ES2577412B1 - Procedimiento para la creación de nano/micro estructuras ordenadas complejas en superficies de materiales poliméricos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la creación de nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas en materiales poliméricos que comprende: a) elaborar mediante litografía blanda una primera réplica polimérica a partir de un molde comercial con nano/micro estructuras superficiales ordenadas sencillas, b) someter la réplica polimérica creada en a) a una deformación bajo condiciones controladas de fuerza, temperatura y velocidad de deformación, hasta alcanzar la deformación deseada, y c) elaborar in situ una segunda réplica polimérica de la réplica bajo deformación de b), o c') someter la réplica bajo deformación de b) a una temperatura que permita mantener la deformación permanentemente tras recuperar la temperatura ambiente inicial. Asimismo, se contemplan las nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas obtenidas por dicho procedimiento y su aplicación en la inhibición de la adhesión bacteriana en superficies poliméricas.

Description

DESCRIPCION

Procedimiento para la creacion de nano/micro estructuras ordenadas complejas en superficies de materiales polimericos

5 Objeto de la invencion

La presente invencion se refiere al campo tecnico de la Fisica Aplicada, y en particular se refiere a un procedimiento para la creacion de nano/micro estructuras ordenadas con formas y dimensiones complejas en superficies de materiales polimericos. Asimismo se contempla el empleo de dichas estructuras en la inhibicion de la adhesion bacteriana en 10 superficies polimericas.

Antecedentes de la invencion

Los patrones o moldes utilizados en "Soft Litography” o Litografia Blanda requieren una alta especializacion para su fabrication, utilizandose para ello tecnicas tales como la 15 Fotolitografia y la Litografia por haz de electrones, fuente de iones o rayos X. Tipicamente,

estas tecnicas dan lugar a geometrias superficiales caracterizadas por formas planas sencillas, tales como pilares y/o huecos de seccion cuadrada, circular o triangular y canales paralelos.

La litografia o fotolitografia es un proceso que consiste en transferir copias de un patron a la 20 superficie de un material (tipicamente silicio). En terminos generales, el proceso consiste en cubrir la superficie del material con una capa fotosensible denominada fotorresina. Seguidamente, se expone esta capa a una fuente de luz, interponiendo previamente entre ellas una mascara patron o fotomascara. Las zonas de la fotorresina expuestas a la luz experimentan un cambio en sus propiedades quimicas, lo que permite eliminarlas 25 posteriormente con un revelador quimico. A continuation, se ataca quimicamente el material con un agente que no afecta a la fotorresina remanente (situada en las zonas protegidas por las regiones opacas a la luz de la fotomascara), quedando el patron de la fotomascara grabado en el material. Por ultimo, se eliminan los restos de la fotorresina remanente. Actualmente, diferentes tecnicas orientadas a dirigir la luz de forma controlada a las zonas 30 deseadas pueden utilizarse con el fin de prescindir de las mascaras patron. En terminos de

resolution, los procesos de fotolitografla estan condicionados por la naturaleza ondulatoria de la luz, particularmente, por la difraccion, que aumenta cuanto mayor es la longitud de onda de la fuente. Es por ello que preferiblemente se trabaja con luz ultravioleta extrema o rayos X, o incluso con haz de electrones o iones, para los que la difraccion es despreciable.

5 De igual modo, la naturaleza de la fotorresina utilizada (espesor y propiedades flsico- qulmicas) condiciona la resolution conseguida. Aun asl, las mayores limitaciones asociadas a los procesos fotolitograficos vienen ligadas a aspectos tales como el alto coste de production, el bajo rendimiento y la necesidad de acceder a instalaciones punteras cuyo acceso suele estar restringido. Ademas su aplicacion requiere substratos planos que 10 resistan ataques corrosivos, radiation de alta energla y elevadas temperaturas, impidiendo asl el uso de materiales relativamente fragiles de interes practico (como por ejemplo, materiales organicos). Por ultimo, mencionar que, puesto que estas tecnicas generan estructuras que son el resultado de proyecciones, dichas estructuras son tlpicamente formas geometricas planas y sencillas (tal y como se indico en el parrafo anterior) (Marc J. 15 Madou (2002) “Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization” Second Edition, CRC Press LLC, Florida; Gates et al., “New approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques’’ (2005), Chemical Reviews, 105, 1171-1196; Harriott, “Limits of Lithography’ Proceedings of the IEEE (2001), 89, 366-374). Conforme aumenta la complejidad de las geometrlas, el coste se hace excesivamente elevado o 20 incluso es tecnicamente imposible de fabricar.

Los autores de la presente invention proporcionan una solution a estos problemas mediante un nuevo procedimiento que, a bajo coste y de manera sistematica, permite generar nano/micro-estructuras superficiales ordenadas con formas complejas, distintas a las que usualmente se comercializan.

25 Por otra parte, existen estudios que evaluan la influencia de nano/micro estructuras en la adhesion de bacterias (empleando moldes comerciales o moldes fabricados mediante “soft litography”) (Xu et al. “Submicron textured biomaterial surface reduces staphylococcal bacterial adhesion and biofilm function” Acta Biotamaterialia (2012) 72-81; Houchbaum & Aizenberg “Bacteria pattern spontaneously on periodic nanostructure arrays” American 30 Chemical Society. Nano Lett. 2010, 3717-3721; Hou et al “Microtopographic patterns affect Escherichis coli biofilm formation on poly(dimethylsiloxane) surfaces”. American Chemical Society. Langmuir 2011, 27, 2686-2691). Igualmente, en el documento Perera-Costa el al

“Study the influence of surfal topography on bacterial adhesion using spatially organized microtopographic surface patterns”. American Chemical Society. Langmuir 2014, 30, 46334641, se estudia la influencia de la topografla de micro/nanoestructuras en la adhesion bacteriana, empleando para ello las replicas obtenidas directamente de moldes comerciales.

5 Los autores de la presente invention han demostrado que las topograflas complejas obtenidas mediante deformation con el metodo planteado en la presente invencion favorecen la inhibition de la adhesion bacteriana frente a las topograflas sencillas (sin deformar) empleadas hasta el momento en el estado de la tecnica. Asl, la presente invencion presenta importantes aplicaciones en el campo de la Medicina, Fotonica, 10 Microfluldica y en la Industria Farmaceutica y Alimentaria.

Description de la invencion

La presente invencion soluciona los problemas anteriormente descritos mediante un nuevo procedimiento basado en la Litografla blanda que permite la creation, a bajo coste y de 15 forma sistematica, de nuevas superficies con topograflas ordenadas compuestas por nano/micro-estructuras con formas y dimensiones complejas, distintas a las que se comercializan en la actualidad.

El proceso de fabrication de este nuevo tipo de muestras se fundamenta en la deformacion de esa primera replica polimerica previamente obtenida del molde comercial. Una vez 20 alcanzada la deformacion deseada, y mientras esta tiene lugar, el metodo desarrollado requiere la elaboration in situ de una segunda replica, tambien polimerica, de la replica bajo deformacion, o, alternativamente, el sometimiento de la replica bajo deformacion a tal temperatura que la deformacion permanezca una vez recuperada la temperatura ambiente inicial. Variando la temperatura, la magnitud de la deformacion, la direction del mismo, 25 aplicando estiramientos en una o dos dimensiones, e incluso estiramientos no lineales, pueden llegar a crearse geometrlas complejas ordenadas como son trapecios piramidales, conos truncados, asl como diversos tipos de prismas. Es importante destacar que, ademas de estiramientos axiales (traction), las muestras pueden someterse a torsion, flexion, cizalladora y compresion. Esto permite controlar tanto la geometrla de las nano/micro 30 estructuras como su ordenacion en el plano y secciones trasversales a partir de una unica muestra patron. La replica deformada (esto es, la replica de la replica sometida a

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deformacion, o, alternativamente, la replica sometida a deformacion despues de ser sometida un tratamiento termico), conteniendo nano/micro estructuras superficiales complejas, puede ademas ser utilizada como molde o patron para la generation de un conjunto de muestras identicas mediante el procedimiento de "Soft Litography”.

Asl, en un aspecto principal de la invention se contempla un procedimiento para la creation de nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas en materiales polimericos que comprende las siguientes etapas:

a) Elaborar mediante litografla blanda una primera replica polimerica a partir de un molde comercial con nano/micro estructuras superficiales ordenadas sencillas,

b) Someter la replica polimerica creada en la etapa a) a una deformacion bajo condiciones controladas de fuerza, temperatura y velocidad de deformacion, hasta alcanzar la deformacion deseada, y

c) Elaborar in situ una segunda replica polimerica de la replica bajo deformacion de la etapa b), o

c') Someter la replica bajo deformacion de la etapa b) a una temperatura que permita mantener la deformacion de forma permanente tras recuperar la temperatura ambiente inicial.

En el contexto de la presente invencion, el termino "replica” se refiere al negativo de una muestra patron o molde polimerico que sirve para copiar o positivar la topografla original de dicha muestra o molde.

Por "nano/micro estructuras superficiales ordenadas sencillas” se entiende aquellas estructuras planas de geometrlas sencillas (p.ej. cuadrados, clrculos, etc) con dimensiones nano o micrometricas que sobresalen de la superficie del material (pilares) o que se encuentran inmersas en el (huecos), y cuya disposition sobre la superficie es ordenada, formando, por ejemplo, una red bidimensional cuadrada, rectangular, hexagonal, etc.

Por "nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas” se entiende aquellas estructuras planas o curvas de geometrlas complejas (por ejemplo trapecios piramidales, cilindros torsionados, prismas oblicuos, etc) con dimensiones nano o micrometricas que sobresalen de la superficie del material (pilares) o que se encuentran inmersas en el

(huecos), y cuya disposition sobre la superficie es ordenada, formando por ejemplo, una red bidimensional cuadrada, rectangular, hexagonal, etc.

En relation con el molde comercial de partida empleado en a), diversas companlas en el mundo expertas en Litografla proporcionan moldes o patrones fabricados de silicio, 5 materiales dielectricos (p. ej. dioxido de silicio o nitruro de silicio), metales (p. ej. nlquel) o materiales polimericos con modulos de Young elevados que contienen nano/micro estructuras superficiales ordenadas con formas simples tales como pilares y/o huecos de seccion cuadrada, circular o triangular y canales paralelos. Estos moldes pueden adquirirse a traves de dichas companlas o ser fabricados en laboratorios que cuenten con tecnicas 10 avanzadas de Fotolitografla.

Tanto las condiciones de temperatura, como las de la relation fuerza-deformacion del paso b), dependen de las caracterlsticas del pollmero utilizado y de las caracterlsticas de la estructura que se desee conseguir.

En una realization particular del procedimiento de la invention, el molde comercial 15 empleado se integra en una probeta de ensayo de traction, aunque podrla emplearse cualquier tipo de probeta (rectangular, cillndirica, etc). La election de una probeta de ensayo de traction garantiza una distribution uniforme de las llneas de fuerza en la parte central de la misma. No obstante, se podrla conseguir lo mismo (es decir, una distribution uniforme de las llneas de fuerza) utilizando una muestra cuadrada o rectangular lo suficientemente 20 grande para contener en su parte central el grabado. La distribution uniforme de llneas de fuerza permite asegurar que todas las estructuras presentes en el grabado, as! como el inter-espaciado entre ellas, se deformen de igual manera en toda la muestra. Sin embargo, en la presente invention, se contempla tambien la posibilidad de que la forma e inter- espaciado de las estructuras vane de una manera determinada a lo largo/ancho de una 25 misma muestra, en cuyo caso serla necesario evitar la distribution uniforme de llneas de fuerza y por tanto, se optarla por un tipo de probeta distinto al de ensayo de traction. En la figura 12, se puede observar una muestra sometida a un mismo estiramiento lineal en el que las llneas de fuerzas estan y no estan distribuidas uniformemente (las flechas rojas indican la direction de estiramiento).

La deformacion llevada a cabo en la etapa b) puede ser por estiramientos axiales (en 1, 2 o mas direcciones), o por torsion, flexion, cizalladura, comprension o una combination de tales esfuerzos mecanicos.

Respecto a los pollmeros que pueden utilizarse en esta invention, pueden ser todos 5 aquellos clasificados como termoplasticos, elastomeros y algunos termoestables. Los pollmeros termoplasticos se caracterizan por ser flexibles o deformables en un cierto rango de temperaturas, derretirse a temperaturas relativamente altas y endurecerse en un estado de transition vltrea cuando se enfrlan lo suficiente. Ademas, despues de calentarse y moldearse pueden recalentarse y formar otros objetos sin degradarse. Los pollmeros 10 elastomeros se caracterizan por su comportamiento elastico, pudiendo ser deformados muy facilmente a temperatura ambiente. Los pollmeros termoestables, por ser pollmeros infusibles e insolubles. Como ejemplo de pollmeros termoplasticos se incluyen polietileno (PE), polipropileno (PP), polibutadieno, poliestireno (PS), cloruro de polivinilo (PVC) fluoruro de polivinilo (PVF), politetrafluoretileno (PTFE), poliacrilonitrilo (PAN), alcohol polivinllico 15 (PVA) y polimetacrilato de metilo (PMMA). Como ejemplo de pollmeros elastomeros se incluyen el caucho natural, poliisopreno, polibutadieno, diversos tipos de cauchos artificiales, silicona y algunos elastomeros de poliuretanos. Finalmente, como ejemplo de pollmeros termoestables se incluyen aquellos que se encuentran en estado llquido o son facilmente maleables previo sometimiento a un proceso de curado, tales como el polidimetilsiloxano 20 (PDMS), poliimidas, diversas resinas, algunos poliuretanos y caucho vulcanizado. Tambien pueden utilizarse combinaciones de los tipos de pollmeros mencionados.

En una realization particular de la invencion, el procedimiento comprende las etapas a), b) y c). En ese caso, tras la etapa c) se puede llevar a cabo una etapa adicional d) en la que se genera, mediante litografla blanda, una copia negativa de la segunda replica, obtenida en la 25 etapa c), partiendo de dicha replica como molde. Esta etapa d) se puede repetir tantas veces como muestras identicas se quieran obtener.

En esta etapa (d), se obtienen copias identicas del negativo de la muestra patron estirada. Para obtener copias del positivo se partirla de las copias obtenidas en d), copiandolas tantas veces como fuera necesario (ver figura 13 A).

30 En este caso, la election de los pollmeros ha de ser tal que el utilizado en la etapa (a) sea lo suficientemente flexible para llevar a cabo la etapa (b) y mantener la estabilidad qulmica y

mecanica necesaria para las condiciones experimentales empleadas en la etapa (c). De forma similar, la etapa (d) requiere que la replica elaborada en la etapa (c) mantenga estabilidad quimica y mecanica bajo las condiciones experimentales empleadas en esta ultima etapa. Por ello, en esta realization del procedimiento de la invention, el polimero 5 empleado es preferiblemente un polimero termoestable.

En otra realizacion particular, el procedimiento de la invencion comprende las etapas a), b) y c'). La etapa c') se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre la temperatura de transition vrtrea y la temperatura de fusion que caractericen al polimero empleado. En este caso, tras la etapa c') se puede llevar a cabo una etapa adicional d') que comprende 10 generar mediante litografia blanda una copia negativa de la replica obtenida en la etapa c') partiendo de dicha replica como molde. La etapa d’) se repite tantas veces como copias negativas se quieran obtener. En esta realizacion del procedimiento de la invencion, el polimero empleado es preferiblemente un polimero termoplastico.

En este proceso (d') se obtienen copias identicas de la muestra patron estirada. En caso de 15 querer obtener lo mismo que en (d), se partiria de las copias obtenidas en (d'), copiandolas tantas veces como fuera necesario (ver figura 13 B).

En realizaciones preferidas, previamente al uso de los moldes comerciales y/o polimericos (etapas a, b y c) todas las superficies que entren en contacto con el polimero de interes en estado liquido son tratadas con agentes antiadherentes o liberadores que faciliten la 20 extraccion/separacion posterior de las muestras curadas.

En otro aspecto principal de la invencion se contemplan las nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas en material polimerico obtenidas por el procedimiento de la invencion.

Por otra parte, los autores de la presente invencion han demostrado que las superficies 25 generadas por deformation mediante el procedimiento de la presente invencion inhiben en mayor medida la adhesion bacteriana, en comparacion con las mismas superficies sin deformar.

Asi, en otro aspecto principal de la invencion se contempla el empleo de las nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas en material polimerico de la invencion en la 30 inhibition de la adhesion bacteriana a superficies polimericas.

Este aspecto es de gran interes, por ejemplo, en el campo de la medicina y de la ingenierla biomedica, para la fabrication de cateteres, implantes o material quirurgico resistentes a la colonization de bacterias, lo que permite disminuir en gran medida la actual tasa de infecciones intra-hospitalarias.

5 Tambien cobran relevancia en el campo de la fotonica, de la nano/microfluldica, y en el desarrollo de sensores chips.

Igualmente, en el terreno de la industria alimentaria el uso de este tipo de superficies permite la prevention de la contamination por bacterias patogenas de los equipos usados en el procesamiento y empaquetado de alimentos. Esto permite extender la vida util de los 10 alimentos y evitar la transmision de enfermedades infecciosas.

Ademas, en la industria farmaceutica, tienen aplicacion en el desarrollo de biosensores y dispositivos bioelectronicos, sistemas que requieren controlar con exactitud la ubicacion espacial de celulas o moleculas. Asimismo, son de gran importancia para el estudio de la diferenciacion de celulas madres, la ingenierla de tejidos, etc.

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Descripcion de las figuras

Con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caracterlsticas de la invention de acuerdo con un ejemplo preferente de realization practica de la misma, y para complementar esta descripcion, se acompana como parte integrante de la misma las 20 siguientes figuras, cuyo caracter es ilustrativo y no limitativo:

Figura 1: Ejemplo ilustrativo de una probeta de ensayo de traction uniaxial (a) y biaxial (b) en cuya zona central (marcada en gris) se fija el molde comercial a replicar.

Figura 2: Sarcofago de tres piezas independientes: Base (1) que contiene un grabado con forma cuadrada (2), un grabado con forma de probeta de ensayo de traccion uniaxial (3), 25 que a su vez contiene en su zona central la replica de un molde comercial (4); Cubo (5) y Tapa (6).

Figura 3: Sistema disenado para someter una probeta de traccion polimerica a un estiramiento uniaxial (por simplicidad la muestra ha sido dibujada con forma rectangular). Este sistema consiste en dos bloques metalicos (7) sobre los que se fija la muestra

30 polimerica (8), mediante unas placas de sujecion (9), que a su vez estan montados sobre un

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tornillo micrometrico (10) que permite, al girarse dicho tornillo, separar los dos bloques simultaneamente. El ejemplo ilustra el sistema antes (a) y despues (b) del estiramiento. Las flechas en a) indican el sentido de la rosca (r) (sentido contrario a o de las agujas del reloj) y las flechas en b) indican la direction de estiramiento.

5 Figura 4: Ejemplo ilustrativo de la fijacion de las paredes de contention (11) en una muestra polimerica (8) sometida a estiramiento.

Figura 5. Molde comercial de silicio (HS-20MG) montado sobre un disco metalico (a) e ilustracion de la disposition y dimensiones de las distintas regiones geometricas (b) que presenta (h:altura; dis: distancia entre centros).

10 Figura 6. Sarcofago de metacrilato disenado para la obtencion de las muestras con forma de probeta de ensayo de traction uniaxial que contenga en su zona central una replica del molde comercial, que esta formado por tres piezas independientes fabricadas en metacrilato: Base (1) que contiene un grabado con forma cuadrada (2), un grabado con forma de probeta de ensayo de traccion (3), que a su vez contiene en su zona central la 15 replica de un molde comercial, donde se fija el molde de silicio (12); Cubo (5) y Tapa (6), que incluye dos orificios para la entrada (13) y salida (14) de PDMS durante el proceso de llenado del sarcofago.

Figura 7. Probeta de ensayo de traccion (a) y de las paredes de contencion (b) en PDMS tras ser extraldas del sarcofago de metacrilato.

20 Figura 8. Dispositivo que permite el estiramiento uniaxial de una probeta de traccion (a), formado por dos plataformas de traslacion uniaxial (15), incorporando cada una sendas placa de fijacion (9), con sendos tornillos micrometricos (10) en su lateral que permiten que las plataformas puedan desplazarse de forma controlada en sentidos opuestos. Probeta de traccion bajo estiramiento antes (b) y despues (c) de colocar sobre ella las paredes de 25 contencion de PDMS (11). (d) Molde en PDMS obtenido tras el proceso de estiramiento.

Figura 9. Imagenes opticas (126 x 96 p,m) de las diferentes topograflas presentes en el molde comercial de silicio (HS-20MG) asl como de sus respectivas replicas en PDMS antes (Replicas en PDMS) y despues (Replicas estirada en PDMS) del proceso de estiramiento. Las columnas (a) y (b) muestran regiones con pilares y huecos de section 30 cuadrada/rectangular, (c) y (d) con pilares y huecos de seccion circular/ellptica y (e) con

canales.

Figura 10. Imagenes topograficas de AFM (20 x 20 p,m) de las diferentes geometrlas topograflas presentes en el molde comercial de silicio (HS-20MG) as! como de sus respectivas replicas en PDMS antes (Replicas en PDMS) y despues (Replicas estirada en 5 PDMS) del proceso de estiramiento. Las columnas (a) y (b) muestran regiones con pilares y huecos de seccion cuadrada/rectangular, (c) y (d) con pilares y huecos de seccion circular/ellptica y (e) con canales.

Figura 11. Topografla (imagenes AFM-3D) de cada una de las regiones geometricas que presentan los diferentes tipos de replicas fabricadas en PDMS. Las flechas indican la 10 direccion de estiramiento para el caso de las muestras estiradas. a) Topografla A; b) Topografla B; c) Topografla C; d) Topografla D y e) Topografla E. (V) vertical; (H) horizontal

Figura 12. Esquema de una muestra sometida a un mismo estiramiento lineal donde se puede observar la muestra inicial (a), la muestra sometida a un estiramiento en el que las llneas de fuerzas estan distribuidas uniformemente (b) y la muestra sometida a un 15 estiramiento en el que las llneas de fuerza no estan distribuidas uniformemente (c) (las flechas indican la direccion de estiramiento).

Figura 13. A) Grafico del proceso formado por las etapas a, b, c y d. B) Grafico del proceso formado por las etapas a, b, c’ y d’ (R: replica; PC: patron comercial; RE: replica estirada).

Figura 14. Densidad total de bacterias adheridas de la cepa Staphylococcus epidermidis en 20 cada region geometrica de las replicas en PDMS del molde comercial HS-20MG antes (A) y despues (B) de ser sometidas al proceso de estiramiento. Los slmbolos al pie de la Figura representan a las regiones que contienen pilares (□ T;OT) y huecos (□ ^;0 J-) de seccion cuadrada/rectangular y circular/ellpticas y canales (II = u). La superficie control es una muestra en PDMS lisa (carente de topografla).

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Realizacion preferente de la invencion

En una realizacion preferente del metodo de la invencion, la etapa (a) comprende la elaboration de una probeta de ensayo de traction uniaxial o biaxial haciendo uso de un molde o patron comercial cuya replica queda situada en la zona central de la probeta 30 (Figura 1a y 1b). Este tipo de probetas, con dimensiones normalizadas acorde a una norma

especlfica como ASTM, IRAM, SAE o DIM, se eligen para garantizar una distribution uniforme en la parte central (“gauge zone”) de las llneas de fuerza que aparecen durante el estiramiento llevado a cabo en la etapa (b), permitiendo asl que las deformaciones provocadas a lo largo de todo el patron topografico sean uniformes.

5 Como ejemplo, para la fabrication de una probeta de ensayo de traction uniaxial, se propone un sarcofago de tres piezas independientes (Figura 2). La primera pieza consiste en una base (1) sobre la que se graba la forma de una probeta de ensayo de traction (3) con un espesor determinado. En el centro de este grabado se incluye un grabado complementario donde el molde o patron comercial (4) elegido queda fijado con la 10 orientation deseada. Esta base incluye ademas un grabado con forma cuadrada (2) que

sera utilizado para la fabrication de paredes de contention y cuyo cometido se detalla mas adelante. La fabrication de tales paredes de contention requiere de una segunda pieza de metacrilato con forma de cubo (5) que se acopla a la base cuadrada mencionada a traves de dos tornillos, creandose asl entre ambas piezas un interespaciado de cierto espesor. Por 15 ultimo, se incluye una tercera pieza (6) cuya funcion es la de sellar a modo de sarcofago el grabado de la probeta de ensayo de traction realizado sobre la base del dispositivo. El sellado se lleva a cabo mediante tornillos distribuidos de tal forma que garantizan que ambas partes quedan fielmente unidas. En esta ultima pieza de metacrilato se han incluido ademas dos orificios que sirven de entrada y salida para el pollmero empleado. Una vez 20 llenado el sarcofago, este se introduce en una estufa precalentada para proceder al curado del pollmero. Transcurrido el tiempo de curado y un periodo de enfriamiento, se procede a abrir el sarcofago para retirar con sumo cuidado la probeta de traction. De igual modo, las paredes de contention se retiran de su propio molde. Para aquellos pollmeros cuya curacion tenga lugar mediante irradiation o reacciones qulmicas, el procedimiento serla 25 similar o incluso podrla prescindirse del sellado del sarcofago, cuyo llenado podrla llevarse a cabo simplemente vertiendo el pollmero de interes en estado llquido sobre el grabado.

La etapa (b) requiere someter la replica creada en la etapa (a) a un estiramiento uniaxial o biaxial mediante un dispositivo de traction bajo condiciones controladas de fuerza, temperatura y velocidad de estiramiento. Sistemas comerciales disenados para el estudio 30 de las propiedades mecanicas de materiales pueden utilizarse para este fin, tales como las conocidas maquinas universales para ensayos de traction. Alternativamente, se pueden construir en el laboratorio sistemas sencillos que permitan llevar a cabo este tipo de

experiencias. Por ejemplo, un sistema simple destinado a someter una muestra a un estiramiento uniaxial puede consistir en dos bloques metalicos (7) sobre los que se fije la muestra y que a su vez esten montados sobre un tornillo micrometrico (10) que permita, al girarse dicho tornillo, separar los bloques simultaneamente (Figura 3). De forma similar, 5 estiramientos biaxiales pueden llevarse a cabo utilizando dos pares de bloques ortogonales que se muevan simultanea o independientemente de manera controlada. Otro ejemplo consiste en acoplar y enfrentar plataformas de traslacion uniaxial, tlpicamente utilizadas en montajes opticos como plataformas de posicionamiento lineal, sobre las que se ensamblen placas de fijacion para inmovilizar la muestra y tornillos micrometricos que permitan el 10 desplazamiento de las plataformas de manera controlada. Para mayor precision, pueden anadirse a este tipo de sistemas motores comerciales de posicionamiento conectados a un PC que incluya un software destinado a controlar el movimiento y/o la fuerza aplicada en cada experiencia. Es importante destacar que, ademas de estiramientos axiales (traccion), pueden disenarse dispositivos similares para someter las muestras a torsion, flexion, 15 cizalladora y compresion. Estos permite controlar tanto la geometrla de las nano/micro estructuras, su ordenacion en el plano asl como sus secciones trasversales a partir de una unica muestra patron (la replica creada en la etapa a).

La etapa (c) consiste en la elaboration de una segunda replica, tambien polimerica, de la replica bajo estiramiento de la etapa (b). Para ello, las paredes de contention (11) 20 previamente fabricadas se fijan sobre la muestra estirada de tal manera que el patron a replicar quede en el centro del recinto que delimiten (Figura 4). Su fijacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el uso de adhesivos comerciales que resistan las condiciones experimentales bajo las que se desarrolle esta etapa. Una vez fijadas, se procede al llenado del recinto que delimitan dichas paredes de contencion con el pollmero de interes en estado 25 llquido. Transcurrido el tiempo de curado de dicho pollmero, se procede a separar la nueva replica de la probeta de traccion.

La etapa (d) consiste en utilizar la replica obtenida en la etapa (c) como molde o patron para la generation de un conjunto de muestras identicas con nano/micro estructuras ordenadas complejas. Para ello, se deposita la replica obtenida en la etapa (c) en un recipiente 30 adecuado (p. ej. pocillo o placa Petri) y se vierte sobre ella el pollmero de interes en estado llquido. Transcurrido el tiempo de curado de dicho pollmero, se procede a separar con sumo cuidado las dos replicas, obteniendose asl un negativo de la replica obtenida en la etapa (c).

Este proceso se repite tantas veces como sea necesario.

Todas las superficies que entran en contacto con el pollmero de interes en estado llquido son tratadas previamente con un agente antiadherente o liberador que facilite la extraccion/separacion posterior de las muestras curadas. Habitualmente este proceso se 5 lleva a cabo mediante el uso de sustancias qulmicas como el hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y el heptadecafluor -1,1,2,2 -tetrahidrodecil dimetilclorosilano (C12H8ClF17Si) (Gitlin et al., “Rapid replication of master structures by double casting with POMS”, Lab Chip (2009), 9, 3000-3002; Ner & McCarthy, “Ultrahydrophobic Surfaces. Effects of Topography Length Scales on Wettability”, Langmuir (2000), 16, 7777-7782). Sin embargo, el uso de 10 este tipo de compuestos supone muy probablemente la modification qulmica de la superficie sobre la que se aplican. Ademas, la capa que dejan sobre dicha superficie puede modificar ligeramente su propia topografla superficial. Para evitar estos dos posibles efectos adversos, en el procedimiento de la invention, de forma preferida, se emplea como agente antiadherente una disolucion de desinfectante.

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EJEMPLO 1.

El patron o molde comercial utilizado en este ejemplo fue adquirido en la casa comercial NanoAndMore GmbH (Alemania), presentando diferentes nano/micro-estructuras fabricadas en dioxido de silicio sobre un chip de silicio de 5 x 5 mm montado sobre un disco de 12 mm 20 de diametro y 0,8 mm de espesor (Figura 5a). El molde pertenece a la serie HS-20MG y se caracteriza por exponer cinco nano/micro-topograflas superficiales diferenciadas sobre una superficie de 1 x 1 mm2 (Figura 5b), esto es, dos regiones con pilares de section cuadrada (6 x 6 pm) y circular ($ = 3 pm) que sobresalen de la base de silicio y que cuentan con un interespaciado de 4 y 2 pm, respectivamente, dos regiones con huecos de seccion 25 cuadrada y circular, inmersos en la capa de dioxido de silicio, y que presentan las mismas dimensiones, tanto en su seccion como en el interespaciado, que las descritas para los pilares y por ultimo, dos regiones que constituyen canales con crestas y valles de 3 y 2 pm de ancho, respectivamente. En este ultimo caso ambas regiones comparten las mismas caracterlsticas topograficas, disponiendo los canales de manera que unos estan orientados 30 respecto a los otros formando un angulo de 90 °. La altura que presentan los pilares, asl como la profundidad asociada a los huecos que aparecen, es uniforme y ha sido testada por

la casa en 21,1 nm. Por sus caracterlsticas topograficas, los moldes de silicio son muy dados a retener suciedad por lo que antes de cada uso han de ser cuidadosamente limpiados. El protocolo de limpieza consistio asl en sumergirlo en desinfectante al 2% (DERQUIM DSF 11, Panreac Qulmica S.A., Espana) y sonicarlo por un perlodo de 5 5 minutos. Posteriormente, se aclaro abundantemente con agua destilada con el fin de retirar los restos de desinfectante, y se sumergio de nuevo en etanol para ser sonicado durante 5 minutos. Seguidamente, el molde se seco inmediatamente con nitrogeno quedando listo para su uso.

El pollmero curable elegido para llevar a cabo la replica del molde anteriormente descrito 10 fue el polidimetilsiloxano (PDMS). En particular, se empleo el kit SylgardTM 184 Silicone Elastomer adquirido a traves de la casa Dow Corning Corporation (EE.UU.). Este kit consta de dos botes con distintos compuestos; en uno se encuentra la base polimerica de PDMS (estado llquido) mientras que en el otro el agente curador (estado llquido) con el que la base polimerica ha de mezclarse para su posterior solidificacion. Al ser un elastomero 15 termoestable se utiliza ampliamente en los procedimientos englobados en la Litografla Blanda, ya que resulta eficaz a la hora de replicar la topografla de cualquier tipo de superficie con alta resolution. El proceso de preparation de PDMS consistio en el mezclado manual de la base elastomerica con el agente curador en una proportion masica de 10:1 durante un perlodo de 20 minutos. El proceso de mezclado genera burbujas de oxlgeno en 20 el interior de la mezcla por lo que posteriormente se introdujo en una camara de vacio durante 1 h a 700 mmHg de presion con el fin de desgasificarla por completo. Una vez eliminado el gas del interior de la mezcla esta queda preparada para su uso inmediato.

El sistema disenado para la elaboration de una probeta de ensayo de traction uniaxial que contenga en su zona central una replica del molde comercial consistio en un sarcofago de 25 tres piezas independientes fabricadas en metacrilato (Figura 6). La primera pieza consiste en una base de metacrilato (1) sobre la que se grabo la forma de una probeta de ensayo de traccion (3) con un espesor de 4 mm. En el centro de este grabado se incluyo un grabado complementario en forma de disco de 12 mm de diametro y 0,8 mm de espesor donde se fijo el molde de silicio (12) empleado con una orientation determinada. Esta base incluye 30 ademas un grabado con forma cuadrada (2) de dimensiones 30 x 30 mm y espesor de 5 mm, el cual se emplea para la fabrication de paredes de contention de PDMS. La fabrication de tales paredes de contencion requiere de una segunda pieza de metacrilato

con forma de cubo (5) (25 x 25 mm) la cual se acoplo a la base cuadrada mencionada a traves de dos tornillos, creandose asl entre ambas piezas un interespaciado 5 mm de espesor. Por ultimo, se incluyo una tercera pieza de metacrilato (6) cuya funcion es la de sellar a modo de sarcofago el grabado de la probeta de ensayo de traccion realizado sobre 5 la base del dispositivo. El sellado se llevo a cabo mediante 8 tornillos distribuidos de tal forma que se garantizo que ambas partes quedaran fielmente unidas. En esta ultima pieza de metacrilato se incluyeron ademas dos orificios para la entrada (13) y salida (14) de PDMS durante el proceso de llenado del sarcofago. Previamente al uso del sarcofago de metacrilato y con el fin de facilitar la extraction posterior de la muestra curada de PDMS, se 10 utilizo como agente antiadherente una disolucion de desinfectante al 10 % en etanol al 75 %. Se comprobo que dicho compuesto no solo facilitaba la separation de la muestra de PDMS del sarcofago de metacrilato, sino tambien la separacion de superficies tipo PDMS- PDMS. El protocolo de aplicacion de este agente antiadherente consistio en cubrir las superficies que entran en contacto durante el proceso de replication con dicho compuesto, 15 para inmediatamente despues secarlas con nitrogeno. Posteriormente, las muestras en PDMS obtenidas tras el proceso de replicacion se aclararon con abundante agua con el fin de eliminar cualquier resto remanente del agente antiadherente. Una vez tratado el sarcofago con tal agente antiadherente y haciendo uso de PDMS llquido preparado bajo las condiciones anteriormente descritas, se lleno tanto el sarcofago como la estructura que 20 permitira obtener las paredes de contention. Posteriormente se procedio a introducir el molde de metacrilato en una estufa previamente precalentada, permaneciendo en ella a 60 °C durante un perlodo de 4,5 horas. Transcurrido el tiempo de curado, y un periodo de dos horas de enfriamiento, se procedio a abrir el sarcofago para retirar con sumo cuidado la probeta de traccion en PDMS. De igual modo, las paredes de contencion fabricadas se 25 retiraron de su propio molde. Las piezas obtenidas (Figura 7) se mantuvieron hasta su uso en un recipiente cerrado.

El procedimiento de deformation de la probeta de ensayo de traccion obtenida, requirio la fabrication de un dispositivo que permitiera su estiramiento uniaxial. Para ello se utilizaron dos plataformas de traslacion uniaxial modelo 16378 de la casa Oriel Instruments (EE.UU.) 30 que usualmente se utilizan en montajes opticos como plataformas de posicionamiento lineal. Ambas plataformas fueron acopladas enfrentandolas una con otra (Figura 8a). En el lateral de las mismas se ensamblaron sendos tornillos micrometricos (10) de 10 pm de precision

que permitieron que las plataformas pudieran desplazarse de forma controlada en sentidos opuestos. Por ultimo, se incorporaron dos chapas metalicas planas (9) que inclulan un extremo curvado que a modo de anclajes, tienen la funcion de fijar cada extremo de la muestra a su respectiva plataforma mientras se lleva a cabo el proceso de estiramiento. El 5 dispositivo asl disenado permitio un desplazamiento maximo de cada plataforma de 24 mm

respecto a su posicion central, lo que arroja un tope maximo de estiramiento macroscopico de 48 mm.

Una vez fijada la probeta de traccion (16) en PDMS sobre el dispositivo de deformacion, se procedio a desplazar lentamente las plataformas de traslacion, accionando de forma 10 simultanea los dos tornillos micrometricos (10), hasta llegar al maximo permitido (Figura 8b). Manteniendo la muestra estirada se procedio a colocar sobre ella las paredes de contention (11) de PDMS de manera que el patron a replicar quedara en el centro del recinto delimitado (Figura 8c). Seguidamente se deposito en el interior del recinto PDMS llquido preparado previamente segun el protocolo ya descrito y se introdujo el dispositivo en 15 una estufa previamente precalentada, permaneciendo en ella a 60 °C durante un perlodo de

una hora. Transcurrido el tiempo de curado, el dispositivo se retiro de la estufa dejandose enfriar durante una hora, periodo tras el cual se procedio a separar la nueva replica en PDMS de la probeta de traccion (Figura 8d).

La replica deformada obtenida se utilizo como molde para la generation de un conjunto de 20 muestras identicas en PDMS. Para ello, dicha replica se corto con un troquel tubular de 12 mm de diametro, tratada con el agente antiadherente anteriormente descrito y fijada al fondo de un disco petri de 3,42 cm. Seguidamente, el disco se situo en una balanza de precision y controlando la cantidad de PDMS llquido depositado en el se pudo asegurar que todas las replicas asl obtenidas tuvieran un espesor de 4 mm. Seguidamente y con el 25 objetivo de conseguir un curado idoneo, se procedio a introducir la muestra en una estufa (Hotcold UB-UC, J.P. Selecta S.A, Espana) previamente precalentada, permaneciendo en ella a 60 °C durante un perlodo de una hora. Una vez transcurrido el tiempo de curado, la muestra se retiro de la estufa dejandose enfriar durante una hora. Una vez enfriada, se procedio con sumo cuidado a separar las dos replicas de PDMS. Este procedimiento puede 30 repetirse tantas veces como se desee.

A traves de este estiramiento, se obtuvo un molde o patron en PDMS que permitio obtener

un conjunto de muestras con caracterlsticas geometricas distintas a las contenidas en los patrones de silicio. En particular, tal y como se observa en la Figura 9, el nuevo tipo de muestras se caracteriza por presentar nano/micro-estructuras de secciones rectangulares y ellpticas dispuestas en una red rectangular bidimensional donde antes apareclan 5 nano/micro-estructuras de secciones cuadradas y circulares (red cuadrada bidimensional), con un interespaciado que, tras el estiramiento, difiere en las direcciones paralela y perpendicular al mismo. De igual modo, las regiones que contenlan canales de identicas caracterlsticas, se transformaron en dos regiones con canales de diferentes caracterlsticas geometricas segun estos estuvieran dispuestos de forma paralela o perpendicular a la 10 direccion de estiramiento. Imagenes topograficas (Figura 10) adquiridas con un Microscopio de Fuerza Atomica (AFM) de las diferentes geometrlas presentes en el patron de silicio comercial y en la replica en PDMS antes y despues del estiramiento permitieron determinar las dimensiones exactas de las distintas caracterlsticas geometricas presentes. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 1.

15 Tabla 1. Caracterlsticas topograficas de las replicas en PDMS

TOPOGRAFIA (Imagenes AFM-3D)

TIPO DE MUESTRA DIMENSIONES DE LA ESTRUCTURA1 DIMENSIONES DEL INTERESPACIADO1 RUGOSIQAD AREAS [pnrt;)

Altura(rm) a(iim)

b(um) C(um| d(rim) Ro Superior Irferior Lateral Total

FIG. 11a

Sir estirar HS-20G 20.39 5.87 5.96 3.88 3.94 9.3 ±1.4 4372 7772 61 12205

Estirada HS-20G

17.88 8.95 5.49 5.60 3.33 7.8 ±1.1 4468 7676 48 12192

FIG. lib

Sir estirar HS-20G 19.93 5.89 5.93 4.16 4.05 9.9 ±1.1 7772 4372 61 12205

Estirada HS-20G 17.95 8.48 5.14 5.84 3.48 7.5 ±0.8 7676 4468 48 12192

FIG. 11c

Sir estirar HS-20G 20.11 3.01 3.11 1.99 2.06 8.9 ±1.7 3434 8710 97 12241

Estirada HS-20G 18.02 4.20 2.33 2.83 1.84 8.2 ±0.9 3366 8778 78 12223

FIG. lid

Sir estirar HS-20G 19.15 2.86 2.89 1.96 2.03 9.1 ±0.9 8710 3434 97 12241

Estirada HS-20G 17.42 4.34 2.56 2.81 1.62 7.7 ±1.2 8778 3366 78 12223

FIG. lie

Sir estirar HS-20G 19.83 2.95 ■ 1.96 ■ 9.7 ±1.0 7286 4858 102 12246

Estirada HS-20G 16.54 4.50 2.57 6.9 ±0.9 7728 4416 57 12201

20.39 2.69 1.52 7.1 ±1.3 7760 4364 96 12240

Comparando las dimensiones de las distintas caracterlsticas topograficas antes y despues

5

10

15

20

25

30

del proceso de estiramiento (figura 11 y tabla 1), se concluye que bajo las condiciones experimentales descritas las caracteristicas topograficas asociadas a pilares y huecos de secciones cuadradas y circulares, asi como sus interespaciados asociados, experimentaron una elongacion promedio del 44 ± 3 % en la direction paralela al estiramiento (direction x), asi como una contraction promedio del 13 ± 3 % en la direccion perpendicular (direccion y) al mismo. Por otro lado, se observa que los canales dispuestos paralelamente a la direccion de estiramiento, sufrieron una contraccion promedio en sus crestas y valles del 12 ± 2 % y 25 ±3 %, respectivamente. En contra, las crestas y valles de los canales dispuestos perpendicularmente a la direccion de estiramiento, experimentaron una elongacion promedio del 50 ± 3 % y 27 ± 2 %, respectivamente. Ademas, la relation altura/profundidad promedio de todas las caracteristicas topograficas experimentaron una disminucion del 18 ± 4 % tras el proceso de estiramiento. La tabla 1 recoge tambien el area superficial asociada a cada region geometrica (parte superior, inferior, lateral y total) calculada antes y despues del proceso de estiramiento para un campo de vision de 12144 pm2 (2). (1) El error asociado a estos parametros es para todos los casos inferior al 6 %.

EJEMPLO 2.

Se llevaron a cabo ensayos para demostrar el incremento de la inhibition bacteriana con las nanoestructuras obtenidas en el procedimiento de la invention.

Asi, se pudo observar que las caracteristicas topograficas obtenidas tras el estiramiento redujeron la adhesion de Staphylococcus epidermidis en un ~ 45 ±9 % frente a las muestras control lisas (muestras en PDMS carentes de topografias) para todas las geometrias consideradas (ver figura 14 B). La reduction en la adhesion obtenida para esta misma cepa mediante el uso de las replicas en PDMS del molde HS-20MG antes de ser sometidas a estiramiento (figura 14 A) alcanzaba un valor promedio de ~ 28 ± 2 % respecto a las muestras control lisas (Perera-Costa el al “Study the influence of surfal topography on bacterial adhesion using spatially organized microtopographic surface patterns”. American Chemical Society. Langmuir 2014, 30, 4633-4641). Por lo tanto, las caracteristicas geometricas obtenidas con la nueva metodologia desarrollada fueron un 17 % mas eficaces en la inhibicion de la adhesion de Staphylococcus epidermidis.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la creacion de nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas en materiales polimericos que comprende las siguientes etapas:

   a) Elaborar mediante litografla blanda una primera replica polimerica a partir de un molde comercial con nano/micro estructuras superficiales ordenadas sencillas,

   b) Someter la replica polimerica creada en la etapa a) a una deformacion bajo condiciones controladas de fuerza, temperatura y velocidad de deformacion, hasta alcanzar la deformacion deseada, y

   c) Elaborar in situ una segunda replica polimerica de la replica bajo deformacion de la etapa b), o

   c') Someter la replica bajo deformacion de la etapa b) a una temperatura que permita mantener la deformacion de forma permanente tras recuperar la temperatura ambiente inicial.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1 donde el pollmero empleado para la

   obtencion de las replicas se selecciona entre pollmeros termoplasticos, elastomeros, termoestables y sus combinaciones.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 donde la replica obtenida en el paso a) es una probeta de ensayo de traccion.
4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3 donde la deformacion se lleva a cabo

   mediante estiramientos o compresiones axiales en una o varias direcciones.
5. 5. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, que comprende las etapas a), b) y c).
6. 6. Procedimiento, segun la reivindicacion 5, que comprende adicionalmente la siguiente

   etapa:

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   d) Generar mediante litografla blanda una muestra identica a la segunda replica, obtenida en la etapa c), partiendo de dicha replica como molde.
7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6 donde la etapa d) se repite tantas veces

   como muestras identicas se quieran obtener.
8. 8. Procedimiento, segun las reivindicaciones 5-7, donde el pollmero empleado es un

   pollmero termoestable, preferiblemente PDMS.
9. 9. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, que comprende las etapas a), b) y c').
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, donde la etapa c') se lleva a cabo a una

    temperatura comprendida entre la temperatura de transicion vltrea y la temperatura de fusion que caractericen al pollmero empleado.
11. 11. Procedimiento, segun la reivindicacion 9 o 10, que comprende adicionalmente la

    siguiente etapa:

    d') Generar mediante litografla blanda una copia negativa de la replica, obtenida en la etapa c’), partiendo de dicha replica como molde.
12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 11 donde la etapa d’) se repite tantas veces

    como copias negativas se quieran obtener.
13. 13. Procedimiento, segun las reivindicaciones 9-12, donde el pollmero empleado es un

    pollmero termoplastico.
14. 14. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, todas las

    superficies que entren en contacto con el pollmero de interes en estado llquido son tratadas previamente con un agente antiadherente.
15. 15. Procedimiento, segun la reivindicacion 14, donde el agente antiadherente empleado

    es una disolucion desinfectante.
16. 16. Nano/micro estructuras superficiales ordenadas complejas en material polimerico

    5 obtenidas por el procedimiento de las reivindicaciones 1-15.
17. 17. Uso de nano/micro estructuras, segun la reivindicacion 16, en la inhibicion de la

    adhesion bacteriana a superficies polimericas.