ES2670532T3 - Tripsinógeno humano con una autoactivación reducida y su uso en un inmunoensayo - Google Patents

Tripsinógeno humano con una autoactivación reducida y su uso en un inmunoensayo Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que tiene al menos una identidad en la secuencia del 90 % con el polipéptido de la SEQ ID NO 03, y que comprende las sustituciones: - el residuo de aminoácido E64 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva, - el residuo de aminoácido K123 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática y - los residuos de aminoácido Y139 y D147 son sustituidos por un residuo de glutamina o de asparagina, y en el que dicho polipéptido está caracterizado por que: - un residuo de aminoácido seleccionado entre E16, E17 y/o E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y/o - el residuo de aminoácido N18 es sustituido por un residuo de histidina, y/o - el residuo de aminoácido R107 es sustituido por un residuo de lisina, y/o - el residuo de aminoácido D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina, y en el que * las posiciones de las sustituciones de aminoácido se refieren a la secuencia de aminoácidos del tripsinógeno 1 natural humano según la SEQ ID NO: 3; * dicho polipéptido es escindible en un polipéptido que tiene una actividad enzimática similar a la natural cuando se compara con la tripsina 1 humana; y * dicho polipéptido no muestra una autoactivación significativa.

Description

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DESCRIPCION
Tripsinógeno humano con una autoactivación reducida y su uso en un inmunoensayo
El tripsinógeno humano (PRSS1) es el precursor inactivo de la enzima tripsina. La enteropeptidasa humana activa el tripsinógeno mediante la escisión de un péptido de activación. Sin embargo, la tripsina o incluso el tripsinógeno también pueden escindir este péptido de activación del tripsinógeno, de forma que el tripsinógeno puede ser activado incluso por mínimas cantidades de tripsina activa o por el propio tripsinógeno. Este proceso se denomina autoactivación.
Una aplicación del tripsinógeno se refiere a ensayos de tipo ELISA, en los que la enteropeptidasa es acoplada covalentemente a un anticuerpo y activa el tripsinógeno inactivo en tripsina activa. Entonces la tripsina escinde una molécula de colorante acoplada por FRET (transferencia de energía por resonancia de Forster) portadora de un péptido más o menos en el sitio de escisión, dando lugar a un cambio en la señal óptica del colorante. La anteriormente mencionada autoactivación del tripsinógeno puede provocar una señal de fondo, que afecta negativamente al límite de detección, al intervalo lineal, etc. Por lo tanto, sería deseable una disminución en la autoactivación del tripsinógeno.
El registro de la base de datos TRY_1, Uniprot: PO7477 & MITSURU E ET AL: "Cloning, characterization and nucleotide sequences of two cDNAs encoding human pancreatic trypsinogens", GENE, ELSEVIER, ÁMSTERDAM, NL, val. 41, n°2-3, 1 de enero de 1986, divulga la secuencia del TRYl humano, tripsinógeno catiónico o tripsinógeno 1. En el registro de la base de datos se hace referencia a numerosos mutantes, tales como mutaciones en la posición 122 del TRP1, la R122C, y mutaciones en la posición 79, a saber, la E79K.
P. SIMON: "Hereditary Pancreatitis Caused by a Novel PRSS1 Mutation (Arg-122 right-arrow Cys) That Alters Autoactivation and Autodegradation of Cationic Trypsinogen", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTrY, vol. 277, n° 7, 8 de febrero de 2002 (2002-02-08), páginas 5404-541002, desvela que el mutante R122C del tripsinógeno humano era más resistente a la autolisis que el natural y se autoactivaba más rápidamente a pH 8. Las tripsinas Cys 122 e His 122 eran expresadas de forma recombinante en E. coli.
El documento EP2045321 desvela variantes de proteasas de serina, incluyendo algunas variantes de la tripsina catiónica humana que tiene sustituciones de aminoácidos que incluyen el E de la posición 56 por G o R, la R de la posición 99 por H, la K de la posición 115 por M, la Y de la posición 131 por F, N o H, y el D de la posición 139 por N.
Las isoformas o los precursores de tipo tripsina 1 con unas elevadas identidades con los polipéptidos de la SEQ ID NO: 1 o 3 de la presente solicitud se conocen, por ejemplo, a partir de Pan troglodytes (véase la URL:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP001160583); Pongo abelii (véase la
URL:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP0028186171) y Macaca mulatta (véase la URL:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001040586).
TEICH ET AL: "Hereditary chronic pancreatitis", BAILLIERE'S BEST PRACTICE AND RESEARCH. CLINICAL GASTROENTEROLOGY, BAILLIERE TINDALL, LONDRES, US, val. 22, n° 1, 17 de enero de 2008, páginas 115130 desvelan mutaciones en el PRSS1 asociadas con pancreatitis; la mayoría de estas aumentan la conversión autocatalítica del tripsinógeno en tripsina activa. Algunas mutaciones incluyen la A16V, la O22G, la K23R, la N291, la N29T, la R122C. Se divulga una caracterización bioquímica de las mutaciones R122H y N291 usando tripsinógeno recombinante. La R122H da como resultado un aumento en la estabilidad y una autoactivación. La N291 aumenta la autoactivación del tripsinógeno.
THOMAS ZAUNER ET AL: "Highly Adaptable and Sensitive Protease Assay Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer", ANALYTICAL cHeMISTRY, val. 83, n° 19, 5 de septiembre de 2011, páginas 7356-7363, notifican el establecimiento de un ensayo simple de proteasa por transferencia de la energía de resonancia de fluorescencia (pro-FRET) para la determinación de las actividades de proteasa. En resumen, este ensayo se basa en la escisión de un sustrato peptídico de FRET, que da como resultado un drástico aumento en la fluorescencia del donante. Este ensayo era muy sensible y rápido para ambas proteasas.
El objetivo de la presente invención es proporcionar medios y métodos para la determinación o la cuantificación de un analito con un aumento en el límite de detección o de cuantificación, particularmente mediante una disminución en la autoactivación del tripsinógeno.
El objetivo se alcanza mediante el asunto en cuestión de las reivindicaciones independientes de la presente invención.
La presente invención se basa en el hallazgo de que una modificación en la superficie del tripsinógeno humano puede dar lugar a la creación de una variante del tripsinógeno humano con una menor autoactivación. Particularmente, esta variante o mutante (tripsinógeno supercargado [sc]) se basa en unas cargas superficiales
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modificadas en el sitio de la secuencia de activación. Este sitio está alejado del bolsillo de unión del sustrato para evitar cualquier efecto no deseado sobre la especificidad de sustrato.
Sin desear estar ligados a ninguna teoría, los inventores creen que la modificación de la carga superficial del tripsinógeno impide la unión de otra molécula de tripsinógeno, o de una tripsina, en el sitio de activación del tripsinógeno debido a la repulsión electrostática entre el tripsinógeno y la tripsina.
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 90 % en la secuencia con el polipéptido de la SEQ ID NO 03, en el que el polipéptido comprende las sustituciones: el residuo de aminoácido E64 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva, particularmente un residuo de lisina o de arginina; el residuo de aminoácido K123 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, los residuos de aminoácido Y139 y/o D147 son sustituidos por un residuo de glutamina o de asparagina, y en el que el polipéptido se caracteriza adicionalmente por que un residuo de aminoácido seleccionado entre E16, E17 y/o E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y/o el residuo de aminoácido N18 es sustituido por un residuo de histidina, y/o el residuo de aminoácido R107 es sustituido por un residuo de lisina, y/o el residuo de aminoácido D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina, y en el que las posiciones de las sustituciones de aminoácido se refieren a la secuencia de aminoácidos del tripsinógeno 1 natural humano según la SEQ ID NO: 3; dicho polipéptido es escindible en un polipéptido que tiene una actividad similar a la natural cuando se compara con la tripsina 1
humana, que es la forma madura del tripsinógeno 1 humano (SEQ ID NO 3), dicho polipéptido no muestra una
autoactivación significativa.
Una actividad enzimática similar a la natural en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una
actividad enzimática que iguala en al menos el 80 %, el 90 % o el 95 % a la actividad enzimática de la tripsina
natural humana, particularmente con una especificidad de sustrato similar cuando se compara con la tripsina natural humana.
En algunas realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
En algunas realizaciones, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
En algunas realizaciones, el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, la R107 es sustituida por un residuo de lisina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, todos los E16, E17 y E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
En algunas realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas
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realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas
realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que
comprende una cadena lateral alifática y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E142 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E142 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas
realizaciones, el E142 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que
comprende una cadena lateral alifática y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina y el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina y el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina y el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva y el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, el D138 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva y el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
En algunas realizaciones, el E16, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina. En algunas realizaciones, el E16, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina.
En algunas realizaciones, el E16, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E142 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E142 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un
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En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva y el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva y el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
En algunas realizaciones, el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E17 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina y el E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática. En algunas realizaciones, el E16 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la R107 es sustituida por un residuo de lisina, el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina, y la N18 es sustituida por un residuo de histidina.
En algunas realizaciones, el E16, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, y la R107 es sustituida por un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el E16, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E16 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, sustituida por un residuo de lisina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E16 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, sustituida por un residuo de lisina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E142 y el E17 son cada uno independientemente sustituidos por un aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la N18 es sustituida por un residuo de histidina, sustituida por un residuo de lisina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el E16, el E17 y el E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, la R107 es sustituida por un residuo de lisina y el D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en, o comprende, una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por una sustitución de aminoácido seleccionada entre la E16A, la E17A, la N18H, la E64K, la R107K, la K123L, la D138K, la Y139N, la E142L y la D147N.
Una sustitución de aminoácido E16A en el contexto de la presente memoria descriptiva significa que el residuo de glutamato en la posición 16 en la secuencia de aminoácidos del tripsinógeno 1 natural humano (SEQ ID NO 3) es sustituido por un residuo de alanina. Esto debe aplicarse igualmente a las otras sustituciones de aminoácido descritas anteriormente.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por una sustitución de aminoácido seleccionada entre la E16A, la E17A, la N18H, la D138K, la E142L y la R107K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A y E17A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A y E142L. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A y E142L.
residuo de la R107 es
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En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E142L y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E142L y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E142L y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido R107K y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A y E142L.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E142L y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E142L y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E142L y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A, E142L y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A, E142L y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza
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adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A, E142L y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K y E16A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K y E17A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K y E142L. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K yD138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido R107K, D138K y E16A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido R107K, D138K y E17A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido R107K, D138K y E142L.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, D138K y E16A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, D138K y E17A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, D138K y E142L.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, E142L y N18H. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, E142L y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, E142L y D138k.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, N18h y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, N18H y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E142L, N18H y R107k. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E142L, N18H y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A, E142L, N18H y R107K. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A, E142L, N18H y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K, D138K y E16a. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L,
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Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K, D138K y El7A. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido e64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido N18H, R107K, D138K y E142L.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, R107K, D138K y E17a. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, R107K, D138K y E142L. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, R107K, D138K y N18H.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, E142L, N18H y R107k. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64K, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, E142L, N18H y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, N18H, R107K y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E142L, N18H, R107K y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E17A, E142L, N18H, R107K y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E64k, K123L, Y139N y D147N, y en el que la variante se caracteriza adicionalmente por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, E142L, R107K y D138K.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano que se caracteriza por las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, N18H, E64K, R107K, K123L, D138K, Y139N, E142L y D147N.
En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en una variante del tripsinógeno 1 humano (SEQ ID NO 3) que muestra una identidad en la secuencia de al menos el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 95 % con el tripsinógeno 1 humano (SEQ ID NO 03).
En una realización, el polipéptido consiste en una variante caracterizada por la SEQ ID NO 01.
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos, en la que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido según el primer aspecto de la invención.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos consiste en, o comprende, la SEQ ID NO 02 o la SEQ ID NO 18.
Cuando se hace referencia en el presente documento a un polipéptido caracterizado por una secuencia en particular, se entiende que dicha referencia también engloba los polipéptidos que tienen una función idéntica a la secuencia en particular, y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente, y que muestra una identidad en la secuencia de al menos el 90 % o el 95 % con esa secuencia en concreto.
Asimismo, cuando se hace referencia en el presente documento a una secuencia de ácidos nucleicos caracterizada por una secuencia en particular, se entiende que dicha referencia también engloba las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que tienen una función idéntica a la del polipéptido codificado por la secuencia en particular, y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente.
En el contexto de las presentes especificaciones, los términos “identidad en la secuencia” y “porcentaje de identidad en la secuencia” se refieren a los valores determinados mediante la comparación de dos secuencias alineadas. Los métodos de alineación de las secuencias para su comparación son bien conocidos en la materia. La alineación de secuencias para su comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y
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Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 2444 (1988) o mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Salvo que se indique de otro modo, los valores de la identidad en la secuencia proporcionados en el presente documento se refieren al valor obtenido usando el conjunto de programas informáticos BLAST usando los parámetros por defecto (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). El soporte lógico para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible al público, por ejemplo, a través del National Center for Biotechnology-Information (
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Un ejemplo para la comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP, que usa los parámetros por defecto tales como: umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 3; coincidencias máximas en un intervalo de interrogación: 0; Matriz: BLOSUM62; coste por hueco: existencia 11, extensión 1; ajustes de la composición: ajuste de la matriz de puntuación de la composición condicional. Uno de dichos ejemplos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos es el algoritmo BLASTN, que usa los parámetros por defecto: umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 28; coincidencias máximas en un intervalo de interrogación: 0; puntuaciones de coincidencia/no coincidencia: 1.-2; coste por hueco: lineal
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según el segundo aspecto de la invención.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos es un transgen para la célula hospedadora.
El término “transgen” en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que ha sido transferida a la célula hospedadora desde otro organismo.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos está comprendida en un vector operable en la célula hospedadora.
En algunas realizaciones, el vector consiste en, o comprende, una secuencia de ácidos nucleicos caracterizada por la SEQ ID NO 18.
El término “vector operable en la célula hospedadora” en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula de ADN que puede ser usada como vehículo para transportar una secuencia de ácidos nucleicos foránea en la célula hospedadora, en el que dicha molécula de ADN puede ser replicada en la célula hospedadora y en el que la secuencia de ácidos nucleicos foránea comprendida en la molécula de ADN puede ser expresada en la célula hospedadora.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora se selecciona entre el grupo formado por un miembro del género Escherichia tal como E. coli, un miembro del género Saccharomyces tal como S. cerevisiae, un miembro del género Schizosaccharomyces tal como S. pombe, un miembro del género Pichia tal como P. pastoris, un miembro del género Aspergillus tal como A. niger, un miembro del género Bacillus tal como B. subtilis y una célula de mamífero en un cultivo celular, tal como una célula CHO (de ovario de hámster chino) o una célula HEK (de riñón embrionario humano) 293.
Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para la elaboración de un polipéptido según el primer aspecto de la invención, en el que el método comprende el uso de una célula hospedadora según el cuarto aspecto de la invención.
En algunas realizaciones, el método comprende:
- una etapa de propagación, en la que se propaga la célula hospedadora, y
- una etapa de expresión, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es expresada en la célula hospedadora, produciendo un polipéptido según el primer aspecto de la invención.
El polipéptido puede estar ubicado intracelularmente, o puede ser transportado al periplasma o el espacio extracelular, particularmente mediante el uso de un péptido de señalización N- o C-terminal unido al polipéptido.
Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para la cuantificación de un analito, en el que el método comprende las etapas de:
- proporcionar un volumen de reacción,
- añadir al volumen de reacción en una primera etapa, un analito y un primer ligando que es capaz de unirse específicamente al analito con una constante de disociación igual o inferior a 10-6 mol/l, 10-7 mol/l, 10-8 mol/l o 10' 9 mol/l,
- añadir al volumen de reacción en una segunda etapa un segundo ligando capaz de unirse específicamente al primer ligando con una constante de disociación igual o inferior a 10-6 mol/l, 10-7 mol/l, 10-8 mol/l o 10-9 mol/l, en el que el segundo ligando comprende un primer polipéptido que tiene una actividad proteolítica,
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- añadir al volumen de reacción, en una tercera etapa, un polipéptido precursor, en el que el polipéptido precursor es escindible por el primer polipéptido en un segundo polipéptido y un sustrato peptídico del segundo polipéptido que comprende un primer compañero de FRET luminiscente y un segundo compañero de FRET, en el que el primer compañero de FRET y el segundo compañero de FRET son capaces de interactuar de tal forma que la señal luminiscente del primer compañero de FRET cambia con la aproximación espacial del primer compañero de FRET y el segundo compañero de FRET, y en el que el sustrato peptídico es escindible por el segundo polipéptido entre el primer compañero de FRET y el segundo compañero de FRET, en el que la escisión del sustrato peptídico da lugar a un cambio en la aproximación espacial del primer y el segundo compañero de FRET,
- la cuantificación de la cantidad de analito mediante la medición de la luminiscencia del primer compañero de FRET y/o del segundo compañero de FRET,
caracterizado por que el polipéptido precursor es un polipéptido según el primer aspecto de la invención.
El término “un primer polipéptido que tiene una actividad proteolítica” se refiere particularmente a una proteasa o a un polipéptido que comprende dicha proteasa, en el que el polipéptido precursor es un sustrato de la proteasa y en el que particularmente la proteasa escinde el polipéptido precursor en un péptido de activación y el segundo polipéptido.
El término “sustrato peptídico escindible por el segundo polipéptido entre el primer compañero de FRET y el segundo compañero de FRET” significa particularmente que el sustrato peptídico es un sustrato del segundo polipéptido, y que el primer compañero de FRET está unido a un primer residuo de aminoácido del sustrato peptídico, y el segundo compañero de FRET está unido a un segundo residuo de aminoácido del sustrato peptídico, en el que el primer residuo de aminoácido y el segundo residuo de aminoácido están conectados por al menos un enlace peptídico, y en el que este enlace peptídico específicamente es escindido por el segundo polipéptido.
El término “sustrato” en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere particularmente a un compuesto que está unido a, y es convertido por, una enzima, por ejemplo, una proteasa, particularmente mediante el primer polipéptido o el segundo polipéptido descrito anteriormente, con una Km no mayor de 100 mmol/l, de 50 mmol/l, de 20 mmol/l, de 10 mmol/l, de 5 mmol/l, de 1 mmol/l de o de 0,1 mmol/l.
Una ventaja del uso del polipéptido según la invención es que, debido a la disminución en la autoactivación del polipéptido, la señal de fondo del método de la invención disminuye, dando como resultado una reducción en el límite de detección o de cuantificación.
Un ligando según cualquier aspecto o realización de la invención puede ser cualquier molécula que se une a una molécula objetivo o analito con una elevada afinidad y especificidad. Dicho ligando puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula similar a un anticuerpo o una molécula de aptámero de un ácido nucleico de entre 10 y 75 nucleótidos de longitud, cualquiera de los cuales se une a la molécula objetivo.
Elevada afinidad en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a la constante de disociación de la unión del ligando con la molécula objetivo, en la que la constante de disociación es de 10-6 mol/l, 10-7 mol/l, 10-8 mol/l de o 10-9 mol/l de o menos, y en la que el ligando no se une a las moléculas de control, por ejemplo, proteínas, con unas características estructurales no relacionadas. Las moléculas de control son, a modo de ejemplo no limitante, proteínas plasmáticas tales como albúminas, globulinas, lipoproteínas, fibrinógenos, protrombina, proteínas en fase aguda, marcadores tumorales tales como CEA, CA19-9 o AFP y transferrina.
Elevada especificidad en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a la proporción entre los objetivos o analitos apropiadamente detectados y la suma de todos los compuestos o sustancias detectadas, en la que la proporción es del 80 %, del 85 %, del 90 %, del 95 %, del 99 % o del 99,9 %.
Un fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, que es el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo, un fragmento variable de cadena única, que es una proteína de fusión de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo conectadas por un péptido conector. Una molécula similar a un anticuerpo puede ser una proteína repetitiva, tal como una proteína repetitiva de anquirina diseñada (Molecular Partners, Zúrich).
Los ligandos adecuados según el anterior aspecto de la invención también pueden ser desarrollados mediante métodos evolutivos tales como una expresión en fago, una expresión en ribosoma o un SELEX, en los que el polipéptido o los oligonucleótidos se seleccionan según su capacidad de unión a un objetivo de interés.
Adicionalmente, la afinidad de unión de un ligando identificado puede mejorarse mediante ciclos de evolución de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos, y la selección de los inhibidores evolucionados puede efectuarse basándose en la afinidad requerida.
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El término “analito” en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere particularmente a un compuesto o a una sustancia de interés que es el objetivo de un análisis.
En algunas realizaciones, el primer polipéptido se caracteriza por un valor de Km no mayor de 10 mmol/l para el polipéptido precursor como sustrato.
En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET se acopla al N terminal o al C terminal del sustrato peptídico. En algunas realizaciones, el segundo compañero de FRET se acopla al N terminal o al C terminal del sustrato peptídico. En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET se acopla al N terminal del sustrato peptídico y el segundo compañero de FRET se acopla al C terminal del sustrato peptídico. En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET se acopla al C terminal del sustrato peptídico y el segundo compañero de FRET se acopla al N terminal del sustrato peptídico.
En algunas realizaciones, el analito se selecciona entre un péptido, un polipéptido, un ácido nucleico y una molécula pequeña tal como un lípido, un azúcar o un metabolito.
En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo ligando se selecciona entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula similar a un anticuerpo y una molécula de aptámero de un ácido nucleico de entre 10 y 75 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el sustrato peptídico es o comprende un péptido caracterizado por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO 06, la SEQ ID NO 07, la SEQ ID NO 08, la SeQ ID NO 09, la SEQ ID NO 10, la SEQ ID NO 11, la SEQ ID NO 12, la SEQ ID NO 13, la SEQ ID NO 14, la SEQ ID NO 15, la SEQ ID NO 16 y la SEQ ID NO 17.
En algunas realizaciones, el primer polipéptido que tiene una actividad proteolítica es o comprende la cadena ligera catalítica de la enteropeptidasa humana (Uniprot E9PG70) o un polipéptido caracterizado por la SEQ ID NO 05 (variante supercargada de la enteropeptidasa humana).
En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET es un colorante que comprende un átomo de un lantánido. En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET es un colorante que comprende un átomo de europio o un átomo de terbio.
En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET se selecciona entre la fluoresceína (CAS n° 2321-07- 5) y EuL[H] ([2-[2-[bis(carboximetil)amino]etil-[2-[carboxi-metil-[2-oxo-2-[4-[2-(1,10-fenantrolin-2-
il)etinil]anilino]etil]amino]etil]amino] acetato] de Eu (lll)).
En algunas realizaciones, el segundo compañero de FRET es Atto612Q, Cy5 (ácido 6-[3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5- (1,3,3-trimetilindolin-2-iliden)penta-1,3-dienil]indol-1-io-1-il]hexanoico) o TAmRa (carboxi-tetrametilrodamina).
En algunas realizaciones, el segundo compañero de FRET no es luminiscente.
En una realización, el segundo compañero de FRET es un inactivador oscuro, particularmente un inactivador de agujero negro tal como BHQ-O (Biosearch Technologies, Estados Unidos), BHQ-1 (Biosearch Technologies, Estados Unidos), BHQ-2 (Biosearch Technologies, Estados Unidos), BHQ-3 (Biosearch Technologies, Estados Unidos) o BHQ-10 (2-[(E)-[4-[(4-hidroxi-4-oxo-butil)-metil-amino]fenil]azo]-5-[(E)-(4-
oxoniosulfonilfenil)azo]bencensulfonato), Dabysyl (ácido dimetilaminoazobencensulfónico), un inactivador Qxl tal como QXL 490 (AnaSpec, Inc., Estados Unidos), QXL 570 (AnaSpec, Inc., Estados Unidos), QXL 610 (AnaSpec, Inc., Estados Unidos), QXL 670 (AnaSpec Inc., Estados Unidos) o QXL 680 (AnaSpec, Inc., Estados Unidos), Iowa black FQ (Integrated DNA Technologies, Inc., Estados Unidos), Iowa black RQ (Integrated DNA Technologies, Inc., Estados Unidos), IRDye QC-1 (LI-COR Biosciences GmbH, Alemania) o un Eclipse Dark Quencher (Eurogentec Deutschland GmbH, Alemania).
En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET es EuL[H] y el segundo compañero de FRET es BHQ-10. En algunas realizaciones, el EuL[H] se acopla al N terminal del sustrato péptido y el BHQ-10 se acopla al C terminal del sustrato péptido.
En algunas realizaciones, el primer compañero de FRET es fluoresceína y el segundo compañero de FRET es la TAMRA. En algunas realizaciones, la TAMRA se acopla al N terminal del sustrato péptido y la fluoresceína se acopla al C terminal del sustrato péptido.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, a partir de las cuales pueden extraerse realizaciones y ventajas adicionales. Se entiende que estos ejemplos ilustran la invención, pero no limitan su ámbito.
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Siempre que en el presente documento se planteen alternativas para características separables individuales tales como, por ejemplo, una variante o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante, como “realizaciones”, debe entenderse que dichas alternativas pueden ser combinadas libremente para formar las realizaciones de la invención individuales divulgadas en el presente documento.
Descripción de las figuras
La
Fig. 1
La
Fig. 2
La
Fig. 3
La
Fig. 4
La
Fig. 5
La
Fig. 6
La
Fig. 7
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Fig. 8
La
Fig. 9
La
Fig. 10
La
Fig. 11
muestra el principio de un método de la invención.
muestra una variante esquemática del tripsinógeno humano con una menor autoactivación. muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos del polipéptido de la invención y el tripsinógeno natural humano, en la que los aminoácidos modificados están destacados en negrita. muestra una comparación de las secuencias de ácidos nucleicos del polipéptido de la invención y el tripsinógeno natural humano, en la que los ácidos nucleicos modificados están destacados en negrita. muestra la cinética de la autoactivación del PRSS1 sc en comparación con el PRSS1 natural, en la que la actividad de la tripsina está representada frente al tiempo de incubación. muestra la cinética de la activación del PRSS1 sc- y del PRSS1 natural después de la incubación con enteropeptidasa humana (hEPI-Sc-C112S), en la que la actividad de la tripsina está representada frente al tiempo de incubación.
muestra los geles de SDS-PAGE de la autoactivación del PRSS1-WT y del PRSS1-sc.
muestra la cinética de la autoactivación del PRSS1 sc en comparación con el PRSS1 natural, en la
que la intensidad de la fluorescencia está representada frente al tiempo de incubación.
muestra la cinética de la activación del PRSS1 sc- y del PRSS1 natural después de la incubación con
enteropeptidasa humana (hEPI-Sc-C112S), en la que la intensidad de la fluorescencia está
representada frente al tiempo de incubación.
muestra un ELISA indirecto contra la interleucina 6 humana (IL-6), en el que la intensidad de la fluorescencia está representada frente a la concentración de interleucina 6.
muestra la cinética de la autoactivación del PRSS1 E64K en comparación con el PRSS1 natural, en la que la actividad de la tripsina está representada frente al tiempo de incubación.
Ejemplos
Ejemplo 1: elaboración de la variante supercargada del tripsinógeno humano
Variante supercargada del tripsinógeno 1 humano elaborada en E coli BL21. En resumen, se propagaron células de E coli BL21 que comprenden un vector de expresión caracterizado por la SEQ ID NO 17 en un medio TB con 30 |jg/ml de kanamicina a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600 de entre 0,8 y 1. A continuación, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 1 mM. Paralelamente a esto se añadió glucosa a una concentración final del 1 % (p/v). Después, las células se incubaron durante 18 h a 25 °C. Después de la incubación, las células se recogieron, y los sedimentos celulares resultantes se almacenaron a -20 °C.
Para la preparación, las células se resuspendieron en tampón de lisis celular (1 mmol/l de EDTA; 100 mmol/l de Tris/HCI; pH 7,0). A la suspensión celular se añadieron 5 mg de lisozima. Después de esto, la concentración de MgCl2 de la suspensión se ajustó a 3 mmol/l y se añadió DNAsa I a una concentración final de 10 jg/ml. La suspensión se incubó después a 24 °C durante 30 min.
Después, las células se rompieron mecánicamente en un homogeneizador a alta presión, en el que la ruptura celular se llevó a cabo tres veces a una presión de aproximadamente 1000 bar. Las células rotas se incubaron durante 30 min a 24 °C y se centrifugaron.
Los cuerpos de inclusión que comprenden la variante supercargada se prepararon como sigue a partir de la fracción insoluble de la ruptura celular: los cuerpos de inclusión se resuspendieron en tampón de lavado IB I (20 mmol/l de EDTA a pH 8,0; 500 mmol/l de NaCI; Triton X-100 al 2 %), se agitaron durante 30 min a la temperatura ambiente y se centrifugaron 30 min a 20.000 g. El sedimento resultante se lavó de nuevo con tampón de lavado IB I y dos veces con lavado IB (20 mmol/l de EDTA; 100 mmol/l de Tris/HCI; pH 7,0) consecuentemente, pero sin agitación.
Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en 4 mmol/l de guanidinio, 100 mmol/l de TRIS HCI y 5 mmol/l de EDTA, a pH 8,0, se redujeron con 3 mmol/l de ditiotreitol y se replegaron a través de un método de dilución rápida en un tampón de replegado (0,7 mmol/l de arginina, 1 mmol/l de EDTA, 3 mmol/l de glutatión reducido, 3 mmol/l de glutatión oxidado, a pH 8,6). La variante supercargada replegada se purificó posteriormente a través de una columna de afinidad con ecotina.
Ejemplo 2: caracterización de la variante supercargada del tripsinógeno humano
El tripsinógeno humano mutante con una menor autoactivación se basa en la introducción de aminoácidos cargados en la superficie de la proteína cerca del sitio de activación (fig. 2). El PRSS1 sc (SEQ ID NO 01) no muestra una autoactivación significativa, según se muestra en la fig. 3 (la activación del tripsinógeno (2 jM) se produjo con 10

Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido que tiene al menos una identidad en la secuencia del 90 % con el polipéptido de la SEQ ID NO 03, y que comprende las sustituciones:
    - el residuo de aminoácido E64 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral con carga positiva,
    - el residuo de aminoácido K123 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática y
    - los residuos de aminoácido Y139 y D147 son sustituidos por un residuo de glutamina o de asparagina, y en el que dicho polipéptido está caracterizado por que:
    - un residuo de aminoácido seleccionado entre E16, E17 y/o E142 es sustituido por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática, y/o
    - el residuo de aminoácido N18 es sustituido por un residuo de histidina, y/o
    - el residuo de aminoácido R107 es sustituido por un residuo de lisina, y/o
    - el residuo de aminoácido D138 es sustituido por un residuo de lisina o de arginina, y
    en el que
    • las posiciones de las sustituciones de aminoácido se refieren a la secuencia de aminoácidos del tripsinógeno 1 natural humano según la SEQ ID NO: 3;
    • dicho polipéptido es escindible en un polipéptido que tiene una actividad enzimática similar a la natural cuando se compara con la tripsina 1 humana; y
    • dicho polipéptido no muestra una autoactivación significativa.
  2. 2. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que todos los E16, E17 y E142 son cada uno independientemente sustituidos por un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral alifática.
  3. 3. El polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho polipéptido se caracteriza por una sustitución de aminoácido seleccionada entre la E16A, la E17A, la N18H, la E64K, la R107K, la K123L, la D138K, la Y139N, la E142Ly la D147N.
  4. 4. El polipéptido de la reivindicación 1, que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 90 % con la SEQ ID NO 01 y que contiene las sustituciones de aminoácido E16A, E17A, N18H, E64K, R107K, K123L, D138K, Y139N, E142Ly D147N.
  5. 5. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. La secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 5, que consiste en, o que comprende, la SEQ ID NO 02 o la SEQ ID NO 18.
  7. 7. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  8. 8. Un método para la elaboración de un polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende el uso de una célula hospedadora según la reivindicación 7.
  9. 9. Un método para la cuantificación de un analito, que comprende las etapas de:
    - proporcionar un volumen de reacción,
    - añadir a dicho volumen de reacción en una primera etapa, un analito y un primer ligando capaz de unirse específicamente al analito con una constante de disociación igual o inferior a 10'° mol/l, 10-7 mol/l, 10-8 mol/l o 10' 9 mol/l,
    - añadir a dicho volumen de reacción, en una segunda etapa, un segundo ligando capaz de unirse específicamente a dicho primer ligando con una constante de disociación igual o inferior a 10-6 mol/l, 10-7 mol/l, 10-8 mol/l o 10-9 mol/l, en el que el segundo ligando comprende un primer polipéptido,
    - añadir a dicho volumen de reacción, en una tercera etapa, un polipéptido precursor, en el que dicho polipéptido precursor es escindible por dicho primer polipéptido en un segundo polipéptido y un sustrato peptídico de dicho segundo polipéptido que comprende un primer compañero de FRET luminiscente y un segundo compañero de FRET, en el que dicho primer compañero de FRET y dicho segundo compañero de FRET son capaces de interactuar de tal forma que la señal luminiscente de dicho primer compañero de FRET cambia con la aproximación espacial de dicho primer compañero de FRET y dicho segundo compañero de FRET, y en el que dicho sustrato es escindible por dicho segundo polipéptido entre dicho primer compañero de FRET y dicho
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    segundo compañero de FRET,
    - la cuantificación de la cantidad de dicho analito mediante la medición de la luminiscencia de dicho primer compañero de FRET y/o de dicho segundo compañero de FRET,
    caracterizado por que
    dicho polipéptido precursor es un polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  10. 10. El método según la reivindicación 9, en el que dicho sustrato es o comprende un péptido caracterizado por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO 06, la SEQ ID NO 07, la SEQ ID NO 08, la SeQ ID NO 09, la SEQ ID NO 10, la SEQ ID NO 11, la SEQ ID NO 12, la SEQ ID NO 13, la SEQ ID NO 14, la SEQ ID NO 15, la SEQ ID NO 16 y la SEQ ID NO 17.
  11. 11. El método según la reivindicación 9 o 10, caracterizado por que dicho primer polipéptido que tiene una actividad proteolítica es o comprende la cadera ligera catalítica de la enteropeptidasa humana o un polipéptido caracterizado por la SEQ ID NO 05.
  12. 12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado por que dicho primer compañero de FRET se selecciona entre fluoresceína y [EuL]H.
  13. 13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que dicho segundo compañero de FRET se selecciona entre Atto612Q, Cy5, TAMRA, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 BHQ-10, Dabysilo, QXL 490, QXL 570, QXL 610, QXL 670, QXL 680, Iowa black FQ, Iowa black RQ, IRDye QC-1 y Eclipse Dark Quencher.
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