ES2691494T3

ES2691494T3 - Liposome for topical administration and application thereof

Info

Publication number: ES2691494T3
Application number: ES13883388.4T
Authority: ES
Inventors: Tatsuhiro Ishida
Original assignee: Delta Fly Pharma Inc
Current assignee: Delta Fly Pharma Inc
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2033-11-01
Also published as: JPWO2014178152A1; CN105142613A; US9745583B2; TW201440813A; US20160208263A1; EP2992874B1; PT2992874T; PL2992874T3; KR20150118955A; EP2992874A1; HUE040425T2; JP6307070B2; TWI594768B; AU2013388255A1; HRP20181735T1; DK2992874T3; EP2992874A4; AU2013388255B2; CN105142613B; KR101831205B1

Abstract

Un liposoma para uso mediante administración tópica en un método de tratamiento médico, que consiste en dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), fosfatidilcolina y lípido catiónico, en el que la fosfatidilcolina comprende al menos una cadena de ácido graso insaturado que contiene un doble enlace de carbono a carbono, y en el que el lípido catiónico es cloruro de O,O'-ditetradecanoil-N-(α-trimetilamonioacetil)dietanolamina (DC-6-14).A liposome for use by topical administration in a medical treatment method, consisting of dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine and cationic lipid, wherein the phosphatidylcholine comprises at least one chain of unsaturated fatty acid containing a double carbon-carbon bond , and wherein the cationic lipid is O chloride, O'-ditetradecanoyl-N- (α-trimethylammoniumacetyl) diethanolamine (DC-6-14).

Description

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DESCRIPCIONDESCRIPTION

Liposoma para administración tópica y aplicación del mismo Campo técnicoLiposome for topical administration and application of the same Technical Field

La presente invención se refiere a un liposoma para administración tópica y un agente antitumoral que usa tal liposoma.The present invention relates to a liposome for topical administration and an antitumor agent using such a liposome.

Antecedentes de la técnicaBackground of the technique

Los liposomas están formados por fosfolípidos que constituyen membranas celulares de organismos, tienen biocompatibilidad elevada, y pueden suministrar fármacos y principios activos a la vez que los protegen de enzimas de degradación in vivo. Por consiguiente, los liposomas han llamado la atención como herramientas útiles para sistemas de administración de fármaco. En los últimos años, se han desarrollado y generalmente se usan liposomas modificados con polietilenglicol (PEG) que mejoran la capacidad de retención en la sangre y liposomas que comprenden, como líquidos constitutivos, fosfatidilcolina hidrogenada libre de enlaces insaturados que mejora la estabilidad en la sangre y resistencia y colesteroles que elevan la temperatura de transición de fases de la membrana.Liposomes are formed by phospholipids that constitute cell membranes of organisms, have high biocompatibility, and can provide drugs and active principles while protecting them from degradation enzymes in vivo. Accordingly, liposomes have attracted attention as useful tools for drug delivery systems. In recent years, polyethylene glycol (PEG) -modified liposomes have been developed and are generally used to improve the retention capacity in the blood and liposomes comprising, as constituent liquids, hydrogenated phosphatidylcholine free of unsaturated bonds that improves the stability in the blood. and resistance and cholesterols that raise the phase transition temperature of the membrane.

Por otro lado, las moléculas de ARNi que inducen ARN de interferencia (en lo sucesivo en el presente documento denominado " ARNi") han llamado la atención como herramientas útiles para tratamiento tumoral y otros fines, y se ha desarrollado una gran diversidad de moléculas de ARNi que son capaces de inhibición del crecimiento tumoral. Además, se ha desarrollado un método de uso de complejos formados por moléculas de ARNi y liposomas (es decir, lipoplejos) para suministrar moléculas de ARNi como principios activos a células tumorales (Qixin Leng et al., Drug Future, septiembre de 2009; 34 (9): 721; Sherry Y., Wu et al., The AAPS Journal, Vol. 11, N.° 4, diciembre de 2009; y B. Ozpolat et al., Journal of Internal Medicine 267; 44-53, 2009).On the other hand, the RNAi molecules that induce interfering RNA (hereinafter referred to as "RNAi") have attracted attention as useful tools for tumor treatment and other purposes, and a great diversity of molecules has been developed. RNAi that are capable of inhibiting tumor growth. In addition, a method of using complexes formed by RNAi and liposome molecules (ie, lipoplexes) to deliver RNAi molecules as active ingredients to tumor cells has been developed (Qixin Leng et al., Drug Future, September 2009; (9): 721, Sherry Y., Wu et al., The AAPS Journal, Vol. 11, No. 4, December 2009, and B. Ozpolat et al., Journal of Internal Medicine 267; 44-53, 2009).

En el pasado, los presentes inventores desarrollaron moléculas de ARNi que se dirigen a timidilato sintasas (en lo sucesivo en el presente documento denominadas "TS"), que está implicada en la síntesis del ADN (documento WO 2010/113844). Los inventores informaron que la administración de tales moléculas de ARNi a los tumores a través de administración intravenosa con el uso de liposomas modificados con PEG que contienen colesteroles a una concentración dada podría hacer posible inhibir el crecimiento de tumores que muestran expresión de TS. Los inventores también informaron que el uso de tales liposomas en combinación con agentes quimioterapéuticos podría dar como resultado mejora del tropismo tumoral así como la mejora de efectos antitumorales de moléculas de ARNi hasta un alcance significativo (documento WO 2012/161196).In the past, the present inventors developed RNAi molecules that target thymidylate synthases (hereinafter referred to as "TS"), which is involved in the synthesis of DNA (WO 2010/113844). The inventors reported that administration of such RNAi molecules to tumors through intravenous administration with the use of PEG-modified liposomes containing cholesterols at a given concentration could make it possible to inhibit the growth of tumors exhibiting TS expression. The inventors also reported that the use of such liposomes in combination with chemotherapeutic agents could result in improvement of tumor tropism as well as improvement of antitumor effects of RNAi molecules to a significant extent (WO 2012/161196).

Sin embargo, en la técnica se ha esperado el desarrollo de un medio que haga posible introducir de forma más eficaz moléculas de ARNi capaces de inhibición del crecimiento tumoral en células tumorales.However, the development of a means that makes it possible to introduce more effectively RNAi molecules capable of inhibiting tumor growth in tumor cells has been expected in the art.

El documento US 2008/0306153 desvela conjuntos de lípidos, tales como liposomas, que comprenden lípidos que incorporan uno o más elementos potenciadores de la transfección (los TEE), que tienen la fórmula:US 2008/0306153 discloses sets of lipids, such as liposomes, which comprise lipids incorporating one or more transfection enhancing elements (the TEEs), which have the formula:

Resto lipídico-[Resto hidrófobo-resto hidrófilo sensible al pH].Lipid residue- [Hydrophobic rest-hydrophilic rest sensitive to pH].

El documento WO 98/45463 desvela liposomas que comprenden lípidos catiónicos, que incluyen DC-6-14.WO 98/45463 discloses liposomes comprising cationic lipids, including DC-6-14.

Sumario de la InvenciónSummary of the Invention

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo sistema de administración que pueda administrar de forma eficaz un principio activo a una célula diana.An objective of the present invention is to provide a new delivery system that can effectively deliver an active ingredient to a target cell.

De forma más específica, un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo liposoma que permita una administración eficaz de una molécula de ARNi capaz de inhibición del crecimiento tumoral a una célula tumoral.More specifically, an object of the present invention is to provide a new liposome that allows an effective administration of an RNAi molecule capable of inhibiting tumor growth to a tumor cell.

Los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de alcanzar los objetivos mencionados anteriormente. Como resultado, descubrieron que la administración tópica a un liposoma que está formado por dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), fosfatidilcolina, y lípido catiónico, que no se modifica con PEG, que está libre de colesteroles, y que comprende un principio activo soportado sobre el mismo a una región que incluye una célula diana o una zona en las proximidades de la misma podría permitir una administración eficaz de un principio activo a la célula diana. Esto ha conducido a la finalización de la presente invención.The present inventors have carried out concentrated studies in order to achieve the objectives mentioned above. As a result, they discovered that topical administration to a liposome which is formed by dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine, and cationic lipid, which is not modified with PEG, which is free of cholesterols, and which comprises an active ingredient supported thereon a region that includes a target cell or an area in the vicinity thereof could allow an effective administration of an active principle to the target cell. This has led to the completion of the present invention.

De forma específica, la presente invención proporciona:Specifically, the present invention provides:

- liposomas para uso mediante administración tópica en un método de tratamiento médico, como se define en las reivindicaciones; y- liposomes for use by topical administration in a medical treatment method, as defined in the claims; Y

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- composiciones para uso mediante administración tópica en un método de tratamiento médico, como se define en las reivindicaciones;- compositions for use by topical administration in a medical treatment method, as defined in the claims;

- agentes antitumorales para uso mediante administración tópica en un método de tratamiento de tumor, como se define en las reivindicaciones; y- antitumor agents for use by topical administration in a tumor treatment method, as defined in the claims; Y

- productos combinados que comprenden los agentes antitumorales de la invención, como se define en las reivindicaciones.- combination products comprising the antitumor agents of the invention, as defined in the claims.

La presente invención puede proporcionar un nuevo liposoma que permita la administración eficaz de un principio activo a una célula diana a través de administración tópica del mismo.The present invention can provide a novel liposome that allows the effective administration of an active ingredient to a target cell through topical administration thereof.

De forma específica, la presente invención puede proporcionar un nuevo liposoma que permita una administración eficaz de una molécula de ARNi capaz de inhibición del crecimiento tumoral a una célula tumoral a través de administración tópica de la misma.Specifically, the present invention can provide a novel liposome that allows an effective administration of an RNAi molecule capable of inhibiting tumor growth to a tumor cell through topical administration thereof.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

La Fig. 1 muestra los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral de un agente quimioterapéutico para cáncer, ARNsh de TS, ARNsh de NS, y ARNsh en combinación con un agente quimioterapéutico para cáncer en células de mesotelioma pleural maligno humano. La Fig. 1 (A) muestra los resultados para ARNsh a una concentración final de 5 nM, y la Fig. 1 (B) muestra los resultados para ARNsh a una concentración final de 10 nM (***: p < 0,005).Fig. 1 shows the inhibitory effects of tumor growth of a cancer chemotherapeutic agent, TS shRNA, NS shRNA, and shRNA in combination with a cancer chemotherapeutic agent in human malignant pleural mesothelioma cells. Fig. 1 (A) shows the results for shRNA at a final concentration of 5 nM, and Fig. 1 (B) shows the results for shRNA at a final concentration of 10 nM (***: p <0.005).

La Fig. 2 muestra los efectos inhibitorios de expresión de TS de ARNsh de TS y ARNsh de NS en células de mesotelioma pleural maligno humano.Fig. 2 shows the inhibitory effects of TS expression of TS shRNA and NSsh shRNA in human malignant pleural mesothelioma cells.

La Fig. 2 (A) muestra los resultados de transferencia puntal de Western, y la Fig. 2 (B) muestra los resultados de cuantificación del nivel de expresión de TS sobre la base de los resultados de transferencia puntal de Western. La proporción de TS/p-actina se representa en forma de porcentaje con respecto a un 100 %, que se asigna a la muestra de control sin tratamiento con ARNsh.Fig. 2 (A) shows the results of western strut transfer, and Fig. 2 (B) shows the results of quantification of the level of expression of TS based on the results of western strut transfer. The proportion of TS / p-actin is represented as a percentage with respect to 100%, which is assigned to the control sample without treatment with shRNA.

La Fig. 3 muestra los resultados de una comparación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos a través de ensayos de luciferasa doble.Fig. 3 shows the results of a comparison of effects of introduction of Luc siRNA with the use of various cationic liposomes through double luciferase assays.

La Fig. 4 muestra fotografías que demuestran los resultados de crecimiento tumoral en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno. El número de días indicado para cada fotografía representa el número de días después del implante de células de mesotelioma pleural maligno.Fig. 4 shows photographs demonstrating the results of tumor growth in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant. The number of days indicated for each photograph represents the number of days after the implantation of malignant pleural mesothelioma cells.

La Fig. 5-1 muestra fotografías que demuestran los resultados de una comparación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno. En la Fig. 5-1, (A) muestra los resultados para el control (sacarosa al 9 %); (B) muestra los resultados para un liposoma que contiene DEPC (DEPC); (C) muestra los resultados para un liposoma que contiene DMPC (DMPC); (D) muestra los resultados para un liposoma que contiene DOPC (DOPC); y (E) muestra los resultados para un liposoma que contiene POPC (POPC).Fig. 5-1 shows photographs demonstrating the results of a comparison of the effects of introduction of Luc siRNA with the use of various cationic liposomes on tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant. In Fig. 5-1, (A) shows the results for the control (9% sucrose); (B) shows the results for a liposome containing DEPC (DEPC); (C) shows the results for a liposome containing DMPC (DMPC); (D) shows the results for a liposome containing DOPC (DOPC); and (E) shows the results for a liposome containing POPC (POPC).

La Fig. 5-2 muestra los resultados de cuantificación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sobre la base de los resultados que se muestran en la Fig. 5-1 (*: p < 0,005).Fig. 5-2 shows the results of quantification of Luc sshRNA introduction effects with the use of various cationic liposomes in tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant based on the results shown in Fig. 5-1 (*: p <0.005).

La Fig. 6-1 muestra fotografías que demuestran los resultados de una comparación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos con diferentes contenidos de DC-6-14 en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno. En la Fig. 6-1, (A) muestra los resultados para un liposoma con contenido de DC-6-14 de un 20 %, (B) muestra los resultados para un liposoma con contenido de DC-6-14 de un 35 %, y (C) muestra los resultados para un liposoma con contenido de DC-6-14 de un 50 %, en moles.Fig. 6-1 shows photographs demonstrating the results of a comparison of the effects of introduction of Luc siRNA with the use of various cationic liposomes with different contents of DC-6-14 in tumor cells in mouse models of orthotopic implant malignant pleural mesothelioma. In Fig. 6-1, (A) shows the results for a liposome with DC-6-14 content of 20%, (B) shows the results for a liposome with DC-6-14 content of a %, and (C) shows the results for a liposome with DC-6-14 content of 50%, in moles.

La Fig. 6-2 muestra los resultados de cuantificación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos con diferentes contenidos de DC-6-14 en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sobre la base de los resultados que se muestran en la Fig. 6-1 (*: p < 0,005).Fig. 6-2 shows the results of quantification of Luc sshRNA introduction effects with the use of various cationic liposomes with different contents of DC-6-14 in tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant over the basis of the results shown in Fig. 6-1 (*: p <0.005).

La Fig. 7-1 muestra fotografías que demuestran los resultados de una comparación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos modificados con PEG y no modificados con PEG en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno. En la Fig. 7-1, (A) muestra POPC modificado con PEG; es decir, los resultados para un liposoma que contiene POPC modificado con PEG, (B) muestra POPC no modificado con PEG; es decir, los resultados para un liposoma que contiene POPC no modificado con PEG, (C) muestra DOPC modificado con PEG; es decir, los resultados para un liposoma que contiene DOPC modificado con PEG, y (D) muestra DOPC no modificado con PEG; es decir, los resultados para un liposoma que contiene DOPC no modificado con PEG.Fig. 7-1 shows photographs demonstrating the results of a comparison of the effects of introduction of Luc siRNA with the use of various cationic liposomes modified with PEG and unmodified with PEG in tumor cells in mouse models of orthotopic mesothelioma implant malignant pleural In Fig. 7-1, (A) shows POPC modified with PEG; that is, the results for a liposome containing POPC modified with PEG, (B) shows POPC not modified with PEG; that is, the results for a liposome containing POPC not modified with PEG, (C) shows DOPC modified with PEG; that is, the results for a liposome containing DOPC modified with PEG, and (D) shows DOPC not modified with PEG; that is, the results for a liposome containing DOPC not modified with PEG.

La Fig. 7-2 muestra los resultados de cuantificación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sobre la base de los resultados que se muestran en la Fig. 7-1 (**: p < 0,01).Fig. 7-2 shows the results of quantification of Luc sshRNA introduction effects with the use of various cationic liposomes in tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant based on the results shown in Fig. 7-1 (**: p <0.01).

La Fig. 8-1 muestra fotografías que demuestran los resultados de una comparación de efectos inhibitorios del crecimiento tumoral de un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa, un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa, un agente quimioterapéuticoFig. 8-1 shows photographs demonstrating the results of a comparison of inhibitory effects of tumor growth of a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface, a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its membrane surface external, a chemotherapeutic agent

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para cáncer (PMX), y un lipoplejo en combinación con un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX) en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno. En la Fig. 8-1, (A) muestra los resultados para el control (sacarosa al 9 %); (B) muestra ARNsh de NS; es decir, los resultados de tratamiento con un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa solo; (C) muestra ARNsh de TS; es decir, los resultados de tratamiento con un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa solo; (D) muestra PMX; es decir, los resultados de tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer solo; (E) muestra PMX + ARNsh de NS; es decir, los resultados de tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer en combinación con un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa; y (F) muestra PMX + ARNsh de TS; es decir, los resultados de tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer en combinación con un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa.for cancer (PMX), and a lipoplex in combination with a cancer chemotherapeutic agent (PMX) in tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant. In Fig. 8-1, (A) shows the results for the control (9% sucrose); (B) shows NSsh shRNA; that is, the results of treatment with a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone; (C) shows TS shRNA; that is, the results of treatment with a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone; (D) shows PMX; that is, the results of treatment with a chemotherapeutic agent for cancer alone; (E) shows PMX + NSsh shRNA; that is, the results of treatment with a cancer chemotherapeutic agent in combination with a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface; and (F) shows PMX + TS shRNA; that is, the results of treatment with a cancer chemotherapeutic agent in combination with a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface.

La Fig. 8-2 muestra los resultados de cuantificación de efectos inhibitorios del crecimiento tumoral conseguidos con diversos tratamientos en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sobre la base de los resultados que se muestran en la Fig. 8-1 (*: p < 0,05; ***: p < 0,01).Fig. 8-2 shows the results of quantification of tumor growth inhibitory effects achieved with various treatments on tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant based on the results shown in Fig. 8- 1 (*: p <0.05; ***: p <0.01).

La Fig. 8-3 muestra las tasas de supervivencia (%) de modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sometido a tratamiento con el control (sacarosa al 9 %), un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX) solo, un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa solo, un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa solo, o un lipoplejo en combinación con un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX).Fig. 8-3 shows the survival rates (%) of mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant treated with control (9% sucrose), a chemotherapeutic agent for cancer (PMX) alone, a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone, a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone, or a lipoplex in combination with a cancer chemotherapeutic agent (PMX).

La Fig. 8-4 muestra el tiempo medio de supervivencia (MST) y el aumento de la esperanza de vida (ILS) de modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sometidos a tratamiento con el control (sacarosa al 9 %), un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa solo, un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa solo, un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX) solo, o un lipoplejo en combinación con un agente quimioterapéutico para cáncer (pMx).Fig. 8-4 shows the mean survival time (MST) and the increase in life expectancy (ILS) of mouse models of malignant pleural mesothelioma orthotopic implant undergoing control treatment (9% sucrose), a lipoplex that has TSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone, a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone, a cancer chemotherapeutic agent (PMX) alone, or a lipoplex in combination with an agent chemotherapy for cancer (pMx).

La Fig. 9 muestra los resultados de cuantificación de niveles de expresión de TS ARNm en células tumorales de modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sometido a tratamiento con el control (sacarosa al 9 %), un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa solo, un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa solo, un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX) solo, o un lipoplejo en combinación con un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX). Los niveles de expresión de TS ARNm se representan en forma de porcentaje con respecto a un 100 %, que se asigna al control (*: p < 0,05; **: p < 0,01).Fig. 9 shows the results of quantification of expression levels of TS mRNA in tumor cells from mouse models of malignant pleural mesothelioma orthotopic implant subjected to control treatment (9% sucrose), a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone, a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone, a cancer chemotherapeutic agent (PMX) alone, or a lipoplex in combination with a cancer chemotherapeutic agent (PMX). The expression levels of TS mRNA are represented as a percentage with respect to 100%, which is assigned to the control (*: p <0.05; **: p <0.01).

La Fig. 10 muestra los resultados de una comparación de efectos de introducción de ARNsh de Luc con el uso de diversos liposomas catiónicos y presomas catiónicos a través de ensayos de luciferasa doble.Fig. 10 shows the results of a comparison of effects of introduction of Luc siRNA with the use of various cationic liposomes and cationic presoms through double luciferase assays.

La Fig. 11 muestra fotografías que demuestran los resultados de una comparación de los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral de un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa, un preplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa, un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX), y un lipoplejo o preplejo en combinación con un agente quimioterapéutico para cáncer (PMX) en células tumorales en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno. En la Fig. 11, (A) muestra los resultados para el control (sacarosa al 9 %); (B) muestra PMX; es decir, los resultados de tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer solo; (C) muestra preplejo de TS; es decir, los resultados de tratamiento con un preplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa solo; (D) muestra PMX + preplejo de TS; es decir, los resultados de tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer en combinación con un preplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa; (E) muestra lipoplejo de TS; es decir, los resultados de tratamiento con un lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa solo; y (F) muestra PMX + lipoplejo de TS; es decir, los resultados de tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer en combinación con un lipoplejo que comprende ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa.Fig. 11 shows photographs demonstrating the results of a comparison of the inhibitory effects of tumor growth of a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface, a preplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface , a cancer chemotherapeutic agent (PMX), and a lipoplex or preplex in combination with a cancer chemotherapeutic agent (PMX) in tumor cells in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant. In Fig. 11, (A) shows the results for the control (9% sucrose); (B) shows PMX; that is, the results of treatment with a chemotherapeutic agent for cancer alone; (C) shows TS preplex; that is, the results of treatment with a preplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone; (D) shows PMX + TS preplex; that is, the results of treatment with a cancer chemotherapeutic agent in combination with a preplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface; (E) shows TS lipoplex; that is, the results of treatment with a lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface alone; and (F) shows PMX + TS lipoplex; that is, the results of treatment with a cancer chemotherapeutic agent in combination with a lipoplex comprising NSsh shRNA attached to its outer membrane surface.

La Fig. 12 muestra los resultados de mediciones de pesos corporales de modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno sometido a tratamiento con un agente quimioterapéutico para cáncer y/o un lipoplejo o preplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa.Fig. 12 shows the results of body weight measurements of mouse models of malignant pleural mesothelioma orthotopic implant subjected to treatment with a cancer chemotherapeutic agent and / or a lipoplex or preplex having TSsh shRNA attached to its membrane surface external

Realizaciones para realizar la invenciónEmbodiments for carrying out the invention

1. Liposoma1. Liposome

El liposoma para uso de la presente invención está en forma un cuerpo hueco esférico que consiste en una bicapa lipídica que consiste en dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), fosfatidilcolina, y lípido catiónico.The liposome for use of the present invention is in the form of a spherical hollow body consisting of a lipid bilayer consisting of dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine, and cationic lipid.

La "fosfatidilcolina" que se puede usar en la presente invención comprende al menos una cadena de ácido graso insaturado que contiene un doble enlace de carbono a carbono; y en algunas realizaciones,The "phosphatidylcholine" that can be used in the present invention comprises at least one unsaturated fatty acid chain containing a carbon-to-carbon double bond; and in some embodiments,

la fosfatidilcolina comprende al menos una cadena de ácido graso insaturados que contiene un doble enlace de carbono a carbono en forma cis. La fosfatidilcolina puede tener una temperatura de transición de fases baja (por ejemplo, inferior a 0 °C, inferior a -10 °C, o inferior a -20 °C).the phosphatidylcholine comprises at least one unsaturated fatty acid chain containing a carbon-to-carbon double bond in cis form. Phosphatidylcholine may have a low phase transition temperature (eg, lower than 0 ° C, lower than -10 ° C, or lower than -20 ° C).

Los ejemplos de tal "fosfatidilcolina" incluyen 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), palmitoil-oleoilExamples of such "phosphatidylcholine" include 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), palmitoyl-oleoil

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fosfatidilcolina (POPC), y 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), con DOPC siendo preferente.phosphatidylcholine (POPC), and 1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC), with DOPC being preferred.

El "lípido catiónico" que se puede usar en la presente invención es DC-6-14.The "cationic lipid" that can be used in the present invention is DC-6-14.

El liposoma de la presente invención consiste preferentemente en DOPE, DOPC, y DC-6-14.The liposome of the present invention preferably consists of DOPE, DOPC, and DC-6-14.

La proporción de DOPE, fosfatidilcolina (DOPC), y lípido catiónico (DC-6-14) en el liposoma se puede determinar preferentemente en un intervalo de 2 a 4:1 a 3:4 a 6 en moles. La proporción de DOPE:DOPC:DC-6-14 es preferentemente 3:2:5.The proportion of DOPE, phosphatidylcholine (DOPC), and cationic lipid (DC-6-14) in the liposome can preferably be determined in a range of 2 to 4: 1 to 3: 4 to 6 in moles. The DOPE: DOPC: DC-6-14 ratio is preferably 3: 2: 5.

El liposoma de la presente invención se puede preparar de acuerdo con una técnica convencional, tal como agitación de película fina (el método Bangham) (A. D. Bangham et al., J. Mol. Biol., 13, 238-252, 1965; A. D. Bangham y R. W. Horne, J. Mol. Biol., 8, 660-668, 1964). De forma específica, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, y lípido catiónico se disuelven por separado en un disolvente orgánico, tal como cloroformo, y se recogen y se mezclan en un recipiente tal como un matraz para conseguir la composición dada que se ha descrito anteriormente. A continuación, el disolvente orgánico se evapora para formar una capa lipídica en la parte inferior del recipiente, una solución acuosa tal como un tampón se introduce en el mismo, y la mezcla se agita para obtener una suspensión que contiene el liposoma. El "liposoma" en ocasiones se denomina "liposoma catiónico" en el presente documento, y estos términos se usan indistintamente.The liposome of the present invention can be prepared according to a conventional technique, such as thin film agitation (the Bangham method) (AD Bangham et al., J. Mol. Biol., 13, 238-252, 1965; Bangham and RW Horne, J. Mol. Biol., 8, 660-668, 1964). Specifically, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and cationic lipid are dissolved separately in an organic solvent, such as chloroform, and collected and mixed in a vessel such as a flask to achieve the given composition as described above. Next, the organic solvent is evaporated to form a lipid layer in the bottom of the container, an aqueous solution such as a buffer is introduced therein, and the mixture is stirred to obtain a suspension containing the liposome. The "liposome" is sometimes referred to as "cationic liposome" in the present document, and these terms are used interchangeably.

Como alternativa, el liposoma de la presente invención se prepara por disolviendo por separado fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, y lípido catiónico en un disolvente orgánico, tal como cloroformo, recogiendo los para conseguir la composición dada que se ha descrito anteriormente, añadiendo un disolvente orgánico (por ejemplo, ciclohexano en una cantidad de 5 a 30 veces, preferentemente de 5 a 15 veces, y más preferentemente 10 veces la cantidad de lípido total en peso y un alcohol (preferentemente etanol) en una cantidad de un 1 % a un 10 %, preferentemente de un 1 % a un 5 %, y más preferentemente un 2 % de la cantidad de ciclohexano en peso), y calentando la mezcla de 50 °C a 80 °C, y preferentemente de 65 °C a 75 °C para preparar una solución. Posteriormente, la solución resultante se filtra, el disolvente orgánico se congela con el uso de hielo seco y acetona, el disolvente orgánico se retira mediante tratamiento de secado (se tritura, de acuerdo con la necesidad), y en la misma se introduce una solución acuosa tal como un tampón. Por lo tanto, se puede obtener una suspensión que contiene el liposoma. En ocasiones el liposoma obtenido de ese modo se denomina "presoma" o "presoma catiónico" en el presente documento. Un presoma se puede conservar en forma liofilizada.Alternatively, the liposome of the present invention is prepared by separately dissolving phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and cationic lipid in an organic solvent, such as chloroform, collecting them to achieve the given composition as described above, adding an organic solvent (per example, cyclohexane in an amount of 5 to 30 times, preferably 5 to 15 times, and more preferably 10 times the amount of total lipid by weight and an alcohol (preferably ethanol) in an amount of 1% to 10%, preferably from 1% to 5%, and more preferably 2% of the amount of cyclohexane by weight), and heating the mixture from 50 ° C to 80 ° C, and preferably from 65 ° C to 75 ° C to prepare a solution. Subsequently, the resulting solution is filtered, the organic solvent is frozen with the use of dry ice and acetone, the organic solvent is removed by drying treatment (it is crushed, according to need), and a solution is introduced into it. watery such as a tampon. Therefore, a suspension containing the liposome can be obtained. Sometimes the liposome thus obtained is referred to as "presoma" or "cationic presoma" herein. A presoma can be stored in lyophilized form.

Un tamaño de partícula del liposoma de la presente invención es de 80 nm a 200 nm, y preferentemente aproximadamente 100 nm. El potencial zeta del el liposoma de la presente invención es de 40 a 60 mV, y preferentemente aproximadamente 50 mV. Cuando el liposoma de la presente invención es el presoma, un tamaño de partícula del mismo es de 100 nm a 600 nm, y preferentemente de aproximadamente 100 nm a 200 nm.A particle size of the liposome of the present invention is from 80 nm to 200 nm, and preferably approximately 100 nm. The zeta potential of the liposome of the present invention is 40 to 60 mV, and preferably about 50 mV. When the liposome of the present invention is the presoma, a particle size thereof is from 100 nm to 600 nm, and preferably from approximately 100 nm to 200 nm.

El liposoma de la presente invención se puede usar como un vehículo para administración tópica de un principio activo. En la presente invención, la "administración tópica" tiene como objeto la administración de un principio activo directamente a una zona afectada, una lesión, y/o una zona en las proximidades de la misma, con el fin de permitir que el principio activo a octubre en la zona o lesión afectadas. Por consiguiente en la presente invención, la "administración tópica" no se refiere a la administración sistémica de un principio activo mediante inyección intravenosa u otros medios. Los ejemplos de administración tópica incluyen, pero no se limitan a, inyecciones intramuscular, intraperitoneal, intratorácica, hipodérmica, endodérmica, intraocular, intracerebral, intratecal, intravaginal, intrarrectal, intraorgánica, e intratumoral y aplicación a la epidermis. La expresión "administración tópica" preferentemente se refiere a una administración intracavitaria, y más preferentemente administración intratorácica o intraperitoneal. La expresión "principio activo" se refiere a un principio activo de un producto farmacéutico o cosmético. Los ejemplos de los mismos incluyen ADN, ARN, un híbrido de ADN-ARN, una proteína, un péptido, y un compuesto.The liposome of the present invention can be used as a vehicle for topical administration of an active ingredient. In the present invention, "topical administration" has as its object the administration of an active principle directly to an affected area, a lesion, and / or an area in the vicinity thereof, in order to allow the active principle to October in the affected area or injury. Accordingly, in the present invention, "topical administration" does not refer to the systemic administration of an active ingredient by intravenous injection or other means. Examples of topical administration include, but are not limited to, intramuscular, intraperitoneal, intrathoracic, hypodermic, endodermal, intraocular, intracerebral, intrathecal, intravaginal, intrarectal, intraorganic, and intratumoral injections and application to the epidermis. The term "topical administration" preferably refers to an intracavitary administration, and more preferably intrathoracic or intraperitoneal administration. The term "active ingredient" refers to an active ingredient of a pharmaceutical or cosmetic product. Examples thereof include DNA, RNA, a DNA-RNA hybrid, a protein, a peptide, and a compound.

2. Composición2. Composition

La composición para uso de la presente invención comprende el liposoma para uso de la presente invención y el principio activo, y tal composición se puede usar para administración tópica del principio activo.The composition for use of the present invention comprises the liposome for use of the present invention and the active ingredient, and such a composition can be used for topical administration of the active ingredient.

Los ejemplos de principios activos incluyen los que se han usado anteriormente a modo de ejemplo. Por ejemplo, los principios activos pueden ser ARNsi o ARNsh que es capaz de inhibir la expresión de genes que codifican factores expresados en células tumorales y que están implicados con el crecimiento de células tumorales a través de ARNi, aunque los principios activos no se limitan en particular a lo mismo. Los ejemplos de "genes que codifican factores expresados en células tumorales e implicados con el crecimiento de células tumorales" incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican factores reguladores del crecimiento, tales como timidilato sintasa, VEGF, EGFR, PDGF, HGF, Wint, Bcl-2, y survivina, y enzimas implicadas en la síntesis de ácidos nucleicos, tales como ribonucleótido reductasa y ADN polimerasa. La información genética sobre estos genes se desvela en bases de datos conocidas de GenBank y similares, y ARNsi o ARNsh se pueden designar y sintetizar basándose en la información genética de ese tipo. El ARNsh que se describe con detalle a continuación se puede usar como ARNsh que puede inhibir laExamples of active ingredients include those that have been used above by way of example. For example, the active principles can be siRNA or siRNA that is capable of inhibiting the expression of genes that encode factors expressed in tumor cells and that are involved with the growth of tumor cells through RNAi, although the active principles are not limited to particular to the same. Examples of "genes encoding factors expressed in tumor cells and involved with the growth of tumor cells" include, but are not limited to, genes encoding growth-regulating factors, such as thymidylate synthase, VEGF, EGFR, PDGF, HGF, Wint, Bcl-2, and survivin, and enzymes involved in the synthesis of nucleic acids, such as ribonucleotide reductase and DNA polymerase. Genetic information about these genes is disclosed in known databases of GenBank and the like, and siRNA or siRNA can be designated and synthesized based on genetic information of that type. The shRNA that is described in detail below can be used as siRNA that can inhibit

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expresión de la timidilato sintasa a través del ARNi. Como alternativa, un agente anticáncer o agente quimioterapéutico para el cáncer se puede usar como un principio activo.expression of thymidylate synthase through RNAi. Alternatively, an anti-cancer agent or chemotherapeutic agent for cancer can be used as an active ingredient.

En la composición de la presente invención, un principio activo puede estar contenido en una parte hueca encerrada por una bicapa lipídica de un liposoma, o se puede unir a la superficie de la membrana externa de una bicapa lipídica. Un principio activo se une preferentemente a la superficie de la membrana externa de una bicapa lipídica de un liposoma.In the composition of the present invention, an active ingredient may be contained in a hollow part enclosed by a lipid bilayer of a liposome, or it may be attached to the outer membrane surface of a lipid bilayer. An active ingredient is preferably attached to the surface of the outer membrane of a lipid bilayer of a liposome.

La composición de la presente invención también puede contener, además del liposoma y el principio activo, un excipiente, un aglutinante, un agente disgregante, un lubricante, un diluyente, un solubilizante, un agente de suspensión, un agente de isotonicidad, un regulador del pH, un tampón, un estabilizante, un colorante, un agente saborizante, un agente mejorador del olor, histidina, u otras sustancias que se usan generalmente en la producción de productos farmacéuticos o cosméticos.The composition of the present invention may also contain, in addition to the liposome and the active ingredient, an excipient, a binder, a disintegrating agent, a lubricant, a diluent, a solubilizer, a suspending agent, an isotonicity agent, a regulator of the pH, a buffer, a stabilizer, a colorant, a flavoring agent, an odor enhancing agent, histidine, or other substances that are generally used in the production of pharmaceutical or cosmetic products.

Los ejemplos de excipientes incluyen lactosa, sacarosa, cloruro sódico, glucosa, maltosa, manitol, eritritol, xilitol, maltitol, inositol, dextrano, sorbitol, albúmina, urea, almidón, carbonato de calcio, caolín, celulosa cristalina, ácido silícico, metilcelulosa, glicerina, alginato sódico, goma arábiga, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de lubricantes incluyen talco purificado, estearato, borato de sodio, polietilenglicol, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de aglutinantes incluyen jarabe simple, solución de glucosa, solución de almidón, solución de gelatina, alcohol polivinílico, polivinil éter, polivinil pirrolidona, carboximetilcelulosa, goma laca, metilcelulosa, etilcelulosa, agua, etanol, fosfato potásico, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de agentes disgregantes incluyen almidón seco, alginato de sodio, agar en polvo, laminarano en polvo, bicarbonato sódico, carbonato de calcio, ésteres de ácido graso de polioxietileno y sorbitán, lauril sulfato sódico, monoglicérido de ácido esteárico, almidón, lactosa, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de diluyentes incluyen agua, alcohol etílico, macrogol, propilenglicol, alcohol isoestearílico etoxilado, alcohol isoestearílico polioxilado, ésteres de ácido graso de polioxietileno y sorbitán, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de estabilizantes incluyen pirosulfito sódico, ácido etilendiamintetraacético, ácido tioglicónico, ácido tioláctico, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de agentes de isotonicidad incluyen cloruro sódico, ácido bórico, glucosa, glicerina, y una mezcla de los mismos. Los ejemplos de reguladores del pH y tampones incluyen citrato sódico, ácido cítrico, acetato sódico, fosfato sódico, y una mezcla de los mismos.Examples of excipients include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, maltose, mannitol, erythritol, xylitol, maltitol, inositol, dextran, sorbitol, albumin, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, methylcellulose, glycerin, sodium alginate, gum arabic, and a mixture thereof. Examples of lubricants include purified talc, stearate, sodium borate, polyethylene glycol, and a mixture thereof. Examples of binders include simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, shellac, methyl cellulose, ethyl cellulose, water, ethanol, potassium phosphate, and a mixture of same. Examples of disintegrating agents include dry starch, sodium alginate, powdered agar, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, esters of polyoxyethylene and sorbitan fatty acid, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose, and a mixture of them. Examples of diluents include water, ethyl alcohol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene and sorbitan fatty acid esters, and a mixture thereof. Examples of stabilizers include sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid, thioglyconic acid, thiolactic acid, and a mixture thereof. Examples of isotonicity agents include sodium chloride, boric acid, glucose, glycerin, and a mixture thereof. Examples of pH regulators and buffers include sodium citrate, citric acid, sodium acetate, sodium phosphate, and a mixture thereof.

La composición de la presente invención se puede preparar en una forma de dosificación adecuada para administración tópica, y se puede preparar en cualquiera de diversas formas, tales como una inyección, una suspensión, una emulsión, una pomada, una crema, o un comprimido.The composition of the present invention can be prepared in a dosage form suitable for topical administration, and can be prepared in any of a variety of forms, such as an injection, a suspension, an emulsion, an ointment, a cream, or a tablet.

3. Agente antitumoral3. Antitumor agent

El agente anti tumoral para uso de la presente invención comprende el liposoma para uso de la presente invención y, como un principio activo, el ARNsh que puede inhibir la expresión de timidilato sintasa (en lo sucesivo en el presente documento denominada "TS") a través de ARNi.The anti tumor agent for use of the present invention comprises the liposome for use of the present invention and, as an active ingredient, the shRNA that can inhibit the expression of thymidylate synthase (hereinafter referred to as "TS") to through RNAi.

El ARNsh que puede inhibir la expresión de TS de acuerdo con la presente invención ejerce una actividad de ARNi específica de TS mediante dirección de ARNm de TS, y por lo tanto de ese modo puede inhibir la expresión de TS de forma notable. La expresión "que se dirige a ARNm" usada en el presente documento se refiere a la situación en la que una hebra antisentido de ARNsh que se describe con detalle a continuación se puede hibridar en condiciones rigurosas al ARNm diana.The shRNA that can inhibit the expression of TS according to the present invention exerts a TS specific RNAi activity by directing TS mRNA, and thereby thereby can inhibit TS expression remarkably. The term "targeting mRNA" used herein refers to the situation in which an antisense strand of shRNA that is described in detail below can hybridize under stringent conditions to the target mRNA.

Las condiciones rigurosas se pueden determinar basándose en la temperatura de (Tm) para ácido nucleico a la que se forma un híbrido de acuerdo con una técnica convencional. En condiciones rigurosas, por ejemplo, las condiciones de lavado que permiten el mantenimiento de la hibridación comprenden generalmente "1 X SSC, SDS al 0,1 %, 37 °C", de forma más estricta "0,5 X SSC, SDS al 01 %, 42 °C", y además de forma estricta "0,1 X SSC, SDS al 0,1 %, 65 °C. "The stringent conditions can be determined based on the temperature of (Tm) for nucleic acid to which a hybrid is formed according to a conventional technique. Under stringent conditions, for example, the washing conditions that allow the maintenance of hybridization generally comprise "1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C", more stringently "0.5 X SSC, SDS at 01%, 42 ° C ", and in addition strictly" 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C. "

De acuerdo con la presente invención, el ARNsh comprende una hebra codificante que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de nucleótidos del ORF que codifica la TS o una parte de la misma y una hebra no codificante que se hibrida en condiciones rigurosas a la hebra codificante. La expresión "secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de nucleótidos de ORF o una parte del mismo" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es idéntica a una secuencia de nucleótidos obtenida por sustitución de timina con uracilo en la secuencia de nucleótidos de ORF o una parte del mismo.In accordance with the present invention, the shRNA comprises a coding strand comprising a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the ORF encoding the TS or a part thereof and a non-coding strand that hybridizes under stringent conditions to the coding strand. The term "nucleotide sequence identical to the ORF nucleotide sequence or a portion thereof" refers to a nucleotide sequence that is identical to a nucleotide sequence obtained by replacing thymine with uracil in the nucleotide sequence of ORF or a part of it.

La hebra codificante consta de 15 a 25 nucleótidos, y preferentemente 19 nucleótidos. Aunque la secuencia de nucleótidos de la hebra codificante es preferentemente la misma que la secuencia de nucleótidos del ORF que codifica la TS, puede ser esencialmente la misma secuencia; es decir, una secuencia homóloga. De forma específica, la secuencia de nucleótidos de la hebra codificante puede ser diferente de la secuencia de nucleótidos del ORF por sustitución, deleción, inserción, y/o adición de uno o más; es decir, de 1 a 3 nucleótidos,The coding strand consists of 15 to 25 nucleotides, and preferably 19 nucleotides. Although the nucleotide sequence of the coding strand is preferably the same as the nucleotide sequence of the ORF encoding the TS, it can be essentially the same sequence; that is, a homologous sequence. Specifically, the nucleotide sequence of the coding strand may be different from the nucleotide sequence of the ORF by substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or more; that is, from 1 to 3 nucleotides,

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preferentemente 1 o 2 nucleótidos, y más preferentemente 1 nucleótido.preferably 1 or 2 nucleotides, and more preferably 1 nucleotide.

La hebra no codificante comprender la secuencia de nucleótidos que puede hibridarse en condiciones rigurosas a la hebra codificante. Siempre y cuando se pueda hibridar en condiciones rigurosas, la hebra no codificante puede comprender una falta de coincidencia, incluyendo sustitución, deleción, inserción, y/o adición de 1 a 3 nucleótidos, preferentemente 1 o 2 nucleótidos, y más preferentemente 1 nucleótido. La hebra no codificante preferentemente consta de una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a la hebra codificante.The non-coding strand comprises the nucleotide sequence that can hybridize under stringent conditions to the coding strand. As long as it can hybridize under stringent conditions, the non-coding strand can comprise a mismatch, including substitution, deletion, insertion, and / or addition of 1 to 3 nucleotides, preferably 1 or 2 nucleotides, and more preferably 1 nucleotide. The non-coding strand preferably consists of a nucleotide sequence completely complementary to the coding strand.

Las secuencias de nucleótidos de la hebra codificante y la hebra no codificante se pueden seleccionar basándose en la secuencia de nucleótidos codificante de TS conocida (GenBank: CR601528.1). Se conocen diversos métodos para seleccionar secuencias de nucleótidos de ese tipo. Por ejemplo, se puede usar el Sistema de Soporte de Diseño de ARNsi (Takara Bio Inc.).The nucleotide sequences of the coding strand and the non-coding strand can be selected based on the known TS coding nucleotide sequence (GenBank: CR601528.1). Various methods are known for selecting nucleotide sequences of that type. For example, the ARNsi Design Support System (Takara Bio Inc.) can be used.

En la presente invención, los ejemplos de hebras codificantes incluyen las que consisten en las secuencias de nucleótidos y se indican a continuación, aunque las hebras codificantes no se limita a las mismas: 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3' (SEQ ID NO: 1);In the present invention, the examples of coding strands include those consisting of the nucleotide sequences and are indicated below, although the coding strands are not limited thereto: 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3 '(SEQ ID NO: 1) ;

5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3' (SEQ ID NO: 3);5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3 '(SEQ ID NO: 3);

5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3' (SEQ ID NO: 5); y 5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3' (SEQ ID NO: 9).5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3 '(SEQ ID NO: 5); and 5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3 '(SEQ ID NO: 9).

En la presente invención, el ARNsh comprende preferentemente: la hebra codificante 5'- GUAACACCAUCGAUCAUGA-3' (SEQ ID NO: 1) y la hebra no codificante 5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3' (SEQ ID NO: 2); la hebra codificante 5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3' (SEQ ID NO: 3) y la hebra no codificante 5'- AUUCCAUAUCUCUGUAUUC-3' (SEQ ID NO: 4); la hebra codificante 5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3' (SEQ ID NO: 5) y la hebra no codificante 5'-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3' (SEQ ID NO: 6); o la hebra codificante 5'- GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3' (SEQ ID NO: 9) y la hebra no codificante 5'-AACAACUCCUCCAAAACACCC- 3' (SEQ ID NO: 10).In the present invention, the shRNA preferably comprises: the coding strand 5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3 '(SEQ ID NO: 1) and the non-coding strand 5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3' (SEQ ID NO: 2); the coding strand 5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3 '(SEQ ID NO: 3) and the non-coding strand 5'- AUUCCAUAUCUCUGUAUUC-3' (SEQ ID NO: 4); the coding strand 5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3 '(SEQ ID NO: 5) and the non-coding strand 5'-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3' (SEQ ID NO: 6); or the coding strand 5'- GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3 '(SEQ ID NO: 9) and the non-coding strand 5'-AACAACUCCUCCAAAACACCC-3' (SEQ ID NO: 10).

En la presente invención, el ARNsh comprende más preferentemente la hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2.In the present invention, the shRNA comprises more preferably the coding strand consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the non-coding strand consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. : two.

Una hebra codificante y una hebra no codificante se conectan entre sí a través de un conector, se pliegan cuando el conector forma un lazo, y la hebra no codificante y la hebra codificante se hibridan entre sí para formar una parte de doble hebra. Siempre y cuando un conector incluido en la molécula de ARNsh pueda conectar la hebra codificante con la hebra no codificante y formar una estructura de tallo-lazo, puede ser un conector polinucleotídico o no polinucleotídico. Un conector es preferentemente, pero no se limita en particular a, un conector polinucleotídico que consiste en 2 a 22 nucleótidos conocido en la técnica. Los ejemplos específicos del mismo incluyen UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7), UUCAAGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAAGAGA, AUG, CCC, y UUCG, con UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7) siendo preferente.A coding strand and a non-coding strand are connected to each other through a connector, they are folded when the connector forms a loop, and the non-coding strand and the coding strand hybridize to each other to form a double-stranded part. As long as a linker included in the shRNA molecule can connect the coding strand to the non-coding strand and form a stem-loop structure, it can be a polynucleotide or non-polynucleotide linker. A linker is preferably, but not limited to, a polynucleotide linker consisting of 2 to 22 nucleotides known in the art. Specific examples thereof include UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7), UUCAAGAGA, CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAAGAGA, AUG, CCC, and UUCG, with UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7) being preferred.

En la presente invención, el ARNsh comprende una protuberancia que consiste en dos o más nucleótidos en el extremo en la posición 3'.In the present invention, the shRNA comprises a protuberance consisting of two or more nucleotides at the end at the 3 'position.

En la presente invención, el término "protuberancia" se refiere a un nucleótido añadido al extremo en la posición 3' de la hebra no codificante que no tienen nucleótido capaz de unirse de forma complementaria a una posición correspondiente de la hebra codificante. Si una hebra no codificante no tiene una protuberancia en el extremo en la posición 3', el grado de inhibición de la expresión de TS causada por el ARNsh disminuye en aproximadamente un 40 % a un 60 % después de transfección con el uso del liposoma de la presente invención, en comparación con un caso en el que una hebra no codificante tiene una protuberancia en el extremo en la posición 3'. Los tipos y números de nucleótidos que constituyen la protuberancia no se limitan en particular. Por ejemplo, se pueden usar secuencias que consisten en 1 a 5, preferentemente de 1 a 3, y más preferentemente 1 o 2 nucleótidos. Los ejemplos específicos incluyen TTT, UU, y TT, con UU siendo preferente.In the present invention, the term "protrusion" refers to a nucleotide added to the end at the 3 'position of the non-coding strand having no nucleotide capable of binding complementarily to a corresponding position of the coding strand. If a non-coding strand does not have a protrusion at the 3 'end, the degree of inhibition of TS expression caused by the shRNA decreases by approximately 40% to 60% after transfection with the use of the liposome. the present invention, as compared to a case in which a non-coding strand has a protrusion at the end at the 3 'position. The types and numbers of nucleotides that make up the bulge are not limited in particular. For example, sequences consisting of 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1 or 2 nucleotides can be used. Specific examples include TTT, UU, and TT, with UU being preferred.

En la presente invención, el ARNsh preferente es un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8.In the present invention, the preferred siRNA is a single-stranded RNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.

La hebra codificante o no codificante puede tener el extremo en la posición 5' fosforilado, y puede comprender trifosfato (ppp) unido al extremo en la posición 5', de acuerdo con la necesidad.The coding or non-coding strand may have the terminus at the 5 'phosphorylated position, and may comprise triphosphate (ppp) attached to the terminus at the 5' position, according to need.

Los ARNsh se unen con enlace covalente o no covalente a la superficie de la membrana externa de la bicapa lipídica del liposoma de la presente invención. Con el fin de unir los ARNsh al liposoma, es precedente que una mezcla que contienen los ARNsh y el liposoma se agite de forma vigorosa de 1 a 15 minutos, y preferentemente aproximadamente 10 minutos (por ejemplo, a través de agitación con ultrasonidos). Por lo tanto, un tamaño de partícula del liposoma resultante que comprende ARNsh se puede ajustar a varios cientos de nanómetrosThe shRNAs bind covalently or non-covalently to the surface of the outer membrane of the lipid bilayer of the liposome of the present invention. In order to bind the shRNAs to the liposome, it is precedent for a mixture containing the shRNAs and the liposome to be vigorously shaken for 1 to 15 minutes, and preferably approximately 10 minutes (for example, by shaking with ultrasound). Therefore, a particle size of the resulting liposome comprising shRNA can be adjusted to several hundred nanometers

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(Barichello, J. M., et al., Int. J. Pharm., 2011). Mediante agitación, además, los ARNsh se pueden dispersar y unir al liposoma de manera uniforme. Esto puede evitar una absorción irregular de liposomas por parte de los tejidos causada por unión no uniforme a ARNsh. Cuando un liposoma es un presoma, como alternativa, el ARNsh se añadía una suspensión que contiene el presoma y se mezcla (por ejemplo, mediante agitación vorticial), con el fin de unir el ARNsh a la superficie de la membrana externa de la bicapa lipídica del presoma.(Barichello, J. M., et al., Int. J. Pharm., 2011). By agitation, in addition, the shRNAs can be dispersed and bound to the liposome in a uniform manner. This can prevent an irregular absorption of liposomes by the tissues caused by non-uniform binding to shRNA. When a liposome is a presoma, alternatively, the shRNA was added to a suspension containing the presoma and mixed (e.g., by vortexing), in order to bind the shRNA to the surface of the outer membrane of the lipid bilayer. of the presoma.

En la presente invención, un tamaño de partícula de un liposoma que tiene ARNsh es de 200 nm a 600 nm, y preferentemente de aproximadamente 300 nm a 400 nm. En la presente invención, también, un tamaño de partícula de un presoma que tiene ARNsh es de 200 nm a 2 pm, y preferentemente de aproximadamente 300 nm a 1 pm. En la presente invención, el potencial zeta de un liposoma que tiene ARNsh es de 0 a 50 mV, y preferentemente de aproximadamente 25 a 35 mV.In the present invention, a particle size of a liposome having siRNA is 200 nm at 600 nm, and preferably at about 300 nm at 400 nm. In the present invention, too, a particle size of a presoma having siRNA is from 200 nm to 2 pm, and preferably from about 300 nm to 1 pm. In the present invention, the zeta potential of a liposome having siRNA is from 0 to 50 mV, and preferably from about 25 to 35 mV.

El liposoma que tiene el ARNsh de la presente invención puede comprender ARNsi o ARNsh que pueden inhibir la expresión de genes que codifican factores expresados en células tumorales, e implicados en el crecimiento de la célula tumoral a través de ARNi, además de ARNsh que puede inhibir la expresión de TS. Se puede usar ARNsi o ARNsh como se ha definido anteriormente. El ARNsh que puede inhibir la expresión de TS y otro ARNsi o ARNsh se puede unir al mismo liposoma, o se puede unir a diferentes liposomas.The liposome having the siRNA of the present invention may comprise siRNA or shRNA that can inhibit the expression of genes encoding factors expressed in tumor cells, and involved in the growth of the tumor cell through RNAi, in addition to shRNA that can inhibit the expression of TS. The siRNA or shRNA can be used as defined above. The shRNA that can inhibit the expression of TS and other siRNA or shRNA can bind to the same liposome, or can bind to different liposomes.

En la presente descripción, un liposoma que tiene ARNsh se denomina en ocasiones "lipoplejo", y un presoma que tiene ARNsh en ocasiones se denomina "preplejo".In the present description, a liposome having siRNA is sometimes called "lipoplex", and a presoma having siRNA is sometimes called "preplex".

Como se describe con detalle en los ejemplos que siguen a continuación, el liposoma que tiene ARNsh es capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales a través de administración tópica del mismo, y en consecuencia se puede usar para el tratamiento del cáncer.As described in detail in the examples that follow, the liposome having siRNA is capable of inhibiting the growth of tumor cells through topical administration thereof, and consequently can be used for the treatment of cancer.

Los cánceres que se pueden tratar con el uso del agente antitumoral de la presente invención son los que presentan niveles de expresión de TS elevados. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan en particular a, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del tracto biliar, cáncer de vesícula biliar y de conductos biliares, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer del cuerpo uterino, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, mesotelioma pleural maligno, tumor testicular, cáncer de ovario, osteosarcoma un osteosarcoma de tejido blando, cáncer de piel, y tumor cerebral. La pleuresía carcinomatosa y peritonitis carcinomatosa se pueden tratar con el uso del agente antitumoral de la presente invención. Los candidatos para el tratamiento son, por ejemplo, preferentemente cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer del tracto biliar, cáncer de hígado, mesotelioma pleural maligno, cáncer de ovario, peritonitis carcinomatosa, y peritonitis carcinomatosa, y de forma particularmente preferente mesotelioma pleural maligno, cáncer de pulmón no microcítico sin metástasis distante, pleuresía carcinomatosa, metástasis peritoneal por cáncer gástrico, metástasis peritoneal por cáncer de ovario, y peritonitis carcinomatosa.Cancers that can be treated with the use of the antitumor agent of the present invention are those that exhibit high TS expression levels. Examples thereof include, but are not limited to, colorectal cancer, liver cancer, kidney cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, gastric cancer, biliary tract cancer, gallbladder and ductal cancer. biliary, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, uterine body cancer, bladder cancer, prostate cancer, malignant pleural mesothelioma, testicular tumor, ovarian cancer, osteosarcoma osteosarcoma soft tissue, skin cancer, and brain tumor. Carcinomatous pleurisy and carcinomatous peritonitis can be treated with the use of the antitumor agent of the present invention. Candidates for treatment are, for example, preferably gastric cancer, lung cancer, biliary tract cancer, liver cancer, malignant pleural mesothelioma, ovarian cancer, carcinomatous peritonitis, and carcinomatous peritonitis, and particularly preferably malignant pleural mesothelioma. , non-small cell lung cancer without distant metastasis, carcinomatous pleurisy, peritoneal metastasis from gastric cancer, peritoneal metastasis from ovarian cancer, and carcinomatous peritonitis.

El agente antitumoral de la presente invención puede comprender adicionalmente, además de un liposoma que tiene ARNsh, un excipiente, un aglutinante, un agente disgregante, un lubricante, un diluyente, un solubilizante, un agente de suspensión, un agente de isotonicidad, un regulador del pH, un tampón, un estabilizante, un colorante, un agente saborizante, un agente mejorador del olor, histidina, u otras sustancias que se usan generalmente en la producción de productos farmacéuticos. Se puede usar el excipiente, el lubricante, el aglutinante, el agente disgregante, el diluyente, el estabilizante, el agente de isotonicidad, y el regulador de pH que se han definido anteriormente.The antitumor agent of the present invention may additionally comprise, in addition to a liposome having siRNA, an excipient, a binder, a disintegrating agent, a lubricant, a diluent, a solubilizer, a suspending agent, an isotonicity agent, a regulator of the pH, a buffer, a stabilizer, a colorant, a flavoring agent, an odor enhancing agent, histidine, or other substances that are generally used in the production of pharmaceutical products. The excipient, the lubricant, the binder, the disintegrating agent, the diluent, the stabilizer, the isotonicity agent, and the pH regulator as defined above can be used.

El agente anti tumoral de la presente invención se puede administrar por medio de administración tópica. Las formas de administración tópica son como se han definido anteriormente. La composición de la presente invención se puede preparar en cualquiera de diversas formas de dosificación adecuadas para administración tópica, tales como una inyección, una suspensión, una emulsión, o una pulverización.The anti tumor agent of the present invention can be administered by means of topical administration. The topical administration forms are as defined above. The composition of the present invention can be prepared in any of various dosage forms suitable for topical administration, such as an injection, a suspension, an emulsion, or a spray.

Los efectos del agente antitumoral de la presente invención se pueden evaluar mediante administración del agente antitumoral a células o tejidos que se originan a partir de cualquiera de los cánceres que se han descrito anteriormente y a un individuo afectado con cualquiera de los cánceres que se han descrito anteriormente, comparando el tamaño del tumor resultante con el tamaño del tumor en células o tejidos y un individuo al que no se le ha administrado el agente antitumoral (o antes de su administración), y usando la contracción o extinción del tumor como el indicador. Como alternativa, los efectos del agente antitumoral de la presente invención se pueden evaluar administrando el agente antitumoral a células o tejidos que se originan a partir de cualquiera de los cánceres que se han descrito anteriormente y a un individuo afectado con cualquiera de los cánceres que se han descrito anteriormente, y determinando la mejora de la tasa de supervivencia (es decir, efectos que prolongan la vida) y reducción o desaparición de una efusión pleural o ascitis, en comparación con un individuo al que no se le ha administrado el agente antitumoral.The effects of the antitumor agent of the present invention can be evaluated by administration of the antitumor agent to cells or tissues that originate from any of the cancers described above and to an individual affected with any of the cancers described above. , comparing the size of the resulting tumor with the size of the tumor in cells or tissues and an individual who has not been administered the antitumor agent (or before its administration), and using contraction or extinction of the tumor as the indicator. Alternatively, the effects of the antitumor agent of the present invention can be assessed by administering the antitumor agent to cells or tissues that originate from any of the cancers described above and to an individual affected with any of the cancers that have been described above, and determining the improvement of the survival rate (i.e., life-prolonging effects) and reduction or disappearance of a pleural effusion or ascites, as compared to an individual who has not been administered the antitumor agent.

El agente antitumoral de la presente invención se puede usar en combinación con quimioterapia para el cáncer existente o un agente quimioterapéutico para cáncer. La quimioterapia para el cáncer o un agente quimioterapéuticoThe antitumor agent of the present invention can be used in combination with chemotherapy for the existing cancer or a chemotherapeutic agent for cancer. Chemotherapy for cancer or a chemotherapeutic agent

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para cáncer que se puede usar en combinación con el agente anti tumoral de la presente invención no está limitado en particular, con la condición de que pueda modificar las afecciones tumorales, de modo que el liposoma de la presente invención puede invadir fácilmente el tejido tumoral. Un ejemplo de quimioterapia para el cáncer existente es una quimioterapia que implica el uso de "un agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS" que se describe a continuación, y un ejemplo de un agente quimioterapéutico para el cáncer existente es un agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS.for cancer that can be used in combination with the anti tumor agent of the present invention is not limited in particular, provided that it can modify the tumor conditions, so that the liposome of the present invention can easily invade the tumor tissue. An example of chemotherapy for existing cancer is chemotherapy that involves the use of "an antitumor agent that has inhibitory action for TS" which is described below, and an example of an existing chemotherapeutic agent for cancer is an antitumor agent that It has inhibitory action for TS.

Un "agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS" no está limitado en particular, con la condición de que pueda inhibir funciones de la TS. Los ejemplos del mismo incluyen un agente antitumoral 5-FU, pemetrexed sódico hidratado, raltitrexed (Tomudex), y metotrexato (MTX).An "antitumor agent that has inhibitory action for TS" is not particularly limited, with the proviso that it can inhibit TS functions. Examples thereof include an antitumor agent 5-FU, pemetrexed sodium hydrate, raltitrexed (Tomudex), and methotrexate (MTX).

Se ha informado de la correlación entre el nivel de expresión de TS y una respuesta al agente antitumoral 5-FU (Patrick G. Johnston et al., Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; y Kun-Huei Yeh et al., Cancer 1998; 82: 1626-31). Entre los pacientes con cáncer, los que presentan un nivel de expresión de TS relativamente bajos muestran una respuesta notable al agente antitumoral 5-FU. Por el contrario, muchos pacientes con cáncer que presentan niveles de expresión de TS relativamente aumentados toleran el agente antitumoral 5-FU. Una correlación similar se observa entre pemetrexed sódico hidratado y los niveles de expresión de TS. A través de la administración del agente antitumoral de la presente invención, la producción de TS en tejidos tumorales se puede suprimir, y una respuesta de los tejidos tumorales al agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS se puede potenciar. Cuando el agente antitumoral de la presente invención se usa en combinación con un agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS, el agente antitumoral de la presente invención se acumula de forma selectiva en tumores, y el ARNsh se puede administrar de forma eficaz a las células tumorales. Con el uso del agente antitumoral de la presente invención en combinación con el agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS, en consecuencia, los efectos antitumorales pueden ser notablemente más elevados que los conseguidos con el uso del agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS o el agente antitumoral de la presente invención solo.The correlation between the level of TS expression and a response to the 5-FU antitumor agent (Patrick G. Johnston et al., Cancer Res., 1995; 55: 1407-12; and Kun-Huei Yeh et al. ., Cancer 1998; 82: 1626-31). Among patients with cancer, those with a relatively low level of TS expression show a remarkable response to the antitumor agent 5-FU. In contrast, many cancer patients with relatively increased TS expression levels tolerate the antitumor agent 5-FU. A similar correlation is observed between pemetrexed sodium hydrate and TS expression levels. Through the administration of the antitumor agent of the present invention, the production of TS in tumor tissues can be suppressed, and a response of the tumor tissues to the antitumor agent that has inhibitory action for TS can be enhanced. When the antitumor agent of the present invention is used in combination with an antitumor agent that has inhibitory action for TS, the antitumor agent of the present invention selectively accumulates in tumors, and the shRNA can be administered effectively to the tumor cells. With the use of the antitumor agent of the present invention in combination with the antitumor agent that has inhibitory action for the TS, consequently, the antitumor effects can be markedly higher than those achieved with the use of the antitumor agent that has inhibitory action for the TS or the antitumor agent of the present invention alone.

Los ejemplos de agentes antitumorales 5-FU incluyen 5-FU y un derivado de 5-FU a partir de que se produce el 5- FU como un metabolito activo. Un ejemplo de un derivado de 5-FU es un agente que contiene tegafur. Un derivado de 5-FU es preferentemente un compuesto que contiene tegafur, y ejemplos específicos de los mismos incluyen un compuesto farmacológico de tegafur y uracilo (por ejemplo, UFT®, Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) y un compuesto farmacológico de tegafur, gimeracilo, y oteracilo potásico. Entre estos, un compuesto farmacológico de tegafur, gimeracilo, y oteracilo potásico, tal como TS-1® (Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.), es particularmente preferente.Examples of antitumor agents 5-FU include 5-FU and a derivative of 5-FU from which 5-FU is produced as an active metabolite. An example of a 5-FU derivative is an agent that contains tegafur. A 5-FU derivative is preferably a compound containing tegafur, and specific examples thereof include a pharmacological compound of tegafur and uracil (eg, UFT®, Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) and a tegafur drug compound, gimeracil, and potassium oteracil. Among these, a pharmacological compound of tegafur, gimeracil, and potassium oteracil, such as TS-1® (Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.), is particularly preferred.

Un ejemplo de pemetrexed sódico hidratado es Alimta® (Eli Lilly Japan K.K.). Al igual que con el caso del agente antitumoral 5-FU, los efectos antitumorales conseguidos con el uso del pemetrexed sódico hidratado en combinación con el agente antitumoral de la presente invención son notablemente más elevados que los conseguidos con el uso del pemetrexed sódico hidratado o el agente antitumoral de la presente invención solos.An example of pemetrexed sodium hydrate is Alimta® (Eli Lilly Japan K.K.). As with the case of the antitumor agent 5-FU, the antitumor effects achieved with the use of the pemetrexed sodium hydrate in combination with the antitumor agent of the present invention are markedly higher than those achieved with the use of the pemetrexed sodium hydrate or the antitumor agent of the present invention alone.

El agente antitumoral de la presente invención se puede usar en combinación con otros agentes quimioterapéutico es para el cáncer convencionales, además de o en lugar del agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS. Los ejemplos de los agentes quimioterapéutico hasta el cáncer de ese tipo incluyen ciclofosfamida, N-óxido de mostaza de nitrógeno, ifosfamida, melfalán, busulfán, mitobronitol, carbocuona, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida, carmustina, pemetrexed disódico, metotrexato, ribósido de 6-mercaptopurina, mercaptopurina, doxifluridina, carmofur, citarabina, ocfosfato de citarabina, enocitabina, gemcitabina, fludarabina, pemetrexed, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, paclitaxel, docetaxel, clorhidrato de irinotecán, y capecitabina. Se puede usar uno o una pluralidad de agentes quimioterapéuticos a la el cáncer seleccionados entre los mismos. Al igual que en el caso del agente antitumoral que tiene acción inhibitoria para la TS, el ARNsh se puede administrar de forma eficaz a células tumorales cuando el agente quimioterapéutico para el cáncer se usa en combinación con el agente antitumoral de la presente invención. Los efectos antitumorales conseguidos de ese modo pueden ser notablemente más elevados que los conseguidos con el uso del agente quimioterapéutico para el cáncer o el agente antitumoral de la presente invención solos.The antitumor agent of the present invention can be used in combination with other conventional chemotherapeutic agents for cancer, in addition to or in place of the antitumor agent which has inhibitory action for TS. Examples of chemotherapeutic agents up to cancer of that type include cyclophosphamide, nitrogen mustard N-oxide, ifosfamide, melphalan, busulfan, mitobronitol, carbocuone, thiotepa, ranimustine, nimustine, temozolomide, carmustine, pemetrexed disodium, methotrexate, riboside 6-mercaptopurine, mercaptopurine, doxifluridine, carmofur, cytarabine, cytarabine ocphosphate, enocythabin, gemcitabine, fludarabine, pemetrexed, cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, paclitaxel, docetaxel, irinotecan hydrochloride, and capecitabine. One or a plurality of cancer chemotherapeutic agents selected from among them may be used. As in the case of the antitumor agent which has inhibitory action for TS, the shRNA can be administered efficiently to tumor cells when the cancer chemotherapeutic agent is used in combination with the antitumor agent of the present invention. The antitumor effects thus achieved may be markedly higher than those achieved with the use of the cancer chemotherapeutic agent or the antitumor agent of the present invention alone.

Siempre y cuando el agente antitumoral de la presente invención se administre en combinación con el agente quimioterapéutico para el cáncer existente, estos agentes se pueden proporcionar en forma de un "producto combinado".Provided that the antitumor agent of the present invention is administered in combination with the existing cancer chemotherapeutic agent, these agents can be provided in the form of a "combined product".

El agente antitumoral de la presente invención se puede preparar en forma de un "producto combinado" en combinación con el agente quimioterapéutico para el cáncer existente. Un "producto combinado" de ese tipo puede ser un compuesto farmacológico que contiene el agente antitumoral de la presente invención y el agente quimioterapéutico para el cáncer existente como principios activos. Además, se puede producir, envasar y distribuir un solo envase (un kit de formulación) que contiene el agente antitumoral de la presente invención y el agente quimioterapéutico para el cáncer existente adecuado para administración combinada.The antitumor agent of the present invention can be prepared in the form of a "combination product" in combination with the existing cancer chemotherapeutic agent. A "combined product" of that type can be a pharmacological compound containing the antitumor agent of the present invention and the existing chemotherapeutic agent for cancer as active ingredients. In addition, a single package (a formulation kit) containing the antitumor agent of the present invention and the existing cancer chemotherapeutic agent suitable for combined administration can be produced, packaged and distributed.

La expresión "administración combinada" puede hacer referencia no solamente a administración simultánea del agente antitumoral de la presente invención y el agente quimioterapéutico para el cáncer existente sino también aThe term "combined administration" can refer not only to simultaneous administration of the antitumor agent of the present invention and the existing cancer chemotherapeutic agent but also to

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administración del agente antitumoral de la presente invención y el agente quimioterapéutico para el cáncer existente a ciertos intervalos. La vía de administración y el medio para la administración del agente antitumoral de la presente invención pueden ser iguales o diferentes a los del agente quimioterapéutico para el cáncer existente.administration of the antitumor agent of the present invention and the existing chemotherapeutic agent for cancer at certain intervals. The route of administration and the means for administering the antitumor agent of the present invention may be the same as or different from those of the existing cancer chemotherapeutic agent.

La dosis y la frecuencia de administración del agente antitumoral de la presente invención puede variar dependiendo de factores, tales como la edad y el peso corporal de un paciente y la gravedad de la enfermedad. El agente antitumoral se puede administrar a una sola dosis seleccionada de forma apropiada desde el intervalo de 0,0001 mg a 100 mg en términos de la cantidad de ARNsh por kg del peso corporal, de 1 a 3 veces cada día o cada 1 a 21 días.The dose and frequency of administration of the antitumor agent of the present invention may vary depending on factors, such as the age and body weight of a patient and the severity of the disease. The antitumor agent can be administered at a single, appropriately selected dose from the range of 0.0001 mg to 100 mg in terms of the amount of shRNA per kg of body weight, from 1 to 3 times each day or every 1 to 21 days.

La dosis del agente quimioterapéutico para el cáncer existente puede variar dependiendo de factores, tales como un tipo de una sustancia química como un principio activo, la edad y el peso corporal de un paciente, y la gravedad de la enfermedad. El agente quimioterapéutico para el cáncer existente se puede administrar a una sola dosis seleccionada de forma apropiada entre el intervalo de 0,0001 mg a 1000 mg por kg del peso corporal, de 1 a 3 veces cada día o cada 1 a 14 días. Cuando el agente quimioterapéutico para el cáncer existente es un agente antitumoral 5-FU, por ejemplo, se puede administrar una dosis diaria de 60 a 160 mg en términos de tegafur cada día o cada 1 a 7 días. Cuando el agente quimioterapéutico para el cáncer existente es pemetrexed sódico hidratado, éste se puede administrar a una dosis diaria de 500 a 1000 mg cada día o cada 1 a 7 días. El agente quimioterapéutico para el cáncer existente se puede administrar a dosis y frecuencias menores cuando se usa en combinación con el agente antitumoral de la presente invención en comparación con un caso en el que se administra solo. Esto puede suprimir o retrasar el desarrollo de efectos secundarios que pueden estar producidos por la administración de los agentes quimioterapéuticos para el cáncer existentes. Los ejemplos de efectos secundarios incluyen, pero no se limitan a, supresión de médula ósea, anemia hemolítica, síndrome de coagulación intravascular diseminada, insuficiencia hepática fulminante, deshidratación, enteritis, neumonía intersticial, estomatitis, ulcera del tracto gastrointestinal, hemorragia del tracto gastrointestinal, perforación del tracto gastrointestinal, insuficiencia renal aguda, síndrome muco-cutáneo-ocular, necrólisis epidérmica tóxica, trastorno psiconeurótico, pancreatitis aguda, rabdomiólisis, y anosmia.The dosage of the chemotherapeutic agent for the existing cancer may vary depending on factors, such as a type of a chemical such as an active substance, the age and body weight of a patient, and the severity of the disease. The existing cancer chemotherapeutic agent can be administered at a single, appropriately selected dose in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight, 1 to 3 times each day or every 1 to 14 days. When the existing chemotherapeutic agent for cancer is a 5-FU antitumor agent, for example, a daily dose of 60 to 160 mg may be administered in terms of tegafur every day or every 1 to 7 days. When the existing chemotherapeutic agent for cancer is pemetrexed sodium hydrate, it can be administered at a daily dose of 500 to 1000 mg every day or every 1 to 7 days. The existing cancer chemotherapeutic agent can be administered at lower dosages and frequencies when used in combination with the antitumor agent of the present invention as compared to a case in which it is administered alone. This can suppress or delay the development of side effects that may be caused by the administration of existing cancer chemotherapeutic agents. Examples of side effects include, but are not limited to, bone marrow suppression, hemolytic anemia, disseminated intravascular coagulation syndrome, fulminant hepatic insufficiency, dehydration, enteritis, interstitial pneumonia, stomatitis, gastrointestinal tract ulceration, gastrointestinal tract hemorrhage, perforation of the gastrointestinal tract, acute renal failure, muco-cutaneous-ocular syndrome, toxic epidermal necrolysis, psychoneurotic disorder, acute pancreatitis, rhabdomyolysis, and anosmia.

EjemplosExamples

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describe con mayor detalle en referencia a los ejemplos que siguen a continuación, aunque la presente invención no se limita a estos ejemplos.Hereinafter, the present invention is described in more detail with reference to the examples that follow, although the present invention is not limited to these examples.

[Ejemplo 1][Example 1]

Efectos inhibitorios en el crecimiento celular con el uso de ARNsh de dirección a TS en combinación con Alimta in vitroInhibitory effects on cell growth with the use of shRNA to address TS in combination with Alimta in vitro

(ARNsh de dirección a TS)(ARNsh address to TS)

El ARNsh de dirección a TS (en lo sucesivo en el presente documento denominado "ARNsh de TS") que tiene la secuencia que se demuestra a continuación se sintetizó basándose en el ARNsh conocido capaz de inhibir la expresión de TS que se confirmó que tenía los efectos antitumorales (véase el documento WO 2012/161196).The shRNA directing to TS (hereinafter referred to as "TS shRNA") having the sequence shown below was synthesized based on the known shRNA capable of inhibiting TS expression which was confirmed to have the anti-tumor effects (see WO 2012/161196).

ARNsh de TS:TS shRNAsh:

S’-GUAACACCAUCGAUCAUGAUAGUGCUCCUGGUUGUCAUGAUCGAUGGUG UUACUU-3’ (SEQ ID NO: 8)S'-GUAACACCAUCGAUCAUGAUAGUGCUCCUGGUUGUCAUGAUCGAUGGUG UUACUU-3 '(SEQ ID NO: 8)

Por el contrario, el ARNsh que tiene la secuencia que se demuestra a continuación que no se dirige a ningún ARNm se usó como un control. En lo sucesivo en el presente documento, el ARNsh de control se denomina "ARNsh de NS".In contrast, the shRNA that has the sequence shown below that is not directed to any mRNA was used as a control. Hereinafter, the control shRNA is referred to as "NS shRNA".

ARNsh de NS:NSs shRNA:

5’-UCUUAAUCGCGUAUAAGGCUAGUGCUCCUGGUUGGCCUUAUACGCGAUU AAGAUU-3’ (SEQ ID NO: II)5'-UCUUAAUCGCGUAUAAGGCUAGUGCUCCUGGUUGGCCUUAUACGCGAUU AAGAUU-3 '(SEQ ID NO: II)

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(Ensayo de MTT)(MTT test)

Este experimento se realizó en una escala de placa de 96 pocilios. La transfección se realizó usando Lipofectamina® RNAi MAX (en lo sucesivo el presente documento denominado "Lf RNAi MAX"), que es un liposoma catiónico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.This experiment was performed on a 96-well plate scale. The transfection was performed using Lipofectamina® RNAi MAX (hereinafter referred to as "Lf RNAi MAX"), which is a cationic liposome, according to the manufacturer's instructions.

El ARNsh (300 pmol of ARNsh de TS o ARNsh de NS) y 15 pl de Lf RNAi MAX se diluyeron por separado con OptiMEM para preparar soluciones (500 pl cada una), las soluciones resultantes se mezclaron entre sí, y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente de 10 a 20 minutos para formar un complejo (es decir, un lipoplejo). Una suspensión de células de mesotelioma pleural maligno humano (MSTO-211H) (2.000 células/100 pl) se añadió a los pocillos, 50 pl de lipoplejo se añadieron a esto 24 horas a partir de ese momento, y el volumen total final se ajustó a 150 pl (la concentración de ARNsh final en los portillos se ajustó a 5 nM o 10 nM). El medio se retiró 24 horas después del inicio de la transfección, y 200 pl de un medio recién preparado que contenía o no contenía un agente quimioterapéutico para el cáncer existente ("Alimta", pemetrexed sódico hidratado, PMX, Eli Lilly) a 0,01 pg/ml se añadió a esto. El medio se retiró 0, 24, 48, 72, y 96 horas después de la adición del medio recién preparado. A esto se le añadió una solución al 0,5 % de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (50 pl), y la incubación se realizó a continuación a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % durante 4 horas. Además, la solución de MTT al 0,5 % se añadió a pocillos sin células para obtener un fondo.The shRNA (300 pmol of TS shRNA or NS shRNA) and 15 pl of Lf RNAi MAX were separately diluted with OptiMEM to prepare solutions (500 pl each), the resulting solutions mixed together, and the mixture was left at rest at room temperature for 10 to 20 minutes to form a complex (i.e., a lipoplex). A suspension of human malignant pleural mesothelioma cells (MSTO-211H) (2,000 cells / 100 pl) was added to the wells, 50 pl of lipoplex were added thereto 24 hours thereafter, and the final total volume was adjusted to 150 pl (final concentration of shRNA in the ports was adjusted to 5 nM or 10 nM). The medium was removed 24 hours after the start of transfection, and 200 μl of a fresh medium containing or not containing an existing cancer chemotherapeutic agent ("Alimta", pemetrexed sodium hydrate, PMX, Eli Lilly) at 0, 01 pg / ml was added to this. The medium was removed 0, 24, 48, 72, and 96 hours after the addition of fresh medium. To this was added a 0.5% solution of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) (50 pl), and the incubation was then carried out at 37 ° C in the presence of 5% CO2 for 4 hours. In addition, the 0.5% MTT solution was added to wells without cells to obtain a background.

Después de la finalización de la incubación, se añadió isopropanol ácido (150 pl) a cada pocillo. Los cristales de Formazán se disolvieron usando un agitador. La absorbancia se determinó a una longitud de onda de 570 nm usando un lector de placas. A continuación la tasa de crecimiento celular se calculó usando la ecuación que se demuestra a continuación.After the completion of the incubation, acid isopropanol (150 pl) was added to each well. The Formazan crystals were dissolved using an agitator. The absorbance was determined at a wavelength of 570 nm using a plate reader. Then the cell growth rate was calculated using the equation shown below.

Tasa de crecimiento celular (%) = [A570 (X horas después de la adición de medio recién preparado)/A570 (0 horas después de la adición de medio recién preparado)] x 100Cell growth rate (%) = [A570 (X hours after the addition of fresh medium) / A570 (0 hours after the addition of fresh medium)] x 100

Los resultados se muestran en la Fig. 1.The results are shown in Fig. 1.

Como se muestra en la Fig. 1, el ARNsh de TS inhibió el crecimiento de las células MSTO-211H hasta un alcance significativo en presencia de PMX de una manera dependiente del tiempo.As shown in Fig. 1, TS shRNA inhibited the growth of MSTO-211H cells to a significant extent in the presence of PMX in a time-dependent manner.

[Ejemplo 2][Example 2]

Inhibición de la expresión de TS por ARNsh de TS (Transfección)Inhibition of TS expression by TSsh shRNA (Transfection)

La transfección se realizó usando Lipofectamina® RNAi MAX (en lo sucesivo en el presente documento denominada "Lf RNAi MAX"), que es un liposoma catiónico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.The transfection was performed using Lipofectamina® RNAi MAX (hereinafter referred to as "Lf RNAi MAX"), which is a cationic liposome, according to the manufacturer's instructions.

En el presente documento se usó el lipoplejo preparado en el Ejemplo 1.In the present document, the lipoplex prepared in Example 1 was used.

Una suspensión de células MSTO-211H (10 ml) se sembró en una placa de 10 cm (500.000 células/placa), y el cultivo se realizó durante 24 horas con antelación. Cada lipoplejo se añadió directamente a esto, con el fin de ajustar el volumen total final a 15 ml, seguido de transfección. La concentración final de ARNsh de TS o NS-ARNsi se ajustó a 5 o 10 nM. El control no se trató con ARNsh. Después del inicio de la transfección, el cultivo se realizó en un medio a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % durante 72 horas, y el estrato celular se preparó a continuación con el método que se describe a continuación.A suspension of MSTO-211H cells (10 ml) was seeded on a 10 cm plate (500,000 cells / plate), and the culture was performed for 24 hours in advance. Each lipoplex was added directly to this, in order to adjust the final total volume to 15 ml, followed by transfection. The final concentration of TSsh or NS-siRNA was adjusted to 5 or 10 nM. The control was not treated with shRNA. After the start of transfection, the culture was performed in a medium at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 for 72 hours, and the cell stratum was then prepared with the method described below.

(Preparación del extracto celular)(Preparation of cellular extract)

Setenta y dos horas después del inicio de la transfección, el medio se retiró, seguido de lavado con PBS(-) frío. A partir de ese momento, las células se desprendieron de la placa usando una solución de tripsina, y el sobrenadante se retiró por centrifugación. Además, se realizó lavado con PBS(-) frío, y a esto se le añadieron de 100 a 50 pl de tampón de lisis frío (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NP-40 al 1 %, desoxicolato sódico al 0,25 %, NaCl 150 mM, y Cóctel Inhibidor de Proteasa (Sigma-Aldrich, MO, U.S.A.)). A continuación la incubación se realizó sobre hielo (4 °C durante 1 hora) para lisis celular. Posteriormente, se realizó centrifugación (15.000 x g, 15 minutos, 4 °C), y el sobrenadante obtenido se usó como un extracto celular.Seventy-two hours after the start of transfection, the medium was removed, followed by washing with cold PBS (-). Thereafter, the cells were detached from the plate using a trypsin solution, and the supernatant was removed by centrifugation. In addition, washing with cold PBS (-) was performed, and to this was added 100 to 50 μl of cold lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% NP-40, sodium deoxycholate 0.25%, 150 mM NaCl, and Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, MO, USA)). The incubation was then carried out on ice (4 ° C for 1 hour) for cell lysis. Subsequently, centrifugation was performed (15,000 x g, 15 minutes, 4 ° C), and the obtained supernatant was used as a cell extract.

(Preparación de muestra de SDS-PAGE)(Sample preparation of SDS-PAGE)

El extracto celular mencionado anteriormente se mezcló con la cantidad equivalente de un tampón de muestra 2x, producto resultante se calentó usando una placa caliente para microtubos a 95 °C durante 3 minutos.The cell extract mentioned above was mixed with the equivalent amount of a 2x sample buffer, the resulting product was heated using a hot plate for microtubes at 95 ° C for 3 minutes.

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Posteriormente, la centrifugación se realizó durante 30 segundos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente. Por lo tanto, se obtuvo una muestra de SDS-PAGE.Subsequently, the centrifugation was performed for 30 seconds, followed by cooling to room temperature. Therefore, a sample of SDS-PAGE was obtained.

(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)

La muestra (6 gl que corresponde a 9 gg de proteína/calle) se aplicó a gel de poliacrilamida al 12 %, el gel se conectó a una fuente de energía (Bio-Rad laboratories), y la electroforesis se realizó durante aproximadamente 80 minutos a una corriente constante de 40 mA para dos láminas de gel (20 mA para una sola lámina de gel).The sample (6 gl corresponding to 9 gg of protein / lane) was applied to 12% polyacrylamide gel, the gel was connected to an energy source (Bio-Rad laboratories), and electrophoresis was performed for approximately 80 minutes at a constant current of 40 mA for two gel sheets (20 mA for a single gel sheet).

(Transferencia puntal de Western)(Western strut transfer)

Para tratamiento previo el filtro de papel y Hybond-ECL cortados en trozos de tamaños adecuados se sumergieron en tampón de transferencia puntual. Después de SDS-PAGE, un aparato de transferencia se usó para transferir una proteína a Hybond-ECL. El Hybond-ECL resultante se sometió a bloqueo (en leche desnatada al 5 %) a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavó 3 veces durante 5 minutos cada uno con tampón Tween.For pretreatment the paper filter and Hybond-ECL cut into pieces of suitable sizes were immersed in spot transfer buffer. After SDS-PAGE, a transfer apparatus was used to transfer a protein to Hybond-ECL. The resulting Hybond-ECL was blocked (in 5% skim milk) at room temperature for 1 hour and washed 3 times for 5 minutes each with Tween buffer.

Para detección de TS y p-actina, se permitió que los anticuerpos primarios cada uno diluido con tampón Tween (es decir, un anticuerpo de TS anti-humano monoclonal de ratón (1:1000) (ANASPEC, Inc., CA, U.S.A.) y un anticuerpo de p-actina anti-humano monoclonal de ratón (1:500) (Abcam, Tokio, Japón)) reaccionaran cada uno a 4 °C durante una noche. Después de lavar con tampón Tween 3 veces durante 5 minutos cada uno, se permitió que una solución de anticuerpo secundario (un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con HRP (1:2000) (ICN Biomedical, CA, U.S.A.)) diluida con tampón Tween reaccionara a temperatura ambiente durante 1 hora. El lavado con tampón Tween 3 veces durante 5 minutos cada uno fue seguido de una reacción con un reactivo de quimioluminiscencia ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) durante aproximadamente 1 minuto. La banda de proteína diana se visualizó usando el LAS-4000 EPUVmini (FujiFilm), se fotografío y a continuación se cuantificó con el uso del software (Multi Gauge v.3.2, FujiFilm, Tokio, Japón).For detection of TS and p-actin, the primary antibodies were each allowed to be diluted with Tween buffer (i.e., a mouse monoclonal anti-human TS antibody (1: 1000) (ANASPEC, Inc., CA, USA) and a mouse monoclonal anti-human p-actin antibody (1: 500) (Abcam, Tokyo, Japan)) will each react at 4 ° C overnight. After washing with Tween buffer 3 times for 5 minutes each, a secondary antibody solution (a goat anti-mouse secondary antibody conjugated to HRP (1: 2000) (ICN Biomedical, CA, USA)) diluted with Tween buffer will react at room temperature for 1 hour. Washing with Tween buffer 3 times for 5 minutes each was followed by a reaction with an ECL chemiluminescent reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) for about 1 minute. The target protein band was visualized using the LAS-4000 EPUVmini (FujiFilm), photographed and then quantified with the use of software (Multi Gauge v.3.2, FujiFilm, Tokyo, Japan).

Los resultados se muestran en la Fig. 2.The results are shown in Fig. 2.

Como se muestra en la Fig. 2, se encontró que el lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa preparado en el Ejemplo 1 inhibía la expresión de TS en las células MSTO-211H de una manera específica de la secuencia independiente de la concentración hasta un alcance significativo.As shown in Fig. 2, it was found that the lipoplex having TSsh shRNA bound to its outer membrane surface prepared in Example 1 inhibited the expression of TS in the MSTO-211H cells in a manner specific to the independent sequence. of concentration to a significant extent.

[Ejemplo 3][Example 3]

Inhibición de expresión de luciferasa con Luciferasa-ARNsh in vitro (Preparación de línea celular que expresa luciferasa)Inhibition of luciferase expression with Luciferase-siRNA in vitro (Preparation of cell line expressing luciferase)

El plásmido de expresión en el que se había introducido el gen de luciferasa ha obtenido a partir de luciérnaga (pGL3-control, Promega) y el plásmido de expresión en el que se había introducido al agente luciferasa obtenido a partir de Renilla reniformis (pRL-TK, Promega) se sometieron a transfección usando Lipofectamina® 2000 (Lf 2000), que es un liposoma catiónico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.The expression plasmid in which the luciferase gene had been introduced was obtained from the firefly (pGL3-control, Promega) and the expression plasmid in which the luciferase agent obtained from Renilla reniformis (pRL-) was introduced. TK, Promega) were transfected using Lipofectamina® 2000 (Lf 2000), which is a cationic liposome, according to the manufacturer's instructions.

Una suspensión de células HT-1080 se sembró en una placa de cultivo celular de 12 pocillos a 100.000 células/pocillo (1 ml), y el cultivo se realizó durante 12 horas con antelación. Después de retirar el sobrenadante del cultivo y realizar el lavado con PBS se realizó una de, a cada pocillo se añadió una solución de transfección (200 gl) que contenía ambos las nidos de expresión para la luciferasa, y los plásmidos que expresan luciferasa se sometieron a transfección. La concentración final de cada plásmido se ajustó a 1 gg/200 gl. Después del inicio de la transfección, el cultivo se realizó a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %.A suspension of HT-1080 cells was seeded in a 12-well cell culture plate at 100,000 cells / well (1 ml), and the culture was performed for 12 hours in advance. After removing the supernatant from the culture and performing the washing with PBS, one of was made, a transfection solution (200 gl) containing both the expression nests for the luciferase was added to each well, and the plasmids expressing luciferase were subjected to to transfection. The final concentration of each plasmid was adjusted to 1 gg / 200 gl. After the start of transfection, the culture was carried out at 37 ° C in the presence of 5% CO2.

(Preparación de liposoma catiónico)(Preparation of cationic liposome)

Los liposomas catiónicos se prepararon con el método que se describe a continuación.The cationic liposomes were prepared by the method described below.

Los lípidos que constituyen el liposomas se seleccionaron entre los siguientes lípidos:The lipids constituting the liposomes were selected from the following lipids:

DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina); POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina); DOPE (1,2-dioleoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina); y DC-6-14 (cloruro de O,O'-ditetradecanoil-N-(a-trimetil-amonioacetil)dietanolamina). Estos lípidos se disolvieron en cloroformo con antelación para preparar soluciones de reserva.DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine); and DC-6-14 (O chloride, O'-ditetradecanoyl-N- (a-trimethyl-ammonioacetyl) diethanolamine). These lipids were dissolved in chloroform in advance to prepare reserve solutions.

Una muestra se recogió de cada solución de reserva mediante medición precisa con el uso de una jeringa de vidrio con el fin de conseguir la siguiente composición de lípido: DOPE:X:DC-6-14 = 3:2:5 (proporción molar; en la que X representa DOPC o POPC). Las muestras se introdujeron en un tubo de ensayo con tapón y se mezclaron en el mismo (la cantidad de lípido total: 200 mmol). Posteriormente, el cloroformo se retiró del mismo a presión reducida usando un evaporador rotatorio (IWAKI, Tokio), y el tubo de ensayo se puso en una bomba de vacío durante unaA sample was collected from each reserve solution by precise measurement with the use of a glass syringe in order to achieve the following lipid composition: DOPE: X: DC-6-14 = 3: 2: 5 (molar ratio; where X represents DOPC or POPC). The samples were placed in a stoppered test tube and mixed therein (the amount of total lipid: 200 mmol). Subsequently, the chloroform was removed therefrom under reduced pressure using a rotary evaporator (IWAKI, Tokyo), and the test tube was placed in a vacuum pump during a

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noche, con el fin de retirar completamente el cloroformo. Por lo tanto, una película fina de lípido se formó en el tubo de ensayo. 2 ml de solución de sacarosa al 9 % (30 ml, pH 7.4) se añadieron como una fase acuosa interna a la película fina de lípido, seguido de agitación vigorosa a 37 °C. Por lo tanto, la película fina de lípido se hidroliza completamente con el fin que se de que se formaran las MLV (vesículas multilamelares) (concentración de lípido final: 100 mM). La solución obtenida se calentó a 37 °C, durante lo cual las LUV (vesículas unilamelares grandes) que tenían tamaños de partícula de aproximadamente 100 nm se prepararon usando membranas de policarbonato de 200, 100, y 50 nm (Nucleopore, CA, U.S.A.) con un método de extrusión.night, in order to completely remove the chloroform. Therefore, a thin film of lipid was formed in the test tube. 2 ml of 9% sucrose solution (30 ml, pH 7.4) were added as an internal aqueous phase to the thin lipid film, followed by vigorous stirring at 37 ° C. Therefore, the thin lipid film is completely hydrolyzed in order to form the MLV (multilamellar vesicles) (final lipid concentration: 100 mM). The solution obtained was heated to 37 ° C, during which the LUV (large unilamellar vesicles) having particle sizes of approximately 100 nm were prepared using polycarbonate membranes of 200, 100, and 50 nm (Nucleopore, CA, USA) with an extrusion method.

(ARNsh que se dirige a Luciferasa (Luc))(ARNsh that goes to Luciferasa (Luc))

El ARNsh que se dirige a Luc (en lo sucesivo en el presente documento denominado "ARNsh de Luc") tiene la secuencia que se muestra a continuación.The shRNA that targets Luc (hereinafter referred to as "Luc shRNA") has the sequence shown below.

ARNsh de Luc:Luc's shRNA:

5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAUAGUGCUCCUGGUUGUCGAAGUACUCAGCG UAAGUU-3’ (SEQ ID NO: 12)5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAUAGUGCUCCUGGUUGUCGAAGUACUCAGCG UAAGUU-3 '(SEQ ID NO: 12)

(Preparación de lipoplejo)(Preparation of lipoplejo)

Los lipoplejos se prepararon mezclando los liposomas catiónicos con los ARNsh a una tasa del liposoma catiónico con respecto a ARNsh de 800, 400, o 200:1 (proporción molar) y agitando vigorosamente la mezcla durante 10 minutos. Tanto si el ARNsh se había adsorbido completamente o no los liposomas catiónicos se inspeccionó confirmando la ausencia de ARNsh libre a través de electroforesis sobre gel de agarosa al 2 %.Lipoplexes were prepared by mixing the cationic liposomes with the shRNAs at a cationic liposome rate relative to 800, 400, or 200: 1 shRNA (molar ratio) and vigorously shaking the mixture for 10 minutes. Whether or not the siRNA had completely adsorbed the cationic liposomes was inspected by confirming the absence of free shRNA through electrophoresis on a 2% agarose gel.

(Inhibición de expresión de luciferasa in vitro)(Inhibition of luciferase expression in vitro)

Cada lipoplejo se añadió a las células que expresan luciferasa para dar como resultado la concentración final de ARNsh de 50 nM, y el cultivo se realizó en un medio a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % durante 48 horas. Después de finalizar el cultivo, los extractos celulares se prepararon y la actividad grasa se sometió al ensayo usando el Sistema de Ensayo de Indicador de Luciferasa Doble (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la finalización del cultivo, de forma específica, se realizó la retirada del medio, lavando con PBS(-) frío, se añadió tampón de lisis pasiva a 150 pl/pocillo, y la incubación se realizó a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación con el uso de un agitador rotatorio para lisis celular. A continuación el producto resultante se transfirió a tubos de muestra, se enfrió a -80 °C durante 30 minutos, y a continuación se volvió a llevar a temperatura ambiente. El producto se centrifugó a 4 °C y 9.000x g durante 30 segundos, y el sobrenadante resultante se usó como un extracto celular. Posteriormente, 10 pl cada extracto celular se añadieron a la microplaca de color blanco de 96 pocillos que comprendía 50 pl cada uno de la solución de Reactivo II de Ensayo de Luciferasa fraccionada, y las células se mezclaron usando una pipeta. La microplaca se montó en el luminómetro (Infinite M200 Pro, Tecan), y la quimioluminiscencia causada por la actividad de luciferasa de luciérnaga se evaluó durante 10 segundos. A partir de ese momento, la placa se retiró, la solución de Reactivo Stop&Glo se añadió a la placa a 50 pl/pocillo, y se mezcló a través de agitación vorticial suave. Inmediatamente a partir de ese momento, la quimioluminiscencia causada por la actividad de luciferasa de Renilla reniformis se sometió a ensayo usando un luminómetro de la misma manera. En el análisis de los datos, el nivel de actividad de luciferasa de Renilla reniformis se estandarizó como la muestra de control interno, y se determinó la actividad de luciferasa de luciérnaga con respecto al grupo de control que no se sometió a ARNsh.Each lipoplex was added to the luciferase expressing cells to result in the final concentration of 50 nM shRNA, and the culture was performed in a medium at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 for 48 hours. After termination of the culture, the cell extracts were prepared and the fat activity was assayed using the Double Luciferase Indicator Assay System (Promega) according to the manufacturer's instructions. After the end of the culture, specifically, the medium was removed, washing with cold PBS (-), passive lysis buffer was added at 150 μL / well, and the incubation was performed at room temperature for 15 minutes with agitation with the use of a rotary shaker for cell lysis. The resulting product was then transferred to sample tubes, cooled to -80 ° C for 30 minutes, and then brought back to room temperature. The product was centrifuged at 4 ° C and 9,000 x g for 30 seconds, and the resulting supernatant was used as a cell extract. Subsequently, 10 μl each cell extract was added to the 96-well white color chip comprising 50 μl each of the fractionated Luciferase Assay II Reagent solution, and the cells were mixed using a pipette. The microplate was mounted on the luminometer (Infinite M200 Pro, Tecan), and the chemiluminescence caused by the firefly luciferase activity was evaluated for 10 seconds. Thereafter, the plate was removed, the Stop & Glo Reagent solution was added to the plate at 50 pl / well, and mixed by gentle vortexing. Immediately thereafter, the chemiluminescence caused by Renilla reniformis luciferase activity was tested using a luminometer in the same manner. In the analysis of the data, Renilla reniformis luciferase activity level was standardized as the internal control sample, and the firefly luciferase activity was determined with respect to the control group that did not undergo siRNA.

Los resultados se muestran en la Fig. 3. Los resultados que se muestran en la Fig. 3 son con respecto a la actividad de luciferasa del control designado como un 100 %.The results are shown in Fig. 3. The results shown in Fig. 3 are with respect to the luciferase activity of the control designated as 100%.

Como se muestra en la Fig. 3, se observó una reducción de la actividad de luciferasa con el uso de lipoplejo que comprendía DOPC o POPC en comparación con el grupo de control que no se sometió a tratamiento con ARNsh de Luc. Esto indica que el lipoplejo que comprende ARNsh de Luc unido a su superficie de membrana externa es capaz de inhibir la expresión de luciferasa en células HT-1080. En comparación con el lipoplejo que comprende POPC, además, se encontró que el lipoplejo que comprende DOPC presentaba efectos de inhibición de la expresión por ARNsh de Luc más elevados. Cuando la proporción molar de ARNsh de Luc con respecto al liposoma catiónico es 1:800, además, se encontró que los efectos de inhibición de expresión por ARNsh de Luc eran elevados.As shown in Fig. 3, a reduction in luciferase activity was observed with the use of lipoplex comprising DOPC or POPC compared to the control group that was not subjected to treatment with Luc shRNA. This indicates that the lipoplex comprising Luc sshRNA bound to its outer membrane surface is capable of inhibiting the expression of luciferase in HT-1080 cells. In comparison with the lipoplex comprising POPC, in addition, it was found that the lipoplex comprising DOPC had higher inhibition effects of expression by lsh shRNA. When the molar ratio of Luc shRNA to the cationic liposome is 1: 800, further, the effects of inhibition of expression by Luc shRNA were found to be high.

[Ejemplo 4][Example 4]

Establecimiento de modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural malignoEstablishment of mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant

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Bajo anestesia con 2,2,2-tribromoetanol (Avertin; Sigma-Aldrich), se implantaron 100 pl de una suspensión de células MSTO-211H (células MSTO-211H-Luc) que expresan luciferasa de forma estable en la cavidad pleural izquierda de un ratón atímico (macho de 5 semanas de edad). Bajo anestesia con isoflurano, se administraron 100 pl de una sal potásica de D-luciferina (Wako Pure Chemical) (7,5 mg/ml) por vía intraperitoneal, 3, 7, 14, y 21 días después del implante de las células, y los niveles de bioluminescencia dependiendo de la actividad de las células MSTO-211H-Luc que se habían cultivado en la cavidad torácica se evaluaron usando IVIS (Xenogen, Alameda, CA, U.S.A.).Under anesthesia with 2,2,2-tribromoethanol (Avertin, Sigma-Aldrich), 100 μl of a suspension of MSTO-211H cells (MSTO-211H-Luc cells) expressing luciferase stably in the left pleural cavity was implanted. an athymic mouse (5-week-old male). Under anesthesia with isoflurane, 100 μl of a potassium salt of D-luciferin (Wako Pure Chemical) (7.5 mg / ml) was administered intraperitoneally, 3, 7, 14, and 21 days after the implantation of the cells, and the bioluminescence levels depending on the activity of the MSTO-211H-Luc cells that had been cultured in the thoracic cavity were evaluated using IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA).

Los resultados se muestran en la Fig. 4.The results are shown in Fig. 4.

Como se muestra en la Fig. 4, una bioluminescencia insignificante se observó después del crecimiento de las células MSTO-211H-Luc, 3 días después del implante, y a continuación la bioluminescencia se aumentó con el transcurso del tiempo. Esto indica que las células MSTO-211H-Luc implantadas se cultivaron de forma suficiente en la cavidad torácica. Por lo tanto, se establecieron los modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno.As shown in Fig. 4, an insignificant bioluminescence was observed after the growth of the MSTO-211H-Luc cells, 3 days after implantation, and then the bioluminescence was increased over time. This indicates that implanted MSTO-211H-Luc cells were cultured sufficiently in the thoracic cavity. Therefore, mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant were established.

[Ejemplo 5][Example 5]

Selección de liposoma catiónico que presenta efecto suficiente de introducción de ARNsh in vivo (Preparación de liposoma catiónico)Selection of cationic liposome that has sufficient effect of introduction of shRNA in vivo (Preparation of cationic liposome)

Los lípidos que constituyen el liposoma se seleccionaron entre los siguientes lípidos: DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero- 3-fosfocolina); POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina); DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosforilcolina); DEPC (1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina); DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina); y DC-6-14 (cloruro de O,O'-ditetradecanoil-N-(a-trimetil-amonioacetil)dietanolamina). Estos lípidos se disolvieron en cloroformo con antelación para preparar soluciones de reserva.The lipids constituting the liposome were selected from the following lipids: DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine); DEPC (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine); and DC-6-14 (O chloride, O'-ditetradecanoyl-N- (a-trimethyl-ammonioacetyl) diethanolamine). These lipids were dissolved in chloroform in advance to prepare reserve solutions.

Una muestra se recogió de cada solución de reserva mediante medición precisa con el uso de una jeringa de vidrio con el fin de conseguir la siguiente composición de lípido: DOPE:X:DC-6-14 = 3:2:5 (proporción molar), y los liposomas catiónicos se prepararon de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3. Los tamaños de partícula (el método de dispersión dinámica de luz) y los potenciales zeta (el método de dispersión de luz por electroforesis) de los liposomas se determinaron usando un NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). Las cargas superficiales de los liposomas eran aproximadamente + 50 mV.A sample was collected from each reserve solution by precise measurement with the use of a glass syringe in order to achieve the following lipid composition: DOPE: X: DC-6-14 = 3: 2: 5 (molar ratio) , and the cationic liposomes were prepared according to the method described in Example 3. The particle sizes (the dynamic light scattering method) and the zeta potentials (the light scattering method by electrophoresis) of the Liposomes were determined using a NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA). The surface charges of the liposomes were approximately + 50 mV.

(ARNsh de dirección a Luciferasa (Luc))(ShRNA to Luciferase (Luc))

Se usó el ARNsh de Luc que se ha descrito en el Ejemplo 3.The Luc shRNA was used as described in Example 3.

(Preparación de lipoplejo)(Preparation of lipoplejo)

Los lipoplejos se prepararon mezclando los liposomas catiónicos con los ARNsh a una proporción de 2000:1 (proporción molar) y agitando la mezcla vigorosamente durante 10 minutos. Tanto si los ARNsh se habían adsorbido completamente o no los liposomas catiónicos se inspeccionó confirmando la ausencia de ARNsh libre a través de electroforesis sobre gel de agarosa al 2 %.The lipoplexes were prepared by mixing the cationic liposomes with the shRNAs at a ratio of 2000: 1 (molar ratio) and stirring the mixture vigorously for 10 minutes. Whether or not the shRNAs had been fully adsorbed to the cationic liposomes was inspected by confirming the absence of free shRNA through electrophoresis on a 2% agarose gel.

El tamaño de partícula promedio y el potencial zeta de los liposomas preparados era aproximadamente 350 nm y aproximadamente + 15 mV, respectivamente.The average particle size and zeta potential of the prepared liposomes was approximately 350 nm and approximately + 15 mV, respectively.

(Inhibición de expresión de luciferasa usando modelos de ratón de implante ortotópico in vivo)(Inhibition of luciferase expression using mouse models of orthotopic implant in vivo)

Con anestesia de 2,2,2-tribromoetanol (Avertin; Sigma-Aldrich), 100 pl una suspensión de células MSTO-211H (células MSTO-211H-Luc) expresaban de forma estable luciferasa se implantaron en la cavidad pleural izquierda de un ratón atímico (macho de 5 semanas de edad). El lipoplejo se administró directamente en la cavidad torácica 10, 13, 16, y 19 días después del implante celular, de modo que pudieran administrar 20 pg (50 pl) de ARNsh. Bajo anestesia con isoflurano, se administraron 100 pl de una sal potásica de D-luciferina (7,5 mg/ml) por vía intraperitoneal,2 días después de la administración final del lipoplejo, y los niveles de bioluminescencia dependiendo de la actividad de las células MSTO-211H-Luc que se habían cultivado en la cavidad torácica se evaluaron usando IVIS (Xenogen, Alameda, CA, U.S.A.).With 2,2,2-tribromoethanol anesthesia (Avertin; Sigma-Aldrich), 100 μl a suspension of MSTO-211H cells (MSTO-211H-Luc cells) stably expressing luciferase were implanted in the left pleural cavity of a mouse athymic (male of 5 weeks of age). The lipoplex was administered directly in the thoracic cavity 10, 13, 16, and 19 days after cell implantation, so that they could administer 20 pg (50 pl) of shRNA. Under anesthesia with isoflurane, 100 μl of a potassium salt of D-luciferin (7.5 mg / ml) was administered intraperitoneally, 2 days after the final administration of the lipoplex, and bioluminescence levels depending on the activity of the MSTO-211H-Luc cells that had been cultured in the thoracic cavity were evaluated using IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA).

Al control se le administró una solución de sacarosa al 9 %.The control was given a 9% sucrose solution.

Los resultados se muestran en la Fig. 5-1 y en la Fig. 5-2.The results are shown in Fig. 5-1 and in Fig. 5-2.

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Como se muestra en la Fig. 5-1 y en la Fig. 5-2, se encontró que el grado de inhibición de expresión de luciferasa podría estar influido por la composición de lípido del liposoma catiónico usado y el del lipoplejo preparado con el uso del liposoma catiónico con la composición de lípido de DOPE/DOPC/DC-6-14 (3:2:5) podría inhibir la expresión de luciferasa en las células MSTO-211 H-Luc que se habían implantado en la cavidad torácica, en la mayor medida.As shown in Fig. 5-1 and Fig. 5-2, it was found that the degree of inhibition of luciferase expression could be influenced by the lipid composition of the cationic liposome used and that of the lipoplex prepared with the use of the cationic liposome with the lipid composition of DOPE / DOPC / DC-6-14 (3: 2: 5) could inhibit the expression of luciferase in the MSTO-211 H-Luc cells that had been implanted in the thoracic cavity, in the biggest measure.

[Ejemplo 6][Example 6]

Influencia del lípido con carga positiva (contenido de DC-6-14) después de introducción de ARNsh in vivo (Preparación de liposoma catiónico)Influence of lipid with positive charge (content of DC-6-14) after introduction of shRNA in vivo (Preparation of cationic liposome)

Los liposomas se prepararon de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3; sin embargo, la composición de lípido de los liposomas se ajustó a DOPE:POPC:DC-6-14 de 3:2 + X:5-X (proporción molar, en la que X es 0, 1,5, o 3,0). Los tamaños de partícula y las cargas superficiales de los liposomas se determinaron usando un NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). Se confirmó que todas las LUV (vesículas unilamelares grandes) tenían tamaños de particular de aproximadamente 100 nm. Se encontró que la carga superficial de un liposoma que contenía DC-6-14 a un 20 % era aproximadamente + 25 mV, se encontró que la del liposoma que contenía DC-6-14 a un 35 % era aproximadamente + 35 mV, y se encontró que la del liposoma que contenía DC-6- 14 a un 50 % era aproximadamente + 50 mV.The liposomes were prepared according to the method described in Example 3; however, the lipid composition of the liposomes was adjusted to DOPE: POPC: DC-6-14 of 3: 2 + X: 5-X (molar ratio, where X is 0, 1.5, or 3, 0). The particle sizes and surface charges of the liposomes were determined using a NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). It was confirmed that all the LUVs (large unilamellar vesicles) had particular sizes of approximately 100 nm. It was found that the surface charge of a liposome containing DC-6-14 at 20% was approximately + 25 mV, that of the liposome containing DC-6-14 at 35% was found to be approximately + 35 mV, and it was found that that of the liposome containing DC-6-14 at 50% was approximately + 50 mV.

(Preparación de lipoplejo)(Preparation of lipoplejo)

Los lipoplejos se prepararon mezclando los ARNsh de Luc que se han descrito en el Ejemplo 3 con liposomas con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3. Los tamaños de partícula (el método de dispersión dinámica de luz) y los potenciales zeta (el método de dispersión de luz por electroforesis) de los liposomas se determinaron usando un NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo que contenía DC-6-14 a un 20 % eran aproximadamente 350 nm y aproximadamente + 25 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo que contenía DC-6-14 a un 35 % eran aproximadamente 350 nm y aproximadamente + 30 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo que contenía DC-6-14 a un 50 % eran aproximadamente 350 nm y aproximadamente + 35 mV, respectivamente.The lipoplexes were prepared by mixing the Luc sshRNAs that have been described in Example 3 with liposomes with the method described in Example 3. The particle sizes (the dynamic light scattering method) and the zeta potentials (the light scattering method by electrophoresis) of the liposomes were determined using a NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA). The particle size and surface charge of the lipoplex containing DC-6-14 at 20% were approximately 350 nm and approximately + 25 mV, respectively. The particle size and surface charge of the lipoplex containing DC-6-14 at 35% were approximately 350 nm and approximately + 30 mV, respectively. The particle size and surface charge of the lipoplex containing DC-6-14 at 50% were approximately 350 nm and approximately + 35 mV, respectively.

De acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 5, se evaluaron los efectos de los lipoplejos preparados para inhibir la expresión genética in vivo (la eficacia para introducción de ARNsh en células).In accordance with the method described in Example 5, the effects of lipoplexes prepared to inhibit gene expression in vivo (efficacy for introduction of shRNA into cells) were evaluated.

Los resultados se muestran en la Fig. 6-1 y en la Fig. 6-2.The results are shown in Fig. 6-1 and in Fig. 6-2.

Como se muestra en la Fig. 6-1 y en la Fig. 6-2, se encontró que los efectos inhibitorios del lipoplejo en la expresión de luciferasa se podrían potenciar in vivo ya que la cantidad de lípido con carga positiva (DC-6-14) aumentó en el liposoma. Un aumento de la carga superficial es ventajoso cuando se forma un complejo de un liposoma con un ARNsh con carga negativa. Además, las interacciones con células tumorales con carga negativa se podrían facilitar debido a un aumento de la carga superficial. Como resultado, en las células se puede introducir una gran cantidad de ARNsh de forma eficaz.As shown in Fig. 6-1 and Fig. 6-2, it was found that the inhibitory effects of lipoplex on luciferase expression could be enhanced in vivo as the amount of positively charged lipid (DC-6) -14) increased in the liposome. An increase in surface charge is advantageous when a complex of a liposome is formed with a negatively charged shRNA. In addition, interactions with tumor cells with negative charge could be facilitated due to an increase in surface charge. As a result, a large amount of shRNA can be introduced efficiently into the cells.

[Ejemplo 7][Example 7]

Influencia de la modificación de PEG en la introducción de ARNsh in vivo (Preparación de liposoma catiónico modificado con PEG)Influence of PEG modification on the introduction of shRNA in vivo (Preparation of PEG-modified cationic liposome)

Los liposomas se prepararon de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3.The liposomes were prepared according to the method described in Example 3.

Los lípidos que constituyen liposomas se seleccionaron entre los siguientes lípidos: DOPC, POPC, DOPE, DC-6-14, y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (mPEG2000-DSPE). La composición del lípido del liposoma modificado con PEG se ajustó a DOPE:X:DC-6-14:mPEG-DSPE=3:2:5:0,1 (proporción molar, en la que X representa DOPC o POPC), la composición del lípido del liposoma no modificado con PEG se ajustó a DOPE:X:DC-6-14 de 3:2:5 (proporción molar, en la que X representa DOPC o POPC), y a continuación se prepararon las LUV (vesículas unilamelar grandes). Los tamaños de partícula de los liposomas se determinaron usando NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). El tamaño de partícula y la carga superficial del liposoma que contenía DOPC (el liposoma no modificado con PEG) eran aproximadamente 100 nm y aproximadamente + 50 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del liposoma que contenía POPC (el liposoma no modificado con PEG) eran aproximadamente 110 nm y aproximadamente + 50 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del liposoma modificado con PEG que contenía DOPC (el liposoma modificado con PEG) eran aproximadamente 106 nm y aproximadamente + 50 mV, respectivamente. El tamaño deThe lipids constituting liposomes were selected from the following lipids: DOPC, POPC, DOPE, DC-6-14, and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] ( mPEG2000-DSPE). The composition of the lipid of the PEG-modified liposome was adjusted to DOPE: X: DC-6-14: mPEG-DSPE = 3: 2: 5: 0.1 (molar ratio, in which X represents DOPC or POPC), Lipid composition of the unmodified liposome with PEG was adjusted to DOPE: X: DC-6-14 of 3: 2: 5 (molar ratio, in which X represents DOPC or POPC), and then LUV (unilamellar vesicles) were prepared big). The particle sizes of the liposomes were determined using NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). The particle size and surface charge of the liposome containing DOPC (the liposome not modified with PEG) were approximately 100 nm and approximately + 50 mV, respectively. The particle size and surface charge of the liposome containing POPC (the liposome not modified with PEG) were approximately 110 nm and approximately + 50 mV, respectively. The particle size and surface charge of the PEG-modified liposome containing DOPC (the PEG-modified liposome) were approximately 106 nm and approximately + 50 mV, respectively. The size of

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partícula y la carga superficial del liposoma modificado con PEG que contenía POPC (el liposoma modificado con PEG) eran aproximadamente 100 nm y aproximadamente + 50 mV, respectivamente.The particle and surface charge of the PEG-modified liposome containing POPC (the PEG-modified liposome) were approximately 100 nm and approximately + 50 mV, respectively.

(Preparación de lipoplejo)(Preparation of lipoplejo)

Los lipoplejos se prepararon mezclando los ARNsh de Luc que se han descrito en el Ejemplo 3 con los liposomas modificados con PEG o liposomas no modificados con PEG con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3. Los tamaños de partícula (el método de dispersión dinámica de luz) y los potenciales zeta (el método de dispersión de luz por electroforesis) de los lipoplejos se determinaron usando un NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo que contenía DOPC eran aproximadamente 350 nm y aproximadamente + 30 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo que contenía POPC eran aproximadamente 360 nm y aproximadamente + 30 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo modificado con PEG que contenía DOPC eran aproximadamente 370 nm y aproximadamente + 30 mV, respectivamente. El tamaño de partícula y la carga superficial del lipoplejo modificado con PEG que contenía POPC eran aproximadamente 370 nm y aproximadamente + 30 mV, respectivamente.The lipoplexes were prepared by mixing the Luc sshRNAs that have been described in Example 3 with the PEG-modified liposomes or non-PEG-modified liposomes with the method described in Example 3. The particle sizes (the dispersion method light dynamics) and the zeta potentials (the light scattering method by electrophoresis) of the lipoplexes were determined using a NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA). The particle size and surface charge of the lipoplex containing DOPC were approximately 350 nm and approximately + 30 mV, respectively. The particle size and surface charge of the lipoplex containing POPC were approximately 360 nm and approximately + 30 mV, respectively. The particle size and surface charge of the PEG-modified lipoplex containing DOPC were approximately 370 nm and approximately + 30 mV, respectively. The particle size and surface charge of the PEG-modified lipoplex containing POPC were approximately 370 nm and approximately + 30 mV, respectively.

De acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 5, se evaluaron los efectos del lipoplejo modificado con PEG preparado o lipoplejo no modificado con PEG para inhibir la expresión genética in vivo (la eficacia para introducción de ARNsh en células).In accordance with the method described in Example 5, the effects of the modified lipoplex with PEG prepared or unmodified lipoplex with PEG were evaluated to inhibit gene expression in vivo (the efficiency for introduction of shRNA into cells).

Los resultados se muestran en la Fig. 7-1 y en la Fig. 7-2.The results are shown in Fig. 7-1 and in Fig. 7-2.

Como se muestra en la Fig. 7-1 y en la Fig. 7-2, se encontró que los efectos inhibitorios del lipoplejo en la expresión de luciferasa se podrían inhibir a través de modificación con PEG, independientemente de la composición del lípido del liposoma catiónico usado. Aunque la PEGilación era necesaria en el caso de administración intravenosa, se encontró que la modificación con PEG podría deteriorar la eficacia para introducción de ARNsh en células en el caso de administración intratorácica.As shown in Fig. 7-1 and Fig. 7-2, it was found that the inhibitory effects of lipoplex on luciferase expression could be inhibited through modification with PEG, regardless of the lipid composition of the liposome. cationic used. Although PEGylation was necessary in the case of intravenous administration, it was found that modification with PEG could impair the efficacy for introduction of shRNA into cells in the case of intrathoracic administration.

[Ejemplo 8][Example 8]

Efectos de inhibición del crecimiento tumoral a través de administración intratorácica de lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa en modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural malignoEffects of inhibition of tumor growth through intrathoracic administration of lipoplex having TSsh shRNA bound to its outer membrane surface in mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant

(Establecimiento de modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno)(Establishment of mouse models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant)

Los modelos de ratón de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno usando las células MSTO-211H-Luc se prepararon con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3, y los ratones en los que las células se habían implantado se fijaron lo suficiente 7 días después del implante se sometieron a experimento in vivo.Mouse models of malignant pleural mesothelioma orthotopic implant using the MSTO-211H-Luc cells were prepared with the method described in Example 3, and the mice in which the cells were implanted were fixed enough 7 days after the implant they underwent an in vivo experiment.

(Preparación de liposoma catiónico)(Preparation of cationic liposome)

Los liposomas se prepararon de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3; sin embargo, la composición del lípido de los liposomas se ajustó a DOPE:POPC:DC-6-14 de 3:2:5.The liposomes were prepared according to the method described in Example 3; however, the lipid composition of the liposomes was adjusted to DOPE: POPC: DC-6-14 of 3: 2: 5.

(Preparación de lipoplejo)(Preparation of lipoplejo)

Los lipoplejos se prepararon mezclando los ARNsh que se han descrito en el Ejemplo 1 con los liposomas con el método que se ha descrito en el Ejemplo 3. Los tamaños de partícula (el método de dispersión dinámica de luz) y los potenciales zeta (el método de dispersión de luz por electroforesis) de los lipoplejos se determinaron usando un NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, U.S.A.). El tamaño de partícula del lipoplejo que tiene ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "lipoplejo de ARNsh de TS") era aproximadamente 400 nm, y la carga superficial del mismo era aproximadamente + 30 mV. Por el contrario, el tamaño de partícula del lipoplejo que tiene ARNsh de NS unido a su superficie de membrana externa (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "lipoplejo de ARNsh de NS") era aproximadamente 400 nm, y la carga superficial del mismo era aproximadamente + 30 mV.The lipoplexes were prepared by mixing the shRNAs described in Example 1 with the liposomes with the method described in Example 3. The particle sizes (the dynamic light scattering method) and the zeta potentials (the method of light scattering by electrophoresis) of the lipoplexes were determined using a NICOMP 370 (Particle Sizing System, CA, USA). The particle size of the lipoplex having TSsh shRNA attached to its outer membrane surface (hereinafter referred to as "TSsh shRNA lipoplex") was approximately 400 nm, and the surface charge thereof was approximately + 30 mV. In contrast, the particle size of the lipoplex having NSsh shRNA attached to its outer membrane surface (hereinafter referred to as "NSsh shRNA lipoplex") was approximately 400 nm, and the surface charge of the same was approximately + 30 mV.

(Evaluación de efectos de lipoplejo de ARNsh de TS en la inhibición del crecimiento tumoral)(Evaluation of lipoplex effects of TSsh shRNA in the inhibition of tumor growth)

El lipoplejo de ARNsh de TS o lipoplejo de ARNsh de NS se administró directamente en la cavidad torácica de un ratón que portaba células MSTO-211H-Luc cada dos días de 7 días a 17 días después del implante del tumor, y la administración se realizó 6 veces en total. Una dosis era 20 pg de ARNsh/100 pl.The TSsh shRNA lipoplex or NSsh shRNA lipoplex was administered directly into the thoracic cavity of a mouse carrying MSTO-211H-Luc cells every two days from 7 days to 17 days after tumor implantation, and administration was performed 6 times in total. One dose was 20 pg of shRNA / 100 pl.

Cuando un agente quimioterapéutico para el cáncer existente (Alimta; pemetrexed sódico hidratado (PMX), Eli Lilly)When an existing chemotherapeutic agent for cancer (Alimta; pemetrexed sodium hydrate (PMX), Eli Lilly)

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se usó en combinación, una dosis de 25 mg/kg se administró por vía intraperitoneal cada día de 7 días a 11 días después del implante del tumor, la misma cantidad del agente se administró por vía intraperitoneal después de un intervalo de 2 días cada día de 14 días a 18 días después del implante del tumor, y la administración se realizó 10 veces en total.was used in combination, a dose of 25 mg / kg was administered intraperitoneally every day from 7 days to 11 days after tumor implantation, the same amount of the agent was administered intraperitoneally after an interval of 2 days each day from 14 days to 18 days after tumor implantation, and administration was performed 10 times in total.

Una solución de sacarosa al 9 % se administró al control.A 9% sucrose solution was administered to the control.

Como se ha descrito en el Ejemplo 5, la actividad carcinostática (es decir, la actividad inhibitoria del crecimiento celular) se evaluó implantando células MSTO-211H-Luc, administrando 100 pl de una solución de sal potásica de D- luciferina (7,5 mg/ml) por vía intraperitoneal con anestesia con isoflurano 21 días después del implante, y evaluando los niveles de bioluminescencia dependiendo de la actividad de las células MSTO-211 H-Luc que se habían cultivado en la cavidad torácica usando IVIS (Xenogen, Alameda, CA, U.S.A.).As described in Example 5, the carcinostatic activity (i.e., the cell growth inhibitory activity) was evaluated by implanting MSTO-211H-Luc cells, administering 100 μl of a potassium salt solution of D-luciferin (7.5 mg / ml) intraperitoneally with anesthesia with isoflurane 21 days after implantation, and evaluating the levels of bioluminescence depending on the activity of the MSTO-211 H-Luc cells that had been cultured in the thoracic cavity using IVIS (Xenogen, Alameda , CAUSE).

Los efectos que prolongan la vida basándose en los efectos carcinostáticos se evaluaron criando continuamente modelos de ratón que se habían sometido a la evaluación basada en IVIS hasta 47 días después del implante celular sin tratamiento.Life-prolonging effects based on carcinostatic effects were evaluated by continuously breeding mouse models that had undergone IVIS-based evaluation up to 47 days after cell implantation without treatment.

Los tiempos medios de supervivencia (MST; el número de días) se evaluaron basándose en la siguiente ecuación.The mean survival times (MST, the number of days) were evaluated based on the following equation.

MST (el número de dias) = el dia en el que el primer ratón murió + el dia en el que el último ratón murió/2MST (the number of days) = the day on which the first mouse died + the day on which the last mouse died / 2

El aumento de la esperanza de vida (%) se determinó de acuerdo con la siguiente forma:The increase in life expectancy (%) was determined according to the following form:

ILS (%) = [tiempo medio de supervivencia para grupo de tratamiento/ tiempo medio de supervivencia para grupo de control] X 100ILS (%) = [mean survival time for treatment group / mean survival time for control group] X 100

Los resultados se muestran en las Figs. 8-1, 8-2, 8-3, y 8-4.The results are shown in Figs. 8-1, 8-2, 8-3, and 8-4.

Como se muestra en las Figs. 8-1 y 8-2, los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral no se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de NS solo en comparación con el grupo de control. Por el contrario, aproximadamente un 50 % de los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de TS o PMX solo. Además, los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral sustancialmente los mismos que los observados en el grupo sometido a tratamiento con PMX solo se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de NS en combinación con PMX. Sin embargo, los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral significativos tan elevados como aproximadamente un 90 % se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de TS en combinación con PMX.As shown in Figs. 8-1 and 8-2, the inhibitory effects of tumor growth were not observed in the group subjected to treatment with the NS-shRNA lipoplex alone compared to the control group. On the contrary, approximately 50% of the inhibitory effects of tumor growth were observed in the group subjected to treatment with the lipoplex of TSsh shRNA or PMX alone. In addition, the inhibitory effects of tumor growth substantially the same as those observed in the group undergoing treatment with PMX were only observed in the group subjected to treatment with the lipoplex of NSsh shRNA in combination with PMX. However, the significant inhibitory effects of tumor growth as high as approximately 90% were observed in the group subjected to treatment with the lshow of TSsh shRNA in combination with PMX.

Como se muestra en las Figs. 8-3 y 8-4, esencialmente no se observaron efectos que prolongaran la vida en el grupo sometido a tratamiento con el de lipoplejo de ARNsh de NS solo en comparación con el grupo de control. Por el contrario, los efectos que prolongan la vida insignificantes (de un 120 % a un 126 %) se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de TS o PMX solo. Además, los efectos que prolongan la vida (122 %) esencialmente los mismos que los observados en el grupo sometido a tratamiento con PMX solo se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de NS en combinación con PMX. Sin embargo, los efectos máximos que prolongan la vida (178 %) que reflejan los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de TS en combinación con PMX.As shown in Figs. 8-3 and 8-4, essentially no life-prolonging effects were observed in the group undergoing treatment with the NS-shRNA lipoplex alone compared to the control group. In contrast, the insignificant life-prolonging effects (from 120% to 126%) were observed in the group undergoing treatment with the TSsh or PMX lshlphoxy alone. In addition, the life-prolonging effects (122%) essentially the same as those observed in the group undergoing treatment with PMX were only observed in the group undergoing treatment with the NSS shRNA lipoplex in combination with PMX. However, the maximum life-prolonging effects (178%) that reflect the inhibitory effects of tumor growth were observed in the group undergoing treatment with the TSsh shRNA lipoplex in combination with PMX.

En ninguno de los grupos de tratamiento se observó una toxicidad grave, incluyendo inhibición del aumento de peso. [Ejemplo 9]In none of the treatment groups was a serious toxicity, including inhibition of weight gain, observed. [Example 9]

Examen de inhibición de expresión genética diana a través de administración intratorácica de lipoplejo de ARNsh de TSExamination of inhibition of target gene expression through intrathoracic administration of TSsh lshlpoplex

Los ratones de los grupos sometidos a tratamiento de la misma manera que en el Ejemplo 8 se sometieron a evaluación a través de IVIS 21 días después del implante de las células MSTO-211H-Luc, los ratones se sacrificaron, las células tumorales se recogieron de la cavidad torácica, y la inhibición de la expresión genética de TS en las células tumorales recogidas se evaluó a través de RT-PCR cuantitativa.Mice from the groups subjected to treatment in the same manner as in Example 8 were subjected to evaluation via IVIS 21 days after implanting the MSTO-211H-Luc cells, the mice were sacrificed, the tumor cells were harvested from the thoracic cavity, and the inhibition of TS gene expression in the collected tumor cells was evaluated through quantitative RT-PCR.

El ARN se extrajo de células tumorales usando el kit RNaqueous-micro (Ambion, Austin, TX, U.S.A.) de acuerdo conRNA was extracted from tumor cells using the RNaqueous-micro kit (Ambion, Austin, TX, U.S.A.) according to

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el método recomendado por el fabricante. La transcripción inversa del ARN en ADNc se realizó con la adición de Oligo (dT)20, dNTP, inhibidor de RNasa, y ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japón) a ARN. La PCR en tiempo real se realizó usando el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, CA, U.S.A.), el ADNc transcrito de forma inversa como el molde, y FastStart TaqMan Probe Master (ROX) y Universal ProbeLibrary (Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Alemania) como reactivos, de acuerdo con el método recomendado por el fabricante. El GAPDH se usó como patrón interno.the method recommended by the manufacturer. Reverse transcription of the RNA into cDNA was performed with the addition of Oligo (dT) 20, dNTP, RNase inhibitor, and ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) to RNA. Real-time PCR was performed using the StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems, CA, USA), the reverse transcribed cDNA as the template, and FastStart TaqMan Probe Master (ROX) and Universal ProbeLibrary (Roche Diagnostics GmbH , Manheim, Germany) as reagents, according to the method recommended by the manufacturer. The GAPDH was used as an internal standard.

Los resultados se muestran en la Fig. 9.The results are shown in Fig. 9.

Como se muestra en la Fig. 9, no se observaron efectos inhibitorios en el gen TS en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de NS solo en comparación con el grupo de control. Por el contrario, aproximadamente un 50 % o aproximadamente un 25 % de los efectos inhibitorio del gen TS se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de TS o PMX solo. Además, aproximadamente un 20 % de los efectos inhibitorios del gen TS, que eran sustancialmente los mismos que los observados en el grupo sometido a tratamiento con PMX solo, se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de NS en combinación con PMX. En el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de ARNsh de TS en combinación con PMX que había presentado los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral, más elevados, en el Ejemplo 8, esencialmente no permanecían células tumorales en la cavidad torácica debido a efectos inhibitorios elevados. Por consiguiente, no fue posible medir cambios en la expresión del gen TS.As shown in Fig. 9, no inhibitory effects on the TS gene were observed in the group treated with the NS-shRNA lipoplex alone compared to the control group. On the other hand, approximately 50% or approximately 25% of the inhibitory effects of the TS gene were observed in the group subjected to treatment with the TSsh or PMX ss liposuction alone. In addition, approximately 20% of the inhibitory effects of the TS gene, which were substantially the same as those observed in the group treated with PMX alone, were observed in the group undergoing treatment with the NS-shRNA lipoplex in combination with PMX In the group subjected to treatment with the TSsh shRNA lipoplex in combination with PMX which had exhibited the highest inhibitory effects of tumor growth in Example 8, essentially no tumor cells remained in the thoracic cavity due to high inhibitory effects. Therefore, it was not possible to measure changes in the expression of the TS gene.

[Ejemplo 10][Example 10]

Influencia de la configuración de la mezcla de lípidos en la introducción de ARNsh in vitro Preparación de presoma catiónicoInfluence of the configuration of the lipid mixture on the introduction of siRNA in vitro Preparation of cationic presoma

En el presente documento se usó la composición del lípido usada en el Ejemplo 3; es decir, DOPE:X:DC-6-14=3:2:5 (X representa DOPC o POPC).In this document the lipid composition used in Example 3 was used; that is, DOPE: X: DC-6-14 = 3: 2: 5 (X represents DOPC or POPC).

Los lípidos se midieron con el fin de conseguir la composición del lípido que se ha descrito anteriormente, y ciclohexano en una cantidad de 10 veces la cantidad del lípido total en peso y etanol en una cantidad de un 2 % de ciclohexano en peso se añadieron para lisar los lípidos en agua tibia a 70 °C. El lisado se filtró a través de un filtro de membrana de PTFE de 0,2 gm, y la solución filtrada se congeló con hielo seco/acetona. Después de la finalización de la congelación, un secado a vacío se realizó durante 12 horas un periodo superior con el uso de una bomba de vacío. Por lo tanto, se obtuvieron presomas catiónicos.The lipids were measured in order to achieve the composition of the lipid described above, and cyclohexane in an amount of 10 times the amount of the total lipid by weight and ethanol in an amount of 2% of cyclohexane by weight were added to lyse the lipids in warm water at 70 ° C. The lysate was filtered through a 0.2 gm PTFE membrane filter, and the filtered solution was frozen with dry ice / acetone. After the completion of the freezing, a vacuum drying was performed for 12 hours a longer period with the use of a vacuum pump. Therefore, cationic presomes were obtained.

Una solución de presomas catiónicos usados en el experimento se preparó por adición de una solución de sacarosa al 9 % (pH 7,4) a los presomas catiónicos obtenidos con el método que se ha descrito anteriormente, con el fin de ajustar la concentración del lípido final a 100 mM, y agitando la mezcla de forma vigorosa durante 10 minutos. El tamaño de partícula promedio de los presomas catiónicos fue aproximadamente 440 ± 210 nm (media ± desviación típica).A solution of cationic pressomas used in the experiment was prepared by adding a solution of 9% sucrose (pH 7.4) to the cationic presomes obtained with the method described above, in order to adjust the concentration of the lipid final at 100 mM, and stirring the mixture vigorously for 10 minutes. The average particle size of the cationic presomas was approximately 440 ± 210 nm (mean ± standard deviation).

Preparación de lipoplejo y preplejoPreparation of lipoplejo and preplex

Los lipoplejos y preplejos se prepararon usando los liposomas catiónicos y se han descrito en el Ejemplo 3 y los presomas catiónicos que se han descrito anteriormente, respectivamente. El ARNsh de Luc que se dirige a luciferasa que se ha descrito en el Ejemplo 3 estaba equipado con los lipoplejos y los preplejos.The lipoplexes and preplexes were prepared using the cationic liposomes and have been described in Example 3 and the cationic presoms that have been described above, respectively. The Luc shRNA that targets luciferase that was described in Example 3 was equipped with the lipoplexes and the preplexes.

Los liposomas catiónicos o presomas catiónicos se mezclaron con los ARNsh de Luc a una proporción de 1600:1 o 800:1 en moles, y los resultantes se agitaron vigorosamente durante 10 minutos. Por lo tanto, se prepararon los lipoplejos y los preplejos con ARNsh de Luc unido a su superficie de membrana externa.Cationic liposomes or cationic presoms were mixed with the Luc siRNAs at a ratio of 1600: 1 or 800: 1 in moles, and the results were vigorously stirred for 10 minutes. Therefore, lipoplexes and preplexes were prepared with Luc shRNA attached to their outer membrane surface.

Transfección en células HT-1080Transfection in HT-1080 cells

Como reactivo de transfección, se usó Lipofectamina™ 2000 (en lo sucesivo en el presente documento denominada "Lf2000"), que es un liposoma catiónico. Como plásmidos que expresan luciferasa obtenidos a partir de luciérnaga firefly y obtenidos a partir de babosa marina, se usaron pGL3-C and pRL-TK (Promega).As a transfection reagent, Lipofectamina ™ 2000 (hereinafter referred to as "Lf2000"), which is a cationic liposome, was used. As luciferase expressing plasmids obtained from firefly firefly and obtained from marine slug, pGL3-C and pRL-TK (Promega) were used.

Los plásmidos que expresan luciferasa obtenidos a partir de luciérnaga y obtenidos a partir de babosa marina (15 gg + 15 gg) y 30 gl de Lf2000 se diluyeron por separado con OptiMEM para preparar 750 gl de las soluciones de los mismos, las soluciones resultantes se mezclaron, la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente de 10 a 20 minutos para formar un lipoplejo de Luc.Plasmids expressing luciferase obtained from firefly and obtained from sea slug (15 gg + 15 gg) and 30 g of Lf2000 were separately diluted with OptiMEM to prepare 750 gls of the solutions thereof, the resulting solutions mixed, the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 to 20 minutes to form a Luc lipoplex.

Una suspensión de células de fibrosarcoma humano (HT-1080) (10.000 células/ml) se pipeteó en una placa de 12 pocillos, la solución del cultivo se retiró de la misma 24 horas a partir de ese momento, se añadieron 100 gl a esto deA suspension of human fibrosarcoma cells (HT-1080) (10,000 cells / ml) was pipetted into a 12-well plate, the culture solution was removed therefrom 24 hours thereafter, 100 gl was added to this of

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la solución de lipoplejo de Luc, y a continuación el cultivo se realizó a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % durante 5 horas.the Luc lipoplex solution, and then the culture was carried out at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 for 5 hours.

A partir de ese momento, la solución de cultivo se retiró, la placa se lavó con PBS(-) frío una vez, se añadieron 100 pl de una solución de un lipoplejo con ARNsh de Luc unido a su superficie de membrana externa o una solución de un preplejo con ARNsh de Luc unido a su superficie de membrana externa (la concentración final de ARNsh en cada pocillo era 50 nM) en combinación con 900 pl de un medio DMEM recién preparado, y a continuación el cultivo se realizó a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % durante un periodo adicional 48 horas.Thereafter, the culture solution was removed, the plate was washed with cold PBS (-) once, 100 pl of a solution of a lipoplex with Luc shRNA attached to its outer membrane surface or a solution was added. of a pre-complex with Luc shRNA attached to its outer membrane surface (the final concentration of shRNA in each well was 50 nM) in combination with 900 μl of a freshly prepared DMEM medium, and then culturing was performed at 37 ° C in presence of 5% CO2 for an additional 48 hours.

Ensayo de actividad de luciferasaLuciferase activity assay

El ensayo de actividad de luciferasa se realizó con el uso del Sistema de Ensayo de Indicador de Luciferasa Doble (Promega) y una microplaca de 96 pocillos. El cultivo se realizó durante 48 horas, el medio se retiró, la placa se lavó con PBS(-) frío una vez, y se añadieron 105 pl de tampón de lisis pasivo directamente a los pocillos para lisis celular. La congelación-descongelación se realizó una vez, la centrifugación se realizó a 10.000x g y 4 °C durante 30 segundos, y el sobrenadante resultante se usó como un extracto celular.The luciferase activity assay was performed with the use of the Double Luciferase Indicator Assay System (Promega) and a 96-well microplate. The culture was performed for 48 hours, the medium was removed, the plate was washed with cold PBS (-) once, and 105 μl of passive lysis buffer was added directly to the wells for cell lysis. Freeze-thaw was performed once, centrifugation was performed at 10,000x g and 4 ° C for 30 seconds, and the resulting supernatant was used as a cell extract.

El Reactivo II de Ensayo de Luciferasa (50 pl) y 10 pl del extracto celular se añadieron a cada pocillo, y el nivel de bioluminescencia se sometió a ensayo basándose en la actividad de luciferasa luciérnaga con el uso de un lector de microplacas (Infinite 200® Pro, Tecan). A partir de ese momento, se añadieron adicionalmente 50 pl del Reactivo Stop & Glo®, y la actividad de luciferasa de babosa marina se sometió al ensayo del mismo modo.Luciferase Assay Reagent II (50 pL) and 10 pL of cell extract were added to each well, and the bioluminescence level was assayed based on firefly luciferase activity with the use of a microplate reader (Infinite 200 ® Pro, Tecan). Thereafter, 50 μl of the Stop & Glo® Reagent was added further, and the marine slug luciferase activity was tested in the same manner.

La actividad de luciferasa obtenida a partir de luciérnaga se determinó de acuerdo con la fórmula que se muestra a continuación, con respecto a la actividad sin tratamiento de ARNsh de Luc.The luciferase activity obtained from firefly was determined according to the formula shown below, with respect to the activity without Luc slsh treatment.

Actividad relativa de luciferasa obtenida a partir de luciérnaga (%) = (actividad de luciferasa de luciérnaga/actividad de luciferasa de babosa marina)/(actividad de luciferasa luciérnaga sin tratamiento de ARNsh de Luc/actividad de luciferasa de babosa marina sin tratamiento de ARNsh de Luc) x 100.Relative activity of luciferase obtained from firefly (%) = (firefly luciferase activity / marine slug luciferase activity) / (firefly luciferase activity without Luc slsh treatment / marine slug luciferase activity without ssh treatment of Luc) x 100.

Los resultados se muestran en la Fig. 10.The results are shown in Fig. 10.

Como se muestra en la Fig. 10, la expresión de luciferasa se inhibió de forma más eficaz con un preplejo con ARNsh de Luc unido a su superficie de membrana externa, en comparación con un lipoplejo que tenía ARNsh de Luc unido a su superficie de membrana externa. Si el complejo contenía DOPC o POPC no era significativo. Además, un preplejo que contenía DOPC presentaba en cierto modo una eficacia más elevada para inhibición de la expresión que un preplejo que contenía POPC en el grupo al que se había administrado el preplejo.As shown in Fig. 10, luciferase expression was more efficiently inhibited with a pre-fold with Luc shRNA attached to its outer membrane surface, compared to a lipoplex having Luc shRNA attached to its membrane surface external Whether the complex contained DOPC or POPC was not significant. In addition, a preplex containing DOPC had somewhat higher efficacy for inhibition of expression than a precondition containing POPC in the group to which the preplex had been administered.

[Ejemplo 11][Example 11]

Efectos inhibitorios del crecimiento tumoral conseguidos por administración intratorácica de lipoplejo y preplejo cada uno con ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa en modelos de implante ortotópica de mesotelioma pleural malignoInhibitory effects of tumor growth achieved by intrathoracic administration of lipoplex and preplex each with TSsh shRNA attached to its outer membrane surface in malignant pleural mesothelioma orthotopic implant models

Establecimiento de modelos de implante ortotópico de mesotelioma pleural malignoEstablishment of orthotopic implant models of malignant pleural mesothelioma

Los modelos de implante ortotópico de mesotelioma pleural maligno usando las células MSTO-211H-Luc se prepararon con el método que se ha descrito en el Ejemplo 4, y los ratones 4 días después del implante se sometieron al experimento in vivo.Models of orthotopic malignant pleural mesothelioma implant using the MSTO-211H-Luc cells were prepared with the method described in Example 4, and the mice 4 days after implantation were subjected to the in vivo experiment.

Preparación de lipoplejo y preplejo cada uno con ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externaPreparation of lipoplex and preplex each with TSsh shRNA attached to its outer membrane surface

De acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 10, se prepararon liposomas catiónicos y presomas catiónicos con la composición del lípido de DOPE:DOPC:DC-6-14 de 3:2:5. El liposomas y los presomas se mezclaron con ARNsh de dirección a TS que se ha descrito en el Ejemplo 1 para preparar un lipoplejo (un lipoplejo de TS) y un preplejo (un preplejo de TS). La proporción de los liposomas o presomas con respecto a los ARNsh fue 2000:1 en moles. El tamaño de partícula promedio del liposoma de TS y el del preplejo de TS preparado fueron aproximadamente 210 ± 100 nm y aproximadamente 630 ± 400 nm (media ± desviación estándar), respectivamente. Evaluación de los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral en el preplejo y el lipoplejo cada uno con ARNsh de TS unido a su superficie de membrana externa.In accordance with the method described in Example 10, cationic liposomes and cationic pressomas were prepared with the DOPE lipid composition: DOPC: DC-6-14 of 3: 2: 5. The liposomes and the presomes were mixed with shRNA in the direction of TS that was described in Example 1 to prepare a lipoplex (a lipoplex of TS) and a preplex (a preplex of TS). The proportion of the liposomes or presomes with respect to the siRNAs was 2000: 1 in moles. The average particle size of the TS liposome and that of the prepared TS preplex were approximately 210 ± 100 nm and approximately 630 ± 400 nm (mean ± standard deviation), respectively. Evaluation of the inhibitory effects of tumoral growth in the preplex and the lipoplex each with TSsh shRNA attached to its outer membrane surface.

El lipoplejo de TS o preplejo de TS se administró directamente en la cavidad torácica, 4, 7, 10, 13, y 16 días después del implante tumoral, de modo que pudieran administrar 20 pg (50 pl) de ARNsh.The TS or TS preplex lipoplex was administered directly into the thoracic cavity, 4, 7, 10, 13, and 16 days after tumor implantation, so that they could administer 20 pg (50 pl) of shRNA.

Cuando un agente quimioterapéutico existente (Alimta; pemetrexed sódico hidratado (PMX), Eli Lilly) se usó en combinación, una dosis de 25 mg/kg se administró por vía intraperitoneal cada día de 4 días a 8 días después delWhen an existing chemotherapeutic agent (Alimta; pemetrexed sodium hydrate (PMX), Eli Lilly) was used in combination, a dose of 25 mg / kg was administered intraperitoneally every day from 4 days to 8 days after the

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implante del tumor, la misma cantidad del agente se administró por vía intraperitoneal después de un intervalo de 2 días cada día de 11 días a 15 días después del implante del tumor, y la administración se realizó 10 veces en total.tumor implant, the same amount of the agent was administered intraperitoneally after an interval of 2 days every day from 11 days to 15 days after tumor implantation, and administration was performed 10 times in total.

Dos días después de la administración final del lipoplejo de TS o preplejo de TS (es decir, 18 días después del implante del tumor), 100 gl de una solución de sal potásica de D-luciferina (7,5 mg/ml) se administró por vía intraperitoneal con anestesia con isoflurano, y los niveles de bioluminescencia dependiendo de la actividad de luciferasa en las células MSTO-211H-Luc que se habían cultivado en la cavidad torácica se evaluaron usando IVIS (Xenogen, Alameda, CA, U.S.A.).Two days after the final administration of the TS lipoplex or TS preplex (ie, 18 days after the tumor implant), 100 g of a potassium salt solution of D-luciferin (7.5 mg / ml) was administered. intraperitoneally with isoflurane anesthesia, and bioluminescence levels depending on the luciferase activity in the MSTO-211H-Luc cells that had been cultured in the thoracic cavity were evaluated using IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA).

Los resultados se muestran en la Fig. 11.The results are shown in Fig. 11.

Los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral observados en el grupo sometido a tratamiento con PMX solo eran insignificantes, en comparación con el grupo de control sin tratamiento. En el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de TS o el preplejo de TS solos, por el contrario, los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral eran aparentemente más elevados, en comparación con el grupo de control y el grupo sometido a tratamiento con PMX solo. Aunque los efectos inhibitorios del crecimiento tumoral más elevados se observaron en el grupo sometido a tratamiento con el lipoplejo de TS o preplejo de TS en combinación con PMX, no se observaron diferencias significativas entre los efectos alcanzados con el lipoplejo y los efectos alcanzados con el preplejo.The inhibitory effects of tumor growth observed in the group undergoing treatment with PMX alone were insignificant, compared to the control group without treatment. In the group undergoing treatment with the TS lipoplex or TS preplex alone, on the contrary, the inhibitory effects of tumor growth were apparently higher, in comparison with the control group and the group undergoing treatment with PMX alone. Although the highest inhibitory effects of tumor growth were observed in the group undergoing treatment with the TS lipoplex or TS preplex in combination with PMX, no significant differences were observed between the effects achieved with the lipoplex and the effects achieved with the preplex .

La Fig. 12 muestra los resultados de medición de pesos corporales de ratones cuando se someten a la evaluación a través de IVIS, y no se observaron diferencias estadísticamente significativas en ningún grupo. Esto indica que el método de administración usado en el presente documento no tiene una toxicidad grave.Fig. 12 shows the results of measurement of body weights of mice when they undergo evaluation through IVIS, and no statistically significant differences were observed in any group. This indicates that the method of administration used in the present document does not have a serious toxicity.

Aplicabilidad industrialIndustrial applicability

La administración tópica del liposoma de acuerdo con la presente invención que tiene un principio activo en el mismo permite una administración eficaz de un principio activo a células limitadas en el sitio diana de administración y/o las proximidades del mismo. Además, la administración tópica del liposoma de acuerdo con la presente invención que tiene, como un principio activo, una molécula de ARNi capaz de inhibir el crecimiento tumoral con respecto al tumor y/o una zona en las proximidades del mismo permite una administración eficaz de una molécula de ARNi a la célula tumoral diana. Por lo tanto, el crecimiento tumoral se puede inhibir de forma eficaz. Se espera que la presente invención produzca una contribución significativa en el campo de la administración farmacológica o tratamiento para el cáncer.Topical administration of the liposome according to the present invention having an active ingredient therein allows an effective administration of an active principle to limited cells at the target site of administration and / or the vicinity thereof. In addition, the topical administration of the liposome according to the present invention having, as an active principle, an RNAi molecule capable of inhibiting tumor growth with respect to the tumor and / or an area in the vicinity thereof allows an effective administration of an RNAi molecule to the target tumor cell. Therefore, tumor growth can be inhibited effectively. It is expected that the present invention will make a significant contribution in the field of pharmacological administration or treatment for cancer.

LISTADO DE SECUENCIASLIST OF SEQUENCES

<110> Delta-Fly Pharma, Inc.<110> Delta-Fly Pharma, Inc.

<120> Un Liposoma para Administración Local y Uso del Mismo<120> A Liposome for Local Administration and Use of the Same

<130> PH-5638-PCT<130> PH-5638-PCT

<150> JP 2013-095950<150> JP 2013-095950

<151> 30.04.2013<151> 04-30-2013

<160> 12<160> 12

<170> Patentln versión 3.4<170> Patentln version 3.4

<210> 1 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial<210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400> 1<223> synthetic oligonucleotide <400> 1

guaacaccau .cgaucauga 19guaacaccau .cgaucauga 19

<210> 2<210> 2

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<211> 19 <212> ARN <213> Artificial<211> 19 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400>2<223> synthetic oligonucleotide <400> 2

ucaugaucga ugguguuacucaugaucga ugguguuac

<210> 3 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial<210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400>3<223> synthetic oligonucleotide <400> 3

gaauacagag auauggaaugaauacagag auauggaau

<210>4 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial<210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400>4<223> synthetic oligonucleotide <400> 4

áuuccauauc ucuguauucAucucuauc ucuguauuc

<210> 5 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial<210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400>5<223> synthetic oligonucleotide <400> 5

cgaucaugau guagagugucgaucaugau guagagugu

<210>6 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial<210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400>6<223> synthetic oligonucleotide <400> 6

acacucuaca ucaugaucgacacucuaca ucaugaucg

<210> 7 <211> 15 <212> ARN<210> 7 <211> 15 <212> RNA

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<213> Artificial <220><213> Artificial <220>

<223> oligonucleótido sintético <400>7<223> synthetic oligonucleotide <400> 7

uagugcticcu gguug 15uagugcticcu gguug 15

<210>8 <211> 55 <212> ARN <213> Artificial<210> 8 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400>8<223> synthetic oligonucleotide <400> 8

guaacaccau cgaucaugau agugcuccug guugucauga ucgauggugu uacuu 55guacacacau cgaucaugau agugcuccug guugucauga ucgauggugu uacuu 55

<210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial<210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético<223> synthetic oligonucleotide

<220> misc_ARN <223> (1)..(19)<220> misc_ARN <223> (1) .. (19)

<400>9<400> 9

ggguguuuug gaggaguugt t 21ggguguuuug gaggaguugt t 21

<210> 10 <211> 21 <212> ARN <213> Artificial<210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético <400> 10<223> synthetic oligonucleotide <400> 10

aacaacuccu ccaaaacacc c 21aacaacuccu ccaaaacacc c 21

<210> 11 <211> 55 <212> ARN <213> Artificial<210> 11 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial

<220><220>

<223> oligonucleótido sintético<223> synthetic oligonucleotide

<400> 11<400> 11

ucuuaaucgc guauaaggcu agugcuccug guuggccuua uacgcgauua agauu 55ucuuaaucgc guauaaggcu agugcuccug guuggccuua uacgcgauua agauu 55

<210> 12 <211> 55 <212> ARN<210> 12 <211> 55 <212> RNA

<213> Artificial <220><213> Artificial <220>

<223> oligonucleótido sintético<223> synthetic oligonucleotide

<400> 12<400> 12

cuuacgcuga guacuucgau agugcuccug guugucgaag uacucagcgu aaguu 55cuuacgcuga guacuucgau agugcuccug guugucgaag uacucagcgu aaguu 55

Claims

5

10

fifteen

twenty

25

30

35

40

Four. Five

1. A liposome for use by topical administration in a medical treatment method, consisting of dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine and cationic lipid,

wherein the phosphatidylcholine comprises at least one unsaturated fatty acid chain containing a carbon-to-carbon double bond, and

wherein the cationic lipid is O, O-ditetradecanoyl-N- (a-trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride (DC-6-14).

2. The liposome for use according to claim 1, wherein the phosphatidylcholine comprises at least one unsaturated fatty acid chain containing a carbon-to-carbon double bond in cis form.

3. The liposome for use according to claim 1, wherein the phosphatidylcholine is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), palmitoyl-oleoyl phosphatidylcholine (POPC) or 1,2-dieicosenoyl- sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC).

4. The liposome for use according to claim 1, wherein the phosphatidylcholine is DOPC.

5. The liposome for use according to claim 1, which consists of DOPE, DOPC and DC-6-14, optionally consisting of DOPE, DOPC and DC-6-14 at 3: 2: 5 in moles.

6. A composition for use by topical administration in a medical treatment method comprising the liposome for use according to any one of claims 1 to 5 and an active compound.

The composition for use according to claim 6, wherein the active compound is a nucleic acid.

The composition for use according to claim 7, wherein the nucleic acid is bound to the surface of the outer membrane of the liposome.

9. An antitumor agent for use by topical administration in a method of treating a tumor, comprising the liposome for use according to any one of claims 1 to 5 and short forked RNA (shRNA) capable of inhibiting the expression of the thymidylate synthase through RNAi.

10. The antitumor agent for use according to claim 9, wherein the shRNA is attached to the surface of the outer membrane of the liposome.

11. The antitumor agent for use according to claim 9, wherein the shRNA consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.

12. The antitumor agent for use according to claim 9, which is for use in combination with cancer chemotherapy or a cancer chemotherapeutic agent.

13. A combination product comprising the antitumor agent for use according to any one of claims 9 to 12 and a cancer chemotherapeutic agent.

The combination product according to claim 13, wherein the chemotherapeutic agent for cancer is an antitumor agent having inhibitory action of TS (thymidylate synthase).

15. The combination product according to claim 14, wherein the antitumor agent having TS inhibitory action is a hydrated 5-FU or pemetrexed sodium antitumor agent.