ES2693697T3 - Actividad de la hormona folículo estimulante equina recombinante - Google Patents
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Abstract
Un análogo de eFSH que tiene al menos el 95 % de homología con la SEQ ID NO 8 para su uso en un método de aumento de la actividad reproductora en uno o más ungulados, comprendiendo el método la administración de una cantidad eficaz del análogo al uno o más ungulados, en donde la cantidad eficaz está entre aproximadamente 200 μg y 850 μg, y en donde se administra una dosis del análogo de la eFSH a cada uno o más ungulados, al menos una vez al día, durante 4 a 9 días en un único ciclo del estro.
Description
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DESCRIPCION
Actividad de la hormona foliculo estimulante equina recombinante Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio sobre la solicitud provisional de Estados Unidos N.° 60/991.297, presentada el 30 de noviembre de 2007, que se incorpora en el presente documento a modo de referencia en su totalidad en la medida en que no sea inconsistente con la divulgacion del presente documento.
Antecedentes de la invencion
La progesterona se requiere para mantener la prenez, y las bajas concentraciones de progesterona se asocian con la infertilidad. Las concentraciones de progesterona en sangre estan influidas por las tasas de secrecion y de metabolismo/eliminacion. Hay una evidencia de que las vacas lecheras actuales mantienen concentraciones de progesterona en sangre mas bajas que las medidas en el ganado vacuno de hace varias decadas (Lucy et al. (1998) "Reproductive endocrinology of lactating dairy cows selected for increased milk production", J. Anim. Sci., 76 (Supl. 1):296). Un cuerpo luteo mas grande secreta mas progesterona y tiene un efecto positivo sobre el reconocimiento de la prenez y en las tasas de prenez, pero hay evidencias de que las vacas lecheras tienen cuerpos luteos mas pequenos de lo deseable en algunas circunstancias (Lucy 2001, citado anteriormente; Vasconcelos et al. (2001) "Reduction in size of the ovulatory follicle reduces subsequent luteal size and pregnancy rate," Theriogenology, 56:307-314). El higado es el sitio principal del metabolismo de la progesterona. Los estudios recientes demuestran que un aumento en la ingesta de alimento aumenta el flujo sanguineo en el higado y aumenta la tasa de eliminacion de progesterona, reduciendo de este modo las concentraciones de progesterona serica (Sangsritavong et al. (2000) "Liver blood flow and steroid metabolism are increased by both acute feeding and hypertrophy of the digestive tract", J. Anim. Sci., 78(Supl 1 )221; y Wiltbank, M.C. et al. (2001) "Novel effects of nutrition on reproduction in lactating dairy cows", J. Dairy Sci., 84(Supl. 1 ):84).
La baja progesterona serica durante la fase lutea del ciclo del estro se asociaria con una tasa de concepcion baja en la primera inseminacion. Las bajas concentraciones de progesterona pueden ser resultado de una secrecion inadecuada o niveles alternativamente altos de metabolismo/eliminacion, incluso cuando la inseminacion ha producido un embrion potencialmente viable. La baja progesterona permitiria la generacion de prostaglandina por el endometrio uterino en aproximadamente el dia 16 del ciclo del estro bovino, dando como resultado la luteolisis y la induccion de la ovulacion, por lo tanto, la muerte del embrion y fracaso al mantener la prenez (Binelli, M. et al. (2001) "Antiluteolytic strategies to improve fertility in cattle," Theriogenology, 56:1451-1463). El aumento de progesterona serica o el mantenimiento de los niveles apropiados de progesterona serica en animales fertiles es un metodo terapeutico prometedor para mantener la prenez y evitar la perdida de la prenez.
En la actualidad, se usan varias terapias hormonales para aumentar la fertilidad o para mantener la prenez. Thatcher et al. (2001 Theriogenology 55:75-89) describen los efectos de los tratamientos hormonales sobre el rendimiento reproductivo del ganado vacuno. Los tratamientos hormonales incluyen la administracion de somatotropina bovina (bST, del ingles bovine somatotrophin) y gonadotropina corionica humana (hCG, del ingles human chorionic gonadotropin). D’Occhio et al. (2000 Anim. Reprod. Sci. 60-61:433-442) describen diversas estrategias para la gestion de ganado vacuno de carne usando implantes agonistas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH, del ingles gonadotropin releasing hormone). De Rensis et al. (2002 Theriogenology 58(9):1675-1687) describen el efecto de la administracion de GnRH o de hCG en vacas lecheras antes de la inseminacion artificial. Martinez et al. (1999 Anim. Reprod. Sci. 57:23-33) describe la capacidad de la hormona luteinizante (LH, del ingles luteinizing hormone) y de la GnRH para inducir la aparicion de la onda folicular en novillas de carne en los dias 3, 6 y 9 del ciclo del estro, tras la ovulacion (dia 0), sin inseminacion. Santos et al. (2001 J. Animal Science 79:2881-2894) describen el efecto sobre el rendimiento reproductor de la administracion intramuscular de 3.300 UI de hCG a vacas lecheras de alta productividad en el dia 5 tras la inseminacion artificial. Lee et al. (1983 Am. J. Vet. Res. 44(11 ):2160-2163) describen el efecto sobre vacas lecheras de la administracion de GnRH en el momento de la inseminacion artificial. Las Patentes de EE.UU. N.° 5.792.785 (presentada el 11 de agosto de 1998) y 6.403.631 (presentada el 11 de junio de 2002) describen metodos y composiciones para la administracion de melatonina antes y despues de la inseminacion para potenciar el exito de la prenez en un animal. Chagas e Silva et al. (2002 Theriogenology 58(1 ):51 -59) describe perfiles de progesterona en plasma tras la transferencia del embrion en ganado de vacas lecheras. Weems et al. (1998 Prostaglandins and other Lipid Mediators) describen los efectos de las hormonas sobre la secrecion de progesterona en los cuerpos luteos (CL) de vacas no prenadas y prenadas. La patente de Estados Unidos N.° 4.780.451 (presentada el 25 de octubre de 1988) describe composiciones y metodos usando LH y hormona foliculo estimulante para producir superovulacion en ganado vacuno; Farin et al. (1988 Biol. Reprod. 38:413-421) describe el efecto sobre el peso luteo ovino de la administracion intravenosa de 300 UI de hCG en los dias 5 y 7,5 del ciclo del estro, sin inseminacion. Hoyer y Niswender (1985 Can. J. Physiol. Pharmacol. 63(3):240-248) describen la regulacion de la esteroidogenesis en celulas luteas ovinas. Juengel y Niswender (1999 J. Reprod. Fertil. Supl. 54:193-205) describen la regulacion molecular de la progesterona lutea en rumiantes domesticos. La patente de Estados Unidos 5.589.457 (presentada el 31 de diciembre de 1996) describe metodos para sincronizar la ovulacion en ganado vacuno usando GnRH, LH, y/o hCG y PGF2a.
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Muchos de estos tratamientos usan hormonas o analogos de hormonas de la familia de hormonas glucoproteicas, que consiste en las protemas hipofisarias de hormona luteinizante (LH), hormona folfculo-estimulante (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y gonadotropina corionica (CG). Las gonadotropinas, que incluyen CG, FSH y LH, son esenciales para la funcion reproductora. Son heterodfmeros compuestos de dos subunidades a y p asociadas de manera no covalente. Ambas subunidades son oligosacaridos (N)-ligados que contienen asparagina y, en el caso de la subunidad CGp, los hidratos de carbono O-ligados tambien estan presentes en un grupo de aminoacidos en el extremo C-terminal. Las subunidades p humanas estan codificadas por genes separados, y las protemas LHp y CGp son estructuralmente y funcionalmente similares; teniendo una identidad de aminoacidos de mas del 80 % (Pierce JG, Parsons (1981) "Glycoprotein hormones: structure and function", Biochem. 50:465-495). Dentro de una especie, la secuencia de aminoacidos de la subunidad a es comun para las cuatro hormonas (Pierce JG, Parsons (1981) Biochem. 50:465-495).
Todos los mamfferos sintetizan LH, pero solo se ha identificado CG en primates y equidos. Al contrario de los primates, las protemas LHp equina y CGp equina estan codificadas por el mismo gen y tienen la misma secuencia de protemas. Sin embargo, los oligosacaridos N-ligados en la CG equina de la placenta (eCG) contienen galactosa y acido sialico terminal, mientras que el sulfato de GalNAc es el resto terminal principal en la LH equina (eLH) hipofisaria. El contenido en hidratos de carbono de la eCG sobrepasa el 40 % de su masa y es la mas glucosilada de todas las especies de hormonas de glucoprotema (Bousfield et al. (2001) "Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin and equine luteinizing hormone p by solid-phase Edman degradation", Biol Reprod. 64: 136-147; Moore y Ward (1980) "Pregnant mare serum gonadotropin. An in vitro biological characterization of the lutropin-follitropin dual activity", J Biol Chem 255: 6923-6929). Esto se atribuye a una mayor abundancia de unidades de hidratos de carbono O-ligadas en comparacion con la CG de primate. Por el contrario, el contenido en hidratos de carbono de la eLH es del 25 % (Bousfield et al. (2001) Biol Reprod. 64:136-147).
En la yegua y el semental, el uso de una variedad de hormonas de otras especies no es satisfactorio debido a su potencial para generar una fuerte respuesta inmunitaria. Una de esas hormonas que induce una respuesta de anticuerpos es hCG (Roser et al., 1979). Como alternativas, se ha probado GnRH, los extractos de hipofisis de equino y la gonadotropina corionica equina (eCG; formalmente denominada gonadotropina serica de yegua prenada (PMSG)). La buserelina de accion corta (un agonista de GnRH) ha sido exitosa en la induccion de la ovulacion pero requiere mas de una induccion para inducir la ovulacion en un perfodo de 48 horas. La cistorelina (GnRH natural) es tambien de accion corta y requiere mas de una inyeccion y su uso no esta autorizado en caballos. La deslorelina (un analogo de GnRH) funciona muy bien en la estimulacion de la ovulacion en 24-48 horas. La deslorelina ha estado en el mercado en dos formas; un implante de liberacion lenta o un inyectable de liberacion lenta. Se ha descubierto que el implante, Ovuplant™, es eficaz en la induccion de la ovulacion en 48 horas, pero en algunas yeguas evito que volvieran a estar en celo durante semanas cuando se aplicaban segun las indicaciones (Johnson et al., 2002). Actualmente, Ovuplant™ esta en el mercado. La forma inyectable de GnRH funciona bien y esta disponible de algun modo como un "reactivo de la composicion".
Los extractos de hipofisis pueden ser productos terapeuticos eficaces para la reproduccion, pero contienen contaminantes y muchos varfan en sus cantidades de LH y de FSH. El tratamiento con extractos hipofisarios o GnRH de una yegua o de un semental da como resultado la exposicion de las gonadas a una proporcion relativamente fija de LH y de FSH, ofreciendo posibilidades limitadas de manipulacion de las gonadas para el desarrollo folicular, la ovulacion o la espermatogenesis. Ademas, los extractos hipofisarios de equino contienen solo el 8-10 % de LH y el 68 % de FSH (Guillou y Combarnous, 1983), lo que requiere el uso de grandes dosis de tratamiento para ser eficaces. Los extractos hipofisarios de equino parecen aumentar el numero de folfculos durante la ovulacion, pero el numero de ovulaciones y el numero de embriones obtenidos no parece que se correlacione siempre con el numero de folfculos desarrollados (Scoggins et al., 2002). La CG de equino ha demostrado tener poco, si lo hay, efecto en la yegua para estimular el desarrollo folicular y la ovulacion durante el estro, probablemente debido a su incapacidad para unirse al tejido ovarico durante el estro (Stewart y Allen, 1979).
Con el fin de usar gonadotropinas de equino para mejorar la eficacia en la reproduccion en equinos y en otras especies, la disponibilidad de protemas purificadas es esencial. En la actualidad, las fuentes para gonadotropinas de equino son el suero (eCG-PMSG) y los extractos hipofisarios completos. Obtener cantidades suficientes de estar hormonas naturales para tal tarea es caro y diffcil. Las preparaciones de gonadotropinas hipofisarias puras de equino sin contaminacion cruzada no estan facilmente disponibles. Dado el problema de las variaciones entre animales de las gonadotropinas de equino naturales y la heterogeneidad de la carga en los hidratos de carbono N-ligados, la capacidad para generar las correspondientes protemas recombinantes producira gonadotropinas de una composicion mas homogenea que se puede estandarizar con respecto a la masa y a la bioactividad. Tales protemas seran crfticas para calibrar los ensayos clmicos de laboratorio y para el manejo de la reproduccion, como acortar el tiempo de ovulacion en yeguas en transicion y en ciclo para la reproduccion natural e inseminacion artificial. El uso de las formas recombinantes, al contrario de las hormonas extrafdas del suero y del tejido hipofisario, evitarfa la cocontaminacion de patogenos y agentes con una propension a provocar enfermedades relacionadas con priones.
Hay una necesidad en la materia de agentes terapeuticos mejorados y seguros para aumentar la eficacia de la reproduccion en caballos y en ganado vacuno, principalmente aumentando la ovulacion, y despues manteniendo la prenez de las yeguas y vacas tras la inseminacion.
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En el primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un analogo de eFSH que tiene al menos el 95 % de homologia con la SEQ ID No 8 para su uso en un metodo de aumento de la actividad reproductora en uno o mas ungulados, comprendiendo el metodo la administracion de una cantidad eficaz del analogo al uno o mas ungulados, en donde la cantidad eficaz esta entre aproximadamente 200 pg y 850 pg, y en donde se administra una dosis del analogo de la eFSH a cada uno o mas ungulados, al menos una vez al dia, durante 4 a 9 dias en un unico ciclo del estro. La presente invencion proporciona un analogo de la hormona foliculo estimulante (FSH), en particular, un analogo de la FSH de equino, y metodos de uso de tales analogos para mejorar la eficacia de la reproduccion de los caballos, del ganado vacuno y de otros mamiferos. La FSH de equino recombinante (eFSH recombinante o reFSH) puede potenciar la reproduccion, no solo en los caballos, sino tambien en otras especies, promoviendo la superovulacion, el desarrollo folicular y la produccion de embriones. El uso de un analogo de reFSH para estimular el desarrollo folicular y/o la superovulacion ofrece la ventaja de usar un producto de FSH pura sin los contaminantes proteicos o la actividad de LH no deseada del extracto hipofisario de equino. La presente invencion tambien proporciona un metodo fiable para producir reFSH biologicamente activa. Preferentemente, las subunidades del analogo de FSH recombinante se unen entre si para formar un analogo de FSH de cadena simple.
Tambien se desvela un metodo de estimulacion del desarrollo folicular o de superovulacion en mamiferos, preferentemente ungulados tales como caballos o ganado vacuno, que comprende la administracion de una dosis eficaz de la eFSH recombinante al animal. En una realizacion adicional, la eFSH recombinante se administra en multiples inyecciones intramusculares. Preferentemente, la eFSH es una eFSH recombinante de cadena simple. En una realizacion, la presente invencion proporciona un analogo de eFSH recombinante de cadena simple, que comprende una subunidad beta de eFSH conectada a una secuencia de enlazador de CTP conectada a una subunidad alfa de eFSH. La secuencia de aminoacidos y de nucleotidos para uno de estos analogos de eFSH (FSHpCTPa) se muestra en la Figura 1. Se ha establecido un bioensayo basado en celulas y se ha desarrollado un ELISA para este analogo. Ademas, se han logrado expresiones tanto amplificadas como a escala.
Se desvelan composiciones bioactivas y metodos de uso de tales composiciones que incluyen los analogos de eFSH activa, en particular, los analogos de eFSH recombinante de cadena simple. Tales productos de analogos de eFSH recombinante activa son beneficiosos para mejorar la actividad reproductora, la superovulacion, el desarrollo folicular y la produccion de embriones en equinos y en otras especies de mamiferos. Los analogos de eFSH recombinantes tambien evitan los problemas de contaminacion cruzada y no desencadenan una fuerte respuesta inmunitaria en los animales tratados.
En una realizacion, los analogos de eFSH se usan para aumentar la actividad reproductora en ungulados, especificamente en caballos y en vacas. En particular, un analogo de eFSH recombinante de cadena simple se usa para estimular la superovulacion, aumentar la produccion de embriones y aumentar la reproduccion en animales hembra. La administracion de eFSH con el fin de aumentar la reproduccion, aumentar el numero de embriones producidos o inducir la superovulacion es deseable en una serie de especies que incluyen, pero sin limitacion, vacas, ovejas, cabras, cervidos, yaks, bufalos acuaticos, bisontes, antilopes, gacelas, alces europeos, renos, alces americanos, borrego cimarron, jirafas, y camelidos que incluyen camellos bactrianos y dromedarios, llamas, cerdos, caballos, alpacas y vicunas. El metodo es particularmente eficaz para aumentar la superovulacion, el desarrollo folicular, la produccion de embriones y las preneces en equinos y en bovinos. Los analogos de eFSH usados en las realizaciones de la presente invencion son al menos puros al 95 % y preferentemente son polipeptidos recombinantes. Mas preferentemente, el analogo de eFSH es una eFSH recombinante de cadena simple biologicamente activa.
Se desvela un metodo de preparacion de analogos de eFSH recombinante mediante la expresion de ADN que codifica las subunidades alfa y beta de eFSH. En una realizacion, se produce un analogo de eFSH recombinante en donde la subunidad alfa esta unida de manera covalente a la subunidad beta usando un peptido enlazador. La FSFH natural se produce como subunidades alfa y beta separadas que no se unen de manera no covalente dentro del cuerpo del animal. La eFSH recombinante de cadena sencilla de la presente invencion tiene un alto nivel de expresion y de bioactividad y se cree que tiene una elevada eficacia y duracion in vivo en comparacion con la eFSH natural debido a que las subunidades alfa y beta no tienen que ensamblarse primero y no se disocian libremente entre si. En una realizacion, un analogo de eFSH recombinante (denominado FSHpCTPa en el presente documento) es un analogo de eFSH recombinante de cadena simple en el que las subunidades alfa y beta de la FSH de equino estan enlazadas entre si usando un peptido de carboxilo terminal de gonadotropina corionica de equino.
Las secuencias de aminoacidos de las subunidades alfa y beta de la eFSH usadas en el presente documento se dan en la SEQ ID NO 5 y en la SEQ ID NO 6, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican estas secuencias de aminoacidos se dan en la SEQ ID NO 1 y en la SEQ ID NO 2, respectivamente, aunque las secuencias de ADN adicionales pueden codificar las mismas subunidades alfa y beta debido a la redundancia del codigo genetico. Se entiende que un analogo de eFSH puede tener pequenas diferencias en la secuencia de aminoacidos en comparacion con las secuencias de eFSH proporcionadas sin que afecte a la funcion. Adicionalmente, un analogo de eFSH puede tener aminoacidos adicionales o delecionados en comparacion con las secuencias de eFSH proporcionadas sin que afecte a la funcion. Preferentemente, el analogo de eFSH contiene adiciones o deleciones de 25 aminoacidos o menos, mas preferentemente de 10 aminoacidos o menos, o mas preferentemente de 5 aminoacidos o menos, que las secuencias de eFSH proporcionadas en la SEQ ID NO 5 y en la SEQ ID NO 6.
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En una realizacion, el analogo de eFSH de cadena simple tiene las subunidades alfa y beta que son al menos el 80 % identicas en secuencia con las subunidades alfa y beta de la FSH de equino de la SEQ ID NO 5 y la SEQ ID NO 6. Preferentemente, el analogo de eFSH comprende un primer polipeptido que tiene al menos el 85 % de homologia con la SEQ ID NO 5 y un segundo polipeptido que tiene al menos el 85 % de homologia con la SEQ ID NO 6. Mas preferentemente, el primer polipeptido tiene al menos el 90 % de homologia con la SEQ ID NO 5 y el segundo polipeptido tiene al menos el 90 % de homologia con la SEQ ID NO 6. Aun mas preferentemente, el primer polipeptido tiene al menos el 95% de homologia con la SEQ ID NO 5 y el segundo polipeptido tiene al menos el 95% de homologia con la SEQ ID NO 6.
Preferentemente, el analogo de eFSH es un polipeptido de cadena simple en el que el primer polipeptido que se corresponde con la subunidad alfa y el segundo polipeptido que se corresponde con la subunidad beta estan unidos de manera covalente. Por unidos de manera covalente, se refiere a que el primer polipeptido ese une al segundo polipeptido de manera directa o a traves de un peptido enlazador, en donde un extremo del peptido enlazador se une al primer polipeptido y el otro extremo del peptido enlazador se une al segundo polipeptido. Los peptidos enlazadores capaces de unirse a los polipeptidos en la sintesis de proteinas recombinantes son bien conocidos en la materia, y se puede usar cualquier peptido enlazador adecuado para expresarse como parte del analogo de la eFSH. Preferentemente, el peptido enlazador tiene entre aproximadamente 10 y 50 aminoacidos, mas preferentemente entre aproximadamente 20 y 40 aminoacidos. En una realizacion, la secuencia del enlazador es una secuencia de enlazador de CTP o una secuencia de enlazador que tiene al menos el 90 % de homologia de secuencia con el enlazador de CTP de equino. En una realizacion adicional, el enlazador de peptidos es el peptido de carboxilo terminal (CTP, del ingles carboxy terminal peptide) de la gonadotropina corionica. Deberia entenderse que las posiciones de las subunidades alfa y veta son reversibles, ya que el analogo de eFSH puede tener la configuracion (subunidad alfa)- enlazador-(subunidad beta) o (subunidad beta)-enlazador-(subunidad alfa). En una realizacion, las moleculas de acido nucleico que codifican el analogo de eFSH se incorporan en un vector de expresion que se transfiere a una celula o linea celular capaz de expresar el vector.
En una realizacion, se usa un analogo de eFSH para producir un evento de superovulacion que da como resultado la recuperacion de embriones viables. En otra realizacion, se usa un analogo de eFSH para aumentar el desarrollo folicular o la produccion del embrion. La induccion de la superovulacion y el aumento de la produccion del embrion son utiles para el trasplante de los embriones y la fertilizacion in vitro. En una realizacion, se administra una cantidad eficaz de un analogo de eFSH a uno o mas ungulados, preferentemente equinos o bovinos, con el fin de aumentar la produccion. En la presente invencion, la eFSH recombinante de cadena simple se puede administrar a los animales como una dosis unica o como multiples dosis durante varios dias para cada ciclo del estro. En una realizacion, la eFSH recombinante se administra diariamente durante aproximadamente 2 a 10 dias, preferentemente durante aproximadamente 4 a 9 dias, mas preferentemente durante aproximadamente 5 a 8 dias. Se puede administrar una dosis unica de la eFSH recombinante por dia al animal, se pueden administrar dos o mas dosis por dia, por ejemplo, a intervalos de 6 horas, de 8 horas o de 12 horas. En una realizacion, se administra una unica dosis diaria o, como alternativa, se administran multiples dosis diarias al animal pero en menores cantidades que en tratamientos comparables de analogos de FSH. Esto se puede atribuir a una elevada actividad y a una mayor duracion por el analogo de FSH de cadena simple.
En una realizacion, el analogo de eFSH se administra al animal aproximadamente 6 a 16 dias tras la ovulacion, preferentemente entre aproximadamente el dia 8 y aproximadamente el dia 14 tras la ovulacion. El analogo de eFSH se puede administrar como una unica inyeccion intramuscular cada dia o en multiples inyecciones cada dia. Se revisan los sintomas de celo en los animales y despues se reproducen mediante inseminacion natural o artificial. En una realizacion adicional, la inseminacion tiene lugar aproximadamente 2 a 8 dias, preferentemente 4 a 6 dias, tras la administracion final de la eFSH. En otra realizacion adicional, los embriones se extraen por enjuague aproximadamente 6-8 dias para su posterior uso.
Las hormonas adicionales, tales como la hormona luteinizante, la gonadotropina corionica y la prostaglandina, se administran de forma opcional, asi como el analogo de eFSH. En una realizacion, se administra prostaglandina al animal ademas de la administracion del analogo de eFSH recombinante. La prostaglandina se administra opcionalmente como una unica dosis, tipicamente mediante inyeccion, o como dosis multiples administradas con varias horas de diferencia. En una realizacion, al animal se le da una primera dosis de prostaglandina tras la administracion del analogo de eFSH seguida por una segunda dosis de prostaglandina que se le da al animal aproximadamente 6 horas a 1 dia despues de la primera dosis de prostaglandina.
En una realizacion, cada dosis del primer analogo de eFSH administrada al animal esta entre aproximadamente 0,01 pg y aproximadamente 5 mg. Preferentemente al animal se le administra el analogo de eFSH entre aproximadamente 1,0 pg y aproximadamente 0,2 mg, mas preferentemente entre aproximadamente 200 pg y aproximadamente 0,1 mg, incluso mas preferentemente entre aproximadamente 500 pg y aproximadamente 850 pg. Se puede administrar el analogo de eFSH usando cualquier medio conocido en la materia, que incluye, pero sin limitacion, la inyeccion intramuscular y la inyeccion intravenosa. Preferentemente, el analogo de eFSH se administra a traves de la inyeccion intramuscular.
Otra realizacion proporciona un kit para inducir superovulacion, desarrollo folicular, o aumentar el numero de
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embriones en un unico ciclo del estro en un mamifero tal como un equino o un bovino que comprende: al menos una dosis que comprende una cantidad eficaz de un analogo de eFSH recombinante de cadena simple que comprende un primer polipeptido que tiene al menos el 95 % de homologia con la SEQ ID NO 5 y un segundo polipeptido que tiene al menos el 95 % de homologia con la SEQ ID NO 6, en donde el primer y el segundo polipeptido estan unidos de manera covalente; un dispositivo para administrar una dosis del analogo de eFSH; e instrucciones para administrar la dosis del analogo de eFSH. En una realizacion adicional, el kit comprende dos o mas dosis que comprenden una cantidad eficaz de una eFSH recombinante de cadena simple. En una realizacion, la cantidad eficaz del analogo de eFSH en cada dosis esta entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 0,2 mg, mas preferentemente entre aproximadamente 200 pg y aproximadamente 0,1 mg, incluso mas preferentemente entre aproximadamente 500 pg y aproximadamente 850 pg y puede variar dependiendo del kit. El dispositivo para administrar la dosis al animal puede ser cualquier dispositivo conocido en la materia, tal como agujas y jeringas. Opcionalmente, el dispositivo es un dispositivo de inyeccion adecuado para administrar una unica dosis del analogo de eFSH. El kit tambien puede comprender componentes tales como hormonas adicionales, tales como prostaglandina, y dispositivos de inyeccion para la administracion de las hormonas adicionales.
En una realizacion, una composicion de la invencion comprende una composicion de proteina tal como se describe en el presente documento, tal como una composicion de eFSH, en una formulacion farmaceutica. En una realizacion adicional, la invencion proporciona un metodo de sintesis de una composicion de la invencion o de una formulacion farmaceutica de la misma. Una formulacion farmaceutica comprende uno o mas excipientes, vehiculos y/u otros componentes tal como se entiende en la materia. Preferentemente, los componentes cumplen los estandares del Formulario Nacional ("NF", del ingles National Formulary), de la Farmacopea de los Estados Unidos ("USP", del ingles United States Pharmacopoeia), o del Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations. En una realizacion, una cantidad eficaz de una composicion de la invencion puede ser una cantidad terapeuticamente eficaz. En una realizacion, la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de una afeccion medica que comprende la administracion, a un sujeto que lo necesite, de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion de la invencion. En una realizacion, la invencion proporciona un medicamento que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una o mas composiciones de la invencion. En una realizacion, la invencion proporciona un metodo para preparar un medicamento para un fin o tratamiento de una afeccion descrita en el presente documento.
Sin desear quedar ligado a ninguna teoria en particular, en el presente documento puede haber una discusion sobre creencias o entendimientos de los principios o mecanismos subyacentes relacionados con la invencion. Se reconoce que, independientemente de la correccion definitiva de cualquier explicacion o hipotesis, una realizacion de la invencion puede, sin embargo, ser operativa y util.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos y de ADN de un analogo de eFSH recombinante de cadena simple (FSHpCTPa) de la presente invencion, en donde la subunidad beta y la subunidad alfa se unen entre si de forma covalente usando un CTP de equino (subrayado).
La Figura 2 es un dibujo esquematico del analogo de eFSH de la Figura 1 en donde las subunidades alfa y beta se unen entre si usando un oligosacarido O-ligado (caja sombreada) con las subunidades dispuestas en tandem, de manera que la subunidad beta esta en N-terminal para la subunidad alfa para formar una molecula de eFSH de cadena simple.
La Figura 3 representa un SDS-PAGE que muestra la FSHpCTPa producida usando los metodos de la presente invencion como un unico punto de 45 kDa.
La Figura 4 es un grafico que compara la actividad biologica in vitro de FSHpCTPa (marcada en la figura como eFSH APNB) con la eFHS natural (extractos hipofisarios naturales, Bioniche Animal Health) en un ensayo de hFSHR en CHO (CHO-hFSHR). Tal como se muestra en la Figura 4, el analogo de eFSH recombinante de cadena simple tiene una actividad biologica aproximadamente igual o mayor que la eFSH natural, especialmente a dosis mas bajas.
La Figura 5 es un grafico que compara las concentraciones de estradiol en medios consumidos de tubulos seminiferos de equino incubados con eFSH natural (de extractos hipofisarios purificados) y con FSHpCTPa a diversas dosis. Se observo una respuesta a la dosis significativa con el analogo de eFSH recombinante. A 50 ng/ml, la respuesta a la dosis de FSHpCTPa fue mayor que la de eFSH natural.
Descripcion detallada de la invencion
Tal como se usa en el presente documento, "reproduccion" se refiere a los metodos conocidos en la materia que pertenecen a hacer que un animal femenino se quede prenado. Tales metodos incluyen la inseminacion natural y artificial. Los metodos de reproduccion pueden incluir un tiempo de espera tras la observacion del estro conductual o despues de forzar el estro.
Tal como se usa en el presente documento, "estro" se refiere al periodo durante el cual es mas probable que un animal
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se quede prenado. Tal como se usa en el presente documento, "forzar el estro" se refiere a los metodos conocidos en la materia para forzar el celo. Forzar el estro puede incluir penodos de espera, segun sea adecuado. Tal como se usa en el presente documento, "estro conductual" se refiere a la demostracion conductual de que un animal esta en celo, que incluye mostrarse receptivas al macho.
"Yeguas" se refiere a los equinos hembra y "sementales" se refiere a los equinos macho. Tal como se usa en el presente documento, "vaca" se refiere a los bovinos hembra, incluyendo las novillas.
Tal como se usa en el presente documento, "aumento de la actividad reproductora" y "aumento de la eficacia reproductiva" se refieren al aumento en la probabilidad de que un animal hembra se quede prenada y finalmente produzca un embrion viable o descendencia viva. Esto se puede lograr aumentando la probabilidad de que un animal hembra inseminado se quede prenado, aumentando la probabilidad de que el animal prenado produzca uno o mas embriones viables y/o aumentando la probabilidad de que se mantenga prenada.
Tal como se usa en el presente documento "sincronizacion de la ovulacion" se refiere al proceso mediante el cual se fuerza la ovulacion de un grupo de animales, de manera que cada animal probablemente ovule en un intervalo de 3-4 dfas. Tal como se usa en el presente documento, "sincronizacion del estro" se refiere a un proceso mediante el cual se fuerza el estro de un grupo de animales, de manera que cada animal probablemente este en estro en un intervalo de aproximadamente 2-5 dfas. Tal como se usa en el presente documento, "presincronizacion del estro" o "presincronizacion de la ovulacion" se refiere a un proceso mediante el cual el ciclo del estro, a menudo para un grupo de animales, se bloquea o se fuerza en una etapa particular del ciclo, de manera los procedimientos de sincronizacion del estro o de la ovulacion que se van a realizar despues tengan mas exito.
Tal como se usa en el presente documento, "mamffero prenado" se refiere a un mamffero que actualmente esta prenado y tambien incluye un mamffero que se ha inseminado y que puede estar prenado o a una multitud de mamfferos inseminados, algunos de los cuales probablemente esten prenados. Tal como se usa en el presente documento, "inseminacion" se refiere a la introduccion de semen mediante cualquier metodo conocido en la materia, incluyendo, pero sin limitacion, la inseminacion natural y artificial.
Tal como se usa en el presente documento, "mantener la prenez" se refiere a aumentar la probabilidad de que un animal que se ha inseminado de positivo en prenez o de descendencia viva, o aumentar la probabilidad de que una multitud de animales que se han inseminado den positivo en prenez o den descendencia viva. Por "se mantiene la prenez" significa que un animal permanece prenado en ese momento y que no ha perdido el embrion.
Tal como se usa en el presente documento, "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un analogo de eFSH que es eficaz para producir el resultado deseado.
Tal como se usa en el presente documento, "administracion" se refiere a cualquier metodo de administrar un agente terapeutico a un animal conocido en la materia. Los ejemplos de administracion incluyen, pero sin limitacion, inyectar el agente terapeutico por vfa subcutanea, intramuscular e intravenosa.
Tal como se usa en el presente documento, "agente terapeutico" se refiere a cualquier farmaco, hormona, analogo o compuesto usado para tratar, modificar o mejorar una afeccion fisiologica. En la presente invencion, las afecciones fisiologicas son aquellas relacionadas con la reproduccion, tales como la ovulacion o el mantenimiento de la prenez.
Tal como se usa en el presente documento, "analogo" se refiere a un compuesto que imita el efecto fisiologico de un compuesto natural. Los analogos normalmente seran estructuralmente similares al compuesto natural pero pueden tener diferencias estructurales o qufmicas como resultado de los metodos de produccion o debido a que las diferencias confieren una actividad beneficiosa al analogo. Un analogo de eFSH es una composicion que tiene una estructura y funcion similares a la eFSH natural.
Tal como se usa en el presente documento, las afirmaciones en relacion con la pureza tales como "aproximadamente puros al 95 %" se refieren a la pureza tal como se mide mediante cualquier metodo conocido en la materia, que incluye, pero sin limitacion, la electroforesis de protefnas. Tal como se usa en el presente documento, las afirmaciones en relacion con la homologfa de secuencias tanto para aminoacidos como para ADN, tales como "una homologfa del 95 % o mas", se refieren a comparaciones de secuencias tal como se entiende y se practica en la materia.
Una realizacion de la invencion abarca un analogo de eFSH recombinante de cadena sencilla que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 8 o una secuencia de aminoacidos que tiene una homologfa del 90 % o mas, preferentemente el 95 % o mas con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 8. Otra realizacion es un acido nucleico o un vector que comprende un acido nucleico que codifica un aminoacido de cadena simple que tiene una homologfa del 90 % o mas, preferentemente del 95 % o mas con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 8. Otra realizacion es un acido nucleico o un vector que comprende un acido nucleico que codifica un aminoacido de cadena simple que tiene un primer polipeptido con una homologfa del 90 % o mas, preferentemente una homologfa del 95 % o mas, con la SEQ ID NO 5 y un segundo polipeptido con una homologfa del 90 % o mas, preferentemente una homologfa del 95 % o mas, con la SEQ ID NO 6. Tambien se incluyen analogos de eFSH recombinantes de
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cadena simple funcionales codificados por fragmentos de la secuencia de nucleotidos proporcionada en la SEQ ID NO 8.
Ejemplo 1 - Diseno genetico y actividad in vitro de la eFSH recombinante de cadena simple
Para construir una eFSH recombinante de cadena simple, la secuencia de nucleotidos que codifica la subunidad alfa se inserto en marco en el extremo 3’ de la subunidad beta de eFSH usando la mutagenesis con PCR de extension solapada. El peptido de carboxilo terminal que lleva los oligosacaridos O-ligados se uso como un enlazador (recuadro sombreado) con las subunidades dispuestas en tandem de manera que la subunidad beta esta N-terminal para la subunidad alfa, tal como se muestra en la Figura 2. Este metodo de diseno genetico de eFSH recombinante es similar a los metodos de diseno genetico de analogos de gonadotropina corionica humana (hCG) (Sugahara et al. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92: 2041-2045; Narayan et al. (1995) "Functional expression of yoked human chorionic gonadotropin in baculovirus-infected insect cells," Mol Endocrinol 9: 1720-1726).
La construccion de cadena simple se inserto en un vector y se transfecto a celulas de ovario de hamster chino (CHO), dando como resultado un polipeptido de eFSH de cadena simple, que se aislo y se purifico. Un SDS-PAGE de FSHpCTPa, un analogo de eFSH recombinante de cadena simple que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 8 y producido mediante el presente metodo, se muestra en la Figura 3 como un punto predominante de 45 kDa.
La actividad biologica in vitro de FSHpCTPa se comparo con la eFHS natural (extractos hipofisarios naturales, Bioniche Animal Health) en un ensayo de hFSHR en CHO (CHO-hFSHR). Tal como se muestra en la Figura 4, FSHpCTPa (marcado como eFSH APNB en la figura) tiene una actividad biologica aproximadamente igual o mayor que la eFSH natural, especialmente a dosis mas bajas (menos de 0,25 ng/ml). Adicionalmente, la Figura 5 compara las concentraciones de estradiol en medios consumidos de tubulos seminiferos de equino incubados con eFSH natural y con FSHpCTPa a diversas dosis (n=9). Se observo una respuesta a la dosis significativa con FSHpCTPa y a 50 ng/ml, la respuesta a la dosis de FSHpCTPa fue mayor que la de eFSH natural (p<0,05).
Ejemplo 2 - Eficacia de la eFSH recombinante de cadena simple en yeguas en ciclo
Se probo adicionalmente la eficacia in vivo de la FSHpCTPa en yeguas en ciclo. Se alojaron quince yeguas, de seis a dieciseis anos de edad en potreros al aire libre y se les dio progesterona varios dias antes de la ovulacion, lo que se denomino dia 0. Despues se trato a las yeguas con progesterona y estradiol para suprimir la posterior gonadotropina y la actividad ovarica. El ciclo del estro de las yeguas se reanudo tras la retirada del tratamiento de progesterona y de estradiol. El uso de progesterona y estradiol para controlar el estro y la ovulacion es bien conocido en la materia Loy et al. (1981) "Control of ovulation in cycling mares with ovarian steroids and prostaglandin", Theriogenology 15:191200; Varner et al. (1988) "Estrogens, oxytocin and ergot alkaloids - Uses in reproductive management of mares"; Proc. Am. Assoc. Equine. Pract., 219-241; Lofstedt, R.M. (1988) "Control of the estrous cycle of the mare"; The Veterinary Clinics of North America - Equine Practice, 189-190).
Se separo a las quince yeguas en tres grupos de tratamiento, de 5 yeguas cada grupo, recibiendo uno de los grupos 500 pg del analogo de reFSH (FSHpCTPa), recibiendo un grupo 850 pg del analogo de reFSH (FSHpCTPa), y recibiendo un grupo 1 ml de solucion salina (grupo de control). El analogo de eFSH recombinante o la solucion salina se administraron dos veces al dia (bidiario o BID) en los dias 8-14 tras la ovulacion. Los animales se reprodujeron aproximadamente 16-22 dias tras la ovulacion (aproximadamente 2-8 dias despues de la ultima administracion de eFSH recombinante) y se comprobo su prenez. Los efectos de los tratamientos sobre el crecimiento folicular se muestran en la Tabla 1, y los efectos sobre el numero de foliculos, ovulaciones y preneces se muestran en la Tabla 2.
Tabla 1 - Crecimiento folicular tras los tratamientos
- Grupos de tratamiento
- 0,85 mg de reFSH BID 0,50 mg de reFSH BID Control
- Yeguas (n) N.° de foliculos de 20-29 mm al final del tratamiento (dia 15) Tiempo (dias) para foliculos de 35 mm tras la retirada de P+E
- 5 5.6 ± 1,24a 2.6 ± 0,51a 5 4,8 ± 1,24a 3,3 ± 0,32a 5 0,2 ± 0,20b 7,8 ± 0,51b
- ab Los valores dentro de las filas con diferentes superindices difieren (p <0,05).
__________________________Tabla 2 - Numero de foliculos, ovulaciones y preneces_______________________
Grupos de tratamiento
0,85 mg de reFSH 0,50 mg de reFSH Control
_______________________________________________________BID________________BID__________________
Yeguas (n) 5 5 5
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Grupos de tratamiento
- 0,85 mg de reFSH BID 0,50 mg de reFSH BID Control
- N.° de foliculos preovulatorios (>35 mm) a N.° de ovulaciones por yegua (intervalo)
- 4,2 ± 0,58b 2,8 ± 0,51 (1-4) 3,4 ± 0,75b 3,0 ± 0,93 (1-6) 1,4 ± 0,24c 2,0 ± 0,32 (13) 0,0 ± 0,00 1, 1, 1, 2
- N.° de foliculos no ovulatorios (>35 mm) a N.° de vesiculas embrionicas detectadas por cada yegua prenada
- 2,4 ± 1,12 1, 2 2,0 ± 0,84 1, 1, 5
a Los valores del periodo de examen ultrasonico se detectaron 12 horas antes de la primera ovulacion y 12 horas despues de la ultima ovulacion.
bc Los valores dentro de las filas con diferentes superindices difieren (p <0,05).
Tal como se muestra en las tablas anteriores, el analogo de eFSH recombinante presento una actividad in vivo a ambas dosis (850 y 500 pg) tal como se muestra mediante un elevado numero de foliculos y de ovulaciones por yegua, y mediante el reducido tiempo requerido para lograr un tamano de foliculo de 35 mm tras la retirada del tratamiento de progesterona y estradiol.
Ejemplo 3 - Eficacia de la eFSH recombinante de cadena simple sobre la superovulacion
En este experimento, a veinte yeguas de ciclo normal, de tres a trece anos de edad, se les administro bien FSH natural (extracto hipofisario purificado) o bien eFSH recombinante de cadena simple. Se examinaron las yeguas mediante ecografia transrectal a los cinco dias despues de la ovulacion. Si el foliculo mas grande era de < 25 mm de diametro, se asignaba a las yeguas de forma aleatoria a uno de los cuatro grupos de tratamiento y se les administraba un analogo de eFSH (FSHpCTPa):
Grupo A 12,5 mg de eFSH de Bioniche dos veces al dia (grupo de control positivo, n=5)
Grupo B 500 de eFSH recombinante (FSHpCTPa) dos veces al dia (n=5)
Grupo C 850 de eFSH recombinante (FSHpCTPa) una vez al dia (n=5)
Grupo D 850 de eFSH recombinante (FSHpCTPa) dos veces al dia (n=5)
Todas las yeguas recibieron 10 mg de dinoprost (prostaglandina) la tarde del segundo dia del tratamiento y los tratamientos prosiguieron hasta que una cohorte de foliculos alcanzo 32-35 mm de diametro. Las yeguas recibieron 1,5 mg de eLH recombinante para inducir la ovulacion aproximadamente 38 horas despues del ultimo tratamiento de FSH.
La media aritmetica de los dias de tratamiento con FSH fueron 6,6 (Grupo A), 7,2 (Grupo B), 8,0 (Grupo C) y 6,0 (Grupo D). El numero de foliculos > 35 mm de diametro en el momento de la administracion de reLH fue de 3,2, 3,2, 3,0 y 4,2, respectivamente. El numero de ovulaciones detectado para los mismos grupos fue 3,8, 3,2, 5,4 y 3,4. El numero de foliculos > 35 mm de diametro que permanece en el momento de la ovulacion para los mismos grupos fue de 0,8, 1,6, 0,6 y 2,6. Los resultados se resumen a continuacion en la Tabla 3.
Tabla 3
- Tratamiento
- N.° de yegua Dias de tratamiento N.° de foliculos > 35 mm en la administracion de LH N.2 de ovulaciones N.° de foliculos > 35 mm en la ovulacion N.2 de embriones de alta calidad
- 12,5 mg bid
- 408 6 2 3 0
- Bioniche
- 625 5 2 3 2
- 579 10 2 2 0
- 418 6 3 3 2
- 419 6 7 8 0
- 6,6 3,2 3,8 0,8
- 0,5 mg bid
- 503 6 3 3 0
- reFSH
- 525 6 4 5 0
- 106 8 3 3 3
- 507 8 3 3 2
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- Tratamiento
- N.° de yegua Dias de tratamiento N.° de foliculos > 35 mm en la administracion de LH N.2 de ovulaciones N.° de foliculos > 35 mm en la ovulacion N.2 de embriones de alta calidad
- 502 8 3 2 3
- 7,2 3,2 3,2 1,6
- 0,85 sid
- 424 9 4 6 0
- reFSH
- 644 8 4 5 0
- 850 5 2 6 1
- 645 10 3 4 2
- 97 8 2 6 0
- 8 3 5,4 0,6
- 0,85 bid
- 128 4 3 3 0
- reFSH
- 66 5 4 4 1
- 459 7 3 5 0
- 454 5 6 4 6 4
- 152 9 5 1 6 7
- 6 4,2 3,4 2,6
Estos resultados indican que la reFSH tiene una bioactividad in vivo en yeguas de ciclo normal y puede ser una herramienta util para estimular el desarrollo folicular/la superovulacion. Todos los grupos de eFSH recombinante (FSHpCTPa) estimularon el desarrollo folicular y produjeron multiples embriones viables. Para todos los parametros medidos, los valores para los grupos de tratamiento de reFSH fueron al menos tan eficaces como el grupo de control positivo (eFS hipofisaria purificada.
La dosis de 850 de reFSH dada dos veces al dia (bid) provoco la sobreestimulacion del desarrollo folicular. La estimulacion folicular continuo en yeguas de este grupo durante dias despues de que se detectasen la mayoria de las ovulaciones. Se pudieron producir embriones viables a pesar de la sobreestimulacion, sin embargo, este efecto no se noto en la misma medida en los otros grupos de reFSH. En consecuencia, para aplicaciones practicas, puede ser preferible la dosis de 500 administrada dos veces al dia. Un protocolo hibrido entre dos inyecciones y una unica inyeccion al dia (sid, del ingles single injection daily) probablemente tambien es eficaz.
Habiendo descrito completamente la presente invencion con cierto detalle a modo de ilustracion y ejemplos con fines de claridad de comprension, sera obvio para un experto en la materia que se puede realizar la misma modificando o cambiando la invencion dentro de un intervalo amplio y equivalente de las condiciones, formulaciones y otros parametros sin afectar al alcance de la invencion o a cualquiera de las realizaciones especificas de la misma, y que tales modificaciones o cambios pretenden estar abarcadas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Cuando un grupo de materiales, composiciones, componentes o compuestos se desvela en el presente documento, se entiende que todos los miembros individuales de estos grupos y todos los subgrupos de los mismos se desvelan por separado. Cuando se use un grupo de Markush u otro agrupamiento en el presente documento, todos los miembros individuales del grupo y todas las combinaciones y subcombinaciones posibles del grupo pretenden estar incluidas de forma individual en la divulgacion. Cada formulacion o combinacion de componentes descrita o ejemplificada en el presente documento se puede usar para poner en practica la invencion, a menos que se indique otra cosa. Cuando se da un intervalo en la memoria descriptiva, por ejemplo, un intervalo de temperatura, un intervalo de tiempo o un intervalo de composicion, todos los intervalos intermedios y subintervalos, asi como los valores individuales incluidos en los intervalos dados pretenden estar incluidos en la divulgacion. Adicionalmente, los puntos extremos de un intervalo dado se incluyen dentro del intervalo. En la divulgacion y en las reivindicaciones, "y/o" significa adicionalmente o como alternativa. Ademas, cualquier uso de un termino en singular tambien abarca las formas en plural.
Un experto en la materia apreciara que los materiales de partida, los reactivos, los metodos de purificacion, los materiales, los sustratos, los elementos del dispositivo, los metodos analiticos, los metodos de ensayo, las mezclas y las combinaciones de los componentes que no sean aquellas ejemplificadas de manera especifica se pueden emplear en la practica de la invencion sin recurrir a la experimentacion indebida. Todos los equivalentes funcionales conocidos en la materia, de cualquiera de tales materiales y metodos pretenden estar incluidos en la presente invencion. Los terminos y expresiones que se han empleado se utilizan como terminos de descripcion y no de limitacion, y no hay intencion en el uso de tales terminos y expresiones de que se excluyan los equivalentes de las caracteristicas mostradas y descritas o partes de las mismas, pero se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invencion reivindicada. La invencion descrita de forma ilustrativa en el presente documento puede
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25
30
35
40
45
50
ponerse en practica de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitacion o limitaciones, que no se desvele de forma especffica en el presente documento.
Todas las publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento se incorporan en el presente documento en la medida en que no sean inconsistentes con el presente documento. Algunas referencias proporcionadas en el presente documento se incorporan a modo de referencia para proporcionar detalles de usos adicionales de la invencion. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de experiencia de los expertos en la materia a la que pertenece la invencion. Las referencias citadas en el presente documento se incorporan a modo de referencia en el presente documento en su totalidad para indicar el estado de la tecnica en el momento de su fecha de presentacion y se pretende que esta informacion se pueda emplear en el presente documento, si es necesario, para excluir realizaciones especfficas que se encuentran en la tecnica anterior. Por ejemplo, cuando se reivindica un compuesto, debena entenderse que los compuestos conocidos en la materia incluyendo los compuestos desvelados en las referencias desveladas en el presente documento no pretenden incluirse en la reivindicacion.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> AspenBio Pharma, Inc. Colgin, Mark Boime, Irving Roser, Janet
<120> Actividad de la hormona folfculo estimulante equina recombinante
<130> 56-07
< 150> 60/991.297 <151 > 30/11/2007
<160>8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211>291
<212> ADN
<213> Equus caballus
<400> 1
- tcttttcctg
- atggagagtt tacaacgcaa gactgtcctg aatgcaagct aagggaaaac 60
- aagtacttct
- tcaaactggg cgtcccgatt taccagtgta agggctgctg cttctccaga 120
- gcgtacccca
- ctccagcaag gtccaggaag acaatgttgg tcccaaagaa catcacctca 180
- gaatccacat
- gctgtgtggc caaagcattt atcagggtca cagtgatggg aaacatcaag 240
- ttggagaacc
- acacccagtg ctattgcagc acttgctatc accacaagat t 291
<210>2
<211> 387
<212> ADN
<213> Equus caballus
<220>
<221 > misc_feature <222> (78)..(78) <223> n es a, c, g o t
<400> 2
5
10
15
20
- atgaagtcag
- tccagttttg tttccttttc tgttgctgga aagcagtctg ctgcaatagc 60
- tgtgagctga
- ccaacatnac catcgccgtg gagaaggagg aatgtggctt ctgcataagc 120
- atcaacacca
- cctggtgtgc gggctactgc tacacccggg acctggtgta caaggaccca 180
- gcccggccca
- acatccagaa aacatgcacc ttcaaggagc tggtgtacga gacagtgaaa 240
- gtgcctggct
- gtgctcacca cgcggactcc ctgtacacgt acccggtggc cactgcatgt 300
- cactgtggca
- aatgtaacag cgacagcact gactgcaccg tgcgaggtct ggggcccagc 360
- tactgctcct
- tcggtgacat gaaggaa 387
<210>3
<211> 102
<212> ADN
<213> Equus caballus
<400>3
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- ggggccagca
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<210>4
<211> 783
<212> ADN
<213> Equus caballus
<220>
<221 > misc_feature <222> (78)..(78) <223> n es a, c, g o t
<400> 4
5
10
- atgaagtcag
- tccagttttg tttccttttc tgttgctgga aagcagtctg ctgcaatagc 60
- tgtgagctga
- ccaacatnac catcgccgtg gagaaggagg aatgtggctt ctgcataagc 120
- atcaacacca
- cctggtgtgc gggctactgc tacacccggg acctggtgta caaggaccca 180
- gcccggccca
- acatccagaa aacatgcacc ttcaaggagc tggtgtacga gacagtgaaa 240
- gtgcctggct
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- cactgtggca
- aatgtaacag cgacagcact gactgcaccg tgcgaggtct ggggcccagc 360
- tactgctcct
- tcggtgacat gaaggaatcc tcttcctcta aggatccccc atcccaacct 420
- ctcacatcca
- catccacccc aactcctggg gccagcagac gttcctctca ccccctccca 480
- ataaagactt
- cttttcctga tggagagttt acaacgcaag actgtcctga atgcaagcta 540
- agggaaaaca
- agtacttctt caaactgggc gtcccgattt accagtgtaa gggctgctgc 600
- ttctccagag
- cgtaccccac tccagcaagg tccaggaaga caatgttggt cccaaagaac 660
- atcacctcag
- aatccacatg ctgtgtggcc aaagcattta tcagggtcac agtgatggga 720
- aacatcaagt
- tggagaacca cacccagtgc tattgcagca cttgctatca ccacaagatt 780
- taa
- 783
<210>5
<211> 97
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400>5
Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr Gin Asp Cys Pro Glu Cys Lys 15 10 15
Leu Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys Leu Gly Val Pro lie Tyr Gin 20 25 30
Cys Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser 35 40 45
Arg Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn lie Thr Ser Glu Ser Thr Cys 50 55 60
Cys Val Ala Lys Ala Phe lie Arg Val Thr Val Met Gly Asn lie Lys 65 70 75 80
Leu Glu Asn His Thr Gin Cys Tyr Cys Ser Thr Cys Tyr His His Lys 85 90 95
He
10
15
20
<210>6
<211 > 129
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400>6
Met Lys Ser Val Gin Phe Cys Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Val 15 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Thr Thr lie Ala Val Glu Lys 20 25 30
Glu Glu Cys Gly Phe Cys lie Ser lie Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn 50 55 60
lie Gin Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys 65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95
Ala Thr Ala Cys His Cys Gly Lys Cys Asn Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110
Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Asp Met Lys 115 120 125
Glu
<210>7
<211> 34
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 7
Ser Ser Ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gin Pro Leu Thr Ser Thr Ser 15 10 15
Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser Ser His Pro Leu Pro lie 20 25 30
Lys Thr
<210>8 <211>260 <212> PRT
<213> Equus caballus <400>8
5
Claims (10)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Un analogo de eFSH que tiene al menos el 95 % de homologia con la SEQ ID NO 8 para su uso en un metodo de aumento de la actividad reproductora en uno o mas ungulados, comprendiendo el metodo la administracion de una cantidad eficaz del analogo al uno o mas ungulados, en donde la cantidad eficaz esta entre aproximadamente 200 pg y 850 pg, y en donde se administra una dosis del analogo de la eFSH a cada uno o mas ungulados, al menos una vez al dia, durante 4 a 9 dias en un unico ciclo del estro.
- 2. El analogo para el uso de la reivindicacion 1 en donde dichos ungulados son equinos.
- 3. El analogo para el uso de la reivindicacion 1 o 2, en donde el analogo se administra entre 6 a 16 dias despues de la ovulacion.
- 4. El analogo para el uso de la reivindicacion 1,2 o 3 en el que los uno o mas ungulados se inseminan entre 2 a 8 dias despues de la administracion del analogo de eFSH.
- 5. El analogo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la cantidad eficaz esta entre aproximadamente 500 pg y 850 pg.
- 6. El analogo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde una dosis del analogo de eFSH se administra una vez al dia a los uno o mas ungulados durante 4 a 9 dias en un unico ciclo del estro.
- 7. El analogo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde una dosis del analogo de eFSH se administra al menos una vez al dia a cada ungulado durante aproximadamente 5 a 8 dias en un unico ciclo del estro.
- 8. El analogo para el uso de la reivindicacion 7 en donde una dosis del analogo de eFSH se administra dos veces al dia a los uno o mas ungulados durante 5 a 8 dias en un unico ciclo del estro.
- 9. El analogo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cantidad eficaz del analogo es de aproximadamente 500 pg, que se administra dos veces al dia a los uno o mas ungulados.
- 10. El analogo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el analogo de eFSH se administra mediante inyeccion intramuscular o inyeccion intravenosa.atgaagtcagtccagttttgtttccttttctgttgctggaaagcagtctgctgcaatagc MKSVQFCFLFCCWKAVCCNS tgtgagctgaccaacatnaccatcgccgtggagaaggaggaatgtggcttctgcataagc CELTNTTIAVEKEECGFCIS atcaacaccacctggtgtgcgggctactgctacacccgggacctggtgtacaaggaccca INTTWCAGYCYTRDLVYKDP gcccggcccaacatccagaaaacatgcaccttcaaggagctggtgtacgagacagtgaaa ARPNIQKTCTFKELVYETVK gtgcctggctgtgctcaccacgcggactccctgtacacgtacccggtggccactgcatgt VPGCAHHADSLYTYPVATAC cactgtggcaaatgtaacagcgacagcactgactgcaccgtgcgaggtctggggcccagc HCGKCNSDSTDCTVRGLGPS tactgctccttcggtgacatgaaggaatcctcttcctctaaggatcccccatcccaacct YCSFGDMKE SS5SKDPPSQP ctcacatccacatccaccccaactcctggggccagcagacgttcctctcaccccctccca LTST5TPTPGA5RRSSHPLP ataaagacttcttttcctgatggagagtttacaacgcaagactgtcctgaatgcaagcta I K T SFPDGEFTTQDCPECKL agggaaaacaagtacttcttcaaactgggcgtcccgatttaccagtgtaagggctgctgc RENKYFFKLGVPIYQCKGCC ttctccagagcgtaccccactccagcaaggtccaggaagacaatgttggtcccaaagaac FSRAYPTPARSRKTMLVPKN atcacctcagaatccacatgctgtgtggccaaagcatttatcagggtcacagtgatggga ITSESTCCVAKAFIRVTVMG aacatcaagttggagaaccacacccagtgctattgcagcacttgctatcaccacaagatt NIKLENHTQCYCSTCYHHKI taa *FIGURA 1
imagen1 FIGURA2imagen2 pmol/ml de AMPcBioensayo de hFSHR en CHO□ eFSH de Bionicheimagen3 0,0000 0,0025 0,0250 0,2500 2,5000 25,0000ng/ml de eFSHFIGURA4imagen4
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