ES2614251T3 - Análisis de diagnóstico para diabetes tipo 1 - Google Patents

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Abstract

Un análisis de diagnóstico para evaluar el riesgo de diabetes tipo 1 (DT1) que comprende determinar la presencia de al menos un riesgo o al menos un serotipo de enterovirus protector en una muestra corporal, por lo que la presencia de al menos un serotipo de riesgo seleccionado del grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, VCA4, VCA5, VCA6 y VCA16 indica un mayor riesgo de contraer DT1, o la presencia de al menos un serotipo protector seleccionado del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11 y Echo13 indica un menor riesgo de contraer DT1.

Description

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DESCRIPCION
Analisis de diagnostico para diabetes tipo 1 Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un analisis de diagnostico para diabetes tipo 1 (DT1), y especialmente a un analisis para predecir el riesgo de contraer la enfermedad. Tambien se refiere a un metodo de seguimiento de la eficacia de los tratamientos antivlricos destinados a la prevencion de DT1. La invencion se refiere aun mas a un equipo de diagnostico.
Antecedentes de la invencion
La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad grave que se ha vuelto cada vez mas frecuente ya a una edad muy temprana. En la diabetes tipo 1 las celulas beta del pancreas se destruyen, lo que conduce a la carencia de insulina. Se cree que la destruccion de las celulas beta que es causada por una respuesta autoinmunitaria, que a su vez se supone que esta provocada por una infeccion vlrica.
La relacion entre enterovirus y diabetes tipo 1 (DT1) se ha documentado en multiples estudios. Se han detectado enterovirus en el pancreas, la sangre y la mucosa intestinal de pacientes con diabetes tipo 1 con mas frecuencia que en los pacientes de referencia y estudios prospectivos han apoyado su funcion en el inicio del proceso de dano de las celulas beta relacionado con la diabetes tipo 1.
La diabetes tipo 1 se diagnostica normalmente basandose en los slntomas cllnicos cuando el proceso de danado de las celulas beta ya ha comenzado y la enfermedad se ha desencadenado. Sin embargo, con el fin de prevenir o poner de manifiesto el proceso de la enfermedad es deseable identificar pacientes en situacion de riesgo de contraer DT1 en una fase temprana, mucho antes de los slntomas cllnicos.
La asociacion sugerida entre enterovirus y DT1 abre nuevas posibilidades para predecir el riesgo de contraer la enfermedad. Sin embargo, el problema es que el conocimiento acerca de que serotipos pueden causar la enfermedad es limitado e incluso contradictorio.
El grupo de los enterovirus incluye mas de 100 serotipos diferentes. Las infecciones por enterovirus son habitualmente asintomaticas, pero tambien pueden causar diversos tipos de enfermedades. Por ejemplo, poliovirus, virus coxsackie B (VCB), virus coxsackie A (VCA) y virus ECHO (E o Echo), as! como enterovirus numerados son los enterovirus conocidos que estan involucrados en el desarrollo de una variedad de enfermedades. El espectro de serotipos responsables varla mucho de una enfermedad a otra, e incluso en una enfermedad como la diabetes tipo 1 los serotipos exactos no han sido plena y fiablemente identificados.
De hecho, estudios previos que describen la asociacion entre enterovirus y DT1 no pudieron discriminar entre serotipo o se restringieron a informes de casos. Algunos estudios han sugerido que los serotipos de VCB pueden ser importantes (Yoon et al., 1979 New Eng. J. Med., vol. 300, pag. 1173 ; Hindersson M., et al., 2005, J. Clin. Virol. vol. 33 pag. 158; Dotta F. et al., 2007, PNAS 104: 5115 ). Sin embargo, otros serotipos de enterovirus tambien se han descrito esporadicamente (Cabrera-Rode et al., 2003, Diabetologia; Williams et al., 2006, J. Clin. Micro. vol. 44 pag. 441).
Shibasakti et al., 2010. Endocrine Journal, vol. 57(3): 211-219 expone la posible implicacion de infecciones vlricas incluidas entre otras CAV4-CAV6 en la patogenia de la diabetes tipo 1 fulminante, pero no se encuentra ninguna prueba directa para la funcion patogena de los virus en la destruccion de las celulas beta. La diabetes tipo 1 fulminante difiere de la diabetes tipo 1 clasica en que no esta relacionada con una respuesta autoinmunitaria de los linfocitos T, sino con un proceso inflamatorio dominado por macrofagos provocado por virus.
En el documento WO01/00236 (Hyoty et al.) se encontraron los siguientes enterovirus no de poliomielitis en ninos diagnosticados con diabetes tipo 1: serotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de VCB, serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y 30 de virus echo, serotipos 9 y 16 de VCA. Sin embargo, no hay datos en cuanto a la funcion de cada uno de los serotipos enumerados, a excepcion de algunos analisis en animales con VCB3. Una publicacion mas reciente documento US2010/0047273 (Rappuoli et al.) encontro una asociacion determinada entre VCB4 y la diabetes tipo 1.
Filippi et al, 2008. Diabetes 57:2863-2871 es una resena sobre la funcion de los enterovirus en la diabetes tipo 1. Se exponen los resultados obtenidos en ratones NOD que demuestran una relacion entre VCB4 y la diabetes o ninguna relacion entre VCB3 y la diabetes. Cabe esperar que puede haber una diferencia fundamental entre roedores y seres humanos a este respecto. La relacion entre el virus y diabetes se dice que es sumamente compleja basandose en los estudios en ratones. Se cree que determinados virus son capaces tanto de provocar como de prevenir la diabetes en el mismo modelo de raton dependiendo del tiempo de infeccion.
Hyoty, 2009, J. Med. Virol. 81:197-198 da una vision general de la relacion entre enterovirus y diabetes tipo 1. El efecto del riesgo de enterovirus no se confirmo en todos los estudios prospectivos.
Jaidane et al., Reviews in Medical Virology, sep. 2010, vol. 20, n° 5, 21 de abril de 2010, paginas 265-280 es una
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resena sobre la relacion entre los enterovirus y DT1.
Oikarinen et al., Diabetes, vol. 60, n° 1, octubre de 2010, paginas 276-279 describe la deteccion de ARN de enterovirus en la sangre para evaluation de riesgos de DT1 en ninos y llega a la conclusion de que los enterovirus pueden desempenar una funcion en el inicio del proceso de lesion de las celulas beta.
Por el momento no hay consenso en la tecnica anterior en cuanto al impacto de los serotipos de enterovirus en el desarrollo de la diabetes tipo 1. Todavla hay gran necesidad de desarrollar medios y metodos eficaces para predecir el riesgo de contraer diabetes tipo 1, y de diagnosticar la enfermedad en una fase temprana. Tambien hay necesidad de controlar el efecto de los tratamientos antivlricos utilizados para la prevention de la diabetes tipo 1. La presente invencion satisface estas necesidades.
Sumario de la invencion
La presente invencion radica en el descubrimiento sorprendente de que determinados serotipos de enterovirus son significativamente mas diabetogenos que otros, y que, ademas hay serotipos que tienen un un efecto opuesto, es decir muy protector sobre la diabetes tipo 1.
La induction de resistencia a los virus heterotlpicos ha sido previamente descrita por Landau B. J. et al., Microbial Pathogenesis 1990:8 289-298 , pero no en relacion con la diabetes. Dicha publication describe un aumento de la resistencia contra la lesion del hlgado, corazon y pancreas producidas por la infection por VCB1 en ratones vacunados con VCB3. Se descubrio que VCB3 produce dano subtotal en las celulas acinares pancreaticas, mientras VCB1 producla necrosis total de celulas acinares. Cuando los ratones vacunados con VCB3 se sometieron a la prueba de provocation con VCB1 no ocurrio aumento del dano a las celulas acinares pancreaticas existentes. De destacar, sin embargo, fue que se encontro que ni VCB3 ni VCB1 afectan a las celulas de los islotes productoras de insulina, es decir, las celulas beta del pancreas.
Los presentes inventores han descubierto que los ninos que hablan estado en contacto con, por ejemplo VCB3 o VCB6 tenlan un riesgo reducido de contraer diabetes tipo 1, mientras que otros que hablan estado en contacto con, p. ej. VCB1 o VCB2 tenlan mayor riesgo. VCB1 resulto estar significativamente mas fuertemente relacionada con el riesgo de contraer diabetes tipo 1 que cualquier otro serotipo de enterovirus. Por primera vez se ha demostrado la relacion entre infeccion por determinados serotipos de enterovirus y la aparicion de DT1 en seres humanos, en un extenso estudio prospectivo de casos de referencia. Llama la atencion que entre todos los serotipos estudiados los que presentaban el riesgo o efecto protector mas marcados perteneclan al grupo VCB. Esto es aun mas sorprendente cuando se tiene en cuenta el bajo numero de serotipos VCB (seis).
El hallazgo de la division de enterovirus en serotipos protectores y de riesgo abre nuevas implicaciones del diagnostico en la prediction de la diabetes tipo 1.
La presente invencion proporciona un analisis de diagnostico para evaluar el riesgo de diabetes tipo 1 (DT1) que comprende determinar la presencia de al menos un riesgo o al menos un serotipo de enterovirus protector en una muestra corporal, por lo que:
la presencia de al menos un serotipo de riesgo seleccionado del grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, VCA4, VCA5, VCA6, y VCA16 indica un mayor riesgo de contraer DT1, o la presencia de al menos un serotipo protector seleccionado del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11, y Echo13 indica un menor riesgo de contraer DT1.
La presente invencion proporciona ademas un metodo para el seguimiento de la eficacia de los tratamientos antivlricos destinados a la prevencion de la DT1, que comprende proporcionar una muestra de un paciente que ha recibido tratamiento antivlrico, y determinar la presencia de al menos un riesgo o al menos un serotipo de enterovirus protector en la muestra, por lo que
la presencia de al menos un serotipo de riesgo seleccionado del grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, VCA4, VCA5, VCA6 y VCA16 indica que el tratamiento no ha reducido el riesgo de contraer DT1, o
la presencia de al menos un serotipo protector seleccionado del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11 y Echo13 indica que el tratamiento ha reducido el riesgo de contraer DT1.
Aun mas, la invencion proporciona la utilization in vitro de un equipo de diagnostico en donde el equipo comprende medios para determinar la presencia de al menos un riesgo y al menos un serotipo de enterovirus protector en una muestra corporal, por lo que el serotipo de riesgo se selecciona del grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, vCa4, VCA5, VCA6, y VCA16, y el serotipo protector se selecciona del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11 y Echo13.
Algunas realizaciones preferidas de la invencion se exponen en las reivindicaciones dependientes. Otros objetos, detalles y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de los siguientes dibujos, description
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detallada y ejemplos.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra el analisis de regresion loglstica condicional para 41 virus en la fecha de seroconversion de autoanticuerpos.
La figura 2 muestra un compendio de los criterios estrictos y aproximados de los analisis de la franja de tiempo de VCB1, VCB3 y VCB6.
La figura 3 muestra un riesgo atribuible a la poblacion (RAP) combinada para VCB1 y VCB2.
La figura 4 muestra el % de RAP protector para VCB3 y VCB6 usando clases positivas frente a negativas (0-3 frente a 4).
La figura 5 muestra la duracion de la excrecion del virus.
La figura 6 muestra la relacion de la infeccion por enterovirus y las muestras en las clases de edad.
La figura 7 muestra la relacion de todas las infecciones por enterovirus y muestras (recuadro superior) y las infecciones y muestras antes de la aparicion de autoanticuerpos (AAB) (recuadro inferior).
Descripcion detallada de la invencion
Si no se indica de otro modo "diabetes tipo 1" o "DT1" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la forma clasica de la enfermedad, que esta relacionada con la aparicion de autoanticuerpos contra las celulas beta pancreaticas. Esta enfermedad tambien puede denominarse "diabetes tipo 1 clasica" para distinguirse de la "diabetes tipo 1 fulminante", que es una forma rara de diabetes que esta relacionada con un proceso inflamatorio por macrofagos, que no implica a anticuerpos autoinmunitarios.
Los grupos de riesgo tlpicos para contraer DT1 son los ninos con diabetes en familiares de primer grado, los ninos que dieron positivo a autoanticuerpos relacionados con la diabetes y los ninos con alelos con riesgo genetico para la enfermedad.
El analisis de diagnostico de la invencion comprende la determination de la presencia de al menos un riesgo y/o serotipo de enterovirus de protection. Los serotipos de riesgo tal como se utilizan en este contexto tambien pueden denominarse serotipos diabetogenos. El grupo de los enterovirus de riesgo consiste en los serotipos VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, VCA4, VCA5, VCA6 y VCA16. El analisis puede comprender la determinacion de cualquier combinacion de dichos virus de riesgo. La presencia de VCB1 y / o VCB2 es especialmente indicativo de un mayor riesgo. Segun una realization de la invencion se determina la presencia de al menos VCB1 o de VCB1 y VCB2. Segun otra realizacion de la invencion, se determina al menos uno de VCB1, VCB2, CVB3, CVB4, CVB5 y VCB6. Segun aun otra realizacion, se determina la presencia de al menos tres de VCB1, VCB2, Echo32, Echo29 y Echo14, o se determinan los dichos cinco serotipos. Segun otra realizacion se determinan los once serotipos de riesgo.
El grupo de enterovirus protectores consiste en los serotipos VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11 y Echo13. El analisis puede comprender la determinacion de cualquier combinacion de dichos virus protectores. La presencia de VCB3 y/o VCB6 es especialmente indicativa de un riesgo reducido de DT1. Por el contrario, la ausencia de un serotipo protector tambien puede indicar un mayor riesgo de contraer DT1. Segun una realizacion de la invencion, se determina la presencia de al menos VCB3 y/o VCB6. Segun otra forma de realizacion se determina la presencia de los seis enterovirus protectores.
En una realizacion preferida de la invencion se determina la presencia de al menos un enterovirus de riesgo y al menos un enterovirus protector. Normalmente, se determina la presencia de al menos VCB1, VCB2, VCB3 y VCB6. Segun una realizacion, se determina la presencia de al menos VCB1, VCB2, Echo32, Echo29, Echo14, VCB3, VCB6, Echo11 y Echo13. Tambien es posible cualquier otra combination de virus de riesgo y protectores. En una realizacion, se determino la presencia de los doce serotipos de riesgo y los cuatro serotipos protectores.
El analisis de diagnostico para evaluar el "riesgo de diabetes tipo 1" se puede usar para predecir el riesgo de contraer DT1 o un proceso autoinmunitario perjudicial para las celulas beta, para el diagnostico de DT1 o un proceso autoinmunitaria perjudicial para las celulas beta en un paciente, o para la pronostico de la enfermedad. Por lo tanto, la presencia de un enterovirus de riesgo indica un mayor riesgo de contraer DT1, o una DT1 ya en curso, o un mal pronostico de la enfermedad, mientras que la presencia de un enterovirus protector indica un menor riesgo de contraer DT1, o un buen pronostico de la la enfermedad, especialmente si el proceso autoinmunitario no ha comenzado todavla, o si el proceso autoinmunitario no ha avanzado hasta DT1 cllnica. Incluso cuando se ha hecho el diagnostico, el pronostico en el sentido de gravedad de la enfermedad puede ser mejor. La presencia de al menos un serotipo de riesgo junto con al menos un serotipo protector, indica un riesgo mas pequeno o mejor pronostico para DT1 que la presencia de al menos un serotipo de riesgo en ausencia de cualquier serotipo protector.
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El tiempo y el orden de la infeccion tambien tiene una influencia sobre el riesgo o pronostico. El analisis de diagnostico puede llevarse a cabo en muestras tomadas en diferentes momentos, por lo que la presencia de un serotipo protector antes de la presencia de un serotipo de riesgo en un sujeto indica un riesgo menor de DT1 que en el orden contrario.
El analisis de diagnostico puede llevarse a cabo en muestras corporales de pacientes muy jovenes, tal como en una muestra de sangre del cordon umbilical de un recien nacido, o en otros tipos de muestras desde bebes a partir de la edad de alrededor de 12 semanas o antes. Segun una realizacion, el analisis se lleva a cabo en muestras de ninos a la edad de aproximadamente 6, 12, 18 y 24 meses. El analisis puede llevarse a cabo como un metodo de deteccion en muestras de una cohorte completa, o de una subpoblacion que tiene mayor riesgo de presentar diabetes tipo
1. Dichos grupos de alto riesgo pueden incluir las madres o los ninos con riesgo genetico otorgado por HLA (HLA- DR3 y/o DR4), pacientes con diabetes tipo 1 en familiares de primer o segundo grado o pacientes que dieron positivo a dos o mas autoanticuerpos asociados a la diabetes. Por lo general la muestra corporal es de un paciente que se sospecha que ha desarrollado DT1 o un proceso autoinmunitario perjudicial para las celulas beta.
El analisis de diagnostico comprende la determinacion de la presencia de determinados serotipos de enterovirus en una muestra corporal. "La determinacion de la presencia", como se emplea en este contexto abarca ambos medios directos e indirectos de mostrar una infeccion en curso o en el pasado. Convenientemente, la presencia del enterovirus se determina detectando uno de sus componentes, o una respuesta inmunitaria al mismo. El componente puede ser una estructura de dicho virus, p. ej. un acido nucleico o un polipeptido codificado, tal como VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C o 3D, o partes del mismo. La respuesta inmunitaria puede medirse determinando un anticuerpo o un linfocito T que reconoce especlficamente el polipeptido vlrico. El analisis puede usarse para identificar una infeccion persistente o aguda por serotipos de riesgo o protectores. La determinacion de una respuesta inmunitaria tambien puede poner de manifiesto infecciones pasadas en el paciente. El virus tambien puede detectarse mediante cultivo.
La muestra corporal a ensayar puede ser cualquier muestra del cuerpo, en donde el virus o la respuesta inmunitaria esta presente, tal como una muestra de sangre, saliva, heces o de tejido. La presencia del virus puede determinarse, p. ej., en una muestra de heces por PCR, o anticuerpos contra el virus pueden determinarse en una muestra de sangre tomada del paciente a analizar, por ejemplo, mediante un analisis de inhibicion de la placa o un analisis de microneutralizacion de la muestra de suero o plasma como se describe en los ejemplos. Ademas, el virus puede detectarse en diversos tejidos usando, p. ej. RT-PCR, hibridacion in situ o inmunohistoqulmica.
Segun una realizacion, la presencia del virus se determina por PCR, RT-PCR, hibridacion in situ, inmunohistoqulmica, deteccion de antlgenos usando EIA u otros metodos, aislamiento de virus, secuenciacion, microscopia electronica o microscopia inmunoelectronica. Segun otra realizacion, la presencia del virus se determina detectando una respuesta inmunitaria contra el virus mediante la medicion de respuesta de anticuerpos especlficos al virus, p. ej., por analisis de neutralizacion o de otros analisis de anticuerpos, o midiendo la respuesta inmunitaria mediada por celulas al virus p. ej., usando ensayos de proliferacion de linfocitos T o de otros metodos de medicion de inmunidad mediada por celulas, o mediciones de activacion del sistema inmunitaria innato.
El analisis puede ser utilizado para detectar un perfil de alto o bajo riesgo de anticuerpos en suero, sangre, saliva o heces utilizando seroneutralizacion contra serotipos de riesgo y protectores. Tambien puede ser utilizado para detectar estructuras de virus especlficas para serotipos de alto riesgo y protectores en tejidos y sangre. Se puede ademas utilizar para la deteccion del genoma vlrico de serotipos de riesgo o protector en hibridacion in situ con sondas especlficas. El analisis puede ser utilizado aun mas en la PCR, que amplifica especlficamente el genoma de los virus de riesgo o protectores, o en la hibridacion con sondas de oligonucleotidos para detectar amplicones de PCR especlficos para serotipos de riesgo y protectores. Otros metodos comprenden la secuenciacion de una secuencia de protelna a partir de tejidos para identificar serotipos de riesgo y protectores, o el aislamiento del virus para detectar los serotipos de riesgo y protectores.
"Seroneutralizacion" es un analisis, en el que se determina la capacidad de los anticuerpos especlficos de un virus dado posiblemente presentes en una muestra corporal para inhibir la multiplicacion del virus dado. Puede medirse como la reduccion del numero de placas en comparacion con una muestra de referencia en el cultivo celular. Los enterovirus forman placas en cultivos celulares sensibles a virus. Esta capacidad para formar placas puede utilizarse en el analisis de los anticuerpos de enterovirus. Los anticuerpos de enterovirus de serotipo especlfico presentes, p. ej. en el suero o el plasma neutralizan los enterovirus y evitan o reducir la formacion de placa. En este analisis, una dilucion definida de muestra en estudio se mezcla con un volumen equivalente de enterovirus de valor conocido, esta mezcla se anade a las celulas y la presencia de anticuerpos de enterovirus se detecta por reduccion en el numero de placas en comparacion con el virus no neutralizado.
Los metodos de diagnostico para determinar la presencia de los serotipos de riesgo o protectores es tambien util en el seguimiento de la eficacia de los tratamientos antivlricos destinadas a la prevencion de DT1. El tratamiento antivlrico puede ir dirigido a la erradicacion o prevencion de infecciones con dichos virus, o a la prevencion del proceso autoinmunitario que dana las celulas beta. Dicho tratamiento antivlrico puede ser, p. ej. el tratamiento con aglutinantes de la capside, inhibidores de proteasa, analogos de nucleosidos, inmunoglobulinas, anticuerpos monoclonales o interferon alfa y beta.
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El equipo de diagnostico para su uso en el analisis de diagnostico o el procedimiento de seguimiento de la eficacia del tratamiento antivirico puede comprender cualquier reactivo necesario para la determinacion de serotipos de enterovirus concretos que han de determinarse. Opcionalmente, el equipo tambien contiene instrucciones de uso.
La presente invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos no restrictivos.
Ejemplo 1
En el presente estudio se identificaron serotipos diabetogenos midiendo anticuerpos neutralizantes en el suero y tipificando virus directamente de las muestras de heces en ninos que fueron observados en un estudio prospectivo de cohortes de natalidad. Las muestras de suero se obtuvieron de una amplia serie de ninos mientras que las muestras de heces se obtuvieron a partir de una cohorte mas pequena. De este modo, los datos principales en este estudio estan basados en el analisis serico mientras que las muestras de heces proporcionaron informacion sobre los enterovirus circulantes y permitieron su aislamiento para la neutralizacion de los analisis de anticuerpos.
Analisis de seroneutralizacion
Se analizaron anticuerpos neutralizantes contra un amplio grupo de diferentes serotipos de enterovirus en la misma muestra de suero que fue la primera muestra positiva de autoanticuerpos tomada durante el seguimiento prospectivo. Por lo tanto, este momento representa el inicio del proceso que dana las celulas beta. Ademas, se cuantificaron los anticuerpos contra esos serotipos que se encontraron interesantes en esta identification sistematica inicial en los puntos de tiempo adicionales para estudiar el momento de las infecciones y su relation con el inicio del proceso que dana las celulas beta.
En conjunto, los analisis de seroneutralizacion se realizaron utilizando 44 muestras de virus y 522 de suero/plasma (174 tripletes, dos ninos de referencia por cada caso de nino). Con el fin de estudiar el efecto de la variation de la cepa, se han analizado dos serotipos (VCB4 y Echo3) usando tanto las cepas naturales (wt) recien aisladas como las cepas (rs) correspondientes de referencia (ATCC).
Los virus se analizaron en analisis de seroneutralizacion utilizando muestras con la fecha de seroconversion de autoanticuerpos. Los virus fueron VCA4, VCA5, VCA10, VCA16, VE71, VCA9, VCB1, VCB2, VCB3, VCB4-wt, VCB4-rs, VCB5, VCB6, Echo1, Echo2, Echo3-wt, Echo3-rs, Echo4, Echo5, Echo6 , Echo7, Echo9, Echo11, Echo12, Echo13, Echo14, Echo15, Echo17, Echo18, Echo19, Echo20, Echo21, Echo25, Echo26, Echo27, Echo29, Echo30, Echo32, Echo33, VE74, VE78 y VE94.
Los analisis de seroneutralizacion se llevaron a cabo usando un analisis de neutralizacion en placa ( Roivainen M., Knip M., Hyoty Hh, Kulmala P., Hiltunen M., Vahasalo P., Hovi T., A Akerblom H. K. 1998. Varios serotipos de enterovirus diferentes pueden estar asociados a episodios autoinmunitarios prediabeticos y el comienzo de IDDM manifiesta. Childhood Diabetes in Finland (DIME) Study Group. J. Med. Virol. 56:74-78). En este analisis se determino la capacidad del suero/plasma para inhibir la capacidad de un determinado virus para formar placas en las capas de celulas en comparacion con las referencias, en las que se ha utilizado suero de ternera fetal en lugar de suero humano. En el analisis la inhibicion se ha considerado significativa (resultado positivo, ++) cuando ha sido superior al 85%. El intervalo de inhibition entre 85-75% se ha considerado positiva debil (+) y la inhibition inferior al 75% ha sido interpretado como resultado negativo. Debido a que estos analisis se han realizado utilizando dos diluciones de suero/plasma diferentes (1/4 y 1/16) los resultados se han combinado utilizando la clasificacion mostrada a continuacion.
Clase
1:4 1:16
Max. positivo (0)
+ + + +
Muy positivo (1)
+ + +
Moderadamente positivo (2)
+ + -
Positivo (3)
+ -
Negativo (4)
- -
Resultados de la seroneutralizacion
Los datos en bruto se exportaron al paquete Stata y se analizaron empleando modelos de regresion logistica condicional para evaluar el riesgo de determinados serotipos de producir DT1. Los resultados del analisis de regresion logistica condicional se dan como relaciones de probabilidades (RP). Si la RP en determinados analisis es mayor que 1 y el limite inferior del intervalo de confianza (IC en el 95%) se mantiene por encima de 1 el virus puede considerarse como que confiere riesgo de DT1. Por otra parte, si tanto la RP como el Kmite superior del IC en el 95%
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es inferior a 1, puede considerarse a dicho serotipo protector frente a DT1. En tales casos en que RP es superior o inferior a 1 y tambien el IC del 95% incluye valores a ambos lados de 1, el resultado no es estadlsticamente significativo (P> 0,05). En la Tabla 1 se presentan los valores de RP e IC para los virus mas interesantes.
Tabla 1. Valores de RP e IC de los serotipos mas interesantes. Los resultados estadlsticamente significativos estan en negrita.
Virus
[RP (IC)] [RP (IC)] [RP (IC)]
0-3 frente a 4 0-1 frente a 2-4 0-2 frente a 4 0-1 frente a 4
VCB1
1,50 (1,02-2,23) 1,10 (0,65-1,87) 1,56 (0,94-2,58) 1,39 (0,68-2,85)
VCB3
0,39 (0,18-0,82) 0,56 (0,24-1,34) 0,36 (0,15-0,85) 0,50 (0,21-1,20)
VCB6
0,64 (0,41-0,97) 0,57 (0,21-1,59) 0,86 (0,50-1,51) 049 (0,16-1,57)
Los resultados para los virus probados se muestran en la figura 1 para los datos de toda la cohorte, clases de 0-3 frente a 4.
Tambien se calculo la prevalencia de anticuerpos (porcentaje de ninos que tienen anticuerpos neutralizantes frente a cada serotipo del virus).
Se descubrio que especialmente VCB3 y VCB6 son serotipos protectores, mientras que especialmente VCB1 es un serotipo de riesgo claro para la diabetes tipo 1. Estas asociaciones se elaboraron en primer lugar a partir de los resultados de seroneutralizacion de un solo momento transversal que representa la primera muestra positiva de autoanticuerpos, y se confirmaron despues en los analisis de multiples puntos de tiempo en los que se analizo con mas detalle el momento de las infecciones. En estos analisis de multiples momentos el resultado mas claro fue la fuerte asociacion del efecto de riesgo del VCB1en el intervalo de tiempo de seis meses inmediatamente anterior a la primera deteccion de autoanticuerpos relacionados con la diabetes tipo 1. Otros serotipos VCB aparte de VCB1, VCB3 y VCB6 no presentaron dicho riesgo claro o efecto protector en el analisis de un solo momento llevado a cabo en la seroconversion de autoanticuerpos.
Analisis de seroneutralizacion en multiples puntos de tiempo con VCB1, VCB3 y VCB6
Para aclarar el posible orden y el momento de las infecciones con VCB1, VCB3 y VCB6, se seleccionaron los siguientes puntos de tiempo para los analisis de seroneutralizacion:
• 12 meses antes de la seroconversion de autoanticuerpos
• 6 meses antes de la seroconversion de autoanticuerpos
• punto (primera deteccion de autoanticuerpos, estas muestras fueron analizadas con anterioridad)
• 12 meses despues de la seroconversion de autoanticuerpos
• momento del diagnostico de la diabetes tipo 1
Segun este plan se identificaron, recogieron, anonimizaron y analizaron aproximadamente 1.250 nuevas muestras que cumplen los criterios anteriores.
Todas las muestras se identificaron utilizando diluciones 1/4 y 1/16 de suero. En este informe la comparacion de clase 03 frente a 4 y los analisis de sensibilidad 1 y 2 se ha utilizado generalmente, excepto en los analisis con criterios estrictos (explicados a continuacion) en los que las infecciones se diagnosticaron por juicios subjetivos realizados por dos investigadores independientes sobre la base de criterios prefijados enumerados a continuation para la infeccion aguda:
La infection aguda se diagnostico segun los criterios siguientes que tenlan que ser ciertos para una infection clasificada:
• Una seroconversion desde valor 0 a valor 4 o mayor
• El valor es 16 en al menos una de las siguientes muestras
• Todas las muestras de seguimiento siguen siendo positivas
Todos los analisis se realizaron a ciegas, sin cocimiento del estado del caso de referencia del nino.
Anticuerpos y anticuerpos maternos que alcanzan un maximo temporalmente
Los datos acumulados de nuevos puntos de tiempo en relacion con VCB1, VCB3 y VCB6 mostraron claramente que las diluciones 1/4 y 1/16 previamente analizadas en el momento de la seroconversion para positividad de autoanticuerpos no proporcionan toda la imagen de los antecedentes de la infeccion de todos los ninos. Cuando se 5 tienen en cuenta estos nuevos datos de puntos de tiempo, se vieron aumentos transitorios en los valores de anticuerpos frente a estos tres serotipos ya sea por separado o en diferentes combinaciones en muchos ninos. Estos aumentos transitorios pueden tener diferentes explicaciones: En algunos casos son claramente restos de anticuerpos maternos. En otros casos, el motivo puede ser la reactividad cruzada del anticuerpo entre serotipos estrechamente relacionados. Este problema se ha estudiado mas a fondo en un subestudio por separado. Ademas,
10 es posible que la cepa del virus utilizada en el ensayo de neutralizacion sea antigenicamente diferente de la que causa la infeccion, y entonces no puede detectar valores bajos de anticuerpos. Por otra parte, no se puede descartar la posibilidad poco probable de que algunas muestras tambien pueden contener otras sustancias aparte de los anticuerpos que pueden inhibir el crecimiento del virus. Por ultimo, siempre hay una posibilidad de variacion en el rendimiento del analisis debido a razones tecnicas.
15 Como hacer frente a este dilema? Los autores han abordado este problema mediante una estrategia de tres vertientes:
1. minimizar la influencia de los negativos erroneos = criterios flexibles
2. minimizar la influencia de positivos erroneos = criterios estrictos
3. eliminar el efecto de los anticuerpos maternos, de otra manera, como criterios flexibles = criterios medios
20 El metodo con criterios flexibles significa que basicamente todos los resultados de los diferentes puntos de tiempo han sido aceptados y analizados como son. En el metodo con criterios medios todos los demas resultados han sido aceptados, excepto los que posiblemente hayan sido influenciados por los anticuerpos maternos. En el metodo con criterios estrictos los autores han ido con cuidado a traves de los datos y han extraldo solo aquellas infecciones que cumplen los criterios previamente establecidos de infeccion aguda.
25 Analisis estadlsticos de multiples momentos
Todos los analisis estadlsticos presentados se basan en analisis de regresion loglstica condicional. Se realizaron tres tipos de analisis para este conjunto de datos. 1) Se determino el momento de las infecciones y se analizo la relacion temporal entre las infecciones y aparicion de autoanticuerpos. En otras palabras, la frecuencia de infecciones entre los casos de los ninos se comparo con la de los ninos de referencia en cada intervalo de tiempo
30 por separado. 2) El orden mutuo de las infecciones por VCB1, VCB3 y VCB6 se analizo por separado en casos y ninos de referencia y tambien se analizaron las interacciones entre los tres serotipos. 3) Los resultados de nuevos puntos de tiempo se analizaron de manera similar como se describio anteriormente comparando casos y referencias en cada momento por separado. Estos analisis se llevaron a cabo en todo el grupo y en diferentes subgrupos segun la lista siguiente:
35 • Conjunto de datos totales de toda la cohorte
• Sexo
• Anos
• Genotipo HLA
• Area de residencia
40 • Combinaciones de diferentes AAB en ciertas muestras de seguimiento
• Diagnostico de diabetes
• Efecto protector acumulativo
Se han llevado a cabo analisis de seroneutralizacion de estos tres virus utilizando un analisis de neutralizacion en placa como se ha descrito anteriormente.
45 Se realizaron analisis estadlsticos en metodos con criterios flexibles y medios segun las clases combinadas 0-3 frente a 4 y tambien se utilizaron analisis de sensibilidad, en los que la clase 3 (analisis de sensibilidad 1) o ambas clases 2 y 3 (analisis de sensibilidad 2) se eliminan del conjunto de datos. En el metodo con criterios estrictos los analisis de sensibilidad no se realizaron debido a su caracter intrlnseco de "sensibilidad".
Se detectaron anticuerpos contra celulas de los islotes por inmunofluorescencia indirecta, y se determinaron
50 anticuerpos contra insulina, acido glutamico descarboxilasa, y protelna similar a la protelna tirosina fosfatasa (IA-2)
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por analisis de radiobinding especlficos de una muestra de suero utilizando metodos normalizados. Si se detectaban dos de estos cuatro autoanticuerpos, el paciente era considerado positivo al autoanticuerpo ( Nanto-Salonen et al, 2008. Lancet 372: 1746-1755).
Momento de las infecciones
El momento de las infecciones causadas por los tres serotipos VCB de interes se planted de la siguiente manera: En primer lugar, las infecciones reconocidas se clasificaron en diferentes intervalos de tiempo con respecto a la fecha de seroconversion a positividad de autoanticuerpos (fecha AAB+). Los intervalos utilizados fueron las siguientes:
0. Sin infecciones o infeccion despues de la fecha de AAB+
1. Infeccion mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
2. Infeccion entre 12 y 6 meses antes de la fecha de AAB+
3. Infeccion 6 meses antes de la fecha de AAB+
Ademas de utilizar estos intervalos de tiempo por separado, tambien se realizaron analisis por combinacion de algunos de estos intervalos.
En el metodo con criterios flexibles el primer resultado positivo se acepto como una infeccion, independientemente de la posibilidad de anticuerpos maternos o la posibilidad de que los resultados de las muestras de puntos de tiempo posteriores se vuelvan negativos. El metodo con criterios medios se realizo de manera similar, excepto que los resultados que fueron sesgados por los anticuerpos maternos identificados se anularon. Este dictamen lo realizaron dos expertos independientes que evaluaron los datos cuidadosamente y descartaron los resultados en los que los anticuerpos maternos podrlan ser la causa de la positividad. En el metodo con criterios estrictos se aplica el procedimiento de dictamen similar. En resumen, las infecciones agudas segun los criterios estrictos fueron las siguientes:
- una seroconversion de tltulo 0 a tltulo 4 o superior
- el tltulo es 16 en al menos una de las siguientes muestras
- todas las muestras de seguimiento siguen siendo positivas
Ademas de utilizar estos intervalos de tiempo por separado, tambien se realizaron analisis combinando algunos de estos intervalos.
El momento de las infecciones producidas por el serotipo de riesgo VCB1 en estos intervalos de tiempo se resume en las Tablas 2 y 3. Estos analisis se realizaron utilizando los criterios flexibles y criterios medios y el efecto de riesgo de infeccion se analizo comparando su frecuencia en diferentes intervalos de tiempo al del intervalo cero (vease anteriormente). Se realizaron analisis estadlsticos basicos, es decir, clases 0-3 frente a 4 y analisis de sensibilidad 1 y 2.
Tabla 2. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB1, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios flexibles con las clases 0-3 frente a 4 y analisis de sensibilidad 1 y 2.
VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,77 0,064 0,97 3,25
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
2,24 0,007 1,25 4,00
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
3,56 <0,001 1,92 6,62
Sensibilidad 1, Clase 0-2 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,89 0,724 0,46 1,72
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,25 0,468 0,68 2,31
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,19 0,018 1,15 4,17
Sensibilidad 2, Clase 0-1frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,19 0,684 0,51 2,79
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,98 0,950 0,47 2,03
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,09 0,067 0,95 4,59
Tabla 3. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB1, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios medios con las clases 0-3 frente a 4 y analisis de sensibilidad 1 y 2.
VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente al 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,62 0,262 0,70 3,75
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,77 0,417 0,41 1,44
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,09 0,002 1,32 3,33
Sensibilidad 1, Clase 0-2 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,14 0,795 0,41 3,17
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,66 0,307 0,30 1,46
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,10 0,007 1,23 3,57
Sensibilidad 2, Clase 0-1 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,70 0,629 0,16 3,02
5
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12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,36 0,078 0,11 1,12
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,44 0,342 0,68 3,05
Curiosamente, en estos analisis, las infecciones por VCB1 se encuentran claramente con mayor frecuencia en el caso de los ninos segun la hipotesis de riesgo con infecciones que se producen proximas en el momento de la seroconversion de autoanticuerpos (en el intervalo de tiempo de 6-0 meses antes de la fecha de AAB+). El resultado es el mismo en todos los analisis, excepto que en el analisis de sensibilidad 2 se pierde la significacion estadlstica. Debido a que en este analisis los autores han aceptado todos los resultados positivos de anticuerpos (probablemente incluidos resultados de falsos positivos), excepto los anticuerpos maternos en analisis de criterios medios, es esencial comparar estos resultados con los obtenidos utilizando criterios estrictos para las infecciones (Tabla 4).
Tabla 4. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB1, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios estrictos.
VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,67 0,455 0,24 1,89
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,38 0,491 0,55 3,46
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
3,76 0,001 1,68 8,44
En este analisis, se ha eliminado una gran cantidad de datos para excluir todos los posibles positivos erroneos. Los resultados demuestran que una curva de respuesta a dosis crelble se observa poniendo de relieve la importancia del intervalo de tiempo de 6-0 meses antes de la fecha de AAB+ y demostrando un efecto de riesgo definido de VCB1 con resultado estadlstico convincente. Lo mas importante, debido a los mismos 6-0 meses antes del intervalo de la fecha AAB+ se observo que es estadlsticamente significativa tanto en los metodos con criterios flexibles, medio como estricto, estos resultados consolidan este perlodo como crltico para la infeccion por VCB1 como un riesgo para provocar DT1. Los resultados de los criterios estrictos y de los criterios flexibles se presentan juntos en la figura 2, que muestran las RP de VCB1, VCB3 y VCB6 en diferentes intervalos de tiempo antes de la fecha de AAB+, izquierda: criterios estrictos, derecha: criterios flexibles (clase 0-3 frente a 4, sensibilidad 1, sensibilidad 2). Las curvas de respuesta a dosis se pueden ver con ambos metodos que son los mas conspicuos en los analisis con sensibilidad 1 de los criterios estrictos y los criterios flexibles.
Con el fin de comprender el significado de este resultado se va a interpretar en terminos del riesgo atribuible a la poblacion (RAP) que estima la proporcion de casos de diabetes tipo 1, que podrlan evitarse con la vacuna VCB1 en la poblacion. Suponiendo que la RP sea 3,76 (= resultado de criterios estrictos para el intervalo de 6-0 meses antes de la fecha de AAB+) y la prevalencia de la infeccion por VCB1 sea del 50%, como se indica por la prevalencia de anticuerpos contra VCB1 en el momento de AAB+ en pacientes de referencia, la ecuacion de RAP da como resultado el 58% de VCB1 solo (figura 3). La figura 3 muestra el riesgo atribuible a la poblacion (RAP) para VCB1 calculado utilizando una RP de 3,76 y una prevalencia (Pc) del 50% que representa la seroprevalencia en el momento de la seroconversion de autoanticuerpos en los pacientes de referencia.
En el analisis siguiente se combinaron los intervalos de tiempo 6-0 y 12-6. El efecto de riesgo de VCB1 fue significativo tambien en este analisis de intervalo de tiempo combinado (Tabla 5).
Tabla 5. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB1, intervalo 12-0 frente al intervalo 0. Metodo con criterios estrictos.
VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,66 0,434 0,24 1,85
12-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,46 0,004 1,33 4,53
Debido a que el efecto de riesgo mas fuerte se observo en el intervalo 6-0, se analizo este perlodo utilizando otro tipo de comparacion. En lugar de compararlo frente al intervalo 0 (lo que se hizo en los analisis anteriores), este intervalo se comparo con todos los demas intervalos en combinacion. Una vez mas, los descubrimientos anteriores que muestran la importancia crltica de este intervalo de tiempo estaban apoyados por este analisis (Tabla 6).
Tabla 6. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB1, intervalo 6-0 frente a otros intervalos combinados de tiempo. Metodo con criterios estrictos.
VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
3,78 0,001 1,69 8,43
Se realizaron analisis similares para los serotipos protectores VCB3 y VCB6. Las tablas 7, 8, 9 y 10 presentan los resultados de diferentes puntos de tiempo para VCB3 y VCB6, respectivamente, cuando se analizaron utilizando 5 criterios flexibles y medios. Los resultados de criterios estrictos y criterios flexibles se presentan en la figura 2 tanto para VCB3 como para VCB6. Se observo proteccion por VCB3 cuando la infeccion se produjo al principio. El efecto se debilito cuando se excluyeron los anticuerpos maternos (criterios medios) lo que sugiere que los anticuerpos maternos pueden proporcionar parte de esta proteccion.
Tabla 7. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB3, otros intervalos frente al 10 intervalo 0. Metodo con criterios flexibles.
VCB3
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,37 0,038 0,14 0,95
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,84 0,618 0,43 1,64
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,74 0,439 0,35 1,57
Sensibilidad 1
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,43 0,086 0,16 1,13
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,90 0,754 0,45 1,77
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,64 0,280 0,28 1,44
Sensibilidad 2
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,59 0,291 0,22 1,58
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,87 0,724 0,42 1,84
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,62 0,266 0,27 1,44
Tabla 8. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB6, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios flexibles.
VCB6
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,92 0,772 0,53 1,61
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,53 0,098 0,92 2,52
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,33 0,264 0,80 2,22
Sensibilidad 1
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,37 0,060 0,13 1,04
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,74 0,410 0,37 1,51
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,04 0,912 0,52 2,08
Sensibilidad 2
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,26 0,227 0,03 2,33
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,57 0,354 0,17 1,88
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,90 0,888 0,20 3,98
Tabla 9. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB3, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios medios.
VCB3
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,50 0,535 0,06 4,47
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,61 0,557 0,11 3,22
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,62 0,327 0,24 1,60
Sensibilidad 1
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,50 0,535 0,06 4,47
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,61 0,557 0,11 3,22
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,42 0,147 0,13 1,36
Sensibilidad 2
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,50 0,535 0,06 4,47
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,39 0,405 0,04 3,59
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,47 0,213 0,14 1,54
5 Tabla 10. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB6, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios medios.
VCB6
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,96 0,902 0,46 1,97
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,87 0,653 0,46 1,62
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,99 0,969 0,63 1,56
Sensibilidad 1
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,70 0,433 0,29 1,69
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,49 0,097 0,21 1,14
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,48 0,222 0,79 2,79
Sensibilidad 2
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,12 0,891 0,22 5,62
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,53 0,358 0,14 2,04
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,34 0,620 0,42 4,27
Los resultados de los criterios estrictos para los mismos virus se muestran en la tabla 11.
Tabla 11. Analisis de regresion loglstica condicional del desarrollo cronologico de VCB3 y VCB6, otros intervalos frente al intervalo 0. Metodo con criterios estrictos. * No hubo infecciones por VCB6 en los casos del intervalo de mas de 12 meses segun el metodo con criterios estrictos. Por lo tanto no se pudieron calcular resultados 5 estadlsticos para ese intervalo. Sin embargo, en infecciones de referencias se reconocieron tambien en este intervalo de tiempo lo que apoya el efecto protector de VCB6.
VCB3
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,33 0,326 0,04 2,95
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,13 0,870 0,27 4,74
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,24 0,195 0,03 2,09
VCB6
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
- * - * - * - *
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,56 0,468 0,12 2,70
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,65 0,592 0,13 3,21
En la mayorla de estos analisis para VCB3 y VCB6 se puede ver una tendencia de que en el primero el intervalo de tiempo es el caracter mas protector que muestran estos dos virus. Estos resultados como tales son logicos: El virus protector debe preceder al virus de riesgo, suponiendo que la proteccion inmunologica cruzada media en el efecto 10 protector. La misma tendencia se observa para ambos virus en la mayorla de los analisis.
Como conclusion de los analisis del desarrollo cronologico se puede observar que el momento crltico de la infeccion por el virus de riesgo VCB1 cae en el intervalo de tiempo de un ano y especialmente 6 meses antes de la fecha de
AAB+. Los resultados tambien apoyan las propiedades protectoras de VCB3 y VCB6.
Si es protector, la falta de dicho virus puede verse como un riesgo para DT1. Por lo tanto la prevalencia inversa y la RP inversa se utilizaron para el calculo del % de RAP protector utilizando positivo frente a negativo (0-3 frente a 4). El resultado de los calculos del % de rapidamente protector fue del 57% para VCB3 y 27% para VCB6, como 5 tambien se muestra en la figura 4.
Orden de las infecciones - desarrollo cronologico
En este analisis se clasificaron en primer lugar diferentes posibilidades del orden de las infecciones en las clases siguientes:
0 = sin riesgo o virus protectores en ningun momento 10 1 = primera infeccion por el virus de riesgo, VCB1
2 = primera infeccion por el virus protector, VCB3 o VCB6, uno solo o ambos
3 = la primera infeccion por el virus de riesgo y protector en el mismo intervalo de tiempo
En este primer analisis se analizaron las clases "primer riesgo de infeccion" (clase 1 anterior) y "clase protectora combinada" (clase 2). Las comparaciones estadlsticas se realizaron contra la clase "sin riesgo o virus protectores en 15 ningun momento" (clase 0). Los resultados de estos analisis se resumen en la Tabla 12 (criterios estrictos), Tabla 13 (criterios flexibles) y en la Tabla 14 (criterios medios). En estos analisis, se ha tenido en cuenta el perlodo de seguimiento hasta la fecha de AAB+.
Tabla 12. Orden de las infecciones (analisis de regresion loglstica condicional), en comparacion con la clase 0. Metodo con criterios estrictos.
Orden
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Primer riesgo
1,29 0,290 0,81 2,06
Primer protector
0,58 0,098 0,31 1,10
20
Tabla 13. Orden de las infecciones (analisis de regresion loglstica condicional), en comparacion con la clase 0. Metodo con criterios flexibles.
Orden
Relacion de probabilida des Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Primer riesgo
1,56 0,247 0,73 3,32
Primer protector
0,87 0,727 0,40 1,90
Tabla 14. Orden de las infecciones (analisis de regresion loglstica condicional), en comparacion con la clase 0. 25 Metodo con los criterios medios.
Orden
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Primer riesgo
3,31 <0,001 1,83 5,99
Primer protector
2,10 0,025 1,10 4,00
Estos tres analisis mostraron tendencias que apoyan especialmente la hipotesis de caracter de riesgo de VCB1 pero tambien la hipotesis de los virus protector. En el segundo tipo de analisis se combinaron las clases 0 y 2 y la clase 1 se analizo frente a esta nueva clase combinada. En este analisis el efecto de riesgo de VCB1 se hace mas fuerte (Tabla 15).
5 Tabla 15. Primeras infecciones por VCB1 (analisis de regresion loglstica condicional), en comparacion con clases combinadas 0 y 2. Metodo con criterios estrictos.
Orden
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Primer riesgo
1,40 0,151 0,88 2,22
Para estudiar el efecto protector mas profundamente la clase de riesgo (clase 1) se combino con la clase 0 y esta clase combinada se comparo con la clase 2. En este analisis el efecto protector se hace mas fuerte y el valor P se acerca mucho a la significacion estadlstica (Tabla 16).
10 Tabla 16. Primeras infecciones protectoras (analisis de regresion loglstica condicional), en comparacion con las clases combinadas 0 y 1. Metodo con criterios estrictos.
Orden
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Primer protector
0,55 0,060 0,29 1,03
En el siguiente analisis los virus protectores VCB3 y VCB6 han sido manipulados como casos independientes y los analisis se realizaron utilizando tanto metodos con criterios estrictos, medios como flexibles (Tablas 17, 18 y 19).
Tabla 17. Orden de las infecciones (analisis de regresion loglstica condicional), frente a la clase 0. VCB3 frente a 15 VCB1 y VCB6 frente a VCB1 manipulados como grupos independientes. Metodo con criterios estrictos.
VCB3 frente a VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Primer VCB1
1,25 0,338 0,79 1,95
Primer VCB3
0,41 0,104 0,14 1,20
VCB6 frente a VCB1
Primer VCB1
1,38 0,170 0,87 2,17
Primer VCB6
0,62 0,236 0,29 1,36
Tabla 18. Orden de las infecciones (analisis de regresion loglstica condicional), en comparacion con la clase 0.
VCB3 frente a VCB1 y VCB6 frente a VCB1 manipulados como grupos independientes. Metodo con criterios medios.
Clase 0-3 frente al 4
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
VCB3 frente a VCB1
Primer VCB1
2,76 <0,001 1,75 4,34
Primer VCB3
1,30 0,706 0,33 5,05
5
10
15
20
25
30
VCB6 frente a VCB1
Primer VCB1
3,67 <0,001 2,00 6,72
Primer VCB6
2,48 0,007 1,28 4,80
Tabla 19. Orden de las infecciones (analisis de regresion ioglstica condicional), en comparacion con la clase 0. VCB3 frente a VCB1 y VCB6 frente a VCB1 manipulados como grupos independientes. Metodo con criterios flexibles.
Clase 0-3 frente al 4
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
VCB3 frente a VCB1
Primer VCB1
1,24 0,488 0,68 2,26
Primer VCB3
0,41 0,057 0,16 1,03
VCB6 frente a VCB1
Primer VCB1
2,37 0,072 0,92 6,06
Primer VCB6
1,85 0,217 0,70 4,91
Segun los analisis de los criterios estrictos las tendencias fueron como era de esperar presentando tendencia de riesgo de VCB1 y las tendencias de proteccion para VCB3 y VCB6. En el analisis de los criterios medios, una vez mas, el caracter de riesgo de VCB1 se evidencio claramente. En los analisis de los criterios flexibles el efecto protector de VCB3 destaca claramente y, en la comparacion de VCB6 frente a VCB1 el efecto del riesgo de VCB1 es obvio.
En conclusion, los estudios de cronologla proporcionaron datos de apoyo para el caracter del riesgo de VCB1 y el caracter protector especialmente para VCB3 y en menor medida tambien para VCB6. Sobre la base de estos resultados se puede concluir que la cronologla de estas infecciones influye en el efecto de riesgo de VCB1. El alto riesgo esta asociado a la infeccion por VCB1 sin exposicion previa a VCB3 o VCB6. Por otra parte, el efecto de riesgo es atenuado por la exposicion previa a VCB3 o VCB6.
Conclusiones
Cuando se combinan todos los analisis, se puede concluir que se encontro una asociacion estadlsticamente significativa entre los enterovirus y proceso de la enfermedad que conduce a la diabetes tipo 1. Los enterovirus pueden tener un efecto de riesgo (es decir, provocar el proceso de la enfermedad diabetica) o un efecto protector. Estos resultados pueden utilizarse en analisis de diagnostico.
Los resultados mas interesantes estan relacionados con los serotipos VCB. En este subgrupo el descubrimiento individual mas fuertes fue el caracter de riesgo definido de VCB1. Se identifico en primer lugar en relacion con el momento de la seroconversion a la positividad de autoanticuerpos por analisis de seroneutralizacion que demuestran que las infecciones por VCB1 preceden a la seroconversion inicial de autoanticuerpos. Despues de este resultado se confirmo demostrando que las infecciones por VCB1 golpean mas a menudo los casos de ninos en comparacion con los referencias en el intervalo de tiempo que precede inmediatamente a la seroconversion de autoanticuerpos. Por otra parte, fuertes propiedades protectoras se asociaron con serotipos VCB VCB3 y VCB6. Tambien estas asociaciones se identificaron por analisis de seroneutralizacion en relacion con el momento de la seroconversion a positividad de autoanticuerpos. Los estudios del desarrollo cronologico y la cronologla apoyaron interacciones especlficas entre VCB1, VCB3 y VCB6 donde el efecto diabetogeno de VCB1 esta atenuado por la exposicion previa a VCB3 o VCB6 o ambos.
Analisis de seroneutralizacion en multiples momentos, que incluye ademas VCB2, VCB4 y VCB5
En este analisis tambien se analizaron los tres serotipos de VCB restantes en un entorno de multiples momentos como VCB1, VCB3 y VCB6.
Desarrollo cronologico de las infecciones
Para aclarar el posible desarrollo cronologico de las infecciones del subgrupo VCB, se seleccionaron los mismos puntos de tiempo para los analisis de seroneutralizacion como se describio anteriormente.
Los resultados presentados a continuacion se basan en el analisis de seroneutralizacion de alrededor de 2.000 muestras para cada uno de estos virus VCB. Con el fin de estudiar el desarrollo cronologico de las infecciones 5 causadas por los seis serotipos del VCB las infecciones reconocidas se clasificaron por diferentes intervalos de tiempo con respecto a la fecha de seroconversion a positividad de autoanticuerpos (fecha de AAB+). Los intervalos utilizados se numeraron de 0 a 3 como se describio anteriormente.
Se utilizaron los mismos metodos de criterios flexibles, medios y estrictos descritos anteriormente. Se realizaron analisis estadlsticos por regresion loglstica condicional. Los resultados de los analisis estadlsticos de los seis 10 serotipos de VCB se muestran en las Tablas 20-25.
Tabla 20. Analisis de desarrollo cronologico de la infeccion por VCB1. Metodo con criterios flexibles con las clases 03 frente a 4.
VCB1
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente al 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,89 0,035 1,05 3,40
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
2,27 0,005 1,28 4,03
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
3,54 <0,001 1,95 6,42
Tabla 21. Analisis del desarrollo cronologico de la infeccion por VCB2. Metodos con criterios flexibles, medios y 15 estrictos con las clases 0-3 frente a 4.
VCB2
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Criterios flexibles
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,79 0,441 0,44 1,43
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,38 0,236 0,81 2,34
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,32 0,001 1,40 3,84
Criterios medios
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,80 0,523 0,41 1,58
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,02 0,946 0,54 1,93
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,29 0,001 1,43 3,66
Criterios estrictos
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,88 0,838 0,26 3,00
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,00 0,994 0,33 3,03
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
2,44 0,059 0,97 6,15
Tabla 22. Analisis del desarrollo cronologico de la infeccion por VCB3. Metodo con criterios flexibles con las clases 0-3 frente a 4.
VCB3
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente al 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,42 0,058 0,18 1,03
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,84 0,609 0,43 1,63
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,69 0,331 0,33 1,45
Tabla 23. Analisis del desarrollo cronologico de la infeccion por VCB4. Metodos con criterios flexibles, medios y 5 estrictos con las clases 0-3 frente a 4.
VCB4
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Criterios flexibles
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,51 0,135 0,21 1,24
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,05 0,887 0,53 2,09
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,07 0,868 0,48 2,41
Criterios medios
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,50 0,380 0,11 2,35
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
* - * - * - *
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,45 0,363 0,08 2,50
Criterios estrictos
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
1,00 0,999 0,09 11,04
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
- * - * - * - *
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
0,59 0,685 0,05 7,43
*Debido a la baja frecuencia general de infecciones por VCB4 no hubo infecciones por VCB4 en los casos en intervalo 12-6 meses segun los metodos con criterios medios y estrictos.
Tabla 24. Analisis del desarrollo cronologico de la infeccion por VCB5. Metodos con criterios flexibles, medios y estrictos con las clases 0-3 frente a 4.
VCB5
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Criterios flexibles
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,56 0,209 0,23 1,38
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,11 0,755 0,57 2,19
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,60 0,211 0,76 3,37
Criterios medios
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
- * - * - * - *
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
0,88 0,849 0,23 3,35
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,45 0,488 0,51 4,14
Criterios estrictos
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
-§ -§ -§ -§
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
-§ -§ -§ -§
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
-§ -§ -§ -§
* No hubo infecciones por VCB5 en los casos de intervalo de mas de 12 meses segun el metodo con criterios medios.
§ En el metodo con criterios estrictos el numero de las observaciones disminuyo tan bajo que no se pudieron generar resultados estadlsticamente analizados.
5 Tabla 25. Analisis del desarrollo cronologico de la infeccion por VCB6. Metodo con criterios flexibles con clases 0-3 frente a 4.
VCB6
Relacion de probabilidades Valor P Intervalo de confianza 95%
Clase 0-3 frente a 4
Mas de 12 meses antes de la fecha de AAB+
0,96 0,874 0,56 1,65
12-6 meses antes de la fecha de AAB+
1,54 0,090 0,94 2,54
6-0 meses antes de la fecha de AAB+
1,35 0,234 0,82 2,22
Conclusiones
Ademas de VCB1 se encontro tambien el VCB2 estrechamente relacionado que es un virus de riesgo en analisis en multiples momentos analiza especialmente en los 6-0 meses antes del intervalo de tiempo AAB+.
10 Se calculo tambien RAP para VCB2 utilizando criterios flexibles RP = 2,26 y la seroprevalencia del 48% en la poblacion de referencia, por lo tanto, se concluye con RAP = 37% (figura 3).
En conjunto, los resultados indican que VCB2 es tambien un virus de riesgo relacionado con la patogenia de DT1 y por lo tanto utiles en diagnosticos.
Ejemplo 2. Analisis de heces
15 En total, 4.184 muestras de heces de 359 ninos (102 casos y 257 referencias) se han examinado para positividad de enterovirus (EV). En la Tabla 26 todas estas muestras antes mencionadas se han dividido en diferentes categorlas. En EV screening PCR ( J. Med. Virol. Nov. 1999; 59(3):378-84. Diagnosis of enterovirus and rhinovirus infections by RT-PCR and time-resolved fluorometry with lanthanide chelate labeled probes. Lonnrot M., Sjoroos M., Salminen K., Maaronen M., Hyypia T., Hyoty H.) se identificaron un total de 230 infecciones por separado, de los 20 cuales 166 pudieron serotiparse por secuenciacion.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 26. Muestras de heces para examen de EV divididas en diferentes categorlas.
Datos totales Caso Referencia
Numero de grupos
102
Numero de ninos
359 102 257
Numero de muestras de heces
4184 1321 2863
Numero de muestras de heces positivas a enterovirus
307 103 204
Cantidad de infecciones por separado
230 75 155
Numero de infecciones serotipadas satisfactoriamente
166 (72%) 54 (72%) 112 (72%)
Numero de infecciones sin tipificar
64 (28%) 21 (28%) 43 (28%)
Numero de serotipos diferentes
28 17 24
La duracion de las infecciones y la proporcion de infecciones y muestras en las clases de edad se presentan en las figuras 5 y 6, respectivamente, de la forma siguiente: La duracion de la excrecion de virus se muestra en la figura 5 como porcentaje del numero de muestras en serie positivas para la misma cepa de virus. La proporcion de infecciones y muestras en las clases de edad (bandas de seis meses) hasta dos anos de edad se muestra en la figura 6. La relacion se calcula como numero de infecciones en clase de edad /numero de todas las muestras en la clase de edad.
Los criterios estrictamente definidos se establecen para los los casos y ninos de referencia, segun lo cual, por ejemplo, se definio la diferencia en el dla del nacimiento entre el nino del caso y el nino de referencia para que fuera como maximo de ± 2 meses. En la practica, en seis grupos de caso/referencia la diferencia de unos ninos de referencia estaba fuera de los criterios definidos. Sin embargo, de estos en 5 casos la diferencia fue de solo 64, 64, 65, 69 y 80 dlas haciendo la desviacion muy pequena. Solo en el caso de un grupo caso/referencia la desviacion para un nino de referencia la diferencia era notable siendo de 271 dlas. Ademas, dos ninos de referencia se volvieron diabeticos tipo 1 durante el periodo de seguimiento.
Serotipia de los enterovirus detectados en muestras de heces en toda la cohorte
De todas las muestras de heces positivas a enterovirus (307) se ha sido identificado el serotipo por VP1/VP2 (J. Clin. Microbiol. Agosto 2006; 44(8):2698-704 .Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens. Nasri D., Bouslama L., Omar S., Saoudin H., Bourlet T., Aouni M., Pozzetto B., Pillet S. Typing of human enterovirus by partial sequencing of VP2. J. Clin. Microbiol. Agosto de 2007; 45 (8): 2370-9) secuenciacion de 166 infecciones (infeccion = mismo serotipo en una o en dos o mas muestras consecutivas). La figura 7 muestra las proporciones de todos los serotipos identificados presentados como una relacion de infecciones y muestras recogidas. En el recuadro superior, la relacion de todas las infecciones y las muestras se calcula como numero de infecciones/numero de muestras, y en el recuadro inferior la relacion de las infecciones y las muestras antes de la aparicion de los autoanticuerpos AAB se calcula como numero de infecciones antes de AAB/numero de muestras antes de AAB. La relacion de los diferentes serotipos por muestras recogidas se calcula en primer lugar para cada nino del caso y cada nino de referencia, aqul presentado como valor medio de todos los casos y todos las referencias.
Segun los datos anteriores, pueden verse tres tipos de serotipos. Un grupo incluye los serotipos que son mas frecuentes en los ninos del caso que en los de referencia, otro grupo comprende los serotipos que son mas frecuentes en los ninos de referencia que en los del caso, y aun otro grupo a los que son aproximadamente igual de frecuentes en los casos y referencias. En base a esto los autores formaron los siguientes grupos de riesgo de los virus: los serotipos VCA4, VCA5, VCA6, VCA16 y ECHO 18 se seleccionaron para formar el grupo diabetogeno 1; y los serotipos VCA4, VCA5, VCA6, VCB2 y ECHO18 como grupo diabetogeno 2. Cuando la frecuencia de las infecciones por los serotipos del grupo de riesgo se analizo como un grupo se observo un efecto de riesgo estadlsticamente significativo (Tabla 27). Estos analisis abordaron la cuestion de si una o mas infecciones por cualquiera de los serotipos de grupos de riesgo (frente a los que no tienen ninguno de estos serotipos de grupo de riesgo) tiene un efecto estadlsticamente significativo.
Se obtuvo alta RP al comparar hombres y mujeres por separado. Antes de la aparicion de autoanticuerpos, las
mujeres tenlan la RP mas alta (RP = 6,48, P = 0,008). Por el contrario, los hombres tuvieron la RP mayor en el intervalo de 12 meses antes de la seroconversion a positividad de autoanticuerpos (RP = 8,49, P = 0,008) (dos grupos de riesgo combinados). La RP mayor se obtuvo un ano antes de AAB en los ninos que tenlan el genotipo HLA de riesgo (RP = 9,86, P = 0,004) (dos grupos de riesgo combinados). La misma tendencia se observo tambien 5 en casos de diabeticos y sus referencias; las RP mayores se obtuvieron en un perlodo desde el nacimiento hasta la seroconversion de autoanticuerpos y un ano antes de la seroconversion de autoanticuerpos (Tabla 28).
Tabla 27. Analisis estadlstico de diferentes grupos de serotipos; dos grupos de riesgo, y dos grupos de riesgo combinados.
Caso
Relacion de probabilidades
P> | z |
limite inferior 95%
limite superior 95%
Grupo de riesgo 1
Toda la cohorte VCA4, VCA5, VCA6, VCA16, ECHO18
1,92 0,030 1,06 3,47
Toda la cohorte antes de AAB VCA4, VCA5, VCA6, VCA16, ECHO18
2,69 0,005 1,34 5,39
Toda la cohorte un ano antes de AAB VCA4, VCA5, VCA6, VCA16, ECHO18
3,72 0,011 1,35 10,21
Grupo de riesgo 2
Toda la cohorte
VCA4, VCA5, VCA6, VCB2, ECHO18 Toda la cohorte antes de AAB
2,39 0,008 1,25 4,57
VCA4, VCA5, VCA6, VCB2, ECHO18 Toda la cohorte un ano antes de AAB
3,16 0,003 1,46 6,84
VCA4, VCA5, VCA6, VCB2, ECHO18
6,53 0,001 2,07 20,60
Grupos de riesgo 1 y 2 combinados
Toda la cohorte
VCA4, VCA5, VCA6, VCA16, VCB2,
ECHO18
1,92 0,03 1,06 3,47
Toda la cohorte antes de AAB VCA4, VCA5, VCA6, VCA16, VCB2, ECHO18
2,91 0,003 1,45 5,84
Toda la cohorte un ano antes de AAB VCA4, VCA5, VCA6, VCA16, VCB2, ECHO18
7,30 0,001 2,32 22,89
Tabla 28. Analisis estadlstico de diferentes grupos de serotipos; dos grupos de riesgo. Solo los casos, que tienen DT1 y sus referencias.
SOLO CASOS DE DIABETES TIPO 1 (DT1) Y
SUS REFERENCIAS 102 casos 63 casos de DT1*
Caso
Relacion de probabilidades P>l z 1 lfmite inferior del 95% lfmite superior 95%
Grupo de riesgo 1
Toda la cohorte
4.85
VCA4 VCA5, VCA6, VCA16, ECHO18
2,31 0,028 1,09
Toda la cohorte antes de AAB
VCA4 VCA5, VCA6, VCA16, ECHO18
4,49 0,003 1,67 12,07
Toda la cohorte un ano antes de AAB
VCA4 VCA5, VCA6, VCA16, ECHO18
3,99 0,029 1,14 13,87
Grupo de riesgo 2
Toda la cohorte
VCA4 VCA5, VCA6, VCB2, ECHO18
2,91 0,014 1,24 6,84
Toda la cohorte antes de AAB
VCA4 VCA5, VCA6, VCB2, ECHO18
5,58 0,004 1,73 18,05
Toda la cohorte un ano antes de AAB
VCA4 VCA5, VCA6, VCB2, ECHO18
5,04 0,02 1,28 19,78
5 * Solo los casos que progresaron a diabetes tipo 1 durante la observation clinica prospectiva, y sus referencias
El numero de ninos e infecciones identificadas en los grupos de riesgo 1 y 2 combinados se presentan en la Tabla 29.
Tabla 29. Numero de ninos e infecciones en los grupos de riesgo 1 y 2 combinados.
Numero de ninos Numero de infecciones
Caso Referencia Caso Referencia
Toda la cohorte 25 39 33 45
Grupos de riesgo 1 y 2 combinados
Antes de AAB 21 21 25 29
Un ano antes de AAB 13 6 13 13
Parece que en el analisis de las heces se ve el efecto del riesgo de determinados virus Coxsackie A si la infeccion se padece a edad muy joven y especialmente si el nino tiene el genotipo HLA de riesgo moderado. Ademas podrlan estar asociados a un proceso autoinmunitario agresivo que conduce a danos graves en las celulas beta y diabetes.
5 En conclusion, cuando se combinaron varios serotipos, podrla reconocerse un grupo de virus de riesgo. VCA4, VCA5, VCA6, VCA16 y E18 son los mas interesantes como virus potenciales de riesgo. A destacar que VCA4, VCA5, VCA6 y VCA16 estan geneticamente muy relacionados entre si. El efecto de riesgo mas claro estaba asociado al sexo masculino en el intervalo de tiempo limitado antes de la fecha de seroconversion de autoanticuerpos.
10 Compendio de analisis de suero y heces
Se creo el siguiente esquema de puntuacion de serotipos que muestra los virus diabetogenos y protectores mas prometedores. El tipo de analisis que sugiere diferente caracter y la fuerza del resultado correspondiente tambien se muestran en la escala (+)/+/++/+++. Todos estos analisis se realizaron en un solo momento que representa la primera muestra positiva de autoanticuerpos.
15 Ejemplo 3. Material que muestra el caracter protector de VCB4 y VCB5, y que apoya el caracter protector de VCB3 y el caracter de riesgo de VCB2.
Virus Propiedad Tipo de analisis
Diabetogeno Protector Seroneutralizacion Muestras de heces
VCB1
x +++
VCB2
x ++
Echo32
x ++
Echo29
x +
Echo14
x +
VCA4
x +
VCA16
x +
VCA5
x +
VCA6
x (+)
Echo18
x (+)
Echo3
x (+)
VCB3
x +++ ++
VCB6
x ++
VCB4
x ++ +
Virus Propiedad Tipo de analisis
Diabetogeno Protector Seroneutralizacion Muestras de heces
VCB5
x ++
Echo11
x + +
Echo13
x (+) (+)
Analisis de las muestras tomadas a la edad de un ano
En este estudio se recogieron un total de 284 muestras de suero de los ninos a la edad de un ano (intervalo de 321 - 430 dlas) y se estudiaron sus respuestas a la seroneutralizacion con seis serotipos VCB. Cuando se analizaron estadlsticamente utilizando el diseno de casos de referencias emparejados, VCB3 y especialmente VCB4 resultaron 5 ser protectores (Tabla 30). Por lo tanto pueden esperarse infecciones a edad temprana para proporcionar proteccion contra un proceso autoinmunitaria diabetogeno que comienza temprano.
Tabla 30. Analisis de regresion loglstica condicional de 6 serotipos VCB en las muestras tomadas a la edad de un ano. Metodo con criterios flexibles: clases 0-3 frente a 4.
RP
P Intervalo de confianza 95%
VCB1
1,05
0,857 0,62 1,79
VCB2
1,04
0,89 0,6 1,79
VCB3
0,35
0,019 0,15 0,84
VCB4
0,16
0,001 0,06 0,48
VCB5
1,2
0,724 0,43 3,34
VCB6
1,01
0,961 0,57 1,8
Momento del diagnostico de la diabetes tipo 1
10 En total, 215 muestras de suero que se obtuvieron de los ninos evolucionaron a diabetes tipo 1 y sus correspondientes referencias, Estas muestras se analizaron realizando analisis de seroneutralizacion con seis virus VCB. Cuando los analisis estadlsticos se realizaron para estos virus con configuracion transversal, VCB5 mostro una tendencia para un caracter protector (Tabla 31). Este resultado sugiere que VCB5 tiene un efecto atenuante en el proceso de autoinmunidad de la diabetes tipo 1 una vez que ya ha comenzado este proceso.
15 Tabla 31. Analisis de regresion loglstica condicional de 6 serotipos VCB en muestras tomadas en el momento del diagnostico de la diabetes tipo 1. Metodo con criterios flexibles: clases 0-3 frente a 4.
RP
P Intervalo de conf. 95%
VCB1
0,98
0,961 0,56 1,74
VCB2
1,38
0,311 0,74 2,55
VCB3
0,68
0,489 0,23 2
VCB4
0,94
0,917 0,27 3,24
VCB5
0,34
0,095 0,1 1,2
VCB6
0,92
0,803 0,48 1,77
Intervalo de muestras entre la fecha de seroconversion de autoanticuerpos y el diagnostico de diabetes tipo 1
Los resultados de la seroneutralizacion con fecha de la seroconversion de autoanticuerpos realizados con seis serotipos VCB se compararon con los resultados de las muestras de la fecha del diagnostico de la diabetes tipo 1 tomadas de los mismos ninos y utilizando los mismos virus. En este analisis, el grupo de referencia consistio en 5 ninos que fueron negativos para un virus dado en ambas muestras. Tambien en este analisis se detecto una tendencia protectora para VCB5 lo que sugiere atenuacion del proceso de autoinmunidad de la diabetes tipo 1 (Tabla 32). Curiosamente, VCB2 presentaba una tendencia de riesgo con una RP alta lo que indica que puede acelerar la evolucion del proceso autoinmunitario tras su inicio.
Tabla 32. Analisis de regresion loglstica condicional de 6 serotipos VCB. Se compararon el intervalo de muestras 10 entre la fecha de la seroconversion de autoanticuerpos y la fecha de diagnostico de la diabetes tipo 1. Metodo con criterios flexibles: clases 0-3 frente a 4. Los cambios de negativo a positivo se han analizado contra el grupo de referencia negativo a negativo.
RP
P Intervalo de conf. 95%
VCB1
0,82
0,797 0,18 3,78
VCB2
6,04
0,106 0,68 53,32
VCB3
0,78
0,778 0,14 4,36
VCB4
0,35
0,339 0,04 3,02
VCB5
0,18
0,108 0,023 1,45
VCB6
0,89
0,813 0,35 2,27
Conclusion
El analisis de las muestras tomadas en la edad de un ano demostro que las infecciones por VCB3 y VCB4 protegen a los ninos de la diabetes tipo 1. Los resultados sugieren que las primeras infecciones que se producen por VCB3 y 5 VCB4 pueden dar una protection frente al proceso autoinmunitaria diabetogeno que empieza a temprana edad. Ademas, una tendencia protectora tambien podrla estar asociada a VCB5 cuando se analizaron las muestras tomadas en la fecha de diagnostico de la diabetes tipo 1 y cuando se compararon el intervalo de tiempo entre la seroconversion de autoanticuerpos y la fecha de diagnostico de la diabetes tipo 1. Estos resultados sugieren que el mecanismo de la proteccion para las infecciones con VCB4 puede ser la atenuacion del proceso autoinmunitario 1 10 en curso. Ademas, se detecto la relation entre las infecciones con VCB2 y el riesgo de diabetes tipo 1 cuando se compararon los datos de intervalo entre muestras con fecha de seroconversion de autoanticuerpos y las muestras tomadas en la fecha de diagnostico de la diabetes.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un analisis de diagnostico para evaluar el riesgo de diabetes tipo 1 (DT1) que comprende determinar la presencia de al menos un riesgo o al menos un serotipo de enterovirus protector en una muestra corporal, por lo que la presencia de al menos un serotipo de riesgo seleccionado del grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, VCA4, VCA5, VCA6 y VCA16 indica un mayor riesgo de contraer DT1, o la presencia de al menos un serotipo protector seleccionado del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11 y Echo13 indica un menor riesgo de contraer DT1.
  2. 2. El analisis de diagnostico de la reivindicacion 1, que comprende determinar la presencia de al menos uno de VCB1, VCB2, VCB3, VCB4, VCB5 y VCB6.
  3. 3. El analisis de diagnostico de la reivindicacion 1, que comprende determinar la presencia de al menos uno de VCB1 y VCB2.
  4. 4. El analisis de diagnostico de la reivindicacion 1, que comprende determinar la presencia de al menos un serotipo de riesgo, y al menos un serotipo protector.
  5. 5. El analisis de diagnostico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde la presencia del enterovirus se determina detectando un componente del virus o una respuesta inmunitaria al mismo en la muestra corporal.
  6. 6. El analisis de diagnostico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde la presencia del virus se determina por PCR, RT-PCR, hibridacion in situ, inmunohistoqulmica, deteccion de antlgenos usando EIA u otros metodos, aislamiento del virus, secuenciacion, microscopia electronica, o microscopia inmunoelectronica.
  7. 7. El analisis de diagnostico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde la presencia del virus se determina por deteccion de una respuesta inmunitaria contra el virus midiendo la respuesta de anticuerpos especlficos del virus, o midiendo una respuesta inmunitaria al virus mediada por celulas, o mediciones de la activacion del sistema inmunitario innato.
  8. 8. Un metodo para el seguimiento de la eficacia de los tratamientos antivlricos destinado a la prevencion de la DT1, que comprende proporcionar una muestra de un paciente que ha recibido tratamiento antivlrico, y determinar la presencia de al menos un riesgo o al menos un serotipo enterovirus protector en la muestra, con lo que la presencia de al menos un serotipo de riesgo seleccionado del grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, VCA4, VCA5, VCA6, y VCA16, indica que el tratamiento no ha reducido el riesgo de contraer DT1, o
    la presencia de al menos un serotipo protector seleccionado del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11, y Echo13, indica que el tratamiento ha reducido el riesgo de contraer DT1.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende determinar la presencia de al menos uno de VCB1, VCB2, VCB3, VCB4, VCB5 y VCB6.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende determinar la presencia de al menos uno de VCB1 y VCB2.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende determinar la presencia de al menos un serotipo de riesgo y al menos un serotipo protector.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 - 11, en donde la presencia del enterovirus se determina detectando un componente del virus o una respuesta inmunitaria a este en la muestra corporal.
  13. 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 - 11, en donde la presencia del virus se determina por PCR, RT-PCR, hibridacion in situ, inmunohistoqulmica, deteccion de antlgenos empleando EIA u otros metodos, aislamiento del virus, secuenciacion, microscopia electronica o microscopia inmunoelectronica.
  14. 14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 - 11, en donde la presencia del virus se determina detectando una respuesta inmunitaria contra el virus midiendo la respuesta de anticuerpos especlficos del virus, o midiendo la una respuesta inmunitaria al virus mediada por celulas, o mediciones de activacion del sistema inmunitario innato.
  15. 15. Utilizacion in vitro uso de un equipo de diagnostico para evaluar el riesgo de DT1 o en el seguimiento de la eficacia de los tratamientos antivlricos destinados a la prevencion de DT1, en donde el equipo comprende
    medios para determinar la presencia de al menos un riesgo y al menos un serotipo enterovirus protector en un muestra corporal, por lo que el serotipo de riesgo se selecciona entre el grupo que consiste en VCB1, VCB2, Echo3, Echo14, Echo18, Echo29, Echo32, CAV4, CAV5, CAV6, y CAV16, y el serotipo de protection se selecciona del grupo que consiste en VCB3, VCB4, VCB5, VCB6, Echo11, y Echo13.
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