ES2632786T3 - Examen de inhibidor de desubiquitinación de proteasoma - Google Patents

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Abstract

Método para examinar un compuesto para determinar si el compuesto es un inhibidor de desubiquitinación de proteasoma de alta especificidad, comprendiendo el método poner en contacto el compuesto con partículas reguladoras 19S (RP 19S) humanas de proteasoma 26S y determinar si el compuesto inhibe la actividad de las enzimas de desubiquitinación (DUB) UCHL5 y USP14, y una etapa adicional de determinar si el compuesto afecta a la actividad de enzimas de DUB asociadas no proteasómicas, en el que la inhibición de las actividades de UCHL5 y USP14 y la actividad no afectada de enzimas de DUB asociadas no proteasómicas indica que el compuesto es un inhibidor de desubiquitinación de proteasoma de alta especificidad.

Description

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DESCRIPCION
Examen de inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma Campo de la invencion
La invencion se refiere a un metodo para examinar un compuesto para determinar si el compuesto es un inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma de alta especificidad.
Antecedentes de la invencion
Las celulas tumorales presentan sensibilidad potenciada a alteraciones en el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) lo que hace que sea una diana atractiva para el desarrollo de terapias anticancerosas (1). Los sustratos etiquetados con ubiquitina se reconocen para su destruccion mediante el proteosoma 26S; un complejo multisubunidad que comprende un nucleo 20S proteolitico (CP 20S) ocupado por particulas reguladoras 19S (19S RP) (2,3). El CP 20S ha evolucionado como una importante diana para el desarrollo de farmacos anticancerosos, lo que dio como resultado la aprobacion de bortezomib (Velcade®) para el tratamiento de leucemia mieloica (4). Se sabe que el compuesto de bajo peso molecular b-AP15 (NSC687852) induce apoptosis independiente de p53 y dependiente de catepsina-D (5,6).
Objeto de la invencion
Es un objeto de la invencion proporcionar un metodo para examinar un compuesto para determinar si el compuesto es un inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma de alta especificidad.
Otro objeto de la invencion es proporcionar inhibidores de desubiquitinacion de proteasoma de alta especificidad identificados mediante el metodo.
Objetos adicionales de la invencion resultaran evidentes estudiando el siguiente sumario de la invencion, varias realizaciones preferidas de la misma ilustradas en un dibujo y las reivindicaciones adjuntas.
Sumario de la invencion
Segun la presente invencion se reconoce que el compuesto b-AP15 conocido pertenece a una clase novedosa de inhibidores de proteasoma que anulan la actividad de desubiquitinacion (DUB) del 19S RP.
imagen1
Segun la invencion se ha encontrado que b-AP15 inhibe la actividad de dos DUB de 19S RP, UCHL5 y USP14 pero no afecta a DUB no proteosomicas. De acuerdo con la inhibicion de DUB, el tratamiento con b-AP15 provoca la acumulacion de proteinas poliubiquitinadas de peso molecular mas alto en comparacion con el tratamiento con bortezomib, y da como resultado una respuesta de proteina desplegada mas fuerte. Segun la invencion, tambien se ha encontrado que la induccion de la apotosis mediante b-AP15 difiere de la de bortezomib al ser insensible a la alteracion del supresor tumoral p53 e insensible a la sobreexpresion del inhibidor de la apoptosis Bcl-2. Se ha encontrado ademas que tratamiento con b-AP15 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores solidos. En consecuencia, inhibir la actividad de DUB del 19S RP es una opcion viable para el tratamiento de cancer. Por este motivo, los compuestos que comparten el patron de actividad de b-AP15 son candidatos para el desarrollo de farmacos anticancerigenos potentes. Por tanto, el metodo mediante el cual se ha identificado que b-AP15 posee las propiedades valiosas mencionadas anteriormente es aplicable a otros compuestos de patron de actividad desconocida y util para identificar si comparten o no las propiedades mencionadas anteriormente de b-AP15. Si las comparten, los compuestos asi identificados tienen potencial como candidatos para el desarrollo de medicamentos anticancerigenos.
Especificamente, segun la presente invencion se da a conocer un metodo para examinar un compuesto para determinar si el compuesto es un inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma de alta especificidad, comprendiendo el metodo poner en contacto el compuesto con particulas reguladoras 19S (19S RP) humanas de proteasoma 26S y determinar si el compuesto inhibe la actividad de las enzimas de desubiquitinacion (DUB) UCHL5 y USP14, y una etapa adicional de determinar si el compuesto afecta a la actividad de enzimas de DUB asociadas no proteosomicas, en el que la inhibicion de las actividades de UCHL5 y USP14 y la actividad no afectada de enzimas de DUB
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asociadas no proteosomicas indica que el compuesto es un inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma de alta especificidad. Se prefiere que las enzimas de DUB asociadas no proteosomicas comprendan al menos una de UCHL1, UCHL3, USP2, USP7, USP8.
Segun otro aspecto preferido de la invencion, la determinacion de la inhibicion de actividades de UCHL5 y USP14 se realiza con un ensayo realizado con 19S RP humanas con HA-ubiquitina o ubiquitina-AMC vinilsulfona como sustrato.
Para caracterizar adicionalmente los efectos provocados por b-AP15, la firma de expresion genica de celulas tratadas con este compuesto se comparo con una coleccion de firmas de expresion para mas de 1300 compuestos bioactivos porporcionados por la base de datos CMAP (
www.broad.mit.edu/cmap) (7). El tratamiento con b-AP15 indujo un perfil de expresion genica comparable al de varios inhibidores de proteasoma caracterizados, MG-262 (8), 15.prostaglandina J2 (9), celastrol (10) y witaferina A (11) que estan entre los inhibidores mas activos. Para confirmar que b-AP15 bloquea la funcion de proteasoma celular, se uso una linea celular indicadora, que expresa ubiquitina etiquetada con proteina fluorescente amarilla (UbG76V-YFP) que se marco constitutivamente para la degradacion proteosomica (12). La inmunotransferencia y la citometria de flujo revelaron una acumulacion dependiente de la dosis del indicador Ub-YFP (IC50=0,8 pM) sugiriendo un dano de la funcion de proteasoma. Puesto que la inhibicion de la funcion de proteasoma se caracteriza por defectos en el recambio de la ubiquitina (13) se trataron celulas de HCT116 carcinoma de colon con el compuesto y se analizo el nivel de conjugacion de ubiqutina mediante inmunotransferencia. El tratamiento con b-AP15 provoco la acumulacion dependiente del tiempo de proteinas poliubiquitinadas de un peso molecular mas alto en comparacion con el inhibidor de CP 20S bortezomib, sugiriendo que b-AP15 inhibe una rama alternativa de la UPS.
El recambio de muchas proteinas reguladoras del ciclo celular se controla mediante el UPS que incluye inhibidores de las cinasas dependientes de ciclina p21 Cip1, p27 Kip1 y el supresor tumoral p53 (4). El tratamiento con b-AP15 aumento sus niveles de manera dependiente de la dosis. En cambio no se observo aumento con respecto al nivel demarcadores de dano en ADN tales como p53 (at Ser 15) (14) o H2AX (at Ser 139) (15) fosforilado, sugiriendo que b-AP15 no es un agente genotoxico. La acumulacion de reguladores de ciclo celular era concomitante con la detencion del ciclo celular en el limite de la fase G2/M. Tan pronto como 6 h tras el tratamiento con b-AP15 las celulas comenzaron a acumularse en la fase G2/M; la exposicion durante un tiempo prolongado dio como resultado un aumento en el contenido de ADN de sub G1.
El aumento en el contenido de ADN de sub G1 se asocia con (i) activacion del mediador de apoptosis caspasa-3 y (ii) con escision de los sustratos de caspasa poli-ADP ribosa polimerasa (PARP) y citoqueratina-18. Se observaron escision de caspasa de citoqueratina-18 y viabilidad celular disminuida al mismo intervalo de concentraciones que la acumulacion inducida del indicador Ub-YFP. La induccion de apoptosis mediante bortezomib es dependiente de p53 y se inhibe mediante la sobreexpresion de la proteina Bcl-2 (16,17). Mediante el uso de clones isogenicos de celulas de cancer de colon HCT116 se encontro que b-AP15 induce la escision de caspasa de citoqueratina-18 no afectada por alteracion genetica de p53 o sobreexpresion de Bcl-2. Ademas, la alteracion genetica de los reguladores apoptoticos BAX o PUMA no afecta a sensibilidad a b-AP15, mientras que se inhibe la apoptosis inducida por bortezomib.
CP 20S contiene las subunidades proteoliticas p1, P2 y P4 responsables de actividades de tipo caspasa, de tipo tripsina y de tipo quimotripsina del proteosoma, respectivamente (18). Experimentos in vitro usando sustratos especificos de actividad no muestran alteracion en ninguna de estas actividades tras el tratamiento con exceso molar de b-AP15. Ensayos de recubrimiento con sustrato adicionales revelaron la presencia de proteasomas 26S ocupados doble e individualmente tras el tratamiento con b-AP15 sugiriendo que la disminucion de la funcion proteomica observada en celulas no estaba provocada por la disociacion del RP19S y CP 20S 19,20.
b-AP15 comprende una entidad dienona a-P con dos carbonos p estericamente accesibles. Se ha descrito anteriormente un farmacoforo estructuralmente similar que esta compuesto por una clase de inhibidores de ubiquitina isopeptidasa (21). Sin embargo, cuando se sometio a prueba la actividad de DUB celular usando ubiquitina-7-amido-4-metilcoumarina (Ub-AMC) sobre celulas tratadas con b-AP15, no pudo observarse reduccion en la escision de Ub-AMC. Esto demuestra que b-AP15 no es un inhibidor de DUB general. En opinion de los presentes inventores las similitudes en la estructura del farmacoforo y los datos que muestran que b-AP15 inhibe actividad de proteasoma independente de la CP 20S indican que b-AP15 representa una clase novedosa de inhibidores de proteasoma que bloquean la actividad de desubiquitinacion del RP19S.
Los ensayos in vitro usando Ub-AMC y RP19S purificada o proteasomas 26S confirmaron que b-AP15 inhibe la actividad de desubiquitinacion de tanto RP19S como de proteasoma 26S. Para este fin se evaluo la capacidad de b- AP15 para inhibir la escision de ubiquitina-GFP recombinante. La ubiquitina-GFP recombinante es un sustrato para actividad de DUB de RP19S (22). El tratamiento de RP19S con b-AP15 inhibio eficazmente la escision de Ub-GFP. El tipo de enlaces de ubiquitina presentes en la cadena de poliubiquitina determina el destino de un sustrato modificado con ubiquitina. Cadenas de poliubiquitina unidas a K48 generalmente seleccionan como diana proteinas conjuntamente para la degradacion (23), mientras que cadenas unidas a K63 estan implicadas en papeles no proteoliticos incluyendo reparacion de ADN (24) y segregacion de cromosomas mitoticos (25). Las reacciones de
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desensamblaje de cadenas de ubiquitina revelaron que b-AP15 inhibia el procesamiento de RP19S de tanto K48 como K63 unidos a tetrameros de ubiquitina. La inhibicion del desensamblaje de cadenas de ubiquitina observada podria explicar la acumulacion de conjugados de ubiquitina de alto peso molecular en celulas tratadas con b-AP15.
La actividad de desubiquitinacion del proteasoma se atribuye a la accion de tres DUB, UCHL5, USP14 y POH1, todas localizados dentro del RP19S 26-28. Tanto UCHL5 como USP14 son sensibles a N-etilmaleimida (NEM), un inhibidor general de cisteina proteasas, mientras que POH1 es insensible a la inhibicion por NEM pero sensible a quelatos de metal tales como N,N,N,N-tetrakis-(2-piridilmetil)etilenodiamina (TPEN) (29). Los experimentos de inhibicion mostraron que la actividad de DUB residual estaba presente incluso tras el cotratamiento de RP19S con NEM y b-AP15. Esta actividad de DUB residual se suprimio tras cotratamiento de RP19S con b-AP15 y TPEN, sugiriendo que b-AP15 inhibe principalmente uno o ambos de las DUB sensibles a NEM. Para identificar especificamente que las DUB se inhibieron mediante tratamiento con b-AP15, se realizaron experimentos de marcaje competitivo usando ubiquitina-vinilsulfonona etiquetada con hemaglutinina (HA-UbVS), una sonda dirigida al sitio activo que reacciona irreversiblemente con las DUB de la clase de cisteina (26). La incubacion de RP19S o proteasomas 26S con b-AP15 suprimio el marcaje de Ub-VS de dos DUB de pesos moleculares correspondientes a UCHL5 y USP14 sin afectar a la actividad de las dos enzimas de DUB asociadas no proteosomicas relacionadas, UCHL1 y USP5.
Para confirmar que los resultados obtenidos mediante ensayos in vitro pueden extenderse a efectos citotoxicos observados sobre celulas, se realizaron experimentos de marcaje adicional, usando HA-UbVS sobre lisados derivados de celulas tratadas con farmacos (1 pM, 3 h). El analisis de inmunotransferencia mostro un desplazamiento decreciente en el peso molecular de tanto USP14 como UCHL5 debido a una perdida de actividad y disminucion de marcaje de HA-UbVS. De manera importante, no se observo alteracion en el perfil de marcaje HA- UbVS general de las DUB de celulas tratadas o lisados de celulas tratados, que es una confirmacion adicional de b- AP15 que no es un inhibidor de DUB general.
Con el fin de investigar el efecto de b-AP15 sobre el crecimiento tumoral in vivo, se le administro el compuesto a ratones que portaban o bien un tumor humano o bien xenoinjertos de raton. Se eligieron carcinoma de cabeza y cuello FaDu como un xenoinjerto de raton SCID ambos como modelo para un tumor p53mut y puesto que este modelo es adecuado para estudios usando biomarcadores de muerte celular circulante (30). Se observo inhibicion significativa del crecimiento de tumor FaDu tras tratamiento diario con b-AP15 (volumen de tumor de control/tratado, T/C=0,4, p=<0,001). De manera similar b-AP15 (programa de dia con tratamiento/2 dias sin tratamiento) inhibio el crecimiento tumoral en ratones C57BL/6J que portaban carcinomas de pulmon (T/C=0,16, p=<0,01). No se observaron efectos secundarios en el grupo tratado con b-AP15 con una perdida de peso promedio de <5% en la finalizacion del estudio. Para examinar si b-AP15 promueve la muerte de celulas tumorales in vivo, se analizaron los niveles en plasma de citoqueratina-18 (CK18). La citoqueratina-18 es un biomarcador para apoptosis y muerte celular (30,31); se usaron ensayos especificos para esta proteina humana. El tratamiento con b-AP15 da como resultado un aumento significativo de los niveles de CK18 humana derivada de tumores FaDu en la circulacion (p=0,01). Los niveles de CK18 escindida con caspasa (CK18-Asp396) aumentaron moderadamente en comparacion con niveles totales, sugiriendo que la apoptosis no es el mecanismo exclusivo de la muerte celular en tumores tratados con b-AP15. Para investigar la capacidad de b-AP15 para inhibir la desubiquitinacion de proteasoma in vivo, se analizo la acumulacion de conjugados de poli-ubiquitina por medio de anticuerpos especificos para cadenas de poliubiquitina unidas a K48. Los analisis histologicos de tumores tratados confirmo la acumulacion de conjugados de poli-ubiquitina. Estos resultados indican que b-AP15 inhibe la actividad de DUB de proteasoma y el crecimiento tumoral in vivo.
Las hidrolasas C-terminales de ubiquitina (UCH) y proteasas especificas para ubiquitina (USP) son los principales subgrupos de los aproximadamente cien DUB codificadas por el genoma humano (32). El mecanismo de especificidad de b-AP15 para UCHL5 y USP14 en el RP19S puede relacionarse con conformaciones unicas de estas enzimas en la RP19S o debido a alteraciones inducidas por farmacos de la estructura de RP19S. Los presentes hallazgos estan de acuerdo con informes en la tecnica que indican que la perdida de tanto UCHL5 como USP14, al contrario que la perdida de o bien uno solo, conduce a la acumulacion de proteinas poliubiquitinadas o bien la inhibicion de la degradacion de proteinas celulares (33).
La capacidad de b-AP15 para inducir la apoptosis de sobreexpresion de celulas Bcl-2 o defectuosas en p53 es de particular interes en la consideracion del papel de estas proteinas en la resistencia a bortezomib (16,17,34). Tanto b- AP15 como bortezomib bloquean la actividad de proteasoma celular pero inducen la apoptosis mediante rutas diferentes. Sin restringirse a la teoria, la observacion que asocia esta inhibicion de DUB con complejos de ubiquitina- sustrato de alto peso molecular parece que es de relevancia particular en este contexto. Se observo una fuerte expresion de genes de chaperona en celulas tratadas con bAP15, lo que indica la induccion de una respuesta proteotoxica.
A continuacion la invencion se describira en mayor detalle por referencia a realizaciones preferidas de la misma ilustradas mediante un dibujo que comprende varias figuras.
Descripcion de las figuras
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Las figuras de los dibujos ilustran:
Figuras 1a-1f: inhibicion mediante b-AP15 del sistema de ubiquitina-proteasoma;
Figuras 2a-2e: inhibicion mediante b-AP15 de la desubiquitinacion mediante el RP19S;
Figuras 3a-3d: inhibicion mediante b-AP15 de las DUB RP19S, UCHL5 y USP14;
Figuras 4a-4h: inhibicion mediante b-AP15 del crecimiento tumoral in vivo;
Figura 5: ausencia de dano en ADN provocado potencialmente por b-AP15;
Figuras 6a-6f: induccion por b-AP-15 de la apoptosis e inhibicion de la supervivencia celular de celulas HCT-116;
Figura 7: curvas de respuesta a la dosis de la induccion de la apotosis en clones isogenicos de celulas HCT-116;
Figuras 8a, 8b: ausencia de inhibicion mediante b-AP15 de la actividad proteolitica de proteasoma;
Figuras 9a, 9b: ausencia de disociacion de particulas 19S y 20S provocada potencialmente por b-AP15 o alteracion de la union a ubiquitina provocada por b-AP15;
Figura 10 b-AP15: que no es un inhibidor de DUB general;
Figuras 11 a-11c: caracterizacion bioquimica de la union a b-AP15;
Figuras 12a-12c: b-AP15 que no es un inhibidor de DUB general;
Figura 13: ausencia de alteracion significativa del peso del animal mediante tratamiento con b-AP15;
Figura 14: sensibilidad de lineas celulares en la linea de celulas NC160 a b-AP15 y bortezomib.
Descripcion de realizaciones preferidas Metodos
Se realizaron ensayos de actividad de proteasoma in vitro en placas de microtitulacion de 96 pocillos negras usando proteasoma 20S humano (Boston Biochem) en tampon de reaccion (Hepes 25 mM, EDTA 0,5 mM, SDS al 0,03%) con Suc-LLVY-AMC, Z-LLEAMC o Boc-LRRAMC usados como sustratos para actividad de proteasoma. Se realizaron ensayos de actividad con desubiquitinasa con RP19S humana (Boston Biochem) con ubiquitina-AMC como sustrato. Para estudios de xenoinjertos se inyecto por via subcutanea una suspension de celulas de 100 pl que contenia 1 x106 celulas de cabeza-cuello FaDu o 2x105 de celulas de carcinoma de pulmon de Lewis (LLC) en el costado de ratones SCID o C57BL/6J. Despues de que los ratones contrajesen el tumor se dispusieron de manera aleatoria en grupos de control o de tratamiento y se les administraron 5 mg kg-1 de b-AP15 o de vehiculo. Se determinaron los niveles de apoptosis in vivo y la muerte celular a partir de la deteccion de caspasa escindida y niveles totales de citoqueratina-18 en plasma usando ensayos M30 Apoptosense® y M65 ELISA® (Peviva). Los metodos se describen a continuacion en detalle.
Reactivos. Se obtuvieron reactivos a partir de las siguientes fuentes: proteasoma 20S (E-360), proteasoma 26S (E- 365), proteasoma 19S (E-366), Suc-LLVY-AMC (S-280), Z-LLE-AMC (S-230), Boc-LRR-AMC (S-300), ubiquitina- AMC (U-550), tetra-ubiquitina K63 (UC-310), tetra-ubiquitina K48 (UC-210), conjunto de enzima de desconjugacion (KE10), HA-ubiquitina vinilsulfona (U-212) (Boston Biochem); anti-actina (AC-15), ODC-1 (HPA001536) (Sigma Aldrich); anti-LC-3 (2775), anti-GAPDH (2118), anti-p44/42 MAPK (4695), anti-fosfo-p44/42 MAPK (9101) (Cell Signaling); N-etilmaleimida (34115) (EMD Chemicals); anti-ubiquitina K48 (Apu2), anti-ubiquitina (MAB1510) (Millipore); anti-p53 (DO1), anti-UCHL5 (H-110), Hdm2 (SMP14) (Santa Cruz); anti-PARP (C2-10), anti-p27 (G173- 524), caspasa 3 anti-activa (C92-605) (BD Biosciences); anti-USP14 (A300-919A) (Bethyl Laboratories); anti-HA (12CA5) (Roche); b-AP15 (NSC687852) se obtuvo del Developmental Therapeutics Program del US National Cancer Institute (
http://www.dtp.nci.nih.gov) o se sintetizo mediante OncoTargeting AB (Uppsala, Suecia). Se obtuvo bortezomib del departamento de oncologia del hospital de Karolinska (Suecia).
Cultivo celular. Se mantuvieron celulas MCF7 en MEM/suero bovino fetal al 10%. Se mantuvieron celulas HCT-116 p53 +/+, p53 -/-, Bcl-2 +/+, PUMA -/- y BAX -/- en medio modificado 5A de McCoy/suero bovino fetal al 10%. Se generaron las HCT-116 p53 +/+, p53 -/-, PUMA -/- y BAX -/- tal como se describio (36). Se genero la linea celular HCT-116 Bcl-2 +/+ transfectando celulas HCT-116 p53 +/+ parentales con pCEP4 Bcl-2 (plasmido 16461 Addgene) (37) y aislando clones de alta expresion. Se mantuvieron celulas FaDu y LLC3 en medio alto en glucosa DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, piruvato de Na, Hepes y aminoacidos no esenciales. Se mantuvieron
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celulas de carcinoma 4T1.12B en medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10%. La linea celular indicadora de proteasoma MelJuSo Ub-YFP se genero tal como se describe (38). Se mantuvieron celulas en medio de Eagle modificado por Dulbecco/suero bovino fetal al 10%. Se genero la linea celular epitelial de la retina tal como se describe (39). Se mantuvieron todas las celulas a 37°C en CO2 al 5%.
Analisis de mapa de conectividad. Se realizo el analisis de expresion genica basado en microalineamiento y el analisis de mapa de conectividad (CMAP) como se describio previamente (40). En resumen, se expusieron celulas MCF7 a b-AP15 (1 pM, 6 h) o vehiculo (DMSO al 0,1%, 6 h). Se aislo ARN (RNeasy miniprep kit, Qiagen) seguido por control de calidad, etiquetado e hibridacion a microalineamientos de Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix Inc). Se normalizaron datos sin procesar usando Mas5 (Affymetrix Inc.) y rango ordenado. Para la seleccion de los 30 transcritos mas inducidos (etiquetas ascendentes) y los 30 mas suprimidos (etiquetas descendentes) se usaron los siguientes criterios: Etiquetas ascendentes, llamada presente y expresion sobre 300 arbitrarios en el experimento con b-AP15; etiquetas descendentes, llamada presente tras tanto b-AP15 como tratamiento con vehiculo, y expresion sobre 300 unidades arbitrarias en el experimento de vehiculo. Para la compatibilidad de CMAP solo se usaron etiquetas (es decir sondas) presentes en HG U133A. Los datos de expresion sin procesar y normalizados se han depositado en Gene Expression Omnibus (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con numero de registro GSE24150.
Ensayos de proteasoma e inhibicion de DUB. Se realizaron ensayos de actividad de proteasoma in vitro usando CP 20S (2nM) (Boston Biochem) a 37°C en 100 pl de tampon de reaccion (Hepes 25 mM, EDTA 0,5 mM, SDS al 0,03%). Se incubaron las muestras durante 10 min con el compuesto indicado seguido por adicion de Suc-LLVY- AMC, Z-LLE-AMC o Boc-LRRAMC 10 pM para la deteccion de actividad de tipo quimotripsina, de tipo caspasa y de tipo tripsina respectivamente. Para los ensayos de inhibicion de DUB RP19S (5 nM), se incubaron 26S (5 nM) UCH- L1 (5 nM), UCH-L3 (0,3 nM), USP2CD (5 nM) USP7CD (5 nM) USP8CD (5 nM) y BAP1 (5 nM) con b-AP15 seguido por adicion de ubiquitina-AMC (1000 nM). Se monitorizo la fluorescencia usando un contador Wallac Multilabel o Tecan Infinite M1000 equipado con filtros de excitacion a 360 nm y emision a 460 nm. Ensayos de superposicion de sustrato. Se realizo electroforesis en gel nativa tal como se describio (41). En resumen, se mezclaron 4 pg de proteasoma 26S purificada (Boston Biochem) con b-AP15 10 o 50 pM y se incubo a 37°C durante 10 min. Se revelaron las muestras sobre PAGE no desnaturalizante al 4%. Se sumergieron geles en tampon de ensayo (Tris- HCl 20 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, Suc-LLVY-AMC 0,1 mM) y se visualizaron proteasomas bajo iluminacion UV.
Ensayo de escision de ubiquitina. El plasmido Ub-GFP recombinante pet19b Ub-M-GFP se genero tal como se describe (42). En resumen, se purifico Ub-GFP recombinante a partir de celulas de E. coli BL21 mediante purificacion por afinidad de His. Para ensayos de escision se incubo RP19S (25 nM) con NEM 10 mM, TPEN 250 pM o b-AP15 50 pM durante 10 min seguido por la adicion de Ub-GFP recombinante (200 nM). Se realizaron reacciones de desensamblaje de cadena de ubiquitina esencialmente como anteriormente excepto que se sustituyeron tetrameros de ubiquitina unidos a K48 o K63 (50 ng) para Ub-GFP. El nivel de escision Ub-GFP o desensamblaje de ubiquitina se determino mediante inmunotransferencia con anticuerpos antiubiquitina. El sustrato de Hdm2 ubiquitinado se genero segun el protocolo de Boston Biochem (K-200). Para el ensayo de escision se incubo RP19S (25 nM) con b-AP15 o DMSO 50 pM durante 10 min seguido por la adicion de sustrato de Hdm2 ubiquitinado (100 nM). La escision de sustrato de Hdm2 ubiquitinado y Hdm2 ubiquitinado se determino mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-Hdm2.
Aislamiento de proteasoma: se trataron celulas HCT-116 con bortezomib (100 nM) o b-AP15 (1 mM) durante 3 horas. Tras la estimulacion, se lisaron las celulas en HEPES 50 mM pH 7,4, sacarosa 250 mM, MgCl2 10 mM, ATP 2 mM, DTT 1 mM y digitonina al 0,025%. Se sonicaron las muestras brevemente y se incubaron durante 15 min sobre hielo. Se aislaron proteasomas de estas muestras segun el protocolo del fabricante.
Marcaje con UbVS de las DUB. Para el marcaje de las DUB en lisados celulares se recogieron mediante tripsinizacion celulas subconfluentes, se lavaron tres veces con PBS, y se centrifugaron a 1500 RPM durante 5 min. Se lisaron aglomerados celulares con tampon (HEPES 50 mM pH 7,4, sacarosa 250 mM, MgCl2 10 mM, ATP 2 mM, DTT 1 mM) sobre hielo durante 15 min. Se retiraron los residuos mediante centrifugacion y se marcaron 25 pg de proteina con HA-UbVS 1 pM durante 30 min a 37°C. Se revelaron las muestras mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.
Determinacion de apoptosis y viabilidad celular. Para la determinacion de apoptosis parental se trataron celulas HCT-116 p53 +/+ con las dosis aumentadas de bortezomib o b-AP15 durante 24 h. Las dosis de tratamiento se basaron en la concentracion de farmaco que dio como resultado apoptosis maxima a lo largo de un periodo de 24 h. Se sembraron celulas HCT-116 en placas de microtitulacion de 96 pocillos a 10.000 celulas por pocillo y se incubaron durante la noche. Se trataron celulas con el farmaco indicado durante 24 h. Al final del periodo de incubacion, se anadio NP40 al medio de cultivo de tejido al 0,1% y se sometieron a ensayo 25 pl del contenido de cada pocillo usando el ELISA M30-Apoptosense® como se describio previamente (43). Se determino la viabilidad celular midiendo la actividad de acido fosfatasa o usando el metodo FMCA (44). Para la actividad de acido fosfatasa, se sembraron celulas a 5000 celulas por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos y se incubaron durante 12 h a 37°C. Se anadieron compuestos a las celulas en medios de crecimiento y se incubaron durante 72 h a 37°C. Se lavaron las celulas con 200 pl de PBS caliente. Se anadieron 100 pl de fosfato de para-nitrofenilo (pNPP, 2 mg/ml)
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en tampon de acetato de Na pH 5 (NaAc 0,1 M, Triton-X-100 al 0,1%) por pocillo. Se incubaron celulas durante 2 h tras lo cual se detuvo la reaccion mediante adicion de NaOH 1N. Se midio la absorbancia a 405 nm.
Para el ensayo de FMCA se sembraron celulas en las placas de 384 pocillos preparadas con farmaco usando el robot para pipetear Precision 2000 (Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT). Se incubaron las placas durante 72 h y entonces se transfirieron a un sistema de nucleo HTS SAIGAN integrado que consiste en un robot ORCA (Beckman Coulter) con incubadora de CO2 (Cytomat 2C, Kendro, Sollentuna, Suecia), modulo dispensador (Multidrop 384, Titertek, Huntsville, AL), modulo lavador (ELx 405, Bio-Tek Instruments Inc), estacion para retirar tapas, hoteles de placas, lector de codigo de barras (Beckman Coulter), manipulador de liquidos (Biomek 2000, Beckman Coulter) y un lector objetivos multiples (FLUOstar Optima, BMG Labtech GmbH, Offenburg, Alemania) para FMCA automatizado. Se define el indice de supervivencia (SI) como la fluorescencia de los pocillos de prueba en porcentaje de controles con valores de blanco sustraidos.
Analisis de ciclo celular. Para la determinacion del ciclo celular se trataron celulas HCT-116 con b-AP15 o DMSO. Se recogieron celulas mediante tripsinizacion, se lavaron y se fijaron en EtOH enfriado con hielo al 70% durante 12 h. Se resuspendieron las celulas en disolucion de tincion que contenia yoduro de propidio (50 pg/ml) y ARNasa A (0,5 pg/ml) en PBS. Se ejecutaron las muestras en un FACScalibur de BD. El porcentaje de celulas en cada fase del ciclo celular se determino usando software ModFit.
Experimentos de tumor in vivo. Se realizaron experimentos de animales de plena conformidad con las regulaciones estatutarias gubernamentales suecas sobre el bienestar animal bajo permiso del comite etico local. Se alojaron los animales en un maximo de cinco por jaula y se les doto de agua esteril y comida a voluntad. Se monitorizaron todos los ratones y se pesaron diariamente. Para el modelo de carcinoma de cabeza y cuello se inyecto por via subcutanea una suspension de celulas de 100 pl que contenian 1x106 celulas de FaDu en el costado de la parte posterior derecha de los animales. Tras la inyeccion, se midio diariamente el crecimiento tumoral con calibradores y se calculo el volumen de tumor mediante la formula L x W2 x 0,44. Cuando los tumores habian crecido hasta un tamano de aproximadamente 200 mm3 (dia 0) se aleatorizaron los ratones para recibir o bien vehiculo (n=10) o bien b-AP15 5 mg/kg-1 mediante inyeccion subcutanea s.c. (n=15) diariamente. Para el modelo de carcinoma de colon, se inocularon por via subcutanea 2,5 x 106 Celulas de carcinoma de colon HCT-116 transfectadas establemente con Bcl-2 (HCT-116Bcl-2+) en el costado derecho de ratones desnudos. Un dia tras la inoculacion se trataron ratones con 5 mg/kg-1 mediante inyeccion intraperitoneal (i.p.). Se inspeccionaron los animales diariamente para establecer la aparicion y crecimiento del tumor. Para el modelo de carcinoma de pulmon se inyecto por via subcutanea una suspension de celulas de 100 pl que contenia 2 x 105 celulas de carcinoma de pulmon de Lewis (LLC) en el costado de la parte posterior derecha de ratones C57/B6. Cuando los tumores habian crecido hasta un tamano de aproximadamente 50 mm3 (dia 0) se aleatorizaron los ratones para recibir o bien vehiculo (n=4) o bien b-AP15 5 mg/kg-1 i.p. (n=4) con un ciclo de tratamiento que consistia en tratamiento de dos dias seguido por dos dias sin tratamiento (2 dias con tratamiento/2 dias sin tratamiento) durante dos semanas. Para el modelo de carcinoma de mama se inyecto por via subcutanea una suspension de celulas de 100 pl que contenia 1 x 105 celulas 4TD en la almohadilla adiposa mamaria derecha de ratones BALB/c. Cuando los tumores habian crecido hasta un tamano de aproximadamente 25 mm3 (dia 0), se aleatorizaron los ratones para recibir o bien vehiculo (n=5) o bien b-AP15 2,5 mg/kg-1 i.p. (n=5) con un ciclo de tratamiento que consiste en un dia de tratamiento seguido por tres dias sin tratamiento (1 dia tratamiento/3 dias sin tratamiento) durante 3 semanas. En los estudios de AML se les inyecto i.v. a ratones C57BL/6J hembra en la vena caudal con 5 x 105 celulas de AML C1498. Tras ocho dias se aleatorizaron los ratones para recibir o bien b-AP15 5 mg/kg-1 (n=10) o bien vehiculo (n=10) i.p. durante 7 dias (dia +8 hasta +14). Diecinueve dias despues de la inyeccion de celulas malignas se sacrificaron todos los ratones y se evaluaron las manifestaciones histopatologicas de higado, ovarios (organos diana para este modelo de tumor) y se compararon entre los grupos. Para la administracion del farmaco se disolvio b-AP15 en Cremphor EL:PEG 400 (1:1) calentando para proporcionar una concentracion de trabajo de 2 mg/ml. Se diluyo la disolucion madre de trabajo 1:10 en solucion salina normal al 0,9% inmediatamente antes de la inyeccion.
Determinacion de CK18 escindida con caspasa en plasma de raton. Para la medicion del fragmento de CK18- Asp396 relacionado con la apoptosis, se recogieron 12,5 ml de plasma 24 h tras el ultimo tratamiento y se analizaron usando el ensayo M30-Apoptosense®. Cada muestra se mezclo con 0,4 ml de reactivo bloqueante heterofilo (Scantibodies Laboratory Inc).
Determinacion de metastasis pulmonar. Puesto que las celulas 4T1 son resistentes a 6-tioguanina, la metastasis puede determinarse cultivando tejido homogeneizado en presencia de 6-tioguanina. Para la determinacion de celulas 4T1 metastasicas el protocolo fue tal como se describio (45). En resumen, se homogeneizaron los pulmones de animales tratados o sin tratar y tratados con colagenasa y elastasa. Se hicieron crecer las celulas en presencia de 6-tioguanina 60 pM durante 2 semanas y el numero de colonias metastasicas se determino mediante tincion Giemsa.
Inmunotincion. Se desparafinizaron secciones tumorales con xileno, se rehidrataron y entonces se incubaron durante la noche con ubiquitina K-48 o caspasa 3 activa (1/500) diluida en albumina de suero bovino al 1% (p/v) y se visualizaron mediante la tecnica de complejo avidina-biotina-peroxidasa convencional (Vector Laboratories). Se
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realizo la contratincion con hematoxilina de Mayer.
Analisis estadfsticos. Para comparaciones de grupos de tratamiento, se realizaron la prueba de t para datos independientes (Mann-Whitney), medidas ANOVA repetidas y supervivencia de Kaplan-Meier (prueba de Mantel- Cox). Se realizaron todos los analisis estadfsticos usando software GraphPad Prism (version 5.0). La significancia estadistica se logro cuando P era de menos de 0,05.
EJEMPLO 1. b-AP15 inhibe el sistema de ubiquitina-proteasoma. La lectura CMAP de celulas MCF7 tratadas con b- AP15 (1 pM) durante 6 h se muestra en la tabla 3.
Tabla 3. Lectura CMAP de celulas MCF7 tratadas con B-AP15
Rango
Nombre Celula Puntuacion
1
MG-262 MCF7
1
2
15 A prostaglandina J2 -”- 0,999
3
Celastrol -”- 0,966
4
15 A prostaglandina J2 -”- 0,940
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Witaferina A -”- 0,922
b-AP15 inhibe la degradacion de YFP etiquetada con ubiquitina en una linea celular indicadora de proteasoma (figura 1a). Se determinaron los niveles de acumulacion de UbG76V-YFP mediante citometria de flujo e inmunotransferencia; la inmunotransferencia de conjugacion de ubiquitina en celulas HCT-116 tratadas con b- AP15(1 mM) o bortezomib (100 nM) (la figura 1b). Inmunotransferencia de conjugados de ubiquitina, escision de PARP de activacion con caspasa 3, p53. P21Cip1 y pKip1 en celulas HCT-116 tras tratamiento de 24 h con las concentraciones indicadas de b-AP15 (figura 1c). Inmunotransferencia de niveles de ODC-1 en celulas HCT-116 tras el tratamiento con bortezomib (100 mM o b-Ap15 (1 pM) (figura 1d); los valores representan unidades de densidad optica cuantificada de ODC-1 normalizada para dar p-actina. Perfiles de ciclo celular de celulas HCT-116 tratadas con b-AP15 (figura 1e); se analizaron celulas mediante tincion con yoduro de propidio y citometria de flujo. Los niveles de actividad caspasa en celulas HCT-116 isogenicas tal como se determino mediante ELISA para citoqueratina-18 escindida con caspasa (CK18-Asp398) tras el tratamiento con bortezomib (100 nM) o b-AP15 (1 pM) (**'P=0,01, ***'P=0,001) (figura 1f).
EJEMPLO 2. b-AP15 inhibe la desubiquitinacion mediante el RP 19S. Inhibicion de escision Ub-AMC mediante RP 19S o proteasomas 26S tras el tratamiento con b-AP15; aldehido de ubiquitina (Ubal), un inhibidor de DUB general, se incluyo como control (figura 2a). La inmunotransferencia de RP 19S medio la escision de Ub-GFP (figura 2b); se pretrataron RP 19S con DMSO o las concentraciones indicadas de b-AP15 seguido por adicion de Ub-GFP recombinante como sustrato de DUB. La cinetica de escision de Ub-GFP RP 19S tras tratamiento con b-AP15 (50 pM) (figura 2c). b-AP15 inhibe la desubiquitinacion de Hdm2 (figura 2d); se anadio Hdm2 ubiquitinada a RP 19S tratado con DMSO o b-AP15 (50 pM) seguido por inmunotransferencia. Las reacciones de desensamblaje de cadena de ubiquitina de tetrameros de ubiquitina unidos a K63/K48 mediante RP 19S tras el tratamiento con DMSO o b- AP15 (50 pM) (figura 2e).
EJEMPLO 3. b-AP15 inhibe las DUB de RP 19S UCHL5y USP14. Se pretrato RP 19S con DMSO, NEM (10 mM), b- AP15 (50 pM) (figura 3a) o TPEN (250 pM) (figura 3b) seguido por adicion de Ub-GFP e inmunotransferencia con anticuerpos anti-GFP. Marcaje dirigido a sitios activos de DUB proteosomicas (figura 3c); se pretrataron proteasomas 19S o 26S purificados con DMSO, NEM o bAP15 seguido por marcaje con HA-UbVS e inmunotransferencia. Inmunotransferencia de celulas HCT116 tratadas con b-AP15 (1 pM) durante 3 h (figura 3d); Se marcaron DUB de lisados de celulas completas con HA-UbVS seguido por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos indicados.
EJEMPLO 4. b-AP15 inhibe el crecimiento tumoral in vivo. Se aleatorizaron ratones SCID que portaban xenoinjertos de tumor humano FaDu en la toma de tumor (200 mm3) y se trataron mediante inyeccion subcutanea diariamente con o bien vehiculo (n = 10) o bien b-AP15 5 mg kg-1 (n=15) durante 10 dias. Volumen de tumor medio ± EEM mostrado (***P=<0,001) (figura 4a). Niveles totales de CK18 derivada de tumor y caspasa escindida (CK 18-Asp396) en circulacion tras el tratamiento con b-AP15 (**P=0,01) (figura 4b). La supervivencia libre de enfermedad de ratones desnudos se desafio con celulas HCT-116Bel-2+ (figura 4c). Se trataron ratones con vehiculo (n=6) o b-AP15 5 mg kg-1 (n=6) 4-5 veces semanalmente durante 3 semanas y se monitorizo durante la aparicion de tumor (rango log, P=0,0136, razon de riesgo = 7,9). Se trataron ratones C57BL/6J que portaban tumores de carcinoma de pulmon singenico (LLC) con o bien vehiculo (n=4) de b-AP15 5 mg kg-1 (n=4) en un ciclo de un dia con tratamiento/dos dias sin tratamiento (figura 4d); volumen de tumor medio ± EEM mostrado (P=<0,01). Se trataron ratones BALB/c que portaban carcinomas de mama ortotopicos (4T1) con o bien vehiculo (n=5) o bien b-AP15 2,5 mg kg-1 (n=5) en un ciclo de un dia con tratamiento/tres dias sin tratamiento (la figura 4e); volumen de tumor medio ± EEM mostrado (**P=<0,01). Diagramas de cajas y bigotes de colonias metastasicas pulmonares de carcinomas de mama 4T1 tratados con vehiculo o b-AP15 (la figura 4f); las cajas representan cuartiles superiores e inferiores y la mediana, los bigotes muestran valores maximos y minimos. Tincion inmunohistoquimica representativa para acumulacion de
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ubiquitina unida a K48 y caspasa-3 escindida en tumores 4T1 tratados con vehiculo y b-AP15, aumento original x 20 (figura 4g). Infiltracion de AML en higado y ovario de ratones tratados con vehiculo y b-AP15 (figura 4h). Higado de ratones tratados con vehiculo con invasion mostrada de blastocitos leucemicos junto con agotamiento de glucogeno y hemorragia no especifica. Seccion de ovarios de ratones tratados con vehiculo con invasion masiva mostrada de blastocitos leucemicos y sangrado intersticial. En cambio, higado y ovarios de ratones tratados con b-AP15 mostraron pocos blastocitos infiltrados y morfologia normal (aumento original x 20).
EJEMPLO 5. b-AP15 no induce dano de ADN. Se trataron celulas HCT-116 con b-AP15 o doxorubicina (100 nM, como control positivo para estres genotoxico durante 18 h) (la figura 5). Se inmunotransfirieron lisados de celulas con anticuerpos para p53 fosforilado y marcador Ax H2 histona para dano de ADN para niveles totales de p53 y p- actina como controles de carga.
EJEMPLO 6. b-AP15 induce apoptosis e inhibe la supervivencia celular de celulas HCT-116 mientras que PBMC (celulas mononucleares de sangre periferica) y hTERT-RPE1 inmortalizado son menos sensibles. Se trataron celulas HCT-116 con concentraciones crecientes de b-AP15 durante 24 h y se determinaron los niveles de apoptosis midiendo los niveles de citoqueratina-18 escindida con caspasa (CK18) mediante ensayo ELISA (figura 6a). Se trataron celulas HCT-116 con concentraciones crecientes de b-AP15 durante 48 h). Se determino la viabilidad celular mediante ensayo de actividad de acido-fosfatasa. Valores de media ± d.e. mostrados (figura 6b). Se trataron celulas HCT-116 o hTERT-REP1 con concentraciones crecientes de b-AP15 durante 72 h seguido por analisis de citotoxicidad usando el metodo FMCA (44) (figura 6c). Se trataron celulas HCT-116 o hTERT-REP1 con concentraciones crecientes de bortezomib durante 72 h seguido por analisis de citotoxicidad usando el metodo FMCA (figura 6d). HTERT-RPE1 es una linea celular de epitelio de pigmento de retina humana inmortalizada (39). Se determino CI50 a partir de curvas de log de concentracion/efecto en Graph Pad Prism (GraphPad Software Inc. CA, EE.UU.) usando analisis de regresion no lineal (modelo de cuatro parametros con pendiente de Hill variable) (figuras 6e, 6f). Se generaron curvas de concentracion/respuesta en diluciones de dos veces en ocho concentraciones de b-AP15 y bortezomib por triplicado usando el ensayo FMCA. Los resultados se expresan como log CI50 + DE a partir de cuatro o cinco experimentos independientes (HCT-116, n=5; PBMC, n=4; hTERT-RPE1, n=5).
EJEMPLO 7. Curvas de respuesta de dosis de la induccion de la apotosis en clones isogenicos de celulas HCT-116. Se trataron celulas HCT-116 con concentraciones crecientes de bortezomib o b-AP15 durante 24 h y se determinaron los niveles de apoptosis midiendo los niveles de citoqueratina-18 escindida con caspasa (CK-18) mediante ensayo ELISA (Cambio en veces de la media ± d.e., n=4) (figura 7).
EJEMPLO 8. b-AP15 no inhibe las actividades proteoliticas del proteosoma. Se pretrato CP 20S (2nM) con DMSO, b-AP15 (50 pM) o bortezomib (100 nM) durante 5 min en tampon de ensayo (HEPES 25 mM, EDTA 0,5 mM, SDS al 0,03%) seguido por la adicion de 100 pM de los sustratos fluorogenicos Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC o Boc-LRR- AMC para analisis de actividades de proteasoma de tipo quimotripsina, de tipo caspasa y de tipo tripsina, respectivamente (la figura 8a). Se trataron proteasomas 26S (2 nM) en tampon de ensayo (HEPES 25 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 1 mM, ATP 2 mM, DTT 1 mM) como en el experimento ilustrado en la figura 8a (figura 8b). Los valores representan escision en veces en unidades fluorescentes relativas.
EJEMPLO 9. b-AP15 no produce disociacion de particulas 19S y 20S o alteran union de ubiquitina. Ensayo de superposicion de sustrato de proteasomas tratados con b-AP15 (figura 9a). Se trato proteasoma 26 S purificado con b-AP15 (10 pM o 50 pM) separada mediante electroforesis en gel nativa y se sometio a ensayo para determinar la actividad proteolitica usando Suc-LLVY-AMC como sustrato fluorogenico para actividad peptidasa. Los analisis de los geles mostraron la presencia de proteasomas ocupados de manera doble (RP2CP) y unica (RP1CP) en carriles tanto de control como de b-AP15. La adicion de SDS al 0,03% no revelo un aumento en presencia de particulas de nucleo 20S sin ocupar. b-AP15 no altera la actividad de union de proteasoma-ubiquitina (figura 9b). Se trataron celulas HCT-116 con bortezomib (100 nNM) o b-AP15 (1 pM), y se purificaron por afinidad los proteasomas. Se determinaron los niveles de poliubiquitina asociada mediante inmunotransferencia.
EJEMPLO 10. b-AP15 no es un inhibidor de DUB general. Se trataron HTC-116 celulas durante 3 h con b-AP15 (1 mM) (figura 10). Se incluyeron los lisados tratados con N-etilmaleimida (NEM) 10 mM como control para la inhibicion total de DUB. Se determino la actividad de DUB de los lisados de celulas midiendo la escision de del sustrato fluorogenico ubiquitin-7-amido-4-metilcumarina (Ub-AMC).
EJEMPLO 11. Caracterizacion bioquimica de la union de b-AP15. Respuesta a la dosis de b-AP15 (figura 11a): se trataron proteasomas 10S purificados (5 nM) con concentraciones indicadas de b-AP15, y se determino la actividad de DUB mediante la deteccion de escision Ub-AMC. Se determino el valor CI50 (2,1 ± 0,411 mM) de curvas de log de concentracion en Graph Pad Prism usando analisis de regresion no lineal (valores de media ±DE, n=3). Debe observarse que el CI50 observado en ensayos libres de celulas es un poco mas alto que el observado en las celulas, probablemente debido a la hidrofobicidad de b-AP15 (XLogP = 3,3) lo que dio como resultado el enriquecimiento del compuesto en celulas (11). Reversibilidad de inhibicion de b-AP15 (la figura 1b): Se determino la reversibilidad de la inhibicion midiendo la recuperacion de la actividad de DUB tras la dilucion rapida del complejo enzima/b-AP15. Se
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incubo una mezcla de reaccion que contenia 50 veces la concentracion 19S usada normalmente en reacciones (250 mM) y 10 veces el valor de CI50 calculado para b-AP15 (25 pM) sobre hielo durante 15 min seguido por una dilucion en 50 veces en tampon de reaccion para proporcionar una concentracion final de 5 nM para 19’S y 0,5 pM para b-AP15. Las curvas de reaccion lineal de escision de Ub-AMC muestran que b-AP15 es un inhibidor reversible. Determinacion de si b-AP15 no reacciona especificamente con residuos de cisteina (figura 11c). Se trato 19S (5 nM) con b-AP15 (10 pM) o b-Ap15 (10 pM) mezclado con glutation reducido (GSH (2 mM). La presencia de glutation no redujo inhibicion mediada por b-AP15 de actividad de DUB de 19S.
EJEMPLO 12. b-AP15 no es un inhibidor de DUB general. Se trataron celulas HCT-116 durante 3 h con b-AP15 (1 pM) y se purificaron por afinidad los proteasomas (figura 12a). Se expresa la actividad de DUB de proteasoma como escision de Ub-AMC/suc-LLVYAMC para normalizar para recuperacion de proteasoma (P=0,012, prueba t para datos independientes, dos colas). b-AP15 no inhibe DUB no proteasomicas (figura 12b). Se trataron DUB no proteosomicas recombinantes con b-AP15 y se determino el % de actividad. Se trataron lisados de celulas de celulas 293T y HeLa con b-AP15 (50 mM) seguido por marcaje activo con HA-UbVS (figura 12c). Se ejecutaron todas las muestras sobre SD-PAGE seguido por inmunotransferencia con anticuerpos a-HA.
EJEMPLO 13. Tratamiento con b-AP15 no altera significativamente el peso del animal (figura 13). La diferencia en peso al inicio y en el punto final entre el animales de control y tratados para los xenoinjertos mostrados en la figura 4 fueron: FaDu, -1,3%; LLC, +2,1%; 4T1 + 5,8%. Las cajas representan los cuartiles superiores e inferiores y la mediana, los bigotes muestran los valores maximos y minimos.
EJEMPLO 14. Sensibilidad de lineas celulares en la linea de celulas NC160 para b-AP15 y bortezomib (figura 14). Se muestran los valores de CI50 para las lineas celulares individuales (graficos a mano izquierda) y mediana de CI50 para cada tipo de tumor (graficos a mano derecha). Los datos se han tomado de
www.dtp.nci.nih.gov. Las flechas incdican los tipos de celulas de tumor mas sensibles para cada farmaco.
EJEMPLO 15. Expresion de genes de chaperona observados en celulas tratadas con bAP15. La expresion de genes de chaperona observadas en celulas tratadas con bAP15 (tabla 1) es indicativa de la induccion de una respuesta proteotoxica.
Tabla 1. Induccion de expresion de chaperona tras tratamiento con b-AP15
Conjunto de Valores de expresion
sondas
ID
Titulo de gen Simbolo de gen b-AP15 Vehiculo Cambio en veces
117_at
Proteina de 70kDa de choque termico 6 (HSP70B’) HSPA6 24149 33 725
225061 at
Homologo de DnaJ (Hsp40), A4 DNAJA4 21103 711 30
203810 at
Homologo de DnaJ (Hsp40), B4 DNAJB4 1955 123 16
205543_at
Proteina de 70kDa de choque termico de tipo 4 HSPA4L 5452 406 13
200666 s at
Homologo de DnaJ (Hsp40), B1 DNAJB1 33900 5251 6
241716_at
Proteina de 60kDa de choque termico 1 HSPD1 487 77 6
203811 s at
Homologo de DnaJ (Hsp40), B4 DNAJB4 960 178 5
202581_at
Proteina de 70kDa de choque termico 1B HSPA1B 31068 6382 5
206976_s_at
Proteina de 105kDa/110kDa de choque termico 1 HSPH1 40974 8427 5
211016_x_at
Proteina de 70kDa de choque termico 4 HSPA4 1803 422 4
202843 at
Homologo de DnaJ (Hsp40), B9 DNAJB9 1879 449 4
200880 at
Homologo de DnaJ (Hsp40), A1 DNAJA1 19970 4872 4
200800 s at
Proteina de 70kDa de choque termico 1A HSPA1A 57478 14352 4
El analisis adicional mediante PCR cuantitativa mostro que b-AP15 induce una expresion de HSPA6 (Hsp70B’), HSPA1B y DNAJB1 (Hsp40) mas fuerte que bortezomib (tabla 2). HSPA6, que se sabe que se induce en respuesta a la acumulacion de proteinas danadas (35), se indujo > 1000 en veces mediante b-AP15. Estos hallazgos indican que complejos de sustrato de ubiquitina de alto peso molecular que se acumulan como resultado de la inhibicion de DUB pueden generar un fuerte citotoxicidad que es insensible a la sobreexpresion de Bcl-2.
Tabla 2. Cuantificacion de la induccion de gen de chaperona.
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Induccion de veces#
Titulo de gen___________________________Simbolo de gen b-AP15________bortezomib
proteina de 70kDa de choque termico 6 (Hsp70B')
HSPA6 1550 60
proteina de 70kDa de choque termico 1B (Hspa1b)
HSPA1B 21 12
Homologo DnaJ, B1 (Hsp40B1)
DNAJB1 22 5
# Se trataron celulas HCT116 con concentraciones CI90 de b-AP15 o bortezomib y se determinaron los niveles de ARNm tras PCR de transcripcion inversa y a tiempo real. La induccion en veces se expresa como control sin tratar en veces. Se repitio el experimento con resultados similares.
La celular respuesta para b-AP15 no es solo distinta de la de bortezomib con respecto a implicacion de reguladores de apoptosis sino tambien en relacion con la sensibilidad de lineas de celulas tumorales en el panel de linea celular NCI-60 (
http://dtp.nci.nih.gov). Los inhibidores de actividad de DUB de RP 19S deben presentar un espectro terapeutico diferente de la de los inhibidores de actividad enzimatica de 20S, y por tanto expanden el arsenal de opciones de terapia en oncologia.
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Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Metodo para examinar un compuesto para determinar si el compuesto es un inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma de alta especificidad, comprendiendo el metodo poner en contacto el compuesto con
    5 particulas reguladoras 19S (RP 19S) humanas de proteasoma 26S y determinar si el compuesto inhibe la
    actividad de las enzimas de desubiquitinacion (DUB) UCHL5 y USP14, y una etapa adicional de determinar si el compuesto afecta a la actividad de enzimas de DUB asociadas no proteasomicas, en el que la inhibicion de las actividades de UCHL5 y USP14 y la actividad no afectada de enzimas de DUB asociadas no proteasomicas indica que el compuesto es un inhibidor de desubiquitinacion de proteasoma de alta 10 especificidad.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que las enzimas de DUB asociadas no proteasomicas comprenden al menos un miembro del grupo que consiste en UCHL1, UCHL3, USP2, USP7, USP8.
    15 3. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la determinacion de la inhibicion de
    actividades de UCHL5 y USP14 se realiza con un ensayo realizado con RP 19S humanas, con HA- ubiquitina o ubiquitina-AMC vinilsulfona como sustrato.
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