ES2629290T3

ES2629290T3 - Expression of recombinant human proteins in Tetrahymena

Info

Publication number: ES2629290T3
Application number: ES03007097.3T
Authority: ES
Inventors: Thomas Kiy; Matthias RÜSING
Original assignee: Cilian AG
Current assignee: Cilian AG
Priority date: 2002-03-30
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2023-03-28
Also published as: JP4434611B2; EP1350838B1; JP2004000181A; EP1350838A1; DK1350838T3; US6962800B2; DE10214413A1; US20030219869A1

Abstract

Procedimiento para la producción de glicoproteínas humanas recombinantes en Tetrahymena, que comprende las etapas: a) transformación de células de Tetrahymena con ADN recombinante, que comprende al menos un gen funcional que codifica para una glicoproteína humana, b) cultivo de las células recombinantes de Tetrahymena y expresión del gen, y c) aislamiento de las glicoproteínasProcess for the production of recombinant human glycoproteins in Tetrahymena, comprising the steps: a) transformation of Tetrahymena cells with recombinant DNA, comprising at least one functional gene that codes for a human glycoprotein, b) culturing the recombinant Tetrahymena cells and gene expression, and c) isolation of glycoproteins

Description

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DESCRIPTION

Expresión de proteínas humanas recombinantes en Tetrahymena Expression of recombinant human proteins in Tetrahymena

5 La presente invención se refiere a la expresión recombinante de proteínas humanas en Tetrahymena. The present invention relates to the recombinant expression of human proteins in Tetrahymena.

La producción de proteínas recombinantes mediante expresión de proteína heteróloga representa una alternativa a la obtención de proteínas a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de proteínas, por ejemplo como productos farmacéuticos están con frecuencia limitadas, son muy caras en su purificación o simplemente no se 10 encuentran disponibles. Además, debido al riesgo de impurezas tóxicas o en particular infecciosas pueden ser muy problemáticas. La biotecnología y la ingeniería genética permiten por el contrario, hoy en día, una producción económica y segura de una serie completa de proteínas en cantidades suficientes por medio de expresión heteróloga para los más diversos campos de uso: por ejemplo anticuerpos (para el diagnóstico, inmunización pasiva e investigación), hormonas (tales como insulina, eritropoyetina (EPO), interleucinas etc. para el uso terapéutico), The production of recombinant proteins by expression of heterologous protein represents an alternative to obtaining proteins from natural sources. Natural sources of protein, for example as pharmaceuticals are often limited, very expensive in their purification or simply not available. In addition, due to the risk of toxic or particularly infectious impurities they can be very problematic. Biotechnology and genetic engineering allow, on the contrary, today an economical and safe production of a complete series of proteins in sufficient quantities by means of heterologous expression for the most diverse fields of use: for example antibodies (for diagnosis, passive immunization and research), hormones (such as insulin, erythropoietin (EPO), interleukins etc. for therapeutic use),

15 enzimas (por ejemplo para el uso en la tecnología de los alimentos, diagnóstico, investigación), factores sanguíneos (para el tratamiento de hemofilia), vacunas, etc. (Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, capítulo 10: 227-252). 15 enzymes (for example for use in food technology, diagnosis, research), blood factors (for the treatment of hemophilia), vaccines, etc. (Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, chapter 10: 227-252).

Las proteínas humanas para un uso médico deben ser idénticas en sus propiedades bioquímicas, biofísicas y Human proteins for medical use must be identical in their biochemical, biophysical and

20 funcionales a la proteína natural. En el caso de una producción recombinante de proteínas de este tipo mediante expresión génica heteróloga ha de observarse a este respecto que, en contraposición a las bacterias en las células eucariotas hay una serie de modificaciones de proteína postraduccionales, por ejemplo la formación de puentes de disulfuro, escisión proteolítica de proteínas precursoras, modificaciones de ésteres de aminoácido, tales como fosforilación, acetilación, acilación, sulfatación, carboxilación, miristilación, palmitilación y en particular 20 functional to the natural protein. In the case of a recombinant production of proteins of this type by heterologous gene expression it should be noted in this regard that, in contrast to the bacteria in eukaryotic cells there are a number of post-translational protein modifications, for example the formation of disulfide bridges. , proteolytic cleavage of precursor proteins, modifications of amino acid esters, such as phosphorylation, acetylation, acylation, sulfation, carboxylation, myristylation, palmitilation and in particular

25 glicosilaciones. Además, las proteínas en células eucariotas se llevan con frecuencia a la estructura tridimensional correcta solo mediante un mecanismo complejo con la participación de chaperonas. Estas modificaciones desempeñan un papel muy importante en cuanto a las propiedades estructurales y funcionales específicas de las proteínas, tal como por ejemplo la actividad de enzimas, la especificidad (unión a receptor, reconocimiento celular), plegamiento, solubilidad, etc. de la proteína (Ashford & Platt 1998, en: Post-Translational Processing -A Practical 25 glycosylations. In addition, proteins in eukaryotic cells are frequently carried to the correct three-dimensional structure only by a complex mechanism with the participation of chaperones. These modifications play a very important role in terms of the specific structural and functional properties of proteins, such as for example enzyme activity, specificity (receptor binding, cell recognition), folding, solubility, etc. of protein (Ashford & Platt 1998, in: Post-Translational Processing -A Practical

30 Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, capítulo 4: 135-174; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, capítulo 7: 145-169). 30 Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, chapter 4: 135-174; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, chapter 7: 145-169).

Modificaciones que se desvían de la estructura natural pueden llevar por ejemplo a la inactivación de las proteínas o tienen un alto potencial alergénico. Modifications that deviate from the natural structure can lead, for example, to protein inactivation or have a high allergenic potential.

35 De este modo, por ejemplo la producción de albúmina de suero humano (HSA) en bacterias lleva con frecuencia a proteínas insolubles no plegadas correctamente, dado que faltan las chaperonas necesarias y los puentes de disulfuro no se forman correctamente. Como alternativas para la obtención de HSA natural a partir de sangre de donante humano están en desarrollo por lo tanto distintos sistemas de producción eucariotas para la obtención de 35 Thus, for example, the production of human serum albumin (HSA) in bacteria often leads to insoluble proteins that are not folded correctly, since the necessary chaperones are missing and disulfide bridges are not formed correctly. As alternatives for obtaining natural HSA from human donor blood, different eukaryotic production systems are therefore in development to obtain

40 HSA recombinante. El espectro llega a este respecto desde la expresión en plantas a través de hongos hasta animales transgénicos o cultivos celulares de mamíferos. 40 recombinant HSA. The spectrum reaches in this respect from expression in plants through fungi to transgenic animals or mammalian cell cultures.

Aunque se ha establecido una serie completa de sistemas de expresión bacterianos y eucariotas para la producción de proteínas recombinantes, no existe ningún sistema universal que cubra el espectro completo de las posibles 45 modificaciones de proteína (en particular en el caso de proteínas eucariotas) y por lo tanto pudiera emplearse de manera universal (Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-45; Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, capítulo 7: 145-169). Además es también extraordinariamente problemático que algunos de los sistemas más usados llevan a modificaciones de proteína postraduccionales poco comunes y en parte 50 indeseadas. De este modo las proteínas de levadura expresadas de manera recombinante están en ocasiones de manera extremadamente intensa con restos manosa (véase la figura 1: glicosilación de proteína). Estas denominadas estructuras “high Mannose” (alto contenido de manosa) de levadura se componen a este respecto de aproximadamente 8-50 restos manosa y se diferencian por lo tanto considerablemente de las estructuras de glicoproteína ricas en manosa de células de mamífero, que presentan como máximo 5-9 restos manosa (Moremen 55 et al. 1994, Glycobiology 4(2): 113-125). Estas estructuras de manosa típicas de levadura son alérgenos fuertes y con ello, en el caso de la producción de glicoproteínas recombinantes son muy problemáticas para un uso terapéutico (Tuite et al. 1999, en Protein Expression -A Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, capítulo 3: en particular página 76). Además, en las levaduras no puede formarse ninguna estructura de glicoproteína híbrida o compleja, lo que limita adicionalmente el uso como sistema de expresión. Las plantas que en Although a complete series of bacterial and eukaryotic expression systems have been established for the production of recombinant proteins, there is no universal system that covers the full spectrum of possible protein modifications (particularly in the case of eukaryotic proteins) and by therefore it could be used universally (Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-45; Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 216: 165- 181; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, chapter 7: 145-169). Furthermore, it is also extraordinarily problematic that some of the most used systems lead to unusual and partly unwanted post-translational protein modifications. Thus recombinantly expressed yeast proteins are sometimes extremely intense with mannose moieties (see Figure 1: protein glycosylation). These so-called "high Mannose" (high mannose) yeast structures are composed in this respect of approximately 8-50 mannose moieties and therefore differ considerably from the mannose-rich glycoprotein structures of mammalian cells, which present as maximum 5-9 mannose remains (Moremen 55 et al. 1994, Glycobiology 4 (2): 113-125). These typical yeast mannose structures are strong allergens and with this, in the case of the production of recombinant glycoproteins they are very problematic for therapeutic use (Tuite et al. 1999, in Protein Expression -A Practical Approach, Ed. Higgins & Hames , Oxford University Press, chapter 3: in particular page 76). In addition, no hybrid or complex glycoprotein structure can be formed in yeasts, which further limits the use as an expression system. The plants that in

60 los últimos tiempos se discuten y se usan cada vez con mayor frecuencia como sistemas de producción para proteínas recombinantes, presentan por el contrario, en lugar del ácido siálico típico para los mamíferos, xilosa sobre las estructuras de glicoproteína (Ashford & Platt, véase anteriormente). La xilosa y la fucosa alfa-1,3 enlazada detectada en plantas pueden representar un riesgo alérgico y por lo tanto son también problemáticas (Jenkins et al. 1996, Nature Biotech. 14: 975-981). The latter times are discussed and used more and more frequently as production systems for recombinant proteins, instead, instead of the typical sialic acid for mammals, xylose on glycoprotein structures (Ashford & Platt, see above) ). Xylose and bound alpha-1,3 fucose detected in plants may pose an allergic risk and therefore are also problematic (Jenkins et al. 1996, Nature Biotech. 14: 975-981).

65 Por consiguiente, existe precisamente una gran necesidad de nuevos sistemas de expresión eucariotas, sobre todo como alternativas a la producción costosa y muy cara de proteínas recombinantes mediante células de cultivo de mamífero. 65 Consequently, there is precisely a great need for new eukaryotic expression systems, especially as alternatives to expensive and very expensive production of recombinant proteins by mammalian culture cells.

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5 Un sistema de este tipo cumplirá idealmente los siguientes requisitos: 5 Such a system will ideally meet the following requirements:

1) Deben proporcionarse marcadores de selección y elementos de ADN reguladores (tales como señales de transcripción y de traducción, etc.). 1) Selection markers and regulatory DNA elements (such as transcription and translation signals, etc.) should be provided.

10 2) El sistema de expresión debe presentar modificaciones de proteína postraduccionales eucariotas importantes, pero, a este respecto, no provocan ningún alérgeno para los seres humanos. 10 2) The expression system must have significant eukaryotic post-translational protein modifications, but, in this respect, they do not cause any allergens for humans.

3) La producción de las proteínas recombinantes debe ser lo más sencilla y económica posible, por ejemplo mediante fermentación de las células u organismos a la escala de producción (que puede ascender a varios 3) The production of recombinant proteins should be as simple and economical as possible, for example by fermentation of cells or organisms at the production scale (which can amount to several

15 1000 L) en medios sencillos y procesamiento sencillo de los productos. Para esto último sería extraordinariamente ventajosa la posibilidad de la secreción de las proteínas expresadas por las células. De este modo es fácilmente posible una separación de las células de los sobrenadantes de cultivo que contienen producto y la cantidad de las impurezas que han de separarse del producto durante el procesamiento, se reduce decisivamente cuando puede prescindirse por completo de una ruptura celular. 15 1000 L) in simple media and simple product processing. For the latter, the possibility of secretion of the proteins expressed by the cells would be extraordinarily advantageous. In this way a separation of the cells from the culture supernatants containing product is easily possible and the amount of impurities to be separated from the product during processing, is decisively reduced when a cell rupture can be completely dispensed with.

20 A los sistemas de expresión eucariotas ya establecidos tales como por ejemplo células de cultivo de levadura, mamífero o de insecto podrían ofrecerse una alternativa interesante protozoos o protistas (como definición véase por ejemplo Hendersons’s dictionary of biological terms, 10ª ed. 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scientific & Technical, England, o Margulis et al. (Eds) 1990. Handbook of Protoctista, Jones & Bartlett, Boston; van den Hoek et 20 To the already established eukaryotic expression systems such as for example yeast, mammalian or insect culture cells an interesting protozoan or protist alternative could be offered (as definition see for example Hendersons's dictionary of biological terms, 10th ed. 1989, Eleanor Lawrence , Longman Scientific & Technical, England, or Margulis et al. (Eds) 1990. Handbook of Protoctist, Jones & Bartlett, Boston; van den Hoek et

25 al. 1995, Algae -An introduction to phycology, Cambridge University Press) como sistemas de expresión. En el caso de estos organismos se trata de un grupo muy heterogéneo de microorganismos eucariotas, por regla general de camada única. Tienen la compartimentación y diferenciación típica para las células eucariotas. Algunos están relativamente estrechamente relacionados con eucariotas superiores, por otro lado, en cambio, se asemejan en parte en el cultivo y el crecimiento más bien a levaduras o incluso a bacterias y pueden fermentarse de manera 25 al. 1995, Algae -An introduction to phycology, Cambridge University Press) as expression systems. In the case of these organisms, it is a very heterogeneous group of eukaryotic microorganisms, as a rule of single litter. They have the compartmentalization and differentiation typical for eukaryotic cells. Some are relatively closely related to higher eukaryotes, on the other hand, on the other hand, they resemble in part in the cultivation and growth rather than yeasts or even bacteria and can be fermented in a manner

30 relativamente fácil con una alta densidad celular sobre medios simples a gran escala. 30 relatively easy with high cell density on simple large-scale media.

Para algunos pocos protistas o protozoos se han descritos métodos para la transformación y expresión de proteína heteróloga. En particular en protozoos parasitarios, tales como Trypanosoma, Leishmania, Plasmodium entre otros, se efectuaron distintos ensayos para la transformación y la expresión de proteínas recombinantes (Beverly 2000, 35 WO 00/58483 A2). Kelly (1997, Adv. en Parasitol., Vol 39, 227-270) da una visión general sobre ello. La posibilidad a la expresión de proteína heteróloga se mostró también en una serie de protistas adicionales (microorganismos eucariotas), tal como por ejemplo en el mixomiceto Dictyostelium discoideum (Manstein et al. 1995, Gene 162: 129134, Jung y Williams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 3-8), en ciliados (documento WO 98/01572 A1) tal como Paramecium (Boileau et al. 1999, J. Eukaryot. Microbiol. 46: 56-65) y Tetrahymena (Gaertig et al. 1999, Nature 40 Biotech. 17: 462-465, WO 00/46381 A1). También en protistas fotoautótrofos, las microalgas, pudieron expresarse proteínas de manera heteróloga. En este caso se mencionan por ejemplo Chlamydomonas (Hall et al. 1993, Gene For a few protists or protozoa, methods for the transformation and expression of heterologous protein have been described. In particular, in parasitic protozoa, such as Trypanosoma, Leishmania, Plasmodium, among others, different tests were carried out for the transformation and expression of recombinant proteins (Beverly 2000, 35 WO 00/58483 A2). Kelly (1997, Adv. In Parasitol., Vol 39, 227-270) gives an overview of this. The possibility of heterologous protein expression was also shown in a series of additional protists (eukaryotic microorganisms), such as, for example, in myxomycete Dictyostelium discoideum (Manstein et al. 1995, Gene 162: 129134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 3-8), in ciliates (WO 98/01572 A1) such as Paramecium (Boileau et al. 1999, J. Eukaryot. Microbiol. 46: 56-65) and Tetrahymena (Gaertig et al. 1999, Nature 40 Biotech. 17: 462-465, WO 00/46381 A1). Also in photoautotrophic protists, microalgae, proteins could be expressed heterologously. In this case, for example, Chlamydomonas (Hall et al. 1993, Gene

124: 75-81), Volvox (Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 91: 5080-5084), dinoflagelados (en Lohuis & Miller 1998, Plant Journal 13: 427-435) y diatomeas (Dunahay et al. 1995, J. Phycol. 31: 1004-1012). En la mayoría de los casos se expresaron a este respecto sin embargo únicamente marcadores de resistencia sencillos o marcadores de selección 124: 75-81), Volvox (Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 91: 5080-5084), dinoflagellates (in Lohuis & Miller 1998, Plant Journal 13: 427-435) and diatoms (Dunahay et al. 1995, J. Phycol. 31: 1004-1012). In most cases, however, only single resistance markers or selection markers were expressed in this regard.

45 no humanos. Representa un especial requisito por el contrario la producción de proteínas humanas lo más idénticas posible en células no de mamífero. En particular cuando se trata de proteínas glicosiladas tales como por ejemplo EPO. 45 nonhumans. It represents a special requirement on the contrary the production of human proteins as identical as possible in non-mammalian cells. In particular when it comes to glycosylated proteins such as for example EPO.

En el caso de los ciliados Tetrahymena se trata de un microorganismo no patógeno, unicelular, eucariota, que está In the case of Tetrahymena ciliates, it is a non-pathogenic, unicellular, eukaryotic microorganism, which is

50 relativamente estrechamente relacionado con eucariotas superiores y que presenta las diferenciaciones celulares típicas para ello. Aunque Tetrahymena es un eucariota real, diferenciado de manera compleja, se asemeja en sus propiedades de cultivo y de crecimiento pero más bien a las levaduras o bacterias simples y puede fermentarse adecuadamente sobre medios de leche desnatada relativamente baratos a gran escala. En condiciones óptimas, el tiempo de generación asciende aproximadamente a 1,5-3 h y pueden alcanzarse densidades celulares muy altas 50 relatively closely related to higher eukaryotes and presenting the typical cell differentiation for this. Although Tetrahymena is a real, complexly differentiated eukaryote, it resembles its cultivation and growth properties but rather simple yeasts or bacteria and can be properly fermented on relatively cheap skim milk media on a large scale. Under optimal conditions, the generation time is approximately 1.5-3 h and very high cell densities can be achieved.

55 (2,2 x 107 células/ml, correspondiente a 48 g/l de biomasa seca) (Kiy y Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy y Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146). Por ello Tetrahymena es muy interesante para una producción fermentativa de proteínas recombinantes a gran escala y esencialmente más ventajosa que por ejemplo las células de mamífero. 55 (2.2 x 107 cells / ml, corresponding to 48 g / l of dry biomass) (Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146). This is why Tetrahymena is very interesting for a fermentative production of large-scale recombinant proteins and essentially more advantageous than for example mammalian cells.

60 Para obtener la ruptura a través de los patrones de glicosilación de las proteínas producidas por Tetrahymena, se examinaron muestras de proteína (en el medio de cultivo de cultivos de Tetrahymena) por medio de transferencias de lectina antes o después de la digestión con péptido:NGlicosidasa F (PNGasa F) (métodos según Ashfort & Platt, 1999, véase anteriormente). Además se aislaron los N-glicanos y se secuenciaron con ayuda de la tecnología FACE (empresa Glyko Inc.). 60 To obtain the break through the glycosylation patterns of the proteins produced by Tetrahymena, protein samples (in the culture medium of Tetrahymena cultures) were examined by lectin transfers before or after peptide digestion: NGlicosidase F (PNGase F) (methods according to Ashfort & Platt, 1999, see above). In addition, N-glycans were isolated and sequenced with the help of FACE technology (Glyko Inc.).

65 Los ensayos por medio de transferencia de lectina muestran que algunas proteínas de las fracciones microsómicas 65 Assays by lectin transfer show that some proteins of microsomal fractions

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o de medios están N-glicosilados. En las dos fracciones pudieron detectarse N-glicanos con disacáridos de manosa terminales (enlace sensible a PNGasa F de la lectina GNA). A este respecto se trata de N-glicanos del tipo rico en manosa. Los enlaces de lectina sensibles a PNGasa F no se detectaron de modo que es improbable la presencia de or of media are N-glycosylated. In the two fractions, N-glycans could be detected with terminal mannose disaccharides (PNGase F sensitive linkage of the GNA lectin). In this respect it is N-glycans of the mannose-rich type. The lectin bonds sensitive to PNGase F were not detected so that the presence of

5 restos fucosa (lectina AAA), de galactosa (RCA, DSA) y de N-acetilglucosamina (DSA, WGA) en los N-glicanos. La fuerte glicosilación hallada de las proteínas de medio no puede atribuirse a la contaminación por el medio usado, dado que los controles correspondientes no mostraron ningún enlace de lectina. Por lo tanto se trata de proteínas secretadas por Tetrahymena. 5 fucose residues (lectin AAA), galactose (RCA, DSA) and N-acetylglucosamine (DSA, WGA) in N-glycans. The strong glycosylation found in the medium proteins cannot be attributed to contamination by the medium used, since the corresponding controls did not show any lectin bond. Therefore it is proteins secreted by Tetrahymena.

Cuatro de los oligosacáridos N-glicosídicos se aislaron y secuenciaron. A este respecto se trata de las siguientes estructuras: Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2 y Man2GlcNAc2. A este respecto se trata de estructuras parciales de las cadenas N-glicosídicas ricas en manosa, tal como se detectaron también por Taniguchi et al. (J. Biol. Chem. 260, 13941-13946 (1985)) para Tetrahymena pyriformis. No se encontraron indicaciones sobre cadenas de azúcar N-glicosídicas complejas o híbridas. Con ello se confirmaron los resultados de las transferencias de Four of the N-glycosidic oligosaccharides were isolated and sequenced. In this regard, these are the following structures: Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2 and Man2GlcNAc2. In this regard, these are partial structures of the mannose-rich N-glycosidic chains, as also detected by Taniguchi et al. (J. Biol. Chem. 260, 13941-13946 (1985)) for Tetrahymena pyriformis. No indications were found for complex or hybrid N-glycosidic sugar chains. This confirmed the results of the transfers of

15 lectina. 15 lectin

Por lo tanto, Tetrahymena muestra glicosilaciones del tipo fundamental sencillo (véase la figura 1). Faltan por completo indicaciones de cadenas oglicosídicas en proteínas secretadas. Con respecto a otros sistemas de expresión, Tetrahymena tiene por lo tanto una ventaja significativa: Las estructuras de azúcar son esencialmente más similares a las estructuras N-glicosídicas de las células de mamífero que por ejemplo en levaduras (ricas en manosa con muchos más restos manosa y estructura poco común) e insectos y plantas (presencia de xilosa). Para algunas aplicaciones, el tipo de glicosilación simple de Tetrahymena podría tener también ventajas frente a los cultivos de células de mamífero, que producen generalmente estructuras de azúcar N-glicosídicas complejas, que con frecuencia influyen considerablemente en la actividad biológica de la proteína (por ejemplo Clearing-rate etc.) y Therefore, Tetrahymena shows glycosylations of the simple fundamental type (see Figure 1). Indications of oglycosidic chains in secreted proteins are completely lacking. With respect to other expression systems, Tetrahymena therefore has a significant advantage: Sugar structures are essentially more similar to the N-glycosidic structures of mammalian cells than for example in yeasts (rich in mannose with many more mannose moieties and unusual structure) and insects and plants (presence of xylose). For some applications, the simple glycosylation type of Tetrahymena could also have advantages over mammalian cell cultures, which generally produce complex N-glycosidic sugar structures, which often have a considerable influence on the biological activity of the protein (for example Clearing-rate etc.) and

25 dificultan la producción (véase por ejemplo la producción de eritropoyetina, 80 % de glicosilación errónea). Con ello Tetrahymena es muy especialmente adecuada para la expresión de proteínas glicosiladas, tales como por ejemplo eritropoyetina (EPO). 25 hinder production (see for example the production of erythropoietin, 80% erroneous glycosylation). With this Tetrahymena is very especially suitable for the expression of glycosylated proteins, such as for example erythropoietin (EPO).

La transformación de Tetrahymena puede conseguirse mediante microinyección, electroporación o bombardeo con micropartículas. Para ello se encuentra disponible una serie de vectores, promotores, etc. La selección de los transformantes tiene lugar por medio de un marcador de resistencia. De este modo se transformó Tetrahymena por ejemplo de manera satisfactoria con un vector de ADNr (selección mediante una mutación de resistencia a paromicina del ARNr (Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491). En otros experimentos de transformación se expresó satisfactoriamente resistencias de cicloheximida o neomicina en Tetrahymena transformation can be achieved by microinjection, electroporation or bombardment with microparticles. For this a series of vectors, promoters, etc. is available. The selection of the transformants takes place by means of a resistance marker. In this way, Tetrahymena was transformed, for example, satisfactorily with a rDNA vector (selection by a mutation of paromycin resistance of the rRNA (Tondravi et al. 1986, PNAS 83: 4396; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487- 8491) In other transformation experiments, cycloheximide or neomycin resistance was successfully expressed in

35 Tetrahymena (Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn et al. 1993, PNAS 90: 9295-9299). Además de estos genes marcadores, Gaertig et al. (1999, Nature Biotech. 17: 462-465) han expresado de manera satisfactoria un antígeno parasitario de pescado recombinante (de un ciliado) en Tetrahymena. Además Gaertig et al. expresó de manera satisfactoria una ovoalbúmina de gallina parcial en Tetrahymena (documento WO 00/46381 A1). La selección tuvo lugar en ambos casos con ayuda de Paclitaxel (taxol). Este sistema desarrollado por Gaertig et al. está pendiente de patente (documento WO 00/46381 A1). 35 Tetrahymena (Yao et al. 1991, PNAS 88: 9493-9497; Kahn et al. 1993, PNAS 90: 9295-9299). In addition to these marker genes, Gaertig et al. (1999, Nature Biotech. 17: 462-465) have satisfactorily expressed a recombinant fish parasitic antigen (from a ciliated) in Tetrahymena. In addition Gaertig et al. satisfactorily expressed a partial chicken ovalbumin in Tetrahymena (WO 00/46381 A1). The selection took place in both cases with the help of Paclitaxel (taxol). This system developed by Gaertig et al. patent pending (WO 00/46381 A1).

Una integración del gen heterólogo mediante recombinación de ADN homólogo es posible en Tetrahymena. De este modo pueden generarse transformantes mitóticamente estables. Mediante la recombinación de ADN homólogo son posibles además también desconexiones génicas dirigidas (Gene Knockouts) (Bruns & Cassidy-Hanley en: Methods An integration of the heterologous gene by homologous DNA recombination is possible in Tetrahymena. In this way, mitotically stable transformants can be generated. Homologous DNA recombination also allows targeted gene disconnections (Gene Knockouts) (Bruns & Cassidy-Hanley in: Methods

45 in Cell Biology, Volumen 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 501-512); Hai et al. en: Methods in Cell Biology, Volumen 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465 o Cassidy-Hanley et al. 1997 Genetics 146:135-147). Además, opcionalmente puede transformarse el macronúcleo somática o el micronúcleo generativo. En el caso de la transformación del macronúcleo se obtienen transformantes estériles, lo que puede ser ventajoso por cuestiones de seguridad o de aceptación. 45 in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 501-512); Hai et al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465 or Cassidy-Hanley et al. 1997 Genetics 146: 135-147). In addition, the somatic macronucleus or generative micronucleus can optionally be transformed. In the case of the macronucleus transformation, sterile transformants are obtained, which can be advantageous for security or acceptance reasons.

En vista del estado de la técnica es ahora objetivo de la presente invención proporcionar un nuevo procedimiento de producción de realización sencilla y económica para proteínas humanas, que albergue la posibilidad de modificaciones de proteína prostraduccionales, que corresponden, lo más posiblemente, al tipo fundamental de las distintas modificaciones de proteína humanas, que permite además preferentemente la secreción de las proteínas In view of the state of the art, it is now the objective of the present invention to provide a new, simple and economical production process for human proteins, which harbors the possibility of prostraductional protein modifications, which most likely correspond to the fundamental type of the different human protein modifications, which also preferably allows protein secretion

55 recombinantes, preferentemente prescindiendo del uso de señales de secreción no humanas (secuencias de secreción). 55 recombinants, preferably without the use of non-human secretion signals (secretion sequences).

Este objetivo se consigue, así como otros objetivos no mencionados explícitamente, que sin embargo pueden derivarse o deducirse sin más de los contextos discutidos inicialmente en el presente documento, mediante las formas de realización definidas en las reivindicaciones de la presente invención. This objective is achieved, as well as other objectives not explicitly mentioned, which however can be derived or deduced without more than the contexts initially discussed herein, by the embodiments defined in the claims of the present invention.

Proporcionar un procedimiento para la producción de proteínas humanas recombinantes se logra de manera asombrosamente sencilla transformándose células de Tetrahymena con ADN recombinante, que contiene al menos un gen funcional que codifica para una proteína humana, cultivándose las células de Tetrahymena recombinantes, 65 expresándose el gen que codifica para una proteína humana y aislándose a continuación las proteínas. En particular, las proteínas humanas recombinantes producidas de esta manera presentan patrones de glicosilación Providing a process for the production of recombinant human proteins is achieved in a surprisingly simple manner by transforming Tetrahymena cells with recombinant DNA, which contains at least one functional gene that encodes a human protein, the recombinant Tetrahymena cells being cultured, expressing the gene that it codes for a human protein and the proteins are then isolated. In particular, recombinant human proteins produced in this manner have glycosylation patterns.

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sencillos, cuyas estructuras son esencialmente más semejantes a las de las células de mamífero que por ejemplo a las de las levaduras. Las propiedades de cultivo y de crecimiento corresponden más bien a las de las levaduras, es decir, crecimiento rápido sobre medios baratos, que puede alcanzarse sin un esfuerzo técnico excesivo. simple, whose structures are essentially more similar to those of mammalian cells than for example those of yeasts. The cultivation and growth properties correspond rather to those of yeasts, that is, rapid growth on cheap media, which can be achieved without excessive technical effort.

5 Una especie preferida de acuerdo con la invención del género Tetrahymena es Tetrahymena thermophila. 5 A preferred species according to the invention of the genus Tetrahymena is Tetrahymena thermophila.

Por una proteína humana se entiende de acuerdo con la invención una proteína para la que puede aislarse una secuencia de ADN correspondiente a partir del ser humano. La secuencia de ADN usada finalmente para la expresión recombinante no tiene que haberse aislado a este respecto a partir de células humanas, esta puede más bien encontrarse también en forma modificada o haberse producido artificialmente. La proteína producida puede presentar también con respecto a la proteína aislable a partir de células humanas mutaciones, tales como deleciones, el intercambio de determinados aminoácidos y más similares. En particular, de acuerdo con la invención con proteínas humanas quiere expresarse proteínas humanas para un uso terapéutico, tales como citocinas (interferonas, interleucinas), enzimas, hormonas (insulina, EPO, hormonas del crecimiento), factores sanguíneos By a human protein is understood according to the invention a protein for which a corresponding DNA sequence can be isolated from the human being. The DNA sequence finally used for recombinant expression does not have to be isolated in this respect from human cells, it can also be found in modified form or produced artificially. The protein produced may also present with respect to the isolable protein from human cell mutations, such as deletions, the exchange of certain amino acids and more similar. In particular, according to the invention with human proteins, human proteins are intended to be expressed for therapeutic use, such as cytokines (interferons, interleukins), enzymes, hormones (insulin, EPO, growth hormones), blood factors

15 (factor VIII, factor IX) y otros. 15 (factor VIII, factor IX) and others.

Por patrones de glicosilación sencillos se entiende para los fines de la presente invención principalmente patrones de glicosilación de la estructura fundamental GlcNAc2-Man2-5. Simple glycosylation patterns are understood for the purposes of the present invention mainly glycosylation patterns of the fundamental structure GlcNAc2-Man2-5.

Por un gen funcional se entiende para los fines de la presente invención un gen que puede expresarse en el organismo objetivo. En particular, un gen funcional comprende por lo tanto, además de una secuencia codificante, un promotor funcional en el organismo objetivo, que lleva a la transcripción de la secuencia codificante. Un promotor funcional de este tipo puede presentar, entre otras, una o varias cajas TATA, cajas CCAAT, cajas GC o secuencias potenciadoras. Además, el gen funcional puede comprender un terminador funcional en el organismo objetivo que A functional gene is understood for the purposes of the present invention as a gene that can be expressed in the target organism. In particular, a functional gene therefore comprises, in addition to a coding sequence, a functional promoter in the target organism, which leads to transcription of the coding sequence. A functional promoter of this type may have, among others, one or more TATA boxes, CCAAT boxes, GC boxes or enhancer sequences. In addition, the functional gene may comprise a functional terminator in the target organism that

25 lleva a la interrupción de la transcripción y contiene secuencias señal, que llevan a la poliadenilación del ARNm. La secuencia codificante del gen funcional presenta así mismo todas las propiedades necesarias para la traducción en el organismo objetivo (por ejemplo codón de inicio (por ejemplo ATG), codón de parada (TGA), región rica en A antes del inicio (sitio de inicio de la traducción), secuencias Kozak, sitio poli-A. El gen puede presentar también la utilización de codón específica para Tetrahymena (Wuitschick & Karrer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)). 25 leads to interruption of transcription and contains signal sequences, which lead to polyadenylation of mRNA. The coding sequence of the functional gene also has all the necessary properties for translation in the target organism (for example start codon (for example ATG), stop codon (TGA), region rich in A before the start (start site) of the translation), Kozak sequences, poly-A site. The gene may also present the use of codon specific for Tetrahymena (Wuitschick & Karrer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)).

En una forma de realización preferida de la presente invención, en el caso del gen expresado se trata de un gen para albúmina de suero humano (HSA) de manera muy especialmente preferente del gen con el número de registro de GenBank: 8392890 o una variante del mismo. Con respecto al tema GenBank véase Benson, D.A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (T), 15-18 (2000). La proteína producida es por consiguiente preferentemente albúmina de suero In a preferred embodiment of the present invention, in the case of the expressed gene it is a gene for human serum albumin (HSA) in a very particularly preferred manner of the gene with the GenBank registration number: 8392890 or a variant of the same. Regarding the GenBank issue see Benson, D.A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (T), 15-18 (2000). The protein produced is therefore preferably serum albumin.

35 humana. 35 human.

Por una variante de HSA recombinante se entiende de acuerdo con la invención un gen con al menos el 70 %, preferentemente el 80 %, de manera especialmente preferente el 90 % y de manera muy especialmente preferente el 95 % de homología con la secuencia del gen con el número de registro de GenBank: 8392890. En particular hibrida una sonda de preferentemente 100 a 300 pb seleccionada de la secuencia del gen con el número de registro de GenBank: 8392890 en las condiciones de hibridación convencionales en una variante de este gen. A variant of recombinant HSA is understood according to the invention to be a gene with at least 70%, preferably 80%, particularly preferably 90% and very particularly preferably 95% homology with the gene sequence with the GenBank registration number: 8392890. In particular, a probe of preferably 100 to 300 bp selected from the gene sequence with the GenBank registration number is hybridized: 8392890 under conventional hybridization conditions in a variant of this gene.

En el presente trabajo se describe por primera vez la expresión satisfactoria de HSA recombinante en Tetrahymena y por lo tanto en realidad por primera vez, que una proteína humana podía expresarse satisfactoriamente en In the present work the satisfactory expression of recombinant HSA in Tetrahymena is described for the first time and therefore in reality for the first time, that a human protein could be expressed satisfactorily in

45 Tetrahymena. 45 Tetrahymena.

Para ello se amplificó por PCR la secuencia codificante completa de HSA inclusive la secuencia líder y se ligó en un vector de expresión de Tetrahymena (véase el ejemplo 2). Después de la transformación de Tetrahymena con este constructo y la selección de los transformantes en cuanto a la resistencia a taxol (véase el ejemplo 3), se cultivaron cultivos en medios de leche desnatada con la adición de inhibidor de proteasa (véase el ejemplo 5). Las proteínas secretadas por Tetrahymena al medio se separaron por medio de SDS-PAGE y se detectó HSA con un anticuerpo específico de HSA en la inmunotransferencia de tipo Western (véase la figura 2). Asombrosamente no se logró solo producir el HSA recombinante, sino también secretarlo al medio. For this, the complete HSA coding sequence was amplified by PCR including the leader sequence and ligated into a Tetrahymena expression vector (see example 2). After the transformation of Tetrahymena with this construct and the selection of transformants for taxol resistance (see example 3), cultures were grown in skim milk media with the addition of protease inhibitor (see example 5) . Proteins secreted by Tetrahymena to the medium were separated by SDS-PAGE and HSA was detected with an HSA specific antibody in Western blotting (see Figure 2). Amazingly, it was not only possible to produce the recombinant HSA, but also to secrete it into the medium.

55 Contra toda expectativa, la secuencia líder humana ha resultado ser totalmente funcional en Tetrahymena. 55 Against all expectations, the human leader sequence has proved to be fully functional in Tetrahymena.

Las células de Tetrahymena que secretan la proteína expresada, constituyen una forma de realización preferida de la presente invención. El aislamiento de las proteínas puede tener lugar en esta forma de realización a partir del sobrenadante de cultivo. Tetrahymena cells that secrete the expressed protein constitute a preferred embodiment of the present invention. Protein isolation can take place in this embodiment from the culture supernatant.

Una forma de realización muy especialmente preferida de la presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento para la producción de proteínas humanas recombinantes en el que el gen que codifica para la proteína humana comprende una secuencia líder humana que provoca la secreción de la proteína expresada por Tetrahymena. Para una descripción de secuencias líder (sinónimo de secuencias señal), o péptidos líder, (o péptidos 65 señal) véase por ejemplo Stryer, L., Biochemie, 4ª edición., Spektrum Akademischer Verlag, 1996, páginas 802-3, o Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell. 3ª ed. Garland Publishing, Nueva York y Londres, 1994, capítulo 12 o A very particularly preferred embodiment of the present invention therefore relates to a process for the production of recombinant human proteins in which the gene encoding the human protein comprises a human leader sequence that causes secretion of the expressed protein. by Tetrahymena. For a description of leader sequences (synonymous with signal sequences), or leader peptides, (or signal peptides) see for example Stryer, L., Biochemie, 4th edition., Spektrum Akademischer Verlag, 1996, pages 802-3, or Alberts , B. et al., Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Garland Publishing, New York and London, 1994, chapter 12 or

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5 preferida, la secuencia líder comprende una secuencia correspondiente a la secuencia de propéptido aggggtgtgt ttcgtcga (SEQ ID No. 7), o codifica para un propéptido que comprende la secuencia de aminoácidos Arg Gly Val Phe Arg Arg (SEQ ID No. 8). 5 preferred, the leader sequence comprises a sequence corresponding to the aggggtgtgt ttcgtcga propeptide sequence (SEQ ID No. 7), or encodes for a propeptide comprising the amino acid sequence Arg Gly Val Phe Arg Arg (SEQ ID No. 8).

En otra forma de realización de la presente invención, se expresa la proteína humana sobre la superficie de las células recombinantes de Tetrahymena. In another embodiment of the present invention, the human protein is expressed on the surface of the Tetrahymena recombinant cells.

Una divulgación adicional se refiere a células recombinantes de Tetrahymena, que contiene ADN que codifica para una proteína humana. Preferentemente, las células recombinantes de Tetrahymena expresan el gen humano recombinante. De manera especialmente preferente, el gen expresado comprende una secuencia líder humana. An additional disclosure relates to recombinant Tetrahymena cells, which contains DNA encoding a human protein. Preferably, the Tetrahymena recombinant cells express the recombinant human gene. Especially preferably, the expressed gene comprises a human leader sequence.

15 Preferentemente, dicha secuencia líder comprende la SEQ ID No. 5, o codifica para un péptido líder que comprende la SEQ ID No. 6. En otra forma de realización preferida, la secuencia líder comprende una secuencia correspondiente a la secuencia de propéptido SEQ ID No. 7, o codifica para un propéptido que comprende la SEQ ID No. 8. Preferably, said leader sequence comprises SEQ ID No. 5, or encodes for a leader peptide comprising SEQ ID No. 6. In another preferred embodiment, the leader sequence comprises a sequence corresponding to the SEQ ID propeptide sequence. No. 7, or encodes for a propeptide comprising SEQ ID No. 8.

De manera muy especialmente preferente, las células recombinantes de Tetrahymena secretan la proteína humana recombinante. En una forma de realización preferida, en el caso de la proteína expresada y secretada de esta manera se trata de albúmina de suero humano, en particular del producto de expresión del gen con el número de registro de GenBank: 8392890 o una variante del mismo. Very particularly preferably, recombinant Tetrahymena cells secrete the recombinant human protein. In a preferred embodiment, in the case of the protein expressed and secreted in this way it is human serum albumin, in particular the gene expression product with the GenBank registration number: 8392890 or a variant thereof.

25 Una forma de realización adicional de la presente invención se refiere a una glicoproteína humana recombinante, caracterizada por que presenta un patrón de glicosilación típico para Tetrahymena con la estructura fundamental GlcNAc2.Man2-5 y que se expresó por una célula de Tetrahymena. A further embodiment of the present invention relates to a recombinant human glycoprotein, characterized in that it has a typical glycosylation pattern for Tetrahymena with the fundamental structure GlcNAc2.Man2-5 and which was expressed by a Tetrahymena cell.

Un vector de expresión para la expresión de proteínas humanas en Tetrahymena, que comprende una secuencia líder humana, constituye una divulgación adicional. An expression vector for the expression of human proteins in Tetrahymena, which comprises a human leader sequence, constitutes an additional disclosure.

Por un vector de expresión se entiende de acuerdo con la invención una molécula de ácido nucleico, tal como ADN o ARN, circular o lineal, por ejemplo un plásmido, un cósmido o un cromosoma artificial, que permite introducir un gen recombinante en una célula huésped y expresar el gen en la célula. El vector puede encontrarse de manera An expression vector is understood in accordance with the invention as a nucleic acid molecule, such as DNA or RNA, circular or linear, for example a plasmid, a cosmid or an artificial chromosome, which allows a recombinant gene to be introduced into a host cell and express the gene in the cell. The vector can be found so

35 episómica en la célula, es decir, puede ser autorreplicante o integrarse en el genoma de la célula huésped. La integración puede tener lugar fortuitamente o también mediante recombinación homóloga. Aparte del gen que va a expresarse recombinante, un vector de expresión de este tipo de acuerdo con la invención puede comprender otras secuencias útiles para el objetivo, tales como sitios de clonación múltiple, secuencias de replicación autónoma, genes marcadores para el huésped como también todas las secuencias necesarias para permitir la replicación en E. coli con fines de clonación, tal como un marcador específico de ori, E. coli, etc. Episomics in the cell, that is, it can be self-replicating or integrated into the genome of the host cell. Integration can take place by chance or also by homologous recombination. Apart from the gene to be expressed recombinantly, such an expression vector according to the invention may comprise other sequences useful for the purpose, such as multiple cloning sites, autonomous replication sequences, host marker genes as well as all the sequences necessary to allow replication in E. coli for cloning purposes, such as a specific marker of ori, E. coli, etc.

En el presente trabajo se describe por primera vez la expresión satisfactoria de una proteína humana en Tetrahymena. In the present work the satisfactory expression of a human protein in Tetrahymena is described for the first time.

45 Descripción de las figuras: 45 Description of the figures:

Figura 1: glicosilación de proteína N-unida Figure 1: N-linked protein glycosylation

Tipo rico en manosa: con 5-9 restos manosa y 2 restos GlcNAc Mannose-rich type: with 5-9 mannose residues and 2 GlcNAc residues

Estructura fundamental simple: con 2-5 restos manosa y 2 restos GlcNAc Simple fundamental structure: with 2-5 mannose residues and 2 GlcNAc residues

Tipo complejo: con restos galactosa, fucosa y ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) Complex type: with galactose, fucose and sialic acid residues (N-acetylneuraminic acid)

55 N-glicanos de levadura se componen exclusivamente del tipo rico en manosa con 8-50 restos manosa. El tipo vegetalmente complejo no presenta ningún ácido siálico, pero puede tener restos xilosa (potencial alergénico). Figura 2: expresión de HSA en Tetrahymena 55 Yeast N-glycans are composed exclusively of the mannose-rich type with 8-50 mannose moieties. The vegetable complex type does not have any sialic acid, but may have xylose residues (allergenic potential). Figure 2: HSA expression in Tetrahymena

Carril 1 y 2: fracción de medio de Tetrahymena, transformado con pBHSA tras 24 y tras 48 h, carril K: HSA natural como control. SDS-PAGE, teñido con azul de Coomassie e inmunotransfererncia de tipo Western con anticuerpos anti-HSA y anticuerpo secundario (acoplado con fosfatasa alcalina) Lane 1 and 2: Tetrahymena medium fraction, transformed with pBHSA after 24 and after 48 h, lane K: natural HSA as control. SDS-PAGE, stained with Coomassie blue and Western blot with anti-HSA antibodies and secondary antibody (coupled with alkaline phosphatase)

Examples:

65 Los siguientes Ejemplos sirven para explicar la invención sin limitar la invención a estos Ejemplos Ejemplo 1: Organismos y condiciones de cultivo The following Examples serve to explain the invention without limiting the invention to these Examples Example 1: Organisms and culture conditions

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Tetrahymena thermophila (cepas B1868 VII, B2086 II, B*VI, CU428, CU427, CU522, proporcionadas por J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, EE.UU.) se cultivaron en medio SPP modificado (proteosepeptona al 2 %, Tetrahymena thermophila (strains B1868 VII, B2086 II, B * VI, CU428, CU427, CU522, provided by J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, USA) were grown in modified SPP medium (2% proteosepeptone ,

5 extracto de levadura al 0,1 %, glucosa al 0,2 %, Fe-EDTA al 0,003 % (Gaertig et al. (1994) PNAS 91:4549-4553)) o medio de leche desnatada (leche desnatada en polvo al 2 %, extracto de levadura al 0,5 %, glucosa al 1 %, Fe-EDTA al 0,003 %) o medio MYG (leche desnatada en polvo al 2 %, extracto de levadura al 0,1 %, glucosa al 0,2 %, Fe-EDTA al 0,003 %) con adición de solución de antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 0,25 µg/ml de anfotericina B (medio SPPA)) a 30 °C en 50 ml de volumen en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con agitaciones (150 rpm). 5 0.1% yeast extract, 0.2% glucose, 0.003% Fe-EDTA (Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553)) or skim milk medium (skimmed milk powder 2%, 0.5% yeast extract, 1% glucose, 0.003% Fe-EDTA) or MYG medium (2% skim milk powder, 0.1% yeast extract, 0.2 glucose %, 0.003% Fe-EDTA) with the addition of antibiotic solution (100 U / ml penicillin, 100 µg / ml streptomycin and 0.25 µg / ml amphotericin B (SPPA medium)) at 30 ° C in 50 ml volume in a 250 ml Erlenmeyer flask with shaking (150 rpm).

Los plásmidos y fagos se multiplicaron y seleccionaron en E. coli XL1-Blue, MRF’, TOP10F’ o JM109 (Stratagene, Invitrogen, GibcoBRL Life Technologies). El cultivo de las bacterias tuvo lugar en condiciones convencionales en medio LB o NZY, con antibióticos en concentraciones convencionales (Sambrook et al. (1989) MolecularCloning: A Plasmids and phage were multiplied and selected in E. coli XL1-Blue, MRF ’, TOP10F’ or JM109 (Stratagene, Invitrogen, GibcoBRL Life Technologies). The culture of the bacteria took place under conventional conditions in LB or NZY medium, with antibiotics in conventional concentrations (Sambrook et al. (1989) MolecularCloning: A

15 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, Nueva York). 15 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York).

Ejemplo 2: Producción del constructo de expresión pBHSA Example 2: Production of the pBHSA expression construct

El vector pBICH3 (Gaertig et al. 1999 Nature Biotech. 17: 462-465, documento WO 00/46381 A1) contiene la secuencia codificante de la proteína de I-antígeno (G1) de Ichthyophthinius flanqueada por las secuencias reguladoras, no codificantes, del gen BTU1 de Tetrahymena thermophila. Un plásmido modificado (pBICH3-Nsi) con un sitio de corte Nsi I en el inicio (proporcionado por J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, EE.UU.) se usó para producir el constructo de expresión pBHSA de albúmina de suero humana (HSA, número de registro de GenBank: 8392890). Para ello se introdujeron por medio de PCR los sitios de corte Nsi I y Bam HI en el inicio y la The vector pBICH3 (Gaertig et al. 1999 Nature Biotech. 17: 462-465, WO 00/46381 A1) contains the coding sequence of the Ichthyophthinius I-antigen (G1) protein flanked by the non-coding regulatory sequences, of the BTU1 gene of Tetrahymena thermophila. A modified plasmid (pBICH3-Nsi) with an Nsi I cut-off site at the beginning (provided by J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, USA) was used to produce the albumin pBHSA expression construct of human serum (HSA, GenBank registration number: 8392890). For this, the Nsi I and Bam HI cutting sites were introduced by PCR at the beginning and the

25 parada de la secuencia de HSA codificante. Para la PCR se empleó un plásmido aislado (ATCC 323324), que contiene las secuencias de ADNc completas de HSA como molde. Los cebadores 25 stop of the coding HSA sequence. An isolated plasmid (ATCC 323324) was used for the PCR, which contains the complete HSA cDNA sequences as a template. The primers

HSA-Nsi-1 5’ GGCACAATGCATTGGGTAACCTTTATTAGC-3’ (SEQ ID No. 1) y HSA-Nsi-1 5 ’GGCACAATGCATTGGGTAACCTTTATTAGC-3’ (SEQ ID No. 1) and

HSA-Bam-R 5’-AAATGGGATCCTCATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’ (SEQ ID No. 2) HSA-Bam-R 5’-AAATGGGATCCTCATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3 ’(SEQ ID No. 2)

generaron un producto de PCR que contenía la secuencia codificante completa del HSA, flanqueada por los sitios de corte Nsi I y Bam HI. El producto de PCR y el plásmido pBICH3-Nsi se cortaron con las enzimas de restricción Nsi I y Bam HI, se purificaron sobre un gel de agarosa y se ligaron. El constructo de expresión así generado pBHSA generated a PCR product that contained the complete coding sequence of the HSA, flanked by the Nsi I and Bam HI cutting sites. The PCR product and plasmid pBICH3-Nsi were cut with restriction enzymes Nsi I and Bam HI, purified on an agarose gel and ligated. The expression construct thus generated pBHSA

35 contenía la secuencia codificante de HSA completa insertada en el marco de lectura correcto en las secuencias reguladoras del gen BTU1. Para la transformación de Tetrahymena se linealizó este constructo mediante una digestión con las enzimas de restricción Sac II y Xho I. 35 contained the complete HSA coding sequence inserted into the correct reading frame in the regulatory sequences of the BTU1 gene. For the transformation of Tetrahymena this construct was linearized by means of a digestion with the restriction enzymes Sac II and Xho I.

En el caso de una transformación satisfactoria, mediante recombinación homóloga se sustituyó el gen BTU1 por este constructo, mediante lo cual se facilitó una resistencia de las células frente a Paclitaxel. In the case of a satisfactory transformation, by means of homologous recombination the BTU1 gene was replaced by this construct, whereby a resistance of the cells against Paclitaxel was facilitated.

Ejemplo 3: Transformación del macronúcleo de Tetrahymena con pBHSA Example 3: Transformation of the Tetrahymena macronucleus with pBHSA

Para una transformación se emplearon 5 x 106 células de Tetrahymena thermophila (CU522). El cultivo de las For a transformation 5 x 106 cells of Tetrahymena thermophila (CU522) were used. The cultivation of

45 células tuvo lugar en 50 ml de medio SPPA a 30 °C en un matraz Erlenmeyer de 250 ml sobre un agitador a 150 RPM hasta una densidad celular de aproximadamente 3-5 x 105 células/ml. Las células se sedimentaron mediante centrifugación (1200 g) durante 5 min y el sedimento celular se resuspendió en 50 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y se centrifugó tal como anteriormente. Esta etapa de lavado se repitió y las células se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5, más antibióticos) a una densidad celular de 3 x 105 células/ml, se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se incubó durante 16-20 h sin agitación a 30 °C (fase de ayuno). Después de la fase de ayuno se determinó de nuevo el número de células, se centrifugó como anteriormente y se ajustaron las células con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) a una concentración de 5 x 106 células/ml. Un ml de la suspensión celular se usó para la transformación. La transformación tuvo lugar por medio de bombardeo con micropartículas (véase a continuación). Para la regeneración se llevaron las células a medio SSPA y se incubaron a 30 °C sin agitación en el matraz Erlenmeyer. Después de 3 h 45 cells took place in 50 ml of SPPA medium at 30 ° C in a 250 ml Erlenmeyer flask on a 150 RPM shaker until a cell density of approximately 3-5 x 105 cells / ml. The cells were pelleted by centrifugation (1200 g) for 5 min and the cell pellet was resuspended in 50 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and centrifuged as before. This washing step was repeated and the cells were resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5, plus antibiotics) at a cell density of 3 x 105 cells / ml, transferred to a 250 ml Erlenmeyer flask and incubated for 16-20 h without stirring at 30 ° C (fasting phase). After the fasting phase the number of cells was determined again, centrifuged as before and the cells were adjusted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) at a concentration of 5 x 10 6 cells / ml. One ml of the cell suspension was used for transformation. The transformation took place by means of bombardment with microparticles (see below). For regeneration the cells were taken to SSPA medium and incubated at 30 ° C without shaking in the Erlenmeyer flask. After 3 h

55 se añadió Paclitaxel® en una concentración final de 20 µM y las células se transfirieron en alícuotas de 100 µl sobre placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células se incubaron en una cada húmeda, oscurecida a 30 °C. Después de 2-3 días pudieron identificarse clones resistentes a Paclitaxel. Los clones positivos se sobreinocularon en medio reciente con Paclitaxel 25 µM. Mediante el cultivo de las células a una concentración creciente de Paclitaxel (hasta 80 µM) se alcanzó una “phenotypic assortment” completa (Gaertig & Kapler (1999)). Paclitaxel® was added in a final concentration of 20 µM and the cells were transferred in 100 µl aliquots on 96-well microtiter plates. The cells were incubated in a wet one, darkened at 30 ° C. After 2-3 days, clones resistant to Paclitaxel could be identified. Positive clones were superinoculated in fresh media with 25 µM Paclitaxel. By culturing the cells at an increasing concentration of Paclitaxel (up to 80 µM) a complete "phenotypic assortment" was achieved (Gaertig & Kapler (1999)).

Para el análisis de los clones se cultivaron aproximadamente 4 ml de cultivos en SPPA con Paclitaxel, se aisló el ADN (Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91:4549-4553) y se amplificó por PCR el ADN integrado en el locus de BTU1. Como cebadores sirvieron los cebadores específicos de BTU1 BTU1-5’F (AAAAATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC SEQ ID No. 3), aproximadamente 50 pb antes del codón de inicio y 65 BTU1-3’R (GTTTAGCTGACCGATTCAGTTC (SEQ ID No. 4), 3 pb detrás del codón de parada. Los productos de PCR se analizaron sin cortar y cortados con Hind III, Sac I o Pst I sobre un gel de agarosa al 1 %. La “phenotypic For the analysis of the clones, approximately 4 ml of cultures were grown in SPPA with Paclitaxel, the DNA was isolated (Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553) and the DNA integrated in the locus of locus was amplified by PCR BTU1. As primers were the specific BTU1 BTU1-5'F primers (AAAAATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC SEQ ID No. 3), approximately 50 bp before the start codon and 65 BTU1-3'R (GTTTAGCTGACCGATTCAGTTC (SEQ ID No. 4), 3 bp behind of the stop codon PCR products were analyzed uncut and cut with Hind III, Sac I or Pst I on a 1% agarose gel.

assortment” completa se examinó a través de RT-PCR con los cebadores específicos de BTU1 (Gaertig & Kapler (1999)). Complete assortment ”was examined through RT-PCR with specific BTU1 primers (Gaertig & Kapler (1999)).

Ejemplo 4: Transformación biolística (bombardeo con micropartículas) Example 4: Biolistic transformation (bombardment with microparticles)

5 La transformación de Tetrahymena thermophila tuvo lugar por medio de transformación biolística, tal como se describe en Bruns & Cassidy-Hanley (Methods in Cell Biology, Volumen 62 (1999) 501-512); Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465) o Cassidy-Hanley et al. ((1997) Genetics 146:135-147). La manipulación del sistema de suministro de partículas de he Biolistic® PDS-1000 (BIO-RAD) está detallado en el manual correspondiente. 5 The transformation of Tetrahymena thermophila took place through biolistic transformation, as described in Bruns & Cassidy-Hanley (Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465) or Cassidy-Hanley et al. ((1997) Genetics 146: 135-147). The handling of the Biolistic® PDS-1000 (BIO-RAD) particle delivery system is detailed in the corresponding manual.

10 Para la transformación se cargan partículas de oro de 6 mg (0,6 mu m; BIO-RAD) con 10 µg de ADN de plásmido linealizado (Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell Biology, Volumen 62: 501-512). 10 For the transformation, 6 mg gold particles (0.6 µm; BIO-RAD) are loaded with 10 µg of linearized plasmid DNA (Sanford et al. (1991) Biotechniques 3: 3-16; Bruns & Cassidy- Hanley (1999) Methods in Cell Biology, Volume 62: 501-512).

15 Preparación de las partículas de oro: 60 mg de partículas de oro de 0,6 µm (Biorad) se resuspendieron en 1 ml de etanol. Para ello se mezclaron vigorosamente las partículas 3 veces durante, en cada caso, 1-2 min en vórtex. A continuación se centrifugaron las partículas durante 1 min (10000 g) y se extrajo el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta. Las partículas de oro se resuspendieron en 1 ml de agua estéril y se centrifugaron tal como anteriormente. Esta etapa de lavado se repitió una vez, se resuspendió la partícula en 1 ml de glicerol al 50 % y se 15 Preparation of gold particles: 60 mg of 0.6 µm gold particles (Biorad) were resuspended in 1 ml of ethanol. To do this, the particles were vigorously mixed 3 times during, in each case, 1-2 min in vortex. The particles were then centrifuged for 1 min (10,000 g) and the supernatant was carefully extracted with a pipette. The gold particles were resuspended in 1 ml of sterile water and centrifuged as before. This washing step was repeated once, the particle was resuspended in 1 ml of 50% glycerol and was

20 almacenó en alícuotas en 100 µl a -20 °C. 20 stored in aliquots in 100 µl at -20 ° C.

Preparación de la transformación: Los soportes de macroportadores, macroportadores y pantallas de retención se almacenaron durante varias horas en 100 % de etanol, los discos de ruptura en isopropanol. Un macroportador se colocó a continuación en el soporte de macroportador y se secó al aire. Preparation of the transformation: The supports of macrocarriers, macrocarriers and retention screens were stored for several hours in 100% ethanol, the rupture discs in isopropanol. A macrocarrier was then placed in the macrocarrier holder and air dried.

25 Carga de las partículas de oro con ADN: Todos los trabajos tuvieron lugar a 4 °C. Partículas de oro, vector preparado, CaCl2 2,5 M, Spermidine1 M, etanol al 70 % y 100 % se enfriaron sobre hielo. Se añadieron 10 mu 1 del ADN de vector linealizado (1 µg/ml) a 100 µl de partículas de oro preparadas y agitaron cuidadosamente con vórtex durante 10 s. A continuación se añadieron primero 100 µl de CaCl2 2,5 M, se agitó con vórtex durante 10 s y 25 Loading of gold particles with DNA: All work took place at 4 ° C. Gold particles, prepared vector, 2.5 M CaCl2, Spermidine1 M, 70% ethanol and 100% cooled on ice. 10 mu 1 of the linearized vector DNA (1 µg / ml) was added to 100 µl of prepared gold particles and vortexed carefully for 10 s. Then 100 µl of 2.5 M CaCl2 was first added, vortexed for 10 s and

30 entonces se añadieron 40 µl de Spermidine 1 M y se agitó con vórtex cuidadosamente durante 10 min. Tras la adición de 200 mu 1 de etanol al 70 % se agitaron con vórtex las partículas durante 1 min y entonces se centrifugaron 1 min a 10000 g. El sedimento se resuspendió en 20 µl de etanol al 100 %, se centrifugó y entonces se resuspendió en 35 µl de etanol al 100 %. 30 then 40 µl of 1 M Spermidine was added and vortexed carefully for 10 min. After the addition of 200 mu 1 of 70% ethanol, the particles were vortexed for 1 min and then centrifuged 1 min at 10,000 g. The pellet was resuspended in 20 µl of 100% ethanol, centrifuged and then resuspended in 35 µl of 100% ethanol.

35 Las partículas así preparadas se añadieron cuidadosamente con una pipeta sobre el centro de un microportador. El microportador se colocó a continuación hasta la transformación en una caja con gel de sílice higroscópico. The particles thus prepared were carefully added with a pipette over the center of a microcarrier. The microcarrier was then placed until transformation into a box with hygroscopic silica gel.

Transformación: un ml de las células preparadas (véase anteriormente) se añadió en el centro de un filtro redondo humedecido con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en una placa Petri y se introdujo en la tira de inserción inferior de la Transformation: one ml of the prepared cells (see above) was added in the center of a round filter moistened with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) in a Petri dish and introduced into the lower insertion strip of the

40 cámara de transformación del sistema de suministro de partículas de He Biolistic® PDS-1000. La transformación tuvo lugar con las partículas de oro preparadas a una presión de 900 psi (dos discos de ruptura de 450 psi) y un vacío de 27 pulgadas de Hg en la cámara de transformación. A continuación se transfirieron las células de inmediato a un matraz Erlenmeyer con 50 ml de medio SPPA y se incubaron a 30 °C sin agitación. 40 He Biolistic® PDS-1000 particle supply system transformation chamber. The transformation took place with the gold particles prepared at a pressure of 900 psi (two rupture discs of 450 psi) and a vacuum of 27 inches of Hg in the transformation chamber. The cells were then transferred immediately to an Erlenmeyer flask with 50 ml of SPPA medium and incubated at 30 ° C without shaking.

45 Ejemplo 5: Expresión de HSA en Tetrahymena 45 Example 5: Expression of HSA in Tetrahymena

De transformantes positivos y como controles de células de tipo natural de Tetrahymena no transformadas se cultivaron cultivos en matraces Erlenmeyer en 20 ml de medio de leche desnatada con la adición de inhibidor de proteasa (Complete, EDTA-free Protease-Inhibitors-Cocktail Comprimidos, Roche Diagnostics GmbH). Después de From positive transformants and as controls of non-transformed Tetrahymena wild-type cells, cultures were grown in Erlenmeyer flasks in 20 ml of skimmed milk medium with the addition of protease inhibitor (Complete, EDTA-free Protease-Inhibitors-Cocktail Tablets, Roche Diagnostics GmbH). After

50 24 h y 48 h (a una densidad celular de aproximadamente 1 x 106 células/ml) se separaron por centrifugación las células y el sobrenadante se mezcló con 1/10 volumen de TCA helado y se incubó 30 min sobre hielo y a continuación se centrifugó durante 30 min a 4 °C a rpm máx. El sedimento se lavó con 300 µl de acetona helada y se centrifugó durante 5 min a 4 °C a rpm máx. El sobrenadante se retiró, se secó el sedimento (vacío), se resuspendió en 150 µl de tampón de muestra y se incubó durante 10 min a 95 °C. Las proteínas así obtenidas de la fracción de 50 24 h and 48 h (at a cell density of approximately 1 x 106 cells / ml) the cells were centrifuged and the supernatant was mixed with 1/10 volume of ice cold TCA and incubated 30 min on ice and then centrifuged for 30 min at 4 ° C at rpm max. The sediment was washed with 300 µl of frozen acetone and centrifuged for 5 min at 4 ° C at max. The supernatant was removed, the sediment was dried (vacuum), resuspended in 150 µl of sample buffer and incubated for 10 min at 95 ° C. The proteins thus obtained from the fraction of

55 medio, de proteínas secretadas por Tetrahymena al medio, se separaron por medio de SDS-PAGE según métodos convencionales y se detectó HSA con un anticuerpo específico de HSA (Sigma) en la inmunotransferencia de tipo Western (véase la figura 2). Como control positivo se usó HSA natural (Sigma). The medium, from proteins secreted by Tetrahymena to the medium, was separated by SDS-PAGE according to conventional methods and HSA was detected with an HSA-specific antibody (Sigma) in Western blotting (see Figure 2). As a positive control, natural HSA (Sigma) was used.

<110> Celanese ventures GmbH 60 <110> Celanese ventures GmbH 60

<120> Expresión de proteínas recombinantes en Tetrahymena <120> Expression of recombinant proteins in Tetrahymena

<130> ax01006de1 <130> ax01006de1

65 <160> 8 <210> 7 65 <160> 8 <210> 7

imagen7image7

<170> PatentIn versión 3.1 <170> PatentIn version 3.1

5 5: <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 1 ggcacaatgc attgggtaac ctttattagc <400> 1 ggcacaatgc attgggtaac ctttattagc: 30 30

15 fifteen: <210> 2 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <400> 2 aaatgggatc ctcataagcc taaggcagct tgac 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 aaatgggatc ctcataagcc taaggcagct tgac 3. 4

<210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence

25 25: <400> 3 aaaaataaaa aagtttgaaa aaaaaccttc 30 <400> 3 aaaaataaaa aagtttgaaa aaaaaccttc 30

<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence

<400> 4 gtttagctga ccgattcagt tc <400> 4 gtttagctga ccgattcagt tc: 22 22

35 35: <210>5 <211> 54 <212> ADN <213> Homo sapiens <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 5 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcc <400> 5 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcc: 54 54

45 Four. Five: <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6 <400> 6

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<211> 18 <211> 18

<212> ADN <212> DNA

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<400> 7 aggggtgtgt ttcgtcga 18 <400> 7 aggggtgtgt ttcgtcga 18

<210> 8 <210> 8

<211> 6 <211> 6

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<212> PRT <212> PRT

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<400> 8 <400> 8

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Claims

image 1

1. Procedure for the production of recombinant human glycoproteins in Tetrahymena, comprising the steps:

5 a) transformation of Tetrahymena cells with recombinant DNA, which comprises at least one functional gene encoding a human glycoprotein, b) culture of Tetrahymena recombinant cells and gene expression, and c) isolation of glycoproteins.

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2. Method for the production of recombinant human glycoproteins according to claim 1, wherein the Tetrahymena cells secrete the glycoprotein.

3. Method for the production of recombinant human glycoproteins according to claim 1, wherein the Tetrahymena cells express the glycoprotein on its surface.

4. Process for the production of recombinant human glycoproteins according to claim 2, wherein the isolation of the glycoproteins takes place from the culture supernatant.

Method for the production of recombinant human glycoproteins according to one of the preceding claims, wherein the gene encoding a human glycoprotein comprises a human leader sequence.

6. Method for the production of recombinant human glycoproteins according to claim 5, wherein the human leader sequence leads to secretion of the glycoprotein expressed by Tetrahymena.

7. Recombinant human glycoprotein, characterized in that it has a glycosylation pattern with the fundamental structure GlcNAc2-Man2-5 and had been expressed by a Tetrahymena cell.

30 8. Use of a recombinant human glycoprotein for the production of a drug, characterized in that the glycoprotein has been expressed in Tetrahymena cells and has been isolated therefrom.

eleven