ES2574138T3 - Sistema de detección óptica para ensayos biológicos de alta sensibilidad sin marcado - Google Patents

Abstract

Sistema de detección óptica para bio-ensayos de alta sensibilidadsin marcado que comprende el uso de técnicas de caracterizaciónóptica que permiten la interrogación vertical en dominios micro ysub-micrométricos así como al menos una celda resonante o interferométrica bio-fotónica de interrogación vertical caracterizado porque además comprende, al menos: (i) un sistema óptico de medidaque comprende, a su vez, y al menos una fuente de excitación, medios ópticos de detección de la señal procedente de un cabezal óptico; y un cabezal óptico; y (ii) un elemento para la integraciónde múltiples analitos comprendiendo, a su vez y al menos, una pluralidad de celdas bio-sensibles, una pluralidad de conexiones fluídicas conectadas con las celdas; y un sustrato sobre el que reposan tanto las celdas bio-sensibles como las conexiones fluídicas; y donde dicho cabezal óptico está configurado para analizar cada una de dichas celdas bio-sensibles y los analitos contenidos enellas.

Description

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DESCRIPCION

Sistema de deteccion optica para ensayos biologicos de alta sensibilidad sin marcado

El objeto de la invencion esta basado en el diseno y desarrollo hoUstico del sistema de bio-deteccion al conjuntar las ventajas interferometricas y resonantes de estructuras fotonicas novedosas con tecnicas de interrogacion optica como espectrometna, elipsometna as^ como reflectancia y/o transmitancia resuelta en angulo de forma simultanea en micro/sub-microdominios, haciendo que el sistema en su conjunto ofrezca maxima sensibilidad y robustez, eliminando ambiguedades en el proceso de interrogacion optica. Dichas cavidades son compatibles y estan adaptadas a los requerimientos flrndicos necesarios para llevar a cabo ensayos biologicos sin marcado. Ademas, el resultado de la medida se obtendra en un corto intervalo de tiempo, en pocos segundos. El campo de aplicacion de la presente invencion se enmarca dentro de la ingeniena y la ffsica, y en concreto, dentro del area de bio-fotonica, materiales, optica y micro-nanotecnologfa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Sectores como el biomedico y el clmico estan demandando continuamente mejores y mas eficaces tecnicas y herramientas de analisis para la identificacion de enfermedades, desarrollo de nuevos medicamentos y mejoras en la eficiencia del diagnostico. Para lograr este objetivo, los sistemas de deteccion compuestos por materiales opticos y componentes fotonicos, como base para el desarrollo de sistemas de bio-deteccion optica, se estan posicionando como una alternativa significativa de gran potencial (Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review, Anal. Chim. Acta 620, pp. 8-26, 2008. doi:10.1016/j.aca.2008.05.022.). Ademas del alto grado de sensibilidad que estos sistemas pueden llegar a alcanzar, ofrecen otras ventajas como: no son invasivos, ausencia de riesgo de descargas electricas o explosiones y su inmunidad a interferencias electromagneticas. Un aspecto clave para el desarrollo de estos sistemas se sustenta en el grado de desarrollo de la tecnologfa de miniaturizacion a micro y nano escala, capaz de integrar componentes mecanicos, flrndicos y fotonicos para desarrollar eficientes bio-sistemas de deteccion.

El proceso de averiguar si determinados patogenos o protemas se encuentran en un determinado analito en los sistemas opticos de bio-deteccion es realizado mediante la inmovilizacion de bioreceptores sobre areas espedficas del sensor. Una vez realizado el proceso de inmovilizacion es cuando se introducen los analitos de prueba en dichas areas, los cuales reaccionaran si tienen contenidos determinados patogenos o protemas que sean captados por los ya comentados receptores moleculares inmovilizados, en un proceso que se denomina reconocimiento molecular (RM). Este proceso de reconocimiento es monitorizado la mayona de las veces mediante tecnicas que requieren para su transduccion elementos de marcado tales como colorantes fluorescentes, isotopos radioactivos o partmulas magneticas, entre otros. Sin embargo, la qrnmica asociada al proceso de marcaje implica mayor tiempo y coste economico. Por el contrario, los bio-sensores opticos refractometricos no requieren este tipo marcaje para la deteccion, lo que se denomina sistemas de bio-deteccion sin marcado (label-free biosensing). Se espera que los sistemas de bio-deteccion sin marcado crezcan mas en importancia en sectores como el clmico, biofarmaceutico, medioambiental, seguridad, entre otros debido a su sensibilidad y capacidad para el modo de realizacion de analisis en tiempo real, ahorro de reactivos y analitos y, en definitiva, menor coste por analisis.

La tecnologfa de miniaturizacion e integracion a micro-nano escala esta logrando resultados prometedores para el desarrollo de nuevos sensores para bio-deteccion sin marcado. Se han desarrollado dispositivos nano-mecanicos como por ejemplo microvoladizos resonantes (resonant microcantilevers), y resonadores acusticos basados en MEMS (Sistemas microelectromecanicos, Micro Electro Mechanical Systems). Sin embargo, la sensibilidad que ofrecen es considerablemente menor que los dispositivos fotonicos integrados. Los dispositivos fotonicos integrados para su aplicacion como biosensores refractometricos son especialmente relevantes cuando son fabricados utilizando tecnicas convencionales de tecnologfa planar de micro-nano-fabricacion, lo que permite la miniaturizacion, reduccion de coste, fabricacion a gran escala, estabilidad mecanica y posibilidad de fabricar componentes opticos, flrndicos, electricos y fotonicos necesarios para conseguir dispositivos monolfticos y compactos de alta sensibilidad, y con capacidad para medir diferentes analitos de forma simultanea. Los sistemas de deteccion optica refractometricos utilizan como transduccion el efecto que provoca tanto la inmovilizacion de biomoleculas como el reconocimiento molecular en variaciones de mdice de refraccion. En la actualidad se han desarrollado y demostrado bio-sensores opticos refractometricos en tecnologfa planar de micro/nano fabricacion que suelen emplear el campo evanescente de un modo de luz guiado por una grna de onda de alto mdice de refraccion y estan basados en estructuras fotonicas tales como el plasmon de resonancia superficial (SPR), interferometros, resonadores, redes de difraccion y cristales fotonicos. Sin embargo, este tipo de dispositivos fotonicos suele necesitar de tecnicas complejas de acoplamiento, por ejemplo, entre la grna de onda y la fibra optica (p.e. grnas de estrechamiento invertido y acopladores basados en redes de difraccion) para obtener la informacion, lo cual dificulta el encapsulado y empaquetamiento de los mismos y repercute drasticamente en el coste del dispositivo.

Algunos de estos sensores, que se describen a continuacion, han sido ya comercializados, otros estan en fase de comercializacion, y algunos todavfa no han sido comercializados:

1. Biosensores refractometricos basados en la resonancia del plasmon superficial, en ingles "Surface plasmon resonance" (SPR)

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Desde sus descubrimiento en 1983, es una de las tecnicas opticas mas exitosas para biosensores sin marcado, esta aceptada comercialmente y es distribuida por ejemplo por las firmas comerciales Biacore (
www.biacore.com) e Ibis Technologies (
www.ibis-spr.nl) entre otras. La tecnica SPR es utilizada ampliamente para la determinacion de muchos tipos de interacciones biologicas y cientos de publicaciones aparecen en la literatura cada ano. Tambien existe un elevado numero de patentes, a modo de ejemplo se referencian algunas de ellas: US5492840, US2008193965, US2064090630, WO2008101348, WO2008054282, al igual que referencias cientificas (Analysis of the performance of interferometr y, surface plasmon resonance and luminescente as biosensors and chemosensors, Review. Anal. Chim. Acta 569 (1-2), pp. 1-20, 2006. doi:10.1016/j.aca.2006.03.058.) y (Surface plasmon resonance sensors: review, Sensors and Actuators B: Chemical 54 (1-2), pp. 3-15, 1999. doi:10.1016/S0925-4005 (98) 003219.). La desventaja de este sistema con el que se propone en la presente invencion se funda en que estos sistemas son mas lentos, no se pueden miniaturizar de modo que alcancen una alta integracion en dispositivos, no son de alta cadencia de medida, y por tanto son de mayor coste economico por analisis.

2. Biosensores refractometricos basados en interferometros

Existen varios tipos de biosensores refractometricos basados en interferometrfa, de los cuales se destacan: Interferometro de Young, los basados en redes de difraccion y los interferometros Mach-Zehnder:

2.1. Interferometro de Young (I-Y): Comercializado por la empresa Farfield Group (
www.farfield-scientific.com) ofrece alta sensibilidad. Consiste en cuatro laminas dielectricas, dos de ellas son el area sensible y las otras dos como referencia. La interferometna entre las dos senales permite determinar la deteccion (US 7050176B1) y (A new quantitative optical biosensor for protein characterisation, Biosensors and Bioelectronics 19 (4), pp. 383-390, 2003. doi: 10.1016/S0956-5663 (03) 00203-3). Tambien puede utilizar la polimerizacion para la excitacion. Sin embargo, es una tecnica en la que la posibilidad de integrar multiples chips es mas complejo en comparacion con otras tecnicas, siendo por tanto la capacidad de integracion y la cadencia de medida inferior y el coste por analisis mayor en comparacion con el sistema de bio-deteccion que se propone en la presente invencion.

2.2. Basados en redes de difraccion: Por ejemplo los Acopladores de gu^as de onda basados en redes de difraccion (Waveguide grating couplers) (WGC): que se han utilizado para comercializar varios sistemas de bio-deteccion sin marcado. Hay varias firmas comerciales que han comercializado este sistema (p.e. Microvacum:
www.microvacuum. com, entre otras). En estos sistemas se utilizan grnas de onda como elemento basico de sus estructuras para la propagacion de la luz y estan basados tambien en el campo evanescente para la deteccion. Dentro de este grupo destaca el sistema de alta cadencia de medida comercializado recientemente por Corning (
http://www.corning.com/) basado en acopladores de redes de difraccion. Este sistema es capaz de hacer una medida cada pocos segundos en pozos estandar de capacidad del orden de micro-litros por pozo. A continuacion se referencia algunas patentes existentes relativas a biosensores basados en acopladores y redes de difraccion: US2008219892, EP1892518, GB2227089, asf como alguna referencia cienrffica (Optical grating coupler biosensors, Biomaterials 23 (17), pp. 3699-3710, 2002. doi:10.1016/S0142-9612 (02) 00103-5), (Wavelength-Interrogated optical sensor for biomedical applications, Opt. Lett. 25 (7), pp. 463-465, 2000. doi:10.1364/OL.25.000463). Este sistema ofrece una solucion de alta cadencia pero en comparacion con la presente invencion, es menos robusto, sensible y los pozos de medida son de mayor volumen que los que se pueden lograr con la presente invencion, pudiendose llegar a medir volumenes del orden de femtolitros.

2.3. Interferometros Mach-Zehnder (M-Z): Ofrecen potencialmente una alta sensibilidad como biosensores sin marcado al disponer de una referencia interna para compensar las fluctuaciones del mdice de refraccion debidas a adsorcion inespedfica. Los sensores interferometricos proporcionan un amplio rango dinamico en comparacion con otros sensores integrados. Sin embargo, la mayona de la investigacion realizada parece todavfa estar confinada a nivel de laboratorio y hasta donde llega nuestro conocimiento no han sido explotados comercialmente. Estos dispositivos tienen la desventaja de su costoso encapsulado y empaquetado al requerir un acoplamiento de grna de onda-fibra optica. Como referencias cienrfficas se pueden consultar: J. Lightwave Technol. 16 (4), pp. 583-592, 1998), Sensors and actuators B: Chemical 92, pp.151-158, 2003. doi:10.1016/S092514005 (03) 00257-0 y Journal of Nanotechnology 14, pp. 907-912, 2003. doi: 10.1088/0957-4484/14/8/312. Un caso particular son los Interferometros Mach-Zehnder (M-Z) basados en Grnas ARROW (gu^as de onda opticas de reflexion antirresonantes, Anti resonant reflecting optical waveguides) (GA): En este caso el campo electrico es confinado en una grna de onda y el campo evanescente interacciona con las biomoleculas (Sensors and actuators B: Chemical 92, pp.151-158, 2003. doi:10.1016/S0925-4005 (03) 00257-0). Grnas huecas ARROW han sido demostradas, con alta sensibilidad. Hasta la fecha no han sido desarrolladas para aplicacion comercial hasta donde llega el conocimiento de los autores de la presente invencion.

3. Biosensores refractometricos basados en resonadores opticos

El fenomeno de la resonancia es un concepto que se puede explotar para la bio-deteccion sin marcado. En este tipo de dispositivos, la sensibilidad viene determinada por el factor de calidad de las cavidades resonantes y de su respuesta ante las reacciones de afinidad y reconocimiento molecular que se provocan en las mismas. Entre ellos destaca como tecnica emergente los dispositivos integrados basados en resonadores de micro-anillo y micro-disco (p.e. US2004023396) en los que el factor de calidad reportado en la bibliograrfa es muy elevado. (p.e. Integrated optics ring-resonator sensors for protein detection, Opt. Lett. 30 (24), pp. 3344-3346, 2005. doi:10.1364/OL.303344).

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Otras configuraciones pueden utilizar micro-esferas resonantes u otro tipo de cavidades, y recientemente se han demostrado gmas de nano-canal en donde las biomoleculas son ancladas en su interior para mejorar su repuesta (Label-free optical biosensing with slot-waveguides. Opt. Lett. 33, (7), pp. 708-710, 2008.

doi:10.1364/OL.33.000708). Hasta donde llega el conocimiento de los autores no existen firmas comerciales que exploten esta tecnologfa comercialmente. La principal desventaja de estos dispositivos con respecto a la presente invencion es que estan desarrollados sobre tecnologfa planar, lo cual requiere costosos sistemas de acoplamiento, encapsulado y empaquetamiento para obtener la informacion. Ademas requieren de tecnicas de micro-fabricacion muy bien desarrolladas ya que las cavidades resonantes son muy sensibles a defectos de fabricacion, se pueden integrar muchos menos dispositivos que con la tecnologfa alternativa que se propone en la presente invencion y la capacidad para crear dispositivos con alta cadencia de medida es muy compleja.

4. Biosensores refractometricos basados cristales fotonicos

Se destacan las microcavidades basadas en cristales fotonicos (PCW). Estos biosensores utilizan las propiedades de los cristales fotonicos donde existen un amplio numero de patentes (p.e. US2008252890, US2008219615) y aplicaciones para crear dispositivos interferometricos o cavidades resonantes de alto factor de calidad mediante la inclusion de defectos en la estructura fotonica (p.e. Ultracompact biochemical sensor built with two dimensional photonic crystal microcavity, Opt. Lett. 29, (10), pp.1093-1095, 2004. doi:10.1364/OL.29.001093). Se reportan valores de sensibilidad elevados, aunque los requerimientos de fabricacion necesarios para su aplicacion comercial parecen ser demasiado exigentes, ademas de influir negativamente otros aspectos como integracion, encapsulado, empaquetamiento para conseguir reduccion de coste y alta cadencia de medida.

Finalmente se ha de remarcar que la actividad investigadora en el campo de la deteccion sin marcado como metodo para el reconocimiento molecular es muy intensa dado que el evitar el marcado mediante fluorescencia, radioactividad o magnetismo mejorara drasticamente el coste por analisis, la calidad de la deteccion y la capacidad para el desarrollo de nuevos medicamentos y la identificacion de enfermedades con el impacto que ello significara en el futuro. Se estan proponiendo de forma continua estructuras fotonicas innovadoras como por ejemplo cavidades resonantes de alto factor de calidad incluso para la deteccion de una sola biomolecula (Label-Free, Single-Molecule Detection with Optical Microcavities, Science Volumen 317, pagina 783, ano 2007).

La presente invencion es novedosa y mejora el estado de la ciencia y tecnologfa en el mercado actual en el campo los biosensores opticos integrados con respecto a los ultimos avances por su enfoque de integracion de tecnologfa para conseguir que la bio-deteccion sin marcado se pueda explotar tanto a nivel de bio-chips desechables como a nivel de deteccion de alta cadencia de medida en sustratos de gran tamano, para ofrecer unas metricas de sensibilidad y robustez que ningun sistema actual es capaz de proporcionar, debido al hecho de combinar avanzadas tecnicas opticas de interrogacion vertical y estructuras bio-fotonicas novedosas como se explicara mas adelante.

Dado que el sistema de medida no solo esta basado en el diseno de estructuras bio-fotonicas de alta sensibilidad, sino tambien en tecnicas de interrogacion optica avanzada, es conveniente destacar que, en la actualidad, existen firmas comerciales que parcialmente ofrecen tecnicas de interrogacion optica complementarias utilizadas tanto en el campo de la investigacion o en la fabricacion de dispositivos en el sector de la micro-nano electronica, pero ninguno de ellos es un sistema integrado para el analisis de bio-chips y estructuras fotonicas para ensayos biologicos sin marcado. Entre ellas, se puede destacar la espectrometna, que se puede realizar a nivel de microdominios, bien mediante espectrometros dispersivos donde existen numerosos fabricantes que ofrecen esta tecnica (p.e. HORIBA Jobin Yvon wwwjobinyvon.com), o por transformada de Fourier donde tambien existen suministradores que ofrecen equipos de gran calidad (p.e. Bruker-Optics,
www.brukeroptics.com), o incluso micro-espectrometros, aunque estos suelen ofrecer muy poca resolucion para ser utilizados para bio-deteccion. Es de destacar tambien el numero de fabricantes que ofrece sistemas opticos basados en tecnologfa confocal como, por ejemplo, Olympus, Leica, Zeiss, Nikon, Perkin-Elmer, Nanofocus Ag, etc. que permiten observar micro y sub-microdominios de muestras para su analisis. En cuanto a la existencia de equipos que integren mas de una tecnologfa optica para aplicaciones de alta cadencia cabe destacar los proveedores en el sector de la microelectronica, por ejemplo KLA-Tencor (
http://www.kla- Tencor.com/) que comercializa una gran variedad de sistemas para la caracterizacion optica en lmea en la fabricacion de dispositivos en el sector de la microelectronica y semiconductores. Tecnologfas opticas como elipsometna, espectrometna y reflectometna en funcion del angulo de incidencia son muy utiles y han sido adaptadas para conseguir una alta cadencia y evaluar cientos de dispositivos y estructuras dentro de microdominios en obleas normalmente de silicio, pudiendose evaluar sustratos de gran tamano como por ejemplo obleas de silicio de 300 mm de diametro. A continuacion se referencia alguna de estas patentes como: "Method and apparatus for evaluating the thickness of thin films (EP0549166"), "High resolution ellipsometric apparatus (EP0396409) " y "Selfcalibrating beam profile ellipsometer (US2004233436) ". Las patentes existentes en este ambito estan enmarcadas unicamente en el sector de la microelectronica, solo para caracterizar propiedades ffsicas de estructuras electronicas por reflexion fabricadas normalmente con materiales dielectricos y en tecnologfa de Si en general, y sobre sustratos de obleas de Si (no contemplan transmision como en la presente invencion), y nunca se ha contemplado ni se han disenado tecnicas avanzadas de medida de evaluacion vertical para bio-deteccion basadas en el analisis de respuesta de bio-chips formados por estructuras resonantes interferometricas y bio-fotonicas.

En conclusion, ni existe ni esta reportado ningun sistema de bio-deteccion basado en el concepto descrito en la

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presente invencion hasta donde los autores han podido investigar, y ningun fabricante en la actualidad ofrece un sistema de deteccion optico integrado para el analisis de micro y sub-microdominios que integre soluciones en transmision y reflexion para analisis mediante elipsometna, espectrometna y transmitancia/reflectancia resuelta en angulo, y mucho menos para el analisis de celdas interferometricas resonantes y/o bio-fotonicas como sistema optico de deteccion para bio-ensayos sin marcado. Ademas, en la presente invencion se propone utilizar un sistema de deteccion matricial tipo CCD que permitira analizar espacialmente todo el perfil de reflexion y transmision para obtener una informacion mas precisa y con mas resolucion de la diferencia de fase de las ondas polarizadas, respuesta espectral y reflectancia/transmitancia resuelta en angulo. El analisis optico del perfil de reflexion y transmision de las micro-celdas bio-fotonicas, nunca antes contemplado, supondran un avance significativo en el desarrollo y eficacia de bio-deteccion sin marcado. Dicho sistema de bio-deteccion optico no esta ni ideado ni mucho menos desarrollado en la actualidad por ningun fabricante.

El artmulo “Resonant Cavity Imaging: A Means Toward High-Throughput Label-Free Protein Detection; Bergstein D A; IEEE JOURNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS, VOL. 14 NR. 1, paginas 131 - 139; 20080101” da a conocer (figs. 1, 4, 7) un biosensor de imagen de cavidad resonante (RCIB) que utiliza una tecnica optica para la deteccion de interacciones de enlazamiento molecular sin marcado en multiples posiciones en paralelo que emplea una cavidad optica resonante para alta sensibilidad. Segun esta tecnica, luz en el infrarrojo cercano pasa de modo resonante a traves de una cavidad de Fabry-Perot compuesta de reflectores dielectricos superior e inferior, fabricados de capas alternadas de Si/SiO2 y la longitud de onda es barrida, por lo que un desplazamiento en longitud de onda en la respuesta resonante local de la cavidad optica indica enlazamiento. La intensidad transmitida en miles (p. e., 16384) de posiciones de pixel puede ser registrada asf simultaneamente.

La fig. 1 da a conocer como se pueden realizar medidas simultaneas independientes utilizando un dispositivo que comprende dos superficies parcialmente reflectoras situadas enfrentadas entre sf para formar una cavidad de Fabry- Perot. Los agentes de captura se estampan sobre una de las superficies reflectoras. Un haz de luz colimado se hace incidir sobre la cavidad a traves de uno de los reflectores, y la longitud de onda se barre a la vez. Una camara recoge las imagenes de intensidad transmitida, mapeando la caractenstica de resonancia de cada posicion a lo largo de la superficie de la cavidad plana respecto a un pixel en la camara. Moleculas dianas ligadas a sus correspondientes agentes de captura fijados a la superficie del reflector desplazan la condicion resonante local de la cavidad. El numero de puntos evaluados simultaneamente esta limitado esencialmente por el numero de pixeles disponibles en la camara, y asf, se puede escalar facilmente para conseguir un rendimiento muy alto. Los reflectores de la cavidad resonante consisten en capas alternantes de Si y SiO2. La fig. 7 muestra imagenes de reacciones de enlazamiento en tres canales de flujo (#1, #2, #3) que indican distintas intensidades de serial cuando se ven orientadas hacia la superficie del sustrato.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion consiste en un novedoso sistema de deteccion optico para ensayos biologicos sin marcado de alta sensibilidad, como se define segun las reivindicaciones adjuntas. Dicho sistema esta basado en celdas bio- fotonicas de interrogacion optica vertical fabricadas con tecnologfa de micro-nano-fabricacion que pueden ser integradas en sustratos de gran tamano (por ejemplo, obleas de silicio, vidrio, etc.) para aplicaciones de alta cadencia de medida, o individualmente para el modo de realizacion de chips desechables. Dichas celdas ofrecen una respuesta de alta sensibilidad a minusculos cambios del mdice de refraccion de las biomoleculas adosadas en las cavidades de sus estructuras. La interrogacion se realiza analizando el perfil de reflexion y/o transmision del haz de luz de las celdas bio-fotonicas verticalmente mediante tecnicas de elipsometna, espectrosmetna, y de transmitancia o reflectancia en funcion del angulo de incidencia de forma simultanea, evitandose el elevado coste que supone el encapsulado de los chips fotonicos convencionales al evitarse el acoplamiento grna de onda-fibra optica.

Mas concretamente, la presente invencion describe el desarrollo de un sistema biosensor optico de alta sensibilidad que evita la necesidad de marcado (p.e. fluorescencia, radioactividad o magnetismo) y que ademas ofrece alta cadencia de medida para el reconocimiento molecular, como por ejemplo la deteccion de patogenos o protemas mediante reacciones de afinidad anticuerpo-antfgeno. Los beneficios y caractensticas claves de la presente invencion subyacen en un nuevo concepto de sistema biosensor que combina, por un lado, el uso de tecnicas avanzadas de caracterizacion optica que permiten la interrogacion vertical en dominios micro y sub-micrometricos y, por otra parte, el desarrollo estructuras resonantes bio-fotonicas y/o interferometricas altamente sensibles para aumentar la capacidad de deteccion de minusculas variaciones del mdice de refraccion. Ademas, los materiales que se pueden utilizar para el modo de realizacion de las celdas bio-fotonicas sensibles son compatibles con los procesos de micro-nano fabricacion a gran escala como oxido de silicio, nitruro de silicio, polidimetil siloxano (PDMS), resina SU8, oxido de titanio, o cualquier otro dielectrico, asf como laminas delgadas de metales como aluminio, cobre, etc.

Mediante la observacion del perfil de reflexion o transmision de varias tecnicas complementarias de interrogacion optica de forma simultanea (p.e. elipsometna, espectrometna y reflectancia o transmitancia resuelta en angulo) y la aplicacion para ensayos biologicos sin marcado de estructuras bio-fotonicas sera posible determinar con mayor fiabilidad y sensibilidad la interaccion molecular con los receptores moleculares inmovilizados en las areas sensibles de las celdas bio-fotonicas. El hecho de que la interrogacion sea realizada verticalmente por varias tecnicas de

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deteccion optica de alta sensibilidad de forma simultanea elimina las incertidumbres y ambiguedades de medida normalmente presentes en los sistemas de deteccion optica.

El sistema biosensor propuesto funciona como un sistema ultra sensible a mmimas variaciones del mdice de refraccion durante el proceso de reconocimiento molecular, y por lo tanto tiene claras aplicaciones potenciales en aquellos campos en los cuales un bio-ensayo pueda ser desarrollado, como por ejemplo los sectores biomedico, bioqmmico, farmaceutico, clmico, medioambiental y seguridad, ya que las variaciones del mdice de refraccion de las interacciones moleculares estan en el rango de indices de refraccion que pueden ser facilmente detectados con este sistema.

El sistema optico biosensor propuesto tambien soluciona un problema inherente a los chips fotonicos convencionales micro-nano fabricados en tecnologfa planar, al ofrecer una solucion de bajo coste para la integracion, encapsulado y empaquetamiento de los chips. Esto es asf porque la interrogacion de las celdas sensibles biofotonicas es vertical, bien sea en reflexion o en transmision, evitandose la necesidad de utilizar costosos sistemas de acoplamiento grna de onda-fibra optica (p.e. grnas de estrechamiento invertido y acopladores basados en redes de difraccion) para obtener la informacion. Para ello se utilizara una o varias fuentes de excitacion dentro del rango visible e infrarrojo, coherentes o no, como por ejemplo un haz de luz laser.

Asf, la interrogacion de las celdas bio-sensibles se realizara mediante luz altamente focalizada a traves de un objetivo optico de alta apertura numerica, permitiendo el analisis en micro y sub-microdominios. El tamano del dominio de analisis viene determinado por el lfmite de difraccion, lo cual implica que para longitudes de onda mas larga los dominios seran de mayor tamano que para longitudes de onda mas corta (p.ej. para una longitud de onda de 633 mm y un objetivo de microscopio estandar de apertura numerica 0,8 sera posible analizar dominios de unos 0,8 micrometros). Se debe destacar que los objetivos de alta apertura numerica permitiran la observacion del perfil de reflexion o transmision directamente traves de un detector matricial tipo CCD, lo cual tambien implicara la obtencion de la transmitancia o reflectancia resuelta en angulo de forma simultanea. A su vez, si la luz de excitacion es polarizada, se podra obtener del mismo perfil informacion sobre el estado de polarizacion de la luz reflejada y transmitida, obteniendose asf informacion elipsometrica de forma simultanea a la transmitancia y reflectancia resuelta en angulo. Finalmente para la obtencion de la respuesta espectral sera necesario contar con una fuente de luz multi-longitud de onda y contar, por ejemplo, con un elemento dispersivo tipo red de difraccion para la deteccion de la respuesta de la reflectancia/transmitancia resuelta en longitud de onda.

Los dominios donde se integran las celdas bio-sensibles se podran fabricar directamente en chips desechables, o en sustratos de gran tamano como puedan ser por ejemplo obleas de silicio, vidrio o cualquier otro material. A su vez, el sistema podra llevar un sub-sistema de reconocimiento de imagenes y geometnas que permitira que el cabezal de medida se posicione en las areas bio-sensibles con la resolucion y precision suficiente, haciendo posible no solamente que el numero de celdas por unidad de superficie se pueda aumentar, es decir la integracion de celdas bio-sensibles se pueda incrementar, sino tambien que la cadencia y acceso a las celdas sensibles bio-fotonicas puedan ser automaticos. Es de destacar que para aumentar la robustez del sistema, la respuesta optica tanto en reflexion y/o transmision de las celdas bio-fotonicas se podra utilizar tambien como informacion de control y herramienta para determinar el correcto posicionamiento, ya que el perfil de simetna de la intensidad optica tanto en transmision como en reflexion puede ser disenado a partir de la geometna de las estructuras bio-fotonicas. Por ejemplo, en el caso de celdas bio-fotonicas formadas por redes periodicas de micropilares, pozos cilmdricos u otro tipo de simetna, el perfil de reflexion/transmision sera tambien simetrico cuando el cabezal optico esta bien posicionado.

En definitiva, mediante el modo de realizacion de este sistema, sera posible lograr que la rutina de medida y analisis de analitos sea mas eficiente desde un punto de vista de coste y adaptada a realizar cientos de medidas sobre un unico o varios analitos. Por tanto, el sistema ofrece la capacidad unica de multiples medidas de un unico analito o bien de varios analitos. Ademas, el uso simultaneo de varias tecnicas de interrogacion optica en pocos segundos hace que el sistema sea muy robusto permitiendo al sistema ser capaz de ofrecer una alta cadencia de medida y productividad en comparacion con otras tecnicas de analisis alternativas para bio-deteccion.

El sistema sera capaz de medir tanto bio-chips desechables para aplicaciones donde la demanda del analisis requiera la cercama al punto de cuidado (p.e. un centro de salud), o al punto de interes en general (p.e. el analisis de contaminantes de un no), o en sustratos de gran tamano para aplicaciones de alta cadencia de medida para por ejemplo, el desarrollo de nuevos medicamentos y receptores farmacologicos para el desarrollo de dianas terapeuticas.

El sistema optico de deteccion de ensayos biologicos sin marcado propuesto en la presente invencion ofrece un sistema de deteccion sin precedentes al ser una solucion holfstica que incorpora todas las cualidades que ofrecen por un lado las celdas bio-fotonicas y por otro las tecnicas avanzadas de interrogacion optica propuestas:

- Celdas bio-fotonicas: Las estructuras fotonicas disenadas que conforman las celdas bio-fotonicas de interrogacion optica vertical ofreceran las ventajas de los fenomenos ffsicos ya mencionados como la resonancia, interferometna. Ademas pueden ofrecer la capacidad de confinamiento y concentracion del campo electrico en aquellas zonas sensibles donde se inmovilizaran las biomoleculas para mejorar la sensibilidad. En la presente invencion, las celdas

bio-fotonicas formadas por una distribucion periodica de micropilares resonantes concentrara el campo electrico evanescente en la superficie de dichos pilares donde seran inmovilizadas las biomoleculas, haciendo por tanto, que la respuesta de los micropilares resonantes incremente ostensiblemente la sensibilidad de las celdas bio-fotonicas.

- Tecnicas opticas de interrogacion vertical: La eficacia de las tecnicas opticas de alta resolucion, capacidad de 5 caracterizacion y deteccion como las que se proponen para la interrogacion vertical de las celdas bio-fotonicas

ofreceran una solucion unica y avanzada porque a la alta sensibilidad de respuesta de las celdas bio-fotonicas se unen las tecnicas de analisis optico mas sensibles a variaciones de mdice de refraccion. La respuesta optica resonante y/o interferometrica ante a las reacciones de afinidad y reconocimiento molecular de las correspondientes celdas bio-fotonicas se vera amplificada cuando son interrogadas haciendo uso del cambio de la polarizacion de la 10 luz (elipsometna), la respuesta de reflectancia y/o transmitancia resuelta en: longitud de onda (espectrometna) y en angulo de incidencia. Ademas, las tecnicas propuestas permitiran: el analisis en micro y sub-microdominios, la localizacion de dichos dominios mediante reconocimiento de imagenes y geometnas, y por tanto, la capacidad de integrar multiples celdas sensibles por unidad de area. Se unen a estas ventajas el tiempo de analisis en pocos segundos y la robustez de analizar cada celda bio-fotonica con tecnicas opticas de alta sensibilidad de forma 15 simultanea, haciendo mas fiable el proceso de interrogacion optica.

En definitiva, el concepto unico propuesto en la presente invencion permitira desarrollar sistemas de bio-deteccion sin marcado competitivos en terminos de comercializacion industrial, sensibilidad, cadencia de medida, robustez y costo.

En la presente invencion, las cavidades de interrogacion vertical que se proponen ofrecen las siguientes ventajas:

20 1°. Alta sensibilidad, ya que hacen uso de los fenomenos interferometricos y resonantes de las estructuras fotonicas

propuestas cuando son evaluados por tecnicas de medida de alta sensibilidad (p.e. elipsometna)

2°. Robustez, ya que las estructuras fotonicas son analizadas simultaneamente con varias tecnicas de medida, lo cual reduce la incertidumbre y ambiguedad de la medida en el proceso de interrogacion.

3°. Sistema de acoplamiento sencillo, la evaluacion vertical en micro y sub-microdominios es facilmente realizable 25 utilizando un objetivo de microscopio de alta apertura numerica, lo cual permite acceder a las estructuras de forma sencilla, donde un simple sistema optico de reconocimiento de imagenes puede ser implementado para la localizacion de las areas de medida.

4°. Reduccion de coste, ya que aprovecha todas las ventajas de la tecnologfa de micro-nano fabricacion y permite la integracion de multiples dispositivos para analisis simultaneo de varios analitos. Ademas, el coste por analisis se 30 reduce ya que las celdas de deteccion pueden ser altamente integradas, por ejemplo es viable integrar 100 celdas sensible por 1 cm2, lo que indicana un coste por analisis de 10 centimos de euro, que es despreciable frente al coste de reactivos y material biologico. Ademas, el hecho de no tener que utilizar tecnicas de marcado (por ejemplo, fluorescencia o radioactividad) en la preparacion de las muestras reduce tambien el coste. Finalmente, este sistema de deteccion optica en micro y sub-microdominios permite analizar volumenes de analitos extremadamente 35 pequenos (muy por debajo de los nano-litros) en comparacion con los sistemas actuales (del orden de micro-litros) reduciendose tambien la cantidad de reactivos para llevar a cabo los analisis.

5°. Alta cadencia de medida, la duracion de una medida optica se realiza en un corto intervalo de tiempo, en pocos segundos, y el desarrollo de la tecnologfa actual permite que el movimiento para el posicionamiento de la sonda optica pueda ir dispositivo por dispositivo para su evaluacion de forma muy precisa y en poco tiempo.

40 6°. Aplicaciones: el numero de aplicaciones es multiple desde un punto de vista de bio-deteccion, ya que depende de

las aplicaciones biologicas correspondientes que continuamente se estan desarrollando. El sistema de deteccion se podra aplicar por tanto para todas aquellas aplicaciones en las que se pueda desarrollar un bioensayo, y por lo tanto como cualquier sistema de bio-deteccion sera relevante en sectores de alto impacto como el clmico, biomedico, medioambiental, farmaceutico, seguridad, etc. Es resenable que el sistema de la presente invencion sera capaz de 45 medir tanto en sustratos de gran tamano para aplicaciones donde la cadencia de medida es esencial para aumentar la eficiencia, reducir el coste y el tiempo en el desarrollo, por ejemplo de nuevos medicamentos, asf como para aplicaciones en las que el punto de analisis requiere de un acceso complicado (p.e. para aplicaciones medioambientales) o para reducir el tiempo y coste al poderse realizar el analisis cerca del punto de cuidado como pueda ser un centro de salud. Esta paliacion se podra realizar mediante bio-chips desechables de bajo coste.

50 BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

A continuacion se pasa a describir de manera muy breve una serie de dibujos que ayudan a comprender mejor la invencion y que se relacionan expresamente con un modo de realizacion de dicha invencion que se presenta como un ejemplo no limitativo de esta.

- FIGURA 1. Representacion esquematica del sistema bio-deteccion optica sin marcado a escala de sustratos de 55 gran tamano como pueden ser obleas de silicio o vidrio transparente.

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- FIGURA 2. Representacion esquematica del sistema bio-deteccion optica a escala de chips desechables.

- FIGURA 3. Vista de un ejemplo de celda fotonica bio-sensible basada en una cavidad resonante tipo Fabry -Perot de interrogacion vertical por reflexion.

- FIGURA 4. Vista de un ejemplo de celda fotonica bio-sensible basada en una cavidad resonante tipo Fabry-Perot de interrogacion vertical por transmision.

- FIGURA 5. Vista de un ejemplo de celda fotonica bio-sensible basada en micropilares resonantes de interrogacion vertical por reflexion, segun la invencion.

- FIGURA 6. Ejemplo de celda fotonica bio-sensible basada en una red de micropilares resonantes de interrogacion vertical por transmision, segun la invencion.

- FIGURA 7. Ejemplo de sistema optico de interrogacion de celdas bio-fotonicas basado en el analisis de reflexion de luz incidente.

- FIGURA 8. Ejemplo de sistema optico de interrogacion de celdas bio-fotonicas basado en el analisis de transmision.

- FIGURA 9. Bio-deteccion mediante la respuesta de reflectancia resuelta en angulo para una celda bio-fotonica tipo cavidad resonante Fabry-Perot. Se representa la respuesta del resonador para dos situaciones: sin ningun anclaje biomolecular (respuesta fotonica de la celda) y para un cierto reconocimiento molecular equivalente a 0, 01 unidades de mdice de refraccion (R.I.U.)

- FIGURA 10. Bio-deteccion mediante la respuesta de espectrometna para una celda bio-fotonica tipo cavidad resonante Fabry-Perot. Se representa el movimiento del pico de resonancia en funcion de la longitud de onda para dos situaciones: sin ningun anclaje biomolecular (respuesta fotonica de la celda) y para un cierto reconocimiento molecular equivalente a 0,01 R.I.U.

- FIGURA 11. Bio-deteccion mediante la respuesta elipsometrica de una celda bio-fotonica tipo cavidad resonante tipo Fabry-Perot. Se representa la diferencia de fase entre los estados de polarizacion vertical y horizontal en funcion del reconocimiento molecular provocado por el incremento de mdice de refraccion.

- FIGURA 12. Ejemplo de un proceso de micro-fabricacion de una celda bio-fotonica de evaluacion vertical.

- FIGURA 13. Representacion esquematica de un ejemplo de integracion completa de interrogacion optica vertical de una celda biofotonica.

MODO DE REALIZACION PREFERENTE DE LA INVENCION

Como se ha indicado anteriormente, constituye el objeto de la presente invencion el desarrollo de un sistema de bio- deteccion optica de alta sensibilidad y capacidad para ensayos biologicos sin marcado. Los beneficios y caractensticas claves de la presente invencion subyacen en un nuevo concepto de sistema biosensor que combina por un lado el uso de tecnicas avanzadas de caracterizacion optica que permiten la interrogacion vertical en dominios micro y sub-micrometricos, y por otra parte el desarrollo celdas bio-fotonicas (tal y como se observa en las figuras 5 y 6) que seran extremadamente sensibles a minusculas variaciones del mdice de refraccion que se produzcan por el anclaje de biomoleculas en las superficies sensibles de las cavidades de dichas celdas bio- fotonicas, haciendo posible el reconocimiento molecular y detectando, por ejemplo, reacciones de afinidad anticuerpo-antfgeno de forma considerablemente sensible. Las celdas bio-fotonicas podran ser fabricadas en materiales compatibles con los procesos de micro-nano fabricacion a gran escala como oxido de silicio, nitruro de silicio, polidimetil siloxano (PDMs), SU8, o cualquier dielectrico, asf como laminas delgadas de metales como aluminio, oro, etc.

Mediante la observacion espacial de la intensidad de luz reflejada (figura 7) o transmitida (figura 8) de por ejemplo tres tecnicas complementarias de interrogacion optica de forma simultanea (elipsometna, espectrometna y reflectancia o transmitancia resuelta en angulo) y la amplificacion para ensayos biologicos sin marcado de las estructuras resonantes o interferometricas bio-fotonicas de interrogacion vertical integradas en celdas opto-flmdicas, sera posible determinar con mayor fiabilidad y sensibilidad la interaccion molecular con los receptores moleculares inmovilizados en las areas sensibles, eliminado todas la incertidumbres y ambiguedades de analisis normalmente presentes en los sistemas de deteccion optica.

El sistema optico biosensor propuesto funciona como un sistema ultra sensible a mmimas variaciones del mdice de refraccion provocada por la interaccion biomolecular del ensayo correspondiente, y por lo tanto tiene claras aplicaciones potenciales en aquellos campos en los cuales un bio-ensayo pueda ser desarrollado, como por ejemplo los sectores biomedico, bioqmmico, farmaceutico, clmico, medioambiental y seguridad, ya que las variaciones del mdice de refraccion de las interacciones moleculares estan en el rango de indices de refraccion que pueden ser facilmente detectados con este sistema.

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El sistema de bio-deteccion optica propuesto tambien soluciona un problema inherente a los chips fotonicos convencionales fabricados en tecnologfa planar al ofrecer un solucion mas eficiente y de bajo coste para la integracion, encapsulado y empaquetamieto de los bio-chips al ser la interrogacion de las celdas sensibles bio- fotonicas vertical, bien en trasmision (figuras 4 y 6) o en reflexion (figuras 3 y 5) evitandose los costosos sistemas de acoplamiento gma de onda-fibra optica necesarios en los bio-chips fotonicos implementados en tecnologfa planar (p.e. gmas de estrechamiento invertido y acopladores basados en redes de difraccion) para obtener la informacion. Para ello (figuras 7 y 8) se utilizara un haz de luz laser u otra fuente de luz coherente o no, altamente focalizado mediante un objetivo de apertura numerica alta, permitiendo el analisis en micro y sub-microdominios tanto en chips desechables (figura 2), o en sustratos de gran tamano (figura 1) como puedan ser obleas de silicio. El sistema puede llevar un sistema de reconocimiento de imagenes incorporado en el sistema de deteccion para localizar y posicionar el cabezal de medida en las areas de deteccion, haciendo asf posible que la cadencia y acceso a las celdas sensibles bio-fotonicas sea automatico. Los perfiles recogidos de intensidad de luz reflejada (ver 78 en figura 7) y transmitida (ver 88 en figura 8) pueden ser utilizados tambien como herramienta de ajuste para determinar el correcto posicionamiento debido a la simetna espacial del perfil de intensidad optica (figura 7 y 8). Esto puede ser asf debido a que las celdas bio-fotonicas pueden ser disenadas para que la respuesta optica tanto de transmision o reflexion sea simetrica, como por ejemplo redes periodicas de micropilares (figura 5 y 6) de la celda bio-fotonica. Estas tecnicas permitiran que se pueda incrementar la densidad de celdas sensibles para proporcionar un sistema optico de bio-deteccion capaz de hacer que la rutina y secuencia de medida de analitos se pueda adaptar a realizar cientos de medidas sobre un unico o varios analitos. El uso simultaneo de varias tecnicas de interrogacion optica en pocos segundos permitira al sistema ser capaz de ofrecer una alta cadencia de medida y productividad en comparacion con otras tecnicas de analisis alternativas, haciendo el proceso mas eficiente.

El sistema sera capaz de medir tanto bio-chips desechables para aplicaciones en las que sea necesario acercar el analisis al punto de demanda, por ejemplo: el punto de cuidado (aplicacion clmica), el punto de deteccion medioambiental (p.e. deteccion de pureza de agua, pesticidas, etc.), y en sustratos de gran tamano para aplicaciones donde la alta cadencia de medida pueda ser crucial, como por ejemplo en el desarrollo de nuevos farmacos. Asf, de una forma mas concreta, el sistema de deteccion optica para ensayos biologicos de alta sensibilidad sin marcado, objeto de la presente patente de invencion comprende:

(i) un sistema optico de medida que comprende al menos una fuente de excitacion (101) y un cabezal optico (103, 103a, 103b), y medios opticos para la deteccion (102) de una senal procedente del cabezal optico (103, 103a, 103b),

(ii) un elemento para la interrogacion de un fluido que tiene multiples analitos que comprende una pluralidad de celdas fotonicas biosensibles (201), en el que cada una de las celulas biosensibles (201) esta formada por un patron periodico de micropilares resonantes y cada celda biosensible comprende:

o un sustrato (55),

o una pluralidad de cavidades resonantes (53), estando cada cavidad definida por uno de dichos micropilares con su base apoyando sobre el sustrato de tal modo que el espacio entre micropilares reciba el fluido,

o una pluralidad de reflectores de Bragg, al menos dos por cavidad resonante (53) situados respectivamente en cada extremo del micropilar, y

o una pluralidad de receptores moleculares (54), unidos a las superficies laterales de los micropilares de modo que esten en contacto con el fluido,

en el que dicho cabezal optico esta configurado para analizar cada una de dichas celdas biosensibles y los analitos contenidos en ellas.

El cabezal optico (103) esta configurado de tal modo que permita el analisis de cada una de dichas celdas biosensibles (201) y los analitos contenidos en ellas.

En la figura 1 dicho elemento para la integracion de multiples analitos (200) es un elemento de gran tamano, mientras que en la figura 2 dicho elemento (200) es un bio-chip (20) conteniendo igualmente los elementos propios del elemento (200) en un espacio reducido.

En la figura 3 se puede observar un ejemplo de celda biosensible (201) basada, en este ejemplo, en una cavidad resonante tipo " Fabry-Perot" de interrogacion mediante la obtencion del perfil de reflexion del cual se obtiene la informacion de reflectancia resuelta en angulo y en longitud de onda, y donde la informacion elipsometrica se obtiene mediante el analisis del mismo perfil de reflexion para la obtencion de la diferencia de fase de los estados de polarizacion horizontal y vertical. La informacion de reflectancia resuelta en angulo y elipsometrica es obtenida de forma simultanea, mientras que la espectrometrica es obtenida de forma continuada. Dicha celda bio-sensible (201) comprende, al menos:

(a) una pluralidad de reflectores de Bragg (32);

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(b) una cavidad resonante (33);

(c) una pluralidad de receptores biomoleculares (34), preferentemente protemas (p.e. anticuerpos/antigenos) inmovilizados en la cavidad. El analito entra por una entrada de fluidos (35) y sale por una salida de fluidos (36); el reconocimiento molecular se produce y se detecta cuando el analito se introduce y distribuye por la cavidad (33); estando, ademas, dichos elementos (32, 33, 34) integrados sobre el sustrato (37).

En la figura 4 sobre la misma celda biosensible (201) de la figura 3 se observa como la interrogacion se produce por transmision, donde se obtiene la informacion de transmitancia resuelta en angulo y en longitud de onda, y donde la informacion elipsometrica se obtiene mediante el analisis del mismo perfil de transmision para la obtencion de la diferencia de fase de los estados de polarizacion horizontal y vertical. La informacion de transmitancia resuelta en angulo y elipsometrica es obtenida de forma simultanea, mientras que la espectrometrica es obtenida de forma continuada. En esta configuracion, el haz optico emitido por un cabezal optico transmisor (103a) conectado a la fuente de excitacion (101) es recibido por un cabezal optico receptor (103b).

En la figura 5 se muestra un modo de realizacion de la celda bio-sensible (201) basado en una red periodica de micropilares resonantes y de interrogacion vertical por reflexion, donde se obtiene la informacion de reflectancia resuelta en angulo y en longitud de onda, y donde la informacion elipsometrica se obtiene mediante el analisis del mismo perfil de reflexion para la obtencion de la diferencia de fase de los estados de polarizacion horizontal y vertical. La informacion de reflectancia resuelta en angulo y elipsometrica es obtenida de forma simultanea, mientras que la espectrometrica es obtenida de forma continuada. Dicha celda (201) comprende, al menos:

(a) una pluralidad de cavidades resonantes (53);

(b) una pluralidad de bio-receptores moleculares (p.e. anticuerpos/antfgenos) (54) adheridos a la superficie de las cavidades resonantes (53), el reconocimiento molecular se produce y se detecta cuando el analito se introduce y distribuye en la red periodica de micropilares resonantes de la celda bio-fotonica (201);

(c) una pluralidad de reflectores de Bragg (52), al menos dos por cavidad resonante (53); estando ademas dichos elementos (52, 53, 54) depositados sobre el sustrato (55).

En la figura 6 sobre la misma celda fotonica biosensible (201) de la figura 5 se observa como la interrogacion se produce por transmision, donde se obtiene la informacion de transmitancia resuelta en angulo y en longitud de onda, y donde la informacion elipsometrica se obtiene mediante el analisis del mismo perfil de transmision para la obtencion de la diferencia de fase de los estados de polarizacion horizontal y vertical. La informacion de transmitancia resuelta en angulo y elipsometrica es obtenida de forma simultanea, mientras que la espectrometrica es obtenida de forma continuada. En esta configuracion, el haz optico emitido por un cabezal optico transmisor (103a) conectado a la fuente de excitacion (101) es recibido por un cabezal optico receptor (103b).

En la figura 7 se muestra un ejemplo para hacer un sistema optico de interrogacion vertical por reflexion de celdas bio-fotonicas, valido tanto para sustratos grandes o bio-chips. El haz de luz (73) que proveniente del sistema de excitacion (101) es reflejado por un partidor de haz (75) y se enfoca en la celda biofotonica (201) mediante un cabezal optico (103) compuesto por un objetivo de alta apertura numerica (74) capaz de enfocar en dominios micro y sub-micrometricos. Debido a la alta apertura numerica del objetivo (74), la luz reflejada se puede analizar para varios angulos de incidencia, el rango de angulos de incidencia viene determinado por la propia apertura del objetivo, siendo factible analizar un rango de angulos de incidencia de ± 64° con un objetivo de apertura numerica 0,9 facilmente disponible en el mercado. La luz reflejada que proviene de la celda bio-fotonica se hace pasar por una lente (76) que se enfoca en un agujero micrometrico (77) que ejerce las funciones de filtro espacial. Los diferentes angulos de incidencia se recogen a traves de un detector matricial tipo CCD (78) de forma simultanea y que conforman el perfil de reflexion de respuesta de la celda bio-fotonica. Si la luz incidente es linealmente polarizada a 45° se pueden obtener las dos componentes correspondientes al estado de polarizacion vertical (s) y horizontal (p). Esto, por ejemplo, se puede conseguir haciendo que la luz de excitacion sea linealmente polarizada y utilizando un retardador y un analizador para la deteccion. De este perfil de reflexion se puede obtener de forma simultanea la reflectancia resuelta en angulo y en funcion del estado de polarizacion, y por ende la respuesta elipsometrica.

La figura 8 muestra un ejemplo practico para hacer de un sistema optico de interrogacion horizontal por transmision de celdas bio-fotonicas, valido tanto para sustratos grandes o bio-chips. El haz de luz (83) que proveniente del sistema de excitacion (101) se enfoca en la celda biofotonica (201) que esta alojada en un sustrato (200) transparente mediante un cabezal optico (103) compuesto por un objetivo de alta apertura numerica (84, 85) capaz de enfocar en dominios micro y sub-micrometricos. Debido a la alta apertura numerica del objetivo (84), la luz incidente se puede analizar para varios angulos de incidencia, el rango de angulos de incidencia viene determinado por la propia apertura del objetivo, siendo factible analizar por ejemplo un rango de angulos de incidencia de ± 64° con un objetivo de apertura numerica 0,9 facilmente disponible en el mercado. La luz transmitida que proviene de la celda bio-fotonica se hace pasar por una lente (86) que se enfoca en un agujero micrometrico (87) que ejerce las funciones de filtro espacial. Los diferentes angulos transmitidos se recogen a traves de un detector matricial tipo CCD (88) de forma simultanea y que conforman el perfil de transmision de respuesta de la celda bio-fotonica. Si la luz incidente es linealmente polarizada a 45° se pueden obtener las dos componentes correspondientes al estado de

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polarizacion vertical (s) y horizontal (p). Esto se conseguira mediante un simple polarizador a la salida de la fuente de luz. De este perfil de transmision se puede obtener de forma simultanea la reflectancia resuelta en angulo y en funcion del estado de polarizacion mediante la utilizacion por ejemplo de un retardador y un analizador para la deteccion, y por ende la respuesta elipsometrica.

En cuanto al posicionamiento, las celdas bio-fotonicas con bio-cavidades Fabry-Perot (figuras 3 y 4) el posicionamiento del cabezal optico sera menos cntico al ser las dimensiones en el plano de mayor tamano. Se pueden realizar marcas de alineamiento para que un sistema de reconocimiento de imagenes pueda determinar el lugar de medida, usadas convencionalmente en micro-fabricacion para localizar determinadas estructuras. Esto se realiza mediante la inclusion de determinados motivos y patrones en la cara superior de los chips. Para las celdas basadas en redes periodicas de micropilares (figuras 5 y 6) las dimensiones de enfoque son mas cnticas, pero este tipo de celdas permite ayudarse para posicionar el cabezal optico de deteccion mediante el analisis de simetna de la intensidad del perfil de reflexion.

La figura 9 representa la respuesta la respuesta teorica de deteccion mediante el analisis del perfil de reflexion por reflectancia resuelta en angulo de una celda bio-fotonica (figura 3). La celda biofotonica de la figura 3 esta formada en su conjunto por reflectores de Bragg y una cavidad por donde se introduciran los diferentes analitos. Dicha celda se comporta opticamente como un resonador tipo Fabry-Perot de deteccion bioqmmica. Se puede observar que la respuesta de reflectancia resuelta en angulo donde aparecen dos mmimos de reflexion (95) debidos a la respuesta resonante de la celda bio-fotonica, siendo la respuesta muy similar para los dos estados de polarizacion: vertical (91) y horizontal (92). La posicion angular de dichos mmimos depende fuertemente del mdice de refraccion dentro de la bio-cavidad, este mdice variara en funcion de la interaccion molecular dentro de la cavidad. La curva (93, 96) representa la respuesta fotonica de la cavidad resonante para polarizacion vertical, mientras que la curva (94, 97) representa la respuesta de la celda bio-fotonica para un porcentaje de biomoleculas reconocidas equivalentes a 0,01 unidades de mdice de refraccion (R.I.U.).

La figura 10 representa la respuesta teorica de deteccion mediante el analisis del perfil de reflexion por reflectancia resuelta en longitud de onda (espectrometna) para una celda biofotonica (figura 3). Para espectrometna aparece un mmimo de resonancia (300) de gran pendiente en torno a 810 nm, separado en mas de 50 nm del siguiente mmimo. Este mmimo se movera a mayores o menores longitudes de onda al variar el mdice efectivo de la bio-cavidad debido a la interaccion biomolecular dentro de la misma. La posicion angular de dicho mmimo depende fuertemente del mdice de refraccion dentro de la bio-cavidad, y por ende del reconocimiento molecular dentro de la cavidad. La curva 1001 representa la respuesta fotonica de la cavidad resonante, mientras que la curva 1002 representa la respuesta de la celda bio-fotonica para un porcentaje de biomoleculas reconocidas equivalentes a 0,01 unidades de mdice de refraccion (R.I.U.).

La figura 11 representa la respuesta teorica de deteccion mediante el analisis del perfil de reflexion por elipsometna. La figura muestra la diferencia de fase (1101) teorica entre las polarizaciones vertical (s) y horizontal (p) y el modulo (1102) para diferentes indices de refraccion de la cavidad, los cuales se corresponden con la concentracion de biomoleculas reconocidas. Estas curvas son una estimacion teorica de la respuesta y rango dinamico de la celda biofotonica. En torno a n = 1,33, dicha fase vana muy rapidamente en funcion del mdice de la bio-cavidad.

Para esta celda, las estimaciones calculadas demuestran que para estas estructuras el lfmite de deteccion que se puede lograr es de 10'7 unidades de mdice de refraccion (R.I.U.). En el caso de la celda bio-fotonica basada en micropilares resonantes (figuras 5 y 6), los resultados obtenidos teoricamente son semejantes, aunque este tipo de estructuras permite concentrar el campo evanescente en las superficies donde se anclaran las biomoleculas. Tambien, otras celdas bio-fotonicas pueden ser objeto de la invencion, como por ejemplo membranas de sub-micro agujeros que permitiran la concentracion del campo evanescente y flujo continuo.

La figura 12 representa un ejemplo para fabricar una celda bio-fotonica basado en una cavidad resonante tipo Fabry- Perot (figura 3 y 4) en cinco pasos de fabricacion (P1, P2, P3, P4, P5), aunque otras celdas bio-fotonicas (figuras 5, 6) pueden ser fabricadas utilizando metodos semejantes de micro-fabricacion. Para la fabricacion de esta estructura tomada como ejemplo se pueden seguir los siguientes pasos (figura 12):

- Proceso de fabricacion P1: Fabricacion de los reflectores de Bragg (32) inferiores: Los reflectores de Bragg se pueden realizar en pares de oxido (SiO2 de bajo mdice de refraccion) y nitruro de silicio (Si3N4 de alto mdice de refraccion) sobre un sustrato (128) para mejorar la respuesta. El deposito de los reflectores tiene que asegurar la uniformidad de las capas depositadas. Para este proceso se puede utilizar tecnicas ampliamente utilizadas como LPCVD (Deposicion qumica en fase vapor a baja presion, o PECVD (Deposicion qu^mica en fase vapor asistida por plasma) de uso comun en tecnologfa de micro-fabricacion. Una capa intermedia de silicio amorfo (126) se deposita despues de la fabricacion de los reflectores mediante PECVD, que sera utilizada para la fabricacion de la bio-cavidad utilizando tecnicas de fotolitograffa convencional.

- Proceso de fabricacion P2: Capa de sacrificio (129). Una vez definida el tamano de la cavidad, se puede depositar una capa de SO2 de sacrificio para posteriormente poder ser eliminada y crear una cavidad hueca. Se puede utilizar tambien PECVD.

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- Proceso de fabricacion P3: Definicion de la cavidad. Utilizando tecnicas de fotolitografia convencionales y tecnicas de ataque convencionales como por ejemplo ataque seco por plasma (dry etching) una lamina delgada de SiO2 puede ser definida solo en la cavidad. Esta capa de SiO2 sera eliminada posteriormente para crear una cavidad hueca.

- Proceso de fabricacion P4: Fabricacion de los reflectores de Bragg superiores (1210). Los reflectores de Bragg superiores se puede fabricar mediante depositos alternativos de oxido y nitruro por las mismas tecnicas anteriormente descritas.

- Proceso de fabricacion P5: Creacion de la cavidad hueca. Para la eliminacion de la capa de sacrificio de SiO2 que define la cavidad se puede utilizar ataque humedo utilizado convencionalmente.

Los accesos flrndicos de las diferentes a las celdas bio-fotonicas se pueden realizar de forma simultanea utilizando tecnicas de micro-fabricacion estandar y siguiendo procesos similares. Por ejemplo para crear los canales en la parte inferior de la oblea se puede utilizar tecnicas de ataque seco profundo tipo DRIE (Deep Reactive Ion Etching) o ataque humedo por ejemplo utilizando acido fluortudrico (HF) o hidroxido de potasio (KOH). Otras posibilidades pasan por utilizar sustratos transparentes, como obleas de vidrio, utilizacion y deposito de laminas delgadas de polfmeros y resinas como por ejemplo PDMS (Polidimetil Siloxano) o SU-8 mediante tecnicas de recubrimientos giratorios de precision tipo "spin coating' o utilizando tecnicas de procesado adecuadas en funcion del material. Los canales flrndicos a nivel de oblea tambien pueden ser procesados por ablacion laser por litograffa directa, por ejemplo procesos de ablacion mediante laser de exdmero con ancho de pulso de pico y nano-segundos, laseres de femtosegundos, por fotolitografia laser o por foto-polimerizacion, etc. Otras tecnicas de micro fabricacion como fotolitografia por haz de electrones, etc. pueden ser tambien utilizadas, aunque las estructuras de las celdas bio- fotonicas se pueden fabricar tecnicas de micro-fabricacion maduras. Dado el progreso de la tecnologfa de micronano fabricacion en los ultimos anos, existen varias posibilidades para el modo de realizacion tanto de las celdas bio-fotonicas como de los canales y accesos flrndicos de forma competitiva.

En la figura 13 se muestra una solucion esquematica tecnologicamente viable basada en las tecnicas de micro- fabricacion estandar como las que se han descrito anteriormente. En este caso se puede utilizar una capa transparente de PDMS (131), donde existe un canal flmdico de acceso (132) sobre un soporte (133) en PMMA (Poli- metil-metacrilato) donde reposa el sustrato (202) donde se alojan las celdas sensibles bio-fotonicas, en este caso formadas por una pluralidad de reflectores de Bragg (32), superiores (134) e inferiores (136) y una cavidad flrndica resonante (135) por donde se introduce el analito correspondiente. El acceso para obtener la informacion de la respuesta al reconocimiento molecular de la cavidad se realiza mediante un cabezal optico (103).

Finalmente la aplicacion biologica de deteccion estara supeditada al desarrollo de bio-ensayo concreto para la deteccion de patogenos, determinadas protemas o fragmento de ADN para deteccion de virus. Una ventaja de este sistema de bio-deteccion es que podra utilizarse con la mayona de ensayos biologicos comerciales existentes u otros por desarrollar, ya que permiten el flujo continuo y la posibilidad de introducir secuencialmente los reactivos necesarios para desarrollar la aplicacion biologica correspondiente, por tanto puede ser tambien utilizando como herramienta para el desarrollo de nuevos ensayos biologicos. Para poder llevar a cabo dicha aplicacion biologica existen ya desarrolladas tecnicas de funcionalizacion de superficies donde inmovilizar y adherir los bio-receptores moleculares ( (Label-free optical biosensing with slot-waveguides. Opt. Lett. 33, (7), pp. 708-710, 2008. doi:10.1364/OL.33.000708) que seran responsables de la selectividad del biosensor. Una vez realizado este proceso el sistema biosensor estara preparado para la deteccion final. Los analitos objetivo se introduciran por el/los canales flrndicos correspondientes y la respuesta de interaccion molecular o reconocimiento molecular sera monitorizada optimamente por el sistema optico de deteccion. Esta respuesta se amplificara debido a la respuesta fotonica de las celdas bio-sensoras (figuras 9, 10 y 11). El uso simultaneo de las tecnicas opticas propuestas (figuras 7 y 8) reducira drasticamente la incertidumbre y hara el sistema mucho mas fiable. Sistemas cognitivos orientados a usuarios y profesionales del sector correspondiente podran ser desarrollados mediante aplicaciones software que hagan que el sistema sea muy facil de utilizar.

Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. Sistema de deteccion optica para ensayos biologicos de alta sensibilidad sin marcado que comprende el uso de tecnicas de caracterizacion optica que permiten la interrogacion vertical resonante o interferometrica de dominios micrometricos y sub-micrometricos de celdas bio-fotonicas que comprende:

   (i) un sistema optico de medida que comprende al menos una fuente de excitacion (101) y un cabezal optico (103, 103a, 103b), y medios opticos para la deteccion (102) de una senal procedente del cabezal optico (103, 103a, 103b),

   (ii) un elemento para la interrogacion de un fluido que tiene multiples analitos que comprende una pluralidad de celdas biosensibles (201), en el que cada una de las celdas biosensibles (201) esta formada por un patron periodico de micropilares resonantes y cada celula biosensible comprende:

   o un sustrato (55),

   o una pluralidad de cavidades resonantes (53), estando cada cavidad definida por uno de dichos micropilares con su base apoyando sobre el sustrato de tal modo que el espacio entre micropilares reciba el fluido,

   o una pluralidad de reflectores de Bragg, al menos dos por cavidad resonante (53) situados respectivamente en cada extremo del micropilar, y

   o una pluralidad de receptores moleculares (54), unidos a las superficies laterales de los micropilares de modo que esten en contacto con el fluido,

   y donde dicho cabezal optico esta configurado para analizar cada una de dichas celdas bio-sensibles y los analitos contenidos en ellas.
2. 2. Sistema segun la reivindicacion 1 en el que el elemento para la integracion de multiples analitos comprende una pluralidad de conexiones flrndicas conectadas a las celdas.
3. 3. Sistema segun la reivindicacion 1 caracterizado porque dichas fuentes de excitacion son fuentes de tipo laser u otras fuentes coherentes o no en longitudes de onda visibles e infrarrojas.
4. 4. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque el elemento de integracion de multiples analitos es un sustrato de gran tamano tipo oblea de silicio, vidrio transparente o similar.
5. 5. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque el elemento de integracion de multiples analitos es un bio-chip desechable.
6. 6. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la interrogacion es por transmision, el cabezal optico (103) es un cabezal optico transmisor (103a) conectado a la fuente de excitacion (101) cuyo haz es recibido por un cabezal optico receptor (103b), conectado a los medios de deteccion optica (102).
7. 7. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la interrogacion es por reflexion, el cabezal optico (103) es un cabezal optico transmisor-receptor conectado a la fuente de excitacion (101) cuyo haz es recibido por reflexion por el cabezal optico (103), conectado a los medios de deteccion optica (102).