ES2698971T3 - Aumento de la recombinación meiótica en plantas por la inhibición de la proteína FIDG - Google Patents

Abstract

Procedimiento para aumentar la frecuencia de CO meióticos en una planta, caracterizado porque comprende la inhibición en dicha planta de una proteína denominada de aquí en adelante FIDG, teniendo dicha proteína al menos un 45 % de identidad de secuencia, o al menos un 60 % de similitud de secuencia, con la proteína AtFIDG de secuencia SEQ ID NO: 1, estando calculados dichos porcentajes con la ayuda del algoritmo Needle EMBOSS usando parámetros por defecto para el cálculo de identidad y la matriz BLOSUM62 para el cálculo de similitud, y que contiene un dominio AAA-ATPasa y un dominio VSP4, catalogados respectivamente con las referencias PFAM PF00004 y PF09336.

Description

DESCRIPCIÓN

Aumento de la recombinación meiótica en plantas por la inhibición de la proteína FIDG

La presente invención está relacionada con un método para aumentar la recombinación meiótica en plantas.

La recombinación meiótica es un intercambio de ADN entre cromosomas homólogos en el curso de la meiosis; tiene lugar durante la profase de la primera división meiótica. Uno de los productos de la recombinación es el entrecruzamiento genético, que conlleva un intercambio recíproco de continuidad entre dos cromátidas homólogas. Esta profase (profase I) comprende 5 estadios sucesivos: leptoteno, cigoteno, paquiteno, diploteno y diacinesis. En leptoteno, los cromosomas se individualizan, formándose cada cromosoma por dos cromátidas hermanas procedentes de la duplicación que tiene lugar previamente a la profase. Durante el cigoteno, los cromosomas homólogos se aparean, formando una estructura llamada “bivalente” que contiene cuatro cromátidas, dos cromátidas hermanas maternas y dos cromátidas hermanas paternas, homólogas de las cromátidas maternas. En paquiteno, los cromosomas están totalmente apareados, y se forman nódulos de recombinación entre las cromátidas homólogas estrechamente ligadas entre ellas por el complejo sinaptonémico (SC); en diploteno, el SC se disocia progresivamente y los cromosomas homólogos empiezan a separarse, pero siguen juntos al nivel de los quiasmas, que corresponden a los sitios de entrecruzamiento genético (CO). Los cromosomas se condensan en el curso de la diacinesis; los quiasmas persisten hasta la metafase I, durante la cual mantienen el apareamiento de los bivalentes a una y otra parte de la placa ecuatorial.

La recombinación meiótica se origina por la formación de roturas bicatenarias (RBC) en una u otra de las cromátidas homólogas, y es el resultado de la reparación de estas roturas, usando como matriz una cromátida del cromosoma homólogo.

La recombinación meiótica tiene como consecuencia provocar una redistribución de los alelos de origen paterno y materno en el genoma, lo que contribuye a generar diversidad genética. Presenta por tanto un interés particular en los programas de mejora de plantas (WIJNKER y de JONG, Trends in Plant Science, 13, 640-646, 2008, Cr ISMANI et al, Journal of Experimental Botany, 64, 55-65, 2013). Especialmente, un control de la tasa de recombinación puede permitir aumentar la mezcla genética, y por tanto las probabilidades de obtener nuevas combinaciones de características; puede permitir también facilitar la introducción de genes de interés, así como la cartografía genética y la clonación posicional de genes de interés.

Se han propuestos diversos métodos para controlar la recombinación meiótica, basados en la sobreexpresión o silenciamiento de uno u otro de los muy numerosos genes identificados como implicados o potencialmente implicados en este mecanismo. Por ejemplo, la solicitud PCT WO/0208432 propone la sobreexpresión de la proteína RAD51, que está implicada en la recombinación homóloga, para estimular la recombinación meiótica; la solicitud US 2004023388 propone sobreexpresar un activador de la recombinación meiótica elegido entre SPO11, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1, DMC1, RAD51, RPA, MSH4, MSHS, MLH1, RAD52, RAD54, TID1, RAD5S, RADS7, RADS9, una resolvasa, una proteína de ligamiento a ADN monocatenario, una proteína implicada en la remodelación de cromatina o una proteína del complejo sinaptonémico, para aumentar la frecuencia de recombinación entre cromátidas homólogas; la solicitud PCT WO 2004016795 propone aumentar la recombinación entre cromosomas homólogos que expresan una proteína SPO11 fusionada con un dominio de enlace con ADN; la solicitud PCT WO 03104451 propone aumentar el potencial de recombinación entre cromosomas homólogos mediante la sobreexpresión de una proteína (MutS) implicada en la reparación de desapareamientos.

Sin embargo, en la mayoría de casos, el efecto de estos genes candidatos sobre la formación de CO meióticos en plantas no se ha confirmado, es por tanto necesario identificar otros genes que intervengan en este fenómeno.

Uno de los factores conocidos por actuar sobre la tasa de recombinación meiótica es el fenómeno de interferencia: la formación de un CO en un lugar del cromosoma inhibe la formación de otros CO en la proximidad. No obstante, se ha mostrado que existían de hecho 2 rutas distintas de formación de CO meióticos (HOLLINGSWORTH y BRILL, Genes Dev., 18, 117-125, 2004; BERCHOWITZ y COPENHAVER, Current genomics, 11, 91-102, 2010). La primera genera CO interferentes denominados CO de tipo I (COI) y hace intervenir un conjunto de genes designados colectivamente con las denominaciones de genes ZMM (ZIP1, ZIP2/SHOC1, ZIP3, HEI10, ZIP4, MER3, MSH4, MSH5, PTD) así como las proteínas MLH1 y MLH3; la segunda ruta genera CO no interferentes denominados CO de tipo II (COII), y depende del gen MUS81.

El uso de una y/o la otra de estas dos rutas es variable de un organismo a otro. En los vegetales superiores, representados por la planta modelo Arabidopsis thaliana, coexisten las 2 rutas, siendo predominante la de CO de tipo I; se ha observado que la inactivación de los genes AtMSH4, AtMSH5, AtMER3, SHOC1, PTD, AtHEI10 o AtZIP4 inducía hasta un 85 % de reducción de la frecuencia de CO (HIGGINS et al., 2004, anteriormente citado; MERCIER et al., 2005, anteriormente citado; CHELYSHEVA et al., PLoS Genet. 3, e83, 2007; HIGGINS et al., Plant J., 55, 28­ 39, 2008 ; MACAISNE et al., Current Biology, 18, 1432-1437, 2008; WIJERATNE et al, Molecular Biology of the cell, 17, 1331-43; CHELYSHEVA et al, PLoS Genetics 8, e1002799, 2012). Ciertos cromosomas homólogos no están ya apareados por esto en forma de bivalentes, sino que aparecen en forma de univalentes. Esta disminución del número de bivalentes está acompañada por una gran reducción de la fertilidad.

Anteriormente, los inventores han identificado un gen, denominado FANCM (por “grupo M de complementación de anemia de Fanconi “Fanconi Anemia Complementaron Group M” en inglés), cuya inactivación compensaba los efectos de la de AtMSH5, SHOC1 o AtZIP4, y permitía aumentar el número de CO meióticos (solicitud PCT WO 2013/038376).

Prosiguiendo sus investigaciones, los inventores han identificado ahora otro gen cuya inactivación produce efectos similares a la de FANCM.

Se trata del gen “FIDGETIN" (FIDG) de Arabidopsis thaliana (AtFIDG): su inactivación compensa los efectos de la de AtMSH5, SHOC1, AtZIP4 o AtHEI10 y permite aumentar el número de CO meióticos y restaurar la fertilidad en mutantes zmm Atzip4-/-, Atmsh5-/-, shoc1-/- y Athei10-/-. Los inventores han descubierto además que los efectos de la inactivación del gen FIDG sobre el aumento del número de CO meióticos se producían no solamente en los mutantes zmm, sino igualmente en las plantas de tipo silvestre que poseían genes ZMM funcionales, y que cuando se combinaba la inactivación del gen FIDG con la del gen FANCM, el número de CO meióticos aumentaba aún más con relación a los observados cuando estos genes se inactivaban separadamente. Por otro lado, no se ha observado ninguna influencia de la inactivación del gen FIDG sobre el fenotipo somático.

Se describió el primer mutante fidg a partir de 1943 (Grüneberg, Journal of Genetics, 45, 22-28, 1943), como asociado en el ratón a un nuevo fenotipo que comprende asentimientos repetidos con la cabeza y movimientos circulares del animal. COX et al. (Nat Genet, 26, 198-202, 2000) han identificado al gen FIDGETIN cuya mutación era responsable de este fenotipo, y han descubierto igualmente la existencia, en el ratón, de dos 2 genes emparentados que han denominado FIDGETIN-Tipo 1 y FIDGETIN-Tipo 2. Se han descrito diferentes funciones de las proteínas FIDG, que las implican especialmente en la regulación de la proliferación y la diferenciación de osteoblastos (PARK et al., J Bone Miner Res, 22, 889-96, 2007), la regulación de la espermatogénesis (L'HOTE et al., PLoS One, 6, e27582, 2011), el seccionamiento de microtúbulos (MUKHERJEE et al., Cell Cycle, 11, 2359-66, 2012) y la participación en un complejo que contiene hsRAD51, implicado en la reparación de cortes bicatenarios en células somáticas (YUAN y CHEN, Proc Natl Acad Sci USA, 2013).

Las proteínas FIDG pertenecen a la familia de las AAA-ATPasas (ATPasas asociadas con diversas actividades), y más particularmente al subgrupo 7 (BEYER, Protein Sci, 6, 2043-58, 1997; FRICKEY y LUPAS, J Struct Biol, 146, 2­ 10, 2004). Este subgrupo comprende igualmente las proteínas katanina y espastina que, como la fidgetina, se describen como enzimas de seccionamiento de microtúbulos. Están implicadas en la regulación del número y tamaño de microtúbulos en numerosas especies: C. elegans (YAKUSHIJI et al., FEBS Lett, 578, 191-7, 2004) D. melanogaster (ZHANG et al., J Cell Biol, 177, 231-42, 2007), H. sapiens (MUKHERJEE et al., Cell Cycle, 11, 2359-66, 2012); f\. thaliana, (STOPPIN-MELLET et al., Biochem J, 365, 337-42, 2002).

Las proteínas FIDG aparecen conservadas en animales y plantas, pero parecen ausentes en levaduras. En los animales, se han identificado de una a tres proteínas emparentadas como fidgetina (especialmente tres en mamíferos), en contraposición, se ha identificado un solo representante de esta familia en el genoma del nematodo C. elegans, de la rana africana de uñas, así como en los de la mayoría de plantas.

Sean animales o vegetales, las proteínas FIDG presentan dos dominios proteicos conservados: un dominio AAA-ATPasa, con un supuesto papel de hidrólisis de a TP; así como un dominio VSP4, conocido por desempeñar un papel importante en el enlace con microtúbulos. Estos dos dominios están respectivamente catalogados con las referencias PF00004 y PF09336 en la base de datos PFAM (PUNTA et al., Nucleic Acids Res. Database Issue 40: D290-D301, 2012)

La inhibición en un planta de una proteína FIDG según la presente invención conlleva un aumento de la frecuencia de CO meióticos en dicha planta.

La secuencia de la proteína FIDG de Arabidopsis thaliana, determinada por los inventores por secuenciación de ADN complementario (ADNc) derivado del ARN mensajero que codifica FIDG, se representa en la lista de secuencias del anexo con el número SEQ ID NO: 1. La secuencia del gen FIDG correspondiente es una secuencia compuesta de dos genes solapantes clasificados en la base de datos TAIR10 con las referencias AT3G27120 y AT3G27130. El ARN mensajero está compuesto por 13 exones, siendo el inicio de traducción aquel del gen predicho como AT3G27130 y perteneciendo el codón de terminación al gen predicho como AT3G27120 (la proteína está codificada por la hebra de Crick). Un sitio de corte y empalme mal predicho es el origen de la mala inscripción de este gen en las bases de datos.

Una investigación en las bases de datos de secuencias permitió identificar los ortólogos de AtFIDG en un amplio panel de eucariotas, y es muy probable que esta proteína esté conservada en el conjunto de plantas terrestres. A modo de ejemplos no limitantes de ortólogos de AtFIDG, se citarán especialmente:

- la proteína de Brachypodium distachyon cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Genbank con el número de acceso XM_003576467;

- la proteína de Carica papaya cuya secuencia polipeptídica está predicha en la base de datos PLAZA con el número de acceso CP00171G00260;

- la proteína de Fragaria vesca cuya secuencia polipeptídica predicha figura en la base de datos Phytozome con el número de acceso mrna25885.1 y en la base de datos PLAZA con el número de acceso FV6G37220; - en Glycin max, existen dos genes procedentes de una duplicación específica de esta especie; su secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Phytozome con los números de acceso Glyma19g18350.2 y Glyma05g14440.2 y en la base de datos PLAZA con los números de acceso respectivos GM19G18350 y GM05G14440;

- la proteína de Oryza sativa cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos GenBank con los números de acceso ABA97741 o EEC69225.1, preferiblemente EEC69225.1;

- la proteína de Populus tricocarpa cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso POPTR_0001s33870;

- la proteína de Ricinus communis cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Genbank con el número de acceso XM_002509479;

- la proteína de Solanum lycopersicum cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Genbank con el número de acceso XM_004233540.1;

- la proteína de Sorghum bicolor cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Genbank con el número de acceso XM_002442067.1;

- la proteína de Theobroma cacao cuya secuencia polipeptídica está predicha en la base de datos Phytozome con el número de acceso Thecc1EG017182t1 o Thecc1EG017182t2 (preferiblemente Thecc1EG017182t2) y en la base de datos PLAZA con el número de acceso TC04G003320;

- la proteína de Vitis vinifera cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso CBI21358;

- la proteína de Zea mays cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso DAA54951;

- la proteína de Hordeum vulgare cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Genbank con el número de acceso BAK02801.1;

- la proteína de Triticum urartu cuya secuencia polipeptídica está disponible en la base de datos Genbank con el número de acceso EMS65393.1.

Se define el objeto de la presente invención por las reivindicaciones 1 a 6.

La presente invención tiene como objeto un procedimiento para aumentar la frecuencia de CO meióticos en una planta, caracterizado porque comprende la inhibición en dicha planta de una proteína denominada de aquí en adelante FIDG, teniendo dicha proteína al menos un 45 % de identidad de secuencia, o al menos un 60 % de similitud de secuencia, con la proteína AtFIDG de secuencia SEQ ID NO: 1, estando calculados dichos porcentajes con la ayuda del algoritmo Needle EMBOSS usando los parámetros por defecto para el cálculo de identidad y la matriz BLOSUM62 para el cálculo de similitud, y conteniendo un dominio AAA-ATPasa y un dominio VSP4, respectivamente, clasificados con las referencias PFAM PF00004 y PF09336.

En un modo de realización, la invención tiene como objeto un procedimiento tal como se define anteriormente, caracterizado porque comprende además la inhibición en dicha planta de una proteína denominada de aquí en adelante FANCM, teniendo dicha proteína al menos un 30 % de identidad de secuencia, o al menos un 45 % de similitud de secuencia, con la proteína AtFANCM de secuencia SEQ ID NO: 2, y conteniendo un dominio helicasa DEXDc y un dominio helicasa HELICc, respectivamente, clasificados con los números de acceso cd00046 y cd00079.

En un modo de realización, la invención tiene como objeto un procedimiento tal como se define anteriormente, caracterizado porque la inhibición de la proteína FIDG, y dado el caso de la proteína FANCM, se obtiene por mutagénesis del gen que codifica dicha proteína o su promotor.

En un modo de realización, la invención tiene como objeto un procedimiento tal como se define anteriormente, caracterizado porque la inhibición de la proteína FIDG, y dado el caso de la proteína FANCM, se obtiene por silenciamiento del gen que codifica dicha proteína expresando en dicha planta un ARN interferente orientado a dicho gen.

En un modo de realización, la invención tiene como objeto una planta mutante caracterizada porque contiene una mutación en el gen FIDG, induciendo dicha mutación la inhibición de la proteína FIDG en dicha planta.

En un modo de realización, la invención tiene como objeto un planta mutante tal como se define anteriormente, caracterizada porque contiene además una mutación en el gen FANCM, induciendo dicha mutación la inhibición de la proteína FANCM en dicha planta.

La presente descripción tiene como objeto un método para aumentar la frecuencia de los CO meióticos en una planta, caracterizado porque comprende la inhibición en dicha planta de una proteína denominada de aquí en adelante FIDG, teniendo dicha proteína al menos un 35 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 50 %, y en orden preferencia creciente, al menos un 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia con la proteína AtFIDG de secuencia SEQ ID NO: 1, y que contiene un dominio AAA-ATPasa (PF00004) y un dominio VSP4 (PF09336).

Preferiblemente, dicha proteína tiene al menos un 70 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 80 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia, con uno cualquiera de los ortólogos de AtFIDG cuya lista se indica a continuación.

Según un modo de ejecución preferido de la descripción, el dominio AAA-ATPasa de dicha proteína FIDG tiene al menos un 60 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 70 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia, con el dominio AAA-ATPasa de la proteína AtFIDG (aminoácidos 431-561 de la SEQ ID NO: 1).

Según otro modo de ejecución preferido de la descripción, el dominio VSP4 de dicha proteína FIDG tiene al menos un 60 %, y en orden de preferencia creciente al menos un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98% de identidad de secuencia, o al menos un 70 %, y en orden de preferencia creciente al menos un 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia, con el dominio Vs P4 de la proteína AtFIDG (aminoácidos 623-672 de la SEQ ID NO: 1).

Ventajosamente, dicha proteína FIDG contiene además un dominio de enlace con RAD51, que tiene al menos un 50 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 70 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia, con los aminoácidos 268-346 de la SEQ ID NO: 1.

A menos que se especifique lo contrario, los valores de identidad y similitud de secuencia indicados aquí se calculan sobre la totalidad de la longitud de las secuencias comparadas, usando el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (programa Needle EMBOSS con los parámetros por defecto). Los cálculos de similitud se efectúan usando la matriz BLOSUM62.

La inhibición puede obtenerse especialmente por mutagénesis del gen FIDG. Por ejemplo, una mutación en la secuencia codificante puede inducir, según la naturaleza de la mutación, la expresión de una proteína inactiva o de una proteína de actividad reducida; una mutación al nivel de un sitio de corte y empalme puede alterar o anular igualmente la función de la proteína y una mutación en la secuencia promotora puede inducir la ausencia de expresión de dicha proteína, o la disminución de su expresión.

La mutagénesis puede efectuarse por ejemplo mediante la supresión de toda o parte de la secuencia codificante o del promotor de FIDG, o mediante inserción de una secuencia exógena, por ejemplo un transposón o un ADN-T, dentro de dicha secuencia codificante o dicho promotor. Puede efectuarse igualmente induciendo mutaciones puntuales, por ejemplo por mutagénesis por EMS, por radiaciones o por mutagénesis dirigida, por ejemplo con la ayuda de nucleasas TALEN (nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción “Transcription Activator-Like Effector Nucleases” en inglés) o de nucleasas de dedo de cinc (CHRISTIAN et al., Genetics, 186, 757-61, 2010; CURTIN et al., Plant Gen., 5, 42-50, 2012).

Los alelos mutados pueden detectarse por ejemplo por PCR, usando cebadores específicos del gen FIDG.

Se describen en la técnica anterior diferentes métodos de mutagénesis y cribado de alto rendimiento. A modo de ejemplos, se pueden citar los métodos de tipo “TILLING” (Orientación a lesiones locales inducidas en el genoma “Targeting Induced Local Lesions In Genome” en inglés), descrito por McCALLUM et al., Plant Physiol., 123, 439-442, 2000). La ausencia de funcionalidad de FIDG en los mutantes puede verificarse basándose en las características fenotípicas de su descendencia; las plantas homocigóticas por una mutación inactivante del gen FIDG tienen una tasa de c O meióticos superior a la de las plantas silvestres (que no portan la mutación en el gen FIDG) de las que proceden. Generalmente, esta tasa de CO meióticos es superior en al menos un 50 %, preferiblemente al menos 2 veces superior, a la de las plantas silvestres de las que proceden.

Como alternativa, la inhibición de la proteína FIDG se obtiene por silenciamiento (silencing en inglés) del gen FIDG. Son conocidas en sí mismas diferentes técnicas de silenciamiento de genes en las plantas (para revisión véase, por ejemplo: WATSON y GRIERSON, Transgenic Plants Fundamentals and Applications (Hiatt, A, ed) New York Marcel Dekker, 255-281, 1992; CHICAS y MACINO, EMBO reports, 21,992-996, 2001). Se puede citar la inhibición antisentido o cosupresión descritas por ejemplo en las patentes US 5190065 y US5283323. Es igualmente posible usar ribozimas orientadas al ARNm de la proteína FIDG.

Preferiblemente, se induce el silenciamiento del gen FIDG por interferencia de ARN orientado a dicho gen.

Un ARN interferente (ARNi) es un ARN pequeño que puede apagar un gen diana de manera específica de secuencia. Los ARN interferentes comprenden en particular “ARN interferentes pequeños” (ARNip) y microARN (miARN).

Inicialmente, los constructos de ADN para expresar ARN interferentes en plantas contenían un fragmento de 100 pb o más (generalmente de 100 a 800 pb) del ADNc del gen diana, bajo el control transcripcional de un promotor apropiado. Actualmente, los contructos más ampliamente usados son aquellos que pueden producir un transcrito de ARN en horquilla pequeño (ARNhp). En estos constructos, el fragmento del gen diana se repite a la inversa, generalmente con una región de espaciado entre las repeticiones (para revisión véase WATSON et al., FEBS Letters, 579, 5982-5987, 2005). Se pueden usar igualmente microARN artificiales (miARNa) dirigidos contra el gen FIDG (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008; SCHWAB et al., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010; WEI et al., Funct Integr Genomics., 9, 499-511,2009).

La presente descripción tiene como objeto constructos de ADN recombinante, y especialmente módulos de expresión, que producen un ARNi que permite apagar el gen FIDG.

Un módulo de expresión según la descripción comprende una secuencia de ADN recombinante cuyo transcrito es un ARNi, especialmente un ARNhp o un miARNa, orientado al gen FIDG, dispuesto bajo el control transcripcional de un promotor funcional en una célula vegetal.

Está disponible en la técnica una amplia selección de promotores apropiados para la expresión de genes heterólogos en células vegetales o plantas.

Estos promotores pueden obtenerse por ejemplo a partir de plantas, de virus de plantas o de bacterias como Agrobacterium. Incluyen promotores constitutivos, a saber promotores que son activos en la mayoría de tejidos y células y en la mayoría de condiciones ambientales, así como promotores específicos de tejido o específicos de célula, que son activos única o principalmente en ciertos tejidos o ciertos tipos de células, y promotores inducibles que se activan por estímulos físicos o químicos.

Son ejemplos de promotores constitutivos que se usan corrientemente en las células vegetales el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) descrito por KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), o sus derivados, el promotor del virus del mosaico de nervaduras de yuca (CsVMV) descrito en la solicitud internacional WO 97/48819, el promotor de ubiquitina del maíz o el promotor “actina-intrón-actina” del arroz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991; número de acceso a GenBank S 44221).

En el marco de la presente descripción, se podrá usar también un promotor específico de la meiosis (es decir, activo exclusiva o preferentemente en células en meiosis). A modo de ejemplo no limitante, se puede citar el promotor DMC1 (KLIMYUK y JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997).

Los módulos de expresión de la descripción comprenden generalmente un terminador transcripcional, por ejemplo el terminador 3'NOS de la nopalina sintasa (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573, 1982), o el terminador 3'CaMV (FRANCK et al., Cell, 21, 285-294, 1980). Pueden comprender igualmente otros elementos de regulación de la transcripción tales como amplificadores.

Los constructos de ADN recombinante según la descripción engloban igualmente vectores recombinantes que contienen un módulo de expresión según la descripción. Estos vectores recombinantes pueden incluir igualmente uno o varios genes marcadores, que permiten la selección de células o plantas transformadas.

La selección del vector más apropiado depende especialmente del hospedador previsto y del método considerado para la transformación del hospedador en cuestión. Están disponibles en la técnica numerosos métodos para la transformación genética de células vegetales o de plantas para numerosas especies vegetales, dicotiledóneas o monocotiledóneas. A modo de ejemplos no limitantes, se pueden citar la transformación mediada por virus, la transformación por microinyección, por electroporación, la transformación por microproyectiles, la transformación por Agrobacterium, etc.

La descripción tiene igualmente como objeto una célula hospedadora que comprende un constructo de ADN recombinante según la descripción. Dicha célula hospedadora puede ser una célula procariota, por ejemplo una célula de Agrobacterium, o una célula eucariota, por ejemplo una célula vegetal genéticamente transformada por un constructo de ADN de la descripción. El constructo puede expresarse transitoriamente, puede incorporarse también a un replicón extracromosómico estable o integrarse en el cromosoma.

La descripción proporciona igualmente un procedimiento para producir una planta transgénica que tiene una tasa de CO meióticos superior a la de la planta silvestre de la que procede, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

- la transformación de una célula vegetal con un vector que contiene un módulo de expresión según la descripción;

- el cultivo de dicha célula transformada con el fin de regenerar una planta que tiene en su genoma un transgén que contiene dicho módulo de expresión.

La descripción engloba igualmente plantas genéticamente transformadas por un constructo de ADN de la descripción. Preferiblemente, dichas plantas son plantas transgénicas, en las que dicho constructo está contenido en un transgén integrado en el genoma de la planta, de modo que se transmite a generaciones sucesivas de plantas. La expresión del constructo de ADN de la descripción da como resultado una regulación negativa de la expresión del gen FIDG, que confiere a dichas plantas transgénicas una tasa de CO meióticos superior a la de las plantas silvestres (que no contienen el constructo de ADN de la descripción) de las que proceden. Generalmente, esta tasa de CO meióticos es superior en al menos un 50 %, preferiblemente al menos 2 veces superior a la de las plantas silvestres de las que proceden.

De manera particularmente ventajosa, la tasa de CO meióticos puede aumentar más combinando en una misma planta la inhibición de la proteína FIDG con la de la proteína FANCM. En este caso, la tasa de CO meióticos es al menos 3 veces superior, preferiblemente al menos 5 veces superior, a la de las plantas silvestres de las que proceden.

El aumento de la tasa de CO meióticos por inhibición de la proteína FANCM se describe en la solicitud PCT WO2013038376, cuyo contenido se incorpora como referencia a la presente descripción.

La proteína FANCM se define como una proteína que tiene al menos un 30 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 45 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia con la proteína AtFANCM de Arabidopsis thaliana (GenBank: NP_001185141; UniProtKB: F4HYE4), y que contiene un dominio helicasa DEXDc (cd00046) y un dominio helicasa HELICc(cd00079). Preferiblemente, el dominio helicasa DEXDc tiene al menos un 65 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 75 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia con el dominio DEXDc (aminoácidos 129-272) de la proteína AtFANCM, y el dominio helicasa HELICc tiene al menos un 60 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia, o al menos un 70 %, y en orden de preferencia creciente, al menos un 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de similitud de secuencia con el dominio HELICc (aminoácidos 445-570) de la proteína AtFANCM. La secuencia polipeptídica de la proteína AtFANCM se representa en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID NO: 2.

La inhibición en una planta de una proteína FANCM tal como se define anteriormente conlleva un aumento de la frecuencia de CO meióticos en dicha planta.

La presente invención tiene igualmente por tanto como objeto:

- un procedimiento para aumentar la frecuencia de CO meióticos en una planta, que comprende la inhibición en dicha planta de la proteína FIDG y de la proteína FANCM;

- plantas mutantes que contienen en el gen FIDG una mutación que induce la inhibición de la proteína FIDG, y en el gen FANCM una mutación que induce la inhibición de la proteína FANCM.

La presente invención puede aplicarse especialmente en el campo de la mejora de plantas, con el fin de acelerar la obtención de nuevas variedades. Permite también facilitar la recombinación entre especies emparentadas, y por tanto la introducción de caracteres de interés. Permite igualmente acelerar el establecimiento de mapas genéticos y las clonaciones posicionales.

La presente descripción se aplica a un amplio abanico de plantas de interés agronómico monocotiledóneas o dicotiledóneas. A modo de ejemplos no limitantes, se pueden citar colza, girasol, patata, maíz, trigo, cebada, centeno, sorgo, arroz, soja, judía, zanahoria, tomate, calabacín, pimiento, berenjena, nabo, cebolla, guisante, pepino, puerro, alcachofa, remolacha, col, coliflor, lechugas, endivia, melón, sandía, fresera, manzano, peral, ciruelo, álamo, viña, algodón, rosa, tulipán, etc.

La presente descripción se comprenderá mejor con la ayuda del complemento de descripción siguiente, que se refiere a ejemplos no limitantes que ilustran los efectos de mutaciones del gen AtFIDG sobre la recombinación meiótica y la tasa de CO, así como de las figuras adjuntas:

Figura 1: Gráfica que representa el número de bivalentes en metafase I de supresores (mutantes zmm-/-) en comparación con el de plantas silvestres y plantas zmm homocigóticas no mutadas porEMS. En las abscisas fenotipo de las plantas ensayadas; en las coordenadas, número de bivalentes (en negro) y de pares univalentes (en gris claro) por meiosis.

Figura 2: Gráfica que representa las frecuencias de recombinación medidas en el doble mutante fidg-1 fancm-1.

Leyenda:

stre

fancm

fidg-1 fancm-1

Eje de abscisas: intervalos ensayados según la nomenclatura de BERCHOWITZ y COPENHAVER (Nat. Protoc., 3, 41-50, 2008). I2a e I2b son dos intervalos adyacentes en el cromosoma 2; I3b e I3c en el cromosoma 3; I5c e I5d en el cromosoma 5. Eje de coordenadas: distancia genética (en cM).

EJEMPLO 1: OBTENCIÓN DE MUTANTES SUPRESORES DE MUTACIONES DE GENES ZMM

Se mutaron granos de Arabidopsis thaliana homocigóticos para inserción de ADN-T en AtZIP4, SHOC1, AtHEI10, AtMSH5 o AtMSH4 (Atzip4-/-, shocl-/-, Athei10-/-, Atmsh5-/- o Atmsh4-/-) por EMS (sulfonato de etilmetano). Las plantas procedentes de granos mutados (población M1, heterocigotos para las mutaciones inducidas por EMS, y homocigotos para la mutación del gen ZMM) tienen un fenotipo idéntico, resultante de la inactivación del gen ZMM, que se traduce por una gran disminución de la frecuencia de CO, lo que lleva a una gran disminución del número de bivalentes y a una bajada muy importante de la fertilidad (plantas “semiestériles”) que da como resultado la formación de silicuas cortas que se diferencian fácilmente de las de las plantas silvestres. Se autopolinizaron plantas M1 para producir una población de descendientes (población M2) que contienen potencialmente plantas homocigóticas para las mutaciones inducidas por EMS. Se seleccionaron y genotiparon plantas de la población M2 que tienen silicuas más largas que las de las plantas zmm homocigóticas de la generación M1 con el fin de verificar el estado homocigótico para la inserción de ADN-T en el gen ZMM referido. Son supresores. Se compararon el número de bivalentes en metafase I de estos supresores con el de plantas silvestres y de plantas zmm homocigóticas no mutadas por EMS.

Se ilustran los resultados por la Figura 1.

Mientras que las plantas silvestres muestran sistemáticamente 5 bivalentes por meiosis, los mutantes zmm-/-, especialmente Atzip4-/-, muestran una gran disminución del número de bivalentes (y por tanto de la aparición de univalentes). Las mutaciones en FIDGETIN de fondo Atzip4-/- (supresores 339 y 346) permiten restaurar parcialmente la formación de bivalentes. Los mutantes de fidg sencillos presentan, como el silvestre, 5 bivalentes.

En las plantas zmm/SUPRESOR, se observa una mala segregación de los cromosomas que da como resultado una disminución del número de bivalentes, inducida por la mutación zmm, y que conduce a gametos desequilibrados no viables. Por el contrario, en las plantas zmm/supresor, el número de bivalentes es más elevado, asegurando una fertilidad en parte restaurada. Los mutantes ZMM/supresor sencillos se comportan como las plantas silvestres, se observa una segregación normal de cromosomas que conduce a la formación de gametos equilibrados.

Las plantas zmm/supresor y ZMM/supresor no presentan por otro lado diferencias somáticas fenotípicas visibles con las plantas silvestres. Las mutaciones inducidas por EMS son recesivas. Efectivamente, no se traducen en un fenotipo detectable en estado heterocigótico en la población de mutantes M1, y las plantas resultantes de retrocruzamiento de mutantes zmm/supresor con los mutantes zmm iniciales de los que proceden respectivamente tienen un fenotipo que no difiere del de los mutantes iniciales. Por otro lado, la segregación de fenotipos “fértil” y “semiestéril” en los descendientes procedentes de la autopolinización de plantas resultantes del retrocruzamiento de mutantes zmm/supresor con los mutantes zmm iniciales de los que proceden respectivamente indica que está afectado por la mutación un solo locus.

EJEMPLO 2: LOCALIZACIÓN EN EL GEN FIDGETIN

Entre los mutantes de EMS descritos en el Ejemplo 1 anterior, se aislaron dos estirpes de mutantes supresores de la mutación del gen ZIP4 (Figura 1), tres estirpes de mutantes supresores de la mutación del gen SHOC1, tres estirpes de mutantes supresores de la mutación del gen AtMSH5, tres estirpes de mutantes supresores de la mutación del gen AtHEI10, así como una estirpe de mutantes supresores de la mutación del gen AtMSH4. Estas estirpes se denominan respectivamente: zip4(s)339, zip4(s)346, msh5(s)647, msh5(s)5, msh5(s)652, shoc1(s)101, shoc1(s)123, shoc1(s)161, hei10(s)141, hei10(s)208, hei10(s)235, msh4(s)80.

Las mutaciones correspondientes se localizaron todas en la secuencia genómica de AtFIDGETIN. Las pruebas de complementación confirmaron que estas mutaciones eran las responsables del fenotipo observado.

La Tabla I siguiente indica la naturaleza y posición de las mutaciones identificadas.

Tabla I

EJEMPLO 3: INFLUENCIA DE LA INACTIVACION DEL GEN FIDG SOBRE LA FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN MEIÓTICA

Se compararon las frecuencias de recombinación meiótica en plantas mutantes fidg y silvestres. Se midió la frecuencia de recombinación meiótica por análisis de tétradas con la ayuda de marcadores fluorescentes, como se describe por BERCHOWITZ y COPENHAVER (Nat. Protoc., 3, 41-50, 2008). Se midió la distancia genética en 2 intervalos adyacentes en el cromosoma 2 (I2a e I2b), 2 intervalos adyacentes en el cromosoma 3 (I3b e I3c), así como 2 intervalos adyacentes en el cromosoma 5 (intervalos I5c e I5d). Se ilustran los resultados por la Figura 2 y la Tabla II.

La mutación del gen FIDGETIN aumenta la recombinación con relación a la silvestre un 72 % de media en los 6 intervalos.

EJEMPLO 4: INFLUENCIA DE LA INACTIVACIÓN COMBINADA DE LOS GENES FIDG Y FANCM SOBRE LA FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN MEIÓTICA

De la misma forma que en el ejemplo 2, se midieron las frecuencias de recombinación en el doble mutante fidg-1 fancm-1. Se representan los resultados en la Figura 2 y en la Tabla II.

La Tabla II representa los tamaños genéticos (en cM) de diferentes intervalos en diferentes mutantes (los errores estándares se indican entre paréntesis; ND: no determinado).

Tabla II

Estos resultados muestran que la inactivación conjunta de FIDG y FANCM (fidg-1 fancm-1) conduce a un aumento medio de la recombinación de 5,77 veces con relación al silvestre (media de los 6 intervalos)

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para aumentar la frecuencia de CO meióticos en una planta, caracterizado porque comprende la inhibición en dicha planta de una proteína denominada de aquí en adelante FIDG, teniendo dicha proteína al menos un 45 % de identidad de secuencia, o al menos un 60 % de similitud de secuencia, con la proteína AtFIDG de secuencia SEQ ID NO: 1, estando calculados dichos porcentajes con la ayuda del algoritmo Needle EMBOSS usando parámetros por defecto para el cálculo de identidad y la matriz BLOSUM62 para el cálculo de similitud, y que contiene un dominio AAA-ATPasa y un dominio VSP4, catalogados respectivamente con las referencias PFAM PF00004 y PF09336.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la inhibición en dicha planta de una proteína denominada de aquí en adelante FANCM, teniendo dicha proteína al menos un 30 % de identidad de secuencia, o al menos un 45 % de similitud de secuencia, con la proteína AtFANCM de secuencia SEQ ID NO: 2, y que contiene un dominio helicasa DEXDc y un dominio helicasa HELICc, catalogados respectivamente con los números de acceso cd00046 y cd00079.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la inhibición de la proteína FIDG, y dado el caso de la proteína FANCM, se obtiene por mutagénesis del gen que codifica dicha proteína o su promotor.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la inhibición de la proteína FIDG, y dado el caso de la proteína FANCM, se obtiene mediante silenciamiento del gen que codifica dicha proteína que expresa en dicha planta un ARN interferente orientado a dicho gen.

5. Planta mutante caracterizada porque contiene una mutación en el gen FIDG, induciendo dicha mutación la inhibición de la proteína FIDG en dicha planta, no obteniéndose dicha planta exclusivamente por medio de un procedimiento esencialmente biológico.

6. Planta mutante según la reivindicación 5, caracterizada porque contiene además una mutación en el gen FANCM, induciendo dicha mutación la inhibición de la proteína FANCM en dicha planta.