ES2654674T3 - Método para seleccionar compuestos usando membrana de STIM1 - Google Patents

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Olivier Mignen
Miguel Burgos
Jacques Olivier Pers
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Centre Hospitalier Regional et Universitaire de Brest
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Abstract

Uso de la fracción aislada de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células en un método in vitro para la selección de moléculas candidatas para tratar leucemia linfática crónica y/o lupus eritematoso sistémico.

Description

Método para seleccionar compuestos usando membrana de STIM1
5 CAMPO DE TECNOLOGÍA
La presente invención se refiere al uso de la fracción de membrana de la proteína STIM1 (molécula de interacción estromal 1 o GOK) en un método de selección, como también a una sustancia que interactúa con la fracción de la proteína STIM 1 localizada en la membrana de plasma para uso terapéutico y una composición farmacéutica que
10 comprende al menos esta sustancia.
En la descripción dada más adelante, las referencias en corchetes ([ ]) se refieren a la listar de referencias dadas al final del texto.
15 TÉCNICA ANTERIOR
El lupus eritematoso sistémico (SLE) y la leucemia linfocítica crónica (CLL) todavía son incurables.
SLE es una enfermedad heterogénea, de origen autoinmune, se caracteriza por la presencia de linfocitos auto
20 reactivos y de anticuerpos antinucleares (ANA). Es una enfermedad multisistémica, con manifestaciones clínicas muy variadas. La prevalencia varía en grupos étnicos diferentes, pero se estiman en aproximadamente 1 en 10000, con una proporción de masculino/femenino de 10:1. La heterogeneidad clínica de esta enfermedad se refleja su complejidad etiopatogénica que comprende factores tanto genético como ambiental. SIE puede afectar todos los órganos. Las manifestaciones más comunes son sarpuILido, artritis y fatiga. Las manifestaciones más severas
25 incluyen nefritis, desórdenes neurológicos, anemia y trombocitopenia. Más de 90% de pacientes tienen ANAs que se consideran positivos por encima de 1/160a. SLE es una enfermedad con evolución episódica. Las metas del tratamiento actual son: tratar los episodios agudos que puede comprometer el pronóstico vital, minimizar los riesgos de brotes durante períodos de estabilidad relativa y monitorear los síntomas que, aunque no ponen en peligro el pronóstico vital, afectan la cualidad cotidiana de la vida.
30 Hidroxicloroquina y los anti-inflamatorios no-esteroides son indicados en las formas moderadas de SLE; los corticoides y los inmunosupresores se reservan para las formas más severas; el anticuerpo monoclonal anti-CD20 (Rituximab, Mabthera®) que se dirige a los linfocitos B (células B) se indica actualmente en pacientes que son afectados de la manera más severa y no han respondido a los tratamientos usuales ([1]). A pesar del mejoramiento
35 en el pronóstico después de la introducción de corticoides e inmunosupresores, SLE continúa teniendo un impacto significativo en la morbidez y la mortalidad de pacientes.
CLL es una hemopatía maligna crónica que también afecta las células B. Estas células desempeñan un papel importante al nivel del sistema inmune. En el curso de CII, las células B de CII se bloquean en su ciclo de vida 40 cuando alcanzan la madurez y su producción continua. En consecuencia, estas células B se acumulan eventualmente en la sangre, en los ganglios, el bazo, el hígado y la médula ósea, lo cual dirige a un incremento en el volumen de los órganos linfáticos secundarios. Los tratamientos actualmente disponibles contra CII se usan de la manera más frecuente cuando la enfermedad se encuentra en una etapa avanzada. Los productos quimioterapéuticos que se usan en el tratamiento intenso de CII son clorambucilo usado solo, fludarabina usada 45 sola, quimioterapia mensual del tipo CHOP (combinación de cuatro agentes: ciclofosfamida-(H)adriamicina-oncovina (vincristina)-prednisona). En términos de terapia dirigida, como las células B leucémicas son CD20+, en el tratamiento puede usarse un anticuerpo monoclonal específicamente que reconoce esta diana (rituximab, Mabthera®). Otro agente es tirosina cinasa de Bruton que es específico para las células B cuya expresión se incrementa en las células leucémicas. Ibrutinib, que es un inhibidor de la enzima, conduce a la apoptosis (muerta) de
50 las células leucémicas, que dan remisiones más largas, incluso en formas refractarias o recurrentes. Sin embargo, los tratamientos pueden dar exposición a efectos indeseables.
En la patología de SLE y CLL, se describe una perturbación de las señales de calcio de las células B en SLE y CLL que sigue a la estimulación del receptor de antígeno de células B (BCR) ([2, 3]).
55 Además de estos efectos de la señalización de calcio, las células B de SLE se caracterizan por una deficiencia de la producción de interleucina 10 (IL-10), la cual afecta la actividad de los linfocitos B reguladores (Bregs) ([4,5]). Esta deficiencia de actividad de Bregs en SLE conduce a menos regulación de la proliferación de linfocitos T (células T), el cual puede contribuir nuevamente a amplificar el proceso de autoinmunidad ([5]).
60 El diagnóstico y el pronóstico de CLL y de SLE se basan en una compilación de criterios clínicos y biológicos imperfectos, por consiguiente en la necesidad de desarroILar nuevos criterios, más efectivos.
En ambos trastornos, la célula B representa la diana terapéutica principal. Sin embargo, algunos pacientes no 65 responden a tratamientos existentes.
Por lo tanto, hay una necesidad real de ofrecer nuevas soluciones terapéuticas las cuales superen estos defectos, desventajas y obstáculos de la técnica anterior e involucren dianas terapéuticas que son fácilmente accesibles, específicas y selectivas para las células afectadas para la enfermedad que va a tratarse.
5 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención hace posible responder a estas necesidades usando la fracción localizada en la membrana de plasma de la proteína STIM1, la cual es una proteína involucrada en la activación y regulación de canales de calcio, como diana terapéutica de SLE y CLL.
10 La solicitante también ha demostrado, de manera sorprendente, que puede usarse cualquier medio para control directo o indirecto de la actividad de la proteína STIM1 que se localiza en la membrana de plasma para modular la respuesta celular de la célula B, y de esta manera para proporcionar una nueva solución terapéutica en SLE y CLL. Por lo tanto, la invención describe el uso en este contexto de cualquier herramienta que modula (i) la expresión de la
15 proteína STIM1 localizada en la membrana de plasma, (ii) direccionamiento de la membrana de esta proteína, o (iii) la actividad biológica de esta proteína en la membrana del linfocito.
Y. Renaudineau »Abnormal calcium influx in T y B lymphocytes from lupus eritematoso sistémico patients is related to STIM-1 over-expression» (Entrada anormal de calcio en linfocitos T y B de pacientes con lupus eritematoso 20 sistémico se relaciona con la sobre-expresión de STIM-1), ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES, vol. 72, No. Suppl1, 25 de febrero de 2013, páginas A30-A31) y Fali et al. »The calcium sensor stromal interaction molecule 1 (STIM 1) controls regulatory B ceIL functions y its activity is impaired in Lupus eritematoso sistémico patients» (La molécula 1 de interacción estromal (STIM 1) del sensor de calcio controla las funciones reguladoras de las células B y su actividad se perjudica en pacientes con lupus eritematoso sistémico), ANNALS OF THE RHEUMATIC
25 DISEASES, vol. 73, No. Suppl1, 1 de enero de 2014, páginas A49-A50) divulgan que STIM1 se sobreexpresa en SLE, al compararse con controles sanos. La sobreexpresión de STIM1 se miden mediante Western blot (inmunoelectrotransferencia) y citometría de flujo en células enteras. Por lo tanto, en estos documentos se detecta el contenido completo de proteínas de STIM1, es decir proteínas STIM1 que se localizan tanto en la membrana de plasma como en el retículo endoplásmico.
30 En el contexto de la presente invención se observa lo siguiente, de manera sorprendente, en las células B de pacientes con lupus:
(1) un incremento en la expresión total de la proteína STIM 1 e inducción de la fracción de STIM 1 localizada en la 35 membrana de plasma que permanece en baja o incluso desde cero en las células B de los controles,
(2) activación de la ruta de MAPK (quinasas de proteína activadas por mitógeno) con fosforilación de las quinasas Erk1/2 (quinasas extracelulares reguladas por señal) en las células B de SLE que poseen la fracción de STIM1 localizada en la membrana de plasma en reposo, en particular en las células B de SLE en la etapa
40 inmadura/transicional,
(3)
una entrada constitutiva incrementada de Ca2+ extracelular, y
(4)
una correlación entre el incremento en la expresión de STIM1, la entrada constitutiva de Ca2+ extracelular y las
45 perturbaciones de activación de la ruta de MAPK ERK1/2 que pueden explicar la activación general de la célula, la supervivencia de las células B auto-reactivas y, por lo tanto, el proceso de autoinmunidad.
Con respecto a la actividad de los Bregs de SLE, se observa sorprendentemente, por primera vez, en el contexto de la presente invención: 50 (x1) que la actividad reguladora deficiente de los Bregs está ligada al incremento en la expresión de la molécula de STIM1 en las células B de SLE,
(x2) que el bloqueo de la molécula de STIM1 localizada en la membrana de plasma, se efectuó específicamente por
55 un anticuerpo de bloqueo o de manera no específica por una STM1 de direccionamiento de ARNip en las células B de SLE, restaura (i) la producción de Il-10 por los Bregs de SLE, (ii) la inhibición de la proliferación de las células T, y
(iii) la inducción de las células T reguladoras. El bloqueo de STIM1 localizado en la membrana de plasma no tiene efecto en los controles sanos.
60 Para las células B de CLL, la solicitante observó también, de manera sorprendente:
(a) que el incremento en el nivel de línea de base del calcio intracitoplásmico fue asociado con un incremento en la supervivencia de las células B de CLL, la activación de la ruta de MAPK Erk1/2, la translocación nuclear de los factores de transcripción NFAT2 (factor nuclear de células T activadas) y STAT3 (transductor de señal y activador de
65 transcripción 3 3), así como también la síntesis de Il-1 0 ([5]),
(b)
que el incremento en la entrada constitutiva de Ca2+ extracelular fue regulado por el incremento en la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma.
(c)
que la presencia de la proteína de STIM1 en la membrana (grupo I) o su ausencia (grupo II) permite distinguir dos grupos de pacientes.
(d)
que un anticuerpo anti-STIM1 dirigido contra la molécula de STIM1, presente en la membrana de plasma, era capaz de reducir en gran medida la entrada constitutiva de Ca2+ extracelular a las células B de CLL de grupo I y más débilmente a las células B de CLL de grupo II,
(e)
que la combinación de un anticuerpo anti-STIM1 que se dirige específicamente a la fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma con el anticuerpo anti-CD20 (rituximab: RTX), era capaz de restaurar el efecto apoptótico inducido por RTX en los pacientes con células B de grupo I (presencia de la proteína de STIM1 en la membrana de plasma). La adición del anticuerpo anti-STIM1 no tiene efecto en el efecto apoptótico de anti-CD20 de los pacientes del grupo II (ausencia de la proteína de STIM1 en la membrana).
La invención describe el uso de la fracción de STIM1 localizada en la membrana de plasma como una nueva diana terapéutica en SLE y CLL.
La invención también describe el uso de moduladores de la fracción de STIM1 localizada en la membrana de plasma en estos trastornos.
La invención describe el uso de la fracción aislada de STIM1 localizada en la membrana de plasma como una diana terapéutica en SLE y CLL mediante modulación de su presencia o de su actividad. Por lo tanto, la invención describe, entre otras cosas, (i) la inhibición de la expresión de la molécula de STIM 1 en la membrana de plasma de las células, (ii) inhibición de la membrana de direccionamiento de esta proteína, y (iii) inhibición de la actividad biológica de la proteína de STIM 1 presente en la membrana de plasma.
Se propone, notablemente en pacientes de CLL resistentes al tratamiento con RTX, bloquear la actividad de STIM1 localizada en la membrana de plasma por un anticuerpo anti-STIM1 que se dirige a la fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma. En realidad se propone que la modulación de las entradas de Ca2+ que depende de la fracción de STIM1 localizada en la membrana de plasma por los moduladores de STIM1 tales como un Ac anti-STIM1 sensibilicen las células a la apoptosis inducida por RTX.
La invención es ventajosa en varios puntos; notablemente, el marcador sólo está presente en las células afectadas y no en las células sanas lo cual permite una ganancia en especificidad y en selectividad. Además, la expresión por parte de células inmunes de la proteína de STIM1 al nivel de la membrana de plasma facilita la accesibilidad de esta diana.
Por lo tanto, un primer objeto de la invención se refiere al uso de la fracción aislada de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células en un método in vitro para seleccionar moléculas candidatas para tratar SLE y/o CLL.
"Fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células" significa, en el sentido de la presente invención, la fracción glicosilada de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células. La proteína de STIM1 posee dos sitios de glicosilación, una asparagina en posición 131 y otra en posición
171. La glicosilación de la molécula de STIM1 es un proceso necesario y obligatorio para direcciona la molécula de STIM1 en la superficie de la célula ([7]). Esta fracción tiene un peso molecular aproximado de 90±2kDa, lo cual hace posible distinguirla de la forma no glicosilada de STIM1 (84±2 kDa). Las dos formas son detectables mediante Western blotting ((inmunoelectrotransferencia). La molécula de STIM1 (molécula de interacción estromal; también ILamada GOK) humana es una proteína que tiene la ID NO: 1 que corresponde a la secuencia de Uniprot: Q13586 o NCBI: NP _003147.2. Esta proteína está codificada por la secuencia ID NO: 2, correspondiente a la secuencia de NCBI: NM_003156.3 (transcrito de ARNm).
"Fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma" significa cualquier producto biológico que resulta del aislamiento de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células. El aislamiento puede realizarse por todos los medios conocidos por una persona con habilidades en la técnica, por ejemplo usando un detergente (por ejemplo un tensioactivo no iónico o iónico tal como Triton X-1 00 o Triton NI 01; o ésteres de polioxietileno sorbitán), después de una centrifugación diferencial o mediante una técnica inmunoquímica o química de proteínas que usa un paso de direccionamiento de las proteínas de membrana (anticuerpo, Thermo scientific sulfo-NHS-SS-biotina), y este listado no es limitante.
"Células" significan, en el sentido de la presente invención, cualquier célula que expresa STIM1 al nivel de la membrana de plasma. De manera ventajosa, las células o células inmunes. Pueden ser, por ejemplo, células B y células T. De manera ventajosa, las células son células B de pacientes con SLE o CLL.
"Método de selección" significa, en el sentido de la presente invención, cualquier método que permite la identificación de una sustancia que interactúa con la fracción de membrana de la proteína de STIM1 o que modula su expresión de membrana. Puede ser cualquier método conocido por una persona con habilidad en la técnica, por ejemplo selección biológica, por ejemplo una técnica seleccionada del grupo que comprende inmunofluorescencia, Western blot (inmunoelectrotransferencia), inmunoprecipitación, resonancia plasmónica de superficie (SPR), citometría de flujo, microscopía con vídeo, estudio de flujos de calcio, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), y microscopía confocal o selección biofísica, por ejemplo midiendo las variaciones en la concentración de calcio intracelular mediante fluorescencia.
"Molecula candidata" significa, en el sentido de la presente invención, cualquier molécula que interactúa con la fracción de la proteína de STIM 1 localizada en la membrana de plasma de las células. La interacción puede ser del tipo de fijación de la molécula candidata sobre la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células. Como alternativa, la interacción puede ser una modulación de la actividad o de la expresión de esta proteína. La modulación de la actividad de la fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma puede ser debido a la modificación de la inserción de STIM 1 en la membrana de plasma, o a una modificación de su interacción con las proteínas que se asocian con eILa. La modulación de la actividad de la proteína puede reflejarse en un cambio de los flujos de calcio tal como un cambio en la entrada constitutiva de calcio intracelular o un cambio en las entradas de calcio activadas durante la estimulación de un receptor tal como las entradas de calcio que dependen de la liberación de reservas (SOCE, entrada de calcio operada por almacenamiento). La modulación de la expresión puede ser un incremento o una disminución en la expresión de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma en relación con un nivel medido en la misma célula o en una célula comparable antes de la aplicación de la molécula candidata. La modulación de la expresión de la proteína de STIM1 puede estar ligada, por ejemplo, a modificaciones transcripcionales, modificaciones epigenéticas o a una modulación del proceso de glicosilación que es indispensable para la membrana de direccionamiento de la proteína de STIM1.
Un segundo objeto de la invención se refiere a una sustancia que interactúa con la fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células, para usar como un producto medicinal en el tratamiento de SLE y/o CLL, y dicha sustancia es un anticuerpo dirigido contra un fragmento de la proteína de STIM1 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.
"Sustancia" significa, en el sentido de la presente invención, cualquier molécula que presenta interacción del tipo fijación a la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma o modulación de la actividad o de la expresión de esta fracción de membrana de la proteína de STIM1, tal como se ha definido antes. La sustancia puede ser de origen natural o sintético. Puede ser una proteína producida químicamente o por cualquier método de bioingeniería, tal como una purificación. La sustancia puede ser identificada notablemente aplicando el método de selección tal como se ha definido antes.
La sustancia es un anticuerpo dirigido contra un fragmento extracelular de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de secuencia SEQ ID NO: 3. Esta secuencia corresponde a aminoácidos 23-213 de STIM1. Puede ser el anticuerpo anti-GOK/STIM1 (clon: 44, BD Biosciences reference 910954).
La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende al menos una sustancia tal como ha sido definida antes, cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado, que comprende por ejemplo excipientes de aditivos que facilitan la formulación de la sustancia en preparados que pueden usarse farmacéuticamente, y un anticuerpo anti-CD20. La expresión "farmacéuticamente aceptable" abarca cualquier vehículo que no interfiere negativamente con la eficacia de la sustancia para tratar SLE o CLL, y que no es tóxica para el hospedero al cual se administra. En particular, vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para una composición según la invención son vehículos que son adecuados en particular para aplicación sistémica. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica anterior y se describe, por ejemplo, en Remington Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, Estados Unidos de América, 1985), el cual es un texto de referencia estándar en este campo. Pueden ser, por ejemplo, uno o más componentes seleccionados de citrato de sodio, polisorbato 80, cloruro de sodio, hidróxido de sodio, ácido clorhídrico y agua para inyección.
Ventajosamente, la composición según la invención puede encontrar aplicación como un producto medicinal. De manera particularmente ventajosa, la composición de la invención puede encontrar aplicación como un producto medicinal en el tratamiento de SLE o de cáncer tal como CLL.
Se describe una composición farmacéutica que comprende cualquier principio activo que potencia el efecto de la sustancia tal como se ha definido antes. Puede ser una molécula asociada con el complejo de proteína que regula los canales de calcio, asociada con la proteína de STIM1, tal como las proteínas Orai y TRPC.
Anti-CD20 puede ser cualquier anti-CD20 conocido en terapia humana o animal, por ejemplo el anticuerpo IDEC-C2B8 (Rituximab, distribuido por Hoffman-la Roche en Europa. Drugbank DB00073 (BIOD00014, BTD00014), atumumab (Arzera, GlaxoSmithKline), tositumomab (GSK, DB00081, BIOD00085, BTD00085), obinutuzumab
(Gazyva, Roche, DB08935, GA101), ibritumomab (Tiuxetan, IDEC Pharmaceuticals, DB00078, BIOD00069, BTD00069), ublituximab (lFB) o AME-133v (liILy, l Y2469298), y esta lista no es limitante.
Otras ventajas también pueden volverse obvias para una persona con habilidades en la técnica después de leer los ejemplos dados a continuación, ilustrados por las figuras anexas, dadas para propósitos de ilustración.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS:
La figura 1 presenta demostración de membrana STIM1 en los linfocitos B (células B) de lupus eritematoso sistémico (SLE) y las células B de leucemia linfocítica crónica (CLL) mediante Western blot (inmunoelectrotransferencia) (A/B) y citometría de flujo (C/D). La figura A presenta la demostración de una banda a 90 kDa para la fracción glicosilada de STIM1 mediante Western blot en las células B de SLE, versus las células B de control de controles sanos. Esta glicosilación de la proteína de STIM1 es indispensable para su inserción en la membrana de plasma. La Fig. B presenta la demostración por medio de Western blot de una banda a 90 kDa para la fracción de STIM1 localizada en la membrana en las células B de CLL que expresan membrana de STIM1 (mSTIM1 +) versus las células de control B de CLL que no expresan membrana STIM1 (mSTIM 1-). La Fig. C presenta la demostración mediante citometría de flujo para la fracción de STIM1 localizada en la membrana en las células B de SLE que expresan membrana STIM1 (mSTIM1+) versus las células B de control de controles sanos que no expresan membrana STIM1 (mSTIM1). La Fig. D presenta la demostración mediante citometría de flujo para la fracción de STIM1 localizada en la membrana en las células B de CLL que expresan membrana STIM1 (mSTIM1+) versus las células B de CLL de control que no expresan membrana STIM1 (mSTIM1-).
La figura 2 presenta la demostración de la inhibición de la entrada de calcio constitutivo por un anticuerpo anti-STIM1 antibody (clon Gokl44, BD Biosciences) dirigido contra un epítopo extracelular de la proteína de STIM1 localizada en las células B de membrana de plasma de la línea humana JOK PlP ([6]), de la línea JOK CD5 ([6]), y linfocitos B de leucemia linfocítica crónica (CLL). Las Figs. A y B muestran la medición de la entrada constitutiva y de los efectos del anticuerpo anti-STIM1 en la entrada constitutiva (expresada en dF/Fo a.u., unidades arbitrarias) medidos en los linfocitos B de las líneas humanas JOK PlP (A) y JOK CD5 (B) en una placa de pozos múltiples usando un lector de placas para células pre-tratadas (5 µg/ml de anticuerpos durante 60 min) con el anticuerpo de control (CTRl, isotipo de IgG2a, Beckman Coulter) o con el anticuerpo anti-STIM1/GOK. La Fig. C muestra la medición de la entrada constitutiva y de los efectos del anticuerpo anti-STIM1 en esta entrada (como la proporción dF/Fo a.u.) Sobre las células B de CLL en imágenes de célula individual para células previamente tratadas (5 µg/ml de anticuerpo durante 60 minutos) con el anticuerpo de control (CTRl, isotipo IgG2a) o con el anticuerpo antiSTIM1/GOK.
La Fig. D muestran la ausencia de un efecto del anticuerpo anti-STIM1 en la entrada de calcio que depende de la liberación de SOCE (entrada de calcio operada por almacenamiento) de reserva inducida por tapsigargina (1 µM, Sigma-Aldrich) y que se mide en las células B de CLL.
La figura 3 presenta la demostración de los efectos del anticuerpo anti-STIM1 (clon Gokl44) (A) en la viabilidad celular sola o (B) en la sinergia con el anticuerpo anti-CD20 (rituximab), (C) en la entrada de calcio constitutivo (Ca2+) en las células B de leucemia linfocítica crónica (CLL) en pacientes clasificados en dos grupos dependiendo de la expresión (mSTIM1+) o no (mSTI M 1-) de la proteína de STIM1 en la membrana de plasma y (D) en la inhibición de la proliferación de linfocitos T (actividad de Breg) por las células B de lupus eritematoso sistémico (SLE). La Fig. A representa el porcentaje de células vivas después de 48 horas de cultivo para las células B de CLL en los dos grupos mSTIM1+ o mSTIM1-en la presencia de 10 µg/ml de un anticuerpo de control isotípico (iso Ab, isotipo de IgG2a, Beckman Coulter) o en la presencia de 10 µg/ml del anticuerpo anti-STIM1/GOK. La Fig. B muestra el porcentaje de células de CLL vivas después de 48h de cultivo para las células B de CLL en los dos grupos mSTIM1+
o mSTIM1-en la presencia de 10 µg/ml de un anticuerpo de control isotípico (iso Ab, isotipo de IgG2a, Beckman Coulter), en la presencia de 10 µg/ml de rituximab (anti-CD20), o la combinación de rituximab (10 µg/ml) y antiSTIM1/GOK (10 µg/ml). La Fig. C muestra la reducción de la entrada constitutiva de Ca2+ (expresada como la proporción dF/Fo a.u., unidades arbitrarias) en las células B de CLL del grupo que expresa STIM1 en la membrana de plasma (mSTIM1 +) después del pretratamiento o no (control sin adición) de las células con 5 µg/ml de anticuerpo anti-STIM1/GOK.
Fig. D muestra la inhibición de la proliferación de las células expresadas en porcentaje por las células B de SLE en un modelo de co-cultivo autólogo 1:1 después de 4 días en la presencia de un anticuerpo anti-STIM 1/GOK o de un control sin adición.
Ejemplos
Ejemplo 1: Método para detectar membrana STIM1
Los linfocitos B fueron purificados a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas en un gradiente de FicoIL después de retirar los linfocitos T (técnica de roseta que usas glóbulos rojos de oveja previamente tratadas con neuraminidasa) y monocitos (técnica de agotamiento negativo, kit de célula B sin CD43,
Stem CeIL Technologies). La pureza de las células B positivas para CD19 fue verificado mediante citometría de flujo, la cual muestra una pureza por encima de 95%.
El análisis de proteína A/B de las células B mediante Western blot en SDS-PAGE hizo posible distinguir, además de la fracción reticular de STIM1 (84±2 kDa), la forma de membrana glicosilada de STIM1 (90±2 kDa) para las células B de SLE (A) y para algunos pacientes con CLL (B, grupo de mSTIM1+). Este análisis de proteína usó primero como anticuerpo anti-STIM1 clon Gok/44 (BD Biosciences), luego un anticuerpo anti-IgG de ratón ligado a peroxidasa (GE Healthcare), y finalmente detección mediante quimioluminiscencia (kit ECl advance, GE Healthcare).
El análisis C/D mediante citometría de flujo consistió en incubar las células B purificadas con un anticuerpo anti-STIM 1 clon Gok/44 (BD Biosciences) durante 15 min a 4°C, luego, después de lavar, fue revelada la fijación del anticuerpo anti-STIM1 usando un anticuerpo anti-IgG de ratón F(ab')2 ligado a fluoresceína (Jackson laboratories). El etiquetado de membrana de STIM1 en las células vivas se determina en relación con el control isotípico (lgG2a, Beckman Coulter).
Ejemplo 2: Método de selección de moléculas de STIM1 anti-membrana
Selección de las moléculas que modulan la fracción de STIM1 localizada en la membrana de plasma se ILeva a cabo en una primera aproximación en líneas de célula B humana JOK que expresan la proteína de STIM1 en la membrana de plasma. Se usan dos tipos de células: células JOK transfectadas establemente con un vector vacío (JOK PlP) o transfectadas establemente con la proteína CD5 ([6]). Estas células presentan una entrada de calcio constitutivo medible. La selección consiste en medir los efectos del direccionamiento de moléculas a la fracción de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células sobre la entrada constitutiva de calcio extracelular. El efecto de estas moléculas en la entrada de calcio, que es dependiente de la liberación de SOCE (entrada de calcio operada por almacenamiento) de reservas, también se evalúa para determinar el efecto de las moléculas en la SOCE de entrada de las moléculas que actúan sobre la entrada de calcio constitutivo. La amplitud de estos dos flujos de calcio se mide monitoreando las variaciones en la concentración de calcio intracelular usando una sonda fluorescente (Calcium 6, Molecular Devices). Se hace que las células se adhieran en placas de 96 pozos tratados con CeliTak (BD Biosciences) a una tasa de 100 000 células por pozos durante 45 minutos. Luego las células se cargan sobre la sonda fluorescente (Calcium 6, Molecular Devices) mediante incubación en presencia de esta sonda durante 60 minutos antes de medir las variaciones en la concentración de calcio intracelular usando un lector de placa multi-pozo del tipo Flexstation type (Molecular Devices). Las células se ponen en contacto con el compuesto de ensayo en el momento de cargar las células con la sonda fluorescente y durante la medición de las variaciones en la concentración de calcio intracelular.
La medición de la entrada de calcio constitutivo se estima retirando y luego adicionando el calcio de la matriz extracelular en ausencia de cualquier estimulación de las células. La SOCE se activa tratando las células con tapsigargina, un inhibidor de bomba SERCA.
Las moléculas identificadas por tener un efecto en los flujos de calcio de interés de las células JOK se ensayan luego en células B purificadas, obtenidas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos de control o de pacientes con CLL, cuyo nivel de expresión de la molécula de STIM1 en la superficie de las células es conocido y medido mediante citometría de flujo. Los efectos de las moléculas de ensayo en la entrada de calcio constitutivo y la SOCE de entrada se miden tal como se ha descrito antes mediante la generación de imágenes por fluorescencia de célula individual. Se hace que las células se adhieran a placas de recubiertas con CeliT AK (BO Biosciences) a una tasa de 500 000 células por placas durante 45 minutos y se cargan con la sonda fluorescente (Fura2, Molecular probes) durante 45 minutos en presencia de ácido plurónico (Sigma Aldrich) antes de medir las variaciones en la concentración de calcio intracelular usando un sistema de generación de imágenes por fluorescencia de célula individual. Las células se ponen en contacto con el compuesto de ensayo durante la carga de las células y durante la medición de las variaciones en la concentración de calcio intracelular. La medición de la entrada de calcio constitutivo se estima retirando y luego adicionando el calcio de la matriz extracelular en ausencia de cualquier estimulación de las células. La entrada de SOCE se activa tratando las células con tapsigargina, un inhibidor de bomba de SERCA.
De esta manera se demuestra la inhibición de la entrada de calcio constitutivo por parte de un anticuerpo anti-STIM1 (clon Gok/44, BO Biosciences) dirigido contra un epítopo extracelular de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células. La entrada constitutiva y los efectos del anticuerpo anti-STIM1 sobre este entrada se miden en las líneas JOK en una placa de pozos múltiples y un lector de placa (Figs. 2A1B) o sobre linfocitos B en la generación de imágenes de célula individual (Figs. 2C/D).
Ejemplo 3: Métodos para demostrar actividad biológica y de anti-linfocito B de las moléculas de STIM1 antimembrana (figura 3)
Fig 3A. El anticuerpo anti-STIM1 (clon Gok/44, BO Biosciences) usado a 10 µg/ml es capaz de reducir la supervivencia de las células B de CLL, que fue incrementada para la CLL del grupo de mSTIM1 + (presencia de la proteína de STIM1 en la membrana de plasma). Para este experimento se cultivaron las células durante 48 horas,
luego se determinó el porcentaje de células vivas (ausencia de etiquetado de annexina V/ yoduro de propidio, Beckman Coulter).
Fig 38. El anticuerpo anti-STIM1 (clon Gok/44) potencia la acción del anticuerpo anti-CD20 (rituximab, 10 µg/ml) 5 sobre la muerte de las células B de CLL del grupo de mSTIM1 +.
Fig 3C. El efecto del anticuerpo anti-STIM1 (clon Gok/44) involucra un efecto del anticuerpo en la entrada constitutiva de Ca2+ en las células B de CLL mSTIM1+.
10 Fig 3D. El anticuerpo anti-STIM1 (clon Gok/44) restaura la capacidad de las células B de SLE para inhibir la proliferación de las células después de 4 días de cultivo autólogo en presencia de la estimulación mediante CpG y anti-CD3/CD28.
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Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Uso de la fracción aislada de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células en un
    método in vitro para la selección de moléculas candidatas para tratar leucemia linfática crónica y/o lupus eritematoso 5 sistémico.
  2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el cual la secuencia de péptido de la proteína STIM 1 es la secuencia SEQ ID NO: 1.
    10 3. Uso según la reivindicación 1 o 2, en el cual el método de selección usa una técnica seleccionada del grupo que comprende selección biológica, y selección biofísica.
  3. 4. Uso según la reivindicación 3, en el cual la selección usa una técnica seleccionada del grupo que comprende inmunofluorescencia, Western blot (inmunoelectrotransferencia), inmunoprecipitación, resonancia plasmónica
    15 superficial (SPR), citometría de flujo, microscopia en vídeo, estudio de flujos de calcio, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), y microscopia confocal.
  4. 5. Sustancia que interactúa con la fracción de la proteína de STIM1 localizada en la membrana de plasma de las células para uso como un producto medicinal en el tratamiento de leucemia linfática crónica y/o lupus eritematoso
    20 sistémico, y dicha sustancia es un anticuerpo dirigido contra un fragmento de la proteína de STIM1 de secuencia SEQ ID NO: 3.
  5. 6. Composición farmacéutica que comprende al menos una sustancia según la reivindicación 5, que comprende
    además un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo anti-CD20. 25
  6. 7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la cual el anticuerpo anti-CD20 es el anticuerpo rituximab.
    Figura 3
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