ES2623602T3 - Entidades biológicamente activas inmovilizadas que tienen un alto grado de actividad biológica después de manipulación mecánica o esterilización - Google Patents

Entidades biológicamente activas inmovilizadas que tienen un alto grado de actividad biológica después de manipulación mecánica o esterilización Download PDF

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Abstract

Un dispositivo médico que comprende: un material de sustrato; un material de recubrimiento polimérico unido a al menos una porción de una superficie de dicho material de sustrato, una pluralidad de entidades biológicamente activas que tienen actividad de unión a la antitrombina III unidas covalentemente a al menos una porción de dicho material de recubrimiento polimérico, siendo dichas entidades biológicamente activas oligosacáridos o polisacáridos; y una composición orgánica biológicamente compatible que es un polisacárido combinado de manera no covalente con dicho material de recubrimiento polimérico, siendo dicho polisacárido un glucosaminoglucano, dextrano o sulfato de dextrano, en donde dichas entidades biológicamente activas tienen una actividad de unión a la anti-trombina III de al menos 5 picomoles de anti-trombina III por centímetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, después de la esterilización o compactación y expansión de dicho material de sustrato.

Description

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DESCRIPCION
Entidades biologicamente activas inmovilizadas que tienen un alto grado de actividad biologica despues de manipulacion mecanica o esterilizacion
Campo de la invencion
La presente invencion se dirige a materiales de sustrato que tienen entidades biologicamente activas inmovilizadas que mantienen su actividad biologica despues de exposicion a condiciones de calor elevado, alta humedad, agentes antibioticos, y/o tensiones mecanicas. La presente invencion es particularmente util en el campo de los dispositivos medicos.
Antecedentes de la invencion
En el campo de los dispositivos medicos, los materiales de vidrio, polimericos, y/o metalicos son materiales comunes para sustratos. Estos materiales se pueden utilizar para dispositivos de diagnostico o dispositivos extracorporeos. Con la excepcion del vidrio, muchos de los materiales se pueden utilizar para dispositivos implantables.
La inmovilizacion de entidades biologicamente activas sobre materiales de sustrato en una forma biologicamente activa implica una apreciacion de las respectivas propiedades qmmicas de la entidad y del material de sustrato. La modificacion de la composicion qmmica de un material de sustrato es necesaria a menudo para inmovilizar una entidad biologicamente activa sobre el mismo. Esto se consigue normalmente mediante el tratamiento de las superficies del material de sustrato para generar una poblacion de elementos o grupos qmmicamente reactivos, seguido por la inmovilizacion de la entidad biologicamente activa con un protocolo apropiado. Con otros materiales de sustrato, las superficies de un material de sustrato se revisten, o recubren, con un material que tiene grupos qmmicos reactivos incorporados. Las entidades biologicamente activas se inmovilizan entonces sobre el material de sustrato a traves de los grupos qmmicos reactivos del material de recubrimiento. Se han descrito una variedad de esquemas para revestir, o recubrir, materiales de sustrato. Ejemplos representativos de entidades biologicamente activas inmovilizadas sobre un material de sustrato con un material de revestimiento, o recubrimiento, se describen en las patentes de Estados Unidos Numeros: 4.810.784; 5.213.898; 5.897.955; 5.914.182; 5.916.585; y 6.461.665.
Cuando se inmovilizan compuestos, composiciones, o entidades biologicamente activas, la actividad biologica de estos “productos biologicos” se puede ver afectada negativamente por el procedimiento de inmovilizacion. La actividad biologica de muchos de los productos biologicos es dependiente de la conformacion (esto es, primaria, secundaria, terciaria, etc.) del producto biologico en su estado inmovilizado. Ademas de un procedimiento de inmovilizacion cuidadosamente seleccionado, pueden ser necesarias alteraciones qmmicas del producto biologico para que el producto biologico sea incorporado en el material de recubrimiento con una conformacion que haga que el producto biologico sea suficientemente activo para realizar su funcion prevista.
A pesar de un esquema optimizado de recubrimiento e inmovilizacion, el procesamiento adicional, tal como la esterilizacion, puede degradar la actividad biologica del producto biologico inmovilizado. Para los dispositivos medicos implantables, es necesaria la esterilizacion antes de su uso. La esterilizacion tambien puede ser necesaria para los dispositivos de diagnostico in vitro que son sensibles a los contaminantes. La esterilizacion de tales dispositivos normalmente requiere la exposicion de los dispositivos a temperatura, presion y humedad elevadas, a menudo durante varios ciclos. En algunos casos, se incluyen agentes antibioticos, tales como oxido de etileno gas (ETO) o vapor de peroxido de hidrogeno en el procedimiento de esterilizacion. Ademas de la esterilizacion, la compactacion y la expansion mecanicas, o el almacenamiento a largo plazo de un producto biologico inmovilizado, pueden degradar la actividad del producto biologico.
El documento EP1559434A1 (Ethicon, Inc.) describe un metodo de una sola etapa para la modificacion de la superficie, el injerto y la esterilizacion de los recubrimientos bio-activos sobre los materiales y biomateriales utilizados en dispositivos medicos, incluidos los stents recubiertos de heparina-
El documento EP09239953A2 (Schneider Inc. (USA)) describe un recubrimiento en capas relativamente finas de material elastomerico bioestable que contiene una cantidad de material biologicamente activo dispersada en el mismo en combinacion con una superficie no trombogenica que se dice que es util para recubrir las superficies de protesis tales como los stents desplegables
El documento WO98/08552 (Medtronic Inc.) describe un metodo de fabricacion de un dispositivo medico que tiene heparina inmovilizada sobre una superficie de contacto con la sangre en la que la superficie heparinizada unida covalentemente esta provista de una protema adsorbida que puede ser activada por la heparina inmovilizada para bloquear la coagulacion del fibrinogeno.
Harchammer et. al., (Circulation, 1996, Vol. 93, N° 3, pp 423-430) describe un estudio en el que el recubrimiento de stents metalicos con heparina redujo los accidentes tromboticos asociados con su utilizacion en arterias coronarias normales de cerdos.
Lin et. al., (Laboratory Investigations, May 2003, Vol. 14, N° 5, pp 603-611) examino el efecto de la colocacion de un
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stent iliaco expandible por balon recubierto con heparina, sobre la hiperplasia de la mtima en un modelo de babuino.
Existe una necesidad de dispositivos medicos que tengan entidades biologicamente activas inmovilizadas sobre los mismos que puedan ser sometidos a esterilizacion, compactacion y expansion mecanicas, y/o almacenamiento sin perdida significativa de actividad biologica. Un dispositivo medico de este tipo debe tener composiciones o compuestos biologicamente compatibles incluidos con las entidades biologicas inmovilizadas que sirven para minimizar la degradacion de la actividad biologica de las entidades durante la esterilizacion, la compactacion y la expansion mecanicas, y/o el almacenamiento. En algunos casos, las composiciones o compuestos biologicamente compatibles adicionales pueden aumentar la actividad biologica de algunas entidades biologicamente activas despues de un procedimiento de esterilizacion.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a dispositivos medicos que tienen materiales de sustrato con entidades biologicamente activas inmovilizadas sobre ellos, en combinacion con composiciones qmmicas organicas biologicamente compatibles adicionales que hacen posible que las entidades biologicamente activas mantengan una actividad biologica importante despues de la exposicion de las entidades inmovilizadas a las condiciones de procesado y almacenamiento que de otra manera pueden degradar la actividad biologica de las entidades.
Un material de sustrato adecuado puede ser cualquier material con una superficie que tiene grupos qmmicos reactivos que son capaces de unir, confinar, o inmovilizar de otro modo una entidad biologicamente activa en una forma biologicamente activa sobre una o mas superficies del material de sustrato. Los materiales de sustrato pueden tener tambien una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos anadidos a las superficies de los materiales a traves de la aplicacion de una o mas composiciones o materiales de recubrimiento, a las superficies. Al menos una porcion de un material de recubrimiento tiene elementos, grupos, compuestos o componentes qmmicos que son reactivos para las entidades biologicamente activas y sirven para unir, confinar, o inmovilizar de otro modo una entidad biologicamente activa en una forma biologicamente activa sobre el material de recubrimiento. En algunas realizaciones, la entidad biologicamente activa puede ser inmovilizada de manera reversible.
Al menos un tipo de entidad biologicamente activa que es un oligosacarido o polisacarido se une qmmicamente, se confina, o se inmoviliza de otro modo, con grupos qmmicos reactivos adecuados sobre el material de sustrato y/o el material de recubrimiento. Despues de la inmovilizacion de una pluralidad de dichas entidades biologicamente activas con al menos una porcion de una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos presentes sobre un material de sustrato y/o material de recubrimiento, una composicion organica biologicamente compatible adicional que es un polisacarido que es un glucosaminoglucano, dextrano o sulfato de dextrano, se combina de manera no covalente con las entidades biologicamente activas, el sustrato, y/o el material de recubrimiento polimerico. La composicion organica biologicamente compatible interactua con las entidades biologicamente activas y los grupos qmmicos reactivos del material de sustrato y/o material de recubrimiento para evitar que las entidades biologicamente activas pierdan la actividad biologica en condiciones que de otro modo podnan degradar significativamente la actividad biologica de las entidades. Estas condiciones incluyen la esterilizacion y el almacenamiento. Con los dispositivos medicos endoluminales expandibles, por ejemplo, la compactacion y la expansion mecanicas de tales dispositivos tambien pueden degradar significativamente la actividad biologica de las entidades.
En algunos casos, la composicion organica biologicamente compatible adicional parece mantener la actividad biologica de las entidades durante la esterilizacion, almacenamiento y/o manipulacion mecanica, al limitar las alteraciones indeseables de las entidades frecuentemente inducidas por la esterilizacion, almacenamiento, y/o proceso de manipulacion mecanica. Las alteraciones que disminuyen la actividad pueden incluir cambios conformacionales de una entidad biologicamente activa que ocultan un sitio activo de la entidad. Las alteraciones que disminuyen la actividad, tambien pueden incluir interacciones entre entidades biologicamente activas vecinas. Los reordenamientos de entidades biologicamente activas con respecto a un material de recubrimiento polimerico son otras alteraciones posibles que disminuyen la actividad de las entidades. La simple desnaturalizacion, u otra degradacion, de las entidades biologicamente activas puede ser otro medio por el cual las entidades pierden actividad biologica. Como se describe en mayor detalle en la presente memoria, las entidades biologicamente activas inmovilizadas esterilizadas, almacenadas, y/o manipuladas mecanicamente en presencia de la composicion organica biologicamente compatible adicional pueden mantener un grado de actividad biologica significativamente mayor que una entidad biologicamente activa inmovilizada similar procesada en las mismas condiciones en ausencia de la composicion organica biologicamente compatible adicional.
La composicion organica biologicamente compatible adicional puede ser eliminada de un dispositivo medico esterilizado durante el procesamiento posterior a la esterilizacion o la composicion puede ser eliminada por los procesos fisiologicos del receptor de un implante despues de la utilizacion del dispositivo medico esterilizado en un sitio de implantacion.
Las entidades biologicamente activas preferidas que son oligosacaridos o polisacaridos reducen o inhiben la formacion de trombos en las superficies de un sustrato y/o material de recubrimiento. Los glucosaminoglucanos son agentes antitromboticos preferidos para uso en la presente invencion, siendo particularmente preferidos la heparina, analogos de heparina y derivados. Se describen tambien sustancias biologicamente activas que reducen el
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crecimiento celular indeseable del tejido en el que se implanta la presente invencion. Los agentes anti-proliferativos incluyen, pero no se limitan a dexametasona, rapamicina, y paclitaxel.
Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un dispositivo medico que comprende un material de sustrato, un material de recubrimiento polimerico unido a al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, una pluralidad de entidades biologicamente activas que tienen actividad de union a la anti-trombina III unidas covalentemente a al menos una porcion de dicho material de recubrimiento polimerico, siendo dichas entidades biologicamente activas oligosacaridos o polisacaridos y una composicion organica biologicamente compatible que es un polisacarido, combinada con dicho material de recubrimiento polimerico, siendo dicho polisacarido un glucosaminoglucano, dextrano o sulfato de dextrano, en donde dichas entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 5 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato despues de la esterilizacion o compactacion y expansion de dicho material de sustrato. En otras realizaciones, la actividad de union a la anti-trombina es de al menos 6 picomoles de anti-trombina III por centfmetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, al menos 7 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, al menos 8 picomoles de anti-trombina III por centfmetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, al menos 9 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, o al menos 10 picomoles de anti-trombina III por centfmetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato. En algunas realizaciones, la actividad de union a la anti-trombina III es de al menos 100 pmol/cm2, picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato.
Se describe tambien un dispositivo medico que comprende un material de sustrato, un material de recubrimiento polimerico unido a al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, una primera pluralidad de moleculas de heparina que tienen actividad de union a la anti-trombina III, unidas en el punto extremo a al menos una porcion de dicho material de recubrimiento polimerico, y una composicion biologicamente compatible combinada con dicho material de recubrimiento polimerico, en donde dicha primera pluralidad de moleculas de heparina, tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 10 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
Se describe tambien un dispositivo medico esterilizado que comprende un material de sustrato polimerico, un material de recubrimiento polimerico unido a al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, una pluralidad de moleculas de heparina que tienen actividad de union a la anti-trombina III unidas en el punto extremo a al menos una porcion de dicho material de recubrimiento polimerico, y una composicion que comprende una pluralidad de moleculas de polietilenglicol combinadas con dicho material de recubrimiento polimerico, en donde dicha primera pluralidad de moleculas de heparina, tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 50 picomoles de anti-trombina III por centfmetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
Se describe tambien un dispositivo medico que comprende un material de sustrato, una pluralidad de entidades qrnmicas que tienen actividad de union a la anti-trombina III presentes sobre al menos una porcion de dicho material de sustrato, una primera composicion biologicamente compatible combinada con dicho material de sustrato, y una segunda composicion biologicamente compatible mezclada con la misma.
Una realizacion adicional de la presente invencion se refiere a un dispositivo medico que comprende un material de sustrato, un material de recubrimiento polimerico unido a al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, una pluralidad de entidades qrnmicas que tienen actividad de union a la anti-trombina III presentes sobre al menos una porcion de dicho material de recubrimiento polimerico, una primera composicion biologicamente compatible combinada con dicho material de sustrato, y una segunda composicion biologicamente compatible mezclada con la misma.
En las realizaciones que se refieren a composiciones organicas biologicamente compatibles combinadas de forma no covalente, al menos una porcion de la composicion organica o la segunda pluralidad de moleculas de heparina se libera a menudo del dispositivo medico esterilizado o manipulado mecanicamente en varias horas cuando se coloca en una solucion tampon de fosfato 0,15 M con una temperatura de aproximadamente treinta y siete grados centfgrados y un pH sustancialmente neutro. La presencia de los compuestos liberados se puede detectar en la solucion tampon con tecnicas de ensayo rutinarias.
En algunas realizaciones, la composicion organica biologicamente compatible se puede mezclar antes de la manipulacion mecanica y/o de la esterilizacion. En otras realizaciones, la composicion organica biologicamente compatible se puede mezclar despues de la manipulacion mecanica o de la esterilizacion. (esto es, en una sala de operaciones). Esto es particularmente util cuando la composicion organica se puede degradar a traves de la manipulacion mecanica o esterilizacion de un sustrato o dispositivo que utiliza la composicion. Esto permite tambien que la composicion organica sea colocada en sitios particulares sobre un sustrato o dispositivo y en dosis variables.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos sobre el mismo.
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La Figura 1A es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico.
La Figura 2 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo.
La Figura 3 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos sobre el mismo.
La Figura 3A es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos sobre el mismo.
La Figura 4 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo.
La Figura 4A es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo.
La Figura 5 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y una composicion biologicamente compatible adicional combinada con ellas.
La Figura 6 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y una composicion biologicamente compatible adicional combinada con ellas.
La Figura 6A es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y una composicion biologicamente compatible adicional combinada con ellas.
La Figura 6B es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo que muestra algo de la composicion biologicamente compatible ilustrada en la Figura 6 que ha sido liberado del material de sustrato y del material de recubrimiento polimerico.
La Figura 6C es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo que muestra algo de la composicion biologicamente compatible ilustrada en la Figura 6A que ha sido liberado del material de sustrato y del material de recubrimiento polimerico.
La Figura 7 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene tres capas de material de recubrimiento polimerico aplicadas al mismo con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y una composicion biologicamente compatible adicional combinada con ellas.
La Figura 7A es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene tres capas de material de recubrimiento polimerico aplicadas al mismo con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y una composicion biologicamente compatible adicional combinada con ellas.
La Figura 7B es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene tres capas de material de recubrimiento polimerico aplicadas al mismo con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo que muestra algo de la composicion biologicamente compatible ilustrada en la Figura 7 que ha sido liberado del material de sustrato y del material de recubrimiento polimerico.
La Figura 7C es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene tres capas de material de recubrimiento polimerico aplicadas al mismo con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo que muestra algo de la composicion biologicamente compatible ilustrada en la Figura 7A que ha sido liberado del material de sustrato y del material de recubrimiento polimerico.
La Figura 8 es un grafico de barras que ilustra como la esterilizacion de la heparina sin unir no reduce significativamente la actividad biologica de la heparina.
La Figura 9 es un grafico de barras que ilustra el efecto de una variedad de composiciones organicas biologicamente compatibles sobre la actividad biologica de la heparina unida en el punto extremo inmovilizada a grupos qmmicos reactivos sobre un material de recubrimiento polimerico durante y despues de la exposicion de la heparina inmovilizada a un regimen de esterilizacion con oxido de etileno.
La Figura 10 es un grafico de barras que ilustra la capacidad de las composiciones organicas biologicamente compatibles de heparina o sulfato de dextrano anadidas para dar como resultado altos niveles de actividad de union a la ATIII de la heparina inmovilizada en un material de recubrimiento polimerico sobre un sustrato durante y despues de la exposicion de la heparina inmovilizada a un regimen de esterilizacion con oxido de etileno.
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La Figura 11 es un grafico de barras que ilustra la capacidad del sulfato de dextrano anadido para mantener la actividad biologica de la heparina unida en el punto extremo inmovilizada sobre un sustrato recubierto con alcohol polivimlico durante y despues de la exposicion de la heparina inmovilizada a un regimen de esterilizacion con oxido de etileno.
La Figura 12 es un grafico de barras que ilustra la capacidad del glicerol anadido para mantener la actividad biologica de la heparina unida en el punto extremo inmovilizada sobre un material de recubrimiento polimerico de un sustrato despues de la compactacion y expansion del material de sustrato.
La Figura 13 es un grafico de barras que ilustra la capacidad del glicerol y la heparina anadidos para mantener la actividad biologica de la heparina unida en el punto extremo inmovilizada sobre un material de recubrimiento polimerico de un sustrato despues de la compactacion mecanica, la exposicion a un regimen de esterilizacion con oxido de etileno, y la expansion mecanica del material de sustrato.
La Figura 14 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y grupos qmmicos reactivos sobre el mismo.
La Figura 15 es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo y grupos qmmicos reactivos sobre el mismo.
La Figura 16 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas y una composicion biologicamente compatible adicional combinada covalentemente con el mismo.
La Figura 17 es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas y una composicion biologicamente compatible adicional combinada covalentemente con el mismo.
La Figura 18 es una representacion esquematica de realizaciones de la presente invencion que tienen una segunda composicion biologicamente compatible adicional combinada con las mismas.
La Figura 19 es una representacion esquematica de realizaciones de la presente invencion que tienen una segunda composicion biologicamente compatible combinada con las mismas.
La Figura 20 es una representacion esquematica de un material de sustrato polimerico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo, una primera composicion biologicamente compatible y una segunda composicion biologicamente compatible combinadas con ellas.
La Figura 21 es una representacion esquematica de un material de sustrato metalico que tiene un material de recubrimiento polimerico con una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas en el mismo, una primera composicion biologicamente compatible y una segunda composicion biologicamente compatible combinadas con ellas.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a materiales y dispositivos que tienen entidades biologicamente activas inmovilizadas en ellos que mantienen una actividad biologica significativa despues de las condiciones de esterilizacion, compactacion y expansion mecanicas, y/o almacenamiento que de otro modo podnan disminuir significativamente la actividad biologica de las entidades. La actividad biologica de una entidad biologica inmovilizada sometida a tales condiciones puede estar influenciada positivamente por la presencia de al menos una composicion biologicamente compatible adicional combinada de forma no covalente con las entidades biologicamente activas. La composicion adicional es un compuesto organico. En realizaciones preferidas, la composicion adicional es un glucosaminoglucano. Los glucosaminoglucanos preferidos son composiciones de heparina, analogos de heparina, y derivados de heparina.
Con referencia a las figuras 1 y 2, algunos materiales de sustrato polimerico (12) tienen multiplicidades de grupos qmmicos reactivos (16) que pueblan al menos una parte de las superficies de los materiales de sustrato a los que una pluralidad de entidades biologicamente activas (17), estan unidas, confinadas, o inmovilizadas de otra forma. La mayor parte de las entidades biologicamente activas (17) estan unidas covalentemente, o enlazadas, a los materiales de sustrato (12) a traves de los grupos qmmicos reactivos (16). Las superficies del material de sustrato polimerico (12) pueden ser lisas, rugosas, porosas, curvadas, planas, angulares, irregulares, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, los materiales de sustrato con poros en la superficie tienen espacios vacfos internos que se extienden desde la superficie porosa del material hasta el cuerpo del material. Estos materiales de sustrato poroso tienen material de sustrato interno que limita los poros que a menudo proporciona superficies susceptibles de inmovilizar entidades biologicamente activas. Ya sean porosos o no porosos, los materiales de
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sustrato pueden estar en la forma de filamentos, peftculas, laminas, tubos, mallas, tejidos, no tejidos, y combinaciones de los mismos.
Los materiales de sustrato adecuados (12) para la inmovilizacion de entidades biologicamente activas (17) incluyen materiales polimericos biocompatibles tales como polietileno, poliuretano, silicona, poftmeros que contienen poliamida y polipropileno. El politetrafluoroetileno de densidad completa o poroso es un material de sustrato polimerico adecuado (12) si se introducen grupos qmmicos reactivos (16) en constituyentes del material polimerico. Los materiales de sustrato con una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos que son parte del material de sustrato se denominan aqm “materiales funcionalizables”. Despues de la reaccion de una entidad biologicamente activa con un material de sustrato funcionalizable, el material de sustrato se considera funcionalizado y la entidad biologicamente activa inmovilizada. Con el fin de mantener la actividad biologica de la entidad inmovilizada durante las condiciones de procesamiento posteriores, tales como la esterilizacion, compactacion y expansion mecanicas, o almacenamiento, una composicion qmmica organica biologicamente compatible adicional se combina de forma no covalente con el material funcionalizado y la entidad inmovilizada.
Los materiales de sustrato pueden tener tambien una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos anadidos a las superficies de los materiales a traves de la aplicacion de una o mas composiciones o materiales de recubrimiento, a las superficies. Al menos una porcion de un material de recubrimiento tiene elementos, grupos, compuestos o componentes qmmicos que son reactivos para las entidades biologicamente activas y sirven para unir, confinar, o inmovilizar de otra manera una entidad biologicamente activa en una forma biologicamente activa con el material de recubrimiento. El material de recubrimiento se puede aplicar en la forma de un soluto, particula, dispersion, recubrimiento, o superposicion y se puede unir al material de sustrato en una variedad de maneras, que incluyen, pero no se limitan a, union covalente, adsorcion, tal como, fisisorcion o quimisorcion, y union no covalente, tal como enlace de hidrogeno o enlace ionico. En realizaciones preferidas, el material de recubrimiento se aplica en una solucion y forma una capa de peticula continua o discontinua en una o mas superficies del material de sustrato despues de la separacion del disolvente. El material de recubrimiento se puede aplicar en una o mas capas. Los constituyentes qmmicos del material de recubrimiento en cada capa pueden ser los mismos o diferentes. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento se reticula en sf mismo o con otros materiales de recubrimiento en otras capas. Los enlaces de reticulacion pueden ser covalentes o ionicos.
Los materiales de sustrato (12, 14) que carecen de grupos qmmicos reactivos en sus superficies (Figura 1A) (o que carecen apropiadamente de grupos qmmicos reactivos) se recubren, al menos en parte, con un material de recubrimiento polimerico (18) que tiene una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos (16) sobre el mismo (figuras 3 y 3A) a los que las entidades biologicamente activas (17) se pueden unir, confinar, o inmovilizar de otra manera (figuras 4 y 4A). La mayor parte de las entidades biologicamente activas (17) se unen o se enlazan covalentemente, al material de recubrimiento polimerico (18) a traves de los grupos qmmicos reactivos (16) del material de recubrimiento (18). El material de recubrimiento polimerico (18) forma al menos una capa sobre al menos una porcion de un material de sustrato (12, 14). En algunas realizaciones, el material de recubrimiento polimerico (18) se reticula (19) en sf mismo o con otras capas (18a, 18b) de material de recubrimiento polimerico (Figura 7 y 7a). La reticulacion puede ser covalente, ionica, o ambas. Los materiales de sustrato susceptibles de ser recubiertos son vidrio, metales (14), ceramicas, materiales polimericos (12), particularmente materiales polimericos qmmicamente inertes, tales como politetrafluoroetileno.
Al menos un tipo de entidad biologicamente activa que es un oligosacarido o polisacarido con capacidad de union a la anti-trombina III (17) se une qmmicamente, se confina, o se inmoviliza de otro modo a grupos qmmicos reactivos adecuados (16) sobre el material de sustrato (12, 14) y/o el material de recubrimiento (18).
Las composiciones biologicamente compatibles (11, 15, 100) incluyen, pero no se limitan a, antitromboticos, anticoagulantes, agentes fibrinolfticos o trombolfticos, antibioticos, compuestos antimicrobianos/antisepticos, compuestos anti-virales, antiproliferativos, compuestos de adhesion celular, compuestos antiadhesivos celulares, y antiinflamatorios. Los antitromboticos de particular interes son los glucosaminoglucanos, en particular la heparina, incluyendo derivados y analogos de la misma. Otros agentes anticoagulantes incluyen, pero no se limitan a, hirudina, protema C activada, y prostaglandinas. Los agentes fibrinolfticos o trombolfticos incluyen, pero no se limitan a, estreptocinasa, urocinasa, y activador del plasminogeno tisular (tPA). Los ejemplos de antibioticos incluyen, pero no se limitan a, penicilina, tetraciclina, cloranfenicol, minociclina, doxiciclina, vancomicina, bacitracina, kanamicina, neomicina, gentamicina, eritromicina y cefalosporinas. Los ejemplos de cefalosporinas incluyen cefalotina, cefapirina, cefazolina, cefalexina, cefradina, cefadroxil, cefamandol, cefoxitina, cefaclor, cefuroxima, cefonicida, ceforanida, cefotaxima, moxalactam, ceftrizoxima, ceftriaxona, y cefoperazona. Los ejemplos de antimicrobianos/antisepticos incluyen, pero no se limitan a, sulfadiazina de plata. clorhexidina, acido peracetico, hipoclorito de sodio, triclosan, fenoles, compuestos fenolicos, compuestos yodoforos, compuestos de amonio cuaternario, compuestos de cloro, heparina y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de agentes anti-virales incluyen, pero no se limitan a, alfa-metil-1-adamantanometilamina, hidroxi-etoximetilguanina, adamantanamina, 5- yodo-2'-desoxiuridina, trifluorotimidina, interferon, y adenina-arabinosido. Los compuestos de adhesion celular incluyen, pero no se limitan a, fibronectina, laminina, colageno, vitronectina, osteopontina, peptidos RGD, peptidos RGDS, peptidos YIGSR, y anticuerpos dirigidos a antigenos de superficie celular. Los compuestos que pueden resistir la union celular incluyen poli HEMA, polietilenglicol, polisacaridos, polivinilpirrolidona, y fosfotipidos. Otras entidades biologicamente activas incluyen, pero no se limitan a, enzimas, catalizadores organicos, ribozimas,
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organometalicos, protemas, glucoprotemas, peptidos, poliaminoacidos, anticuerpos, nucleosidos, nucleotidos, acidos nucleicos, moleculas esteroidales, antibioticos, compuestos antimicrobianos, antimicoticos, citocinas, hidratos de carbono, oleofobicos, Upidos, productos farmaceuticos y terapeuticos.
Las entidades biologicamente activas (17) de uso mas preferidas en la presente invencion, como se ha descrito antes, son los oligosacaridos o polisacaridos capaces de interactuar con componentes de la sangre de mairnfero para evitar la coagulacion o formacion de trombos sobre las superficies de un material de sustrato (12, 14) o material de recubrimiento (18) por los componentes de la sangre. Algunos de los polisacaridos son glucosaminoglucanos incluidas las composiciones de glucosamina o galactosamina. Los glucosaminoglucanos preferidos son composiciones de heparina, analogos de heparina, y derivados de heparina. La heparina es un glucosaminoglucano complejo con muchas funciones biologicas mediadas por su union a factores de crecimiento, enzimas, morfogenos, moleculas de adhesion celular, y citocinas. La actividad biologica de la heparina para funcionar como un anticoagulante se basa en la capacidad de la heparina para actuar como un catalizador para la union a la trombina y anti-trombina III (AT III). La mayor parte de la actividad anti-coagulante de la heparina se asocia con una secuencia de pentasacarido que facilita esta union.
La composicion de heparina mas preferida para la inmovilizacion en la presente invencion es una composicion de heparina que tiene un grupo aldehfdo terminal libre preparada segun las instrucciones de la patente de Estados Unidos. No. 4.613.665, expedida a Larm. En el procedimiento de preparacion de heparina con un grupo aldehfdo terminal libre, la heparina se somete a degradacion por diazoacion para formar un fragmento de heparina que tiene un grupo aldehfdo terminal libre. El grupo aldehfdo terminal libre permite que la composicion de heparina este “unida en el punto extremo” a los grupos amino primarios de un sustrato o material de recubrimiento polimerico para formar una imina que, por reduccion, se convierte en una amina secundaria. La union en el punto extremo de la composicion de heparina permite que la heparina sea inmovilizada en una conformacion que expone muy ventajosamente la porcion biologicamente activa de la composicion de heparina a los componentes de la sangre responsables de la coagulacion y formacion de trombos. Cuando se expone a los componentes de la sangre responsables de la formacion de trombos y de la coagulacion, la heparina inmovilizada de manera optima interactua con los componentes de la sangre para reducir o prevenir la formacion de trombos o otros episodios de coagulacion sobre las superficies del material de sustrato y/o de recubrimiento.
Otras entidades biologicamente activas deseables (17) para su uso en la presente invencion incluyen composiciones de heparina sintetica que se denominan “fondaparinux,” composiciones que implican la inhibicion mediada por la antitrombina III del factor Xa, antiproliferativas y antiinflamatorias.
A pesar de un esquema de inmovilizacion optimizado, la actividad biologica de una entidad biologica basada en heparina se redujo significativamente durante la esterilizacion, compactacion y expansion mecanicas, y/o el almacenamiento de las entidades (figuras 9, 11, 12, y 13). Como se ha expuesto anteriormente, la reduccion de la actividad biologica de una entidad biologicamente activa inmovilizada puede ser causada por una variedad de factores.
Independientemente del mecanismo por el cual disminuye la actividad biologica de una entidad inmovilizada, la adicion de una composicion organica biologicamente compatible combinada de manera no covalente con la entidad biologicamente activa inmovilizada mantiene la actividad biologica de la entidad durante y despues de la esterilizacion, manipulacion mecanica — tal como compactacion y expansion mecanicas, y/o almacenamiento de las entidades.
La composicion organica biologicamente compatible adicional puede tener alguna actividad biologica o ninguna actividad biologica. La composicion organica biologicamente compatible adicional es un polisacarido que es un glucosaminoglucano, dextrano o sulfato de dextrano. Se describen tambien composiciones organicas biologicamente compatibles que incluyen mucopolisacaridos acidos, aminoacidos, polipeptidos, protemas, glucoprotemas, nucleosidos, nucleotidos, polinucleotidos, u otro compuesto alifatico o aromatico biologicamente compatible, cargado o no cargado, que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 100.000.
Con referencia a las figuras 5-6A, los materiales de sustrato recubierto o no recubierto (14, 12, respectivamente) que tienen entidades biologicamente activas (17) inmovilizadas sobre ellos tienen una composicion biologicamente compatible adicional (100) combinada con las entidades biologicamente activas (17), el material de sustrato (12, 14) y/o el material de recubrimiento (18). La composicion biologicamente compatible es organica. La composicion organica biologicamente compatible se puede aplicar a las entidades biologicamente activas inmovilizadas, al sustrato, y/o al material de recubrimiento en una variedad de maneras. En una realizacion preferida, una composicion biologicamente compatible adecuada basada en hidratos de carbono se disuelve en un disolvente acuoso y la solucion se aplica a las entidades biologicamente activas inmovilizadas, al sustrato, y/o al material de recubrimiento polimerico mediante pulverizacion, recubrimiento por inmersion, inmersion, rodillo, extension, u otros medios de deposicion. En sistemas apropiados, las composiciones biologicamente compatibles se pueden disolver en disolventes organicos y se aplican de manera similar.
Una realizacion preferida de la presente invencion se refiere a un dispositivo medico esterilizado para implantacion, u otra colocacion, en un sitio anatomico. Tambien son preferidos los dispositivos medicos esterilizados para
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colocacion dentro de una estructura anatomica que delimita un espacio vado, o lumen, para reforzar la estructura anatomica o mantener el espacio vado delimitado de este modo. Cuando se utilizan estos dispositivos esterilizados dentro de una estructura vascular, las entidades biologicamente activas inmovilizadas en la forma de heparina unida en el punto extremo, interaction con la sangre que fluye a traves de, o alrededor de los dispositivos. para reducir al mrnimo o prevenir la formacion de trombos u otros productos de coagulacion sobre las superficies de los dispositivos que estan en contacto con la sangre. En un aspecto de la descripcion, la composicion organica biologicamente compatible adicional es un compuesto de polietilenglicol combinado covalentemente con el material de sustrato y/o material de recubrimiento. La heparina unida covalentemente puede permanecer con los dispositivos esterilizados. El metodo de esterilizacion preferido incluye oxido de etileno gas.
La fabricacion de dispositivos medicos puede requerir manipulacion mecanica que a menudo reduce la actividad biologica de una entidad biologicamente activa inmovilizada. La composicion biologicamente compatible adicional combinada con las entidades biologicamente activas inmovilizadas, el material de sustrato, y/o el material de recubrimiento, como se ha descrito antes, puede mantener tambien la actividad biologica de las entidades biologicamente activas inmovilizadas despues de la compactacion y expansion mecanicas de un dispositivo medico (figuras. 12 y 13). Los stents expandibles y los stents-injertos son dispositivos medicos para los que la actividad biologica mejorada de las entidades biologicamente activas inmovilizadas es particularmente significativa.
La presente invencion, por lo tanto, proporciona dispositivos esterilizados que tienen entidades biologicamente activas inmovilizadas en los mismos, donde la actividad biologica de las entidades inmovilizadas se mantiene significativamente durante y despues de un procedimiento de esterilizacion (figuras. 9-11, y 13). Antes de la esterilizacion, los dispositivos pueden ser manipulados mecanicamente, a traves de compactacion y expansion, por ejemplo, y mantienen una actividad biologica significativa (figuras. 12 y 13).
La Figura 14 ilustra esquematicamente realizaciones de la presente invencion (50) que tienen un sustrato polimerico (12) que tiene un material de revestimiento o recubrimiento polimerico (18) reticulado (19) sobre el mismo. El recubrimiento (18) tiene una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas “B” (17) unidas al mismo. El recubrimiento (18) tiene tambien una pluralidad de grupos qmmicamente reactivos “R” (13) sobre el mismo a los cuales puede ser unida covalentemente una composicion biologicamente compatible ”S” (15) (figuras 16 y 17). En algunas realizaciones, los enlaces covalentes son reversibles, haciendo de este modo que la composicion biologicamente compatible ”S” (15) sea liberable de la invencion en condiciones apropiadas. Las figuras 15 y 17 ilustran esquematicamente construcciones (50) similares utilizando un sustrato metalico (14).
Las figuras 18 y 19 ilustran esquematicamente realizaciones de la presente invencion (70) que tienen un sustrato polimerico (12) o un sustrato metalico (14) que tienen un material de revestimiento o recubrimiento polimerico (18) reticulado (19) sobre el mismo. El recubrimiento (18) tiene una pluralidad de entidades biologicamente activas inmovilizadas “B” (17) y una primera composicion biologicamente compatible ”S” (15) unidas covalentemente al mismo. En algunas realizaciones, los enlaces covalentes son reversibles, haciendo de este modo que la composicion biologicamente compatible ”S” (15) sea liberable de la invencion en condiciones apropiadas. En adicion, esta realizacion tiene una segunda composicion biologicamente compatible “A” (11) mezclada con ellas.
Las figuras 20 y 21 ilustran esquematicamente realizaciones de la presente invencion (80) que tienen un sustrato polimerico (12) o un sustrato metalico (14) que tienen un material de revestimiento o recubrimiento polimerico (18) reticulado (19) sobre el mismo. El recubrimiento (18) tiene una pluralidad de entidades biologicamente activas “B” (17) inmovilizadas en el mismo. Una primera composicion biologicamente compatible (100) se combina con las entidades biologicamente activas (17). En adicion, esta realizacion tiene una segunda composicion biologicamente compatible “A” (11) mezclada con ellas.
Ejemplos
Excepto para el Ejemplo 1, los calculos de la actividad de la heparina sobre las superficies en la presente invencion se realizaron utilizando el area de superficie de un solo lado del material de muestra, aunque la muestra entera, incluyendo los intersticios, puede tener heparina inmovilizada sobre ella. La actividad de heparina se ensayo midiendo la aptitud, o capacidad, de la heparina unida en el punto extremo, para unirse a una cantidad conocida de anti-trombina III (ATIII). Los resultados se expresaron como picomoles de anti-trombina III (ATIII) unidos por centimetro cuadrado de material de sustrato (pmol de ATIII/cm2 de material de sustrato). Este ensayo esta descrito por Larsen M.L., et. al., en “Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip- Arg-pNA” (S-2238) (Thromb. Res. 1978; 13:285-288) y Pasche, et. al., en “A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions” (Artif. Organs 1991; 15:281-491).
La actividad de union a ATIII por area de superficie de material de sustrato se define como el numero de picomoles de ATIII unidos por el area de superficie aparente del material de sustrato recubierto o no recubierto. El area de superficie aparente del sustrato no tiene en cuenta multiples superficies recubiertas ni consideraciones de porosidad de un material de sustrato poroso. Si el material de sustrato es poroso, el efecto de la porosidad sobre el area de superficie no se considera para estos calculos. Por ejemplo, el area de superficie aparente de un injerto vascular de ePTFE tubular cilrndrico (que esta hecho de un material poroso) con heparina unida en el punto extremo, inmovilizada sobre el material de sustrato que comprende la superficie interior del injerto tubular, se calcula tal como
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para cualquier geometna cilmdrica como 2 nrL: donde r es el radio interior del injerto; L es la longitud axial; y nes el numero pi. Es importante senalar que la naturaleza porosa de ePTFE y su efecto sobre el area de superficie no se tienen en cuenta aqrn. Por consiguiente, los materiales de sustrato no porosos que se cortan en cuadrados para el analisis, se considera que tienen un area de superficie de la longitud multiplicada por la anchura.
Los ejemplos marcados con un asterisco (*) son ejemplos de referencia y no forman parte de la presente invencion.
Ejemplo 1*
Este ejemplo demuestra la retencion de la actividad biologica de heparina no unida “neta” despues de exposicion de la heparina a un procedimiento de esterilizacion con oxido de etileno (ETO).
En este ejemplo, se obtuvo heparina sodica grado USP sin esterilizar, en forma de polvo liofilizado de Celsus Laboratories (Cincinnati, OH). Cantidades medidas de heparina se colocaron en bolsas de esterilizacion CHEX- ALL® (Long Island City, NY) para analisis. Un grupo de bolsas que conteman heparina se expuso a esterilizacion con ETO. La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de, acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h). Se sometio otro grupo al procedimiento de esterilizacion en ausencia de ETO. Un tercer grupo no se expuso al procedimiento de esterilizacion.
Despues del procedimiento de esterilizacion, se retiraron cantidades conocidas de heparina de cada bolsa y se ensayaron en cuanto a bio-actividad con un kit de ensayo de heparina ACTICHROME (anti-FXa) disponible de American Diagnostica Inc. (Stamford, CT.). Los valores de bioactividad para cada muestra de heparina se expresaron como unidades internacionales de heparina por masa de heparina (lU/mg). Las unidades internacionales de heparina se calculan en base a la inactivacion de Factor Xa por ATIII que es catalizada por la heparina. Las unidades internacionales son por lo tanto una medida de la actividad de union a la ATIII de la heparina. Cualquier reduccion en la actividad de la heparina se expresa simplemente como una reduccion en las lU/mg de los controles de heparina comparables del ensayo con ACTICHROME. La heparina que presenta una reduccion en la actividad se considera que ha sido desactivada hasta un nivel por el procedimiento de esterilizacion.
La Figura 8 es un grafico de barras que ilustra el efecto de la esterilizacion con ETO sobre la actividad de union a la anti-trombina III (ATIII) de la heparina seca, en polvo, en estado no unida. La Figura 8 muestra los niveles medios de actividad, expresada como IU/mg, para las muestras de heparina (n = 3) de cada grupo. Las muestras de heparina control que no se sometieron a esterilizacion teman un valor medio de 138 IU/mg. Las muestras de heparina control que sufrieron el procedimiento de esterilizacion en ausencia de ETO (es decir, alta humedad, altas temperaturas, etc.) tuvieron un valor medio de 119 IU/mg. Las muestras de heparina que sufrieron el procedimiento de esterilizacion en presencia de ETO tuvieron un valor medio de 123 IU/mg. Las muestras de heparina expuestas al procedimiento de esterilizacion en ausencia de ETO tuvieron una disminucion de la actividad de un catorce por ciento (14 %) en comparacion con las muestras de control no esterilizadas, mientras que las muestras expuestas al procedimiento de esterilizacion en presencia de ETO tuvieron solamente un once por ciento (11 %) de disminucion de la actividad. Como se ve en la Figura 8, la esterilizacion de heparina polvo, no unida, neta, en presencia o ausencia de ETO no reduce significativamente la union de ATIII a la heparina cuando se compara con las muestras de control no esterilizadas. La actividad de union a la anti-trombina III de la heparina no unida, no esterilizada, no se reduce de manera significativa por la esterilizacion sin ETO ni por la esterilizacion con ETO. Por lo tanto, la degradacion de la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada sometida a condiciones similares de esterilizacion con ETO debe ser causada por un mecanismo distinto de la simple exposicion a la esterilizacion con o sin ETO.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la construccion de una realizacion de la presente invencion en la que la union de la heparina a la antitrombina III (ATIII) no se reduce significativamente por la exposicion a esterilizacion con ETO.
De acuerdo con la patente de Estados Unidos No. 6.653.457, una composicion de heparina modificada con aldehfdo preparada segun la patente de Estados Unidos No. 4.613.665, se unio en el punto extremo a un material de recubrimiento, o capa de recubrimiento, colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE). Una composicion organica biologicamente compatible adicional se incorporo dentro del material de recubrimiento y la heparina unida, para hacer posible que la heparina inmovilizada sufra la esterilizacion con ETO sin perdida significativa de actividad biologica.
Se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406). Un material de recubrimiento en forma de un recubrimiento base se aplico al material de ePTFE montando el material sobre un aro de bordar de plastico de diez centfmetros (10 cm) de diametro y sumergiendo el material soportado en ePTFE primero en alcohol isopropflico (IPA) al 100 % durante aproximadamente cinco minutos (5 min) y despues en una solucion de polietilen-imina (PEI) LUPASOL®, y IPA en una relacion uno a uno (1:1). La PEI LUPASOL® libre de agua se obtuvo de BASF y se diluyo hasta una concentracion de aproximadamente cuatro por ciento (4 %) y se ajusto a pH 9,6. Despues de la inmersion del material de ePTFE en la solucion durante aproximadamente quince minutos (15 min), se retiro el material de la
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solucion y se enjuago con agua desionizada (DI) a pH 9,6 durante quince minutes (15 min). La PEI que queda sobre el material de ePTFE se reticulo con una solucion acuosa al 0,05 % de glutaraldetedo (obtenido de Amresco) a pH
9.6 durante quince minutes (15 min). Se anadio PEI adicional a la construccion colocando la construccion en una solucion acuosa al 0,5 % de PEI a pH 9,6 durante quince minutes (15 min) y enjuagando de nuevo en agua DI a pH
9.6 durante quince minutes (15 min). La imina formada como resultado de la reaccion entre el glutaraldetedo y la capa de PEI se reduce con una solucion de cianoborohidruro de sodio (NaCNBHa) (5 g disuelto en 1 L de agua DI, pH 9,6) durante quince minutos (15 min) y se enjuaga con agua DI durante treinta minutos (30 min).
Se anadio una capa adicional de PEI a la construccion sumergiendo la construccion en solucion acuosa de glutaraldetedo al 0,05 % a pH 9,6 durante quince minutos (15 min), seguido por inmersion en una solucion acuosa al 0,5 % de PEI a pH 9,6 durante quince minutos (15 min). Despues, se enjuago la construccion con agua DI a pH 9,6 durante quince minutos (15 min). Las iminas resultantes se redujeron sumergiendo la construccion en una solucion de NaCNBH3 (5 g disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,6) durante quince minutos (15 min), seguido por un enjuagado en agua DI durante treinta minutos (30 min). Se aplico una tercera capa a la construccion mediante la repeticion de estas etapas. El resultado fue un material de base fluoropolimerico hidrofobo poroso que tiene una cubierta base de polfmero reticulado hidrofilo sobre sustancialmente todas las superficies expuestas e intersticiales del material base.
Se unio una capa qrnmica intermedia a la cubierta base polimerica en preparacion para la colocacion de otra capa de PEI sobre la construccion. La capa de carga ionica intermedia se preparo por incubacion de la construccion en una solucion de sulfato de dextrano (Amersham Pharmacia Biotech) y cloruro de sodio (0,15 g de sulfato de
dextrano y 100 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 3) a 60 °C durante noventa minutos (90 min), seguido por
enjuagado con agua DI durante quince minutos (15 min).
Una capa de PEI, denominada en esta memoria como una “capa de tapado”, se unio a la capa intermedia mediante la colocacion de la construccion en una solucion acuosa al 0,3 % de PEI (pH 9) durante aproximadamente cuarenta y cinco minutos (45 min), seguido por un enjuagado en una solucion de cloruro de sodio (50 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI) durante veinte minutos (20 min). Se realizo un enjuagado final con agua DI durante veinte minutos (20 min).
La heparina modificada con aldehfdo se unio o se conjugo en el punto extremo, a la capa o capas de PEI mediante la colocacion de la construccion en una solucion de sal de cloruro de sodio que contema heparina (1,5 g de
heparina, 29,3 g de NaCl disuelto en 1 L de agua DI, pH 3,9) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta
grados centfgrados (60 °C). Se anadio un volumen de 2,86 mL de una solucion acuosa al 2,5 % (p/v) de NaCNBH3 a un litro (1 L) de solucion de heparina antes de anadir las muestras. Se enjuagaron entonces las muestras con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente con agua DI durante quince minutos (15 min), seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE. La presencia y uniformidad de la heparina se determino tinendo las muestras de la construccion por ambos lados con azul de toluidina. La tincion produjo una superficie tenida uniformemente de color purpura, lo que indica que la heparina estaba presente y unida uniformemente al material de ePTFE.
Mediante la adicion de compuestos o composiciones particulares a la construccion unida a heparina, la actividad biologica de la heparina se puede mantener despues de la exposicion a condiciones que de otra manera pueden reducir la actividad biologica de la heparina. Las condiciones incluyen, pero no se limitan a, esterilizacion con ETO, compactacion y expansion mecanicas y almacenamiento.
Las construcciones descritas anteriormente recubiertas con un material de recubrimiento se expusieron a soluciones de los siguientes compuestos para evaluar su efecto estabilizador sobre la actividad biologica de la heparina unida a partes del recubrimiento: cloruro de calcio grado USP (Fisher Scientific), heparina sodica grado USP (Celsus), polietilenglicol (peso molecular 20.000, Sigma), dextrano DEAE (peso molecular 500.000, PK qrnmica), sal de sodio de sulfato de dextrano (peso molecular 8.000, Sigma), y dextrano (peso molecular 9.500, Sigma) a concentraciones de 0,5 g por 100 mL de agua DI ajustada a pH 9,6. Se utilizo tambien dexametasona a 0,5 g por 100 mL de etanol sin ajuste de pH. Cada una de estas soluciones se denomina en la presente memoria una “solucion de tratamiento”. El efecto de estos diferentes compuestos sobre la actividad de union de la heparina a la antitrombina III (ATIII) despues de esterilizacion con ETO se expreso como picomoles de anti-trombina III unidos por centimetro cuadrado (cm2) de material de sustrato. Estos datos se resumen en la Figura 9.
Para exponer una construccion particular que contiene heparina a una solucion particular de tratamiento, se coloco la construccion en un vaso de precipitados de dos litros (2 L) y se anadieron cien mililitros (100 mL) de solucion de tratamiento, suficiente para sumergir completamente la construccion en la solucion de tratamiento. Cada construccion se expuso a la solucion de tratamiento durante una hora (1 h) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Se retiro la construccion de la solucion y se liofilizo antes de la exposicion a un procedimiento de esterilizacion.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, cada construccion liofilizada se coloco y se sello en una bolsa de autosellado de una torre DUALPEEL® (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL.). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia del ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un
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tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Despues de la esterilizacion con ETO, cada construccion (incluidos los controles) se retiro de su bolsa y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se cortaron muestras de la construccion de aproximadamente un centfmetro cuadrado (1 cm2) de tamano y se ensayaron en cuanto a actividad de heparina midiendo la capacidad de la heparina unida en el punto extremo, para unirse a ATIII. El ensayo esta descrito por Larsen M.L., et. al., en “Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238).” Thromb. Res. 13:285-288 (1978) y Pasche B, et. al., en “A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions” Artif. Organs 15:281-491 (1991). Los resultados se expresaron como la cantidad de ATIII unida por unidad de area superficial de material de sustrato en picomoles por centfmetro cuadrado (pmol/cm2). Todas las muestras se mantuvieron en condiciones humedas durante todo el ensayo. Es importante senalar que, aunque las mientras de aproximadamente un centfmetro cuadrado (1 cm2) tienen cada una un area de superficie total de dos centfmetros cuadrados (2 cm2) si se consideran ambos lados del material, se utilizo solamente una superficie de la muestra (esto es, 1 cm2) para calcular la actividad de union de la heparina a ATIII en pmol/cm2.
La Figura 9 es un grafico de barras que ilustra los efectos de diversas composiciones organicas biologicamente compatibles, combinadas en forma no covalente con heparina inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto, sobre la actividad de union de la heparina inmovilizada a la anti-trombina III despues de la exposicion de la heparina inmovilizada a esterilizacion con ETO.
La actividad de union de la anti-trombina III a la heparina inmovilizada se expreso en picomoles de ATIII unida por centfmetro cuadrado de material de sustrato (pmol/cm2). Un conjunto de muestras de control no fueron esterilizadas. Otro conjunto de muestras de control se sometieron a esterilizacion con ETO en ausencia de una composicion organica biologicamente compatible combinada de forma no covalente con la heparina inmovilizada y el material de recubrimiento. Cada barra restante representa la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada en presencia de la composicion organica biologicamente compatible indicada combinada de forma no covalente con la heparina inmovilizada y el material de recubrimiento. Todas las barras representan valores medios de n = 3 muestras, excepto para el sulfato de dextrano con n = 6 muestras.
Como se puede ver en el grafico de barras, las muestras de control esterilizadas mostraron una reduccion importante en la actividad de union a la anti-trombina III en comparacion con las muestras de control no esterilizadas. La actividad de union a la anti-trombina III de las muestras de control no esterilizadas fue de 103 pmol/cm2 de material de sustrato. La actividad de union a la anti-trombina III de las muestras de control esterilizadas fue de 66 pmol/cm2 de material de sustrato. La esterilizacion con ETO causo una reduccion del treinta y seis por ciento (36 %) en la actividad de union a la anti-trombina III en comparacion con las muestras no esterilizadas.
La influencia de las composiciones organicas biologicamente compatibles descritas anteriormente combinadas de forma no covalente con la heparina inmovilizada y el material de recubrimiento, sobre la actividad de union a la anti- trombina III se resume en el siguiente parrafo. Cada composicion organica biologicamente compatible se enjuago, como se ha descrito antes, de cada construccion antes de que fuera determinada la actividad de union a la anti- trombina III.
Cuando se anadio heparina a la construccion, la actividad media de union a la anti-trombina III fue de 108 pmol/cm2. La adicion de dextrano a la construccion dio como resultado una actividad media de union a la anti-trombina III de 98 pmol/cm2 de material de sustrato. Cuando se anadio sulfato de dextrano a la construccion, la actividad media de union a la anti-trombina III fue de 134 pmol/cm2 de material de sustrato. Adicionalmente, el polietilenglicol dio como resultado una actividad media de union a la anti-trombina III de 129 pmol/cm2 de material de sustrato. De manera interesante, estos valores son mayores que los valores medios de las muestras de control no esterilizadas de 103 pmol/cm2 de material de sustrato.
Cuando se anadio cloruro de calcio inorganico (CaCh) a la construccion, la actividad media de union a la anti- trombina III de la heparina inmovilizada fue de 75 pmol/cm2 de material de sustrato. La adicion de dexametasona a la construccion dio como resultado una actividad media de union a la anti-trombina III de 42 pmol/cm2 de material de sustrato. El dextrano DEAE parecio disminuir la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada con una actividad media de 5 pmol/cm2 de material de sustrato.
Estos resultados demuestran la capacidad de los dispositivos de la presente invencion, en los que la composicion organica biologicamente compatible es heparina, dextrano o sulfato de dextrano, para mantener o aumentar, la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina unida en el punto extremo, despues de esterilizacion con ETO con una composicion biologicamente compatible apropiada combinada de forma no covalente con la heparina inmovilizada y el material de recubrimiento.
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Ejemplo 3
Este ejemplo describe la capacidad de una composicion organica biologicamente compatible adicional para producir una alta actividad de union a la anti-trombina III (ATIII) de la heparina unida en el punto extremo a un material de recubrimiento polimerico sobre un material de sustrato que es un componente de un dispositivo medico implantable.
El dispositivo medico implantable utilizado en este ejemplo tema la forma de tubo reforzado con un alambre de nitinol hecho de un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), poroso, obtenido de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. con el nombre comercial Endoprotesis VIABAHN®. El dispositivo tubular tema quince centimetros (15 cm) de longitud y seis milfmetros (6 mm) de diametro.
La endoprotesis VIABAHN® estaba constrenida dentro de un cateter de administracion y requena la retirada del cateter antes de la inmovilizacion de la heparina sobre la misma. Cada dispositivo constrenido en un cateter se saco para el procesamiento tirando de una cuerda de liberacion unida a una vaina de constriccion y liberando la vaina de alrededor del dispositivo. Una vez libre, cada dispositivo se expandio y se utilizo como un material de sustrato separado. Cada material de sustrato (dispositivo de endoprotesis) se sumergio en una solucion de PEI (al 5 % en agua DI) y de IPA (grado USP) en una relacion de volumen en tanto por ciento de 30:70, respectivamente, durante aproximadamente doce horas (12 h) para colocar un material de recubrimiento polimerico (18) sobre el material de sustrato (12). El material de recubrimiento polimerico (18) tema una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos (16) a los cuales se unieron eventualmente en el punto extremo, una pluralidad de moleculas de heparina modificadas con aldelmdo (17).
Al menos una capa adicional de material de recubrimiento (18a, 18b) se coloco sobre la primera capa de PEI (18). Esto se realizo colocando cada dispositivo endoprotesico dentro de un tubo de silicona separado y conectando el tubo a una bomba peristaltica y deposito de solucion. Esto permitio que una solucion adicional que contema un material de recubrimiento pasara repetidamente a traves del centro del dispositivo medico tubular para recubrir principalmente las superficies interiores del dispositivo.
Con cada endoprotesis constrenida dentro de uno de estos sistemas de flujo dinamico, se paso a traves del dispositivo un material de recubrimiento (18) en la forma de una solucion acuosa al 0,10 % (pH 9,0) de PEI e IPA en una relacion de volumen en tanto por ciento de 45:55, respectivamente, durante aproximadamente veinte minutos (20 min). Despues, se enjuago cada dispositivo con agua Di (pH 9,0) durante cinco minutos (5 min) y las capas de PEI se reticularon (19) por exposicion a una solucion acuosa de glutaraldehndo al 0,05 % (pH 9,0) durante veinte minutos (20 min). Los dispositivos se enjuagaron entonces de nuevo con una solucion acuosa de PEI (al 0,10 %, pH 9,0) durante cinco minutos (5 min). Las iminas resultantes se redujeron con una solucion de cianoborohidruro de sodio (5 g en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante quince minutos (15 min) y se enjuagaron con agua DI durante treinta minutos (30 min).
Se coloco una capa de carga ionica intermedia sobre la capa o capas de PEI reticuladas de cada dispositivo haciendo fluir una solucion de sulfato de dextrano (0,15 g de sulfato de dextrano y cien gramos de cloruro de sodio (100 g de NaCl) disueltos en un litro (1 L) de agua DI, pH 3) a traves del sistema de flujo dinamico y sobre la capa de PEI a sesenta grados centfgrados (60 °C) durante aproximadamente noventa minutos (90 min). Esto fue seguido por enjuagado del sistema con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se anadio una capa de “tapado” (18b) de PEI a la capa de sulfato de dextrano cargada ionicamente (18a) haciendo fluir una solucion acuosa de PEI (al 0,075 %, pH 9,0) a traves del sistema de flujo dinamico durante aproximadamente cuarenta y cinco minutos (45 min), seguido por un enjuagado con una solucion de cloruro de sodio (50 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI) durante quince minutos (15 min). El enjuagado fue seguido por una breve descarga de agua DI durante aproximadamente dos minutos y medio (2,5 min).
La heparina modificada con aldehfdo se unio o se conjugo en el punto extremo, a la capa o capas de PEI mediante la colocacion de la construccion en una solucion de sal de cloruro de sodio que contema heparina (1,5 g de heparina, 29,3 g de NaCl disueltos en agua DI, pH 3,9) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Se anadio un volumen de 2,86 mL de una solucion acuosa al 2,5 % (p/v) de NaCNBH3 a un litro (1 L) de solucion de heparina, diez minutos (10 min) despues de iniciar la etapa. Un primer enjuagado con agua DI durante quince minutos (15 min), fue seguido por un enjuagado con una solucion de acido borico (0,7 g de NaCl,
10,6 g de acido borico y 2,7 g de NaOH disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante aproximadamente veinte minutos (20 min), y un enjuagado final con agua DI durante quince minutos (15 min). Despues, se sometio la construccion a un proceso de liofilizacion. La tincion de muestras seleccionadas con azul de toluidina produjo una superficie de color purpura consistente que indica heparina unida uniformemente.
Basandose en los resultados obtenidos en los estudios descritos en el Ejemplo 2, supra, se seleccionaron heparina grado USP (sal de sodio) y sulfato de dextrano de peso molecular 8.000 (sal de sodio) a una concentracion de 0,5 g/100 mL de agua DI (pH 9,6), como las composiciones organicas biologicamente compatibles preferidas para mantener, o estabilizar, la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada durante y despues de esterilizacion con ETO.
Para cada composicion organica biologicamente compatible preferida, las secciones de las endoprotesis que tienen
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heparina unida en el punto extremo a un material de recubrimiento polimerico, se colocaron en tubos de plastico que conteman una solucion de dichas composiciones organicas biologicamente compatibles (cada una a una concentracion de 0,5 g/100 mL de agua DI, pH 9,6) y se incubaron a sesenta grados centigrados (60 °C) durante una hora (1 h). Cada muestra tratada se retiro del tubo de plastico y se expuso a un proceso de liofilizacion.
Cada muestra liofilizada se coloco en una bolsa de autosellado de una torre DUALPEEL® (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL.) y se sello para esterilizacion con ETO. La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centigrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Despues de esterilizacion con ETO, cada construccion se retiro de su bolsa y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se cortaron de cada dispositivo muestras de material de sustrato de cada dispositivo esterilizado con ETO (aproximadamente 0,5 cm de largo) y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad biologica utilizando el ensayo descrito anteriormente de union a ATIII (Ejemplo 2). Las muestras se mantuvieron humedas a lo largo del procedimiento de ensayo. Los resultados se expresaron como picomoles de anti-trombina III unidos por unidad de area del material de sustrato (pmol/cm2), medidos sobre la superficie luminal de cada dispositivo y no en toda el area superficial del dispositivo (esto es, ambas superficies abluminal y luminal).
La Figura 10 es un grafico de barras que ilustra el efecto de dos composiciones organicas biologicamente compatibles separadas en la forma de heparina y sulfato de dextrano sobre la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto durante y despues de la exposicion a un regimen de esterilizacion con ETO. La actividad de union a la anti-trombina III se expresa como picomoles de anti- trombina III unida por centfmetro cuadrado de material de sustrato. Como se ve por los resultados, el uso de composiciones organicas biologicamente compatibles de heparina y sulfato de dextrano dieron como resultado una alta actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada despues de la esterilizacion con ETO, con actividades de 97 pmol/cm2 de material de sustrato y 91 pmol/cm2 de material de sustrato, respectivamente. Todas las barras representan valores medios de n = 6 muestras.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe la construccion de una realizacion de la presente invencion que tiene un compuesto de heparina modificada con aldehfdo unido en el punto extremo a un material de recubrimiento polimerico que incluye una primera capa de recubrimiento ionicamente neutra. La construccion tema una union de heparina a ATIII que no habfa disminuido significativamente por exposicion a la esterilizacion con ETO.
El material de recubrimiento utilizado como recubrimiento base en esta construccion se selecciono para obtener un material de recubrimiento, o recubrimiento con heparina, que no tema esencialmente ninguna carga ionica. Se utilizaron alcohol polivimlico y PEI como los materiales de recubrimiento.
De acuerdo con la patente de Estados Unidos No. 6.653.457, una composicion de heparina modificada con aldehfdo se unio a un material de sustrato recubierto. El material de sustrato (12) era material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE). Se incorporo una composicion qmmica organica biocompatible adicional (100) al material de recubrimiento de la construccion que contiene heparina (18) para permitir que la heparina pueda sufrir una esterilizacion con ETO sin perdida significativa de actividad biologica.
Se obtuvo un material de sustrato de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406). Se aplico una capa de material de recubrimiento, o recubrimiento base, al material de sustrato de ePTFE montando el material sobre un aro de bordar de plastico de 10 cm de diametro y sumergiendo el material soportado en ePTFE en una solucion de IPA al 100 % durante aproximadamente cinco minutos (5 min). Esto fue seguido por inmersion del material de ePTFE en una solucion acuosa al dos por ciento (2 %) de alcohol polivimlico de grado USP (PVA) (Spectrum) durante quince minutos (15 min). Despues de un enjuagado de quince minutos (15 min) en agua DI, la capa de PVA se expuso a una solucion acuosa al dos por ciento (2 %) de glutaraldefndo y al uno por ciento (1 %) de acido clorfndrico (HCL) durante quince minutos (15 min) para reticular (19) el PVA (18), in situ. Se enjuago la construccion con agua DI durante quince minutos (15 min), seguido por un segundo enjuagado con agua DI de quince minutos (15 min). El recubrimiento base de PVA reticulado resultante no tema ninguna carga ionica neta.
Se anadio otra capa de material de recubrimiento polimerico (18a) a la construccion mediante la inmersion de la construccion en una solucion acuosa al 0,15 % de PEI (pH 10,5) durante treinta minutos (30 min). Las iminas resultantes se redujeron sumergiendo la construccion en una solucion acuosa de solucion de cianoborohidruro de sodio (5 g/L en agua DI, pH 10,5) durante quince minutos (15 min). Se enjuago la construccion con agua DI durante quince minutos (15 min), seguido de un segundo enjuagado con agua DI durante quince minutos (15 min).
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Un material de sustrato de ePTFE recubierto que tiene una multiplicidad de grupos qmmicos reactivos sobre el mismo se sumergio en la solucion de heparina (1,0 g de heparina, 29,3 g de NaCl disueltos en agua DI, pH 3,9) durante 90 minutos (90 min) a 60 °C. Se anadio un volumen de 2,86 mL de una solucion acuosa al 2,5 % (p/v) de NaCNBH3 a 1 L de la solucion de heparina antes de iniciar esta etapa. Un primer enjuagado de quince minutos (15 min) en agua DI, fue seguido por un enjuagado en una solucion acuosa de acido borico (0,7 g de NaCl, 10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante aproximadamente veinte minutos (20 min), y un enjuagado final en agua DI durante quince minutos (15 min). Despues, se sometio la construccion a un proceso de liofilizacion. Se tineron entonces las muestras de la construccion con azul de toluidina. La tincion produjo una superficie purpura consistente que indica una heparina unida uniformemente sobre el material de ePTFE recubierto.
Se expuso la construccion a una solucion acuosa de tratamiento que contiene una composicion organica biologicamente compatible (100) en la forma de sulfato de dextrano de grado USP de peso molecular 8.000 (sal de sodio) (Sigma) mediante la inmersion de la construccion en 100 mL de solucion de tratamiento (0,5 g de sulfato de dextrano/100 mL de agua DI, pH 9,6) a sesenta grados centfgrados (60 °C) durante una hora (1 h). Despues de la separacion de la construccion de la solucion de tratamiento, se liofilizo la construccion.
Cada construccion liofilizada se coloco en una bolsa de autosellado de una torre DUALPEEL® (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL) para esterilizacion con ETO. La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Despues de esterilizacion con ETO, cada construccion (incluyendo los controles) se retiro de su bolsa y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con una solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH, 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se cortaron muestras de la membrana (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Las muestras se mantuvieron humedas a lo largo de todo el procedimiento de ensayo. Los resultados se expresaron como picomoles de anti-trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2 de material de sustrato).
La Figura 11 es un grafico de barras que ilustra el efecto de una composicion organica biologicamente compatible en la forma de sulfato de dextrano sobre la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina unida en el punto extremo inmovilizada sobre un material de sustrato de politetrafluoroetileno expandido poroso y un material de recubrimiento de alcohol polivimlico y PEI, despues de esterilizacion con ETO. La actividad biologica de la heparina inmovilizada se expreso como picomoles de anti-trombina III unida por centimetro cuadrado de material de sustrato.
Las muestras de control no esterilizadas teman una actividad de union a la anti-trombina III de 150 pmol/cm2 de material de sustrato. Las muestras de control esterilizadas teman una actividad de union a la anti-trombina III de 93 pmol/cm2 de material de sustrato. Las muestras esterilizadas con oxido de etileno tratadas con sulfato de dextrano teman una actividad de union a la anti-trombina III de 115 pmol/cm2 de material de sustrato. Este valor era mayor que los valores de control para los dispositivos esterilizados con ETO que no fueron expuestos a una solucion de tratamiento de sulfato de dextrano (esto es, 93 pmol/cm2 de material de sustrato), lo que indica que el sulfato de dextrano anadido aumento la actividad biologica de la heparina inmovilizada despues de la esterilizacion con ETO. Ambas de estas construcciones teman valores de actividad de union a la anti-trombina III que eran significativamente mas bajos que los controles no tratados, ni esterilizados con ETO (150 pmol/cm2 de material de sustrato).
Como se ve por los resultados, el sulfato de dextrano tuvo un impacto significativo sobre la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada unida a una construccion con un material de recubrimiento polimerico que incluye una primera capa de recubrimiento ionicamente neutra, despues de la esterilizacion con ETO. Todas las barras representan valores medios de n = 3 muestras.
Ejemplo 5*
Este ejemplo describe la capacidad de una composicion organica biologicamente compatible adicional para mantener o aumentar la actividad biologica de una heparina biologicamente activa inmovilizada en un material de sustrato recubierto durante y despues de la imposicion de una tension mecanica de magnitud suficiente para reducir de otro modo de manera significativa la actividad biologica de la entidad.
En este ejemplo, se aplico a dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales un recubrimiento que contiene heparina como se describe en el Ejemplo 3, supra. Cada protesis tema la forma de un tubo reforzado con alambre de nitinol hecho de un material de politetrafluoroetileno expandido, poroso, (ePTFE) obtenido de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. con el nombre comercial de endoprotesis VIABAHN®. El dispositivo tubular tema quince centimetros (15 cm) de longitud y seis milfmetros (6 mm) de diametro. Se utilizo el mismo procedimiento detallado en el Ejemplo 3 para formar un recubrimiento que contiene heparina sobre el
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dispositivo.
Para el tratamiento con la composicion organica biologicamente compatible (100), se preparo el material de sustrato (12) del dispositivo endoluminal con un material de recubrimiento polimerico (18) que tiene heparina modificada con aldelmdo (17) unida en el punto extremo a al menos una porcion del mismo. Secciones del dispositivo preparado se colocaron en tubos de plastico y se incubaron con una solucion de glicerol (5 mL, glicerol SigmaUltra de Sigma- Aldrich en 100 mL de agua DI, pH 9,6) a sesenta grados centigrados (60 °C) durante una hora (1 h). Cada dispositivo tratado se retiro del tubo de plastico y se expuso a un proceso de liofilizacion.
Cada endoprotesis cilmdrica fue colocada sobre un sistema de administracion intravascular y se comprimio mecanicamente hasta que estuvo suficientemente compactada sobre el sistema de administracion para ser constrenida en una funda de constriccion. Los dispositivos hechos segun el Ejemplo 3 pueden resistir los esfuerzos mecanicos asociados con la compactacion de la endoprotesis sobre el sistema de administracion sin perdida significativa de actividad de la heparina incorporada en el recubrimiento.
El glicerol fue elegido como la composicion organica biologicamente compatible unida no covalentemente (100) para mantener la actividad biologica de la heparina unida en el punto extremo (17) durante la compactacion y la expansion diametrales de cada endoprotesis de ensayo. Cada seccion del dispositivo de endoprotesis de control no tema la composicion de glicerol biologicamente compatible unida no covalentemente (100) incluida con la heparina unida en el punto extremo (es decir, unida covalentemente) (17) y el material de recubrimiento polimerico (18). Cada dispositivo se sometio a un proceso de liofilizacion.
Para comprimir y compactar los dispositivos endoluminales en un sistema de administracion, cada endoprotesis fue sacada a traves de un embudo conico con un diametro fijo. Cada endoprotesis tema seis (6) puntos de sutura (Gore- Tex® CV-0, 0N05) cosidos a traves de un extremo para tirar de los dispositivos a traves del embudo. Se tiro de cada dispositivo a traves de la apertura de una punta de pipeta de veinticinco mililitros (25 mL) (Falcon®, producto # 357525) con un diametro de aproximadamente tres milfmetros (3 mm) y en un tubo de vidrio con un diametro de aproximadamente 3,1 mm para mantenerlo en estado compactado.
Despues de la compactacion, cada endoprotesis se desplego en una solucion salina acuosa al 0,9 % a treinta y siete grados centfgrados (37 °C), se enjuago y se ensayo en cuanto a actividad de union a la anti-trombina III como se describe en la presente memoria. Los resultados se muestran en la Figura 12. Se preparo cada endoprotesis para ensayo por el lavado con agua DI durante quince minutos (15 min), seguido de un enjuagado con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico 2,7 g de NaOH, 0,7 de NaCl, disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min) y un enjuagado final de quince minutos (15 min) con agua DI.
Se cortaron muestras de material que contiene heparina de cada endoprotesis (aproximadamente 0,5 cm de largo) y se midio la heparina unida en cuanto a actividad biologica utilizando el ensayo de union a anti-trombina III (ATIII) descrito antes (Ejemplo 2). Las muestras se mantuvieron humedas durante el procedimiento de ensayo. Los resultados se expresaron como union de anti-trombina III por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2 de material de sustrato).
La Figura 12 es un grafico de barras que ilustra el efecto de una composicion de glicerol con heparina inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto despues de la compactacion y expansion. Los resultados muestran que la adicion de glicerol a la heparina inmovilizada mejora de modo significativo la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina unida, despues de la compactacion y expansion de la heparina inmovilizada en comparacion con muestras de control tratadas de manera similar que no tienen glicerol anadido. Todas las barras verticales representan los valores medios de n = 3 muestras.
La heparina inmovilizada en un material de recubrimiento polimerico que no recibio la composicion organica biologicamente compatible de glicerol adicional, y que estaba diametralmente compactada y expandida, mostro una reduccion significativa en la actividad de union a la antitrombina III (85 pmol/cm2) en comparacion con los materiales de control construidos y tratados de manera similar no compactados ni expandidos diametralmente (137 pmol/cm2). Cuando los materiales de sustrato recubiertos con heparina inmovilizada se trataron con una composicion organica de glicerol biologicamente compatible y se expusieron a las mismas manipulaciones mecanicas que la construccion no tratada, la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada se mantuvo similar a la de los materiales de control (129 pmol/cm2).
Ejemplo 6
Este ejemplo describe el efecto de la adicion de una composicion organica biologicamente compatible sobre la actividad de union a ATIII del dispositivo medico recubierto descrito en los Ejemplos 3 y 5, sometido a compactacion, expansion y esterilizacion con eTo.
El dispositivo medico implantable utilizado en este ejemplo se construyo de la misma manera que se describe en el Ejemplo 3. El dispositivo tema la forma de un tubo reforzado con alambre de nitinol hecho de un material de politetrafluoroetileno expandido, poroso, (ePTFE) obtenido de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. con el nombre comercial de endoprotesis VIABAHN®. El dispositivo tubular tema quince centimetres (15 cm) de longitud y
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seis mi^metros (6 mm) de diametro. Se utilizo el mismo procedimiento que se detalla en los Ejemplos 3 para formar un recubrimiento que contiene heparina sobre el dispositivo.
Para tratamiento con la composicion organica biologicamente compatible (100), se preparo el material de sustrato (12) del dispositivo endoluminal con un material de recubrimiento polimerico (18) que tiene heparina modificada con aldehndo (17) unida en el punto extremo a al menos una porcion del mismo. El dispositivo preparado se coloco en un tubo de plastico y se incubo con una solucion de heparina y glicerol (0,5 g de heparina USP y 5 mL de glicerol disueltos en 100 mL de agua DI, pH 9,6) a sesenta grados centigrados (60 °C) durante una hora (1 h). La eleccion de estos compuestos se basa en los resultados de los Ejemplos 2, 3 y 5. Cada dispositivo tratado se retiro de la solucion de heparina y glicerol y se expuso a un proceso de liofilizacion. El procesamiento y analisis posterior de los dispositivos fue identico al del Ejemplo 5, supra.
La Figura 13 es un grafico de barras que ilustra la capacidad de una composicion organica biologicamente compatible en la forma de glicerol y heparina, para mantener la actividad biologica de la heparina inmovilizada en un material de recubrimiento polimerico sobre un material de sustrato, tanto durante como despues de la exposicion a un regimen de esterilizacion con ETO y manipulacion mecanica en forma de compactacion y expansion del sustrato y el material de recubrimiento polimerico en el cual se inmovilizo la heparina. Todas las barras verticales representan los valores medios de n = 3 muestras.
Los materiales de sustrato recubierto con heparina inmovilizada que no recibieron las composiciones organicas biologicamente compatibles adicionales de glicerol y heparina y se expusieron a esterilizacion con ETO y compactacion y expansion diametrales mostraron una reduccion significativa en la actividad de union a la antitrombina III (63 pmol/cm2) en comparacion con los materiales de control similarmente construidos y tratados no sometidos a esterilizacion con ETO ni a compactacion y expansion diametrales (158 pmol/cm2). Cuando los materiales de sustrato recubiertos con heparina inmovilizada se trataron con una composicion organica biologicamente compatible de glicerol y heparina y se expusieron a las mismas condiciones de esterilizacion con ETO y manipulaciones mecanicas que la construccion no tratada, la actividad de union a la anti-trombina III de la heparina inmovilizada se mantuvo similar a los materiales de control (147 pmol/cm2).
Ejemplo 7*
Este ejemplo demuestra una actividad relativamente baja de union a la anti-trombina III de un dispositivo medico recubierto con heparina disponible comercialmente. El dispositivo era un injerto vascular recubierto con heparina de cincuenta centfmetros (50 cm) de largo, seis milfmetros (6 mm) de diametro, esterilizado, y empaquetado, disponible bajo el nombre comercial de injerto vascular recubierto con heparina FLOWLINE BIPORE® (numero de catalogo 15TW5006N) de JOTEC GmbH (Hechingen, Alemania). Segun el fabricante, el injerto vascular tubular esta hecho de un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) con heparina unida covalentemente y ionicamente a la superficie luminal del injerto. El fabricante afirma que la heparina esta unida de forma estable y permanente al ePTFE. Las superficies del injerto que contiene heparina se dice que son anti-tromboticas.
Se obtuvieron muestras (0,5 cm de largo) del injerto vascular que contiene heparina y se ensayaron como se describe en el Ejemplo 2, supra. Al igual que con los materiales de la invencion, la actividad de union a la anti- trombina III del injerto vascular se expreso como picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado del material de sustrato (pmol/cm2). Como en los ejemplos anteriores, se midio solo el area de la superficie luminal de cada dispositivo y no toda la superficie del dispositivo. Los resultados del ensayo de union a ATIII mostraron que no habfa actividad de union a la anti-trombina III a pesar de las reclamaciones por parte del fabricante de que la heparina biologicamente activa estaba presente en la superficie luminal del injerto vascular. Cabe senalar que el ensayo de actividad de union a la anti-trombina III es capaz de detectar la actividad de union a la anti-trombina III a un nivel de aproximadamente cinco picomoles por centfmetro cuadrado de material de sustrato (5 pmol/cm2 de material de sustrato) y por encima.
Ejemplo 8*
Este ejemplo describe el uso de un agente antibiotico peptfdico como una composicion organica biologicamente compatible conjuntamente con heparina biologicamente activa inmovilizada sobre un material de sustrato revestido o recubierto. La construccion presento una union significativa a ATIII despues de exposicion a esterilizacion con ETO.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2.
La construccion descrita anteriormente se expuso a una solucion de bacitracina (72.000 unidades/gramo) a una concentracion de 0,5 g por 100 mL de agua desionizada (agua DI) sumergiendo la construccion en cien mililitros (100 mL) de la solucion de bacitracina durante tres horas (3 h) a temperatura ambiente. Se retiro la construccion de la solucion y se liofilizo antes de la exposicion a un procedimiento de esterilizacion.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, cada construccion liofilizada se coloco y se sello en una bolsa de autosellado de una torre DUALPEEL® (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de
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etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperature de ajuste de cincuenta y cinco grados centigrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Despues de esterilizacion con ETO, se retiro cada construccion de su bolsa y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con una solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH, 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se cortaron de la construccion esterilizada muestras de la membrana (aproximadamente 1 cm2) y la heparina inmovilizada se midio en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Las muestras se mantuvieron humedas a lo largo de todo el procedimiento de ensayo. Los resultados se expresaron como picomoles de anti-trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra tratada con bacitracina y posteriormente esterilizada con oxido de etileno terna una actividad de union a la anti-trombina III de 9 pmol/cm2 (n = 3)-
Ejemplo 9*
Este ejemplo describe la adicion de una composicion organica biologicamente compatible a heparina biologicamente activa inmovilizada sobre un material de sustrato revestido o recubierto y previamente expuesto a esterilizacion con ETO. Se selecciono un agente antibiotico peptidico como la composicion organica biologicamente compatible en este ejemplo. Una construccion tratada de este modo tuvo una union significativa de la heparina a ATIII despues de exposicion a esterilizacion con ETO.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, cada construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de autosellado de una torre DUALPEEL® (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centigrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Despues de esterilizacion con ETO, la construccion se manipulo asepticamente en una cabina de seguridad biologica NUAIRE, clase II, tipo A/B3, modelo UN-425-600 (Plymouth, MN).
Se cortaron de la construccion muestras esterilizadas de aproximadamente un centimetre cuadrado (1 cm2) de tamano y se sumergieron en una solucion de bacitracina esterilizada por filtracion (649,4 mg a 77.000 unidades/g disueltos en 10 mL de solucion de irrigacion de cloruro de sodio al 0,9 % comprada de Hospira, Inc,) con una concentracion resultante de aproximadamente cinco mil (5000) unidades por mL de solucion de irrigacion de cloruro de sodio al 0,9 % de grado USP. Se expusieron las muestras a la solucion de bacitracina durante dos minutos (2 min) a temperatura ambiente.
Se retiraron las muestras de la solucion y se lavaron con agua DI durante quince minutos (15 min), con una solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuagaron con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se cortaron muestras del material en forma de lamina (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Las muestras se mantuvieron humedas a lo largo de todo el procedimiento de ensayo. Los resultados se expresaron como picomoles de anti-trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra que fue inicialmente esterilizada con oxido de etileno y posteriormente tratada con bacitracina terna una actividad de union a la anti-trombina III de 185 pmol/cm2 (n = 3). Como indican estos resultados, se puede mezclar un agente terapeutico con heparina biologicamente activa inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto despues de que la entidad haya sido esterilizada, sin reduccion significativa de su actividad biologica.
Ejemplo 10*
Este ejemplo demuestra la heparina biologicamente activa inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto que fue mezclada con una composicion organica biologicamente compatible, esterilizada con ETO, y finalmente tratada con un agente antibiotico peptidico. Una construccion tratada de este modo tiene una union significativa de heparina a ATIII.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ.
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bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2.
La construccion descrita anteriormente se expuso a una solucion de polietilenglicol (peso molecular 20.000, Sigma) a una concentracion de 0,5 g por 100 mL de agua DI ajustada a pH 9,6. La construccion se puso en un vaso de precipitados y se anadieron cien mililitros (100 mL) para sumergir completamente la construccion en la solucion de polietilenglicol. Se expuso la construccion a la solucion de polietilenglicol durante una hora (1 h) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Se retiro la construccion de la solucion y se liofilizo antes de la exposicion a un procedimiento de esterilizacion.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, la construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de autosellado Convertors® (Cardinal Health, McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Despues de esterilizacion con ETO, la construccion se manipulo asepticamente en una cabina de seguridad biologica NUAIRE, clase II, tipo A/B3, modelo UN-425-600 (Plymouth, MN).
Se cortaron de la construccion muestras esterilizadas de aproximadamente un centimetro cuadrado (1 cm2) de tamano y se sumergieron en una solucion de bacitracina esterilizada por filtracion (649,4 mg a 77.000 unidades/g disueltos en 10 mL de solucion de irrigacion de cloruro de sodio al 0,9 %) con una concentracion resultante de aproximadamente cinco mil (5.000) unidades por mL de solucion de irrigacion de cloruro de sodio al 0,9 % grado USP. Se expusieron las muestras a la solucion de bacitracina durante dos minutos (2 min) a temperatura ambiente.
Se retiraron las muestras de la solucion y se lavaron con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuagaron con agua DI durante quince minutos (15 min).
Se cortaron muestras de la membrana (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Las muestras se mantuvieron humedas a lo largo de todo el procedimiento de ensayo. Los resultados se expresaron como picomoles de anti-trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra que fue inicialmente tratada con polietilenglicol, esterilizada con oxido de etileno y despues tratada con bacitracina, tema una actividad de union a la anti-trombina III de 195 pmol/cm2 (n = 3). Por lo tanto, un material de sustrato recubierto esterilizado con heparina biologicamente activa inmovilizada sobre el mismo y una primera composicion organica biologicamente compatible (PEG) mezclada con ellos se pueden tratar ademas con una segunda composicion organica biologicamente compatible (bacitracina) despues de esterilizacion con ETO y mantienen una actividad significativa de union a ATIII.
Ejemplo 11*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la posterior union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (dextrano activado con aldetndo) al material de recubrimiento, Esta composicion se expuso a esterilizacion con ETO y despues de ella demostro una significativa actividad biologica de heparina.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406), Este material de ePTFE fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2, sin embargo, la construccion se conservo en agua DI despues de haber sido recubierta, en lugar de ser liofilizada.
La construccion descrita anteriormente recubierta con un material de recubrimiento se expuso a una solucion de dextrano activado con aldetndo (peso molecular 40.000, Pierce) (0,050 g de dextrano activado con aldetndo, 2,93 g de NaCl disueltos en 100 mL de agua DI, pH 5,5) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Se anadio un volumen de 0,286 mL de una solucion acuosa al 2,5 % (p/v) de NaCNBH3 a cien mililitros (100 mL) de solucion de dextrano activado con aldetndo antes de anadir la muestra.
Se retiro la construccion de la solucion de dextrano activado con aldetndo y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, la construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de
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autosellado Convertors® (Cardinal Health, McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Se cortaron muestras de la membrana esterilizada (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Los resultados se expresaron como picomoles de anti- trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra preparada como se ha descrito en este ejemplo, tema una actividad media de union a la anti-trombina III de 65 pmol/cm2 (n = 3). Este ejemplo demuestra que, en adicion a la heparina unida en el punto extremo unida covalentemente, una composicion organica biologicamente compatible, puede estar unida covalentemente a la capa de recubrimiento a la vez que se mantiene una actividad significativa de la heparina despues de esterilizacion con ETO.
Ejemplo 12*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la posterior union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (dextrano activado con aldehfdo, peso molecular 1000) al material de recubrimiento. Esta composicion se expuso a esterilizacion con ETO y despues de ella demostro una significativa actividad biologica de la heparina.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406), Este material de ePTFE fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2, sin embargo, la construccion se conservo en agua DI despues de haber sido recubierta, en lugar de ser liofilizada.
La construccion descrita anteriormente recubierta con un material de recubrimiento se expuso a una solucion de PEG activado con aldelmdo (peso molecular 1000, Nanocs) (0,20 g de PEG, 3,90 g de NaCl disueltos en 133 mL de agua DI, pH 5,5) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Se anadio un volumen de 0,380 mL de una solucion acuosa al 2,5 % (p/v) de NaCNBH3 a cien mililitros (100 mL) de solucion de PEG antes de anadir la muestra.
Se retiro la construccion de la solucion de PEG y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida el material de ePTFE.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, la construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de autosellado Convertors® (Cardinal Health, McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Se cortaron muestras de la membrana esterilizada (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Los resultados se expresaron como picomoles de anti- trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra preparada como se ha descrito en este ejemplo, tema una actividad media de union a la anti-trombina III de 96 pmol/cm2 (n = 3). Este ejemplo demuestra que, en adicion a la heparina unida en el punto extremo unida covalentemente, una composicion organica biologicamente compatible, puede estar unida covalentemente a la capa de recubrimiento a la vez que se mantiene una actividad significativa de la heparina.
Ejemplo 13*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la posterior union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol activado con aldelmdo, peso molecular 5000) con el material de revestimiento o recubrimiento. Esta composicion se expuso a esterilizacion con ETO y despues de ella demostro una significativa actividad biologica de la heparina.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406), Este material de ePTFE fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2, sin embargo, la construccion se conservo en agua DI despues de haber sido recubierta, en lugar de ser liofilizada.
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La construccion descrita anteriormente recubierta con un material de recubrimiento se expuso a una solucion de PEG activado con aldelmdo (peso molecular 5000, Nanocs) (0,20 g de PEG, 3,90 g de NaCI disueltos en 133 mL de agua DI, pH 5,5) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centigrados (60 °C). Se anadio un volumen de 0,380 mL de una solucion acuosa al 2,5 % (p/v) de NaCNBH3 a cien mililitros (100 mL) de solucion de PEG antes de anadir la muestra.
Se retiro la construccion de la solucion de PEG y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, la construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de autosellado Convertors® (Cardinal Health, McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Se cortaron muestras de la membrana esterilizada (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Los resultados se expresaron como picomoles de anti- trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra preparada como se ha descrito en este ejemplo, tema una actividad media de union a la anti-trombina III de 64 pmol/cm2 (n = 3). Este ejemplo demuestra que, en adicion a la heparina unida en el punto extremo unida covalentemente, una composicion organica biologicamente compatible, puede estar unida covalentemente a la capa de recubrimiento a la vez que se mantiene una actividad significativa de la heparina.
Ejemplo 14*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la posterior union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (heparina USP activada con EDC) al material de recubrimiento. Esta composicion se expuso a esterilizacion con ETO y despues de ella demostro una significativa actividad biologica de la heparina.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406), Este material de ePTFE fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2, sin embargo, la construccion se conservo en agua DI despues de haber sido recubierta, en lugar de ser liofilizada.
Se unio o se conjugo la heparina grado USP a la capa o capas de PEI que ya conteman heparina unida en el punto extremo, colocando la construccion en una solucion de sal de cloruro de sodio (1,5 g de heparina USP, 29,3 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 3,9) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Se transfirieron las construcciones a una solucion 0,1 M de MES [acido 2-(N-morfolino)etano-sulfonico], solucion salina tamponada de MES BupH™ (Pierce), 1,5 g de heparina USP, 29,3 g de NaCl, 0,20 g de hidrocloruro de N-(3- dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC), y 0,13 g de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) disueltos en 1 L de agua DI a pH 5,5 durante 4 horas (4 h) a temperatura ambiente.
Se retiro la construccion de la solucion descrita antes, y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, la construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de autosellado Convertors® (Cardinal Health, McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Se cortaron muestras de la membrana esterilizada (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Los resultados se expresaron como picomoles de anti- trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra preparada como se ha descrito en este ejemplo, tema una actividad media de union a la anti-trombina III de 31 pmol/cm2 (n = 3). Este ejemplo demuestra que, en adicion a la heparina unida en el punto extremo unida covalentemente, una composicion organica biologicamente compatible, puede estar unida covalentemente a la capa de recubrimiento a la vez que se mantiene una actividad significativa de la heparina.
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Ejemplo 15*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por una union covalente secundaria de la heparina a la capa de recubrimiento. Para conseguir la union covalente secundaria de la heparina unida en el punto extremo, se activan los grupos de acido carboxflico con EDC y se hacen reaccionar con los grupos de amina primaria restantes presentes en la capa de recubrimiento. Esta composicion se expuso a esterilizacion con ETO y despues de ella demostro una significativa actividad biologica de la heparina.
En este ejemplo, se obtuvo un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406), Este material de ePTFE fue provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2, sin embargo, la construccion se conservo en agua DI despues de haber sido recubierta, en lugar de ser liofilizada. Se transfirieron las membranas a una solucion 0,1 M de MES [acido 2-(N-morfolino)etano-sulfonico], solucion salina tamponada de MES BupH™ (Pierce), 29,3 g de NaCl, 0,20 g de hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N- etilcarbodiimida (EDC), y 0,13 g de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) disueltos en 1 L de agua DI a pH 5,5 durante 4 horas (4 h) a temperatura ambiente.
Se retiro la construccion de la solucion descrita antes, y se lavo con agua DI durante quince minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1000 mL de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente se enjuago con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE.
En la preparacion para esterilizacion con ETO, la construccion liofilizada, se coloco y se sello en una bolsa de autosellado Convertors® (Cardinal Health, McGaw Park, IL). La esterilizacion con oxido de etileno se llevo a cabo en condiciones de acondicionamiento durante una hora (1 h), un tiempo de permanencia de ETO gas de una hora (1 h), una temperatura de ajuste de cincuenta y cinco grados centfgrados (55 °C), y un tiempo de aireacion de doce horas (12 h).
Se cortaron muestras de la membrana esterilizada (aproximadamente 1 cm2) con heparina unida en el punto extremo y se midio la heparina inmovilizada en cuanto a la actividad de union a la anti-trombina III utilizando el ensayo de union a ATIII descrito anteriormente (Ejemplo 2). Los resultados se expresaron como picomoles de anti- trombina III unida por unidad de area superficial de sustrato (pmol/cm2).
La muestra preparada como se ha descrito en este ejemplo, tema una actividad media de union a la anti-trombina III de 20 pmol/cm2 (n = 3). Este ejemplo demuestra que, en adicion a la union covalente en el punto extremo, la heparina puede estar ademas unida covalentemente a una capa de recubrimiento, a la vez que se mantiene una actividad significativa de la heparina despues de la esterilizacion con ETO.
Ejemplo 16*
Este ejemplo describe el uso de un agente antibiotico peptfdico como una composicion organica biologicamente compatible conjuntamente con heparina biologicamente activa que es inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto. La construccion tiene una actividad de union a ATIII mayor que 5 pmol/cm2 despues de compactacion y expansion mecanicas.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Se aplica entonces bacitracina utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 8. Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces mecanicamente, se expanden mecanicamente, se enjuagan, se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra tratada con bacitracina y posteriormente compactada y expandida tiene una actividad de union a anti- trombina III mayor que 5 pmol/cm2
Ejemplo 17*
Este ejemplo describe la adicion de una composicion organica biologicamente compatible a la heparina biologicamente activa que es inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto y previamente compactada y expandida. Se selecciona un agente antibiotico peptfdico como la composicion organica biologicamente compatible. Una construccion tratada de este modo tiene una union de heparina a ATIII significativa despues de compactacion y expansion.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3 y se compactan y se expanden mecanicamente como se describe en el Ejemplo 5. La protesis endoluminal se trata entonces con bacitracina y se enjuaga como se describe en el Ejemplo 9. Las protesis endoluminales heparinizadas se cortan entonces para analisis, y se ensayan en cuanto a union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
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Una muestra heparinizada que es compactada y expandida, seguido por la adicion de bacitracina, tiene una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2
Ejemplo 18*
Este ejemplo describe heparina biologicamente activa inmovilizada sobre un material de sustrato recubierto. La heparina biologicamente activa inmovilizada se mezcla con una composicion organica biologicamente compatible, se compacta mecanicamente, se expande mecanicamente, y se trata con un agente antibiotico peptidico, Una construccion tratada de este modo tiene una union de heparina a ATIII significativa despues de la exposicion a manipulacion mecanica.
Las protesis endoluminales se tratan y se ensayan como se describe en el Ejemplo 17 con una excepcion; se mezcla polietilenglicol con la protesis endoluminal heparinizada, como se describe en el Ejemplo 10, antes de la compactacion y expansion.
Una muestra heparinizada mezclada con una composicion organica biologicamente compatible que es compactada y expandida, seguido por la adicion de bacitracina, tiene una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 19*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (dextrano activado con aldehndo) al material de recubrimiento. Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues de esto demuestra una significativa actividad biologica de la heparina.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Se inmoviliza dextrano activado con aldehndo sobre la capa de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 11. Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces mecanicamente, se expanden mecanicamente, se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra preparada como se describe en este ejemplo tiene una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 20*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol activado con aldehndo, peso molecular 1000) al material de recubrimiento. Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues de esto demuestra una significativa actividad biologica de la heparina.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Se inmoviliza polietilenglicol activado con aldehndo sobre la capa de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 12. Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces, se expanden, se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra preparada como se describe en este ejemplo tiene una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 21*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol activado con aldehndo, peso molecular 5000) al material de recubrimiento. Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues de esto demuestra una actividad biologica de la heparina significativa.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Se inmoviliza polietilenglicol activado con aldehndo sobre la capa de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 13. Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces, se expanden, se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra preparada como se describe en este ejemplo tiene una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 22*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (heparina USP activada con EDC) al 5 material de recubrimiento. Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues de esto demuestra una actividad biologica de la heparina significativa.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Se inmoviliza heparina USP sobre la capa de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 14. Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces, se expanden, se cortan para 10 analisis, y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra preparada como se describe en este ejemplo tiene una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2
Ejemplo 23*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa 15 de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por una union covalente secundaria de la heparina a grupos reactivos de la capa de recubrimiento. Para conseguir la union covalente secundaria de la heparina unida en el punto extremo, los grupos de acido carboxflico se activan con EDC y se hacen reaccionar con los grupos de amina primaria restantes presentes en la capa de recubrimiento. La composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas, Despues de esto la construccion demuestra una 20 actividad biologica de la heparina significativa.
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Una posterior union covalente de la heparina inmovilizada con la capa de recubrimiento se realiza como se describe en el Ejemplo 15.
Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces mecanicamente, se expanden mecanicamente, 25 se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 24*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa 30 de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la union adicional de una composicion organica biologicamente compatible mediante un enlace labil al material de recubrimiento. El enlace labil permite la administracion local de un compuesto terapeutico a la vez que la heparina unida de manera estable mantiene una actividad de union a ATIII significativa despues de la esterilizacion y compactacion y expansion mecanicas
35 En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Una heparina modificada con aldehfdo es unida en el punto extremo a la capa de recubrimiento mediante un enlace labil colocando la construccion en una solucion de sal de cloruro de sodio que contiene heparina (1,5 g de heparina modificada con aldehndo, 29,3 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 3,9) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Es importante observar que el agente 40 reductor; NaCHBH3, no se anade durante esta segunda conjugacion de heparina modificada con aldehndo. El enlace formado entre las aminas primarias y los aldehndos, cuando permanecen en estado no reducido, es labil. Las muestras se enjuagan entonces con agua DI durante 15 minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para 45 producir hepar4ina seca unida al material de ePTFE.
Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces como se describe en el Ejemplo 5 y se esterilizan como se describe en el Ejemplo 3. Se expanden despues, se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a anti-trombina III mayor 50 que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 25*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la union adicional de una composicion organica biologicamente compatible mediante un enlace labil al material de
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recubrimiento. El enlace labil permite la administracion local de un compuesto terapeutico a la vez que la heparina unida de manera estable mantiene una actividad de union a ATIII significativa despues de la compactacion y la expansion mecanicas
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Una heparina adicional modificada con aldefndo es unida en el punto extremo a la capa de recubrimiento mediante un enlace labil covalente colocando la construccion en una solucion de sal de cloruro de sodio que contiene heparina (1,5 g de heparina modificada con aldefndo, 29,3 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 3,9) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centigrados (60 °C). Es importante observar que el agente reductor; NaCHBH3, no se anade durante esta segunda conjugacion de heparina modificada con aldefndo. El enlace formado entre las aminas primarias y los aldefndos, cuando permanecen en el estado no reducido, es labil. Las muestras se enjuagan entonces con agua DI durante 15 minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE.
Las protesis endoluminales heparinizadas se compactan entonces, se expanden, se cortan para analisis, y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 26*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la union adicional de una composicion organica biologicamente compatible mediante un enlace labil al material de recubrimiento. El enlace labil permite la administracion local de un compuesto terapeutico a la vez que la heparina unida de manera estable mantiene una actividad de union a ATIII significativa despues de la esterilizacion con ETO
En este ejemplo, se obtiene un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y es provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2. Una heparina adicional modificada con aldefndo es unida en el punto extremo a la capa de recubrimiento mediante un enlace labil covalente colocando la construccion en una solucion de sal de cloruro de sodio que contiene heparina (1,5 g de heparina modificada con aldefndo, 29,3 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 3,9) durante ciento veinte minutos (120 min) a sesenta grados centfgrados (60 °C). Es importante observar que el agente reductor; NaCHBH3, no se anade durante esta segunda conjugacion de heparina modificada con aldefndo. El enlace formado entre las aminas primarias y los aldefndos, cuando permanecen en el estado no reducido, es labil. Las muestras se enjuagan entonces con agua DI durante 15 minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca unida al material de ePTFE.
El material heparinizado se esteriliza entonces, se corta para analisis, y se ensaya en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 2.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 27*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol activado con aldefndo) al material de recubrimiento con la adicion final de una composicion organica biologicamente compatible mezclada de manera no covalente (bacitracina). Esta composicion se expone a esterilizacion con ETO y despues demuestra una actividad biologica de heparina significativa
En este ejemplo, se obtiene un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y es provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2. Un polietilenglicol (peso molecular 1000) activado con aldefndo se une covalentemente al material de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 12 y se mezcla entonces bacitracina de manera no covalente con esta composicion como se describe en el Ejemplo 8. Se esteriliza entonces la composicion y se toman muestras como se describe en el Ejemplo 8 y la heparina inmovilizada se mide en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 2.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a la anti-trombina III
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50
mayor que 5 pmol/cm2 Ejemplo 28*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol activado con aldetndo) al material de recubrimiento con la adicion final de una composicion organica biologicamente compatible mezclada de manera no covalente (bacitracina). Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues demuestra una actividad biologica de heparina significativa
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Un polietilenglicol (peso molecular 1000) activado con aldetndo se une covalentemente al material de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 12 y se mezcla entonces bacitracina de manera no covalente con esta composicion como se describe en el Ejemplo 8. Entonces las protesis endoluminales heparinizadas se compactan mecanicamente, se expanden mecanicamente, se cortan para analisis, se enjuagan y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra preparada como se describe en este ejemplo tiene una actividad de union a la anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 29*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (dextrano activado con aldetndo) al material de recubrimiento con la adicion final de una composicion organica biologicamente compatible mezclada de manera no covalente (dexametasona). Esta composicion se expone a esterilizacion con eTo y despues demuestra una actividad biologica de heparina significativa
En este ejemplo, se obtiene un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y es provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2. Se une covalentemente dextrano activado con aldetndo al material de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 11 y se mezcla entonces dexametasona de manera no covalente con esta composicion que se esteriliza despues y se toman muestras como se describe en el Ejemplo 2. La heparina inmovilizada se mide en cuanto a la union a ATIII utilizando el ensayo de union a ATIII descrito en el Ejemplo 2.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a la anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 30*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la subsiguiente union covalente de una composicion organica biologicamente compatible (dextrano activado con aldetndo) al material de recubrimiento con la adicion final de una composicion organica biologicamente compatible mezclada de manera no covalente (dexametasona). Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues demuestra una actividad biologica de heparina significativa
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Dextrano activado con aldetndo se une covalentemente al material de recubrimiento como se describe en el Ejemplo 11 y se mezcla entonces dexametasona de manera no covalente con esta composicion como se describe en el Ejemplo 2. Entonces las protesis endoluminales heparinizadas se compactan mecanicamente, se expanden mecanicamente, se cortan para analisis, se enjuagan y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
La muestra preparada como se describe en este ejemplo tiene una actividad de union a la anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 31*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la union adicional de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol) mediante un enlace labil al material de recubrimiento, con la adicion final de una composicion organica biologicamente compatible mezclada de manera no covalente (dexametasona). Esta composicion se expone a esterilizacion con ETO y despues demuestra una actividad biologica de heparina significativa
5
10
15
20
25
30
35
En este ejemplo, se obtiene un material de ePTFE en forma de lamina de W.L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ. bajo la marca comercial GORE™ Microfiltration Media (GMM-406) y es provisto con un recubrimiento que contiene heparina utilizando un procedimiento sustancialmente equivalente al del Ejemplo 2. Se une a la capa de recubrimiento polietilenglicol (peso molecular 1000) modificado con aldehndo mediante un enlace covalente labil utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 12 incluyendo la adicion de NaCHBH3. Es importante observar que el agente reductor; NaCHBH3, no se anade durante la conjugacion de polietilenglicol modificado con aldehndo. El enlace formado entre las aminas primarias y los aldehndos, cuando permanecen en estado no reducido, es labil. Las muestras se enjuagan entonces con agua DI durante 15 minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca y polietilenglicol unidos al material de ePTFE. Entonces se anade y se mezcla dexametasona de manera no covalente con esta composicion como se describe en el Ejemplo 2. El material heparinizado se esteriliza despues, se toman muestras, y se mide la actividad de union a ATIII como se describe en el Ejemplo 2.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.
Ejemplo 32*
Este ejemplo demuestra la union covalente de heparina biologicamente activa a un material de recubrimiento o capa de recubrimiento colocado sobre un material de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) seguido por la union adicional de una composicion organica biologicamente compatible (polietilenglicol) mediante un enlace labil al material de recubrimiento, con la adicion final de una composicion organica biologicamente compatible mezclada de manera no covalente (dexametasona). Esta composicion se expone a compactacion y expansion mecanicas y despues demuestra una actividad biologica de heparina significativa
En este ejemplo, dispositivos medicos implantables en la forma de protesis endoluminales se heparinizan como se describe en el Ejemplo 3. Polietilenglicol (peso molecular 1000) modificado con aldehndo se une a la capa de recubrimiento mediante un enlace covalente labil utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 12 excluyendo la adicion de NaCHBH3. Es importante observar que el agente reductor; NaCHBH3, no se anade durante la conjugacion de polietilenglicol modificado con aldehndo. El enlace formado entre las aminas primarias y los aldehndos, cuando permanecen en estado no reducido, es labil. Las muestras se enjuagan entonces con agua DI durante 15 minutos (15 min), con solucion tampon de borato (10,6 g de acido borico, 2,7 g de NaOH y 0,7 g de NaCl disueltos en 1 L de agua DI, pH 9,0) durante veinte minutos (20 min), y finalmente con agua DI durante quince minutos (15 min) seguido por liofilizacion de la construccion entera para producir heparina seca y polietilenglicol unidos al material de ePTFE. Entonces se anade y se mezcla dexametasona de manera no covalente con esta composicion como se describe en el Ejemplo 2. Entonces las protesis endoluminales heparinizadas se compactan mecanicamente, se expanden mecanicamente, se cortan para analisis, se enjuagan y se ensayan en cuanto a la union a ATIII como se describe en el Ejemplo 5.
Las muestras preparadas como se describe en este ejemplo tienen una actividad de union a anti-trombina III mayor que 5 pmol/cm2.

Claims (29)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un dispositivo medico que comprende:
    un material de sustrato;
    un material de recubrimiento polimerico unido a al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, una pluralidad de entidades biologicamente activas que tienen actividad de union a la anti- trombina III unidas covalentemente a al menos una porcion de dicho material de recubrimiento polimerico, siendo dichas entidades biologicamente activas oligosacaridos o polisacaridos; y
    una composicion organica biologicamente compatible que es un polisacarido combinado de manera no covalente con dicho material de recubrimiento polimerico, siendo dicho polisacarido un glucosaminoglucano, dextrano o sulfato de dextrano,
    en donde dichas entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 5 picomoles de anti-trombina III por centfmetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la esterilizacion o compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  2. 2. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 6 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  3. 3. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 7 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  4. 4. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 8 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  5. 5. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 9 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  6. 6. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 10 picomoles de anti-trombina III por centimetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  7. 7. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas tienen una actividad de union a la anti-trombina III de al menos 100 picomoles de anti-trombina III por centfmetro cuadrado (pmol/cm2) de material de sustrato, despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  8. 8. El dispositivo medico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde al menos una porcion de dicha composicion organica biologicamente compatible se libera de dicho dispositivo medico en una solucion tampon de fosfato 0,15 M que tiene una temperatura de aproximadamente treinta y siete grados centfgrados y un pH sustancialmente neutro.
  9. 9. El dispositivo medico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas comprende un glucosaminoglucano.
  10. 10. El dispositivo medico de la reivindicacion 9, en donde dicha pluralidad de entidades biologicamente activas comprende heparina unida en el punto extremo.
  11. 11. El dispositivo medico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha composicion organica biologicamente compatible que es un polisacarido, es heparina.
  12. 12. El dispositivo medico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha composicion organica biologicamente compatible que es un polisacarido, es dextrano.
  13. 13. El dispositivo medico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha composicion organica biologicamente compatible que es un polisacarido, es sulfato de dextrano.
  14. 14. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicho material de recubrimiento polimerico comprende multiples capas, en donde los componentes qmmicos de al menos una capa estan reticulados.
  15. 15. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicho material de sustrato es de composicion polimerica.
  16. 16. El dispositivo medico de la reivindicacion 15, en donde dicho material de sustrato polimerico es de composicion fluoropolimerica.
    5
    10
    15
    20
    25
  17. 17. El dispositivo medico de la reivindicacion 16, en donde dicho material fluoropolimerico es politetrafluoroetileno.
  18. 18. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicho material de sustrato es de composicion metalica.
  19. 19. El dispositivo medico de la reivindicacion 18, en donde dicha composicion metalica es una aleacion metalica de mquel y titanio.
  20. 20. El dispositivo medico de la reivindicacion 18, en donde dicha composicion metalica es acero inoxidable.
  21. 21. El dispositivo medico de la reivindicacion 1, en donde dicho material de recubrimiento polimerico comprende al
    menos una capa de polietilen-imina.
  22. 22. El dispositivo medico de cualquier reivindicacion precedente, que comprende ademas una segunda composicion biologicamente compatible mezclada con el mismo, antes de la esterilizacion o compactacion y expansion de dicho dispositivo.
  23. 23. El dispositivo medico de la reivindicacion 22, en donde dicha segunda composicion biologicamente compatible es un agente antiproliferativo.
  24. 24. El dispositivo medico de la reivindicacion 23, en donde dicho agente antiproliferativo es dexametasona.
  25. 25. El dispositivo medico de cualquier reivindicacion precedente, que comprende una segunda composicion biologicamente compatible mezclada con el mismo, despues de la esterilizacion o compactacion y expansion de dicho dispositivo.
  26. 26. El dispositivo medico de la reivindicacion 25, en donde dicha segunda composicion biologicamente compatible es un agente antimicrobiano.
  27. 27. El dispositivo medico de la reivindicacion 26, en donde dicho agente antimicrobiano es bacitracina.
  28. 28. Un dispositivo medico segun la reivindicacion 1, que comprende un material de sustrato con una pluralidad de entidades qmmicas que tienen actividad de union a la anti-trombina III presentes sobre al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, en donde al menos el noventa por ciento de dicha actividad de union a la anti-trombina III se mantiene despues de la compactacion y expansion de dicho material de sustrato.
  29. 29. Un dispositivo medico esterilizado segun la reivindicacion 1, que comprende un material de sustrato con una pluralidad de entidades qmmicas que tienen actividad de union a la anti-trombina III presentes sobre al menos una porcion de una superficie de dicho material de sustrato, en donde al menos el noventa por ciento de dicha actividad de union a la anti-trombina III se mantiene despues de la esterilizacion de dichas entidades qmmicas.
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