ES2667433B1 - Una cepa de sporobolomyces roseus para la produccion de composiciones con propiedades colorantes y antioxidantes - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Una cepa de Sporobolomyces roseus para la producción de composiciones con propiedades colorantes y antioxidantes

La presente invención se refiere a los campos de la microbiología, la tecnología alimentaria y a los procedimientos para obtener colorantes a partir de materiales de desecho industriales de alimentos, en particular a una nueva cepa de levadura de Sporobolomyces roseus que puede utilizarse en procedimientos industriales para la producción de composiciones coloreadas y de ingredientes antioxidantes.

TÉCNICA ANTERIOR

Los colorantes se utilizan de forma extensa en la industria alimentaria para proporcionar un color apropiado a los productos finales, los cuales son reconocidos por los consumidores como alimentos en buenas condiciones.

La producción de colorantes y, en particular, de pigmentos carotenoides mediante síntesis química implica altos costes asociados a bajos rendimientos de producción.

Con el objetivo de mejorar la producción de colorantes y en particular de carotenoides, algunos de ellos se producen de forma industrial utilizando bacterias, levaduras, hongos y plantas. Estos colorantes producidos mediante organismos vivos también se denominan “biocolorantes”. En el caso particular de las levaduras, la producción de carotenoides está asociada con la respuesta a las condiciones de estrés. Los carotenoides son pigmentos orgánicos producidos por todos estos organismos a partir de las grasas y otros componentes orgánicos metabólicos básicos. Los carotenoides se dividen en dos clases, las xantofilas (que contienen oxígeno) y los carotenos (que son puramente hidratos de carbono y no contienen oxígeno). Todos los carotenoides son tetraterpenoides, lo que significa que se producen a partir de 8 moléculas de isopreno y contienen 40 átomos de carbono. De acuerdo con su estructura y síntesis química, los carotenoides son tetraterpenoides (40 átomos de carbono) obtenidos de la condensación de cuatro unidades de terpeno (que tiene cada una 10 átomos de carbono). Entre los carotenoides, el p-caroteno, el a-caroteno y la pcriptoxantina tienen actividad de vitamina A en los seres humanos. También pueden actuar como antioxidantes. El p-caroteno es un pigmento rojo-naranja fuertemente coloreado. El pcaroteno se biosintetiza a partir del geranilgeranil pirofosfato y comprende anillos beta en ambos extremos de la molécula. La absorción intestinal del p-caroteno se potencia si se consume junto con grasas, dado que los carotenos son moléculas liposolubles.

Aprovechando el hecho de que algunos microorganismos pueden producir carotenoides, está ampliamente extendido su uso para reutilizar materiales de desecho que estos microorganismos procesan como fuente de carbono, nitrógeno y energía. Un ejemplo de esto es la producción de colorantes a partir de levaduras, como se divulga en Marova et al. "Use of several waste substrates for carotenoid-rich biomass yeast production”, Journal of Environmental Management- 2012, vol. n.° 95, pág.: s338-s342. Marova et al. divulgan la influencia de varios tipos de sustratos de desecho y de factores de estrés sobre la producción de carotenoides por parte de las cepas de levaduras Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa y Sporobolomyces roseus. Algunos de los materiales de desecho utilizados incluyen sustrato desecho de patata y de suero de la leche procedente de la industria láctea.

Se puede obtener una visión de conjunto de la producción biotecnológica de carotenoides mediante levaduras del documento de Mata-Gómez et al. "Biotechnological production of carotenoids by yeast: an overview”, Microbial Cell Factories-2014, vol. n.° 13:12. Los autores divulgan algunas de las condiciones necesarias para las levaduras para producir carotenoides, así como los factores que afectan tal producción (fuente de carbono, disolventes, medio de cultivo, etc.). Además, Mata-Gómez et al. enuncian algunos de los subproductos industriales que se utilizan como sustratos de bajo coste, incluyendo zumo de uva, mosto de uva, zumo de azúcar de caña, aislados de desechos de mostaza hidrolizados, jarabe de maíz y suero de la leche. La Tabla 1 del documento enumera algunas de las especies de levaduras que se han utilizado para producir carotenoides a partir de desechos agroindustriales, así como qué desechos son los sustratos para las levaduras. Entre estas levaduras están las anteriormente citadas levaduras Rhodotorula glutinis y Rhodotorula mucilaginosa, divulgadas por Marova et al. (citado anteriormente).

Otras levaduras carotenogénicas también se utilizan como ingredientes alimentarios, como la divulgada en el documento WO2011130576, en el que se utiliza como ingrediente en alimentos biomasa de levadura oleaginosa procedente de Rhodotorula mucilaginosa DSM 70398 y otras cepas de levadura, en forma de aceite de levadura o de células de levadura oleaginosa enteras. Se utilizan principalmente como agentes inductores de saciedad, antioxidantes y/o agentes conservantes.

Las cepas de levaduras genéticamente modificadas y mutadas también se divulgan en la bibliografía de patente para la producción de composiciones que comprenden p-caroteno. Los ejemplos incluyen la solicitud de patente US20120142082, en la que se divulga que algunas cepas de la levadura Yarrowia lipolytica modificadas genéticamente tienen la capacidad de producir carotenoides. Además, el resumen de la patente JPH0622748 se refiere a la producción de p-caroteno estable en calidad y productividad utilizando cepas seleccionadas de Rhodotorula glutinis creadas mediante tratamiento mutagénico.

Aunque existen algunos microorganismos, junto con las levaduras, para producir carotenoides, existe aún una necesidad de nuevas cepas y de nuevas condiciones industriales que permitan altos rendimientos de producción de carotenoides para producir biocolorantes e ingredientes antioxidantes, al mismo tiempo que se ahorran costes y tiempo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores han aislado una nueva cepa de Sporobolomyces roseus productora de pigmento depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) el 25 de marzo de 2015 con la referencia de identificación LGO1107.

La cepa de Sporobolomyces roseus se aisló de una superficie industrial en una fábrica de alimentos de España. Se depositó, de acuerdo con el Tratado de Budapest, el 25 de marzo de 2015 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) en la Universidad de Valencia C.P. 46980, Catedrático Agustín Escardino N.° 9 Paterna, Valencia (España), por los depositantes: 1)CENTRO NACIONAL DE TECNOLOGÍA Y SEGURIDAD ALIMENTARIA (CNTA) (Ctra. Na - 134, Km 50, 31570 SAN ADRIÁN (Navarra), España); 2) FUNDACIÓN TECNALIA RESEARCH & INNOVATION (Parque Tecnológico de Miramón, Mikeletegi Pasealekua, 2, 20009 DONOSTIA - SAN SEBASTIÁN, España); 3) CENTRO TECNOLÓGICO AGROALIMENTARIO EXTREMADURA (Ctra. Villafranco a Balboa Km 1,2, 06195, VILLAFRANCO DEL GUADIANA (Badajoz), España). La cepa de Sporobolomyces roseus se identificó por parte del depositante con la referencia de identificación LGO1107 y recibió el número de referencia de CECT, CECT 13123 después de que la Autoridad Internacional de Depósito declarara a la cepa como viable. Se menciona de forma indistinta a lo largo de la presente descripción como Spombolomyces rnseus CECT 13123, S. rnseus CECT 13123 o simplemente CECT 13123, S. rnseus LGO1107 o simplemente LGO1107.

Esta cepa aislada tenía la capacidad de producir p-caroteno (y otros carotenos y carotenoides) en altos rendimientos a partir de materiales de desecho de cítricos, en particular a partir de melaza de frutas cítricas, como se representará en los ejemplos a continuación. La melaza de frutas cítricas es un subproducto de la extracción del zumo de cítricos. Como norma general, la pulpa fresca obtenida tras el prensado de las frutas se mezcla con lima y se prensa para eliminar la humedad. El líquido resultante (zumo de prensado) se filtra para eliminar las partículas grandes, se estiliza mediante calentamiento y se concentra. El producto resultante contiene aproximadamente el 72 % de materia seca y aproximadamente el 64 % de azúcares. La melaza de cítrico es un líquido viscoso y espeso, de marrón oscuro a casi negro, con un sabor muy amargo. A menudo se vende a destilerías o se reincorpora en la pulpa de cítrico seca, pero también puede proporcionarse directamente a animales como alimento o añadirse al ensilado de hierbas.

Por lo tanto, la cepa de levadura de la invención proporciona la ventaja de añadir valor a subproductos o productos secundarios industriales, tales como la melaza de frutas cítricas.

La invención también se refiere a un cultivo puro de levadura que comprende la cepa de Spombolomyces rnseus como se define anteriormente. Cultivo puro significa que no hay en el cultivo otra cepa de levadura u otro microorganismo, pero puede comprender de forma opcional compuestos del medio de cultivo en el que se cultivaron las células. Los cultivos puros generalmente se proporcionan como cultivos liofilizados.

Teniendo en cuenta la capacidad de la cepa como productora de alto rendimiento de pcaroteno, así como de productora de otros carotenoides, otro aspecto de la invención es un procedimiento de obtención de una composición coloreada que comprende carotenoides, comprendiendo el procedimiento fermentar una composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno con una cepa de levadura, según se define anteriormente, en condiciones aeróbicas; aislar la cepa de levadura y romper la pared celular de la levadura para liberar la composición que comprende carotenoides.

Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de la cepa Sporobolomyces roseus CECT 13123 para la producción de carotenoides.

Las composiciones coloreadas obtenidas mediante la acción de la cepa Sporobolomyces roseus CECT 13123 implican la ventaja de tener altas concentraciones de carotenos, principalmente p-caroteno, entre los carotenoides sintetizados. Esto es así dado que la cepa tiene la capacidad de producir aproximadamente 2 ^g de carotenos por ml de composición de medio de cultivo, cuantificado por UV-Vis como equivalentes de p-caroteno a 450 nm. Además, la extracción o separación de carotenoides puede realizarse para obtener composiciones coloreadas con mayores concentraciones de p-caroteno y/o una fracción aislada de compuesto carotenoide de torularrodina, como se ilustrará a continuación. Los otros carotenos principales comprendidos en las composiciones coloreadas obtenidas mediante la acción de la cepa Sporobolomyces roseus CECT 13123 incluyen Y-caroteno y toruleno.

La invención se refiere también a un procedimiento de obtención de p-caroteno que comprende llevar a cabo un procedimiento como se define anteriormente y extraer el pcaroteno de la composición coloreada que comprende carotenoides.

Además, la invención abarca también como aspecto una composición coloreada que comprende carotenoides y que se puede obtener mediante un procedimiento como se define anteriormente, comprendiendo dicha composición p-caroteno, Y-caroteno, toruleno y torularrodina.

Estas composiciones coloreadas pueden actuar, así, como agentes colorantes, lo que significa que pueden utilizarse para colorear cualquier sustrato en el que puedan estar comprendidos, formando parte de una composición más compleja (tal como un alimento, pintura, composición farmacéutica, etc.).

Las composiciones coloreadas que comprenden carotenoides de la invención son particulares debido a que son el resultado de la liberación de los contenidos citoplasmáticos celulares de la levadura. Por lo tanto, también comprenden compuestos celulares de la célula S. roseus, tal como ácidos grasos. Incluso en las realizaciones particulares del procedimiento de obtención de composiciones coloreadas, en las cuales se realizan etapas de extracción o separación de carotenoides, las composiciones coloreadas resultantes comprenden algunos compuestos celulares de la célula S. rnseus, que también se extraen o separan junto con los carotenoides.

Considerando las bien conocidas propiedades de las composiciones carotenoides y en particular del p-caroteno, otro aspecto de la invención es el uso de la cepa de levadura como se define anteriormente o de la composición coloreada como se define anteriormente, que comprenden carotenoides y en particular altas cantidades de p-caroteno, como agentes antioxidantes. Esta actividad antioxidante puede realizarse, por ejemplo, dentro de una composición farmacéutica oral o nutracéutica, siendo la composición coloreada o la propia levadura ya sea el principio activo o el excipiente o el vehículo apropiado para preservar de la oxidación de otras sustancias activas. Se proporciona la actividad antioxidante a partir de la propia levadura, por ejemplo, cuando tras la ingestión por parte del consumidor, se suministran los contenidos del citoplasma tras la digestión.

De hecho, la producción de carotenoides se logra sometiendo la cepa Spombolomyces rnseus CECT 13123 (LGO1107) aislada a condiciones de cultivo que estimulen la síntesis de carotenoides. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso de una cepa como se define anteriormente o de una composición coloreada obtenible como se expone anteriormente, como agente productor de coloración. Un agente productor de coloración debe entenderse como cualquier compuesto, composición o célula que proporciona color a un sustrato o matriz en donde está este compuesto/composición/célula. Por lo tanto, no solo es un agente productor de coloración la composición coloreada suministrada incluida en las células de levadura sino también la propia levadura proporciona dicho efecto colorante, debido a su color inherente y a la composición que comprende carotenoides incluida en su citoplasma.

Las composiciones coloreadas de la invención, así como la cepa de la invención, pueden utilizarse en la producción de alimentos como aditivos coloreados, con el objetivo de reajustar la coloración del producto alimentario final (producto comestible). Es conocido de forma general que el color de los alimentos afecta activamente la elección de los consumidores. Del mismo modo, estas composiciones coloreadas pueden emplearse en composiciones farmacéuticas o cosméticas, por ejemplo para colorear comprimidos o pastillas, e incluso suspensiones o soluciones líquidas.

Las composiciones coloreadas, así como la cepa de la invención, también pueden utilizarse como ingredientes alimentarios, con el objetivo de ser consumidos por parte de los consumidores y de proporcionarles los efectos saludables asociados debidos a su consumo.

Por lo tanto, es otro aspecto de la invención el uso de una cepa como se define anteriormente o de una composición coloreada obtenible como se expone anteriormente, como un ingrediente de un producto comestible.

Aún otro aspecto de la invención es un producto comestible que comprende una cantidad eficaz de la cepa S. rnseus LGO1107 como se define anteriormente, junto con cantidades apropiadas de otros ingredientes comestibles.

La invención se refiere también a un método de producción de carotenoides que comprende fermentar una composición de medio de cultivo que comprende melaza de frutas cítricas con una cepa de la levadura Spombolomyces rnseus en condiciones aeróbicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra las cinéticas de crecimiento (log de UFC/ml) de S. rnseus CECT 13123 (LGO1107) en medio de levadura malta (YM) a distintas concentraciones de glucosa; 10 g/l (A), 20 g/l (B) y 40 g/l (C). T(h) significa tiempo en horas.

La FIG. 2, en relación con el Ejemplo 2, muestra el rendimiento de Spombolomyces rnseus CECT 13123 en biomasa (g/l), determinado por medición gravimétrica tras centrifugación y secado, y la producción de carotenos (^g/ml) a las 240 horas en medio de levadura malta (YM) a distintas concentraciones de glucosa; 10 g/l (YM10), 20 g/l (YM20) y 40 g/l (YM40).

La FIG. 3, en relación con el Ejemplo 3, es un diagrama de barras con la producción de carotenos comparada (^g/ml de melaza) entre S. rnseus CECT 13123 (referencia del depositante: LGO1107) y la cepa de referencia CECT 13019 en melaza de mandarina a pH 6. T (h) significa el tiempo en horas. También se representan los datos procedentes de otra de S. rnseus aislada del vinagre. Como anteriormente, T(h) significa el tiempo en horas.

Las FIG. 4 y 5 muestran respectivamente las cinéticas de crecimiento (log de UFC/ml) de S. rnseus CECT 13123 en melaza de mandarina en un volumen de 3 litros o de 30 litros. T (hora) significa el tiempo en horas. En cada tiempo ensayado también se registró el pH del medio. También se registró la producción de carotenos (mg/l de medio). Como anteriormente, T(h) significa el tiempo en horas.

Las FIG. 6 y 7, en relación al Ejemplo 4, muestran respectivamente la producción de caroteno (mg/l) de S. rnseus CECT 13123 en los medios YM e YUCCA complementados de manera distinta para observar la influencia de la glucosa en los parámetros de fermentación. Como anteriormente, T(h) significa el tiempo en horas.

La FIG. 8, también en relación al Ejemplo 4, muestra el efecto del pH del medio de cultivo en la producción de carotenos. Como anteriormente, T(h) significa el tiempo en horas.

La FIG. 9, en relación al Ejemplo 5, es un diagrama de barras que muestra los niveles de glucosa (g/l) y las cantidades de carotenos producidas (mg/l) a lo largo del tiempo (T en horas; T(h)) cuando se cultiva la cepa S. rnseus CECT 13123 (LGO1107) en melaza de naranja.

La FIG. 10, en relación al Ejemplo 6, es otro diagrama de barras que muestra el efecto del pH del medio en la cantidad de p-caroteno (^g/ml) producida por S. rnseus LGO1107 y por la referencia S. rnseus CECT 13019. La composición de medio de cultivo comprende melaza de mandarina y los pH ensayados son pH 3 y pH 6.

La FIG. 11, en relación al Ejemplo 9, es un cromatograma de los carotenoides extraídos de Spombolomyces rnseus CECT 13123. Método de detección y cuantificación mediante HPLC-DAD. mUA son unidades de miliabsorbancia (eje Y); el volumen de elución está en ml (eje X). Los picos que corresponden a tolureno, p-caroteno, Y-caroteno y torularrodina se representan para una muestra extraída de la fermentación de medio PDA (forma siglada de Potato Dextrose Agar, agar de dextrosa y patata) por CECT 13123.

La FIG. 12, en relación al ejemplo 11, es una comparación del contenido de carotenoides entre la composición coloreada de la invención y la divulgada en Davoli et. al., que describe una cepa de Sporobolomyces roseus que es aparentemente similar a la de la presente invención.

La FIG. 13, en relación al ejemplo 11, es una comparación del contenido en ácidos grasos entre la composición coloreada de la invención y la divulgada en Davoli et. al., que describe una cepa de Sporobolomyces roseus que es aparentemente similar a la de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Todos los términos como se usan aquí en la presente solicitud, a menos que se indique otra cosa, se entenderán en su significado ordinario como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos que se usan en la presente solicitud son las que se exponen a continuación y están destinadas a aplicarse de manera uniforme a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que una definición establecida expresamente de otro modo proporcione una definición más amplia. Las siguientes definiciones se incluyen con el fin de compresión.

Por “ingrediente alimentario” debe entenderse cualquier sustancia que se convierte en parte de un producto alimentario, ya sea de forma directa o indirecta, durante alguna fase de su procesamiento, almacenamiento o envasado, o que puede consumirse sola como alimento. Incluido en esta definición, por “aditivo alimentario” debe entenderse cualquier sustancia añadida a un alimento para un fin específico en ese alimento: el uso previsto de la cual da como resultado, directa o indirectamente, que se convierta en un componente del alimento o que afecte de otra forma a las características de cualquier alimento. La cepa de la invención o la composición coloreada que se puede obtener de ella puede utilizarse o concebirse de forma independiente como un ingrediente alimentario como un todo o incluso de forma específica como un aditivo alimentario. A modo de ejemplo, si la composición que comprende carotenoides (es decir, p-caroteno) está en un alimento final para ser consumida y con el objetivo de producir un efecto particular en los organismos (por ejemplo, estimular la síntesis de vitamina A), entonces se concibe como un ingrediente. Si, por otro lado, la composición se añade al alimento para conservarlo hasta su fecha de caducidad, esta se concibe como un aditivo. La concentración en el alimento final se ajustará en consecuencia dependiendo de la función deseada.

Por "aditivo de color” debe entenderse cualquier sustancia o composición que puede añadirse a algo más para provocar un cambio de color. Un aditivo de color (también denominado por la presente agente colorante o agente que produce coloración) es cualquier colorante, pigmento, sustancia o composición que, cuando se añade o aplica a un alimento, fármaco o cosmético, o al cuerpo humano, tiene la capacidad (sola a través de reacciones con otras sustancias) de impartir de color. Una "composición coloreada que comprende carotenoides” debe entenderse, por lo tanto, como una composición con la capacidad de cambiar el color de cualquier sustrato (por ejemplo, otra composición) donde se añade.

Por "agente antioxidante” debe entenderse una molécula o composición que inhibe la oxidación de otras moléculas. La oxidación es una reacción química que implica la pérdida de electrones o un aumento del estado de oxidación. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres. A su vez, estos radicales pueden iniciar reacciones en cadena. Cuando la reacción en cadena se produce en una célula, esto puede provocar el daño o la muerte de la célula. Los antioxidantes, y en particular los carotenoides, interrumpen estas reacciones en cadena mediante la eliminación de radicales libres intermediarios e inhibiendo otras reacciones de oxidación. Hacen esto oxidándose a sí mismas, por lo que los antioxidantes a menudo son agentes reductores que tienen la capacidad de inactivar especies reactivas del oxígeno (ROS, forma siglada de reactive oxygen species).

Por "producto comestible” debe entenderse cualquier alimento que se ingiere por vía oral por parte de los consumidores. Los ejemplos de alimentos incluyen zumos de fruta, bebidas refrescantes, batidos, productos lácteos (leche, yogur y mantequilla), cremas de verduras y productos de pastelería, entre otros. La "cantidad eficaz de la composición coloreada o de la cepa de levadura” se refiere a una cantidad no tóxica de esta composición que produce, en la composición en la que se añade, un cambio de color además de actuar como un agente oxidante o simplemente como un ingrediente comestible. Un "ingrediente comestible” es cualquier compuesto de un producto comestible que puede consumirse por vía oral.

Las "composiciones farmacéuticas orales” o "composiciones nutracéuticas” que comprenden las cantidades eficaces de cualquiera de la composición coloreada o de la cepa de levadura incluyen comprimidos, pastillas, cápsulas y suspensiones o soluciones líquidas. La cepa o las composiciones coloreadas se añaden en este tipo de composiciones en una cantidad eficaz no tóxica, capaz de producir el efecto deseado sin ser peligrosas para el consumidor. Estas composiciones farmacéuticas están acompañadas (o comprenden) excipientes y/o vehículos farmacéuticos. Las composiciones nutracéuticas son nutrientes y/o vitaminas y/o fuentes minerales concentrados ingeridos por los animales o los seres humanos para completar su alimentación. Las composiciones cosméticas en las que están incluidas cantidades eficaces de cualquiera de la composición coloreada o de la cepa de levadura, comprenden geles, cremas, pomadas, sueros, polvos, espumas, lociones, barras, pomadas, pastas, champús, geles de baño, productos corporales líquidos o productos faciales líquidos, en los que cualquier excipiente y/o vehículo cosméticamente aceptable está acompañando a la composición coloreada de la invención o a la cepa CECT 13123. Estas composiciones cosméticas se benefician de las cantidades eficaces de cualquiera de la composición coloreada o de la cepa de levadura, en particular debido a su actividad antioxidante.

Por “equivalentes de p-caroteno” debe entenderse la cantidad total de carotenos de cualquier tipo en una solución que proporciona las mismas unidades de absorbancia (U.A.) que corresponderán a una solución con p-caroteno puro (sin otro compuesto de tipo caroteno).

La invención proporciona una cepa aislada de Spombolomyces rnseus con valiosas ventajas sobre otras cepas de Spombolomyces rnseus, ya que es una productora de carotenoides de alto rendimiento en condiciones aeróbicas y en particular una alta productora de p-caroteno, que es un pigmento extensamente utilizado en muchas industrias, incluyendo la industria alimentaria. Además, esta cepa tiene la capacidad de crecer en sustratos que contienen material de desecho agroindustrial, tal como en subproductos o productos secundarios de cítricos, incluyendo melaza de frutas cítricas. En ese sentido, la cepa también tiene la capacidad de fabricar carotenoides a partir de estos productos secundarios, en particular carotenos (principalmente p-caroteno), añadiendo valor a los mismos al tiempo que se reduce el impacto de material de desecho.

La cepa de Spombolomyces rnseus CECT 13123 (LGO1107) se utiliza para producir carotenoides. La cepa CECT 13123 puede utilizarse también en un procedimiento de obtención de composiciones coloreadas que comprenden dichos carotenoides (entre los que está presente el p-caroteno), comprendiendo dicho procedimiento fermentar una composición de medio de cultivo que proporciona los nutrientes elementales para el cultivo de la cepa de levadura en condiciones aeróbicas. Estos ingredientes nutritivos elementales son una fuente de carbono, tal como los hidratos de carbono (para obtener energía y componentes básicos para las paredes celulares) y una fuente de nitrógeno, tal como los aminoácidos, utilizados básicamente para la síntesis de proteínas. Dado que los carotenoides son compuestos no secretados que permanecen dentro de la célula de levadura, la ruptura de la pared celular de las levaduras o la extracción en cualquier modo desde interior de la célula, es obligatoria para liberar los carotenoides (composición coloreada que comprende carotenoides).

En una realización particular, el procedimiento para obtener composiciones coloreadas se caracteriza por comprender las etapas de:

(a) preparación de un precultivo de la cepa de Spombolomyces rnseus CECT 13123 como se define anteriormente;

(b) inoculación de una composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno con el precultivo de la etapa (a);

(c) fermentación de forma aeróbica de la fuente de carbono de la composición de medio de cultivo;

(d) aislamiento de la cepa de levadura; y

(e) ruptura de la pared celular de la levadura para liberar la composición que comprende carotenoides.

Es fácil observar que el método anteriormente mencionado puede detenerse en (d) si se desea. Después, se realiza un método de aislamiento de la cepa de la invención con la composición coloreada que constituye el citoplasma de la célula. Como se indicará a continuación, estas células aisladas en forma entera son, como tales, agentes productores de coloración, debido a su coloración inherente.

En aún una realización más particular, el precultivo es un cultivo preliminar a pequeña escala de la cepa utilizada para inocular la composición de medio de cultivo en la que se llevará a cabo la fermentación. En otra realización particular, el precultivo de la cepa de la invención puede llevarse a cabo en un medio de cultivo de levaduras con un pH modificado de entre 3 y 6. Con este precultivo se tiene como objetivo preparar la cepa para cultivarla de forma eficaz en el medio de fermentación, en el que tendrá lugar la producción de los carotenoides. Un ejemplo de este medio de cultivo de levaduras para preparar el precultivo es el medio YUCCA, que comprende glucosa 10 g/l, extracto de levadura 3 g/l, KH2PO42 g/l, MgSO4 0,5 g/l (pH 6), en donde la cepa se cultiva en las condiciones de cultivo aeróbicas explicadas a continuación.

Además, en otra realización más particular, de forma opcional en combinación con cualquier realización anterior o posterior, la composición de medio de cultivo de la etapa (b), que comprende la fuente de carbono y nitrógeno, comprende adicionalmente o consiste en melaza de frutas cítricas. Los ejemplos de melazas incluyen las de mandarina, naranja, limón, pomelo, lima y mezclas de las mismas. De forma más particular, la melaza de frutas cítricas es melaza de mandarina o melaza de naranja.

Esta composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno (sea melaza o no) se refiere a un medio de cultivo que contiene energía digerible, el carbono y el nitrógeno utilizado por la cepa de levadura. Por ejemplo, entre las fuentes de carbono y energía adecuadas se encuentran la glucosa, xilosa, fructosa, sacarosa, lactosa, galactosa y mezclas de las mismas. Como fuentes de nitrógeno adecuadas pueden incluirse, pero sin limitación a ellas, extracto de levadura, extracto de carne, agua de macerado de maíz (AMM), carne, soja o peptonas de caseína, hidrolizados de proteína procedentes de subproductos agroalimentarios ricos en proteína, tales como la harina de soja, suero, granos secos de destilería con solubles (GSDS) y mezclas de los mismos.

Como se expone anteriormente, estas melazas se obtienen como subproductos de la extracción del zumo de cítricos. Cuando las melazas de frutas cítricas se emplean como medio de cultivo, previamente se tratan para reducir el contenido de sólidos. Este tratamiento puede incluir etapas tales como la precipitación y/o el filtrado, y/o la decantación de las partículas sólidas de la fruta cítrica realizada con el objetivo de separar los sólidos que no se utilizarán en la fermentación. En una realización particular, la melaza de frutas cítricas se clarifica hasta un residuo sólido que está en el intervalo del 1 % al 10 % en peso, en particular del 2,5 % al 5 % en peso.

La invención también proporciona un procedimiento para la producción de carotenoides que comprende fermentar una composición de medio de cultivo que comprende melaza de fruta cítrica con una cepa de levadura de Spombolomyces rnseus en condiciones aeróbicas y romper la pared celular de las levaduras para recuperar los carotenoides. Como se expone anteriormente, una realización particular de este procedimiento es la llevada a cabo con la cepa LGO1107 que utiliza como medio de cultivo una composición que comprende o consiste en melaza de fruta cítrica.

Para liberar los carotenoides del interior de las células de levadura, la pared celular tiene que romperse, entendiendo como ruptura tanto la formación de poros en la pared celular o la membrana celular de las levaduras como la formación de cualquier otro deterioro en la pared o la membrana celular de las levaduras que permita la liberación de los contenidos citoplasmáticos. En una realización particular, la ruptura se realiza por centrifugación, por procedimientos de molienda o con impulsos eléctricos de alto voltaje, combinado con el uso de disolventes orgánicos, lo que significa en un disolvente orgánico.

En una realización particular del procedimiento, la ruptura de la pared celular de las levaduras se lleva a cabo en un medio líquido que comprende el disolvente polar aprótico dimetil sulfóxido (abreviado DMSO), que puede de forma opcional precalentarse de 40 °C a 50 °C. El tratamiento con ultrasonido y la agitación vorticial también son técnicas adicionales adecuadas para romper la pared celular de las levaduras. Los medios líquidos pueden ser el propio disolvente o un medio de cultivo de levaduras conocido, tal como el medio YUCCA o el medio YM, comprendiendo dicho disolvente orgánico apolar.

En otra realización particular, de forma opcional en combinación con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores, la ruptura de la pared celular de las levaduras se realiza mediante procedimientos de molienda en un disolvente orgánico seleccionado de dietiléter, etil acetato, acetona, hexano, etanol, éter de petróleo y combinaciones de los mismos. Aún en otra realización particular, la ruptura se realiza con impulsos eléctricos de alto voltaje en cualquier de estos disolventes orgánicos.

Enlazando con las técnicas o etapas adicionales para recuperar las composiciones que comprenden carotenoides, en otra realización más particular, el procedimiento comprende etapas adicionales para lograr el aislamiento de compuestos de caroteno específicos, tales como p-caroteno purificado. “P-caroteno purificado” debe entenderse en el sentido de la presente invención, como una composición que se recupera mediante cualquiera de las tecnologías mencionadas anteriormente o a continuación, y en la que el porcentaje en peso (en g/g) de p-caroteno en relación a la cantidad total de carotenos aislados es de al menos el 90 %.

En una realización particular del método de obtención de p-caroteno, o de obtención de composiciones coloreadas con carotenoides (principalmente carotenos), el método comprende etapas de extracción líquida adicionales o etapas de extracción en combinación con destilación, u otras técnicas que el experto en la materia conocerá y que pueden utilizarse para el aislamiento de los distintos carotenos.

Teniendo presentes las propiedades químicas y físicas particulares de los carotenoides, las fracciones enriquecidas con carotenoides particulares pueden obtenerse aplicando varias series de destilación o como alternativa mediante varias etapas de extracción con disolvente (extracción en fase sólida o de líquido-líquido), o como alternativa utilizando técnicas cromatográficas que conocerá el experto en la materia. Los ejemplos se proporcionan a continuación.

Por lo tanto, en otra realización particular del procedimiento, tras la ruptura de la pared celular de las levaduras, se realiza una etapa adicional para recuperar los carotenoides. En particular, la recuperación se realiza mediante una etapa de extracción en un disolvente orgánico apolar (disolvente orgánico no polar). En una realización particular, el disolvente orgánico es un disolvente orgánico apolar seleccionado de dietiléter, etil acetato, acetona, hexano, etanol, éter de petróleo y combinaciones de los mismos. El uso del disolvente orgánico permite la recuperación de los carotenoides o de la composición coloreada producida por la cepa de levadura a partir de otros compuestos del citoplasma de la célula de levadura. Dependiendo del disolvente utilizado, también podría utilizarse con el objetivo de separar (fraccionar) compuestos de carotenoides individuales producidos por la cepa.

En una realización particular, la solución que comprende carotenoides se seca para obtener los carotenoides en forma seca o, como alternativa, la solución que comprende carotenoides se somete a precipitación de los carotenoides, que se recuperan más tarde a partir del precipitado.

Cualquiera de las formas en que la composición coloreada que comprende carotenoides se proporcione puede utilizarse como agente productor de coloración o como agente antioxidante dentro de composiciones más complejas (alimentos, composiciones farmacéuticas orales o nutracéuticas).

En una realización más particular, la obtención o la liberación de la composición coloreada que comprende carotenoides se realiza mediante:

- el aislamiento de células de levadura a partir del medio de cultivo fermentado de la etapa (c) mediante medios de centrifugación;

- la resuspensión y ruptura de las células de levadura en un disolvente orgánico, en particular dimetilsulfóxido (DMSO), y en el que el disolvente, en particular, se precalienta a una temperatura que varía de 40 a 50 °C;

- la extracción de las células de levadura resuspendidas y rotas con un disolvente orgánico seleccionado de dietiléter, etil acetato, acetona, hexano, etanol, éter de petróleo y combinaciones de los mismos, en particular la combinación dietiléter/etil acetato (1:1); y

- la centrifugación de la mezcla para obtener dos fases, y

- la recuperación de la fase orgánica superior que consiste en la composición coloreada que comprende carotenoides.

En cualquiera de los procedimientos de obtención de composiciones coloreadas que comprenden carotenoides o de obtención de p-caroteno, la etapa (b) se lleva a cabo con una concentración de inóculo de la cepa de 103 a 108 unidades de formación de colonias por ml de cultivo (UFC/ml), en particular de 104 a 107 UFC/ml. En una realización más particular, es de 105 a 106 UFC/ml de medio de cultivo. En una realización más particular, el volumen total de la composición de medio de cultivo es de 15 a 60 litros (l). De 103 a 108 incluye 103, 104, 105, 106, 107 y 108 UFC/ml.

En otra realización particular del procedimiento de la invención, de forma opcional en combinación con cualquier realización anterior o posterior, la etapa de fermentación del medio de cultivo se realiza en un intervalo de temperatura de 20 °C a 35 °C, de forma más particular de 20 °C a 30 °C e incluso de forma más particular de 20 °C a 25 °C. De 20 °C a 35 °C significa cualquier temperatura seleccionada de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35 °C.

En otra realización particular, de forma opcional en combinación con cualquier realización anterior o posterior, la etapa de fermentación del medio de cultivo se lleva a cabo en un intervalo de pH de 2,0 a 8,0, de forma más particular de 3,0 a 6,0. Por lo tanto, el pH se selecciona de 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 y 8,0.

Cuando se mencionan condiciones aeróbicas en la presente invención, estas comprenden en particular realizaciones de oxigenación (proporción de una fuente de oxígeno) a un caudal de 2 a 10 l/min, en particular de 5 l/min, del 20 % v/v-30 % v/v, en el que v/v significa un volumen de aire que contiene hasta el 21 % de O2 por volumen de medio de cultivo, y agitación constante de la composición de medio de cultivo, ayudando así a una oxigenación homogénea de todo el volumen.

En otra realización particular de los procedimientos, la etapa de fermentación se lleva a cabo durante un periodo que varía entre 7 y 12 días, de forma más particular durante 10 días.

Mediante todas estas realizaciones de los procedimientos pueden obtenerse las composiciones coloreadas que comprenden carotenoides, en particular que comprenden pcaroteno. Por lo tanto, en una realización particular las composiciones coloreadas se pueden obtener mediante un procedimiento que comprende fermentar una composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno con la cepa de Spombolomyces rnseus CECT 13123, o con un cultivo puro de ella en condiciones aeróbicas y romper la pared celular de las levaduras para liberar la composición que comprende carotenoides.

De forma más particular, las composiciones coloreadas se pueden obtener mediante:

(a) la preparación de un precultivo de la cepa de Spombolomyces rnseus CECT 13123, o un cultivo puro de ella;

(b) la inoculación de una composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno con el precultivo de la etapa (a), comprendiendo dicha composición de medio de cultivo melazas de frutas cítricas o incluso consistiendo solo de estas melazas de frutas cítricas;

(c) la fermentación de forma aeróbica de la fuente de carbono de la composición de medio de cultivo;

(d) el aislamiento de la cepa de levadura, y

(e) la ruptura de la pared celular de la levadura para liberar la composición coloreada que comprende carotenoides del interior de las células.

Las composiciones coloreadas así obtenidas comprenden p-caroteno, entre otros carotenoides (incluyendo xantofilas y otros carotenos). Las composiciones coloreadas así obtenidas comprenden en particular p-caroteno, Y-caroteno, toruleno y torularrodina. En una realización particular de las composiciones coloreadas de la invención el porcentaje en peso de p-caroteno es al menos del 40 % en relación al total de carotenos en la composición (p/p en gramos). El porcentaje en peso indicado aquí se calcula recuperando los carotenos de la composición coloreada mediante la ruptura de las células de levadura con DMSO precalentado a 50 °C y la extracción de las células de levadura rotas con dietiléter/etil acetato (1:1). Este es el método analítico de referencia propuesto por los inventores para comparar los resultados obtenidos con otras cepas de levadura.

En otra realización particular, la composición coloreada que comprende carotenoides comprende p-caroteno en un porcentaje en peso que varía del 48 al 50 %; Y-caroteno en un porcentaje en peso que varía del 10 al 12 %; toruleno en un porcentaje en peso que varía del 26 al 28 % y torularrodina en un porcentaje en peso que varía del 12 al 14 %, todos los porcentajes en peso en relación a la cantidad total de carotenos que asciende al 100 %. Como se indica anteriormente, la composición coloreada que comprende carotenoides también comprende otros carotenoides, en particular xantofilas. Estos porcentajes en peso de carotenos en la composición coloreada se determinan, como se indica anteriormente, recuperando carotenos con el procedimiento que comprende la ruptura con DMSO y la extracción con dietiléter/etil acetato.

Considerando las propiedades antioxidantes conocidas del p-caroteno, las composiciones coloreadas de la invención se proponen para su uso como agentes antioxidantes, así como agentes productores de coloración dentro de composiciones complejas. Los ejemplos de composiciones complejas incluyen composiciones comestibles (alimento), composiciones nutracéuticas y farmacéuticas, o composiciones cosméticas.

Los ejemplos no limitativos de productos en los que las composiciones coloreadas de la invención pueden añadirse incluyen composiciones farmacéuticas (en particular composiciones farmacéuticas orales), composiciones nutracéuticas, composiciones cosméticas y alimentos, en particular zumos de fruta, bebidas refrescantes, batidos, productos lácteos (leche, yogur, mantequilla), cremas de verduras y productos de pastelería entre otros.

En toda la descripción y las reivindicaciones no se pretende que la palabra "comprende” y las variaciones de la palabra, excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra "comprende” abarca el caso de "consiste en”. Los objetivos, ventajas y características adicionales de la invención serán obvios para los expertos en la materia tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que limiten la presente invención. Además, la presente invención incluye todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferentes descritas en el presente documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Aislamiento de la cepa Spombolomyces rnseus CECT 13123 (LGO1107)

La cepa de Spombolomyces rnseus de la invención se aisló de una superficie en una industria alimentaria, de acuerdo con el siguiente procedimiento:

Se seleccionaron cinco colonias bacterianas de placas de contacto Rodac con agar de sabouraud con cloranfenicol incubadas durante cinco días a 25 °C y aisladas por su color rojo. Se hicieron varias incubaciones en Agar de Dextrosa y Patata (ADP) antes de su análisis.

La identificación se realizó utilizando la técnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, forma siglada de restriction fragment length polymorphism) del espaciador interno transcrito (ITS, forma siglada de internal transcribed spacer) y secuenciando la región apropiada de ARNr para conocer la cepa específica con la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básica (BLAST, forma siglada de Basic Local Alignment Search Tool).

Tabla 1. Peso molecular mediante RFLP-ITS

Código Género y especie ITS Hhal Haell Hinfl

Interno de

la muestra

LGO1107 Sporobolomyces 610 300+200+80 600 280+120+95+95 sp

Tabla 2. Resultados de secuenciación

Código interno de la Perfil por RFLP Homología de BLAST % muestra

LGO1107 Sporobolomyces sp 99.9% roseus

Todos estos datos confirmaron que la cepa aislada era una cepa de S. roseus.

Como se indicó anteriormente, la cepa aislada LGO1107 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y recibió el número de referencia CECT 13123.

Ejemplo 2. Cultivo y producción de carotenos de Sporobolomyces roseus CECT 13123 (LGO1107) en caldo YM.

Para caracterizar mejor la nueva cepa aislada, se analizó su crecimiento en un Caldo de Levadura Malta (YM) formulado con la adición de distintas cantidades de glucosa (azúcar principal en el subproducto de melaza): glucosa 10,00, 20,00 y 40,00 g/l. En estas condiciones, también se evaluó la producción de carotenos.

La composición del caldo YM era: Digestión péptica de tejido animal (5,00 g/l), extracto de levadura (3,00 g/l), extracto de Malta (3,00 g/l), Dextrosa (10,00 g/l).

En la FIG. 1 (A a C) se representan las cinéticas de crecimiento y la producción de carotenos. La producción de carotenos se determinó como se expone en el Ejemplo 8, comprendiendo el procedimiento la ruptura con DMSO y la extracción con dietiléter/etil acetato (1:1) y la cuantificación con un ensayo de espectrofotometría de UV-Vis a 450 nm.

La FIG. 2 muestra la producción de Sporobolomyces roseus CECT13123 en biomasa (g/l), determinado mediante medición gravimétrica tras centrifugación y secado, y la producción de carotenos a las 240 horas.

La conclusión a partir de estos datos es que Sporobolomyces roseus CECT13123 produce altas cantidades de carotenos en este medio de cultivo.

Ejemplo 3. Composiciones coloreadas a partir de la fermentación de melaza de mandarina con cepas de levadura. Comparación de Sporobolomyces roseus CECT 13123 con otras cepas de Sporobolomyces roseus

Sporobolomyces roseus CECT 13123 (LGO1107), la cepa Sporobolomyces roseus CECT 13019 de referencia (disponible en el mercado) y otra cepa de Sporobolomyces roseus aislada del vinagre se cultivaron y se ensayaron para obtener composiciones coloreadas que comprenden carotenoides.

Las cepas (mantenidas previamente a 4 °C en agar de dextrosa y patata) se inocularon en un caldo sintético YUCCA (composición de medio de cultivo) que comprende extracto de levadura (2 g/l) glucosa 10 g/l, KH2PO4 10 g/l, MgSO4 2 g/l (pH 6). Estas se cultivaron durante 24 h a 23 °C con oxigenación constante y agitación.

A una escala de laboratorio, se inocularon 105-6 UFC/ml de cada cepa a partir de los precultivos, en 3 l de melaza de mandarina. La fermentación se llevó a cabo durante 10 días (240 h) en condiciones de luz y a una temperatura de 23 °C. La agitación fue a 200 rpm (Biostat ® B Plus) y la oxigenación se mantuvo constante con un flujo del 25 % v/v mediante Biostat ® B Plus.

La melaza de mandarina se obtuvo de un proveedor de derivados de frutas cítricas y su composición era la siguiente: humedad (95 g/100 g), nitrógeno (0,32/100 g), cenizas (0,17 g/100 g), hidratos de carbono (4,5 g/100 g), fructosa (0,10 g/100 g), glucosa (3,9 g/100 g), sacarosa (0,32 g/100 g) y pH 3,4. La melaza se clarificó por filtrado y el pH se ajustó a 6 antes de la inoculación de las cepas.

En la FIG. 3, se representa con barras la producción total de carotenos entre las tres distintas cepas de S. rnseus en melaza de mandarina a pH 6 en un fermentador de 3 l. Las cantidades de caroteno se determinaron como en el Ejemplo 8, con el procedimiento comprendiendo la ruptura con DMSO y la extracción con Dietiléter/Etil Acetato (1:1), y la cuantificación mediante un ensayo de espectrofotometría de UV-Vis a 450 nm, como equivalentes de p-caroteno.

Spombolomyces rnseus CECT 13123 (LGO1107) aparece como la mejor productora de caroteno en melaza de mandarina con pH modificado, incluso mejor que la referencia CECT 13019. Los resultados de la FIG. 3 muestran que S. rnseus LGO1107 produjo una mayor cantidad de composición coloreada que comprendía carotenoides, en particular carotenos, a partir de melaza de fruta cítrica que la referencia CECT 13019. Además, la producción de LGO1107 fue más rápida que la producción de CECT 13019, dado que en cada uno de los tiempos ensayados se observó una mayor producción.

Con el objetivo de caracterizar adicionalmente las cinéticas de crecimiento y el comportamiento de Spombolomyces rnseus CECT 13123, se hicieron varios ajustes del pH en la melaza de mandarina en donde se inoculó CECT 13123 como se indica anteriormente. Se registraron el log de las UFC/ml y la producción de caroteno (mg/l). Los datos se representan en la FIG. 4, la cual muestra la cinética de crecimiento (log de UFC/ml) frente al tiempo en horas de S. rnseus CECT 13123 en melaza de mandarina en un volumen de 3 litros. También se representa el pH del medio en cada tiempo.

A escala piloto, también se inoculó Spombolomyces rnseus CECT 13123 (LGO1107) a la misma concentración inicial que en la escala de laboratorio pero en un volumen final de melaza de mandarina de 30 l. La fermentación se realizó durante 10 días a 23 °C, 680 rpm (Reactor Biológico RB-50, Energesa S.A.) y suministro de oxígeno constante. Los resultados se representan en la FIG. 5, en la que se observan las cinéticas de crecimiento (log de UFC/ml) frente al tiempo en horas de S. rnseus CECT 13123. La fase estacionaria se alcanzó a las 72 h y no se representan los datos de crecimiento entre la 96 h y 240 h.

Ambas FIGs. 4 y 5 demuestran que la nueva cepa tenía la capacidad de crecer con altos rendimientos en melaza de mandarina y también tenía la capacidad de producir carotenos en altas concentraciones.

La cepa de Sporobolomyces roseus CECT 13123 (LGO1107) fue, por lo tanto, también útil para llevar a cabo la fermentación a niveles industriales. Sin ligarse a teoría alguna, los inventores creen que esto se debe en particular al hecho de que esta cepa tiene una alta tasa de crecimiento en melazas de frutas cítricas en relación a otras cepas de Sporobolomyces roseus.

Ejemplo 4: Influencia de las condiciones de fermentación sobre la producción de carotenos por Sporobolomyces roseus CECT 13123

Se estudiaron las condiciones de fermentación para la optimización de la producción de carotenos.

Se analizó la producción de carotenos en los medios YM e YUCCA con distintas concentraciones de glucosa. Las condiciones de cultivo y la inoculación eran las mismas que las indicadas en el Ejemplo 3 (solo se cambiaron los medios de cultivo). Los datos se representan en la FIG. 6, para YM complementado y en la FIG. 7, para el medio YUCCA complementado. Cuando mayor era el contenido de glucosa, mayor era la producción de caroteno (en mg/l) considerando el tiempo de cultivo total (240 horas).

El efecto del pH del medio de cultivo puede observarse en la FIG. 8. Se ensayó a varios pH (pH 3, 5 y 7) el crecimiento de CECT 13123 en YUCCA complementado con glucosa 20 g/l. La producción de carotenos a varios tiempos de cultivo (principalmente de p-caroteno entre otros carotenos) se determinó como se expone anteriormente (como en el Ejemplo 8, comprendiendo el procedimiento la ruptura con DMSO y la extracción con Dietiléter/Etil Acetato (1:1), y la cuantificación con un ensayo de espectrofotometría de UV-Vis a 450 nm). Sorprendentemente, la producción de carotenos se consigue incluso a un bajo pH (los de las melazas de frutos cítricos). La mejor producción en YUCCA se obtuvo a pH 5-7.

Ejemplo 5. Cultivo de Sporobolomyces roseus CECT 13123 (LGO1107) en melaza de naranja

Con el objetivo de determinar si la cepa de LGO1107 tenía la capacidad de crecer y de producir carotenoides, se realizó el cultivo en melaza de naranja a pH 5,5, y la recuperación de carotenos y la cuantificación como se indica en el Ejemplo 8, comprendiendo el procedimiento la ruptura con DMSO, la extracción con Dietiléter/Acetato de Etilo (1:1) y la cuantificación con un ensayo de espectrofotometría de UV-Vis a 450 nm como equivalentes de p-caroteno.

LGO1107 tuvo la capacidad de crecer también en melaza de naranja. La producción de carotenos (principalmente de p-caroteno, entre otros carotenos) se representa en la FIG. 9. En esta figura, las primeras barras son las cantidades de caroteno (mg/l de medio) producidas en cada tiempo muestreado (en horas). Las segundas barras corresponden a los niveles de glucosa (g/l de medio) en el medio de cultivo en el mismo tiempo muestreado.

Este ejemplo muestra la capacidad de la cepa de la invención para fermentar otro material de fruta cítrica (melaza de naranja), lo que la hace una cepa versátil útil en varios materiales de desecho de industrias de frutas cítricas.

Ejemplo 6. Efecto del pH de la composición de medio de cultivo que comprende melaza de mandarina

Se cultivaron Sporobolomyces roseus CECT13123 (LGO1107) y CECT 13019 en melaza de mandarina como las que se indican en el Ejemplo 3.

El cultivo se realizó en un Erlenmeyer (volumen de medio de 0,3 l) durante 240 horas. Para controlar el procedimiento de fermentación se controlaron a diario durante el tiempo de fermentación el crecimiento celular y el pH.

El pH de los medios se ajustó a 3 o 6. Como puede observarse en la FIG. 10, la cepa de la invención (LGO1107) tuvo la capacidad de producir carotenos incluso en condiciones ácidas (pH 3), en donde tuvo la capacidad de crecer. Este no fue el resultado con la cepa de referencia CECT 13019. Como se expone anteriormente, a pH 6 la cepa de la invención produce mayores cantidades de caroteno que la cepa de referencia. (Recuperación de carotenos y cuantificación, como equivalentes de p-caroteno, según se indica en el Ejemplo 8, comprendiendo el procedimiento la ruptura con DMSO y la extracción con Dietiléter/Etil Acetato (1:1), y un ensayo de espectrofotometría de UV-Vis a 450 nm).

Por lo tanto, Sporobolomyces roseus CECT 13123 (LGO1107) tuvo la capacidad de crecer en melaza de mandarina con mayores rendimientos que la referencia CECT 13019, aunque esta última también tuvo la capacidad de crecer en este medio y también produjo carotenoides. Sin embargo, Sporobolomyces roseus LGO1107, con un alto rendimiento de producción de carotenoides y una mejor adaptación a este medio particular, supone una cepa ventajosa con una contribución industrial real.

Estos datos demuestran la versatilidad de la cepa de la invención en comparación con la cepa de referencia en relación a los medios de cultivo. Por lo tanto, la cepa de la invención no solo es capaz de crecer en varios medios de cultivo que comprenden melazas de frutas cítricas, también tiene la capacidad de producir carotenoides en todas estas condiciones analizadas. La producción de carotenoides, incluso en condiciones de estrés severas (por ejemplo pH 3), hace de la cepa CECT 13123 (LGO1107) una cepa realmente interesante para la industria alimentaria, en concreto en la revalorización del material de desecho procedente de la industria alimentaria de los cítricos.

Ejemplo 7. Comparación de Sporobolomyces roseus CECT 13123 (LGO1107) con Rhodotorula mucilaginosa DSM 70398

También se comparó la cepa LGO1107 con Rhodotorula mucilaginosa, otra levadura conocida por producir carotenoides (como se divulga en el documento WO2011130576), en un ensayo de laboratorio en el medio de levadura malta (YM) complementado con glucosa a distintas concentraciones (10, 20 y 40 g/l). Los inóculos se realizaron a una concentración de 105 células/ml y el cultivo durante 240 horas en matraces Erlenmeyer, pH 6 en un fermentador de 3 l. Los datos se representan en la Tabla 3 siguiente.

Tabla 3. Comparación de la producción en equivalentes de p-Caroteno (^g/g de biomasa seca)

Caldo R. mucilaginosa DSM S. roseus LGO1107

70398

YM 10 g/L glucosa 6.39 10.00

YM 20 g/L glucosa 11.18 18.40

YM 40 g/L glucosa 13.09 25.28

(cuantificado por UV-Vis como equivalentes de p-caroteno a 450 nm) (^g/g de biomasa seca)

A partir de esta comparación se deduce de forma directa la ventaja de utilizar S. roseus CECT 13123 (LGO1107) como productora de carotenoides. En las mismas condiciones de cultivo tuvo la capacidad de producir mayores cantidades de carotenos (principalmente pcaroteno) que otra levadura conocida también como productora de alto caroteno.

Todos los datos expuestos aquí permiten, así, concluir que podría establecerse un procedimiento de fermentación industrial añadiendo valor a los subproductos de frutas cítricas de la industria alimentaria. Esto se llevó a cabo con una cepa de Sporobolomyces roseus, la cual es una productora de altos carotenoides en relación a otras cepas de levadura y puede producir tales carotenoides en un medio que comprende melazas procedentes de materiales de desecho agroindustriales, incluso en condiciones de estrés severas para las levaduras, tales como un pH bajo.

Ejemplo 8. Efecto de los métodos de ruptura celular y extracción de carotenos para la recuperación de carotenos a partir de la biomasa seca aislada de R. glutinis, R. mucilaginosa o S. roseus.

Los inventores se centraron también en la provisión de un método para una determinación convencional de la recuperación de carotenos tras la fermentación con cepas de levaduras, y también en la provisión de un método de recuperación aceptable en la industria alimentaria, en donde las composiciones coloreadas de la invención pueden utilizarse.

En la bibliografía se identifican distintos métodos como útiles para lograr la ruptura de la pared celular de la levadura y también una gran cantidad de disolventes orgánicos y combinaciones para la extracción de carotenos del interior de la célula. La Tabla 4 siguiente resume los principales métodos de recuperación de carotenos (en las columnas, las etapas de procedimiento secuenciales).

Tabla 4. Métodos de recuperación de carotenos

EXTRACCIÓN DE CAROTENOS

CONCENTRACIÓN DE CAROTENOS

Evaporación de disolvente

Los inventores quieren indicar que la recuperación de carotenoides depende de las condiciones concretas de los métodos de ruptura y de extracción de carotenos (temperatura, disolventes, tiempo y tipo de agitación...) pero también de la cepa de células de levadura o de bacterias, lo que también tiene una fuerte influencia debido a las diferencias en la resistencia de la pared de cada cepa.

Para comparar distintas cepas y métodos, los resultados en las tablas a continuación se relacionan con la biomasa seca utilizada en cada procedimiento de ruptura y extracción.

Las siguientes Tablas 5 y 6 son solo ejemplos ilustrativos no relacionados con la cepa S. roseus CECT 13123 de la invención. Pero se incluyen para señalar la importancia de considerar las condiciones experimentales comparativas.

Tabla 5. (Ejemplo de referencia) Comparación de disolventes de la extracción de carotenos a partir de R. glutinis cultivada en caldo YM tras el uso de DMSO (50 °C) y agitación vorticial (cuantificado por UV-Vis como equivalentes de p-caroteno a 450 nm).

DISOLVENTE CONCENTRACIÓN DE CAROTENOS (|jg/g

de sedimento seco)

Dietiléter 97.88 ± 8.82

Dietiléter/Etil Acetato (1:1) 128.07 ± 6.53

Éter de Petróleo 114.50 ± 9.27

Éter de Petróleo/Acetona (1:2) 120.61 ± 6.03

Esta tabla ilustra la variabilidad debida a la naturaleza del disolvente utilizado en la extracción. Dietiléter/etil acetato (1: 1) permite los mayores rendimientos de extracción.

Tabla 6. (Ejemplo de referencia) Comparación de la recuperación de carotenos en los métodos con DMSO a partir de R. mucilaginosa y R. glutinis (cuantificado por UV-Vis como equivalentes de p-caroteno a 450 nm).

MÉTODO TIEMPO CONCENTRACIÓN DE CAROTENOS

(horas) (jg/mL)

R. mucilaginosa R.glutinis

DMSO (50 °C) y agitación 24 0.0636 ± 0.0190

vorticial 48 0.212 ± 0.00160 0.799 ± 0.016 Hexano/Acetona/Etanol 73 0.326 ± 0.00620 1.035 ± 0.059

(2:1:1) como disolvente 96 0.317 ±0.00190 1.499 ± 0.122 orgánico 162 0.620 ± 0.0303 1.852 ± 0.0550

168 0.612 ± 0.470 1.403 ± 0.204

DMSO (50 °C) y agitación 24 0.190 ± 0.054

vorticial 48 0.623 ± 0.005 2.31 ± 0.046 Dietiléter/Etil Acetato 73 0.948 ± 0.018 2.99 ± 0.169

^{(1:1) como disolvente 96 0.921 ± 0.005 4.31 ± 0.347}

162 1.79 ± 0.086 5.32 ± 0.156_{orgánico 168 1.76 ± 0.134 5.03 ± 0.582}

Los datos procedentes de esta tabla permiten concluir que ambos métodos son buenos para la recuperación de carotenos. La tabla también muestra que a pesar de las distintas especies de levadura y de las diferencias en la resistencia de su pared celular, el método que comprende agitación vorticial y extracción con Dietiléter/Etil Acetato (1:1), disolvente orgánico es el mejor en términos de concentración de carotenos. Este último método en particular es el propuesto y el utilizado por los inventores como el método analítico de referencia para comparar la producción de carotenoides (principalmente carotenos) entre especies y cepas de levadura.

Dado que este método es el que se ha utilizado para la cuantificación de carotenos en el Ejemplo 2-7, es el que se divulga con más detalle:

El medio de cultivo en donde se cultivaron las cepas de levadura se centrifugó durante 10 min a 10000 rpm y se lavó. El sedimento resultante se resuspendió en DMSO (precalentado a 50 °C) para provocar la ruptura de la pared celular de las levaduras. Los carotenoides se extrajeron con una mezcla de disolventes de dietiléter/etil acetato (1/1 v/v) y se agitó en un genoGrinder® durante 5 min a 480 min-1. La extracción se realizó dos veces y finalmente se mezclaron los sobrenadantes. Se añadió NaCl para estimular la separación de fases durante la centrifugación (10 min, 10000 rpm).

Con flujo de nitrógeno se evaporó un volumen conocido de esta fase superior. Los carotenoides extraídos se disolvieron en acetona (4 ml), se filtró la disolución (0,45 micrómetros) y se midió la absorbancia a 454 nm (espectrofotómetro de UV-Vis). El patrón de calibración se realizó con diluciones de p-caroteno (0,2-10 ^g/ml). Con este procedimiento, la concentración de carotenos se determina/cuantifica mediante UV-Vis como equivalentes de p-caroteno a 450 nm. Como se expone anteriormente, los “equivalentes de p-caroteno” es la cantidad total de carotenos de cualquier tipo en una solución que proporciona las mismas unidades de absorbancia (U.A.) que corresponderán con una solución con p-caroteno puro (sin otro compuesto de tipo caroteno).

Para fines industriales, en particular debido a la normativa de la industria alimentaria, la ruptura de la pared celular y la extracción de carotenos no puede realizarse con DMSO. Por lo tanto, se han ensayado métodos alternativos, en particular la combinación de ruptura celular con molienda o con impulsos de alto voltaje con la extracción con acetona como disolvente orgánico.

La siguiente Tabla 7, que se refiere a Spombolomyces rnseus CECT 13123, detalla la recuperación de carotenos (mg/g de biomasa) obtenida en dos ensayos de fermentación (1 y 2) y utilizando distintos procedimientos de recuperación.

Tabla 7. Comparación de la recuperación de carotenos a partir de Sporobolomyces roseus CECT 13123 (cuantificado por UV-Vis como equivalentes de beta-caroteno a 450 nm) (mg/g de biomasa)

EXPERIMENTO PROCEDIMIENTO DE RECUPERACIÓN DE DMSO (50 °C) y Molienda Impulsos Eléctricos FERMENTACIÓN agitación vorticial Acetona como

Dietiléter/Etil Acetato disolvente orgánico de Alto voltaje (1:1) como disolvente ^{Acetona como} orgánico disolvente orgánico

1 0.065 0.075 0.091

2 0.043 0.050 0.059

Esta tabla 7 permite concluir que cuando se aumenta la escala de los procedimientos de laboratorio (ruptura de la pared celular con DMSO), la recuperación se mantiene o incluso se mejora.

Ejemplo 9. Identificación de la composición de carotenos

La cantidad total de compuestos de carotenos se midió por espectrometría de UV-Vis como equivalentes de p-caroteno a 454 nm. Este método se ha utilizado en todos los ejemplos anteriores cuando se hizo referencia a la cuantificación de carotenos.

Además, la identificación y cuantificación de los compuestos de caroteno individuales se realizó mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC de Agilent, columna C18, gradiente de la fase móvil de acetona (A) y agua (B) a 1 ml/min con un volumen de inyección de 20 microlitros) y detección de haz de diodos a dos longitudes de onda distintas (450 nm y 490 nm). Los compuestos principales identificados en cada una de las muestras ensayadas procedentes de la fermentación de medio PDA por CECT 13123 fueron: pcaroteno, Y-caroteno, toruleno y torularrodina. No hay disponible ningún patrón de referencia para la cuantificación de toruleno; por lo tanto, este compuesto se cuantificó utilizando un patrón de p-caroteno de acuerdo con la bibliografía.

Los resultados obtenidos para Sporobolomyces roseus CECT 13123 en varias fermentaciones en medio PDA a 168 horas se muestran en la Tabla 8, en la que se establecen los intervalos de porcentajes en peso de cada uno de los carotenos detectados. Los datos también se representan en el cromatograma de la FIG. 11

Tabla 8. Composición de carotenos a partir de Sporobolomyces roseus CECT 13123

Compuesto de Intervalo de % (peso/peso, el total de compuestos

caroteno carotenos es el 100% de carotenos en la muestra)

(Cuantificación por HPLC/equivalentes de beta-caroteno

por medición de UV-Vis)

p - caroteno 48 -50

Y - caroteno 10 -12

Toruleno 26 -28

Torularrodina 12 -14

La producción de carotenos total y la composición relativa depende de varios aspectos, tales como la composición del medio (es decir, el tipo y concentración de azúcar y nitrógeno), los factores de estrés (luz, oxígeno, etc.) y el tiempo de fermentación. Esto es así debido a que la producción de carotenos por parte de la cepa de levadura es en respuesta a las condiciones de estrés. Por lo tanto, dependiendo de dicho estrés se obtiene un patrón cuantitativo de carotenos dentro de los intervalos de la Tabla 8. Siempre se obtiene pcaroteno con al menos el 40 % en peso y el resto de los carotenos indicados también están presentes en la composición coloreada que se puede obtener por la acción de Sporobolomyces roseus CECT 13123.

Ejemplo 10. Aislamiento de las fracciones de carotenoides

Se realizó una extracción en fase sólida (en sílice) para obtener distintas composiciones colorantes. Una composición se relacionó con la fracción de torularrodina y otra composición se relacionó con p-caroteno, toruleno y Y-caroteno.

Como observará el experto en la materia, si se desea el p-caroteno puede purificarse adicionalmente del resto de los carotenos (toruleno y Y-caroteno), mediante varias series de destilación o, como alternativa, mediante varias etapas de extracción con disolvente (extracción en fase sólida o líquido-líquido) o, como alternativa, mediante técnicas de cromatografía.

Ejemplo 11. Comparación de la composición coloreada de la invención con la descrita en Davoli et al. “Carotenoids and fatty acids in red yeasts Spombolomyces rnseus and Rhodutorula glutinis’’ Appl. Biochem. And Microbiol. 2004, vol. 40, pág. 392-397.

En un intento de determinar si la composición coloreada que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención (a base de la cepa LGO1107) tiene alguna diferencia con la técnica anterior relacionada, se llevó a cabo una serie de experimentos. En particular, los inventores querían determinar si la composición coloreada de la invención tiene alguna diferencia en la composición de carotenoides y de ácidos grasos con respecto a la composición coloreada descrita en Davoli et al. (citado anteriormente), que describe la cepa Spombolomyces rnseus D99040.

Como puede observarse en la FIG. 12 y la FIG. 13, hay claras diferencias entre las composiciones coloreadas obtenidas mediante las dos cepas.

La FIG. 12 representa la clara diferencia en términos de proporción de carotenoides entre las dos composiciones. La selección de la cepa tiene un efecto estadísticamente significativo sobre todos los compuestos de carotenoides en el intervalo de confianza del 95,0 %. La composición obtenida mediante la cepa descrita en Davoli et al. tiene una mayor proporción de p-caroteno y toruleno, en comparación con la composición obtenida mediante la cepa LGO1107. De forma adicional, la composición obtenida mediante la cepa descrita en Davoli et al. tiene una menor proporción de torularrodina en comparación con la composición obtenida mediante la cepa LGO1107. Debe tenerse en cuenta que los contenidos en pcaroteno también son claramente distintos en los experimentos convencionales.

Debe indicarse en este punto que las diferencias en la proporción de tipos de carotenoides tienen una influencia en el color final de la composición así como en su actividad antioxidante. La torularrodina, que tiene una mayor proporción en la composición coloreada obtenida de la cepa LGO1107, tiene un efecto más potente en la captación de radicales peroxilo que otros carotenoides tales como p-caroteno; además, inhibe la degradación de sustrato por oxígeno singlete de forma más eficaz que el p-caroteno (Sakaki, H., “Effect of active oxygen species on the productivity of torularhodin by Rhodotorula glutinis No. 21” J. Biosci. Bioeng. 2002, vol. 93, pág. 338-340).

La FIG. 13 representa la clara diferencia en términos de proporciones de ácidos grasos entre las dos composiciones. La composición obtenida mediante la cepa descrita en Davoli et al. tiene una proporción distinta de ácidos grasos C18 en comparación con la composición obtenida mediante la cepa LGO1107. En particular, se observa que la fracción de C18:2 (ácido linoleico) es mucho mayor en la composición coloreada obtenida mediante la cepa D99040, mientras que la fracción de C18:1 (oleico) es mucho mayor en la composición coloreada obtenida mediante la cepa LGO1107. Se ha sugerido que el grado de insaturación se relaciona de forma proporcional con la tasa de oxidación. Por lo tanto, la composición de LGO1107, debido a su mayor proporción de ácido oleico, podría propiciar la estabilidad de la composición coloreada como un antioxidante.

Para finalizar, también debe indicarse que la cepa de la presente invención es mucho más eficaz que la cepa divulgada en Davoli et al. (citado anteriormente) en términos de producción de carotenoides, dado que la producción en una matraz recto es de 108,9 ^g/g de materia seca para D99040, mientras que en el caso de la cepa de la invención (LGO1107), la producción es de 6599,6 ± 1108,5 ^g/g.

Por lo tanto, es de esperar que la composición coloreada que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención tenga un comportamiento distinto al de la composición divulgada en Davoli et al.

REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD

- Marova et al. "Use of several waste substrates for carotenoid-rich biomass yeast production”, Journal of Environmental Management- 2012, vol. n.° 95, pág.: s338-s342 - Mata-Gómez et al. “Biotechnological production of carotenoids by yeast: an overview”, Microbial Cell Factories-2014, vol. n.° 13:12.

- Documento US20120142082

- Documento JPH0622748

- Documento WO2011130576

- Davoli et al. “Carotenoids and fatty acids in red yeasts Sporobolomyces roseus and Rhodutorula glutinis” Appl. Biochem. And Microbiol. 2004, vol. 40, pág. 392-397 - Sakaki, H., "Effect of active oxygen species on the productivity of torularhodin by Rhodotorula glutinis n.º 21" J. Biosci. Bioeng. 2002, vol. 93, pág. 338-340

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de levadura aislada de Spombolomyces rnseus depositada el 25 de marzo de 2015 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con la referencia de identificación LGO1107 y que recibió el número de referencia CECT 13123.

2. Un procedimiento de obtención de una composición coloreada que comprende carotenoides, comprendiendo el procedimiento:

- fermentar en condiciones aeróbicas una composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno con una cepa de levadura como se define en la reivindicación 1;

- aislar la cepa de levadura; y

- romper la pared celular de la levadura para liberar la composición que comprende carotenoides.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende las etapas de:

(a) preparación de un precultivo de una cepa como se define en la reivindicación 1;

(b) inoculación de una composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno con el precultivo de la etapa (a);

(c) fermentación de forma aeróbica de la fuente de carbono de la composición de medio de cultivo; y

(d) aislamiento de la cepa de levadura, y

(e) ruptura de la pared celular de la levadura para liberar la composición que comprende carotenoides.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la etapa (b) se lleva a cabo con una concentración de inóculo de la cepa de 103 a 108 UFC/ml de medio de cultivo.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la fermentación del medio de cultivo se realiza en un intervalo de temperaturas de 20 °C a 35 °C.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que la fermentación del medio de cultivo se lleva a cabo en un intervalo de pH de 2,0 a 8,0.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que las condiciones aeróbicas comprenden la oxigenación a un caudal de 2 a 10 l/min del 20 % v/v-30 % v/v, en el que v/v significa volumen de aire que contiene hasta el 21 % de O2 por volumen de medio de cultivo.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que la composición de medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una de nitrógeno es un medio de cultivo que comprende melaza de frutas cítricas.

9. Una composición coloreada que comprende carotenoides obtenible mediante un procedimiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2-8, comprendiendo dicha composición p-caroteno, Y-caroteno, toruleno y torularrodina.

10. La composición coloreada de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el porcentaje en peso de p-caroteno es al menos del 40 % en relación a la cantidad total de carotenos en la composición (p/p), dichos carotenos se recuperan rompiendo las células de levadura con dimetilsulfóxido precalentado a 50 °C y extrayendo la célula de levadura rota con dietiléter/etil acetato (1:1).

11. Uso de una cepa como se define en la reivindicación 1, o de una composición coloreada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-10, como agentes antioxidantes.

12. Uso de una cepa como se define en la reivindicación 1, o de una composición coloreada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-10, como agente productor de coloración.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el efecto colorante se aplica en un producto seleccionado del grupo que consiste en un producto comestible, una composición farmacéutica oral, una composición nutracéutica y una composición cosmética.

14. Un producto comestible que comprende una cantidad eficaz de una cepa como se define en la reivindicación 1, o una composición coloreada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-10, junto con cantidades apropiadas de ingredientes comestibles.

15. Uso de una cepa como se define en la reivindicación 1, o de una composición coloreada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-10, como un ingrediente de un producto comestible.