ES2674522T3 - Composición liofilizada - Google Patents

Abstract

El uso de estaquiosa como agente de formación de vidrio para la liofilización de una mezcla de reacción que comprende una polimerasa.

Description

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DESCRIPCION

Composición liofilizada

La presente invención se refiere a composiciones liofilizadas, en particular a las que se utilizan para llevar a cabo reacciones químicas o bioquímicas y que contienen una polimerasa, así como a métodos para prepararlas y a su uso.

La liofilización o criodesecación es una técnica muy conocida para preservar una amplia gama de residuos que incluyen productos químicos, bioquímicos y muestras biológicas. Es bien sabido que estos residuos deben mezclarse con reactivos tales como estabilizadores. Se conocen diversos estabilizadores que son necesarios para garantizar que, durante el proceso de liofilización, los residuos conservan su estructura y función.

En un caso particular, algunos o todos los reactivos que son necesarios para llevar a cabo reacciones químicas o bioquímicas específicas se combinan, y la mezcla se congela o liofiliza. El material resultante puede después almacenarse o transportarse al laboratorio o al entorno en el que la reacción se lleva a cabo más tarde, por ejemplo, mediante la adición de una muestra que puede ser, por ejemplo, una muestra clínica, ambiental u otra muestra biológica que requiera ensayo. El material liofilizado proporciona una forma más conveniente para el almacenamiento y el transporte ya que no se requiere refrigeración.

Una reacción particular en la que se ha utilizado este procedimiento son los métodos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En esta reacción, las secuencias de ácido nucleico específicas se multiplican o amplifican sometiendo una muestra que contiene ese ácido nucleico a una serie de etapas iterativas. Los cebadores que están específicamente diseñados para hibridarse con la secuencia de ácido nucleico diana se incluyen en la reacción y se extienden mediante enzimas polimerasas y en particular polimerasas térmicamente estables presentes en la mezcla de reacción para producir copias de la diana de una manera exponencial. El progreso de la reacción se puede controlar en tiempo real, utilizando sondas marcadas u otros residuos fluorescentes que están dispuestos para producir una variedad de sistemas de marcaje.

Las secuencias de ácido nucleico diana amplificadas pueden ser ADN o ARN. Cuando el ácido nucleico diana es ADN, la polimerasa utilizada será una ADN polimerasa dependiente de ADN. En el caso de que el ARN sea la diana, el producto de amplificación es el ADNc o ARN complementario y se produce en una variante particular de PCR conocida como PCR de transcriptasa inversa o RT-PCr. Esta reacción utiliza una ADN polimerasa dependiente de ARN o una ADN polimerasa dependiente de ARN/ADN como enzima transcriptasa inversa para producir el ADNc (ARN implícito a ARN). Como se usa en el presente documento, las referencias a la reacción en cadena de la polimerasa o PCR incluyen RT-PCR así como PCR convencional y el término "polimerasa" incluye tanto ADN polimerasa como transcriptasa inversa.

Aunque los cebadores y las sondas serán específicos para reacciones particulares, existen otros reactivos, en particular, enzimas polimerasas, nucleótidos, tampones y sales, tales como sales de magnesio, que son comunes a todas estas reacciones. Estos forman elementos de las denominadas 'mezclas maestras principales' y están disponibles, ya listas para mezclar, en fuentes comerciales. Estas pueden congelarse o liofilizarse como se indicó anteriormente, y se dispone de las denominadas "perlas listas para la PCR". Cuando se realizan PCR específicas regularmente, por ejemplo, con el fin de realizar un diagnóstico particular, los cebadores y las sondas, u otros reactivos marcadores necesarios, pueden incorporarse a la mezcla de reacción liofilizada de modo que estén listos para su uso directamente al añadirse a una muestra adecuada.

La liofilización de dichas mezclas complejas requiere tener muy en cuenta los reactivos estabilizadores que pueden incluirse. Estos son necesarios para proteger a los reactivos y, en particular, a los reactivos biológicamente activos, tales como enzimas, durante el proceso de liofilización, aunque entonces no deben inhibir o influir en la reacción posterior que se lleva a cabo utilizando la mezcla liofilizada.

Para su uso en este caso se han sugerido diversos agentes estabilizadores. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 2002/0173016 sugiere que una combinación de un azúcar de bajo peso molecular (que en sí misma puede ser una combinación de di y trisacáridos) y un almidón, proporciona una composición estabilizadora adecuada para la liofilización de mezclas de reacción que contienen polimerasa. El documento WO2010/001162 enseña que el trisacárido rafinosa y, en particular, el pentahidrato de rafinosa es un agente de formación de vidrio adecuado para su uso en dichas mezclas de reacción, en particular cuando también están presentes reactivos fluorescentes. En los documentos WO2008/036544 y WO2008/155524 se describen otras composiciones cristalizadas o liofilizadas de dichos agentes biológicos. El documento WO2010/144682 describe formulaciones vitrificadas para su uso en dispositivos microfluídicos.

Aunque anteriormente se han utilizado azúcares de mayor peso molecular, tales como la estaquiosa, como un estabilizador en la liofilización de algunas proteínas farmacéuticas (Prestrelski et al, Pharmaceutical Research, (1995) 12, 9 p 1250-1259), generalmente se cree que son menos eficaces que los azúcares de bajo peso molecular

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en relación con la liofilización de la enzima p-galactosidasa (Yoshioka et al. Pharmaceutical Research (2007) 24, 9, 1660-1667).

Los solicitantes han descubierto que los sacáridos de mayor peso molecular son agentes formadores de vidrio particularmente beneficiosos para su uso en la liofilización, en particular de mezclas de reacción químicas y bioquímicas que comprenden una serie de enzimas, en particular las que son útiles en la manipulación de ácidos nucleicos tales como polimerasas.

Según la presente invención, se proporciona el uso de una estaquiosa como agente de formación de vidrio para la liofilización de una mezcla de reacción que comprende una polimerasa.

La estaquiosa es un polisacárido que comprende 4 unidades sacarídicas.

Aunque se puede utilizar sacárido puro, una buena fuente de material sacarídico son extractos de productos naturales que pueden contener una variedad de sacáridos que incluyen algunos que tienen menos de 4 unidades sacarídicas. Sin embargo, siempre que una parte sustancial de los sacáridos presentes, en particular al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %, sea estaquiosa, se puede encontrar un efecto beneficioso.

En particular, al utilizar la estaquiosa como el principal elemento estabilizador de la mezcla, los solicitantes han descubierto que las composiciones liofilizadas obtenidas tienen una resistencia mejorada a la hidratación al exponerse a la humedad, por ejemplo, al aire. Parece que el azúcar actúa como un desecante más eficaz, y esto aumenta la longevidad de la composición.

Sin embargo, además, las composiciones que contienen estaquiosa pueden diseñarse para tener mejores propiedades de disolución que las formulaciones que contienen azúcares de menor peso molecular, ya que la cantidad de otros excipientes de alto peso molecular que tienden a reducir la solubilidad, puede reducirse. Además, las soluciones de estaquiosa tienen una vida útil más larga que las soluciones similares de azúcares de bajo peso molecular, lo que facilita su manipulación y conservación durante el proceso de fabricación. Además, la estaquiosa se incorpora en la solución mejor que la rafinosa, que requiere un calentamiento suave para incorporarse en la solución. Asimismo, la rafinosa tiene una tendencia a precipitar cuando se conserva en solución a bajas temperaturas como las que hay en un refrigerador, mientras que la estaquiosa y algunos otros azúcares de alto peso molecular no tienen esa tendencia. Esto significa que las soluciones procedentes de composiciones que contienen estaquiosa se pueden conservar fácilmente en un frigorífico y muestran un deterioro reducido como resultado de la contaminación bacteriana.

En particular, según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición deshidratada que comprende:

(i) una polimerasa; y

(ii) estaquiosa.

La composición está adecuadamente en forma liofilizada.

La polimerasa puede ser cualquier enzima, tal como una polimerasa, que influya en el ácido nucleico. Se conoce una variedad de polimerasas y estas se seleccionan dependiendo de su propósito previsto en una reacción. Por ejemplo, hay diversas reacciones de amplificación isotérmicas tales como la amplificación mediada por transcripción, amplificación basada en secuencias de ácido nucleico, amplificación de tecnología de ARN mediada por señal, amplificación de desplazamiento de cadena, amplificación de círculo rodante, amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle (LAMP), amplificación isotérmica de desplazamiento múltiple, amplificación dependiente de helicasa, amplificación isotérmica de cebador único y amplificación dependiente de helicasa circular, así como amplificación de genoma completo, donde la polimerasa utilizada solo necesita ser activa a la temperatura a la que se lleva a cabo la reacción.

En una realización particular, la polimerasa es una polimerasa termoestable, tal como una polimerasa de Taq o Pfu o una enzima transcriptasa inversa tal como de MMuLV, AMV o Tth, que se utiliza en reacciones tales como la reacción en cadena de la polimerasa que implica termociclado, incluidas las fases llevadas a cabo a altas temperaturas. Las polimerasas pueden ser recombinantes para formar termoestabilidad o procesividad, u otras propiedades, mejoradas, por ejemplo, pueden incluir proteínas de fusión que combinan dominios de unión a ADN con una polimerasa. La polimerasa termoestable puede modificarse químicamente o bloquearse de otra manera, de modo que se inactiva hasta que se somete a una etapa de termoactivación inicial, como se utiliza en una PCR de arranque en caliente ("HotStart") convencional. Dichas enzimas están disponibles en diversas fuentes comerciales y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 5. 677.152. La polimerasa también puede formar un conjugado de anticuerpo contra antígeno (anticuerpo anti Taq y Taq) para facilitar un arranque en caliente como se describe, por ejemplo, en los documentos USP5338671 o USP5586287). Para facilitar un arranque en caliente se utilizan otras modificaciones o especies co-reactantes, tales como aptámeros, péptidos u otras especies.

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La enzima polimerasa está presente de manera adecuada a una concentración que la permitirá llevar a cabo una reacción, tal como una PCR, cuando la composición de la invención en forma liofilizada se reconstituye. Esto dependerá de factores tales como el volumen de la composición liofilizada utilizada y el volumen de la mezcla de reacción reconstituida. Sin embargo, en general, la polimerasa está presente en una reacción, tal como una PCR, en concentraciones de 0,01 unidades/ul (10000 UNIDADES/L) a 0,2 unidades/ul (200000 UNIDADES/L) y esto normalmente se puede lograr garantizando que la composición liofilizada contenga de 10000 a 200000 unidades/l, en particular, 40000 unidades/l, definiéndose una "unidad" como la cantidad de enzima que incorporará 15 nmol de dNTP en material insoluble ácido en 30 minutos a 75 °C. Como se expuso anteriormente, la estaquiosa puede estar presente como una mezcla de sacáridos tal como se encuentra en un extracto de un producto natural. Sin embargo, no es necesario añadir almidón u otros componentes.

La estaquiosa debe estar presente en una cantidad formadora de vidrio en la composición. Esto variará dependiendo de los otros componentes que están presentes en la mezcla. Cuando el contenido de sal de una mezcla de reacción es alto, los niveles de estaquiosa deben aumentar para lograr el efecto protector deseado. Sin embargo, la estaquiosa no debe estar presente en una cantidad tan significativa que al reconstituir la composición mediante la adición de agua para producir una "composición final" para utilizar en una reacción química o bioquímica, esté presente en una cantidad tal que inhiba o de lo contrario, limite la reacción. Típicamente, en una composición final, la cantidad no es mayor del 10 % m/v, por ejemplo, del 0,5 al 10 % m/v y, convenientemente, del 1 al 20 % m/v para la solución utilizada para formar el sustrato vítreo liofilizado. El volumen relativo de la composición antes y después de la liofilización variará dependiendo de la cantidad de agua requerida para solubilizar los componentes para formar la composición mezclada. Sin embargo, en general, el volumen de la composición antes de la liofilización será de 0,1 a 0,5 veces el volumen de la composición después de la liofilización y disolución / reconstitución, y de forma adecuada aproximadamente la mitad del volumen. Esto significa que típicamente, la cantidad de azúcar presente en la composición o "torta" liofilizada es de 0,5 a 5% m/v, por ejemplo, de aproximadamente 2,5 % m/v.

La composición puede comprender adicionalmente otros componentes necesarios para llevar a cabo una reacción química o bioquímica, tal como la reacción en cadena de la polimerasa. En particular, las mezclas de reacción pueden comprender además un tampón utilizado en la reacción de PCR, en particular un tampón que tiene un pH de 7 - 9 por ejemplo de 8 a 9. Los tampones adecuados incluyen tampones Tris o Trizma así como HEPES, tricina y en algunos casos tampones de bicina. Cuando el tampón no está incluido en la composición, sería necesario garantizar que se utiliza un tampón de rehidratación adecuado para reconstituir la composición deshidratada lista para su uso. La cantidad de tampón presente en la composición será tal que garantice que cuando se reconstituya la composición liofilizada, produzca una concentración de tampón en la mezcla de reacción final según lo que es convencional en la técnica, dependiendo del tampón particular empleado. Por ejemplo, pueden utilizarse concentraciones de tampón Tris en el intervalo de 1-50 mmol/l, tales como de 5 a 35 mmol/l y, en particular, generalmente se requieren de 10 a 20 mmol/l en mezclas de reacción de amplificación final y por eso antes de la liofilización a la composición se añadirán concentraciones apropiadas.

De manera similar, la composición puede comprender además sales necesarias para su uso en la reacción. En el caso de la PCR, dichas sales serán, por ejemplo, sales de magnesio, sodio, litio, potasio, amonio o manganeso, tales como sales de haluros, por ejemplo, cloruros o sulfatos. Una sal particular que se utiliza de esta manera es cloruro de magnesio (MgCh). Las sales estarán presentes en una cantidad que sea necesaria para llevar a cabo la reacción. Por tanto, en el caso de la reacción en cadena de la polimerasa, las sales, y en particular las sales de magnesio, pueden estar presentes en la composición liofilizada en una cantidad de 1 a10 mM y de manera adecuada de 1,5 a 6 mM tal como de 3 a 6 mM para producir concentraciones de sal adecuadas en la reconstitución. Sin embargo, se ha informado que la presencia de sales puede conducir a inestabilidad en la composición y así nuevamente las sales necesarias pueden omitirse de la composición y añadirse posteriormente con el tampón de rehidratación si fuera necesario. En esta realización, las sales se pueden incluir en un kit que comprende la composición y los complementos de sal necesarios.

Como alternativa, las sales, tales como las de magnesio, pueden estar presentes pero en concentraciones que son inferiores a las requeridas para su uso en la reacción, por ejemplo, a concentraciones inferiores a 500 pM. Como se describe en el documento WO2006/003439, se ha descubierto que dichas pequeñas cantidades de sales de magnesio pueden ser, de hecho, beneficiosas para dar estabilidad a la composición. En este caso, en el tampón de rehidratación se incluirán sales complementarias.

Generalmente, las composiciones utilizadas para reacciones tales como la reacción en cadena de la polimerasa, incluirán los nucleótidos que forman los bloques de construcción del producto de amplificación. Estos pueden incluir desoxi o deaza nucleótidos que contienen los nucleósidos GATC o U o sus derivados. En algunos casos, los propios nucleótidos ser etiquetarán con fluorescencia. Estos están disponibles en diversas fuentes comerciales. Estarán presentes en la composición liofilizada en una concentración que proporcionará una concentración adecuada de nucleótidos en la mezcla de reacción reconstituida a partir de ella. Esto dependerá del volumen de la composición liofilizada y del volumen final de la mezcla de reacción reconstituida a partir de ella. Típicamente, una PCR requiere una concentración de 50 pM a 8000 pM de cada nucleótido y esto puede lograrse generalmente incluyendo en la composición de la invención en forma liofilizada nucleótidos a una concentración de 0,1 a 1 mM, por ejemplo de 0,2 a 0,4 mM.

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En una realización particular, en la composición se puede incluir un compuesto bloqueante, como es convencional en las mezclas de reacción de PCR. Se cree que el compuesto bloqueante actúa impidiendo la inhibición de la PCR por interacción con las paredes del recipiente, por ejemplo, impidiendo la lixiviación de metales o el secuestro de cualquier metal que pueda lixiviarse de las paredes durante la reacción. También puede reducir la abstracción de la enzima y los nucleótidos en la pared del recipiente de reacción. La naturaleza del compuesto bloqueante dependerá de la naturaleza del recipiente destinado para llevar a cabo la reacción.

Son ejemplos particulares de compuestos bloqueantes, compuestos de recubrimiento de vidrio o compuestos bloqueantes de vidrio tales como albúmina de suero bovino (BSA), ya sea solos o en combinación con otros materiales bloqueantes tales como gelatina. La gelatina puede obtenerse de diversas fuentes entre las que se incluyen la gelatina de bovino, porcino, algas marinas (carragenina) o de pescado, como se describe en el documento WO2008155524.

Los agentes bloqueantes se incluyen adecuadamente en cantidades eficaces que dependerán del compuesto particular seleccionado. Sin embargo, para la BSA por ejemplo, la cantidad es adecuadamente suficiente para proporcionar de 0,1 a 1 mg/ml y preferentemente de aproximadamente 0,25 mg/ml en la composición de reacción final (es decir, la composición constituida para llevar a cabo la reacción química o bioquímica). Las gelatinas estarán adecuadamente presentes en una cantidad que varíe de aproximadamente 0,0025 % - 0,01 % m/v o de aproximadamente 0,0025 % - 0,01 % p/ p. Se debe tener cuidado de que la cantidad del agente bloqueante no sea lo tan alta como para inhibir significativamente la reacción final.

De manera adecuada, las composiciones también comprenden un reactivo antioxidante y/o antiMaillard. Los solicitantes han descubierto que la treonina actúa como un agente antioxidante y/o antiMaillard, particularmente eficaz y mejora la estabilidad de la composición liofilizada. Se utiliza L-o D-treonina. La treonina parece reaccionar con cualquier oxígeno producido, o como resultado de la entrada en el producto resultante y, por lo tanto, ayuda a la estabilización de la mezcla.

Asimismo, se ha descubierto que la presencia de la treonina puede estabilizar la señalización realizable con marcadores fluorescentes incluidos en la composición, en particular cuando se conserva a temperaturas elevadas.

La cantidad de treonina en la composición variará dependiendo de la naturaleza exacta de la composición. Se selecciona adecuadamente de modo que no influya en el pH de la composición, que puede ser importante en algunas reacciones químicas o bioquímicas. Sin embargo, típicamente, puede estar presente en la composición de reacción final en una cantidad de 1 a 20 mM/l, por ejemplo, a aproximadamente 5 mM/l. Como se indicó anteriormente, esto significa que, en las composiciones liofilizadas, la treonina estará presente a una concentración más alta, por ejemplo, a aproximadamente el doble de estas concentraciones.

Cuando una composición se liofiliza en presencia de un reactivo de formación de vidrio, generalmente forma una estructura tridimensional de tipo "torta". Esta estructura está sustentada opcionalmente gracias a la inclusión de un estabilizador adecuado para dar la estructura de torta, por lo que este es un componente adicional de la mezcla.

Son ejemplos de estabilizadores adecuados que pueden incluirse en la composición, los que incluyen compuestos poliméricos, tales como polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidina (PVP) y/o polisacáridos, tales como Ficoll o Dextrano. Sin embargo, en una realización particular, el estabilizador se omite o se usa a concentraciones reducidas dentro de la composición, ya que se ha descubierto que compuestos tales como PEG pueden contribuir a la inhibición de señales fluorescentes. También puede reducir la solubilidad de las composiciones globales descritas anteriormente. En el contexto de las composiciones de la presente invención, el uso de azúcares de alto peso molecular como agente de formación de vidrio significa que la cantidad de estabilizador que se utiliza en la composición final puede ser menor del 4 % M/v, por ejemplo, menor del 1 % M/v, por ejemplo, menor del 0,8 % para 0,1-0,5 % M/v, tal como de aproximadamente 0,25 % M/v. Por tanto, en las composiciones liofilizadas y en la torta, habrá típicamente menos del 2 % M/v, por ejemplo de 0,2 M/v a 1 % M/v, por ejemplo, solo aproximadamente 0,5% M/v de estabilizador

Como se mencionó anteriormente, las enzimas exactas y otros reactivos presentes, se seleccionarán dependiendo de la naturaleza particular de la reacción química o bioquímica que se esté efectuando. Estas pueden incluir reacciones llevadas a cabo en ocasiones múltiples o repetidas, tales como pruebas de diagnóstico, de exploración, reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos, etc.

Además, como se comentó anteriormente, cuando la enzima polimerasa no está "bloqueada" químicamente, o de otra manera, se pueden incorporar tecnologías alternativas de "arranque en caliente" en la composición mediante la inclusión de componentes de adición adecuados. Por ejemplo, como un componente adicional de la composición, es posible añadir un anticuerpo anti ADN polimerasa de Taq (Thermus aquaticus), tal como los disponibles en Clontech, Sigma o Invitrogen. Dichos anticuerpos se unen al sitio activo de la polimerasa y lo inactivan a temperatura ambiente para formar un conjugado de anticuerpo contra antígeno del tipo comentado anteriormente. Sin embargo, el anticuerpo se desnaturaliza y se disocia de la enzima a las temperaturas elevadas que se utilizan durante los ciclos de amplificación y, por lo tanto, la enzima se activa. La cantidad relativa de cualquier anticuerpo anti Taq que se

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incluya en la composición es adecuadamente suficiente para garantizar que es capaz de cumplir la función de inhibir la enzima de Taq hasta que se requiera. Por lo tanto, generalmente, se utilizará un exceso de anticuerpo anti Taq en comparación con la enzima de Taq. De este modo, por ejemplo, por cada unidad de enzima de Taq en la composición, se incluirán al menos 1,5 y, preferentemente, al menos 2 unidades de anticuerpo anti Taq. El anticuerpo anti Taq se vende generalmente por |jg y la concentración depende mucho de la fuente y de la calidad del anticuerpo, así como de la naturaleza del ensayo. Demasiado anticuerpo puede ser perjudicial y, en algunos ensayos, puede de hecho producir más dímero cebador. Sin embargo, la cantidad exacta de anticuerpo contra Taq se determinará según la práctica habitual y típicamente estará en el intervalo de 0,001 a 0,004 pg/l de mezcla de reacción final.

En el documento WO 02/088387 se describe otra metodología de arranque en caliente (Hot-Start) que conlleva el uso de una combinación de una cantidad inhibidora de una sal de pirofosfato para impedir que se produzca la extensión del cebador, y de una enzima pirofosfatasa que digiere este pirofosfato a temperaturas elevadas, para permitir el avance de la PCR.

En este caso, la sal de pirofosfato y la enzima pirofosfatasa se pueden incluir como componentes adicionales de la composición de la invención.

Si se requiere, la composición puede comprender otros elementos que pueden ser útiles en la reacción, tal como la PCR. Un ejemplo particular de dicho elemento puede comprender un ácido nucleico que tenga la capacidad de actuar como un control interno en la reacción de amplificación. Este ácido nucleico puede ser un ácido nucleico "homólogo" que reconocen los mismos cebadores como el ácido nucleico diana en la muestra, pero que produce un producto diferente y diferenciable, por ejemplo de un tamaño diferente. De manera alternativa, puede ser un ácido nucleico heterólogo que se amplifica mediante un conjunto diferente de cebadores, que están, en ese caso, también incluidos en la composición, para dar lugar a un producto diferente que es claramente diferenciable de la diana de amplificación. En cualquier caso, la presencia del producto de amplificación del ácido nucleico que actúa como control interno, proporcionará la confirmación de que las condiciones de amplificación han sido eficaces y que, por lo tanto, se esperaría la amplificación de la diana, caso de estar presente.

Como se indicó anteriormente, la enzima, tal como la polimerasa utilizada en la composición, puede obtenerse de diversas fuentes. Sin embargo, en general, tal como se suministra, la enzima está en forma de un reactivo húmedo que incluye una serie de excipientes entre los que se incluyen detergentes, agentes antioxidantes, antirreductores y cantidades significativas de disolvente que, generalmente, es glicerol, aunque en algunos casos, se utilizan soluciones oligosacarídicas. Por ejemplo, algunas enzimas polimerasas se suministran como una solución de glicerol al 50 %, estando presente esta última para ayudar con la congelación-descongelación llevada a cabo durante la producción de la enzima y el proceso de almacenamiento. Sin embargo, es necesario eliminar el glicerol para llevar a cabo un proceso eficaz de liofilización. Los solicitantes han descubierto que la eliminación sustancialmente completa de glicerol es beneficiosa en el proceso de liofilización, de modo que la composición carece sustancialmente de glicerol. En particular, la composición debe contener menos de 1 % v/ v de glicerol, por ejemplo, menos de 0,5 %, 0,22 %, 0,11 % o 0,01 % v/v de glicerol. Adecuadamente, la composición carece de glicerol.

La eliminación de glicerol de las preparaciones de polimerasa comerciales, puede efectuarse utilizando diversas técnicas convencionales que incluyen, por ejemplo, la separación basada en peso molecular, tal como diálisis, microfiltración utilizando una membrana o cromatografía de exclusión, por ejemplo, en una columna de Sepharose™, o separación basada en técnicas de afinidad, tales como, unión a ligando, etiquetado con histidina, o utilizando compañeros de unión específicos, tales como anticuerpos o aptámeros.

En una realización particular, para garantizar la eliminación sustancialmente completa de glicerol, se realizan una o más etapas de lavado utilizando un tampón, tal como un tampón Tris, durante o después del procedimiento de eliminación.

En esta fase, puede ser necesario volver a introducir los restantes agentes, tales como un detergente, agente antioxidante y antirreductor, que facilitan la actividad de la enzima durante la reacción ya que estos componentes pueden perderse durante dicho procedimiento de eliminación completa. En general, los reactivos específicos que adaptan una PCR a la diana particular, tales como los cebadores y cualquiera de las sondas necesarios, por ejemplo, para su uso en relación con una PCR en tiempo real, son específicos de un área de aplicación particular, tal como la investigación, y por eso se añaden cuando la composición liofilizada se reconstituye en una mezcla de reacción para su uso. Sin embargo, en muchos casos, en particular en el campo del diagnóstico, las dianas son las mismas en muchos casos, y por lo tanto, la inclusión de oligonucleótidos que actúan como sondas y cebadores en la composición liofilizada es conveniente, de modo que la composición se vuelve específica para el ensayo, lo cual es deseable para facilitar el uso.

Como alternativa, pueden prepararse individualmente una o más composiciones distintas que comprendan oligonucleótidos que actúen como sondas y/o cebadores, así como composiciones salinas o tampón, necesarias para llevar a cabo la reacción, y convenientemente estas también pueden deshidratarse. Pueden liofilizarse, pero en

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algunos casos, pueden deshidratarse utilizando otros métodos tales como secado al aire o secado por aplicación directa de calor, para provocar la evaporación del solvente (p. ej., agua, etanol), en lugar de la sublimación, como ocurre en la liofilización.

Por ejemplo, utilizando esta estrategia, tampones o sales que incluyen posibles cofactores enzimáticos, que pueden ser necesarios para la reacción final, pero que podrían ser inhibidores, por ejemplo, de la estabilidad de las polimerasas durante y después del secado, se conservarían por separado de las enzimas antes de su uso. Los ejemplos de dichos tampones o sales pueden incluir sulfato de amonio, pero como apreciará un experto, existen otros ejemplos. Un ejemplo de un cofactor enzimático que puede deshidratarse y almacenarse individualmente son los iones de magnesio o manganeso en forma de sales tales como cloruro de magnesio. Dichos cofactores enzimáticos podrían deshidratarse individualmente para formar composiciones individuales adicionales o alternativas, o convenientemente, estos se pueden incluir en la composición tampón deshidratada como una sola composición secundaria. Al mantener los componentes del tampón y/o los cofactores separados de esta manera, se suprime la actividad polimerasa de la enzima hasta que se resuspende utilizando el tampón de reconstitución, mejorando así además la estabilidad de la composición.

Antes del uso, el usuario final puede volver a hidratar dichas composiciones adicionales. Dependiendo del contenido de la composición secundaria, puede reconstituirse utilizando una solución de cualquier componente residual necesario en la reacción, por ejemplo, utilizando un cóctel de cebadores y sondas en solución que son necesarios para completar su reacción de amplificación específica, o una solución tampón de reconstitución si los componentes del tampón no están ya incluidos en la composición.

Sin embargo, en una realización particular, puede ser conveniente proporcionar composiciones de sondas y/o cebadores en forma deshidratada e individual, en particular en kits en los que puede ser necesario utilizar una sola mezcla maestra en diversas reacciones de amplificación diferentes.

En dichos casos, cuando la composición secundaria se liofiliza, puede ser conveniente, aunque no esencial, utilizar agentes de formación de vidrio similares a los descritos anteriormente. Los solicitantes han descubierto que polisacáridos tales como la estaquiosa proporcionan agentes de formación de vidrio eficaces para dichas composiciones que incluyen composiciones de oligonucleótidos como se ilustra más adelante. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un kit que comprende la composición de la invención y una composición secundaria en forma deshidratada, por ejemplo, liofilizada, comprendiendo dicha composición secundaria un reactivo, tal como un oligonucleótido útil como sonda o cebador en una reacción de amplificación de ácido nucleico y/o reactivos de tampón, tales como sales, para su uso en una reacción con dicha enzima. La composición secundaria puede comprender además estaquiosa como se describió anteriormente.

Las nuevas composiciones, tales como composiciones tampón deshidratadas, que se pueden incluir en dichos kits como dichas composiciones secundarias, forman un aspecto adicional de la invención. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición deshidratada que comprende uno o más de lo siguiente:

(i) una sal necesaria para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico;

(ii) componentes de un tampón de reconstitución útil en una reacción de amplificación;

(iii) un oligonucleótido capaz de actuar como un cebador en una reacción de amplificación de ácido nucleico; y

(iv) un oligonucleótido capaz de actuar como una sonda en una reacción de amplificación de ácido nucleico.

Como es bien sabido, cualquier oligonucleótido que se utilice en las composiciones o composiciones secundarias, como se ha descrito anteriormente, puede marcarse utilizando, por ejemplo, un marcador fluorescente. La composición puede comprender además un oligonucleótido marcado, tal como uno o más oligonucleótidos marcados con fluorescencia, útiles para controlar el progreso de una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. En la composición también pueden incluirse otros agentes fluorescentes, tales como colorantes fluorescentes intercalados, útiles en la detección de reacciones, tal como PCR en "tiempo real". En otros ensayos, tal como el ensayo Plexor®, en el proceso de monitorización se utilizan mononucleótidos fluorescentes y si la composición pretende utilizarse en dicho ensayo, los nucleótidos marcados pueden incluirse en la composición de la invención.

Las cantidades de los diversos componentes incluidos en la composición, variarán dependiendo de factores tales como la naturaleza exacta del componente particular; la naturaleza de la PCR que se pretende llevar a cabo, etc. Sin embargo, como se entenderá en la técnica, esto será determinable en cada caso utilizando protocolos y procedimientos establecidos.

Las composiciones de la invención se liofilizan adecuadamente para formar una torta deshidratada que puede distribuirse en forma de gránulos y/o perlas. En una realización particular, una composición suficiente para llevar a cabo reacciones múltiples, por ejemplo hasta 96 o 48 reacciones, se liofiliza para formar en un recipiente una sola torta grande. El recipiente debe tener un tamaño suficiente para permitir la adición de agua o disolvente suficiente para reconstituir suficiente solución para efectuar múltiples reacciones. Después, volúmenes de mezcla de reacción individuales se pueden dispensar desde el recipiente, por ejemplo, utilizando una pipeta, a los envases de reacción

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en los que se va a llevar a cabo la reacción. Dichos envases de reacción pueden incluir pocilios de placas de microtitulación.

Sin embargo, en una realización particular, las composiciones de la invención se forman en forma de solución mezclando los reactivos en agua, y después se liofilizan in situ para formar una estructura de torta.

En otra realización, la estructura de torta se puede formar a partir de dos o más capas de diferentes formulaciones de reactivo. El propósito de esto puede ser mejorar la estabilidad de la torta resultante y/o el rendimiento de la reacción final después de la disolución. La formulación activa de muchas reacciones puede comprometer la estabilidad óptima de uno o más componentes específicos. Uno o más de estos componentes pueden incluirse en una capa de reactivo distinta.

Por ejemplo, ciertos fluoróforos tienen una mayor estabilidad a pH particulares. Los derivados de fluoresceína prefieren ambientes básicos, mientras que los derivados de cianina prefieren pH neutros que no son coherentes con el intervalo óptimo de amplificación final descrito anteriormente. Por lo tanto, las tortas estándar preparadas a un pH de 8-9 comprometerían la estabilidad de los fluoróforos de cianina.

Del mismo modo, las polimerasas se pueden definir en su propia capa de modo que no estén disponibles para interaccionar con componentes de reacción específicos tales como cebadores o sondas. Esto proporcionaría un pseudo 'arranque en caliente' durante el proceso de liofilización, activándose solo la reacción resultante después de la disolución de ambas capas.

Cada capa puede contener uno o más de los reactivos de la formulación de amplificación final junto con un azúcar de formación de vidrio como se describió anteriormente, y cualquier otro excipiente tal como el estabilizador. Las capas se forman dispensando reactivos individualmente y congelando cada uno antes de dispensar el siguiente reactivo sobre el mismo. La estructura resultante de las capas congeladas se puede liofilizar. Las formulaciones exactas de cada capa se formularían para proporcionar una composición final adecuada tras la disolución conjunta, mientras se deshidrata para formar una sola estructura de torta.

En resumen por tanto, las composiciones en capas de este tipo se pueden preparar mediante un proceso que comprende (i) congelar una solución de una estaquiosa y cualquiera de uno o más de dichos componentes adicionales o dicha enzima, para formar una primera capa congelada, (ii) añadir una segunda solución de estaquiosa y un componente diferente de dichos componentes adicionales o dicha enzima y congelar la segunda solución en una capa distinta, (iii) opcionalmente repetir la etapa (ii) hasta que todos los componentes de la composición estén presentes en una de las capas congeladas y v) liofilizar la estructura resultante. La torta obtenida de esta manera también tendrá una estructura en capas, permitiendo que los componentes de la mezcla que, de alguna manera, son incompatibles, se mantengan separados en la torta para que no interaccionen significativamente antes de que la torta se disuelva para su uso.

En una realización particular, las composiciones de la invención se liofilizan en un recipiente de reacción adecuado para llevar a cabo la reacción final tal como la reacción en cadena de la polimerasa. Esto significa que las composiciones se pueden reconstituir y reaccionar en el mismo recipiente, evitando la necesidad de transferir reactivos entre los recipientes y así evitar algunos riesgos de contaminación.

Un recipiente particularmente adecuado para contener las composiciones descritas anteriormente es uno como el que se describe en la solicitud de patente británica en tramitación No. 1208808.4. Este comprende plástico térmicamente conductor que permite la transferencia rápida de energía térmica de los contenidos durante la liofilización y también la transferencia rápida de energía térmica durante los ciclos de calentamiento y enfriamiento necesarios para llevar a cabo una PCR. Dichos recipientes pueden estar en forma de tubos individuales o placas de múltiples pocillos tales como placas de microtitulación que contienen convencionalmente 96 pocillos individuales.

Por lo tanto, dichos recipientes, previamente cargados con las composiciones de la invención en forma liofilizada, se pueden almacenar, transportar y comercializar listos para su uso.

Durante su uso, la composición liofilizada se reconstituye mediante la adición de una muestra en forma líquida junto con cualquier componente que sea necesario para la reacción, pero que no esté presente en la composición como se indicó anteriormente. La solución así formada se somete después a condiciones de reacción apropiadas, que, en el caso de la PCR, es un procedimiento de termociclado.

Los métodos para preparar la composición de la invención y el uso de la misma, constituyen aspectos adicionales de la invención.

Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para preparar una composición, como se describió anteriormente, en forma liofilizada, cuyo método comprende combinar conjuntamente una enzima polimerasa, estaquiosa y, opcionalmente, uno o más de los componentes adicionales como se describió

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anteriormente, en forma de solución, y liofilizar dicha mezcla. Adecuadamente, en una etapa preliminar, el glicerol se elimina sustancialmente por completo de la enzima polimerasa utilizada como se describió anteriormente.

En una realización particular, la composición líquida se divide en múltiples recipientes de reacción, que comprenden adecuadamente un plástico térmicamente conductor como se describió anteriormente, de modo que cada recipiente contiene suficientes reactivos para llevar a cabo una sola reacción utilizando la enzima polimerasa, y se liofiliza dentro de dichos recipientes.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para llevar a cabo una reacción química o bioquímica utilizando una enzima polimerasa, comprendiendo dicho método formar una mezcla de reacción por adición de un líquido y cualquier componente de adición necesario para llevar a cabo dicha reacción, una composición como se describió anteriormente en forma liofilizada, y someter la solución así formada a condiciones de reacción adecuadas. En particular, la reacción será una reacción en cadena de la polimerasa. El uso de estaquiosa como se describió anteriormente proporciona excelentes propiedades de almacenamiento, estabilidad y disolución, de la composición liofilizada.

La invención se describirá ahora particularmente como ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad llevado a cabo en diversas soluciones de azúcar liofilizadas;

La figura 2 muestra los resultados de reacciones de PCR llevadas a cabo utilizando mezclas de reacción según la invención y una mezcla de reacción reciente no deshidratada; y

Las Figuras 3-5 muestran los resultados de reacciones de amplificación llevadas a cabo utilizando diversas enzimas de PCR que se han incorporado en composiciones según la invención.

Ejemplo 1

Preparación de las composiciones de la invención

Las composiciones liofilizadas de la invención se preparan mezclando conjuntamente los componentes necesarios para la reacción, que incluyen enzimas y opcionalmente otros componentes indicados anteriormente, con un azúcar como se definió anteriormente, tal como estaquiosa en una cantidad de formación de vidrio y una pequeña cantidad (menos de 1 % M/v y preferentemente menos de 0,5 % M/v) de un estabilizador estructural tal como PEG, como también se describió anteriormente. Cualquier enzima utilizada debe carecer sustancialmente de glicerol. En esta fase, la mezcla contendrá un disolvente y en particular agua. La cantidad de agua presente se selecciona para dar el volumen de torta deseado después de la liofilización. Específicamente, durante un proceso de liofilización, la mezcla se congela primero, lo que determina efectivamente el volumen de la torta. Durante la sublimación posterior del disolvente, el material congelado puede experimentar cierta reducción, pero generalmente conservará una proporción sustancial del volumen del material congelado. Esto es útil porque permite que se produzca una torta con un volumen adecuado. Por lo tanto, la cantidad de disolvente, tal como agua, presente en la mezcla en este momento, variará dependiendo de factores tales como la cantidad necesaria para la disolución de los componentes y el volumen de torta deseado. Típicamente, cualquier solución contiene adecuadamente menos del 50 % de agua como disolvente en comparación con la composición de reacción reconstituida final.

La solución se liofiliza después para eliminar sustancialmente toda el agua en un liofilizador utilizado según las instrucciones del fabricante. La composición liofilizada forma una torta cohesiva y maleable.

En particular, el o cada recipiente que contiene la composición liofilizada se sella en una atmósfera inerte, tal como una atmósfera de nitrógeno.

Justo antes de su uso, las composiciones liofilizadas se reconstituyen mediante la adición de un volumen de agua adecuado, que puede incluir una muestra sometida a ensayo. Después, la mezcla de reacción se procesa de la manera habitual.

Se ha descubierto que las composiciones liofilizadas de la invención son más estables durante periodos de tiempo prolongados, por ejemplo, a humedad alta antes de su uso, en comparación con los métodos publicados. También se reconstituyen más fácilmente, después de su exposición para formar mezclas de reacción activas que son extremadamente seguras en cuanto a su uso.

Ejemplo 2

Propiedades comparativas de exposición ambiental de tortas liofilizadas de diversos azúcares Se prepararon las siguientes soluciones:

A) Rafinosa al 2,5 % (m/v), PEG al 0,5 % (m/v), torta 500 pl

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10

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25

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B) Estaquiosa al 2,5 % (m/v), PEG al 0,5 % (m/v), torta 500 |jl

C) Trehalosa al 2,5 % (m/v), PEG al 0,5 % (m/v), torta 500 jl

Cada una de estas soluciones se liofilizó para formar una torta similar de 500 jl. Las tortas se almacenaron en un evaporador a aproximadamente 75 % de humedad en presencia de una solución saturada de cloruro de sodio a temperatura ambiente. La estabilidad de las tortas a lo largo del tiempo se controló y los resultados muestran que la composición de estaquiosa (B) conservó la estabilidad mejor que las dos composiciones (A) y (C).

El experimento se repitió utilizando tortas ligeramente más grandes (525 jl). Los materiales se colocaron en viales de liofilización fabricados de vidrio y después se deshidrataron utilizando un liofilizador Virtis Advantage +, en funcionamiento con un ciclo de liofilización que comprendía una etapa de tratamiento térmico, una etapa de deshidratación primaria y una etapa de mantenimiento posterior, como se resume en las siguientes tablas:

Tratamiento térmico

Etapa N°

Temp °C Tiempo (minutos) Aumento/Mantenimiento

1

10 15 Mantenimiento

2

-45 110 Aumento

3

-45 120 Mantenimiento

Deshidratación primaria

Etapa N°

Temp °C Tiempo (minutos) Vacío Aumento/Espera

1

-45 900 100 Mantenimiento

2

0 120 100 Aumento

3

0 60 100 Mantenimiento

4

20 50 100 Aumento

5

20 120 100 Mantenimiento

Mantenimiento posterior

Temp °C

Tiempo (minutos) Vacío

20

1000 100

Temperatura del condensador: -55 °C Punto de ajuste secundario: 45 °C

Para producir un entorno de humedad relativa de aproximada 75 %, un jarro con forma de campana se llenó con una solución saturada de cloruro de sodio a temperatura ambiente. Los tapones de los tres viales de liofilización se retiraron inmediatamente antes de cerrar y colocar en dicho jarro. La hidratación de las tortas se filmó con fotografía de lapso temporal.

Los resultados se muestran en la Figura 1. Estos muestran que la torta de estaquiosa (B) fue resistente al colapso y muestra una alteración marginal en la estructura de la torta en el período de tiempo del experimento (n80 minutos). La torta de rafinosa (A) mostró un colapso casi completo después n65 minutos. La torta de trehalosa (C) mostró un colapso de aproximadamente 50 % al final del experimento (D80 minutos).

Como resultado, la estaquiosa parece proporcionar una composición liofilizada más estable que la rafinosa o la trehalosa.

Ejemplo 3

Generación y prueba de una mezcla maestra de PCR liofilizada

Este ejemplo ilustra la generación de una preparación de mezcla maestra principal liofilizada según la invención. Esto incluye el uso de una polimerasa dependiente de ADN polimerasa de Taq de inicio en caliente, modificada químicamente, en una composición tampón adecuada deshidratada en un vial de liofilización de vidrio.

Ejemplo de composición de mezcla maestra liofilizada:

Reactivo

Concentración de la torta (2x) Concentración final (1x)

Tris

20m M 10 mM

MgCl2

6mM 3 mM

BSA

500ng / jl 250 ng/jl

dNTP con dUTP diversos

0,4 mM 0,2 mM

Estaquiosa

2,5 % 1,25 %

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Reactivo

Concentración de la torta (2x) Concentración final (1x)

PEG

0,5 % 0,25 %

TAQ polimerasa

0,08 U/pl 0,04 U/pl

aditivo TAQ *

= 0,08 U/pl = 0,04 U/pl

* El aditivo TAQ es una mezcla de detergente que puede obtenerse en Fluorogenics Ltd.

Se preparó una torta que comprendía los componentes anteriores y se liofilizó en un liofilizador Virtis Advantage + utilizando el programa descrito en el Ejemplo 2 para crear un producto liofilizado activo que tenía una concentración final como se detalla anteriormente.

La mezcla liofilizada resultante se reconstituyó mediante la adición de diversas concentraciones de agua como se detalla a continuación y se utilizó para amplificar un ADN diana (derivado del bacteriófago A) utilizando cebadores personalizados en combinación con el colorante de unión a ADN SYBR®Green-1 hasta una concentración final de 1: 10.000 de solución de referencia. La mezcla se amplificó en el termociclador Genie utilizando:

Parámetros de PCR

• Desnaturalización a 95 °C durante 900 segundos

• Amplificación a 95 °C durante 20 segundos 55 °C durante 20 segundos

74 °C durante 20 segundos, Lectura óptica X5 45 Ciclos

• Fusión a 50 °C durante 20 segundos

95 °C durante 10 segundos, lectura continua -1 Velocidad = 0,1 °C /segundo

La mezcla resultante se utilizó para amplificar un ADN diana (derivado del bacteriófago A) utilizando cebadores personalizados en combinación con el colorante de unión a ADN SYBR®Green - 1 hasta una concentración final de 1: 10.000 de solución de referencia. Los datos (Figura 2) muestran tres diluciones de factor 10 (marcadas 105, 104 y 103) de molde y un control sin molde en amplificaciones duplicadas. Las líneas continuas son reacciones preparadas utilizando la mezcla maestra liofilizada. La línea discontinua muestra la misma formulación preparada como un control no liofilizado.

Los resultados, que son sustancialmente equivalentes, muestran que la estaquiosa ha protegido la actividad de los componentes activos a través del proceso de liofilización.

Ejemplo 4

Preparación y uso de un kit de composición de dos partes

Se preparó una mezcla maestra de PCR principal liofilizada según la invención, y también se preparó una segunda composición que comprendía una mezcla liofilizada de cebador y sonda. La enzima de Taq utilizada en este ejemplo era una polimerasa dependiente de ADN de Taq de arranque en caliente mediada por anticuerpo anti Taq en una composición tampón adecuada, disponible en Promega (Estados unidos).

Receta de sonda y cebador (formulación de torta 2X), deshidratada a un volumen final de 12,5 pl.

REACTIVO

CONCENTRACIÓN DE LA TORTA (2x) Unidades

HSV 1 F

1 uM

HSV 1 R

1 uM

HSV 1 P

0,4 uM

HSV 2 F

1, uM

HSV 2 R

1,8 uM

HSV 2 P

0,8 uM

Trizma

2 mM

ESTAQUIOSA

2,5 % M/V

PEG

0,5 % M/V

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Receta de mezcla maestra (formulación de torta 2.5X) deshidratada a un volumen final de a 5jl (1x).

REACTIVO

CONCENTRACIÓN DE LA TORTA (2,5 x)

MgCl2

10 mMol/l

BSA

625 mg/l

dUTP diversos (mezcla de dUTP/dNTP)

0,5 mMol/l

Taq

100000 UNIDADES/l

Trizma

25 mMol/l

ESTAQUIOSA

2,5 % (M/v)

PEG

0,5 % (M/v)

Ambas composiciones se liofilizaron como se describe en el Ejemplo 2, pero en distintos recipientes de estilo micro- amp.

Las composiciones resultantes se utilizaron para amplificar un ADN diana (derivado de HSV 1 y 2) utilizando cebadores personalizados en combinación con sondas fluorogénicas doblemente marcadas para cada diana utilizando el proceso de ensayo de 5' nucleasa.

Los recipientes con sonda y cebador se resuspendieron en 12,5 jl de agua a la que se añadieron y se mezclaron 12, 5 jl de molde o agua (para controles sin amplificación). Se transfirieron 12,5 jl al recipiente de mezcla maestra principal y se mezclaron antes de transferirlos a una placa ECO. La mezcla se amplificó en el termociclador ECO de Illumina utilizando los siguientes parámetros:

Parámetros de PCR

• Desnaturalización a 98 °C durante 600 segundos

• Amplificación a 95 °C durante 5 segundos

62 °C 35 segundos, lectura óptica en canales FAM y HEX 45 Ciclos

Los resultados se muestran en la Figura 3 e ilustran la amplificación eficaz de los dos moldes analizados.

Ejemplo 5

Generación y análisis de otras mezclas de reacción de PCR liofilizadas

Este ejemplo ilustra la generación y el uso de preparaciones de mezclas maestras principales liofilizadas según la invención.

Una primera mezcla maestra incluía como enzima una ADN polimerasa recombinante de alta fidelidad dependiente de ADN de Pfu (Pyrococcus furiosus) en una composición tampón adecuada.

Reactivo

Concentración de la torta (2X) Concentración final

Trizma

20m M 10mM

BSA

500 ng/jl 250 ng / jl

dUTP/dNTP

0,4 mM 0,2 mM

enzima de Pfu

0,04 U/jl 0,02 U / jl

ESTAQUIOSA

2,5 % 1.25%

PEG

0,5 % 0,25 %

La composición se liofilizó como se describe en el Ejemplo 2 en un vial de liofilización de vidrio. La mezcla resultante se resuspendió en tampón de resuspensión que fue capaz de proporcionar disolución y una mezcla de reacción de PCR completa activa. Después, esta mezcla se utilizó para amplificar un ADN diana (derivado del bacteriófago A) utilizando cebadores personalizados en combinación con el colorante de unión a ADN SYBR®Green-1 hasta una concentración final de 1: 10.000 de solución de referencia. La mezcla se amplificó en el termociclador Genie utilizando:

Parámetros de PCR

• Desnaturalización a 98 °C durante 30 segundos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

• Amplificación a 98 °C durante 10 segundos

55 °C 30 segundos 72 °C 30 segundos, lectura óptica X5 45 Ciclos

• Fusión a 50 °C durante 20 segundos

95 °C durante 10 segundos, lectura continua -1 Velocidad = 0,1 °C/segundo

Los datos muestran tres diluciones de factor 10 (marcadas 105, 104 y 103) de molde y un control sin molde en amplificaciones duplicadas. Los resultados ilustrados en la Figura 4 muestran amplificación eficaz en todas las concentraciones de molde diana analizadas.

En un segundo experimento, como molde se utilizó una polimerasa dependiente de ADN polimerasa de Taq de inicio en caliente, modificada químicamente, en combinación con una ADN RNasa H-polimerasa dependiente de ARN de MMuLV termoestable. Esto se combinó con otros reactivos que incluían sales y concentraciones apropiadas de estaquiosa para formar una mezcla maestra de PCR. Esto se deshidrató en un vial de liofilización de vidrio utilizando un método como se describe en el Ejemplo 2.

La mezcla resultante se utilizó para amplificar un ARN diana (derivado de ARN 18s de rata) utilizando cebadores personalizados en combinación con sondas fluorogénicas doblemente marcadas para cada diana utilizando el procedimiento de ensayo de 5' nucleasa. La mezcla se amplificó en el termociclador Genie utilizando:

Parámetros de PCR

• Etapa de RT a 48 °C durante 600 segundos

• Desnaturalización a 95 °C durante 900 segundos

• Amplificación a 95 °C durante 20 segundos

60 °C durante 60 segundos, lectura óptica X10 45 Ciclos

Las amplificaciones se llevaron a cabo en tres diluciones de factor 10 (marcadas a 4,5 ng (por reacción), 0,45 ng (por reacción), 0,045 ng (por reacción) de molde y un control sin molde en amplificaciones duplicadas. Los resultados se muestran en la Figura 5 Las líneas continuas son reacciones preparadas utilizando mezcla maestra liofilizada. La línea discontinua muestra un control comercial 2x de mezcla maestra (no liofilizada). Los resultados son sustancialmente equivalentes.

Ejemplo 6

Composiciones alternativas distintas

Como se describió anteriormente, una realización de la invención incluye el uso de una mezcla maestra de PCR principal liofilizada con un tampón de resuspensión liofilizado, que forma una segunda composición. Este tampón de resuspensión también puede liofilizarse utilizando el mismo procedimiento de liofilización que el de la mezcla maestra de PCR, pero en un vial distinto (aunque pueden utilizarse técnicas de deshidratación alternativas como se describió anteriormente). Esto significa que las sales necesarias para la composición tampón en la reacción final, pero que podrían ser inhibitorias, por ejemplo, para la estabilidad de las polimerasas durante y después de la deshidratación, se mantendrán alejadas de las enzimas hasta que se requiera. Asimismo, algunos de los cofactores enzimáticos, que en este caso son iones de magnesio en forma de cloruro de magnesio, pueden deshidratarse en este tampón.

Esto se ilustra aquí mediante un ejemplo del uso de una mezcla maestra liofilizada de polimerasa dependiente de ADN de Taq de arranque en caliente mediada con anticuerpo anti Taq para su uso en combinación con el tampón de reconstitución. La mezcla de tampón de reconstitución y la maestra de PCR liofilizada se deshidrata utilizando el mismo procedimiento pero en recipientes distintos.

Receta de torta en tampón de reconstitución (formulación de la torta 2X), deshidratada a un volumen final de 12,5 pl.

REACTIVO

CONCENTRACIÓN DE LA TORTA (2x)

Cloruro de magnesio

4 mMol/l

Sulfato de amonio

20 mMol/l

Cloruro de potasio

20 mMol/l

ESTAQUIOSA

2,5 % M/V

PEG

0,5 % M/V

Receta de mezcla maestra de PCR (formulación de la torta 2X) deshidratada a un volumen final de 12,5 |jl (2x). La reacción de PCR final sería de 25 jl.

REACTIVO

CONCENTRACIÓN DE LA TORTA (2 x)

MgCl2

6 mMol/l

BSA

500 mg/l

dUTP diversos (mezcla de dUTP/dNTP)

0,4 mMol/l

Taq

80000 UNIDADES/L

Trizma

20 mMol/l

ESTAQUIOSA

2,5 % (M/v)

PEG

0,5 % (M/v)

5

Las dos composiciones deshidratadas distintas como se expone anteriormente, se pueden recoger juntas en un kit.

Son posibles diversos regímenes de reconstitución y permutaciones de solutos. Por ejemplo, en una primera realización, la torta de tampón de reconstitución se resuspende utilizando solo agua hasta una composición 2x. La 10 mezcla resultante se utiliza para efectuar la disolución de la mezcla maestra liofilizada en una solución 2x. La solución completa formará una mezcla 2x que se puede diluir adicionalmente con cebadores, sondas y molde para llevar a cabo una PCR.

Como alternativa, la torta de tampón de reconstitución se resuspende utilizando un cóctel de cebador-sonda en una 15 composición 2x. La mezcla resultante se utiliza para efectuar la disolución de la mezcla maestra liofilizada en una solución 2x. La solución completa formará una mezcla 2x que se puede diluir adicionalmente con molde para llevar a cabo una PCR.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. El uso de estaquiosa como agente de formación de vidrio para la liofilización de una mezcla de reacción que comprende una polimerasa
2. 2. Una composición deshidratada que comprende:

   (i) una polimerasa; y

   (ii) estaquiosa.
3. 3. La composición según la reivindicación 2, que está en forma liofilizada.
4. 4. La composición según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que la enzima polimerasa es una polimerasa termoestable, y/o es una transcriptasa inversa o está modificada químicamente o bloqueada de modo que está inactivada hasta que se somete a una etapa de termoactivación inicial.
5. 5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende un extracto de producto natural que contiene estaquiosa en una cantidad de al menos 50 % p/p.
6. 6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que es para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa y que además comprende al menos uno de los siguientes puntos:

   (i) un tampón;

   (ii) una sal metálica;

   (iii) nucleótidos que pueden marcarse con fluorescencia;

   (iv) un compuesto bloqueante;

   (v) un reactivo antioxidante y/o antiMaillard;

   (vi) un cebador útil en una reacción en cadena de la polimerasa que opcionalmente está marcado con un marcador fluorescente;

   (vii) una sonda útil en la detección de una reacción en cadena de la polimerasa que opcionalmente está marcada con uno o más marcadores fluorescentes;

   (viii) un colorante fluorescente;

   (ix) un anticuerpo anti Taq que se une al sitio activo de la polimerasa y lo inactiva a temperatura ambiente, pero que se desnaturaliza y se disocia de la enzima a temperaturas elevadas;

   (x) una sal de pirofosfato y la enzima pirofosfatasa;

   (xi) un ácido nucleico que puede actuar como un control interno para una reacción de amplificación; y

   (xii) un cebador que puede amplificar un ácido nucleico del punto (xi).
7. 7. Una composición según la reivindicación 6, que está en forma de una torta liofilizada y en la que al menos uno de dichos reactivos adicionales está comprendido en una capa distinta en la torta.
8. 8. Un kit que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, y una segunda composición que comprende un reactivo para su uso en una reacción con dicha enzima.
9. 9. Un kit según la reivindicación 8, en el que la segunda composición está en forma liofilizada.
10. 10. Un kit según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la segunda composición comprende estaquiosa y una mezcla de reacción para su uso en una reacción con dicha enzima.
11. 11. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la segunda composición comprende un oligonucleótido útil como sonda o cebador en una reacción de amplificación de ácido nucleico o una composición de sal o tampón útil en una reacción de amplificación de ácido nucleico.
12. 12. Un método para preparar una composición en forma liofilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, cuyo método comprende combinar conjuntamente, en forma de solución, una polimerasa, estaquiosa y, opcionalmente, uno o más de los componentes adicionales definidos en la reivindicación 6, y liofilizar dicha mezcla.
13. 13. Un método según la reivindicación 12, que comprende uno o más componentes adicionales y en el que el método comprende (i) congelar una solución de estaquiosa y cualquiera de uno o más de dichos componentes adicionales o dicha enzima, para formar una primera capa congelada, (ii) añadir un segunda solución de estaquiosa y uno de dichos componentes adicionales diferentes o dicha enzima y congelar la segunda solución en una capa distinta, (iii) repetir opcionalmente la etapa (ii) hasta que todos los componentes de la composición estén presentes en una de las capas congeladas y (v) liofilizar la estructura resultante.
14. 14. Un método según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la composición líquida se divide en múltiples recipientes de reacción, de manera que cada recipiente contenga suficientes reactivos para llevar a cabo una sola reacción utilizando la enzima polimerasa, y se liofiliza en dichos recipientes.

    5 15. Un método para llevar a cabo una reacción química o bioquímica, tal como una reacción en cadena de la

    polimerasa, utilizando una enzima polimerasa, comprendiendo dicho método la formación de una mezcla de reacción por adición, a una composición en forma liofilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, de un líquido y de cualquiera de los componentes de adición necesarios para llevar a cabo dicha reacción, y someter la solución así formada a condiciones de reacción adecuadas.

    10