ES2622153T3 - Una antraciclina para el tratamiento de la sepsis - Google Patents

Abstract

Antraciclina para la utilización en el tratamiento de la sepsis, en la que la antraciclina se selecciona entre epirrubicina, doxorrubicina y daunorrubicina y se administra una vez, tan pronto como sea posible, después del diagnóstico y de nuevo 24 horas más tarde, en la misma dosificación, en una dosis total de 1,2 μg/g de peso corporal para epirrubicina y daunorrubicina o en una dosis total de 1,0 μg/g de peso corporal para doxorrubicina.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Una antraciclina para el tratamiento de la sepsis SECTOR DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere al sector de los medicamentos para el tratamiento de la sepsis, en particular, la sepsis grave, mediante la utilizacion de antraciclinas, a saber, epirrubicina, doxorrubicina y daunorrubicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La inflamacion es una respuesta a los estimulos nocivos que limita el dano de los tejidos y tiene como objetivo restablecer la homeostasis4. El huesped percibe patrones moleculares asociados a patogenos (PAMP) en los microorganismos y patrones moleculares asociados al dano (DAMP) procedentes de las celulas moribundas a traves de receptores de reconocimiento de patron codificados por la linea germinal (PRR) que reconocen estructuras de firma conservadas en no auto y en auto5-7. Estos sensores estan presentes tanto en celulas inmunitarias profesionales (que incluyen neutrofilos, macrofagos y celulas dendriticas) como en no profesionales y su activacion inicia cascadas de senalizacion intracelular que conducen a la expresion transcripcional de mediadores inflamatorios, tales como citoquinas y quimioquinas. Es necesario que la inflamacion se termine de forma eficaz despues de la eliminacion del activador original y la reparacion del tejido danado. En el huesped susceptible, la sobreproduccion de mediadores inflamatorios o una respuesta exagerada a su presencia puede llevar a shock septico, a la destruccion del tejido, a perdida permanente de funcion, a inmunodeficiencia o a autoinmunidad8.

La sepsis es una afeccion mortal que surge como una respuesta inflamatoria sistemica a una infeccion9. Se inicia por una superproduccion de mediadores proinflamatorios que conducen potencialmente a una funcion cardiaca reducida, a una permeabilidad vascular aumentada y al desequilibrio metabolico que finalmente causa el fallo multiorganico y la muerte10. La sepsis incluye un continuo de condiciones que oscilan entre el sindrome inflamatorio sistemico (SIRS), que puede progresar a fallo multiorganico y finalmente a shock septico y a la muerte11. La sepsis es la principal causa de muerte en unidades de cuidados intensivos y la tercera causa de mortalidad hospitalaria12,13. La incidencia de sepsis y su carga economica ha aumentado en las ultimas decadas un 1% cada ano13,4 y, a pesar de una mejora significativa en el diagnostico y las medidas de soporte, las tasas de mortalidad aun oscilan, como minimo, entre menos del 10% en SIRS hasta casi el 80% en el shock septico. La fisiopatologia de la sepsis sigue sin entenderse bien. Como resultado, los elementos basicos del tratamiento (antibioticos, control de la fuente de infeccion y soporte de organos) no han cambiado significativamente en los ultimos cincuenta anos, y las tentativas de traducir los resultados basicos de la investigacion en nuevas intervenciones eficaces han tenido un exito limitado o ningun exito11.

La sepsis es un sindrome heterogeneo y dinamico causado por disfuncion inmunitaria que puede asumir diferentes aspectos de forma temporal y en componentes diferentes del sistema inmunitario. Por ejemplo, la etapa temprana de la sepsis se caracteriza por un ambiente hiperinflamatorio debido a la activacion abrumadora de las respuestas inmunitarias innatas por infeccion o dano de tejido, mientras que los momentos posteriores se pueden describir mejor como un estado inmunosupresor10. El paso temprano de iniciacion es dependiente de factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina 1p(IL-1p) y la fase progresiva retardada y lenta, dependiente de mediadores tardios, tales como el grupo de alta movilidad de caja-1 (HMGB1)13.

De la forma mas comun, la sepsis se desencadena por una infeccion bacteriana que causa una produccion excesiva de mediadores preinflamatorios, que incluyen las TNF e IL-1 p iniciales criticas, lo que conduce a la activacion de cascadas de senalizacion en espiral, que causan, en ultimo lugar, el fallo multiorganico y la muerte10. Los inventores de la presente invencion realizaron cribados quimicos y geneticos, que los condujeron a la identificacion del grupo de antraciclinas como inhibidores potentes de su secrecion y a la identificacion de ATM como regulador negativo de la inflamacion. Las antraciclinas confieren una fuerte proteccion al modelo en raton de sepsis incrementando la tolerancia a la carga de la infeccion, sin aumentar la muerte de las bacterias. A nivel molecular, inhiben el programa de inflamacion inducido por bacterias, de una manera parcialmente dependiente de ATM. Especificamente, se requiere ATM para la proteccion in vivo contra la sepsis, lo que se basa en la inhibicion de mediadores inflamatorios, la induccion de autofagia y la proteccion del dano en organos diana.

DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa un cribado primario para identificar los compuestos en la biblioteca de la coleccion de espectros que inhiben la secrecion de TNF e IL-1 p. (A) es un diagrama de dos dimensiones de los resultados Z de produccion de TNF e IL-1 p, calculados despues del desafio de celulas THP-1 con E. colifijada en PFA durante 24 horas en presencia de 10 pMI de cada compuesto. El cuadrado define el area en la que los compuestos se consideran exitos primarios, es decir, inhibicion tanto de TNF como de IL-1 p, (B) representa la produccion de IL-1 p y TNF por celulas THP-1 expuestas a E. coli (4 horas) despues de una preincubacion (1 hora) con concentraciones crecientes de epirrubicina. Los resultados que se muestran representan la media ± desviacion estandar en muestras por triplicado en uno de tres ensayos independientes. (C) es una identificacion transcripcional de la respuesta de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

linea celular THP-1 a la epirrubicina y la agrupacion no supervisada de perfiles de expresion de micromatrices. Los datos de expresion normalizada de micromatrices a partir de dos muestras replicadas de celulas THP-1 sin tratar

(Control_1 y Control_2) y celulas The-1 expuestas a E Colifijada en PFA (E.coli_1 y E.coli_2), epirrubicina (Epi_1 y

Epi_2) o ambas (E.coli+Epi_1 y E.coli+Epi_2) se utilizaron para llevar a cabo un analisis de agrupacion despues de filtrar los genes con baja expresion o bien con baja variacion entre las muestras. El gradiente de color indica la variacion en los niveles de expresion dentro de un intervalo de log2 de -2 a 2, despues de centrar la media de los valores de expresion de genes. La clasificacion GO de genes en agrupaciones seleccionadas (Agrupacion Ecoli1 a 3 y Agrupacion Epi1 a 4) se indica a la derecha. Las lineas verticales marcan la localizacion de las agrupaciones en el arbol de genes. (D) se refiere a la validacion por RT-qPCR de datos de micromatrices. Los graficos indican la expresion relativa de IL-1p, TNF, CCL2, CXCL10, STAT1, STAT2, STAT4 y STAT5a, tal como se calcula por qRT- PCR en celulas THP-1 expuestas a E coli (4 horas) despues de la preincubacion (1 hora) con epirrubicina 5 pM. Los resultados que se muestran representan el numero medio de moleculas de ARNm de cada gen por molecula de ARNm de GAPDH ± desviacion estandar a partir de muestras por triplicado.

La figura 2 muestra que la epirrubicina protege contra CLP grave. (A) y (B) se refieren a la supervivencia de los animales de tipo salvaje C57BL/6 sometidos a (A) CLP o (B) inyeccion de LPS letal con vehiculo (PBS) o epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) en el momento del procedimiento y 2< horas mas tarde. NS, no significativo; **P<0,01; ****P<0,0001 (prueba de orden logaritmico (Mantel-Cox) para 2A, 2B y prueba de Mann-Whitney para 2C). (C) muestra la carga polimicrobiana (UFC) en la sangre de animales C57BL/6 sometidos a CLP en puntos temporales indicados. Tratamiento con PBS y epirrubicina, tal como anteriormente. Cada circulo representa animales individuales. Las barras son valores de la media ± SEM. La epirrubicina contrarresta la inflamacion y el dano del tejido asociado con CLP. Cuando se indica (+) animales C57HL/6 recibieron PBS (n=3) o epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) (n = 3) a las 0 y 24 horas despues de la CLP. (D) representa concentraciones plasmaticas de TNF, (E) de IL-1 p, (F) de IL-6 y (G) de HMCB1, 24 horas despues de la CLP. Los resultados que se muestran representan valores de la media ± SEM a partir de lecturas por triplicado por animal. Se presentan las mediciones de (H) LDH, (I) CK, (J) ALT y (K) urea en plasma de animales C57BL/6 que experimentan CLP y tratados con la misma dosis y programacion, tal como anteriormente. Los resultados que se muestran representan valores de la media ± SEM a partir de lecturas por duplicado por animal (n=5).

La figura 3 muestra que los efectos antiinflamatorios de la epirrubicina estan mediadas por ATM (A) es un diagrama de puntuaciones Z, ordenadas en orden ascendente, de la produccion de IL-1 p por las celulas THP-1 despues del silenciamiento de genes diana (“knockdown”) utilizando un grupo seleccionado de construcciones de la biblioteca de vectores lentivirales ARNsh TRC seguido por la estimulacion de E. coli fijada con PFA durante 24 horas. Cada punto representa una construccion individual. El circulo rojo define el area en la que los compuestos se consideran aciertos primarios. (B) se refiere a un analisis por citometria de flujo de la forma activada del ATM, fosforilada en la serina 1981, en celulas THP-1 dejadas sin tratamiento o tratadas con epirrubicina sola (1 pM) (5 horas), expuestas a E. coli fijada con PFA (4 horas) o E. coli (4 horas) mas el tratamiento previo con epirrubicina (1 hora). (C) representa la produccion de IL-1 p y TNF por celulas THP-1 expuestas a E. coli (4 horas) despues de una preincubacion (1 hora) con PBS, epirrubicina (1 pM) o epirrubicina mas KU-55933 (2 pM) cuando se indica (+). Los resultados que se muestran representan la media ± desviacion estandar a partir de muestras por triplicado en uno de 3 ensayos independientes. (D) se refiere a la expresion de IL-1 p, TNF, CCL2 y CXCL10, tal como se calculan por qRT-PCR en celulas THP-1 tratadas tal como en (C). Los resultados que se muestran representan el numero medio de moleculas de ARNm de cada gen por molecula de ARNm de GAPDH ± desviacion estandar a partir de muestras por triplicado.

La figura 4 muestra que la proteccion dependiente de ATM de la epirrubicina contra la CLP se basa en la induccion de autofagia. (A) representa la supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje y Atm-/- sometidos a CLP y tratados con PBS o epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) en el momento del procedimiento y 24 horas mas tarde. (B) representa la supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje tratados con PBS, etoposida y epirrubicina sometidos a CLP. La dosis de etoposida fue de 2,0 pg/g de peso corporal. La dosis de epirrubicina y la programacion de tratamiento, tal como en (A). (C) es un analisis por citometria de flujo de la induccion de autofagia en: (i) celulas THP-1 sin tratamiento o con pretratamiento con epirrubicina (1 pM) (1 hora) y expuestas a E. coli fijada con PFA (4 horas) (histograma superior) o (ii) celulas THP-1 pretratadas con KU-55933 (2 pM) o epirrubicina (1 pM) mas KU-55933 (2 pM) (1 hora) y expuestas a E. Coli fijada con PFA (4 horas) (histograma inferior). (D) representa una supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje y LC3b-/- sometidos a CLP y tratados con PBS o epirrubicina en la dosis y la programacion tal como en (A). *P<0,05; ** p<0,01; ***P<0,001 (prueba del orden logaritmico (Mantel-Cox)). La epirrubicina confiere proteccion contra CLP grave de manera terapeutica. (E) se refiere a la supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje sometidos a CLP tratados con epirrubicina (0-6 pg/g de peso corporal) en el tiempo indicado en ausencia de meropenem (panel izquierdo superior); con una administracion de meropenem (40 pg/g de peso corporal/dia) empezando en el momento del procedimiento (panel superior derecho) o con el tratamiento con meropenem (40 pg/g de peso corporal/dia) empezando 12 horas despues de la CLP (panel inferior izquierdo).

La figura 5 muestra que las antraciclinas inhiben la secrecion de TNF e IL-1 p. La produccion de TNF por celulas The- 1 expuestas a E. coli (4 horas) despues de una preincubacion (1 hora) con concentraciones crecientes de daunorrubicina, doxorrubicina y epirrubicina. Los resultados que se muestran representan la media ± desviacion estandar de muestras por triplicado en uno de 3 ensayos independientes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La figura 6 muestra que otra antraciclina, ademas de la epirrubicina, protege contra la CLP grave. Supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje sometidos a CLP tratados con vehfculo (PBS), epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal), doxorrubicina (0,5 ug/g de peso corporal) o daunorrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) en el momento del procedimiento y 24 horas mas tarde.

La figura 7 muestra que la epirrubicina no contrarresta la migracion de celulas inflamatorias al sitio de la inflamacion. Cuantificacion de (A) celulas totales (B) neutrofilos, (C) macrofagos, (D) celulas B, linfocitos (E) CD4 T y (F) CD8 T en la cavidad peritoneal 18 horas despues de la CLP de animales C57EL/6 de tipo salvaje tratados con PBS o epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) en el momento del procedimiento.

La figura 8 representa la produccion de radicales libres en las celulas THP-1, tal como se determina por citometna de flujo con CM-H2DCFDA. Las celulas se dejaron sin tratamiento o, cuando se indica (+), se pretrataron con epirrubicina (1 mM) (1 hora) o epirrubicina (1 mM) mas KU-55933 (2 mM) (1 hora) y se expusieron a E. colifijada con PFA (4 horas). Los resultados que se muestran representan la intensidad de la media normalizada de control de valores de fluorescencia ± error estandar de la media de tres experimentos independientes.

La figura 9 se refiere a la supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje y Nrf2-/- sometidos a CLP y tratados con PBS o epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) a las 0 y 24 horas despues de la CLP.

La figura 10 se refiere a la supervivencia de animales C57BL/6 de tipo salvaje y miR-145a-/- sometidos a CLP y tratados con PBS o epirrubicina (0,6 pg/g de peso corporal) a las 0 y 24 horas despues de la CLP.

La figura 11 presenta la evolucion temporal de la induccion de miR-146a en respuesta al tratamiento con epirrubicina de celulas tHp-1 expuestas a E. coli fijada con PFA, tal como se mide por RT-qPCR.

CARACTERISTICAS DE LA INVENCION

La sepsis sigue siendo una afeccion inflamatoria sistemica mal entendida con altas tasas de mortalidad y limitadas opciones terapeuticas ademas de las medidas de soporte de organos1. De la forma mas frecuente, la sepsis se desencadena por una infeccion bacteriana que causa una produccion excesiva de mediadores proinflamatorios, incluyendo el factor de necrosis tumoral (TNF) crftico inicial e interleuquina 1p (IL-1p), que conduce a la activacion de cascadas de senalizacion en espiral, que en ultima instancia causan fallo multiorganico y la muerte2,3. En el presente documento los inventores de la presente invencion utilizan un cribado de farmacos para identificar el grupo aprobado clmicamente de las antraciclinas como potentes inhibidores in vitro de dos iniciadores claves de la sepsis, TNF e IL- 1p. In vivo, las antraciclinas confieren una proteccion fuerte contra la sepsis grave inducida por ligadura y puncion cecal (CLP) en ratones. Este efecto protector se basa en la induccion de autofagia y en un programa antiinflamatorio que aumenta la tolerancia a la infeccion sin reducir la carga bacteriana. Utilizando un cribado basado en ARNsh, los inventores de la presente invencion identificaron el ataxia telangiectasia mutado (ATM) como mediador del efecto protector de las antraciclinas. Los ratones deficientes en ATM (Atm-/-) son refractarios a este efecto protector sucumbiendo a sepsis grave con cinetica similar a los ratones de tipo salvaje no tratados. Los resultados de los inventores de la presente invencion identifican el grupo de las antraciclinas como opciones terapeuticas eficaces en sepsis y ATM como una diana molecular potencial en condiciones impulsadas por la inflamacion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

A efectos de identificar moleculas pequenas que inhiben simultaneamente la secrecion de TNF e IL-1 p, los inventores de la presente invencion llevaron a cabo un cribado qufmico utilizando 2.320 compuestos. Los inventores de la presente invencion identificaron 45 candidatos principales (figura 1A y tabla I) que inhiben ambas citoquinas.

Tabla I

Lista de farmacos candidatos con efecto simultaneo sobre la secrecion de TNF e IL-IL-1 p ordenados segun la puntuacion de TNF

ID

Compuesto puntuacion Z de TNFa puntuacion Z de IL1 b

1505708

Clorhidrato de epirrubicina -4,474857631 -1,212875226

300037

Acetato de Crasin -4,448741528 -2,126298968

1501193

Erysolin -4,442389411 -1,162701697

1504079

Tomatina -4,440219344 -2,626087357

330001

Dactinomicina -4,13760156 -1,187827575

1505483

Doxorrubicina -4,071115136 -2,412138965

200007

Acido gambogico -3,862359373 -1,529656531

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Antraciclina para la utilizacion en el tratamiento de la sepsis, en la que la antraciclina se selecciona entre epirrubicina, doxorrubicina y daunorrubicina y se administra una vez, tan pronto como sea posible, despues del

   5 diagnostico y de nuevo 24 horas mas tarde, en la misma dosificacion, en una dosis total de 1,2 |xg/g de peso corporal para epirrubicina y daunorrubicina o en una dosis total de 1,0 |xg/g de peso corporal para doxorrubicina.
2. 2. Antraciclina, para la utilizacion, segun la reivindicacion 1, que es epirrubicina.

   10 3. Antraciclina, para la utilizacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el tratamiento de sepsis grave.

   imagen1

   imagen2

   Fig. 2

   UFC/ml

   imagen3

   Horas

   f.> -£■ <51 ct> a

   imagen4

   CD

   Porcentaje de supervivencia

   imagen5

   o

   >

   imagen6

   imagen7

   imagen8

   imagen9

   imagen10

   Fig. 2 (continuacion)

   dm Z uopenjund

   imagen11

   Expresion

   relativa

   ATMI E call

   Secrecion de citoquina, O

   pg/mL/celula

   imagen12

   Porcentaje de Porcentaje de Porcentaje de

   supervivencia supervivencia supervivencia

   A. B

   imagen13

   imagen14

   D

   imagen15

   imagen16

   imagen17

   imagen18

   imagen19

   -■-PBS n=10 -■-Epi a 0horasn=10 -*-Epia 3horasn=10 — Epi a 6horas n=10 Epi a 12horasn=10 Epi a 24horasn=1Q

   imagen20

   imagen21

   imagen22

   (pg/ml/celula)

   imagen23

   imagen24

   imagen25

   -P^

   T|

   <5‘

   ■

   ■*vj

   Numero de celulas

   m

   Numero de celulas

   o

   Niimero de celulas

   imagen26

   imagen27

   imagen28

   Porcentaje de

   imagen29

   Epirrubicina (1uM) - - - + +

   ATMi (2uM) - - + - +

   Fig. 8

   imagen30

   Fig. 9

   expresion de miR-146a, veces de induction

   imagen31

   Horas despues de la CLP Fig. 10

   Porcentaje de supervivencia

   ro cd co o

   o o o o o o

   imagen32