ES2633888T3 - Procedimiento de determinación de un riesgo de contaminación por aspergillus basado en la detección de compuestos orgánicos volátiles microbianos - Google Patents

Procedimiento de determinación de un riesgo de contaminación por aspergillus basado en la detección de compuestos orgánicos volátiles microbianos Download PDF

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ES2633888T3 ES13184238.7T ES13184238T ES2633888T3 ES 2633888 T3 ES2633888 T3 ES 2633888T3 ES 13184238 T ES13184238 T ES 13184238T ES 2633888 T3 ES2633888 T3 ES 2633888T3
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Abstract

Procedimiento de determinación de riesgo de contaminación por Aspergillus en un ambiente interior que comprende las etapas de: (a) extracción de una muestra de aire en el ambiente interior, después (b) detección de Compuestos Orgánicos Volátiles microbianos (COVm) en la muestra, caracterizado por que la etapa (b) comprende la búsqueda de una huella química comprendiendo al menos una molécula objetivo que es un COVm, asociado al metabolismo por aspergillus, seleccionándose dicha molécula objetivo entre los COVm siguientes: 1,4-pentadieno, 4-heptanona, disulfuro de dimetilo, metoxibenceno, 1,3-butanodiol, 1,4-hexadieno, 1-metoxi-2-metilbenceno, 1-octen-3-ona, 1-penteno, 2(5H)-furanona, 2-metilisoborneol, 3,3-dicloro-1-propeno, 3-butin-1-ol, 3-heptanol, 3-heptanona, 3-metil-2-butanol, 3-metilhexano, 4-heptanol, 4-metil-2-hexanona, cariofileno, trisulfuro de dimetilo, eremofileno, germacreno D, isoledeno, longifoleno, 2-etilhexanoato de metilo, muurolano, terpinoleno.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de determinacion de un riesgo de contaminacion por Aspergillus basado en la deteccion de compuestos organicos volatiles microbianos
Campo tecnico de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la determinacion de una huella qmmica espedfica de contaminacion por Aspergillus en ambientes interiores.
Por ambiente interior se entiende un espacio confinado al interior de un edificio que se ventila de manera no continua. Pueden encontrarse ejemplos de ambientes interiores en habitaciones, museos, iglesias, bodegas, monumentos historicos, edificios administrativos, colegios y hospitales.
El desarrollo fungico va acompanado de emision de COVm (Compuestos Organicos Volatiles de origen microbiano) desde el comienzo de su desarrollo y durante el conjunto de fases de crecimiento de micromicetos.
Tecnica anterior
En este campo, se conoce la solicitud de Patente Internacional WO 2004/051226 que trata sobre procedimientos de vigilancia de entornos en riesgo con respecto a la presencia o ausencia de microbios. Esta invencion se caracteriza por la busqueda de un marcador cnp60.
Sin embargo, este documento se limita a la busqueda de una chaperonina (cnp60) lo que implica extracciones celulares que deben ser selectivas para esta chaperonina.
Este tipo de procedimiento implica un crecimiento significativo de micromicetos, entonces coleccion y extraccion de la chaperonina. Por supuesto, es preferible evitar la generacion de micromicetos potencialmente peligrosos para el ser humano. Ademas, la deteccion de chaperonina resulta muy diffcil en comparacion con una deteccion de COV.
Para paliar estos inconvenientes, la solicitante ha puesto a punto un procedimiento de deteccion de contaminacion fungica de un ambiente interior, con la ayuda del calculo de un mdice qmmico de contaminacion fungica. Este procedimiento se describe en la solicitud de patente internacional WO 2008/125770. Esta herramienta ha permitido pronunciarse sobre la presencia de micromicetos en 37 a 42% de las viviendas francesas con ocasion de la campana nacional del Observatorio de la Calidad del Aire Interior (Moularat et al., 2008a).
Sin embargo, este procedimiento no permite concluir de manera espedfica si hay o no riesgo de contaminacion por Aspergillus.
Polizzi et al., (Fungal Biology, 116, 941-953, 2012) han descrito la deteccion de diferentes COVm en locales contaminados por micromicetos y la comparacion de los COVm detectados con los perfiles de COVm producidos por micromicetos aislados de estos mismos locales, varias especies de Aspergillus de los mismos, cuando son cultivados in vitro en medio MEA (del ingles, Malt extract agar). Estos autores indican que 4 COVm (a-copaeno, geranil acetona, trans-calameneno y or-calacoreno), detectados en locales donde la presencia de Aspergillus es predominante, son producidos igualmente in vitro por ciertas cepas de la especie Aspergillus ustus.
Exposicion de la invencion
En este contexto, el mdice de contaminacion fungica puesto a punto por la solicitante y descrito en la solicitud de Patente Internacional WO 2008/125770 podna completarse y afinarse por una deteccion precoz de desarrollo de Aspergillus.
Para paliar los inconvenientes de la tecnica anterior, la solicitante propone un procedimiento para la determinacion de riesgo de contaminacion por Aspergillus en un ambiente interior, que comprende las etapas de:
(a) extraccion de una muestra de aire en el ambiente interior, despues
(b) deteccion de COVm en la muestra, comprendiendo esta etapa la busqueda de una huella qmmica que comprenda al menos una molecula objetivo que sea un COVm, asociado al metabolismo de Aspergillus, siendo seleccionada dicha molecula objetivo entre los COVm siguientes: 1,4-pentadieno, 4-heptanona, disulfuro de dimetilo, metoxibenceno, 1,3-butanodiol, 1,4-hexadieno, 1-metoxi-2-metil-benceno, 1-octen-3-ona, 1-penteno, 2(5H)-furanona, 2-metil-isoborneol, 3,3-dicloro-1-propeno, 3-butin-1-ol, 3-heptanol, 3-heptanona, 3-metil-2-butanol, 3-metilhexano, 4-heptanol, 4-metil-2-hexanona, cariofileno, trisulfuro de dimetilo, eremofileno, germacreno D, isoledeno, longifoleno, 2-etilhexanoato de metilo, muurolano, terpinoleno..
Por ’’riesgo de contaminacion por Aspergillus” se entiende desarrollo de micromicetos del genero aspergillus sobre un sustrato determinado.
De manera particularmente ventajosa, la deteccion de dichas moleculas objetivo es mas facil y mas rapida que la
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deteccion de cepas de aspergillus o metabolitos de Aspergillus solubles.
Segun un modo de realizacion preferido, la etapa (b) comprende las subetapas siguientes antes de la busqueda de una huella qmmica que comprenda al menos una molecula objetivo que sea un COVm, asociado al metabolismo de Aspergillus:
- deteccion de COV en la muestra, que comprende la deteccion de la presencia o ausencia de ciertos COV predeterminados resultantes del metabolismo fungico, comprendiendo estos COV predeterminados al menos un COV de cada una de las tres categonas de COV siguientes:
(1) los COV que son emitidos independientemente de la especie fungica y su sustrato y que solo son emitidos por especies fungicas;
(2) los COV que son emitidos independientemente de la especie fungica y su sustrato y que son emitidos por especies biologicas no fungicas;
(3) los COV que son emitidos en funcion de la especie fungica y/o su soporte;
- calculo de un mdice qmmico de contaminacion fungica en funcion respectivamente de la presencia y ausencia de COV predefinidos resultantes del metabolismo fungico.
Por “sustrato” de una especie fungica, se entiende el material sobre el que se desarrolla la especie fungica, preferiblemente un material de construccion tal como papel pintado, tela de vidrio u otro.
Ventajosamente, la huella qmmica es espedfica de al menos una especie de aspergillus elegida entre: Aspergillus restrictus, Aspergillus versicolor, Aspergillus sydowii, Aspergillus niger.
Como alternativa, dicha molecula objetivo se selecciona del grupo que comprende: 1,4-pentadieno, 4-heptanona, disulfuro de dimetilo, metoxibenceno. Estas moleculas objetivo son espedficas de una pluralidad de cepas de Aspergillus.
Segun otra alternativa, dicha molecula objetivo se selecciona del grupo que comprende: 1,3-butanodiol, 1,4- hexadieno, 1-metoxi-2-metilbenceno, 1-octen-3-ona, 1-penteno, 2(5H)-furanona, 2-metil-isoborneol, 3,3-dicloro-1- propeno, 3-butin-1-ol, 3-heptanol, 3-heptanona, 3-metil-2-butanol, 3-metilhexano, 4-heptanol, 4-metil-2-hexanona, cariofileno, trisulfuro de dimetilo, eremofileno, germacreno D, isoledeno, longifoleno, 2-etilhexanoato de metilo, muurolano, terpinoleno. Estas moleculas objetivo son espedficas de una o dos cepas de Aspergillus.
Asf, el procedimiento segun la invencion puede realizarse con dichas moleculas objetivo, que es espedfico de una o dos cepas de Aspergillus. Como alternativa, esta molecula objetivo es espedfica de mas de dos cepas de Aspergillus.
Segun una alternativa preferida, la huella qmmica comprende al menos dos moleculas objetivo.
Segun otra alternativa, la huella qmmica comprende todas esas moleculas objetivo.
Ventajosamente, el procedimiento comprende una etapa de busqueda de zonas de contaminacion fungica realizada antes de la etapa (a). Asf, el procedimiento segun esta alternativa comienza por esta etapa.
El procedimiento segun el segundo modo de realizacion de la invencion es util, en particular, para la deteccion precoz de riesgo de contaminacion por Aspergillus, es decir, antes de la aparicion de cantidades significativas para deteccion microbiologica. Esta posibilidad de deteccion precoz es tanto mas interesante cuanto no requiera deteccion directa de especies de aspergillus. Asf se puede concluir contaminacion por Aspergillus en un estadio precoz de desarrollo de hongos. Por “estadio precoz” de desarrollo, se entiende un estadio en el que son invisibles los micromicetos en la superficie del sustrato y preferiblemente indetectables para el analisis microbiologico del aire, pero producen sin embargo metabolitos y productos de degradacion inhalables y responsables en ciertos casos de enfermedades.
Descripcion detallada de un modo de realizacion.
La presente invencion se basa en el estudio en laboratorio de las emisiones de COV de 4 especies del genero Aspergillus:
- Aspergillus restrictus,
- A. versicolor,
- A. sydowii,
- A. niger.
Estas especies han sido cultivadas al abrigo de la luz y a 25°C sobre diferentes materiales esterilizados que
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frecuentemente se encuentran contaminados en ambientes interiores. Un sustrato de referencia no emisor, constituido por fibra de vidrio con una disolucion nutritiva embebida, ha sido utilizado igualmente para el conjunto de las cepas ensayadas. La disolucion nutritiva utilizada es, por ejemplo, una disolucion acuosa que comprende especialmente K2HPO4, KCl, MgSO4, FeSO4, glucosa y NaNO3. Esta disolucion esta tamponada a un pH de 7,4.
5 Por supuesto, puede utilizarse otra disolucion nutritiva conocida sin apartarse del alcance de la invencion.
El plan de manipulacion se resume en la Tabla 1 a continuacion.
Tabla 1: Cepas fungicas ensayadas en funcion del sustrato de crecimiento
TO O C 0 0 4— 0 0 ■o O +-* TO +-* CO 3 a) O ■o > 0 "O TO 0 1- O _£= O O O O _£= O 0 +-* 0 "O TO O TO CL Papel pintado “vinilo” o CO 0 0 "O TO O TO CL TO C 4—* TO 0 O) 0 "O O "O TO O O c 0 "0 Q_ TO CL TO c 'c O) c CO "0 Q_ TO CL TO c 'c O) c 0 0 "0 Q_ TO CL 0 +-> c 0 c TO E 0 Q_ "0 Q_ TO CL 0 c _l
A. restrictus
X X X X X
A. versicolor
X X X X X X X X X X
A. sydowii
X X
A. niger
X X X X X X
En la tabla 1, una cruz indica la identificacion de la cepa de aspergillus (en lmea) que se desarrolla sobre el sustrato 10 de crecimiento (en columna).
El sustrato de referencia sirve aqrn de testigo positivo para validar la capacidad de las cepas de aspergillus para desarrollarse. El sustrato utilizado aqrn es fibra de vidrio con disolucion nutritiva embebida descrito a continuacion. Por supuesto, puede utilizarse otro sustrato de referencia conocido.
Las cepas estudiadas se desarrollan todas sobre el sustrato de referencia y sobre al menos otro sustrato de 15 crecimiento entre los ensayados. La cepa A. sydowii solo crece sobre lino. Las otras cepas A. restrictus, A. versicolor, A. sydowii, A. niger crecen sobre mas de dos sustratos de crecimiento entre los ensayados.
Durante este estudio, se identificaron 28 COV unicamente a partir de cepas de Aspergillus (Tabla 2):
Tabla 2: Compuestos emitidos en presencia de desarrollo de Aspergillus.
COV
N° CAS Aspergillus restrictus Aspergillus versicolor Aspergill us sydowii Aspergillus niger
1,4-pentadieno
591-93-5 X X X X
4-heptanona
123-19-3 X X X X
Disulfuro de dimetilo
624-92-0 X X X X
Metoxibenceno
100-66-3 X X X X
1,3-butanodiol
107-88-0 X
1,4-hexadieno
592-45-0 X
1-metoxi-2-metilbenceno
578-58-5 X
1-octen-3-ona
4312-99-6 X X
COV
N° CAS Aspergillus restrictus Aspergillus versicolor Aspergill us sydowii Aspergillus niger
1-penteno
109-67-1 X X
2(5H)-furanona
497-23-4 X
2-metil-isoborneol
2371-42-8 X
3,3-dicloro-1-propeno
563-57-5 X
3-butin-1-ol
927-74-2 X
3-heptanol
589-82-2 X
3-heptanona
106-35-4 X X
3-metil-2-butanol
598-75-4 X
3-metilhexano
589-34-4 X
4-heptanol
589-55-9 X
4-metil-2-hexanona
105-42-0 X X
Cariofileno
87-44-5 X
Trisulfuro de dimetilo
3658-80-8 X
Eremofileno
10219-75-7 X
Germacreno D
23986-74-5 X
Isoledeno
156108 X
Longifoleno
475-20-7 X
2-Etilhexanoato de metilo
816-19-3 X X
Muurolano
29788-41-8 X
Terpinoleno
586-62-9 X
La tabla 2 enumera los COV emitidos en presencia de diferentes cepas de Aspergillus. Las extracciones y el analisis de estos COV se realizan despues de 7 d^as de incubacion de las cepas a 25°C. Las cruces indican identificacion del COV a partir del crecimiento de la especie sobre al menos un sustrato de crecimiento.
5 Como se puede ver en la tabla 2, los cuatro primeros COV son marcadores de cuatro especies de aspergillus, mientras que los otros COV son marcadores de una o dos especies de aspergillus.
Asf, esta lista de compuestos puede dividirse en 2 grupos:
Los compuestos emitidos por el conjunto de especies de Aspergillus ensayadas (grupo 1 resaltado en gris en la tabla).
10 Los compuestos emitidos por al menos una y a lo sumo tres de cuatro especies de Aspergillus ensayadas (grupo 2).
Desde el punto de vista practico, despues de la determinacion de la presencia de desarrollo fungico, por ejemplo, por el mdice de contaminacion fungica, la busqueda de objetivos espedficos enumerados en la Tabla 2 permite alertar sobre un probable desarrollo de especies de Aspergillus. En efecto, la presencia de al menos uno de estos objetivos indica la presencia probable de desarrollo de especies de Aspergillus.
15 El numero de trazadores identificados se correlaciona con la probabilidad de presencia de desarrollo de Aspergillus. La ausencia de compuestos del grupo 1 disminuye esta probabilidad.
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Pueden identificarse otras moleculas objetivo. De manera general, las moleculas objetivo de este tipo pueden consistir en cualquier COV relacionado con los esquemas metabolicos de Aspergillus, es decir, un COV producido por una cepa de Aspergillus por el metabolismo de Aspergillus.
Asf, la determinacion de una huella de contaminacion por Aspergillus basada en la deteccion de COVm qmmicos espedficos que permitan completar los indices de contaminacion fungica ya desarrollados en la solicitud de Patente Internacional WO 2008/125770, proporcionando criterios claros y fiables para las decisiones relativas, por ejemplo, a la ocupacion y la renovacion de edificios contaminados.
En la aplicacion del procedimiento segun una variante preferida, se realizan sucesivamente las etapas de:
a) extraccion de una muestra de aire en un ambiente interior, por ejemplo, en la proximidad de zonas que se sospecha que estan contaminadas;
b) deteccion de COV en la muestra, que comprende deteccion de la presencia o ausencia de ciertos COV predeterminados resultantes del metabolismo fungico, comprendiendo estos COV predeterminados al menos un COV de cada una de las tres categonas de COV siguientes:
(1) los COV que son emitidos independientemente de la especie fungica y su sustrato y que solo son emitidos por especies fungicas;
(2) los COV que son emitidos independientemente de la especie fungica y el sustrato, pero que pueden tener igualmente otros ongenes biologicos por COV que tengan ”otros ongenes biologicos”, se entiende especialmente COV emitidos por especies biologicas no fungicas;
(3) los COV que son emitidos en funcion de la especie fungica y/o su soporte;
c) calculo de un mdice qrnmico de contaminacion fungica en funcion, respectivamente, de la presencia y ausencia de COV predefinidos, resultantes del metabolismo fungico, segun el procedimiento descrito en la solicitud de Patente Internacional WO 2008/125770, para determinar si hay contaminacion fungica;
Despues, para determinar si hay contaminacion por Aspergillus, se realizan ademas las etapas:
d) busqueda de al menos una molecula objetivo, que sea un COV resultante de metabolismo de Aspergillus, en particular al menos una molecula objetivo seleccionada del grupo que comprende: 1,4-pentadieno, 4-heptanona, disulfuro de dimetilo, metoxibenceno, 1,3-butanodiol, 1,4-hexadieno, 1-metoxi-2-metilbenceno, 1-octen-3-ona, 1- penteno, 2(5H)-furanona, 2-metilisoborneol, 3,3-dicloro-1-propeno, 3-butin-1-ol, 3-heptanol, 3-heptanona, 3-metil-2- butanol, 3-metilhexano, 4-heptanol, 4-metil-2-hexanona, cariofileno, trisulfuro de dimetilo, eremofileno, germacreno D, isoledeno, longifoleno, 2-etilhexanoato de metilo, muurolano, terpinoleno y preferiblemente,
e) busqueda de una huella qrnmica que comprenda al menos dos de dichas moleculas objetivo.
De manera interesante, novedosa e inventiva, los resultados procedentes de las etapas d) y e) permiten determinar con precision, claridad y fiabilidad si hay o no riesgo de contaminacion por Aspergillus.
Este modo de realizacion conduce, por supuesto, a resultados mas completos que los de la tecnica anterior, de manera que se llega no solamente a concluir una contaminacion fungica sin ningun signo visible de desarrollo fungico, sino ademas se llega a determinar desarrollo de Aspergillus de manera precisa y fiable.
En otra variante de la invencion, tambien se pueden buscar zonas de contaminacion fungica, extraer despues una muestra de aire en la proximidad de estas zonas de contaminacion fungica antes de buscar dicha o dichas moleculas objetivo, mencionadas anteriormente.
Dicha busqueda de zonas de contaminacion fungica puede hacerse, por ejemplo, a simple vista, por analisis en microscopio o por ensayos microbiologicos o bioqmmicos.
La extraccion de la muestra de aire se realiza, por ejemplo, por muestreo difusivo sobre un adsorbente solido del tipo carbografo 4. La deteccion se realiza, por ejemplo, por cromatograffa en fase gaseosa seguido por espectrometna de masas (GC/EM). Pueden utilizarse otros metodos de deteccion.

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de determinacion de riesgo de contaminacion por Aspergillus en un ambiente interior que comprende las etapas de:
    (a) extraccion de una muestra de aire en el ambiente interior, despues
    (b) deteccion de Compuestos Organicos Volatiles microbianos (COVm) en la muestra, caracterizado por que la etapa (b) comprende la busqueda de una huella qmmica comprendiendo al menos una molecula objetivo que es un COVm, asociado al metabolismo por aspergillus, seleccionandose dicha molecula objetivo entre los COVm siguientes: 1,4-pentadieno, 4-heptanona, disulfuro de dimetilo, metoxibenceno, 1,3-butanodiol, 1,4-hexadieno, 1-metoxi-2-metilbenceno, 1-octen-3-ona, 1-penteno, 2(5H)-furanona, 2- metilisoborneol, 3,3-dicloro-1-propeno, 3-butin-1-ol, 3-heptanol, 3-heptanona, 3-metil-2-butanol, 3- metilhexano, 4-heptanol, 4-metil-2-hexanona, cariofileno, trisulfuro de dimetilo, eremofileno, germacreno D, isoledeno, longifoleno, 2-etilhexanoato de metilo, muurolano, terpinoleno.
  2. 2. Procedimiento de determinacion de riesgo de contaminacion por aspergillus en un ambiente interior segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la etapa (b) comprende las siguientes subetapas antes de la busqueda de una huella qmmica que comprende al menos una molecula objetivo que es un COVm, asociado al metabolismo por aspergillus:
    - deteccion de la presencia o ausencia de ciertos Compuestos Organicos Volatiles (COV) predeterminados resultantes del metabolismo fungico, comprendiendo estos COV predeterminados al menos un COV de cada una de las tres categonas de COV siguientes:
    (1) los COV que son emitidos independientemente de la especie fungica y su sustrato y que solo son emitidos por especies fungicas;
    (2) los COV que son emitidos independientemente de la especie fungica y el sustrato y que son emitidos por especies biologicas no fungicas;
    (3) los COV que son emitidos en funcion de la especie fungica y/o su soporte;
    - calculo de un mdice qmmico de contaminacion fungica en funcion, respectivamente, de la presencia y ausencia de COV predefinidos resultantes del metabolismo fungico.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que la huella qmmica es espedfica de al menos una especie de aspergillus elegida entre: Aspergillus restrictus, Aspergillus versicolor, Aspergillus sydowii, Aspergillus niger.
  4. 4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la huella qmmica comprende al menos dos de dichas moleculas objetivo.
  5. 5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la huella qmmica comprende todas esas moleculas objetivo mencionadas.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicha molecula objetivo es espedfica de una o dos cepas de Aspergillus.
  7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, caracterizado por que dicha molecula objetivo se selecciona del grupo que comprende: 1,3-butanodiol, 1,4-hexadieno, 1-metoxi-2-metilbenceno, 1-octen-3-ona, 1-penteno, 2(5H)-furanona, 2-metilisoborneol, 3,3-dicloro-1-propeno, 3-butin-1-ol, 3-heptanol, 3-heptanona, 3-metil-2-butanol, 3-metilhexano, 4- heptanol, 4-metil-2-hexanona, cariofileno, trisulfuro de dimetilo, eremofileno, germacreno D, isoledeno, longifoleno, 2- etilhexanoato de metilo, muurolano, terpinoleno.
  8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que dicha molecula objetivo es espedfica de mas de dos cepas de Aspergillus y se selecciona preferiblemente del grupo que comprende: 1,4- pentadieno, 4-heptanona, disulfuro de dimetilo, metoxibenceno.
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una etapa de busqueda de zonas de contaminacion fungica realizada antes de la etapa (a).
ES13184238.7T 2012-09-14 2013-09-13 Procedimiento de determinación de un riesgo de contaminación por aspergillus basado en la detección de compuestos orgánicos volátiles microbianos Active ES2633888T3 (es)

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