ES2606214T3 - Técnicas espectroscópicas mejoradas que usan conformación de haz espacial - Google Patents

Técnicas espectroscópicas mejoradas que usan conformación de haz espacial Download PDF

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Abstract

Un método de espectroscopia Raman para recoger una señal de Raman con ruido o fluorescencia de fondo reducidos, comprendiendo el método: excitar una señal de Raman iluminando una muestra usando un haz de rayos láser que está conformado de modo que su máximo de intensidad se propague lejos del eje óptico espectroscópico y tenga un punto oscuro en su centro, en donde el haz de rayos láser se selecciona entre: un haz Laguerre-Gaussiano; un haz Hermite- Gaussiano o un haz de Bessel, hacer pasar el haz de rayos láser conformado a través de uno o más elementos de enfoque para enfocarlo sobre la muestra, y recoger una señal de Raman a partir de la muestra.

Description

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DESCRIPCION
Tecnicas espectroscopicas mejoradas que usan conformacion de haz espacial
La presente invencion se refiere a un sistema de espectroscopia Raman y un metodo para mejorar la relacion de senal respecto a ruido de tecnicas espectroscopicas enfocadas usando conformacion de haz espacial disenada especificamente para mejorar su rendimiento.
Antecedentes de la invencion
La espectroscopia Raman es un potente metodo para obtener una signatura quimica que defina la estructura molecular interna de una muestra. Las aplicaciones y principios de la espectroscopia Raman son bien conocidos y, por lo tanto, en el presente documento no se describiran en detalle. La espectroscopia Raman es una tecnica de dispersion de luz inelastica que usa el efecto Raman. En un sistema de espectroscopia Raman tipico, un laser de excitacion ilumina una muestra, por ejemplo una muestra molecular o celular, que contiene diversas moleculas que proporcionan la senal de dispersion de Raman. La luz, que es dispersada desde la muestra, exhibe un desplazamiento de frecuencia que refleja la energia de vibraciones moleculares especificas dentro de la muestra. Esto proporciona una composicion quimica detallada de la muestra - una huella quimica.
Dado que puede aplicarse a muestras en un amplio intervalo de tamano desde celulas individuales hasta tejido intacto, la espectroscopia Raman tiene un potencial significativo en la ciencia biomedica, por ejemplo en la deteccion temprana de una enfermedad. Sin embargo, un desafio fundamental de la espectroscopia Raman es que la senal es muy debil y puede ser enmascarada por la fluorescencia de fondo que es generada a partir de componentes dentro de la disposicion optica, asi como en la muestra. En particular, puede generarse fluorescencia a partir de revestimientos sobre la superficie de los componentes opticos y/o dentro de los propios componentes opticos. Se ha realizado un esfuerzo considerable por mejorar la relacion de senal con respecto a ruido de fondo para espectroscopia Raman. Pueden conseguirse algunos beneficios incrementando el tiempo de adquisicion normalmente a varios minutos. Sin embargo para celulas vivas, tiempos de adquisicion largos pueden causar danos debido a una irritacion prolongada por el laser de excitacion Raman.
La figura 1 muestra un equipo de microscopio de espectroscopia tipico que incluye una fuente de luz, una lente de objetivo para enfocar luz procedente de la fuente sobre un plano de muestra, un colimador para colimar la luz procedente del plano de muestra, y una lente adicional para enfocar la luz colimada sobre un detector que mide el espectro. La senal de Raman se generara en el plano de muestra y sera recogida eficazmente sobre el detector. Adicionalmente, la fluorescencia generada a partir del sistema optico sera recogida con eficiencia variable. Se muestra la trayectoria de la luz fluorescente generada a partir de un punto especifico en la lente de objetivo. La cantidad de fluorescencia recogida y detectada depende de la fluorescencia total generada inicialmente, la distancia desde el eje paraxial y la distancia desde el plano focal. Cuanto mas cerca este el punto de fluorescencia del eje paraxial y/o del plano focal, mas fluorescencia se detecta. La cantidad de fluorescencia detectada tambien depende de la intensidad de la excitacion, el perfil del haz y la eficiencia de recogida. Por ejemplo, cuando se excita con un perfil de haz Gaussiano, la intensidad maxima esta situada a nivel central haciendo que la mayor cantidad de fluorescencia se genere bajo el centro del eje paraxial, permitiendo que sea recogida de forma eficiente por el detector. Esto es un problema.
El documento US 2006184037 describe un sistema de imaginologia optica. En una realizacion, la luz pasa a traves de una guia luminica anular hacia una lente que enfoca la luz sobre un area de muestra. Las emisiones procedentes de la muestra son recogidas en reflexion. No hay, sin embargo, ninguna descripcion de los problemas asociados con los requisitos de sensibilidad para medir senales de Raman. Ademas, no hay ninguna ensenanza de una solucion a este problema.
Sumario de la invencion
Diversos aspectos de la presente invencion estan definidos en las reivindicaciones independientes. Algunas caracteristicas preferidas estan definidas en las reivindicaciones dependientes.
Conformando el haz de excitacion, por ejemplo formando un campo de luz anular, la presente invencion puede reducir significativamente la fluorescencia de fondo que habitualmente eclipsa las senales de dispersion de Raman, proporcionando de este modo una sensibilidad mejorada. Esto ayuda tanto a reducir la necesidad de adquisicion prolongada asi como el ruido global de la senal de Raman. Esta es una tecnica robusta y sencilla que puede implementarse facilmente en cualquier configuration de Raman.
El haz es conformado antes de la iluminacion de la muestra y/o antes de pasar a traves de uno o mas elementos de enfoque para enfocarlo sobre la muestra.
La espectroscopia puede ser, por ejemplo dispersion de Raman, dispersion de Raman intensificada en la punta (TERS), dispersion de Raman intensificada por efecto superficial (SERS).
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Breve descripcion de los dibujos
A continuacion se describiran diversos aspectos de la invencion a modo de ejemplo solamente y con referencia a los dibujos adjuntos, de los cuales:
la figura 2 es un grafico teorico de perfiles de intensidad para una serie de diferentes rayos, junto con calculos teoricos de la fluorescencia de fondo recogida;
la figura 3 es un diagrama de bloques de una disposicion experimental que se uso para ensayar los efectos de
conformacion de haz sobre espectroscopia Raman;
la figura 4 muestra espectros Raman para dos perfiles de haz diferentes;
la figura 5 muestra la desviacion estandar de cada componente espectral para los espectros de la figura 4; la figura 6 muestra la desviacion estandar de la senal de Raman con respecto al tiempo de adquisicion, y la figura 7 muestra diversas representaciones esquematicas que comparan las secciones transversales de un haz Gaussiano con las secciones transversales de un haz de Bessel.
Descripcion especfica de los dibujos
De acuerdo con la presente invencion, se usa un perfil de haz espacial disenado especialmente como fuente de iluminacion para tecnicas espectroscopicas, y en particular las tecnicas espectrocopicas basadas en Raman. Usar, por ejemplo, un haz anular en la disposicion de la figura 1 reduce la fluorescencia de fondo, ya que aleja la parte de intensidad maxima del haz de las partes centrales y, por lo tanto, mas anchas de los componentes opticos. Esto significa que menos fluorescencia global es generada y recogida por el detector. Este comportamiento es independiente en gran medida de la configuracion optica usada para generar y recoger la senal de Raman.
Podria usarse cualquier forma de haz espacial disenado, siempre que su mayor intensidad se propague lejos del eje paraxial. Por ejemplo, podria usarse un haz Laguerre-Gaussiano (LG), o Hermite Gaussiano de orden superior. La figura 2 muestra, teoricamente, la eficiencia de recogida global para un Laguerre-Gaussiano (LG) de acuerdo con la invencion y uno Gaussiano tal como se usa en la tecnica anterior.
Se consideraron dos fuentes principales de fluorescencia por separado, siendo estas la fluorescencia causada por el revestimiento sobre los componentes opticos y la fluorescencia causada por el la masa de vidrio. Los datos de la figura 2 muestran que rayos anulares son beneficiosos respecto a un perfil Gaussiano para reducir la fluorescencia de fondo. Esto es debido a que el haz anular permite que la intensidad de excitacion maxima se aleje del eje paraxial de modo que este distribuida uniformemente una distancia establecida alrededor del eje. Como consecuencia, cualquier fluorescencia generada es recogida menos eficazmente que un haz que tenga un perfil Gaussiano.
Un haz Laguerre-Gaussiano tiene un centro oscuro tal como se muestra en la figura 2. Tener un centro oscuro en el punto focal, como el de un haz LG, distribuye el haz de excitacion por un area mas grande, reduciendo el dano fotoinducido en la muestra.
La figura 3 muestra una disposicion optica para demostrar como un perfil de haz disenado reduce la fluorescencia de fondo. Se usaron elementos opticos estandar, no disenados especificamente para reducir la fluorescencia. Para los experimentos, el haz de excitacion Raman fue proporcionado por un diodo laser de alta potencia (Tui Optics TA100) que funciona a una longitud de onda de 780 nm. Se uso un holograma para crear un haz optico conformado. Este se selecciono para crear un haz LG (1=3) cuando esta en su posicion central o un perfil Gaussiano atravesandolo lejos de la posicion central, permitiendole actuar como una rejilla estandar. Se uso un telescopio para expandir el haz para maximizar la apertura numerica (AN) de la lente de objetivo mientras que al mismo tiempo se garantiza que no habia acortamiento del haz para los tres perfiles. Una lente de objetivo de AN elevada de inmersion en aceite (Nikon x100, AN=1,4) se uso para enfocar sobre la camara de una muestra mientras que un objetivo de recogida de AN mas baja (Nikon x20, AN=0,9) se uso para colimar la senal de Raman. Al hacer esto, solamente se recogio luz que se origina desde la parte central de la camara de la muestra.
La camara de la muestra se formo usando un separador de vinilo de 80 ^m de profundidad entre un portaobjetos de microscopio de cuarzo y un cubreobjetos de silice fundida (120 ^m de grosor). Un cubreobjetos de silice fundida se prefirio respecto a un cubreobjetos de cuarzo menos fluorescente dado que ayudaba a incrementar senales extranas que se derivan de la muestra. Como muestra, se uso una solucion diluida de 10 ^m de microesferas de polimero en agua destilada. Un filtro de muesca holografica de cero grados se coloco despues del objetivo de recogida para eliminar la luz de excitacion. La luz se enfoco finalmente a continuacion a traves de la hendidura de entrada de 100 ^m del espectrometro (Jobin Yvon Triax 550). El espectro de dispersion de Raman fue recogido por una camara CCD refrigerada de Peltier (Symphony OE STE Jobin Yvon). La potencia del haz de rayos laser que entra en la primera lente de objetivo se mantuvo constante (13 mW) para los tres perfiles.
Para permitir que se obtenga informacion estadistica de las mediciones, se recogieron 125 espectros para cada perfil de haz. Cada espectro tenia un tiempo de integracion de 0,2 segundos que, cuando se sumaron, dieron como resultado un tiempo de exposicion global de 25 segundos. Se realizaron dos mediciones espectrales independientes para cada perfil de haz, uno con una unica esfera de polimero presente y una medicion de fondo cuando la esfera de
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polimero esta retirada. La senal de dispersion de Raman se obtuvo restando los dos espectros. La figura 4 muestra los espectros sumados para los dos perfiles cuando la esfera de polimero estaba presente.
En cada uno de los espectros de la figura 4, se observa una gran senal de dispersion de Raman a 1000 cm-1 con todos los picos de Raman restantes estando eclipsados en gran medida por fluorescencia. Sin embargo, el perfil de haz LG observa mucha menos fluorescencia de fondo (3,4 veces menos) con solamente una reduccion muy pequena de la senal de Raman global. Esto puede observarse especialmente a partir del gran pico de fluorescencia a ~1400 cm-1 que, con un perfil Gaussiano, es significativamente mayor que el pico de Raman a 1000 cm-1. Cuando se observa el LG sin embargo, la reduccion de fluorescencia permite que la senal de Raman se convierta en el componente espectral mas grande.
El ruido presente en la senal de Raman resultante esta directamente relacionado con la cantidad de fluorescencia de fondo presente. Esta correlacion es evidente en la figura 5, que muestra la desviacion estandar de cada componente espectral. Esto demuestra como grandes cantidades de fluorescencia anaden directamente ruido a la senal de Raman. Para LG, la cantidad reducida de fluorescencia permite que pase menos ruido sobre la senal de Raman.
La figura 6 ilustra la importancia de reducir este ruido. Esto muestra la desviacion estandar de la senal de Raman con respecto al tiempo de adquisicion. A partir de esto, queda claro que el perfil de haz anular proporciona mediciones de Raman mas limpias mas rapidamente que una configuracion Gaussiana. Esto permite que picos de Raman mas pequenos se distingan del ruido usando un tiempo de adquisicion significativamente reducido. Esto es importante si Raman se va a convertir en una tecnica experimental practica en areas tales como para diagnostico medico.
Asi como rayos Laguerre-Gaussianos, podrian usarse otros rayos disenados especialmente, por ejemplo un haz de Bessel. Esto puede crearse de diversas maneras, por ejemplo usando un elemento optico de forma conica (axicon). Estos rayos mantienen su perfil de intensidad de seccion transversal a lo largo de una distancia mucho mayor que el haz Gaussiano y Laguerre-Gaussiano equivalente. El orden no cero de un haz de Bessel esta compuesto por multiples anillos concentricos que muestran la misma region oscura en el centro del haz que el haz Laguerre- Gaussiano mientras su distancia de propagacion enfocada es muchas veces mas grande. Esta propiedad mejora la disposicion optica reduciendo los requisitos de enfoque del haz de excitacion en la muestra y mediante un volumen de excitacion mayor.
La figura 7 compara las secciones transversales de un haz Gaussiano con las secciones transversales de un haz de Bessel. Muestra que, aunque el haz de Bessel tiene una region de baja intensidad en su centro que es util para suprimir la fluorescencia de fondo, tambien tiene una region focal mucho mas profunda que hace la recogida de la senal de Raman mas facil. Las figuras superiores muestran la seccion transversal del haz Gaussiano (izquierda) y de Bessel (derecha) y el par inferior las secciones longitudinales respectivas.
Un experto en la materia apreciara que son posibles variaciones de las disposiciones develadas sin alejarse de la invencion.
La fuente de excitacion incluye, por ejemplo, laseres de onda continua o pulsados y fuentes de banda ancha/super- continuas. El diseno especifico de rayos puede conseguirse por ejemplo, mediante tecnicas holograficas de fase y amplitud, elementos opticos en masa tales como lentes cilindricas y axicones asi como mascaras de fase y amplitud. Estos perfiles de haz especiales son rayos Laguerre-Gaussianos, de Bessel y rayos Hermite-Gaussianos. Esta mejora de la relacion de senal respecto a ruido puede obtenerse incrementando el nivel de senal, reduciendo la senal de fondo independientemente de su origen dentro de la disposicion optica y/o la muestra, asi como reduciendo el nivel de ruido.
La configuracion espectral abarca experimentos que usan disposiciones que contienen, por ejemplo, lentes de objetivo numericas elevadas que enfocan estrechamente el haz de excitacion. Dichas aplicaciones pueden incluir dispersion de Raman, dispersion de Raman intensificada en la punta (TERS), Dispersion de Raman intensificada por efecto superficial (SERS), microscopia por fluorescencia, microscopia multifotonica y generacion de frecuencia tal como mezcla de cuatro ondas no generadas. Estas tecnicas pueden usarse para caracterizar espectralmente muestras que incluyen celulas fijadas o vivas, y soluciones quimicas y coloides.
Por consiguiente, la description anterior de la realization especifica se realiza a modo de ejemplo solamente y no para fines de limitation. Quedara claro para el experto en la materia que pueden realizarse modificaciones menores sin cambios significativos al funcionamiento descrito.

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de espectroscopia Raman para recoger una senal de Raman con ruido o fluorescencia de fondo reducidos, comprendiendo el metodo:
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    excitar una senal de Raman iluminando una muestra usando un haz de rayos laser que esta conformado de modo que su maximo de intensidad se propague lejos del eje optico espectroscopico y tenga un punto oscuro en su centro, en donde el haz de rayos laser se selecciona entre: un haz Laguerre-Gaussiano; un haz Hermite- Gaussiano o un haz de Bessel,
    10 hacer pasar el haz de rayos laser conformado a traves de uno o mas elementos de enfoque para enfocarlo sobre la muestra, y
    recoger una senal de Raman a partir de la muestra.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la espectroscopia Raman es 15 una de: dispersion de Raman, dispersion de Raman intensificada en la punta (TERS) y dispersion de Raman
    intensificada por efecto superficial (SERS).
  3. 3. Un sistema de espectroscopia Raman que comprende medios para iluminar una muestra con un haz de rayos laser conformado para excitar una senal de Raman, uno o mas elementos de enfoque para enfocar el haz de rayos
    20 laser conformado sobre la muestra y un detector que es utilizable para detectar luz que se refleja desde o se transmite a traves de una muestra, en donde los medios para iluminar la muestra son utilizables para proporcionar un haz de rayos laser que tiene un maximo de intensidad que se propaga lejos del eje optico espectroscopico y un punto oscuro en su centro, en donde el haz de rayos laser se selecciona entre: un haz Laguerre-Gaussiano; un haz Hermite-Gaussiano o un haz de Bessel.
    25
  4. 4. Un sistema de acuerdo con la reivindicacion 4, configurado para medir una o mas de dispersion de Raman, dispersion de Raman intensificada en la punta (TERS) y dispersion de Raman intensificada por efecto superficial (SERS).
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