y 16:1n7) estan asociados con la diabetes incidente, independientemente de la via reconocida de la resistencia a la insulina y la respuesta alterada de las celulas beta. Los biomarcadores de acidos grasos son correlatos transversales de Si y predictores de la diabetes. Los resultados de aplicar el mdice de DNL compuesto a partir de dichos biomarcadores a dichos sujetos demuestran que el mdice de DNL a) se correlaciona con la resistencia a la insulina, y b) es predictivo de la diabetes futura de una manera que es independiente de la sensibilidad a la insulina y de la funcion de las celulas beta. El mdice de DNL representa un nuevo atributo fisiologico de procesos diabeticos que debe medirse para evaluar el riesgo de desarrollar diabetes y para controlar los cambios que se producen en la diabetes.
Ejemplo 5: Desarrollo y aplicacion del mdice de DNL de sebo
En otro ejemplo se evaluaron los efectos de un inhibidor de la lipogenesis para inhibir la produccion/secrecion de sebo en la piel empleando modelos de mdice de DNL de sebo. La cohorte estaba formada por 20 sujetos reclutados en un estudio clmico de un inhibidor de la lipogenesis como tratamiento para la reduccion de la secrecion de sebo. Diez sujetos recibieron un placebo y diez sujetos recibieron el tratamiento. Se calculo una puntuacion del mdice de DNL de sebo para las muestras recogidas en la lmea de base y las muestras recogidas despues del tratamiento. Se generaron y evaluaron dos modelos de mdice de DNL de sebo:
^dice de DNL de sebo 1 (SDI1): puntuacion de DNL = 0,0398(16:0)+0,0455(16:1n10)-1,398(18:2n6)
mdice de DNL de sebo 2 (SDI2): puntuacion de DNL = 0,0398(16:0)+0,0455(16:1n10)-0,0113(escualeno).
Se recogieron muestras de los participates en la linea de base y despues del tratamiento empleando Sebutape que se aplico a la frente de los participates durante 30 minutos, se retiro y se proceso mediante los mismos metodos que se describen en los metodos generales. Los valores medidos obtenidos para las variables de biomarcadores indicados en cada uno de los modelos del mdice de DNL de sebo se emplearon despues para calcular las puntuaciones del mdice de DNL. Con ambos ejemplos de modelos del mdice de DNL de suero se observo una reduccion significativa (p<0,01) en la puntuacion de DNL en el grupo tratado, pero no se observo cambio en la puntuacion del mdice de DNL del grupo con placebo (p = 0,66 para SDI1, p = 0,93 para SDI2), basandose en un ensayo de la t de Student apareado que compara la linea de base con momentos del tiempo despues del tratamiento para cada grupo. Para el mdice de DNL de sebo 1 se midio una disminucion significativa en la puntuacion con el tratamiento (p<0,01), mientras que no se produjo ningun efecto con el placebo (p = 0,66) en la puntuacion de SDI1. En la figura 7 se ilustra una representacion grafica de los resultados. De modo similar, se midio una reduccion significativa en la puntuacion obtenida del mdice de DNL de sebo 2 en respuesta al tratamiento (p<0,01), mientras que la puntuacion de SDI2 no cambio en el tratamiento con placebo (p = 0,93). En la figura 7 se presenta una ilustracion grafica de los datos. Estos resultados obtenidos con SDI1 y SDI2 son coherentes con el efecto del tratamiento comparado con el placebo.
Ejemplo 6: Actuacion de los indices de DNL en una poblacion humana normal
En el analisis se emplearon muestras de plasma humano procedentes de 11 pacientes cuya contribucion fraccionaria de la lipogenesis de novo (fDNL) a la composicion de lfpidos totales del plasma es conocida. La fDNL se determino como se describe en M. K. Hellerstein, De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects, European journal of clinical nutrition, 53, supl., 1, S53-65 (1999). Se tomaron muestras de plasma para el analisis de los acidos grasos al mismo tiempo que se realizaba la evaluacion de fDNL. En cada muestra se realizo un analisis de los acidos grasos para determinar la concentracion de 16:0, 16:1n7, 18:2n6, 14:0, 14:1n5, 18:1n9, 20:4n6 y 22:6n3.
Usando los metodos descritos en la presente, se calcularon tres versiones del mdice de DNL a partir de los datos de composicion de acidos grasos:
Puntuacion de mdice de DNL 1 = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)
Puntuacion de mdice de DNL 2 = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)
Puntuacion de mdice de DNL 3 = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)-f(20:4n6)-g(22:6n3)
Los coeficientes usados en los indices de DNL son iguales a la inversa del promedio de concentracion en % moles de cada acido graso a traves de las muestras de la cohorte de estudio: a = 0,043870068, b = 0,576706455, c = 0,030067766, d = 0,887528921, e = 16,64691481, f = 0,178183345, g = 0,670499855.
La puntuacion del mdice de DNL para cada uno de los 11 pacientes se calculo para los 3 ejemplos de indices de DN. En la tabla 4 se muestran las tres puntuaciones del mdice de DNL y las concentraciones de los acidos grasos 16:0, 16:1n7, 18:2n6, 14:0, 14:1n5, 20:4n6, y 22:6n3 para cada paciente.
Se realizo un analisis con cada uno de los tres indices de DNL y la fDNL. Los tres mdices de DNL se correlacionaron positiva y significativamente con fDNL. El mdice de DNL 1 tiene un coeficiente de correlacion de 0,62 (p = 0,04) con fDNL. El mdice de DNL 2 tiene un coeficiente de correlacion de 0,77 (p = 0,01) con fDNL. El mdice de DNL 3 tiene un coeficiente de correlacion de 0,62 (p = 0,04) con fDNL. La figura 8 muestra una ilustracion grafica de las graficas de correlacion para el mdice de DNL 1, el mdice de DNL 2 y el mdice de DNL 3.
Ejemplo 7: Actuacion de los indices de DNL en una poblacion de pacientes con NASH sospechada
En otro ejemplo se evaluaron tres modelos de mdice de DNL para determinar la asociacion de cada mdice con un diagnostico de NASH frente a no NASH (clasificacion binaria) y el estadio de la esteatosis. El diagnostico de NASH y el grado de esteatosis se determino mediante una biopsia de Imgado y una histologfa para 213 sujetos sospechosos de padecer NASH. Se recolectaron muestras de suero en ayunas de los sujetos en el mismo dfa en que se realizaron las biopsias. Se realizo el perfil de la composicion de acidos grasos de las muestras de suero y se determino la asociacion de cada uno de los ejemplos de indices de DNL y cada uno de los acidos grasos que forman los indices de DNL con la presencia de NASH (resultado dicotomo de presencia o ausencia) y con el grado de esteatosis (0, 1, 2, 3).
Se emplearon los tres indices de DNL:
Puntuacion de mdice de DNL 1 = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)
Puntuacion de mdice de DNL 2 = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)
Puntuacion de mdice de DNL 3 = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)-f(20:4n6)-g(22:6n3)
Los coeficientes usados en los indices de DNL son iguales a la inversa del promedio de concentracion en % moles de cada acido graso a traves de las muestras de la cohorte de estudio: a = 0,043870068, b = 0,576706455, c = 0,030067766, d = 0,887528921, e = 16,64691481, f = 0,178183345, g = 0,670499855.
Tal como se describe en el ejemplo 6, se calculo la puntuacion del mdice de DNL para cada uno de los 213 pacientes. Cada uno de los tres indices de DNL y los componentes de acido graso individuales de los indices de DNL se asocio con el diagnostico de NASH empleando un analisis de regresion logfstica. Los datos se presentan en la tabla 5. Los resultados se muestran graficamente en la figura 9 que muestra diagramas de cajas de la distribucion de los valores en NASH y no NASH para las puntuaciones de los indices de DNL 1, 2 y 3, respectivamente. Las puntuaciones de los indices de DNL 1, 2 y 3 estaban todas significativamente asociadas con el diagnostico de NASH, con unos valores de p de 0,027, 0,002 y 0,004, respectivamente.
Tabla 5 - Analisis de regresion logfstica que asocia los indices de DNL con muestras de pacientes NASH o no NASH
Los pacientes se clasificaron segun el grado de esteatosis (grados 0 y 1, grado 2, y grado 3) basandose en una biopsia hepatica y un analisis histologico. Cada uno de los tres indices de DNL y los componentes de acido graso
individuals de los indices de DNL se asocio con el grado de esteatosis empleando un analisis ANOVA. Los datos se presentan en la tabla 6. Los resultados se muestran graficamente en la figura 10 que muestra diagramas de cajas de la distribucion de los valores en los grados 0 y 1, grado 2, y grado 3 de esteatosis para las puntuaciones de los indices de DNL 1, 2 y 3, respectivamente. Las puntuaciones de los indices de DNL 1, 2 y 3 estaban todas significativamente asociadas con el grado de esteatosis, con unos valores de p menores que 0,001 para todos los indices.
Tabla 6 - Asociacion de los indices de DNL con el grado de esteatosis
Aunque la invencion se ha descrito en detalle y haciendo referencia a realizaciones concretas de la misma, para los expertos en la tecnica sera evidente que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invencion.
Claims (15)
1. - Un metodo para calcular la lipogenesis de novo en un sujeto, que comprende:
medir los niveles de tres o mas biomarcadores en una muestra biologica, en el que los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en el nivel total de acido minstico (14:0), el nivel total de acido miristoleico (14:1n5), el nivel total de palmitato (16:0), el nivel total de palmitoleato (16:1n7), el nivel total de acido sapienico (16:1n10), el nivel total de escualeno, el nivel total de linoleato (18:2n6), el nivel total de acido araquidonico (20:4n6), el nivel total de acido docosaheaenoico (22:6n3), el nivel de acido minstico (14:0) en una o mas clases de lfpidos, el nivel de acido miristoleico (14:1n5) en una o mas clases de lfpidos, el nivel de palmitato (16:0) en una o mas clases de lfpidos, el nivel de palmitoleato (16:1n7) en una o mas clases de lfpidos, el nivel de acido sapienico (16:1n10) en una o mas clases de lfpidos, el nivel de escualeno en una o mas clases de lfpidos, el nivel de linoleato (18:2n6) en una o mas clases de lfpidos, el nivel de acido araquidonico (20:4n6) en una o mas clases de lfpidos, y el nivel de acido docosaheaenoico (22:6n3) en una o mas clases de lfpidos en una muestra recolectada de un sujeto; y
usar uno de los siguiente modelos para generar una puntuacion de mdice de lipogenesis de novo para calcular la lipogenesis de novo en el sujeto:
(i) DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)
(ii) DNL = (a(16:0)+b(16:1n7))/c(18:2n6)
(iii) DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)
(iv) DNL = a(16:0)+b(16:1n7)-c(18:2n6)+d(14:0)+e(14:1n5)-f(20:4n6)-g(22:6n3)
(v) DNL = a(16:0)+b(16:1n10)-c(18:2n6), o
(vi) DNL = a(16:0)+b(16:1n10)-c(escualeno)
en los que a, b, c, d, e, f, y g son numeros constantes; (16:0), (16:1n7), (18:2n6), (14:0), (14:1n5), (20:4n6), (22:6n3), (16:1n10), y escualeno son valores medidos del analito de biomarcador; y DNL es la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo predicha.
2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que los biomarcadores comprenden los niveles totales de palmitato (16:0), palmitoleato (16:1n7) y linoleato (18:2n6) en sangre.
3. - El metodo de la reivindicacion 2, en el que los biomarcadores comprenden ademas los niveles totales de acido minstico (14:0), y (14:1n5) en sangre.
4. - El metodo de la reivindicacion 3, en el que los biomarcadores comprenden ademas los niveles totales de acido araquidonico (20:4n6) y acido docosaheaenoico (22:6n3) en sangre.
5. - El metodo de la reivindicacion 1, en la que muestra biologica se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sebo, una muestra de piel, una muestra epidermica y una muestra de celulas de la piel.
6. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que los biomarcadores se miden en una o mas clases individuales de lfpidos seleccionadas del grupo que consiste en triacilgliceridos, fosfatidilcolina y esteres de colesterilo.
7. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que los biomarcadores se miden despues de separar los acidos grasos de su esqueleto.
8. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que los biomarcadores se miden como una especie de lfpido compleja intacta.
9. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que los biomarcadores se miden en los lfpidos en sangre totales.
10. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo es la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo de sebo y se calcula usando el modelo (v) o (vi).
11. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que se emplea la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo para evaluar la salud hepatica de un individuo que presenta una insuficiencia hepatica en forma de esteatohepatitis no alcoholica (NASH), enfermedad del Imgado graso no alcoholica (NAFLD), resistencia a la insulina o diabetes.
12. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que se emplea la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo para estadificar trastornos hepaticos, en el que el trastorno hepatico se selecciona del grupo que consiste en esteatohepatitis no alcoholica (NASH) y enfermedad del Imgado graso no alcoholica (NAFLD).
13.- El metodo de la reivindicacion 1, en el que se emplea la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo para
controlar la respuesta a un agente terapeutico de la lipogenesis de novo y trastornos de enfermedad asociados.
14. - El metodo de la reivindicacion 13, en el que el agente terapeutico es un inhibidor de molecula pequena.
15. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que se emplea la puntuacion del mdice de lipogenesis de novo para determinar la eficacia de un agente terapeutico para inhibir la lipogenesis de novo.
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