ES2587302T3 - Diseño racional de componentes de la glucosilación con asparagina unida catalizada por oligosacariltransferasa - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un posible componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado del grupo que consiste en (a) un posible donante de oligosacáridos, preferiblemente un oligosacárido unido a un lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, (b) una posible oligosacariltransferasa (OST), (c) un posible polipéptido con motivo de secuencia consenso, y (d) un posible inhibidor de glucosilación, que comprende las etapas siguientes (i) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, más preferiblemente todos los amino ácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485, y/o, preferiblemente y (ii) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente 1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331, W463, W464, D465 e I572, (iii) llevar a cabo preferiblemente traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en las coordenadas de los aminoácidos de los modelos tridimensionales de (i) y/o (ii), (iv) utilizar dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) de (i), (ii) y/o (iii) para diseñar o seleccionar al menos uno de los posibles componentes (a) a (d), (v) proporcionar al menos uno de dichos componentes posibles (a) a (d), y (vi) poner en contacto al menos uno de dichos posibles componentes (a) a (d) con los demás componentes funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST), (vii) identificar un componente funcional seleccionado del grupo que consiste en (A) un donante de oligosacárido funcional, preferiblemente un donante de oligosacáridos unido a un lípido funcional (OUL) o un donante de oligosacáridos unido a pirofosfato de undecaprenilo, (B) una oligosacariltransferasa funcional (OST), (C) un polipéptido funcional con motivo de secuencia consenso, y (D) un inhibidor de glucosilación funcional.

Description

imagen1

DESCRIPCIÓN

Diseño racional de componentes de la glucosilación con asparagina unida catalizada por oligosacariltransferasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la identificación o el diseño de (a) un posible donante

5 de oligosacáridos, (b) una posible oligosacariltransferasa (OST), (c) un posible polipéptido con el motivo de la secuencia consenso y/o (d) un posible inhibidor de glucosilación para utilizar en la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST), que comprende las etapas de generación de un modelo tridimensional del dominio catalítico y/o el punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, y el diseño o la selección de un posible componente seleccionado de (a) a (d) que optimiza la

10 complementariedad estereoquímica de dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) y el posible componente.

Antecedentes relevantes de la invención

Se estima que más de la mitad de todas las proteínas eucariotas son glucoproteínas, lo que implica que las cadenas laterales de aminoácidos específicos están químicamente modificadas con hidratos de carbono. La forma más abundante de estas modificaciones es la glucosilación con asparagina unida ("unida por N"), que afecta a un gran 15 número de funciones celulares que van desde el plegamiento de proteínas, el control de calidad, la selección y secreción hasta el desarrollo del organismo y las interacciones huésped-patógeno. Las asparaginas orientadas a la luz del retículo endoplásmico (RE) están específicamente glucosiladas cuando se encuentran en el "sequon" consenso Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. La reacción tiene lugar en la membrana que rodea el RE y está catalizada por la enzima oligosacariltransferasa (OST), un complejo proteico

20 hetero-oligomérico incrustado en la membrana del RE de los eucariotas superiores (véase la Fig. 1b). Una característica distintiva de la glucosilación por unión a N es su amplia especificidad con respecto al sustrato polipeptídico, que es una consecuencia directa del corto "sequon" de reconocimiento. Esta característica distingue a OST de las glucosiltransferasas que modifican restos de serina o treonina (glucosilación por unión a O) y presentan una mayor especificidad para sus sustratos proteicos.

25 La etapa clave en la glucosilación catalizada por OST es la formación de un enlace N-glucosídico entre el nitrógeno amídico de una asparagina receptora y el carbono C1 del primer resto de sacárido de un donante oligosacárido unido a un lípido (OUL) (véase la Fig. 1a). Esto da lugar a la transmisión en bloque del oligosacárido al receptor asparagina. Los detalles del mecanismo de reacción subyacente, son poco conocidos. Esto es debido a la ausencia de una visión estructural en OST en alta resolución, pero también a la naturaleza química compleja del sustrato

30 OUL, su escasez en muestras biológicas, y su insolubilidad en agua. Por el contrario, las estructuras cristalinas de diversas glucosiltransferasas solubles han sido publicadas y sus mecanismos de reacción fueron investigados con gran detalle. Para OST, el modelo actualmente aceptado sugiere que los "sequones" de glucosilación se reconozcan cuando se encuentra en segmentos de proteínas no plegadas, lo que puede ocurrir durante la translocación de proteínas en el RE o una vez que la translocación se ha completado. El componente principal catalíticamente activo

35 dentro de OST es la subunidad STT3, mientras que se cree que las demás subunidades ayudan a refinar el proceso facilitando el montaje del complejo OST o interactuando con un subconjunto de proteínas receptoras o el sustrato OUL, lo que lleva a un aumento del número de puntos de glucosilación accesibles y modificados.

La glucosilación por unión a N no está restringida a los eucariotas. Procesos homólogos se encuentran en arqueas y en taxones definidos de proteobacterias. Sin embargo, los kinetoplástidos carióticos y eucarióticos contienen una 40 enzima OST de una sola subunidad que es homóloga a la subunidad STT3 de los eucariotas superiores. En el proceso de N-glucosilación procariótico mejor estudiado interviene como mediador el locus pgl de glucosilación de proteínas de la bacteria Campylobacter jejuni (Szymanski et al. (1999) Molecular Microbiology 32, 1022-1030). El locus contiene una proteína de membrana integral denominada PgIB que comparte similitud de secuencia significativa con STT3 eucariótica, lo que sugiere una configuración de la membrana y mecanismo de reacción 45 comunes (véase la Fig. 1b). Este grupo de genes es suficiente para catalizar la glucosilación de proteínas cuando se transfiere a las células de Escherichia coli. La glucosilación de proteínas procarióticas catalizada por OST de sustratos de proteínas que contienen "sequon" es una forma económica, eficaz y conveniente de glucosilar proteínas producidas por ingeniería genética (Wacker et al. (2002), Science 298, 1790-1793). La glucosilación de proteínas por unión a N puede hacerse por ingeniería genética con diversas estructuras lipopolisacárido de O antígeno de origen 50 distinto de C. jejuni en E. coli (Feldman et al. (2005) PNAS 102 (8), 3016-3021), lo que permite la transferencia procariótica N-glucanos eucarióticos a sustratos de proteínas biotecnológicas. Glover et al. (2005, Chemistry & Biology 12, 1311-1315) demostraron por primera vez la glucosilación de proteínas in vitro utilizando membranas de células E. coli que comprenden PgIB sobrexpresada y un oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo . En 2006 Kowarik et al. (2006, EMBO J. 25(9), 1957-1966) definió más la secuencia consenso del punto de N55 glucosilación bacteriana al demostrar que la especificidad de sustrato de OST bacteriana se extiende a un aminoácido cargado negativamente en la posición 2 de la asparagina receptor, dando como resultado el "sequon" consenso Asp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr (donde tanto X1 como X2 no son prolina; SEQ ID nº: 3). Utilizando una biblioteca de sustrato peptídico, Chen et al. (2007, Biochemistry 46, 5579 -5585) confirmaron la necesidad de una

imagen2

carga negativa en la posición 2 de la asparagina receptora e identificaron la secuencia DQNAT (SEQ ID Nº: 4) como el sustrato óptimo para PglB de C. jejuni.

De lo anterior se deduce que la oligosacariltransferasa procariótica (OST) tiene una amplia especificidad para sustratos de proteínas, porque está basada en pequeños "sequon" y puede utilizarse para transferir N-glucanos

5 eucarióticos, procarióticos, así como sintéticos. Esencialmente, el sistema de N-glucosilación a base de OST procariótica requiere tres componentes, (a) un donante de oligosacáridos, preferiblemente un donante de oligosacáridos unido a pirofosfato de lípido o undecaprenilo (b) una oligosacariltransferasa procariótica (OST), (c) un posible sustrato de polipéptido con motivo de la secuencia consenso y por último si bien no menos importante, un microentorno fisiológico adecuado, p. ej., membranas celulares in vitro o in vivo.

10 El problema subyacente de la presente información es que no se puede predecir o diseñar componentes esenciales de para el muy versátil sistema de N-glucosilación basado en OST procariótica más allá de la información dada para componentes de OST ya conocidos. Además, no hay una idea de qué requisitos estructurales debe tener un posible inhibidor de glucosilación OST. Cabe esperar que dichos inhibidores tengan efectos biológicos pronunciados y podría ser de gran valor médico, para el diagnóstico y científico. El otro problema es que hasta ahora no había sido

15 posible proporcionar un modelo tridimensional del dominio catalítico y el punto de unión del polipéptido de una OST que podría haber provisto a la comunidad científica de una visión respecto a la posible variación de los componentes que intervienen en la glucosilación en la que OST actúa como mediador.

Los problemas anteriores se han resuelto mediante la provisión de la estructura tridimensional por rayos X de una OST bacteriana, la proteína PglB de Campylobacter lari (que comparte 56% de identidad de secuencia con PglB de 20 C. jejuni) en el complejo con el hexapéptido receptor DQNATF (SEQ ID nº: 5). PglB de C. lari está activa cuando se expresa junto con el grupo pgl de C. jejuni en células de E. coli, como se demuestra por la glucosilación de una proteína receptora que contiene un "sequon" consenso (véase la Fig. 2). Para su análisis estructural, PglB de C. lari se cristalizado con el hexapéptido DQNATF (SEQ ID nº: 5) que contiene el "sequon" glucosilado en el ensayo in vivo, que se había identificado como secuencia receptora óptima para PgIB de C. jejuni (véase Chen et al. 25 anteriormente). La estructura de PgIB de C. lari (712 restos de aminoácidos, SEQ ID nº: 1) se determinó utilizando una combinación de sincronización experimental y sustitución molecular, haciendo uso de la estructura determinada previamente del dominio periplásmico de PgIB de C. jejuni. Los cristales compartidos de PgIB eran pequeños, frágiles y difractaban anisotrópicamente los rayos X, extendiéndose los mejores datos naturales hasta una resolución de 3,4 Å. La estructura se ajustó a valores de R/Rlibre de 23,8 y 27,1%, respectivamente (Tabla 2). Otros

30 detalles de la estructura de PgIB de C. lari se proporcionan en el apartado experimental más adelante.

Esta nueva estructura tridimensional proporciona conocimiento en la base molecular para el reconocimiento del "sequon" y pone de manifiesto una zona catalítica que está formada por el dominio de transmembrana de la proteína y características conservadas, restos de cadenas laterales ácidas y un catión divalente unido. Estos resultados sugieren por primera vez un mecanismo para la activación del nitrógeno amídico y glucosilación y proporcionan un

35 método fundamentado para identificar y diseñar nuevos donantes de oligosacáridos, nuevas variantes de oligosacariltransferasa (OST), nuevos polipéptidos con motivo de secuencia consenso, así como inhibidores de glucosilación de OST, todos los cuales tienen utilidad en la producción de glucoproteínas biotecnológicas, diagnóstico, medicinas y como herramientas científicas.

En vista de lo anterior, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para identificar un posible

40 componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado del grupo que consiste en

(a)

un posible donante de oligosacáridos, preferiblemente un oligosacárido unido a un lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo,

(b)

una posible oligosacariltransferasa (OST),

45 (c) un posible polipéptido con motivo de secuencia consenso, y

(d)

un posible inhibidor de glucosilación,

que comprende las etapas siguientes

(i)

utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un

50 modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, más preferiblemente todos los amino ácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485, y/o, preferiblemente y

(ii) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más

preferiblemente 1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo 55 tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331, W463, W464, D465 e I572,

imagen3

(iii) llevar a cabo preferiblemente traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en las coordenadas de los aminoácidos de los modelos tridimensionales de (i) y/o (ii),

5 (iv) utilizar dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) de (i), (ii) y/o (iii) para diseñar o seleccionar al menos uno de los posibles componentes (a) a (d),

(v)

proporcionar al menos uno de dichos componentes posibles (a) a (d), y

(vi)

poner en contacto al menos uno de dichos posibles componentes (a) a (d) con los demás componentes

funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por 10 oligosacariltransferasa (OST),

(vii) identificar un componente funcional seleccionado del grupo que consiste en

(A)

un donante de oligosacárido funcional, preferiblemente un donante de oligosacáridos unido a un lípido funcional (OUL) o un donante de oligosacáridos unido a pirofosfato de undecaprenilo,

(B)

una oligosacariltransferasa funcional (OST),

15 (C) un polipéptido funcional con motivo de secuencia consenso, y

(D) un inhibidor de glucosilación funcional.

En una realización preferida, en la etapa (ii) el modelo tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari comprende al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente todos los amino ácidos M318, A331, W463, W464, D465 e

20 I572.

Las coordenadas atómicas de la Tabla 1 para su empleo en los métodos de la presente invención se muestran en la Fig. 7. Las coordenadas de rayos X de la OST de C. lari, en especial de la zona catalítica y/o el punto de unión del polipéptido complejado con el sustrato DQNAT del polipéptido optimizado (SEQ ID nº: 4) proporcionan al experto en la técnica la información tridimensional necesaria para la identificación de un posible componente para la catálisis de 25 OST y la inhibición catalítica. Las restricciones espaciales en combinación con la naturaleza química funcional de cada uno de los átomos de los aminoácidos involucrados en la acción catalítica y la unión del polipéptido, p. ej., las densidades de electrones, la posición de las fuerzas de van der Waals, las interacciones iónicas, las interacciones hidrófobas, etc. unión, informan al expertos en la técnica en modelado molecular asistido por ordenador de los requisitos previos estructurales y espaciales de (a) un posible donante de oligosacáridos, preferiblemente un

30 oligosacárido unido a lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo; (b) una posible oligosacariltransferasa (OST), (c) un posible polipéptido con motivo de secuencia consenso, y/o (d) un posible inhibidor de glucosilación.

Como se ha descrito anteriormente las OST bacterianas tienen una amplia especificidad para moléculas donantes de oligosacáridos. Con la información de coordenadas y el método de la invención, el repertorio de donantes 35 útiles de oligosacáridos puede diseñarse de forma racional y ampliarse sin tener que volver a estrategias de síntesis de prueba y error. Además, la propia OST puede variarse de forma racional sin hacer no funcionales la zona catalítica y el sitio de unión del polipéptido. Esta variación de OST es útil, por ejemplo para modificar el potencial catalítico, la especificidad de sustrato del polipéptido y/o la especificidad del donante de de oligosacáridos de las OST. Además, el motivo consenso del receptor de oligosacáridos del polipéptido puede variarse y diseñarse de

40 forma racional, lo que conduce a la generalización de la utilidad de OST tales como p. ej., la glucosilación de las zonas eucarióticas. Por último, pero no menos importante, el modelo de rayos X tridimensional de la invención proporciona una excelente base para diseñar posibles inhibidores de glucosilación, que cabe esperar que sean fisiológicamente activos al interrumpir, modificar o ralentizar la actividad de OST. Estos inhibidores tienen un gran potencial para proporcionar herramientas científicas, de diagnóstico y terapéuticas.

45 La expresión "error cuadrático medio" o "error cm" o "ecm" significa la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones de la media. En el contexto de objetos atómicos los números se expresan en angstroms (Å). Es una manera de expresar la desviación o variación de una tendencia u objeto.

El método de la invención comprende la etapa de utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la

50 cadena principal, para generar un modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos o tres, preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente al menos cinco o seis, más preferiblemente siete o todos los aminoácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485, y/o, preferiblemente y

imagen4

utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del punto de unión del polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno o dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro o cinco,

5 más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331 (o A331), W463, W464, D465 e I572.

En el punto de unión del polipéptido W463, W464 y D465 forman fuertes enlaces de hidrógeno con el grupo βhidroxilo de T en la unión "sequon" receptor. Estos restos contribuyen fuertemente a la unión "sequon" receptor y son la razón por la que una S o T se encuentra en la posición +2 de la asparagina receptor (N-X-S/T). R331 forma un puente salino con la D cargada negativamente del polipéptido receptor y por lo tanto contribuye a la unión 10 "sequon" receptor. R331 es responsable del requisito de un aminoácido cargado negativamente en la posición -2 de la asparagina receptor y es responsable de la ampliación del "sequon" consenso para la glucosilación de proteínas bacterianas unidas por N (D/E-X1-N-X2-S/T; SEQ ID nº: 3) (Fig 4a). R331 sólo se conserva en OST bacterianas y puede servir como objetivo para cambiar la especificidad de sustrato de PgIB hacia el reconocimiento de puntos de glucosilación eucarióticos. De hecho, cuando R331 ha mutado a A, el punto de glucosilación AQNAT resultante

15 (SEQ ID nº: 8) en una proteína receptora, p. ej., 3D5 con fragmento scFv modificado que contiene originalmente el "sequon" DQNAT (SEQ ID nº: 4), puede estar glucosilado, mientras este punto no sirve como sustrato para la enzima natural (Fig. 4b).

En la zona catalítica, D56, D 154 y E319 parecen responsables de la coordinación del ion metálico divalente unido, que es esencial para la catálisis. Sobre todo, D56 y E319 forman enlaces de hidrógeno con el grupo amido de la

20 cadena lateral de asparagina del "sequon" receptor unido. Esta interacción produce una rotación del enlace C-N en el grupo amido, que es importante para la activación nucleofílica del nitrógeno. D156 y R147 estabilizan la red de enlaces de hidrógeno y R375 compleja la carga negativa de uno de los fosfatos de un oligosacárido unido al lípido (OUL).

Por ejemplo, en el punto de unión del polipéptido W463, W464 y D456 podrían ser sustituidos por dos H y un E

25 (WWD → HHE). Para mantener el requisito de la carga negativa en la posición -2 del receptor asparagina, R331 podría ser sustituido por K. Para crear el requisito de una carga positiva en esta posición, R331 podría ser sustituidos por D o E. Para superar el requisito de la carga negativa en la posición -2 del receptor asparagina, R331 puede ser sustituido por A (Fig. 4). En la zona catalítica D154 y D156 puede ser sustituidos por E cada uno. E319 podría ser sustituido por D y D56 podría ser sustituido por E, respectivamente (véase más adelante). Para modificar

30 la actividad de PgIB, por ejemplo, D56, D154 y E319 podrían ser sustituidas por alaninas o la correspondiente función amino (N o Q). H485 podría ser sustituido por W ya que W aparece en OST eucariotas en esta posición.

El coordenadas de estructura de PgIB de C. lari enumeradas en la Table 1 en la Fig. 7 son accesibles para su descarga por el expertos en la técnica a partir de la base de datos pdb. (El colaboratorio de investigación para bioinformática estructural (RCSB) Base de Datos de Proteínas (PDB)). Con la ayuda de un ordenador y programas

35 de estructuras de libre acceso, como PyMOL o los programas de estructuras disponibles en el mercado, el expertos en la técnica puede generar fácilmente modelos tridimensionales útiles para el procedimiento reivindicado.

Los expertos en la técnica entenderán que un conjunto de coordenadas de estructura para una proteína, proteína/sustrato o complejo proteína/inhibidor o una de sus partes es un conjunto relativo de puntos que define una forma en tres dimensiones. Por lo tanto, es posible que un conjunto completamente diferente de coordenadas podría 40 definir una forma similar o idéntica. Por esta razón se prefiere llevar a cabo traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en las coordenadas de los aminoácidos de los modelos tridimensionales (i) y/o (ii) obtenidas a partir de las coordenadas atómicas de la Tabla 1. Estas variaciones en las coordenadas pueden generarse por manipulaciones matemáticas de las coordenadas de estructura, por ejemplo manipulación por permutaciones cristalográficas de las coordenadas de estructura, operaciones de fraccionamiento o en la matriz para conjuntos de coordenadas de

45 estructura o cualquier combinación de las anteriores.

A continuación, los modelos tridimensionales generados anteriormente se utilizan para diseñar o seleccionar al menos uno de los posibles componentes de la glucosilación de OST o un posible inhibidor. Se necesitan diversos análisis informáticos para determinar si una molécula tal como un donante de oligosacáridos específico, una OST modificada, un polipéptido con motivo de secuencia consenso de receptor de oligosacárido o un inhibidor de la 50 glucosilación está suficientemente diseñado para predecir racionalmente su funcionalidad en la reacción catalizada por OST. Deberán hacerse consideraciones espaciales, funcionales y químicas tales como la naturaleza, posición de los átomos, grado de libertad de rotación, densidad de electrones, impedimento estérico, interacciones de van der Waals, iónicas e hidrófobas, etc.. Dicho análisis se puede llevar a cabo convenientemente en ordenadores mediante aplicaciones informáticas habituales tales como CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, 1994.

55 NÚMERO 4. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763).

Las aplicaciones de similitud molecular informáticas actuales permiten comparaciones entre diferentes estructuras, diferentes configuraciones de la misma estructura y diferentes partes de la misma estructura. El procedimiento de comparación se suele dividir en cuatro etapas: (1) cargar la información estructural, (2) definir la equivalencia atómica en estas estructuras, (3) realizan una operación de ajuste (superposición) y (4) análisis de los resultados. Cada estructura se identifica mediante un nombre. Una estructura se identifica entonces como lel posible componente de OST o inhibidor de OST (es decir, el objetivo o estructura fija), todas las estructuras restantes son estructuras en funcionamiento (es decir, estructuras en movimiento). Cuando se usa un método de ajuste rígido la estructura en funcionamiento se traslada y se hace girar para obtener un ajuste óptimo (complementariedad espacial

imagen5

5 y funcional) con la estructura objetivo, p. ej. un inhibidor de OST es la estructura fija y los aminoácidos de OST se trasladan y se hacen girar para obtener el un ajuste óptimo. La operación de ajuste emplea un algoritmo que calcula el traslado y la rotación óptimos que se aplicará a la estructura móvil, de manera que el ecm del ajuste sobre los pares especificados de átomos equivalentes sea un mínimo absoluto. Después de la superposición de las dos estructuras puede calcularse un valor de ecm para conjuntos específicos de átomos equivalentes.

10 El posible componente funcional o inhibidor de la reacción de OST seleccionado o diseñado según el método de la invención como se ha descrito anteriormente proporcionará al expertos en la técnica una expectativa razonable de éxito al verificar su funcionalidad en un ensayo de rutina de actividad de OST. Para dicha finalidad, debe proporcionarse el posible componente por compra, modificación de los materiales adquiridos, síntesis química y/o biotecnológica, etc. Este posible componente a continuación tendrá que ponerse en contacto con los demás

15 componentes funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por OST, por supuesto, en condiciones que permitan la actividad de OST. Los ensayos de actividad de OST preferidos se describen en (1) 2005 Chemistry & Biology 12, 1311-1315, (2) 2006 Science 314, 1148-1150, (3) 2007 Biochemistry 46, 5579-5585, (4) 2007 Glycobiology 11, 1175-1182 y (5) 2011 Glycobiology 5, 575-583. Si los posibles componentes o inhibidores son activos o no para OST se verifica preferiblemente en comparación con

20 patrones positivos o negativos. Por ejemplo, la funcionalidad del ensayo de OST se comprueba con un conocido polipéptido receptor de oligosacáridos, p. ej., el hexapéptido DQNATF (SEQ ID nº: 5), y a continuación el posible polipéptido con motivo de la secuencia consenso funcional se sustituye por el hexapéptido y se determina la glucosilación del polipéptido sustituto. Este sencillo sistema analítico de OST se puede adaptar para identificar cualesquier componentes funcionales de OST, preferiblemente el seleccionado del grupo que consiste en (A) un

25 donante de oligosacárido funcional, preferiblemente un donante de oligosacárido unido a lípido (OUL) funcional o de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, (B) una oligosacariltransferasa (OST) funcional, (C) un polipéptido con motivo de secuencia consenso funcional y (D) un inhibidor de glucosilación funcional.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para diseñar un posible componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado del 30 grupo que consiste en (a) un posible donante de oligosacárido, preferiblemente un oligosacárido unido a lípido (OUL)

o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, (b) una posible oligosacariltransferasa (OST),

(c)

un posible polipéptido con motivo de secuencia consenso y (d) un posible inhibidor de glucosilación, que comprende las etapas siguientes

(i)

utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más

35 preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos o tres, preferiblemente al menos cuatro o cinco, más preferiblemente al menos seis o siete, aún más preferiblemente todos los aminoácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485, y/o, preferiblemente y

40 (ii) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente 1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno o dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro o cinco, aún más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331, W463, W464, D465 e I572,

45 (iii) llevar a cabo preferiblemente traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en las coordenadas de los aminoácidos de los modelos tridimensionales de (i) y/o (ii),

(iii.1) utilizar dicho modelo tridimensional de (i), (ii) y/o (iii) para evaluar la complementariedad estereoquímica entre dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) (i), (ii) y/o (iii) y un componente conocido o posible para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado de un donante

50 de oligosacáridos, preferiblemente un donante de oligosacáridos unido a lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, un polipéptido con motivo de secuencia consenso y un posible inhibidor de glucosilación, o

(iii.2) variar al menos un aminoácido en dicho modelo tridimensional de (i), (ii) y/o (iii) y usando dicha variados modelo tridimensional de (i), (ii) y/o (iii) para evaluar la complementariedad estereoquímica entre dichos modelos

55 tridimensionales (i), (ii) y/o (iii) y un componente conocido o posible para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado de un donante de oligosacáridos, preferiblemente un donante de oligosacárido unido a lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, un polipéptido con motivo de secuencia consenso, y un posible inhibidor de glucosilación,

imagen6

(iv) optimizar dicha complementariedad estereoquímica en un método iterativo observando cambios en el modelo tridimensional de (iii.1), (iii.2) o el componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST),

(v) diseñar un posible componente seleccionado de (a) a (d) que optimiza dicha complementariedad 5 estereoquímica de dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) y el posible componente,

(vi.1) proporcionar opcionalmente el posible componente optimizado, y

(vi.2) poner en contacto al menos uno de dichos posibles componentes (a) a (d) con los demás componentes funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST),

10 (vi.3) identificar un componente funcional seleccionado del grupo que consiste en (A) un donante de oligosacárido funcional, preferiblemente un oligosacárido unido a lípido (OUL) funcional o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, (B) una oligosacariltransferasa (OST) funcional, (C) un polipéptido funcional con motivo de secuencia consenso y (D) un inhibidor de glucosilación funcional.

En una realización preferida, en la etapa (ii) el modelo tridimensional del punto de unión del polipéptido de la

15 oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari comprende al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, aún más preferiblemente todos los amino ácidos M318, A331, W463, W464, D465 e I572.

Este método es básicamente muy similar al método del primer aspecto, excepto que en el método directamente sobre el posible componente de OST se diseña optimizando su complementariedad estereoquímica con los modelos

20 tridimensionales con o sin traslaciones y rotaciones de todo el conjunto en un método iterativo observando los cambios en los modelos tridimensionales o el componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST), cuando se varía al menos un aminoácido en al menos uno de dichos modelos tridimensionales.

Una vez que el posible componente de OST diseñado se selecciona en base a su complementariedad

25 estereoquímica optimizado con dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) puede opcionalmente verificarse en un análisis de OST, proporcionando preferiblemente el posible componente optimizado (por síntesis química y/o biotecnológica, compra, modificación de compuestos conocidos, etc.), poniendo en contacto dicho posible componente optimizado con los demás componentes funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST). En una última etapa opcional el componente funcional de la reacción

30 de OST o uno de sus inhibidores se identifica por su impacto en la reacción de OST. Normalmente, se utilizan componentes de referencia positivos y negativos para verificar la actividad del ensayo de OST.

En una realización preferida de los métodos de la presente invención para la identificación o el diseño de posibles componentes de OST, el modelo de zona catalítica tridimensional específica de la etapa (i) comprende además uno

o más, preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10, más preferiblemente todos los aminoácidos

35 seleccionados del grupo que tiene restos situados a la distancia de Van der Waals al péptido unido de la SEQ ID nº: 2, seleccionado preferiblemente de los que están a una distancia de 5 Å a dicho péptido, seleccionado más preferiblemente del grupo que consiste en T53, T54, N55, D56, N146, R147, Y152, E315, T316, I317, M318, E319, V320, N321, R331, L374, R375, Y433, S435, V438, W463, W464, D465, G482, H485, I572, V575.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un medio legible por máquina que comprende, p. ej. almacenar

40 (i) las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, que comprende preferiblemente al menos una, dos o tres, preferiblemente al menos cuatro o cinco, más preferiblemente al menos seis o 7, aún más preferiblemente todos los aminoácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485, y/o, preferiblemente y

45 (ii) las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente 1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del punto de unión all polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno o dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro o cinco, aún más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331 (o A331), W463, W464, D465 e I572,

50 (iii) preferiblemente las coordenadas atómicas de (i) o (ii) modificadas mediante la realización de traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en dichas coordenadas.

El medio anterior es particularmente útil para una variedad de propósitos, tales como el diseño de fármacos asistido por ordenador, el descubrimiento de fármacos y el análisis cristalográfico por rayos X de las OST de otras bacterias.

imagen7

A continuación, la presente invención se ilustrará más con referencia a formas de realización y experimentos específicos que no se pretende que sean interpretados como restrictivos del alcance de la invención tal como se presenta en las reivindicaciones adjuntas.

La SEQ ID nº: 1 enumera los 712 aminoácidos de la oligosacariltransferasa (OST) de PgIB de C. lari.

imagen8

5 La SEQ ID nº: 2 enumera los aminoácidos del hexapéptido DQNATF{pNO2} (donde F{pNO2} es paranitrofenilalanina) que representa el sustrato receptor de oligosacárido optimizado para la OST. Este hexapéptido se cristalizó junto con la BSO de PgIB de C. lari para dar las coordenadas atómicas de la estructura de la Tabla 1 a continuación, cuyas estadísticas se proporcionan en la Tabla 2. 10 La Tabla 1 se muestra en la Fig. 7. Enumera las coordenadas de la estructura atómica de la oligosacariltransferasa cristalizada (OST, cadena A) de Campylobacter lari complejada con la secuencia DQNATF del péptido {pNO2} (SEQ ID nº: 2) (cadena B), el sustrato óptimo para la glucosilación OST y un ion de metal divalente unido (cadena C), útil para generar un modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari. La tabla contiene la información siguiente:

15 COLUMNAS CONTENIDO 1-6 Átomo 7-11 Número de serie del átomo 13-16 Nombre del átomo 17 Indicador de posición alternativa

20 18-20 Nombre de resto 22 Identificador de cadena 23-26 Número de secuencia de restos 27 Código para la inserción de restos 31-38 Coordenadas ortogonales de X en Angstroms

25 39-46 Coordenadas ortogonales de Y en Angstroms 47-54 Coordenadas ortogonales de Z en Angstroms 55-60 Ocupación 61-66 Factor de temperatura (por defecto = 0,0) 73-76 Identificador de segmentos, justificado a la izquierda

30 77-78 Símbolo del elemento, justificado a la derecha 79-80 Carga en el átomo La Tabla 2 muestra la recopilación de datos de rayos X y las estadísticas de afino de la Tabla 1 en la Fig. 7.

A. Estadística de la recopilación de datos a Sin factores Recm indicados por HKL debido a anisotropía severa

imagen9

Serie de datos

Natural EMP1 EMP2 EMP3

Trayectoria del rayo / detector

MD2 en S06SA/PX1 (Mar225) SLS HighRes en S06SA/PX1 (Pilatus) SLS MD2 en S06SA/PX1 (Mar225) SLS MD2 en SLS S06SA/PX1 (Mar225)

Programa informático

XDS/HKL XDS HKL HKL

Longitud de onda (Å)

1,0 1,0 1,0 1,0

Grupo espacial

P212121 P212121 P212121 P212121

Celda unitaria: a (Å)

85,06 85,5 86,1 87,8

b (Å)

116,1 116,4 117,0 119,4

c (Å)

175,04 175,2 174,8 169,9

Resolución

30-3,4 30-4,45 30-3,8 30-4,2

Posiciones cristalinas recopiladas

12 3 4

Totalidad (%)

99,3 (97,6%) 99,6 (100%) 92,3 (68,3) 96,9 (84,2)

Redundancia

9,6 (8,7) 11,1 9,2 (7,3) 9,2 (7,2)

<I/□(I)>

13,2 (1,3) 10,8 (2,25) 11,1 (0,8) 13,2 (2,6)

RecmF (XDS) (%)

13,9 (132,8) 15,2 (86,3)

Recm (HKL) (%)

13,3a 16 (50,7)

B. Estadísticas de afino (datos no elaborados) Resolución (Å) 30 – 3,4 Nº de reflexiones equipo en operación (equipo de prueba) 21.834 (2.000)

5 Rop/Rlibre (%) 23,8 / 27,1

ecm del óptimo longitudes de enlace (Å) 0,011 ángulos de enlace (°) 1,475

Factor B medio (Å2) 10 PglB 129 Péptido 117

Análisis de Ramachandran (Molprobity) Ramachandran favorecidos 82,6% Ramachandran valores atípicos 1,5%

15 Figuras

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La Fig. 1 muestra esquemáticamente el proceso de glucosilación de proteínas unidas a N. a. Proteínas que contienen "sequones" receptores (NxT/S en eucariotas, D/Ex1Nx2 T/S (SEQ ID nº: 3) en bacterias) están glucosiladas en el resto de asparagina por la acción de OST. La reacción química incluye una activación del nitrógeno amídico y la formación de un enlace glucosídico. b. Similitudes y características distintivas de la glucosilación por unión al N en bacterias (cuadro izquierdo) y eucariotas (cuadro derecho). La enzima principal de la OST es STT3 (PglB en las bacterias), que se conserva en la secuencia y estructura en todos los ámbitos de la vida. Los restos de lípidos y el oligosacárido son similares pero no idénticos en bacterias y eucariotas, como se indica. Ambos contienen un resto de isoprenoide-pirofosfato que se hidroliza después de la etapa de glucosilación.

La Fig. 2 muestra la actividad de PglB de la oligosacariltransferasa de C. lari. Se transformaron células de E. coli con una combinación de tres plásmidos independientes: (i) el mecanismo de la glucosilación de C. jejuni que genera OUL, pero contiene PglB inactivada; (ii) Una proteína receptora (3D5 del fragmento scFv modificado) que contiene el "sequon" DQNAT (SEQ ID nº: 4) y (iii) PglB de C. lari funcional. Téngase en cuenta que la estructura cocristalina presentada en la presente memoria contiene PglB de C. lari unida a un péptido receptor que contiene la secuencia utilizada en el ensayo. La glucosilación de la proteína receptora se analizó en extractos periplásmicos, mientras que la expresión de PglB se analizó en extractos de células enteras. Las proteínas se analizaron por inmunotransferencia utilizando anticuerpo anti-c-Myc que detecta sustrato scFv (parte superior), antisuero hr6 específico para glucanos (medio) o antisuero anti-HA que detecta PglB (parte inferior). Los montajes de PglB se indican encima de los carriles: Vector de referencia (ev), natural (wt) o mutaciones en código de una sola letra. La glucosilación de 3D5 produce un cambio de movilidad desde la forma no modificada (g0) a la forma glucosilada (g1). PglB funcional está parcialmente auto-glucosilada en N535 y N556, lo que da como resultado dos bandas adicionales (g1 y g2). Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado, y se presentan muestras representativas.

La Fig. 3 es una imagen que muestra la estructura y sustrato que unen cavidades de PglB de C. lari. a. Diagrama de cintas de PglB en dos orientaciones, con dominios TM y periplásmicos. La supuesta posición de la membrana está indicada por líneas y se muestra la posición del péptido sustrato unido. b. Representación lineal de PglB con el péptido receptor unido. Dos cavidades están presentes en caras opuestas de la proteína (marcadas), proporcionando acceso para los sustratos. Las cavidades están conectadas por una ventanilla que acomoda la cadena lateral de la asparagina receptora (no visible en este modo de presentación).

La Fig. 4 muestra el reconocimiento del "sequon" de glucosilación por PgIB. a. Una imagen que muestra el punto de unión del péptido y el reconocimiento del "sequon" en PgIB. El péptido receptor se muestra en formato de línea y cada uno de los aminoácidos está etiquetado con el código de tres letras. Los restos de PgIB que contribuyen a la unión específica del "sequon" están en formato de bola y bastón y están etiquetados con el código de una sola letra incluidos los números de aminoácidos. Los enlaces de hidrógeno entre el motivo WWD y la Thr en +2 del péptido receptor se indican mediante líneas de trazos, b. Actividad de PgIB de oligosacariltransferasa de C. lari y R331A mutante de PgIB frente a diferentes "sequones" de glucosilación: células de E. coli se transformaron con una combinación de tres plásmidos independientes: (i) El mecanismo de la glucosilación de C. jejuni que genera OUL, pero contiene PgIB inactivada; (ii) Una proteína receptora (3D5 del fragmento scFv modificado ) que contiene ya sea el "sequon" DQNAT (SEQ ID nº: 4) o el "sequon" AQNAT (SEQ ID nº: 8) y (iii) PgIB o R331A mutante de PgIB funcional de C. lari. Se analizó la glucosilación de la proteína receptora en extractos periplásmicos, mientras que la expresión de PgIB se analizó en extractos de células enteras. Las proteínas se analizaron por inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-c-Myc que detecta sustrato scFv (parte superior), antisuero hR6 específico de glucanos (medio) o antisuero anti-HA que detecta PgIB (parte inferior).Los montajes de PgIB están indicados encima de los carriles y los "sequones" receptores están indicados encima de las líneas. La glucosilación de 3D5 produce un cambio de movilidad de la forma no modificada (g0) para la forma glucosilada (g1). La PgIB funcional está parcialmente autoglucosilada en N535 y N556, lo que da como resultado dos bandas adicionales (g1 y g2).

La Fig. 5 muestra la zona catalítica y la activación del nitrógeno amídico. a. Cadenas laterales seleccionadas de PgIB están en formato de bola y bastón y están etiquetadas en código de una sola letra incluidos los números de aminoácidos. El péptido receptor se muestra en formato de línea y la asparagina activado está etiquetada. El catión divalente catalítico se muestra como una esfera. Las líneas discontinuas indican enlaces de hidrógeno o interacciones ligando-metal como se sugiere en las mediciones de distancias. b. Estructura química de la zona catalítica, lo que indica interacciones como en a. Las líneas de trazos finos indican cadenas principales de proteínas y péptidos. c. Supuesto mecanismo de activación del nitrógeno del grupo amido. La cadena lateral de asparagina libre presenta deslocalización/conjugación del par de electrones del nitrógeno, como se indica por las fórmulas de resonancia. Cuando se une a PgIB, el grupo amido de la asparagina receptora puede formar enlaces de hidrógeno con los grupos carboxilo del D56 catalíticamente esencial y E319, lo que requiere rotación alrededor del enlace C-N (flecha). Esto daría lugar a la rotura de la conjugación y un aumento de nucleofilia del nitrógeno.

Fig. 6: Mecanismo de glucosilación propuesto. a. Se muestran superficies de dominios TM y periplásmico de PgIB. El péptido receptor unido está en formato de bola y bastón, y las líneas negras indican los extremos N y C. La estructura química de OUL bacteriana se muestra esquemáticamente en blanco para destacar las supuestas interacciones del grupo pirofosfato con las de cationes divalentes (M2+) y con el R375 conservado, al tiempo que permite una disposición colineal de los grupos atacante y saliente de la sustitución nucleófila. Una flecha indica el ataque del nitrógeno amídico activado. Una muesca predominantemente hidrófoba se indica en la superficie de PgIB, donde cabe esperar que los restos isoprenoides se introduzcan en la bicapa lipídica. b. Mecanismo en tres etapas propuesto de glucosilación catalizada por PglB. Los episodios moleculares que conducen de una etapa a la siguiente están indicados junto a las flechas. La estructura cristalina observada refleja el estado superior, con el

imagen10

5 péptido receptor unido a la proteína y el la mitad del terminal C del bucle EL5 externo ordenado. El estado de la parte inferior izquierda refleja el estado fundamental, sin sustratos unidos y con el bucle externo EL5 desordenado, indicado por líneas discontinuas. En el estado de la parte derecha inferior, OUL de C. jejuni (línea negra para restos isoprenoides, P para fosfato, elipsoides para restos de sacáridos) está unido y la asparagina receptora está glucosilada.

10 Fig. 7: véase el comentario en la Tabla 1 anterior.

Ejemplos

Métodos

Complementación in vivo

Para analizar la actividad de PgIB de C. lari in vivo el gen que codifica pgIB se amplificó en el grupo de genes pgl de

15 ADN genómico de la cepa Campylobacter lari (muestra proporcionada gentilmente por H. Hächler, Lucerna, Suiza) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se clonó en un plásmido pMLBAD (Lefebre y Valvano, Appl. Environ. Microb. 68, 5.956-5.964 (2002) con una etiqueta HA en el terminal C fusionada a PgIB, dando lugar al plásmido pMIK71. Para los estudios de complementación el vector vacío pMIK71 o pMLBAD se transformó en células SCM6 de E. coli que llevan los plásmidos pCL21 (2011 Bioconjug. Chem. 3, 488-496) o pCL64 y

20 pACYCpglmut (Wacker et al., Science 298, 1790-1793 (2002). pCL21 codifica la expresión del fragmento Fv de una sola cadena de 3D5 que lleva un punto de glucosilación DQNAT (SEQ ID nº: 4) en la región del enlazador y una etiqueta Myc en el terminal C fusionada a 3D5. En pCL64 el punto DQNAT de pCL21 se sustituyó por un punto de glucosilación AQNAT (SEQ ID nº: 8). pACYCpglmut codifica la biosíntesis del oligosacárido unido a lípido (OUL) de C. jejuni con un gen pgIB de C. jejuni inactivado (W458A y D459A). A 5 ml de precultivo se inoculó en un único clon y

25 se cultivó durante la noche a 37°C en medio LB. El

cultivo principal se inoculó a una densidad óptica (A600) de 0,05 en 15 ml de medio LB y se cultivó a 37°C a A600 de 0,5. El cultivo se provocó por adición de arabinosa al 0,1% (p/v) y se cultivó durante 4 horas a 24°C. Para la extracción de proteínas periplásmicas un equivalente de 1 ml de volumen de cultivo con una Α600 de 3,0 se recogió por centrifugación, se volvió a poner en suspensión en 150 μl de tampón de extracción, que consiste en Tris-HCl 30 30 mM, pH 8,5; 20% (p/v) de sacarosa; EDTA 1 mM y 1 mg/ml de lisozima (Sigma) y se incubó durante 1 h a 4°C. Una etapa de centrifugación final proporcionó proteínas periplásmicas en el sobrenadante. La glucosilación de 3D5 y la expresión de PgIB se analizaron por SDS-PAGE (realizado según Lämmli). La inmunodetección se realizó con anticuerpos anti-c-Myc monoclonales (Calbiochem) y suero HR6 antiglucano (Amber S. y Aebi M., comunicación personal) para observar 3D5 glucosilada. La inmunodetección de PgIB de C. lari se realizó con antisuero anti-HA

35 (Santa Cruz).

Estudio de mutagenia

Se generó PgIB mutante por el método QuickChange. Se generó plásmido pCL64 por ligadura de ADN fosforilado, bicatenario de los oligonucleótidos CTAGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGCCCAGAACGCCA y CCGGTGGCGTTCTGGGCACCACCACCAGAACCACCACCACCG en el plásmido pCL21 digerido con NheI y

40 Agel. Los plásmidos resultantes de todas los montajes se validaron por secuenciación del ADN. Las variantes de PgIB mutantes se clonaron en pMLBAD como anteriormente y se utilizaron en ensayos de complementación.

Purificación de PgIB

El gen que codifica pgIB se clonó en un plásmido de expresión pBAD modificado (Invitrogen) con una etiqueta de afinidad de decahistidina en el terminal C fusionada a PgIB, dando lugar al plásmido Psf2. Debido a la estrategia de 45 clonación aplicada, PgIB llevaba la mutación K2E y el plásmido se confirmó por secuenciación del ADN (Microsynth). PgIB de C. lari se sobreexpresó desde Psf2 en células BL21-Gold (DE3) de Escherichia coli (Stratagene) en un fermentador de 30 l (Infors). Las células se cultivaron a 37°C en medio Terrific Broth enriquecido con 1% de glicerol (p/v) a una densidad óptica (A600) de 10,0 antes el cultivo se provocó por la adición de 0,1% de arabinosa (p/v) durante 2 h. Todas las etapas siguientes se realizaron a 4°C a menos que se especifique de otra

50 manera. Las células se recogieron por centrifugación, se volvieron a poner en suspensión en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; NaCl 250 mM y se disgregaron en un microfluidizador M-110L (Microfluidics) a 103 MPa (15.000 psi) de presión externa. Las membranas se sedimentaron por ultracentrifugación a 100.000 g durante 0,5 h. PgIB se disolvió en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; NaCl 250 mM; 10% de glicerol (v/v) y 1% de N-dodecil-β-D-maltopiranósido (p/v) (DDM, Anatrace) durante 1 h.

55 Todos los tampones posteriores contenían DDM como detergente. El sobrenadante se enriqueció con imidazol 25 mM y se cargó en una columna de afinidad SuperFlow NiNTA (Qiagen), se lavó con imidazol 60 mM antes de PgIB y se eluyó con imidazol 200 mM. La proteína se desaló en MES 10 mM-NaOH, pH 6,5; NaCl 100 mM; EDTA 0,5 mM; 3% de glicerol (v/v); 3% de polietilenglicol 400 (v/v) y se concentró a 7-10 mg/ml en un concentrador Amicon Ultra-15 (Millipore) con un umbral de peso molecular de 100 kDa.

imagen11

Cristales naturales

5 El péptido Ac-DQNATF{4NO2}-NH2 (SEQ ID nº: 6) se añadió a PgIB concentrada hasta una concentración final de 0,75 mM, se incubó durante 0,5 h, y se cristalizó por difusión con vapor en gotas depositadas a 20°C frente a un depósito de glicina 100 mM, pH 9,4; acetato de magnesio 50 mM; 6% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (v/v) y 2334% (v/v) de polietilenglicol 400. La relación proteína a volumen del depósito en la gota depositada era 2:1. Los cristales aparecieron normalmente después de tres a cuatro semanas y maduraron a tamaño completo en seis

10 semanas. Los cristales se congelaron rápidamente directamente por inmersión en nitrógeno líquido antes de la recopilación de datos.

Derivados de metales pesados

Los cristales naturales se remojaron durante 30-60 min en de fosfato de etil-mercurio (EMP) 1 mM antes de volver a remojarlos y de congelación ultrarrápida por inmersión en nitrógeno líquido.

15 Recopilación de datos

Los cristales pertenecían al grupo espacial P212121, con un complejo PglB-péptido en la unidad asimétrica. Se recogieron datos no elaborados en la trayectoria del haz X06SA del microdifractómetro en la fuente de luz Swiss (SLS, Villigen) porque no todas las secciones de los cristales difractan igual de bien. Los conjuntos de datos derivados EMP2 y EMP3 (véase la Tabla 2 anterior) se recopilaron en la misma estación, mientras que EMP1 se

20 recopiló en la estación de alta resolución de la misma trayectoria del haz. Los datos se procesaron y se juntaron con XDS (Kabsch, W. Xds. Acta Crystallogr. D66, 125-132, (2010) o HKL2000 (HKL Research, Inc.).

Determinación de la estructura

La estructura se determinó utilizando una combinación de sustitución molecular utilizando el dominio periplásmico de PgIB de C. jejuni (código 3AAG de pdb) como un modelo de búsqueda y Phaser (Mccoy et al., Phaser 25 crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674, 2007) por una parte y sustitución isomorfa múltiple con dispersión anómala (MIRAS) usando SHARP (Global Phasing Limited) por la otra. El proceso de cálculo de fase y construcción de modelos (usando O; Jones et al., Acta Crystallogr. A47, 110-119, 1991) y afino (usando Phenix;. Adams et al., Acta Crystallogr. D66, 213-221, 2010) se iteró, comenzando con el dominio periplásmico y extendiéndose en las regiones mejor ordenados del dominio TM (TM1-4 y TM10-13) seguido de TM5-9. Las

30 posiciones de las tres cisteínas en el dominio TM (indicado por los picos anómalos Hg) sirvieron como puntos de partida para el rastreo hasta que la muy buena densidad permitió la colocación de restos voluminosos, lo que confirma el registro de secuencia. La estructura final excluye dos bucles desordenados de PgIB (restos 283-306 y restos 605-607), así como la etiqueta de polihistidina C-terminal. En la Tabla 2 anterior se dan la recopilación de datos y estadísticas de afino.

35 Resultados y conclusiones

Estructura de PgIB de C. lari

De acuerdo con las predicciones anteriores (Kelleher y Gilmore, Glycobiology 16, 47-62, 2006) la estructura de rayos X reveló que PgIB consta de dos dominios (Fig. 3a), un dominio transmembrana (TM) que comprende los restos 1432 y un dominio periplásmico que comprende los restos 433-712. Además del enlace covalente, los dos dominios 40 interactúan ampliamente mediante interacciones no covalentes, proporcionadas principalmente por el primer bucle externo (EL1) del dominio TM que forma dos hélices colocadas en paralelo al plano de la membrana (EL1-h1 y EL1h2). El dominio periplásmico pone de manifiesto una estructura α/β mixta que alberga el motivo de la secuencia más conservada de la familia de proteínas (véase más adelante). Las estructuras de dos dominios periplásmicos relacionados, uno de PgIB de C. jejuni y otro de AgIB de Pyrococcus Furiosus, se han descrito anteriormente (Maita

45 et al., J. Biol. Chem. 285, 4941-4950, 2010; Igura et al., Embo J27, 234-243, 2008). Sin embargo, estos dominios aislados eran catalíticamente inactivos e incapaces de unirse a péptidos receptores. La presente estructura de PgIB completa proporciona una base molecular para esta observación al poner de manifiesto que el dominio TM es indispensable tanto para la unión como para la catálisis de péptidos.

A diferencia del dominio periplásmico, el dominio TM presenta un nuevo plegamiento, con 13 segmentos TM

50 conectados mediante bucles citoplásmicos y externos (extracitoplásmicos) relativamente cortos, con la notable excepción de los bucles largos externos EL1 y EL5. En base a las alineaciones de secuencias y a las predicciones del segmento TM, la configuración observada parece conservarse en la familia de proteínas STT3. TM1-4 y TM1013 forman los puntos de unión del "sequon" y catalíticos y proporcionan la mayor parte de la interfase con el dominio periplásmico, mientras que TM5-9 son hélices TM cortas, paralelas normales al plano de la membrana. Pueden

55 interactuar con los oligosacáridos o restos de bactoprenol o proporcionar un espaciador para la unión remota de EL5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(véase más adelante). Mientras que EL1 está bien ordenado e interactúa firmemente con el dominio periplásmico, EL5 está sólo parcialmente ordenado, con 25 restos escasa o completamente desordenados en las cartografías de densidad de electrones. La sección ordenada de EL5 interactúa tanto con el dominio periplásmico como con el péptido receptor unido, lo que sugiere un cometido crucial en la captación y unión del "sequon". Es concebible que en ausencia de péptidos, EL5 sea completamente flexible y esté desordenado, lo que representa el hallazgo de que ningún cristal de PgIB se desarrolló en ausencia de péptido receptor. En el estado de péptido unido, PgIB forma dos grandes cavidades por encima de la superficie de la membrana, ambas accesibles desde el espacio periplásmico, pero situadas en los lados opuestos de la proteína (Fig. 3). La cavidad del lado izquierdo proporciona acceso para las proteínas receptoras como se sugiere por la presencia de péptido unido en la estructura, mientras que la cavidad del lado derecho alberga los restos catalíticos (véase más adelante) y probablemente sirve como el sitio de unión para el sustrato OUL. Las dos cavidades están conectadas por una ventanilla, a través del cual la asparagina receptora del péptido unido se extiende desde el punto de unión al péptido en la supuesta zona catalítica.

Unión y reconocimiento del sequon receptor

Se determinó la estructura de PgIB en el complejo con el hexapéptido DQNATF (SEQ ID nº: 5), y se observó densidad clara para el péptido en una posición que colocaba la asparagina receptora unos 15 Å por encima de la superficie de la membrana (Fig 3a). Los puntos de unión al péptido y las zonas catalíticas son las regiones mejor ordenadas de la estructura, y la densidad de electrones permitió una asignación inequívoca del registro del péptido receptor. Casi el 80% de la superficie de contacto (calculada por areaimol; Bailey, S., Acta Crystallogr. D50, 760763, 1994) del péptido está enterrada en la interfaz de los dominios TM y periplásmico (lo que sugiere una muy estrecha unión junto con una configuración firmemente impuesta. El hexapéptido forma un bucle que casi completa un giro de 180°; en consecuencia, los sustratos de polipéptidos tienen que presentar sus "sequones" de glucosilación en bucles suficientemente grandes, flexibles y expuestos en la superficie, debido a que la cavidad de PgIB de unión al péptido no parece fijar los dominios de la proteína completamente plegada. Una parte importante de la interacción del dominio TM con el péptido es proporcionada por el bucle externo EL5, que también presenta un resto de metionina que se asemeja a una silla de montar para el péptido. La configuración observada del péptido sería incompatible con un resto de prolina en la posición +1, según la observación de que +1 prolinas no están permitidas en "sequones" de glucosilación. Una característica distintiva de glucosilación unida por N es el requisito de una serina o treonina en la posición +2 de la "sequon" receptor. La estructura de PgIB proporciona una explicación molecular al poner de manifiesto que el grupo β-hidroxilo de la Thr en +2 del péptido unido forma tres enlaces de hidrógeno, uno con cada una de las cadenas laterales del "motivo WWD", que está estrictamente conservado en las proteínas STT3 (Fig. 4). El motivo WWD se encuentra en el dominio periplásmico, y la interacción de las dos cadenas laterales de triptófano y aspartato saturan la capacidad de enlaces de hidrógeno del grupo βhidroxilo, un grupo funcional que sólo está presente en las serinas y treoninas. La disposición separa físicamente la Thr en +2 de la asparagina receptora, y se supone que el motivo WWD define la especificidad del sustrato por el polipéptido, pero no interviene directamente en la actividad catalítica de la enzima. Especialmente, la estructura también puede explicar preferencias y desviaciones en la posición +2 de los "sequones" de glucosilación. El grupo γmetilo de la Thr en +2 está en contacto de Van der Waals con la isoleucina conservada I572 de PgIB (distancia de 3,6Å al grupo γ-metilo de I572, fig. 4). Esta interacción estabilizante está ausente si una serina está en la posición +2. Esto puede explicar que las "sequones" receptores que contienen una Thr en +2 están glucosilados 40 veces más eficazmente que si contienen una serina en +2 (Bause, E., Biochem. Soc. T12, 514-517, 1984). La estructura sugiere que la treonina artificial con configuración S dos podría causar un choque estérico con I572. La treonina con configuración S de hecho no está permitida en la posición +2, con una reducción de 15.000 veces en la eficacia de la glucosilación en comparación con la treonina con configuración R (Breuer et al., Febs Lett. 501, 106-110, 2001). I572 se conserva en bacterias y se ha sugerido para formar parte de un motivo Mxxl (SEQ ID nº:. 7; Maita et al., J. Biol Chem 285, 4941-4.950, 2010). Sin embargo, el resto correspondiente en la proteína AGIB de arqueas resultó ser una lisina (Igura et al., Embo J27, 234-243, 2008) y las alineaciones de secuencias con homólogos eucarióticos de STT3 no ponen de manifiesto una conservación clara de I572, lo que sugiere que otros restos distintos de isoleucina pueden proporcionar contactos con la Thr en +2 en proteínas homólogas. La estructura de PgIB también puede explicar desviaciones permitidas de los "sequones" consenso: La secuencia receptora N-X-C, presente en ~2,2% de los puntos de glucosilación determinados experimentalmente del glucoproteoma de ratón (Zielinska et al., Cell 141, 897-907, 2010), está probablemente permitido porque el grupo β-sulfhidrilo de la cisteína puede formar enlaces de hidrógeno similares a los de un grupo β-hidroxilo. Glicines, alaninas y valines también se han descrito en la posición +2 de "sequones" glucosilados, aunque sólo en escasez (Zielinska et al., Cell 141, 897-907, 2010; Schwarz et al., Glycobiology 21, 45-54, 2011; Valliere-Douglass et al. J. Biol. Chem. 284, 32493-32506, 2009). Estos restos, en principio, pueden ser acomodados en el punto de unión de PgIB porque son de igual tamaño o más pequeños que la treonina. Sin embargo, la glucosilación de "sequones" tales como N-G-X siendo X mayor que la treonina, o de T/S-X-N ("sequones inversos") (Valliere-Douglass et al. J. Biol. Chem. 284, 32493-32506, 2009) no puede explicarse por la estructura de PgIB. En comparación con las enzimas eucariotas OST bacterianas tienen un requisito adicional para el "sequon" receptor: La glucosilación sólo es eficaz si un resto cargado negativamente (Asp o Glu) está presente en la posición -2, lo que da como resultado un "sequon" consenso D/E-x1-N-x2-S/T (SEQ ID nº: 3; Kowarik et al, Embo

J. 25, 1957-1966, 2006). En PgIB el resto R331 de arginina proporciona un puente salino al Asp en -2 del péptido receptor (Fig. 4a), fortaleciendo de ese modo la interacción PglB-péptido. R331 se conserva en las bacterias, pero no en los eucariotas, donde no se observa ningún requisito de una carga negativa en la posición -2. El "sequon" de reconocimiento ampliado puede reflejar la necesidad de unión peptídica más estricta en las bacterias, donde la concentración local del polipéptido receptor es probablemente menor que en los eucariotas. De hecho, la mutación de R331 a Ala da lugar a una eficacia de glucosilación reducida de la proteína 3D5 receptora que contiene un punto de glucosilación DQNAT (Fig. 4b). Sin embargo, el mutante R331A permite la glucosilación de 3D5 que contiene un

imagen12

5 punto AQNAT (SEQ ID nº: 8), que no ha sido glucosilado por PgIB natural (Fig 4b.). Por lo tanto, el R331A mutante se puede utilizar para ocupar selectivamente los puntos de glucosilación que PgIB natural no utiliza. Por consiguiente, una combinación de enzima natural y el mutante R331A permite la unión específica al punto de diferentes glucanos dentro de la misma glucoproteína.

Zona catalítica

10 La zona catalítica está situada en la cavidad del lado derecho de PgIB (Fig. 3b) y se caracteriza por un catión unido, situado ~ 8Å por encima del límite de la membrana. Debido a la gran concentración de sal de magnesio en la solución de cristalización, se modeló como Mg2+. Al igual que todas las OST PgIB es sólo funcional con un catión divalente unido (Imperiali y Rickert, P. Natl. Acad. Sci. USA92, 97-101, 1995; Sharma et al., Eur. J. Biochem. 116, 101-108, 1981). Se ha sugerido que el catión fisiológico es Mn2+, pero PgIB también está activa en Mg2+ (no

15 publicado), una propiedad que se ha observado previamente en otras glucosiltransferasas dependientes de metal (Liu y Mushegian, Protein Sci. 12, 1418-1431, 2003). La zona catalítica de PgIB cuenta con tres cadenas laterales ácidas (D56, D154, E319) que son proporcionados por el dominio TM y que coordinan el M2+ (Fig. 5a). En la resolución actual, las moléculas de agua que pueden ser ligandos adicionales de M2+ no pueden modelarse. Los restos situados en la zona catalítica se conservan en proteínas STT3. Los aspartatos D154 y D156 pertenecen a un

20 motivo D-X-D anteriormente descrito y la mutación de aspartato a alanina en la manosiltransferasa GPI-MT-1, miembro de la misma familia de glucosiltransferasa como PgIB (GT-C) (Lairson et al., Annu. Rev. Biochem. 77, 521555, 2008).; Liu y Mushegian, Protein Sci. 12, 1418-1431, 2003), suprimió la actividad de esta enzima (Maeda et al., Embo J20, 250-261, 200). Por el contrario, D56 y E319 no se han identificado previamente como catalíticos relevante, pero sus grupos carboxilo están interactuando tanto con el ion metálico como con el grupo amido del

25 asparagina receptora. Para confirmar la participación catalítica de los tres ácidos, restos de unión a M2+, se mutaron individualmente a alaninas y la actividad de los mutantes de PgIB resultante se ensayó en un ensayo de complementación (Fig. 2). A pesar de que OST no es restrictivo en nuestro ensayo, el D154A de la mutación redujo el rendimiento de la glucosilación observado en > 50%, los mutantes D56A y E319A la redujeron en > 90%, y el doble mutante D56A/E319A era completamente inactivo.

30 Hay una debate polémico sobre cómo el grupo amido de la asparagina receptora puede activarse para realizar un ataque nucleófilo en el carbono C1 del sustrato OUL, etapa clave en la glucosilación por unión a N. Las amidas son poco nucleófilas debido a que el par de electrones libres del nitrógeno está conjugado con el doble enlace del grupo carbonilo (Fig. 5c). Como consecuencia, el enlace N-C tiene carácter de doble enlace, y el carácter nucleófilo del nitrógeno es bajo. Para explicar la reactividad del grupo amido, se han propuesto configuraciones específicas del

35 péptido receptor, tal como una "espira β" o una "espira Asx", recurriendo a la participación directa del grupo βhidroxilo de Ser/Thr en +2 para aumentar el carácter nucleófilo del grupo amida (Bause y Legler, Biochem. J. 195, 639-644, 1981; Imperiali et al, J. Am Chem. Soc. 114, 7942-7944, 1992). Dada la firme unión de Thr en +2 al motivo WWD en nuestra estructura PgIB, dicho mecanismo se puede descartar. En su lugar, la estructura de PgIB presenta una posibilidad distinta para explicar la activación de nitrógeno de la amida: Los dos restos ácidos D56 y E319

40 esenciales como catalizadores, están situados de manera óptima para formar enlaces de hidrógeno con los protones de la amida de la asparagina receptora. La formación de dichos enlaces de hidrógeno requeriría una rotación del enlace N-C del grupo amida, suprimiendo de esta manera la desplazamiento de los electrones libres del átomo de nitrógeno y rompiendo la conjugación con el grupo carbonilo (Fig. 5c). Esto no sólo aumentaría la naturaleza electronegativa del nitrógeno de la amida (polarizando los enlaces N-H y aumentando la densidad de electrones en

45 el nitrógeno), sino también generaría un nitrógeno hibridado sp3 con un par solitario reactivo situado de manera óptima para el ataque nucleófilo en el carbono C1 del sustrato oligosacárido activado (OUL). La barrera de energía para hacer girar el enlace N-C en la mayoría de las amidas se estima en 16 a 20 kcal/mol, y la configuración de la amida 270° mostrada en la fig. 5c se ha calculado que tiene una energía de ~18,6 kcal/mol con relación a la configuración plana (Wiberg y Breneman, J. Am. Chem. Soc. 114, 7942-7944, 1992). por lo tanto tomaría 1-2

50 enlaces de hidrógeno de baja barrera (Cleland y Kreevoy, Science 264, 1887-1890, 1994) (cada uno vale ~10 kcal/mol) para proporcionar suficiente energía para romper permanentemente la conjugación del grupo carboxamido de la asparagina receptora. Los carboxilatos de D56 o E319 podrían proporcionar este tipo de interacciones en el estado de transición de la reacción de glucosilación, aunque requerirá una estructura de mayor resolución para medir de forma fiable longitudes de enlaces de hidrógeno. La mutación de D56 a asparagina (D56N) tiene un efecto

55 inhibidor aún más pronunciado que el truncamiento a alanina, y el mutante E319Q es completamente inactivo (Fig. 2). Esto demuestra que las cargas negativas proporcionadas por los grupos carboxilo del D56 y E319 son esenciales para la catálisis y las cadenas laterales ácidas no pueden ser sustituidas por las correspondientes amidas isoelectrónicas. Los efectos estéricos podrían explicar el aumento de inhibición de D56N con relación a D56A y de E319Q en comparación con E319A.

60 Mecanismo de glucosilación

imagen13

Dado que PgIB está activa incluso cuando se disuelve en detergente (utilizado para la purificación y cristalización) la estructura proporcionada es probable que haya capturado un estado funcionalmente competente. La reacción de glucosilación se produce con inversión de la configuración en el carbono C1 sustituido de la primera fracción de azúcar. El sustrato OUL se modeló en la estructura PgIB de modo que el resto di-N-acetil-bacilosamina está 5 correctamente alineado para un ataque nucleófilo por el nitrógeno de la amida activado, mientras que el grupo pirofosfato saliente está en contacto con el ion metálico divalente y el R375 conservado (Fig 6a). Esta disposición coloca los fragmentos de sacáridos adicionales en la cavidad derecha del PgIB, donde pueden interactuar con restos en la superficie tanto de los dominios TM como de los periplásmicos. La disposición también coloca el sustituyente C2 del primer fragmento de sacárido, un grupo N-acetilo presente en las OUL de bacterias y eucariotas, en las 10 proximidades de un resto conservado de tirosina (Y468), donde se observa una densidad constante con una molécula de agua unida. Cuando está modelada como se muestra en la Fig. 6a, la cola de lípidos de la OUL está situada en una ranura en su mayor parte hidrófoba en la superficie de PgIB, apuntando sus restos isoprenoides en la bicapa lipídica. La función del catión divalente unido en PgIB por lo tanto parece ser doble: Por una parte, orienta las cadenas laterales ácidas que interactúan con el asparagina receptora, y, por otra parte, estabiliza el grupo saliente

15 de la sustitución (lípido-pirofosfato), acelerando así la reacción. Esto sería distinto de las glucosiltransferasas de la familia GT-A de configuración inversora dependientes del metal, donde el ion metálico sólo sirve para la estabilización del grupo saliente (véase Lairson anteriormente).

Con el péptido receptor presente en la estructura y la molécula de OUL provisionalmente modelada, puede proponerse un ciclo catalítico básico de tres estados para la glucosilación catalizada por PglB (Fig. 6b). Un elemento 20 crítico del mecanismo propuesto es el acoplamiento y desacoplamiento del bucle externo EL5, que se sospecha que es flexible y está desordenado en ausencia de péptido receptor unido (estado fundamental). Tras la unión del péptido, este bucle se vuelve parcialmente ordenado y sujeta el péptido contra el dominio periplásmico, restringiendo así su movimiento. Debido a que el E319 esencial es parte de EL5, esto al mismo tiempo da lugar a la formación de la zona catalítica, donde el receptor Asn se orienta correctamente y se activa. Este estado sólo puede ser alcanzado 25 si un "sequon" consenso de un bucle de la proteína flexible, expuesto se inserta en el sitio de unión. En la siguiente etapa, cabe esperar la unión de OUL, con lo cual el nitrógeno de la amida activado realiza un ataque nucleófilo sobre el primer fragmento de sacárido, dando como resultado la glucosilación. Una vez formado el enlace glucosídico, los azúcares recién unidos están fuertemente presionados contra PgIB (específicamente contra Ile317 e His485), produciendo tensión estérica que puede liberarse por desacoplamiento de EL5. Esto abre la ventanilla del receptor

30 Asn y permite al glucopéptido disociarse de la enzima. La escisión posterior del anhídrido del pirofosfato unido al lípido y el plegamiento del dominio proteico glucosilado probablemente proporcionan las principales contribuciones a la fuerza impulsora de la reacción. Se observa que PgIB también podría unirse a OUL antes de péptido de unión, y no hay ninguna prueba experimental que sugiera una estricta secuencia de episodios.

Claims (8)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Un método para identificar un posible componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado del grupo que consiste en

   (a) un posible donante de oligosacáridos, preferiblemente un oligosacárido unido a un lípido (OUL) o 5 un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo,

   (b)

   una posible oligosacariltransferasa (OST),

   (c)

   un posible polipéptido con motivo de secuencia consenso, y

   (d)

   un posible inhibidor de glucosilación,

   que comprende las etapas siguientes

   10 (i) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, más preferiblemente todos los amino ácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485,

   15 y/o, preferiblemente y

   (ii) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente 1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos, tres,

   20 cuatro, cinco, más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331, W463, W464, D465 e I572,

   (iii) llevar a cabo preferiblemente traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en las coordenadas de los aminoácidos de los modelos tridimensionales de (i) y/o (ii),

   (iv) utilizar dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) de (i), (ii) y/o (iii) para diseñar o seleccionar al menos uno de los posibles componentes (a) a (d),

   25 (v) proporcionar al menos uno de dichos componentes posibles (a) a (d), y

   (vi) poner en contacto al menos uno de dichos posibles componentes (a) a (d) con los demás componentes funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST),

   (vii) identificar un componente funcional seleccionado del grupo que consiste en

   30 (A) un donante de oligosacárido funcional, preferiblemente un donante de oligosacáridos unido a un lípido funcional (OUL) o un donante de oligosacáridos unido a pirofosfato de undecaprenilo,

   (B) una oligosacariltransferasa funcional (OST),

   (C)

   un polipéptido funcional con motivo de secuencia consenso, y 35 (D) un inhibidor de glucosilación funcional.

2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde en la etapa (ii) el modelo tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari comprende al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente todos los amino ácidos M318, A331, W463, W464, D465 e I572.

   40 3. Un método para diseñar un posible componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado del grupo que consiste en

   (a) un posible donante de oligosacárido, preferiblemente un oligosacárido unido a lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo,

   (b)

   una posible oligosacariltransferasa (OST), 45 (c) un posible polipéptido con motivo de secuencia consenso y

   (d) un posible inhibidor de glucosilación,

   22

   imagen2

   que comprende las etapas siguientes

   (i) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente ±1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena principal, para generar un modelo tridimensional del dominio catalítico de la oligosacariltransferasa

   5 (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno, dos o tres, preferiblemente al menos cuatro o cinco, más preferiblemente al menos seis o siete, aún más preferiblemente todos los aminoácidos D56, R147, D154, D156, E319, R375, Y468 y H485, y/o, preferiblemente y

   (ii) utilizar las coordenadas atómicas de la Tabla 1, preferiblemente ±2, más preferiblemente ±1,5, aún más preferiblemente 1,0 Å de error cuadrático medio (ecm) de los átomos de la cadena

   10 principal, para generar un modelo tridimensional del punto de unión al polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari, que comprende al menos uno o dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro o cinco, aún más preferiblemente todos los aminoácidos M318, R331, W463, W464, D465 e I572,

   (iii) llevar a cabo preferiblemente traslaciones y/o rotaciones de todo el conjunto en las 15 coordenadas de los aminoácidos de los modelos tridimensionales de (i) y/o (ii),

   (iii.1) utilizar dicho modelo tridimensional de (i), (ii) y/o (iii) para evaluar la complementariedad estereoquímica entre dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) (i), (ii) y/o

   (iii) y un componente conocido o posible para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado de un donante

   20 de oligosacáridos, preferiblemente un donante de oligosacáridos unido a lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, un polipéptido con motivo de secuencia consenso y un posible inhibidor de glucosilación, o

   (iii.2) variar al menos un aminoácido en dicho modelo tridimensional de (i), (ii) y/o (iii) y usando dicha variados modelo tridimensional de (i), (ii) y/o (iii) para evaluar la 25 complementariedad estereoquímica entre dichos modelos tridimensionales (i), (ii) y/o (iii) y un componente conocido o posible para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST) seleccionado de un donante de oligosacáridos (OUL), preferiblemente un donante de oligosacárido unido a lípido (OUL) o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo, un polipéptido con

   30 motivo de secuencia consenso, y un posible inhibidor de glucosilación,

   (iv)

   optimizar dicha complementariedad estereoquímica en un método iterativo observando cambios en el modelo tridimensional de (iii.1), (iii.2) o el componente para la glucosilación con asparagina unida ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST),

   (v)

   diseñar un posible componente seleccionado de (a) a (d) que optimiza dicha

   35 complementariedad estereoquímica de dicho(s) modelo(s) tridimensional(es) y el posible componente,

   (vi.1) proporcionar opcionalmente el posible componente optimizado, y

   (vi.2) poner en contacto al menos uno de dichos posibles componentes (a) a (d) con los

   demás componentes funcionales necesarios para una glucosilación con asparagina unida 40 ("unida por N") catalizada por oligosacariltransferasa (OST),

   (vi.3) identificar un componente funcional seleccionado del grupo que consiste en

   (A) un donante de oligosacárido funcional, preferiblemente un oligosacárido unido a lípido (OUL) funcional o un donante de oligosacárido unido a pirofosfato de undecaprenilo,

   45 (B) una oligosacariltransferasa (OST) funcional,

   (C)

   un polipéptido funcional con motivo de secuencia consenso y

   (D)

   un inhibidor de glucosilación funcional.

3. 4. El método de la reivindicación 3, en donde en la etapa (ii) el modelo tridimensional del sitio de unión del polipéptido de la oligosacariltransferasa (OST) de Campylobacter lari comprende al menos dos, preferiblemente al

   50 menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente todos los aminoácidos M318, A331, W463, W464, D465 E I572.

   23

   imagen3
4. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el modelo de la zona catalítica tridimensional específico de la etapa (i) comprende además uno o más, preferiblemente la totalidad de los aminoácidos seleccionados del grupo que tiene los restos situados dentro de la distancia de Van der Waals al péptido unido de la SEQ ID nº: 2, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en Thr53, Thr54, Asn55, Asp56, Asn146,

   5 Arg147, Tyr152, Glu315, Thr316, Ile317, Met318, Glu319, Val320, Asn321, Arg331, Leu374 , Arg375, Tyr433, Ser435, Val438, Trp463, Trp464, Asp465, Gly482, His485, Ile572, Val575.
5. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el modelo de la zona catalítica tridimensional específica de la etapa (i) comprende además uno o más, preferiblemente la totalidad de los aminoácidos seleccionados de entre el grupo que tiene los restos situados dentro de la distancia de Van der Waals al péptido

   10 unido de la SEQ ID nº: 2, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en Thr53, Thr54, Asn55, Asp56, Asn146, Arg147, Tyr152, Glu315, Thr316, Ile317, Met318, Glu319, Val320, Asn321, Ala331, Leu374 , Arg375, Tyr433, Ser435, Val438, Trp463, Trp464, Asp465, Gly482, His485, Ile572, Val575.
6. 7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el posible componente es un donante

   de oligosacárido (a), preferiblemente un donante de oligosacárido unido a lípido (OUL) o de oligosacárido unido a 15 pirofosfato de undecaprenilo.

7. 8.

   El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el posible componente es una oligosacariltransferasa (OST) (b).

8. 9.

   El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el posible componente es un polipéptido con motivo de secuencia consenso (c).

   20 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el posible componente es un inhibidor de glucosilación (d).

   24