ES2564830T3 - Uso adicional de la proteína quinasa N beta - Google Patents

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ES2564830T3 ES09000014.2T ES09000014T ES2564830T3 ES 2564830 T3 ES2564830 T3 ES 2564830T3 ES 09000014 T ES09000014 T ES 09000014T ES 2564830 T3 ES2564830 T3 ES 2564830T3
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Abstract

Uso de la proteína quinasa N beta o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de proteína quinasa N beta, para la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de un tumor de etapa tardía in vivo.

Description

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DESCRIPCION
Uso adicional de la protema quinasa N beta
La presente invencion se relaciona con el uso de la protema quinasa N beta.
El desarrollo de farmacos modernos ya no se basa en un metodo mas o menos heunstico sino que normalmente implica la aclaracion del mecanismo molecular que subyace a una enfermedad o afeccion, identificacion de moleculas objetivo candidatas y evaluacion de dichas moleculas objetivo. Una vez que dicha molecula objetivo validada, la cual aqrn tambien se denomina como objetivo, se encuentra disponible, se pueden probar los candidatos de farmaco relacionados con la misma. En muchos casos dichos candidatos de farmaco son miembros de una coleccion compuesta que puede consistir de compuestos sinteticos o naturales. Tambien es comun el uso de colecciones combinatorias. Dichas colecciones de compuesto se mencionan aqrn como colecciones de compuestos candidatos. Aunque este metodo ha probado ser exitoso en el pasado, aun consume tiempo y dinero. Actualmente se aplican diferentes tecnologfas para la identificacion y validacion de objetivos.
Aun, numerosos tumores y canceres son una gran amenaza para la salud humana. Con el fin de crear farmacos mas seguros y mas poderosos que tengan menos efectos secundarios, es necesario conocer acerca de las moleculas objetivo que, luego de ser abordadas por los compuestos apropiados, se pueden influenciar espedfica y selectivamente en su actividad o presencia. Debido a la interaccion preferiblemente selectiva y espedfica entre el compuesto, que puede ser un farmaco potencial o candidato, y el objetivo, se puede influenciar la funcion del objetivo en una enfermedad o condicion de enfermedad tal como, por ejemplo, cancer, tumorogenesis y metastasis, y de esta manera se puede tratar o evitar la enfermedad y mejorar la condicion de enfermedad.
Por lo tanto, el problema que subyace a la presente invencion es proporcionar un objetivo que sea adecuado para metodos terapeuticos en el tratamiento de tumorogenesis y cancer. Es un problema adicional que subyace a la presente invencion proporcionar un objetivo que se involucre en la tumorogenesis y metastasis.
La presente invencion se define de acuerdo con las reivindicaciones proporcionadas aqrn.
El problema que subyace a la presente invencion se resuelve por el uso de la protema quinasa N beta como un objetivo en direccion 3' de la ruta de PI 3-quinasa, preferiblemente como un objetivo de farmaco en direccion 3' de la ruta de PI 3-quinasa.
De acuerdo con la presente invencion se proporciona un uso de la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion se proporciona una protema quinasa N beta o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para uso en un metodo para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
En una realizacion la protema quinasa N beta tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1.
En otro aspecto de la presente invencion se proporciona un uso de un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
En aun un aspecto adicional de la presente invencion se proporciona un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, o para un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para uso en el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
En una realizacion el acido nucleico es un acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2.
Preferiblemente, la secuencia de acidos nucleicos, pero para la degeneracion del codigo genetico, se hibridana al acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 2.
Alternativamente, la secuencia de acidos nucleicos es una secuencia nucleica que se hibrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia de acidos nucleicos o parte de la misma, de acuerdo con la SEQ ID NO. 2.
Preferiblemente, el tumor de etapa tardfa se caracteriza de tal manera que las celulas que estan involucradas en dicho tumor de etapa tardfa carecen de actividad PTEN o muestran un aumento en el comportamiento agresivo.
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En otro aspecto de la presente invencion se proporciona el uso de un acido nucleico que inhibe un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta o una parte de la misma, en donde dicha parte realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de un tumor de etapa tardfa, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
En un aspecto adicional de la invencion se proporciona el uso de un acido nucleico que inhibe la protema quinasa N beta o una parte de la misma, en donde dicha parte realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de tumor de etapa tardfa in vivo, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invencion se proporciona un acido nucleico que inhibe la protema quinasa N beta o una parte de la misma, en donde dicha parte realiza el efecto de protema quinasa N beta, para uso en un metodo para el tratamiento de un tumor de etapa tardfa, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invencion se proporciona un acido nucleico que inhibe la protema quinasa N beta o una parte de la misma, para uso en un metodo para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo, en donde el acido nucleico que interactua es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
En otro aspecto de la invencion se proporciona un metodo para la deteccion de un agente para el tratamiento de un tumor de etapa tardfa y/o para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un compuesto candidato,
b) proporcionar un sistema de expresion para la protema quinasa N beta y/o un sistema que detecta la actividad de protema quinasa N beta;
c) poner en contacto el compuesto candidato con el sistema de expresion para la protema quinasa N beta y/o el sistema que detecta actividad de protema quinasa N beta;
d) determinar si la expresion y/o la actividad de protema quinasa N beta se cambia bajo la influencia del compuesto candidato.
Preferiblemente, el compuesto candidato se puede seleccionar de peptidos, protemas, anticuerpos, anticalinos, acidos nucleicos funcionales, compuestos naturales y moleculas pequenas.
Los acidos nucleicos funcionales se pueden seleccionar de aptameros, aptazimas, ribozimas, espiegelmeros, oligonucleotidos antisentido y siARN.
En otro aspecto de la presente invencion se proporciona un metodo in vitro para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa que comprende el uso de la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta.
En un aspecto adicional de la presente invencion se proporciona un metodo in vitro para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa que comprende el uso de un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta.
Los presentes inventores han encontrado de manera sorprendente que la protema quinasa N beta, tambien denominada aqrn como PKN beta, es un objetivo valioso en relacion con el cancer y los tumores. Mas particularmente, los presentes inventores han descubierto que la protema quinasa N beta es un objetivo en direccion 3' de la ruta de PI-3 quinasa/PTEN. De manera aun mas sorprendente los presentes inventores han descubierto que la protema quinasa N beta esta ligada a la tumorogenesis y metastasis. Particularmente, el ultimo efecto parece estar fuertemente relacionado con la perdida de la funcion supresora, mas particularmente la funcion supresora del tumor PTEN. Como se mostrara en los ejemplos, la protema quinasa N beta se regulara por aumento bajo condiciones en donde no esta activo el PTEN que es un inhibidor de la ruta de PI-3 quinasa. Debido a la regulacion por aumento de la protema quinasa N beta, las celulas donde ocurre dicha regulacion por aumento, mostraran un incremento en el comportamiento metastasico y el comportamiento de migracion. Esto significa que un inhibidor de la protema quinasa N beta es un medio adecuado para controlar el comportamiento metastasico y de migracion de las celulas y este es un medio adecuado para el tratamiento de tumores y canceres, mas par aquellos tumores y canceres son metastasicos y de las celulas que muestran un comportamiento metastasico y/o de migracion que son generalmente denominadas aqrn como 'la enfermedad como se describe aqrn’ o como 'condicion de enfermedad como se describe aqrn’. La enfermedad como se describe aqrn asf como tambien la condicion de enfermedad como se describe aqrn comprende tambien tumorogenesis y metastasis. Esto aplica en particular a aquellas enfermedades como se describe aqrn y aquellas condiciones de enfermedad como se
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describe aqrn, donde las celulas involucradas en dichas enfermedades o condiciones de enfermedad son PTEN negativas lo que significa que el PTEN supresor del tumor no esta activo o tiene un nivel reducido de actividad. Las enfermedades tambien comprenden aquellas enfermedades en las cuales esta involucrada en general la ruta de PI-3 quinasa. Ademas de los tumores metastasicos en particular, la diabetes pertenece a esta clase de enfermedades y condiciones de enfermedad, respectivamente. Por lo tanto, las celulas, en particular aquellas que estan involucradas en la enfermedad o condicion de enfermedad como se describe aqrn y que son PTEN negativas, son susceptibles al tratamiento mediante un farmaco, con un modo de accion tal que reduce o elimina la actividad de la protema quinasa N beta en las respectivas celulas involucradas. De acuerdo con esto, los pacientes cuyos tumores se caracterizan por una ruta de PI-3 quinasa preferiblemente hiperactivada, que incluye pero que no se limita a, cualquier amplificacion o mutacion de componentes que codifican genes de la ruta de Pl-3 quinasa (p110, Akt) o son PTEN negativos o que tienen celulas que son PTEN negativas, particularmente si estas celulas estan involucradas en la enfermedad tal como se describe aqrn o en la condicion de enfermedad como se describe aqrn, se pueden tratar de manera ventajosa utilizando dichos farmacos. Dicha reduccion en la actividad puede provenir de una reduccion a nivel de trascripcion o a nivel de traduccion, es decir, la actividad enzimatica de la protema quinasa N beta. Sin desear estar limitado por ninguna teona, el ultimo aspecto, es decir, modificar la actividad de la protema quinasa N beta es tambien un resultado de una percepcion de los inventores en relacion con las caractensticas del PKNbeta, es decir que la actividad enzimatica del PKNbeta tambien se puede regular por aumento y descenso, mas preferiblemente regular por descenso.
Un grupo adicional de pacientes que se pueden tratar de manera ventajosa utilizando dichos farmacos son aquellos que sufren de canceres que tienen una alta incidencia por la perdida de la funcion PTEN, especialmente en tumores de etapa tardfa (Cantley, L. C. and Neel, B. G. (1999). New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4240-4245; Ali, 1. U. (2000). Gatekeeper for endometriurn: the PTEN tumor suppressor gene. J Natl Cancer Inst 92, 861-863). La perdida de PTEN se correlaciona con un comportamiento agresivo e invasivo creciente de las respectivas celulas tumorales. En razon de esto, en las realizaciones preferidas de la presente invencion aquellos agentes de diagnostico que tambien se pueden utilizar como herramientas o medios analfticos en relacion con los diversos aspectos de la presente invencion, y agentes terapeuticos, respectivamente, dirigidos a la protema quinasa N beta o a los acidos nucleicos que codifican para esta, se pueden utilizar para cualquier tumor de etapa tardfa siempre y cuando se cumpla el prerrequisito anteriormente mencionado, es decir, que el PTEN se correlacione con un comportamiento agresivo e invasivo creciente.
Esta clase de farmaco se puede disenar, filtrar o elaborar sobre la base de la descripcion dada aqrn, a saber, que la protema quinasa N beta es un objetivo de farmaco en direccion 3' y que la protema quinasa N beta es un objetivo para la tumorogenesis y metastasis y enfermedades relacionadas con la misma o que surgen de esta.
En razon del involucramiento de la protema quinasa N beta en los mecanismos destacados anteriormente, esta tambien se puede utilizar como un marcador para diagnosticar el estado de una celula o paciente que tiene en su cuerpo dichas clases de celulas si estas sufren de metastasis y tumorogenesis, respectivamente. Como un ejemplo de que esta clase de metodo funciona y es aplicable para ese proposito esta, por ejemplo, el ICAM-1. El ICAM-1 se utiliza en el pronostico de canceres gastricos que sufren de metastasis (Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, Shimamura H, Yamada T, Tanaka N, OritaK., Int. J Cancer. 2002 Ago 1; 100(4):486-490) donde se encontraron como elevados los niveles de s-ICAM-1 en pacientes con metastasis en el hngado. En otro ejemplo, se utiliza osteopontina como un marcador de pronostico para el cancer de mama (Rudland PS, Platt-Higgins A, El-Tanami M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howitt R, West CR. Cancer Res. 2002 Jun 15; 62(12):3417-3427). Hasta ahora la presencia o el nivel de presencia (protema o mARN) o el nivel de actividad de la protema quinasa N beta se puede utilizar como marcador y cualquier compuesto que interactue mas o menos espedficamente con protema quinasa N beta sera, por lo tanto, un agente de diagnostico apropiado.
Se describiran en lo que sigue metodos y diseno principales para farmacos y agentes de diagnostico que en cualquier caso interactuan espedficamente y/o selectivamente con la protema quinasa N beta.
A la luz de estos hallazgos, la quinasa N beta prueba ser un objetivo de farmaco en direccion 3' adecuado que permite la modulacion selectiva de solo algunos aspectos que estan normalmente relacionados con la ruta de PI-3 quinasa, a saber metastasis y migracion, y un metodo de diagnostico selectivo y espedfico, es decir, deteccion, de procesos normalmente relacionados con la ruta de PI-3 quinasa, mas particularmente metastasis y migracion.
La ruta de PI-3 quinasa se caracteriza por una actividad de PI-3 quinasa luego de la induccion del factor de crecimiento y una ruta de senalizacion paralela. La estimulacion del factor de crecimiento de las celulas conduce a la activacion de sus receptores afines en la membrana celular que a su vez se asocian y activan las moleculas de senalizacion intracelular tales como la PI 3-quinasa. La activacion de PI 3-quinasa (que consiste de una subunidad p85 reguladora y una p110 catalftica) da como resultado la activacion de Akt mediante la fosforilacion, soportando de esta manera respuestas celulares tales como proliferacion, supervivencia o migracion adicional en direccion 3'. El PTEN es asf un supresor de tumores que esta involucrado en la ruta de la fosfatidilinositol (PI) 3- quinasa y que se ha estudiado extensamente en el pasado por su papel para regular el crecimiento y transformacion celular (para revistas, vease, Stein, R. C. and Waterfield, M. D. (2000). PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today 6, 347357; Vazquez, F. and Sellers, W. R. (2000). The PTEN tumor suppressor protein: an antagonist of phosphoinositide 3-
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kinase signaling. Biochim Biophys Acta 1470, M21-35; Roymans, D. and Slegers, H. (2001). Phosphatidylinositol 3- kinases in tumor progression. Eur J Biochem 268, 487-498). El PTEN supresor de tumores funciona como un regulador negativo de la PI 3-quinasa al invertir la reaccion catalizada de PI 3-quinasa y asegurar de esta manera que la activacion de la ruta ocurra de una manera transitoria y controlada. La hiperactivacion cronica de la senalizacion de PI 3- quinasa es causada por la inactivacion funcional del PTEN. La actividad de PI 3-quinasa se puede bloquear mediante la adicion del inhibidor de molecula pequena LY294002. La actividad y respuestas en direccion 3' de la quinasa de senalizacion MEK que actuaa en una ruta paralela, puede por ejemplo, ser inhibida por el inhibidor de molecula pequena PD98059.
Una activacion cronica de la ruta de PI 3-quinasa a traves de la perdida de funcion PTEN es un contribuyente principal a la tumorogenesis y metastasis que indica que este supresor de tumores representa un control importante para una proliferacion de celula controlada. Las celulas modificadas PTEN muestran caractensticas similares a las celulas en las cuales se ha inducido de manera cronica la ruta de PI 3-quinasa por via de las formas activadas de la PI 3-quinasa (Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C., and Pandolfi, P. P. (1998). El PTEN es esencial para el desarrollo embrionario y supresion de tumores. Nat Genet 19, 348-355. Klippel, A., Escobedo, M. A., Wachowicz,, M. S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W. M. y Williams, L. T. (1998). La activacion de fosfatidilinositol 3-quinasa es suficiente para la entrada de ciclo celular y promueve los cambios celulares caractensticos de la transformacion oncogenica. Mol Cell Biol 18, 5699-5711. Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S. and Fukui, Y. (1999). Dedifferentiation de adenocarcinomas by activation de phosphatidylinositol 3-kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4874-4879).
El PTEN esta involucrado en varias rutas las cuales que tambien se denominan rutas relacionadas con PTEN tales como la ruta PI3K/PTEN, la ruta Akt, el bucle autocrino relacionado con EGF y la ruta mTOR. Una ruta de PI 3-quinasa es realmente cualquier ruta que involucra la PI 3-quinasa, directa o indirectamente. La PI 3- quinasa puede actuar como un inhibidor o como un activador en tal ruta, o esta puede como tal ser regulada por otros elementos de la ruta.
Hay una cantidad de enfermedades y afecciones que describe la tecnica anterior que involucran la ruta de PI 3- quinasa. Por razones de ilustracion pero no de limitacion, esta es referida a lo siguiente: cancer del endometrio, carcinomas colorectales, gliomas, canceres del endometrio, adenocarcinomas, hiperplasias endometriales, smdrome de Cowden, carcinoma colorrectal hereditario sin poliposis, smdrome de Li-Fraumene, cancer de mama-ovarios, cancer de prostata (Ali, I. U., Journal of the Nacional Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, 7 Junio 2000, pagina 861-863), smdrome de Bannayan-Zonana, LDD (smdrome de Lhermitte-Duklos) (Macleod, K., supra) enfermedades de harmatoma- macrocefalia que incluyen la enfermedad de Cow (CD) y smdrome de Bannayan-Ruvalcaba- Rily (BRR), lesiones mucocutaneas (por ejemplo, triquilemonas), macrocefalia, retardo mental, harmatomas gastrointestinales, lipomas, adenomas de tiroides, enfermedad fibroqrnstica de mama, gangliocitoma displasico del cerebelo, y enfermedades malignas de mama y tiroides (Vazquez, F., Sellers, W. R., supra)
En vista de esto, la protema quinasa N beta es un objetivo valioso de farmaco en direccion 3' de la ruta de PI 3-quinasa N beta que se puede dirigir a farmacos que tendran menos efectos colaterales que otros farmacos dirigidos a objetivos en direccion 5' de la protema quinasa N beta. Hasta ahora la presente invencion suministra un objetivo de farmaco que es adecuado para el diseno, filtracion, desarrollo y elaboracion de compuestos farmaceuticamente activos que son mas selectivos que aquellos conocidos en la tecnica, tal como, por ejemplo, LY 29402. Al tener control sobre esta fraccion particular de las moleculas efectoras, es decir, la protema quinasa N beta y cualquier molecula en direccion 3' adicional involucrada en la ruta, solo un numero muy limitado de ramas paralelas de la misma u objetivos en direccion 5' adicionales en la cascada de senalizacion son probable que originen efectos no deseados. Por lo tanto, no estaran influenciadas las otras actividades de ruta de la PI-3 quinasa/PTEN relacionada con el ciclo celular, reparacion de ADN, apoptosis, transporte de glucosa, traduccion. Tambien, la senalizacion de la insulina no es inducida lo que significa que de hecho se evitan las respuestas diabeticas u otros efectos colaterales observados en relacion con el uso de LY294002. La LY294002 (2-(4-morfolinil)8-fenilcromona) es uno de varios inhibidores de molecula pequena derivados de varias cromonas desarrolladas por Lilly Research Laboratories (Indianapolis) como un inhibidor para PI-3K (Vlahos et al. 1994, JBC 269, 5241-5248). Este se dirige a su subunidad catalftica de la molecula de PI- 3K, p110 y funciona al competir con la union de ADP en el centro catalftico. Sin embargo, la LY294002 no puede distinguir entre diferentes isoformas de p110 (alfa, beta, delta) que se sugieren por tener diferentes funciones celulares.
La protema quinasa N beta esta tambien ademas en direccion 3' del mTOR que esta dirigido por la rapamicina. El mTOR (Objetivo mairnfero de la Rapamicina), tambien conocido como Raft o FRAP, actua en direccion 3' de PI 3- quinasa para regular procesos tales como la entrada dependiente de quinasa pp70 S6 en el ciclo celular. El mTOR actua como un sensor para el factor de crecimiento y la disponibilidad de nutrientes para controlar la traduccion a traves de activar el pp70 S6 quinasa y el factor de iniciacion 4E. La funcion del mTOR se inhibe por la rapamicina de macrolido bacteriano que bloquea el crecimiento de las celulas T y de ciertas celulas tumorales (Kuruvilla and Schreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136).
El hecho de que la rapamicina y sus derivados sean farmacos adecuados que se utilizan actualmente en clmicas prueba que un objetivo de farmaco es el de mas ayuda y tiene menos efectos colaterales, entre mas espedfico sea para un
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mecanismo molecular particular como, por ejemplo, se demuestra por Yu et al. (Yu, K. et al (2001) Endrocrine- RelatCanc 8,249).
La protema quinasa N beta es un miembro de la familia de la protema quinasa C todas las cuales se dice que son protema-serina/treonina quinasas. Normalmente, esta clase de protema quinasa comprende una subunidad reguladora y una catalftica y utiliza iones de calcio y fosfolfpidos como cofactores. Los diacil gliceroles actuan como un activador de esta clase de la familia de la protema quinasa. Los miembros de la familia de la protema quinasa C estan involucrados en diversas rutas de senalizacion ligadas a hormonas o neurotransmisores. Estas protemas quinasas regulan la actividad de sus protemas objetivo mediante fosforilacion. Se conoce en la tecnica que la activacion continua no fisiologica de la protema quinasa C da como resultado un fenotipo celular transformado que podna conducir a la generacion de cancer.
La secuencia completa de la protema quinasa N beta como mARN esta disponible en bancos de datos, por ejemplo, bajo los numeros de acceso gi 7019488 o NM-013355. Utilizando el codigo genetico, la secuencia de aminoacidos particular se puede deducir de este mARN. Tambien, la secuencia de aminoacidos de la protema quinasa N Beta esta disponible en los bancos de datos bajo numero de acceso gi 7019489 o NP_037487.1. La extension de la derivacion y truncamiento se pueden determinar asf por un experto en la tecnica mediante analisis de rutina. Cuando este llega a secuencias de acidos nucleicos, aquellas secuencias de acidos nucleicos tambien estan comprendidas por el termino secuencias de acidos nucleicos que codifican la protema quinasa N beta que son hibridizantes para el acido nucleico especificado por los numeros de acceso anteriormente mencionados o cualquier secuencia de acidos nucleicos que se puede derivar de las secuencias de aminoacidos anteriormente mencionadas. Dicha hibridacion es conocida por un experto en la tecnica. Las particularidades de dicha hibridacion se pueden tomar de Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory. En una realizacion preferida, la hibridacion es una hibridacion bajo condiciones estrictas. Ademas, un acido nucleico que codifica para una protema quinasa N beta es tambien una secuencia de acidos nucleicos que es homologa a cualquiera de las secuencias de acidos nucleicos anteriormente mencionadas, por medio de las cuales el grado de homologfa preferiblemente es 75, 80, 85, 90 o 95%. Las referencias adicionales relacionadas con la protema quinasa N beta son, entre otras, Shibata H. et al., J. Biochem. (Tokyo) 2001 Jul; 130 (1): 23 - 31; Dong, LQ, Proc Natl Akad Scie USA, 2000, May 09; 97 (10): 5089 - 5094; and Oishi, K., Biochem Biophys Res Cornmun. 1999, Aug. 1 1 ; 261 (3) : 808 - 814.
Se pueden encontrar homologos a una protema quinasa N beta humana, entre otros, en M. musculus, R. norvegicus, A. thaliana, C. elegans, D. melanogaster y S. cerevisiae. El porcentaje de identidad y la longitud de la region alineada es de 67% y 279 aminoacidos, 51% y 866 aminoacidos, 38% y 305 aminoacidos, 36% y 861 aminoacidos, 63% y 296 aminoacidos y 44% y 362 aminoacidos, respectivamente, para las diversas especies mencionadas anteriormente. Se debe reconocer por aquellos expertos en la tecnica que cualquiera de estos u otros homologos seran en principio adecuados para la practica de la presente invencion a menos que el farmaco o el agente de diagnostico generado que utiliza dicho homologo pueda interactuar aun con la protema quinasa N beta humana o cualquier protema quinasa N beta pretendida.
La secuencia de aminoacidos humanos tambien se puede tomar del ProtEST, numero de acceso pir: JC7083 donde la respectiva protema quinasa N beta se denomina como la protema quinasa JC7083. El gen para la protema quinasa N beta humana se ubica en el cromosoma humano numero 9. Las fuentes de cADN para la protema quinasa N beta son en general un numero de canceres y diversos tejidos fetales o embrionicos, mas particularmente, entre otros, del estomago, adenocarcinoma, cerebro, mama, linfoma de Burkitt, linfoma, cuello del utero, condrosarcoma, colon, ojos fetales, cristalinos fetales, segmento anterior de ojo fetal, nervio optico fetal, retina fetal, fovea de la retina fetal, coroide fetal macular fetal, fibroteoma, estirpe germinal, cabeza cuello, corazon, rinon, carcinoma de celulas grandes, leiomiosarcoma condrosarcoma metastasico, ovarios, paratiroides, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de celulas pequenas, carcinoma de celulas epidermoides, testfculos, y utero. De esta lista es obvio que el farmaco que tambien se denomina aqrn como medicamento, y el agente de diagnostico, que incluye un agente de etapas, es decir, un agente que puede ser utilizado para diferenciar el estado de un paciente con relacion al estado de una enfermedad de la cual podna sufrir, asf como tambien para vigilar la efectividad de un tratamiento aplicado a un paciente, respectivamente, a ser disenado, filtrado o elaborado de acuerdo con la ensenanza tecnica dada aqrn puede adicionalmente a cualquiera de las otras enfermedades como se describe aqrn y las condiciones de enfermedad tal como se describe aqrn ser utilizado tambien para el tratamiento, prevencion, diagnostico, pronostico y vigilancia de estas enfermedades o de cualquier enfermedad que involucre las celulas, tejidos u organos espedficos. Estas enfermedades y condiciones de enfermedad tambien deben estar comprendidas por el termino “enfermedad como se describe aqrn”.
En vista de los sorprendentes hallazgos descritos aqrn, la protema quinasa N beta como tal se puede utilizar como un medicamento para la prevencion y/o tratamiento de las diversas enfermedades y condiciones de enfermedad como se describe aqrn, y para la fabricacion de un medicamento para dicho proposito y para la fabricacion de un agente de diagnostico.
En el caso de la protema quinasa N beta o un fragmento o derivado de la misma como se definio anteriormente se utiliza como un medicamento en sf mismo, se utiliza preferiblemente como un competidor a la protema quinasa N beta
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de ocurrencia natural y evitando asf la funcion biologica normal de la misma. Se prefiere particularmente que la protema quinasa N beta utilizada para ese proposito sea cataltticamente defectuosa. Esta clase de protema quinasa N beta se puede aplicar al organismo y celula, respectivamente, o se puede introducir en el organismo y celulas respectivas por medio de terapia genica.
Aparte de ser un farmaco potencial en s^ mismo, la protema quinasa N beta se puede utilizar como el compuesto contra el cual se dirigen los compuestos qmmicos que se pueden utilizar como farmacos o candidatos de farmaco o como agentes de diagnostico. Estos compuestos qmmicos pertenecen a diferentes clases de compuestos tales como anticuerpos, peptidos, anticalinos, aptameros, espiegelmeros, ribozimas, oligonucleotidos antisentido y siARN asf como tambien moleculas pequenas. Los compuestos se disenan, seleccionan, filtran, generan y/o elaboran al utilizar la protema quinasa N beta en sf misma como un entidad ffsica o qmmica, o informacion relacionada con la protema quinasa N beta. En el proceso de diseno, seleccion, filtracion, generacion y/o fabricacion de dichas clases de compuestos, la protema quinasa N beta tambien se denominara como un objetivo que se utiliza en el proceso en lugar de la aplicacion final del compuesto respectivo a un paciente en necesidad del mismo. En los procesos que suministran las diversas clases de compuestos, se pueden utilizar la protema quinasa N beta, tambien denominada aqm como protema quinasa N beta o un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta. El termino protema quinasa N beta como se utiliza aqm comprende cualquier fragmento o derivado de protema quinasa N beta que permite el diseno, seleccion, filtracion, generacion y/o fabricacion de dichas clases de compuestos de la(s) clase(s) respectiva(s) de compuestos que a su vez son/estan despues de su aplicacion como un medicamento o como un agente de diagnostico activos como tal. El termino acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta como se utiliza aqm comprendera cualquier acido nucleico que contenga un acido nucleico que codifique la protema quinasa N beta como se definio anteriormente, o una parte de la misma. Una parte de un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta es considerado como tal siempre y cuando este sea aun adecuado para el diseno, seleccion, filtracion, generacion y/o fabricacion de dichas clases de compuestos que a su vez son/estan luego de su aplicacion como un medicamento o como un agente de diagnostico activos como tal. El acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta puede ser un acido nucleico genomico, hnARN, mARN, cADN, o parte de cada uno de ellos.
Se pueden utilizar otros medios o compuestos con el fin de crear o suprimir los efectos que surjan de la protema quinasa N beta o de la protema quinasa N beta que codifica el acido nucleico. Dichos medios se pueden determinar o seleccionar en un metodo de filtracion. En dicho metodo de filtracion una primera etapa es suministrar uno o varios de los asf llamados compuestos candidatos. Los compuestos candidatos como se utilizan aqm son compuestos cuya idoneidad debe ser ensayada en un sistema de ensayo para tratar o aliviar las diversas enfermedades como se describieron aqm y las condiciones de enfermedad como se describieron aqm o ser utilizadas como un medio o agente de diagnostico para esta clase de enfermedades y condiciones de enfermedad. Si un compuesto candidato muestra un efecto respectivo en un sistema de ensayo dicho compuesto candidato es un medio o agente adecuado para el tratamiento de dichas enfermedades y condiciones de enfermedad y, en principio, tambien un agente de diagnostico adecuado para dichas enfermedades y condiciones de enfermedad. En una segunda etapa, el compuesto candidato se pone en contacto con un sistema de expresion de protema quinasa N beta o un producto genico de la protema quinasa N beta, preferiblemente un producto de expresion genico, tal como el hnARN o mARN, o un sistema de actividad de protema quinasa N beta o una protema quinasa N beta. El sistema de actividad de protema quinasa N beta tambien se denomina aqm como y/o tambien es preferiblemente activo en el significado de un sistema que detecta la actividad de la protema quinasa N beta.
Un sistema de expresion de la protema quinasa N beta es basicamente un sistema de expresion que muestra o despliega la expresion de protema quinasa N beta, por medio del cual basicamente se puede cambiar la extension o nivel de expresion. Preferiblemente, el sistema de actividad de protema quinasa N beta es esencialmente un sistema de expresion por medio del cual la actividad o condicion de actividad se mide en lugar de la expresion de protema quinasa N beta. Alternativamente, un sistema de actividad de quinasa de protema es una protema quinasa N beta cuya actividad se puede medir o un sistema que suministra o comprende la protema quinasa N beta. En cualquiera de estos sistemas se ensaya si bajo la influencia de un compuesto candidato la actividad de protema quinasa N beta o del acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta es diferente de la situacion sin el compuesto candidato. Sin importancia el sistema particular es un sistema de expresion o un sistema de actividad, esta dentro del alcance de la presente invencion que un incremento o disminucion de la actividad y expresion, respectivamente, pueda ocurrir y ser medidos. Normalmente, el sistema de expresion y/o el sistema de actividad es una reaccion in vitro, tal como un extracto celular o un fragmento del extracto celular tal como un extracto de nucleo. Un sistema de expresion de protema quinasa N beta como se utiliza aqm tambien puede ser una celula, preferiblemente una celula o un tejido u organo involucrado en las enfermedades como se describieron aqm y las condiciones de enfermedad como se describen aqm.
Si existe un incremento o disminucion en el sistema de actividad o en el sistema de expresion se puede determinar en cada nivel de la expresion, por ejemplo al medir el incremento o disminucion de la cantidad de acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, mas particularmente el mARN o el incremento o disminucion de la protema quinasa N beta expresada bajo la influencia del compuesto candidato. Las tecnicas requeridas para la medicion, mas particularmente la medicion cuantitativa de esta clase de cambios, tales como para el mARN o la protema son conocidas por el experto en la tecnica. Tambien se conocen por el experto en la tecnica los metodos para determinar la cantidad o contenido de la protema quinasa N beta, por ejemplo, mediante el uso de los anticuerpos apropiados. Los
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anticuerpos se pueden generar como se conoce por un experto en la tecnica y se describe, por ejemplo, en Harlow, E., y Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
En el caso de un sistema de expresion de protema quinasa N beta se puede determinar un incremento o disminucion de la actividad de la protema quinasa N beta, preferiblemente en un ensayo funcional.
Poner en contacto el compuesto candidato y el sistema de expresion y el sistema de actividad, respectivamente, normalmente se realiza al agregar una solucion acuosa del compuesto candidato a un sistema de reaccion respectivo que se denomina generalmente aqrn como sistema de ensayo. Ademas de las soluciones acuosas tambien se pueden utilizar suspensiones o soluciones del compuesto candidato en solventes organicos. La solucion acuosa preferiblemente es una solucion reguladora.
Preferiblemente, en cada serie que utiliza el sistema de expresion y el sistema de actividad, respectivamente, solamente se utiliza un compuesto candidato unico. Sin embargo, esta dentro de la presente invencion que diversas de estas clases de ensayo se efectuan en paralelo en un sistema de alto rendimiento.
Una etapa adicional en el metodo de acuerdo con la presente invencion reside en determinar si bajo la influencia del compuesto candidato se cambia la expresion o actividad del sistema de expresion y el sistema de actividad, respectivamente, con relacion a la protema quinasa N beta o el acido nucleico que la codifica. Normalmente esto se realiza al comparar la reaccion del sistema luego de la adicion del compuesto candidato con relacion a aquel sin la adicion del compuesto candidato. Preferiblemente, el compuesto candidato es un miembro de una coleccion de compuestos. Basicamente cualquier coleccion de compuestos es adecuada para el proposito de esta invencion sin importar la clase de compuestos. Las colecciones de compuestos adecuadas, entre otras, son las colecciones compuestas de moleculas pequenas, de peptidos, protemas, anticuerpos, anticalinos y acidos nucleicos funcionales. Estos ultimos compuestos se pueden generar como lo sabe el experto en la tecnica y como se subraya aqrn.
La fabricacion de un anticuerpo espedfico para la protema quinasa N beta o para el acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, es conocido por el experto en la tecnica y, por ejemplo, se describe en Harlow, E., y Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferiblemente, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales en relacion con la presente invencion que se pueden fabricar de acuerdo con el protocolo de Cesar y Milstein y los desarrollos adicionales basados en el mismo. Los anticuerpos como se utilizan aqrn, incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos o derivados tales como fragmentos Fab, fragmentos Fc, y anticuerpos de cadena unica, en tanto que sean adecuados y capaces de unirse a la protema quinasa N beta. Aparte de los anticuerpos monoclonales tambien se pueden utilizar y/o generar anticuerpos policlonales. La generacion de anticuerpos policlonales tambien es conocida por el experto en la tecnica y, por ejemplo, se describe en Harlow, E., y lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferiblemente, los anticuerpos utilizados para los propositos terapeuticos son anticuerpos humanizados o humanos como se definio anteriormente.
Los anticuerpos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invencion pueden tener uno o varios marcadores o etiquetas. Dichos marcadores o etiquetas pueden ser utiles para detectar el anticuerpo en su aplicacion diagnostica o en su aplicacion terapeutica. Preferiblemente, los marcadores y las etiquetas se seleccionan del grupo que comprende avidina, estreptavidina, biotina, oro y fluorescema y se utiliza, por ejemplo, en metodos de ELISA. Estos marcadores y marcadores adicionales asf como tambien los metodos, por ejemplo, se describen en Harlow, E., y Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
Tambien esta dentro de la presente invencion que la etiqueta o marcador exhiba una funcion adicional aparte de la deteccion, tal como la interaccion con otras moleculas. Dicha interaccion puede ser, por ejemplo, interaccion espedfica con otros compuestos. Estos otros compuestos pueden ser aquellos inherentes al sistema donde el anticuerpo se utiliza tal como el cuerpo humano o animal o la muestra que se analiza al utilizar el respectivo anticuerpo. Los marcadores apropiados, por ejemplo, pueden ser biotina o fluorescema con los companeros de interaccion espedficos de los mismos tales como avidina y estreptavidina y los similares, que estan presentes en el respectivo compuesto o estructura para interactuar con los anticuerpos asf marcados o etiquetados.
Una clase adicional de medicamentos asf como tambien agentes de diagnostico que se pueden generar utilizando la protema de la protema quinasa N beta o el acido nucleico que codifica la protema quinasa beta, son peptidos que se unen a la misma. Se pueden generar dichos peptidos al utilizar metodos de acuerdo con el estado en la tecnica tal como exhibicion de fagos. Basicamente, se genera una coleccion de peptidos, tal como en forma de fagos, y esta clase de colecciones se pone en contacto con la molecula objetivo, en el presente caso, por ejemplo, la protema quinasa N beta. Aquellos peptidos que se unen a la molecula objetivo posteriormente se retiran, preferiblemente como un complejo con la molecula objetivo, de la respectiva reaccion. Un experto en la tecnica sabe que las caractensticas de union, por lo menos en una cierta proporcion, dependen de la configuracion experimental particularmente efectuada tal como la concentracion de sal y similares. Despues de separar aquellos peptidos que se unen a la molecula objetivo con una mayor afinidad o una fuerza mas grande, de los miembros no ligantes de la coleccion, y opcionalmente tambien despues de la eliminacion de la molecula objetivo del complejo de la molecula objetivo y el peptido, se puede(n)
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caracterizar posteriormente el (los) peptido(s) respectivo(s). Antes de la caracterizacion opcionalmente se efectua una etapa de amplificacion tal como, por ejemplo, al propagar los fagos que codifican el peptido. La caracterizacion comprende preferiblemente la secuenciacion de los peptidos de union objetivo. Basicamente, los peptidos no se limitan en sus longitudes, sin embargo, preferiblemente los peptidos que tienen longitudes desde aproximadamente 8 hasta 20 aminoacidos se obtienen preferiblemente en los respectivos metodos. El tamano de las colecciones puede ser
O 1 x q 1 c* 1
aproximadamente 10 a 10 , preferiblemente 10 a 10 diferentes peptidos, sin embargo, no se limitan a estos.
Una forma particular de polipeptidos que se unen a un objetivo son los asf llamados “anticalinos” que, entre otros, se describen en la solicitud de patente Alemana DE 197 42 706.
La protema de la protema quinasa N beta asf como tambien el acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta se puede utilizar como el objetivo para la fabricacion o desarrollo de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades descritas aqm y de las condiciones de enfermedad descritas aqm, asf como tambien para la fabricacion y/o desarrollo de medios para el diagnostico de dichas enfermedades y dichas condiciones, en un proceso de filtracion, por medio del cual en el proceso de filtracion se utilizan moleculas pequenas o colecciones de moleculas pequenas. Esta filtracion comprende la etapa de poner en contacto la molecula objetivo con una molecula pequena unica o una variedad de moleculas pequenas al mismo tiempo o posteriormente, preferiblemente aquellas provenientes de la coleccion como se especifico anteriormente, e identificar aquellas moleculas pequenas o miembros de la coleccion que se unen a las moleculas objetivo las cuales, si se filtran en relacion con otras moleculas pequenas se pueden separar de las moleculas pequenas no ligantes o no interactuantes. Se puede reconocer que la union y no union pueden estar fuertemente influenciadas por la configuracion experimental particular. Para modificar la exigencia de los parametros de reaccion es posible variar el grado de union y no union que permite la sintoma fina de este proceso de filtracion. Preferiblemente, despues de la identificacion de una o varias moleculas pequenas que interactuan espedficamente con la molecula objetivo, se puede caracterizar adicionalmente esta molecula pequena. Esta caracterizacion adicional puede, por ejemplo, residir en la identificacion de la molecula pequena y la determinacion de su estructura molecular y caractensticas ffsicas, qmmicas, biologicas y/o medicas adicionales. Preferiblemente, los compuestos naturales tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a 1000 Da. Tambien, preferiblemente, las moleculas pequenas son aquellas que cumplen con las reglas de Lepinsky de cinco conocidas por aquellos expertos en la tecnica. Alternativamente, las moleculas pequenas tambien se pueden definir de tal manera que sean moleculas pequenas sinteticas, que surgen preferiblemente de la qmmica combinatoria, en contraste con los productos naturales que preferiblemente no son sinteticos. Sin embargo, se debe notar que estas definiciones son solo subsidiarias del entendimiento general de los respectivos terminos en la tecnica.
Tambien esta dentro de la presente invencion utilizar la protema quinasa N beta y/o un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta como una molecula objetivo para la fabricacion o seleccion de aptameros y espiegelmeros que luego se pueden utilizar directamente o indirectamente como medicamentos o agentes de diagnostico.
Los aptameros son acidos nucleicos D que son de cadena sencilla o doble y que interactuan espedficamente con una molecula objetivo. La fabricacion o seleccion de aptameros, por ejemplo, se describe en la patente Europea EP 0 533 838. Basicamente se efectuan las siguientes etapas. Primero, se suministra una mezcla de los acidos nucleicos, es decir, los aptameros potenciales, por medio de los cuales cada acido nucleico comprende normalmente un segmento de diversos, preferiblemente por lo menos ocho nucleotidos posteriormente aleatorizados. La mezcla posteriormente se pone en contacto con la molecula objetivo por medio de la cual el(los) acido(s) nucleico(s) se une(n) a la molecula objetivo, tal como la basada en una afinidad creciente hacia el objetivo o con una mayor fuerza a esta, en comparacion con la mezcla candidata. El(los) acido(s) nucleico(s) de union se separa/n posteriormente del resto de la mezcla. Opcionalmente, el(los) acido(s) nucleico(s) asf obtenido(s) se amplifican utilizando, por ejemplo, reaccion de cadena de polimerasa. Estas etapas se pueden repetir varias veces dando al final una mezcla que tiene una relacion creciente de acidos nucleicos que se unen espedficamente al objetivo del cual luego se selecciona opcionalmente el acido nucleico de union final. Estos acidos nucleicos de union espedfica son denominados aptameros. Es obvio que en cualquier etapa del metodo para la generacion o identificacion de las muestras de aptameros de la mezcla de acidos nucleicos individuales se puede tomar para determinar la secuencia de las mismas que utilizan tecnicas estandar. Esta dentro de la presente invencion que los aptameros se puedan estabilizar, tal como, por ejemplo, al introducir los grupos qmmicos definidos que son conocidos por aquellos expertos en la tecnica para generar aptameros. Dicha modificacion puede por ejemplo residir en la introduccion de un grupo amino en la posicion 2' de la porcion de azucar de los nucleotidos. Los aptameros se utilizan actualmente como agentes terapeuticos. Sin embargo, esta dentro de la presente invencion que los aptameros asf seleccionados o generados se puedan utilizar para la validacion de objetivos y/o como una sustancia ffder para el desarrollo de medicamentos, preferiblemente de medicamentos a base de moleculas pequenas. Esto de hecho se hace mediante un ensayo de competicion por medio del cual la interaccion espedfica entre la molecula objetivo y el aptamero se inhibe por un farmaco candidato por lo cual luego del reemplazo del aptamero del complejo de objetivo y aptamero se puede asumir que el respectivo candidato a farmaco permite una inhibicion espedfica de la interaccion entre el objetivo y el aptamero, y si la interaccion es espedfica, dicho farmaco candidato, por lo menos en principio, sera adecuado para bloquear el objetivo y asf disminuir su disponibilidad o actividad biologica en un sistema respectivo que comprenda dicho objetivo. La molecula pequena asf obtenida puede entonces estar sujeta a una derivacion y modificacion adicional para optimizar sus caractensticas ffsicas, qmmicas, biologicas y/o medicas tales como toxicidad, especificidad, biodegradabilidad y biodisponibilidad.
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La generacion o fabricacion de espiegelmeros que se pueden utilizar o generar de acuerdo con la presente invencion que utilizan la protema quinasa N beta o un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, se basa en un principio similar. La fabricacion de los espiegelmeros se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/08856. Los espiegelmeros son acidos nucleicos L, lo que significa que estan compuestos de L-nucleotidos en lugar de aptameros que estan compuestos de D-nucleotidos como lo estan los aptameros. Los espiegelmeros se caracterizan por el hecho de que tienen una estabilidad muy alta en el sistema biologico y, comparables a los aptameros, interaction espedficamente con la molecula objetivo contra la cual se dirigen. Con el proposito de generar espiegelmeros, se crea una poblacion heterogenea de acidos nucleicos D y esta poblacion se pone en contacto con la antfpoda optica de la molecula objetivo, en el presente caso por ejemplo con el enantiomero D del enantiomero L de ocurrencia natural de la protema quinasa N beta. Posteriormente, se separan aquellos acidos nucleicos D los cuales no interaction con la antfpoda optica de la molecula objetivo. Sin embargo, se separan aquellos acidos nucleicos D que interactuan con la antfpoda optica de la molecula objetivo, opcionalmente se determinan y/o se secuencian y posteriormente se sintetizan los acidos nucleicos L correspondientes con base en la informacion de la secuencia de acidos nucleicos obtenida de los acidos nucleicos D. Estos acidos nucleicos L que son identicos en terminos de secuencia con los acidos nucleicos D anteriormente mencionados que interactuan con la antfpoda optica de la molecula objetivo, interactuaran espedficamente con la molecula objetivo de ocurrencia natural en lugar de con la antfpoda optica de la misma. Similar al metodo para la generacion de aptameros tambien es posible repetir las diversas etapas varias veces y asf enriquecer aquellos acidos nucleicos que interactuan espedficamente con la antfpoda optica de la molecula objetivo.
Una clase adicional de compuestos que se pueden fabricar o generar con base en la protema quinasa N beta o un acido nucleico que codifica la protema quinasa beta, como la molecula objetivo como se describe aqm, son las ribozimas, oligonucleotidos antisentido y siARN.
Es una caractenstica comun de todos los acidos nucleicos anteriormente mencionados que no interactuan con la molecula objetivo al nivel del producto de traduccion que a su vez esta presente en el caso de la protema quinasa N beta, sino que por el contrario interactuen con el producto de trascripcion, es decir, el acido nucleico que codifica la protema quinasa beta tal como el acido nucleico genomico o cualquier acido nucleico derivado del mismo tal como los correspondientes hnARN, cADN y mARN, respectivamente. Hasta ahora, la molecula objetivo de la clase anteriormente mencionada de compuestos es preferiblemente el mARN de la protema quinasa N beta.
Las ribozimas son acidos nucleicos catalfticamente activos que consisten preferiblemente de ARN que comprende basicamente dos porciones. La primera porcion muestra una actividad catalftica mientras que la segunda porcion es responsable de la interaccion espedfica con el acido nucleico objetivo, en el presente caso el acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta. Luego de la interaccion entre el acido nucleico objetivo y la segunda porcion de la ribozima, normalmente mediante hibridacion y emparejamiento de bases Watson-Crick de esencialmente los tramos de bases complementarios sobre las dos cadenas de hibridacion, la porcion catalfticamente activa se puede volver activa lo que significa que esta cataliza intramolecular o intermolecularmente, el acido nucleico objetivo en el caso de que la actividad catalftica de la ribozima sea la actividad de la fosfodiesterasa. Posteriormente, puede haber una degradacion adicional del acido nucleico objetivo que al final da como resultado la degradacion del acido nucleico objetivo asf como tambien la protema derivada de dicho acido nucleico objetivo que en el presente caso es la protema quinasa N beta debido a la falta de protema quinasa N beta recientemente sintetizada y un recambio de protema quinasa N beta existente anterior. Las ribozimas, su uso y principios de diseno son conocidos por el experto en la tecnica, y, por ejemplo se describen en Doherty y Doudna (Ribozym structures and mechanism. Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30: 457-75) y Lewin y Hauswirth (Ribozyme Gene Therapy: Applications for molecular medicine. 2001 7:221-8).
El uso de oligonucleotidos antisentido para la fabricacion de un medicamento y como un agente de diagnostico, respectivamente, se basa en un modo similar de accion. Basicamente, los oligonucleotidos antisentido se hibridizan con base en complementariedad de la base, con un ARN objetivo, preferiblemente con un mARN, activan de esta manera la RNasa H. La RNasa H se activa mediante tanto el fosfodiester como el ADN acoplado a fosforotioato. Sin embargo, el ADN acoplado a fosfodiester se degrada rapidamente mediante las nucleasas celulares con la excepcion del ADN acoplado a fosforotioato. Estos derivados de de ADN de ocurrencia no natural resistentes no inhiben la RNasa H luego de la hibridacion con el ARN. En otras palabras, los polinucleotidos antisentido son solamente efectivos como complejos de hubridos de ADN ARN. Ejemplos de esta clase de oligonucleotidos antisentido se describen, entre otros, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,849,902 y 5,989,912. En otras palabras, con base en la secuencia de acidos nucleicos de la molecula objetivo que en el presente caso es el acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, o de la protema de objetivo de la cual se puede deducir una secuencia de acidos nucleicos respectiva en principio, o al conocer la secuencia de acidos nucleicos como tal, particularmente el mARN, se pueden disenar los oligonucleotidos antisentido adecuados con base en los principios de complementariedad de base.
Particularmente preferidos son los oligonucleotidos antisentido que tienen un tramo corto de ADN fosforotioato (3 a 9 bases). Se requiere un irftnimo de 3 bases de ADN para la activacion de la RNasa H bacteriana y se requiere un irftnimo de 5 bases para la activacion de la RNasa H de mairftfero. En estos oligonucleotidos quimericos existe una region central que forma un sustrato para la RNasa H que esta flanqueada por los “brazos” hibridizantes comprendidos de nucleotidos modificados que no forman sustratos para la RNasa H. Se pueden modificar los brazos hibridizantes de los oligonucleotidos quimericos tal como mediante 2'-O-metilo o 2'-fluoro. Los metodos alternativos utilizan enlaces de
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metilfosfonato o fosforamidato en dichos brazos. Las realizaciones adicionales del oligonucleotido antisentido util en la practica de la presente invencion son los P-metoxioligonucleotidos, P-metoxioligodesoxirribonucleotidos parciales o P- metoxioligonucleotidos.
De particular relevancia y utilidad para la presente invencion son aquellos oligonucleotidos antisentido como se describe particularmente en las dos patentes Estadounidenses mencionadas anteriormente. Estos oligonucleotidos contienen nucleotidos ligados 5'^-3' de ocurrencia no natural. En cambio, los oligonucleotidos tienen dos tipos de nucleotidos: 2'- desoxifosforotioato, que activa la RNasa H, y nucleotidos 2'-modificados que no la activan. Los enlaces entre los nucleotidos 2'-modificados pueden ser fosfodiesteres, fosforotioato o P-etoxifosfodiester. La activacion de la RNasa H se logra por una region de activacion de RNasa H contigua, que contiene entre 3 y 5 nucleotidos 2'-desoxifosforotioato para activar la RNasa H bacteriana y entre 5 y 10 nucleotidos 2'-desoxifosforotioato para activar la RNasa H eucariotica y, particularmente, mairnfera. La proteccion de la degradacion se realiza al elaborar la nucleasa de bases terminales 5' y 3' altamente resistentes y, opcionalmente, al colocar un grupo de bloqueo de terminal 3'.
Mas particularmente, el oligonucleotido antisentido comprende un terminal 5' y un terminal 3'; y desde 11 hastaa 59 nucleotidos enlazados 5'^-3' seleccionados independientemente del grupo que consiste de nucleotidos de fosfodiester 2'-modificados y nucleotidos de P-alquiloxifosfotriester 2'-modificado; y en donde el nucleosido de terminal 5' se adhiere a una region de activacion de RNasa H de entre tres y diez desoxirribonucleotidos ligados a fosforotioato contiguos, y en donde el terminal 3' de dicho oligonucleotido se selecciona del grupo que consiste en un desoxirribonucleotido invertido, un tramo contiguo de uno a tres ribonucleotidos 2'-modificados de fosforotiato, un grupo biotina y un nucleotido de P- alquiloxifosfotriester.
Tambien se puede utilizar un oligonucleotido antisentido en donde el nucleosido de terminal 5' no se adhiere a la region de activacion de RNasa H sino a nucleosido de terminal 3' como se especifico anteriormente. Tambien, el terminal 5' se selecciona del grupo particular en lugar del terminal 3' de dicho oligonucleotido.
Los oligonucleotidos antisentido adecuados y utiles tambien son aquellos que comprenden una region de activacion de RNasa H de terminal 5' y que tienen entre 5 y 10 nucleotidos de desoxifosforotioato; entre 11 a 59 2'- metoxirribonucleotidos ligados 5'^3' contiguos; y un grupo de bloqueo de exonucleasa presente en el extremo 3' del oligonucleotido que se extrae del grupo que consiste de un nucleotido ligado a no-5'-3'-fosfodiester, de uno a tres nucleotidos modificados ligados a 5'-3' contiguos y un grupo de bloqueo qmmico de no nucleotidos.
Se pueden caracterizar dos clases de oligonucleotidos antisentido particularmente preferidos como sigue:
La primera clase de oligonucleotidos antisentido, tambien denominada aqrn como la segunda generacion de oligonucleotidos antisentido, comprende un total de 23 nucleotidos que comprenden en la direccion 5'^3' un tramo de siete 2'-O- metilribonucleotidos, un tramo de nueve 2'-desoxirribonucleotidos, un tramo de seis 2'-O-metilribonucleotidos y un 2'-desoxirribonucleotido de terminal 3'. Del primer grupo de siete 2'-O-rnetilribonucleotidos los primeros cuatro se ligan con fosforotioato, mientras que los posteriores cuatro 2'-O-metilribonucleotidos se ligan con fosfodiester. Tambien, existe un enlace de fosfodiester entre el ultimo, es decir, el extremo mas terminal 3' de los 2'-O-metilribonucleotidos y el primer nucleotido del tramo que consiste de nueve 2'- desoxirribonucleotidos. Todos los 2'-desoxirribonucleotidos se ligan con fosforotioato. Tambien esta presente un enlace de fosforotioato entre el ultimo, es decir, el 2'-desoxinucleotido mas terminal 3' y el primer 2'-O-metilribonucleotido del tramo posterior que consiste de seis 2'-O-metilribonucleotidos. De este grupo de seis 2'- O-metilribonucleotidos los primeros cuatro de ellos, nuevamente en la direccion 5'^3', se ligan con fosfodiester, mientras que los ultimos tres, que corresponden a las posiciones 20 a 22 se ligan con fosforotioato. El ultimo, es decir, el 2'-desoxinucleotido de terminal 3' se liga al ultimo, es decir, al 2'-O-metilribonucleotido mas terminal 3' a traves de un enlace de fosforotioato.
Tambien se puede describir la primera clase mediante referencia a la siguiente estructura esquematica: RRRnnnnNNNNNNNNNnnnRRRN. Por esto, R indica ribonucleotidos 2'-O-metilo ligados a fosforotioato (A, G, U, C); n significa ribonucleotidos de 2'-O-metilo (A, G, U, C); N representa desoxirribonucleotidos ligados a fosforotioato (A, G, T, C).
La segunda clase de oligonucleotidos antisentido particularmente preferidos, tambien denominada aqrn como tercera generacion (de) oligonucleotidos antisentido o GeneBlocs, tambien comprende un total de 17 a 23 nucleotidos con la siguiente estructura basica (en la direccion 5'^3').
En el extremo del terminal 5' se encuentra un nucleotido abasico invertido que es una estructura adecuada para conferir resistencia contra la actividad de exonucleasa y, se describe, por ejemplo en el documento WO 99/54459. Este abasico invertido se liga a un tramo de cinco a siete 2'-O-metilribonucleotidos que se ligan a fosfodiester. Despues de este tramo de cinco a siete 2'-O- metilribonucleotidos se encuentra un tramo de siete a nueve 2'-O- desoxirribonucleotidos todos los cuales se ligan a fosforotioato. El enlace entre el ultimo, es decir, el 2'-O-metilribonucleotido mas terminal 3' y el primer 2'-O-desoxinucleotido del 2'-desoxinucleotido que comprende el tramo ocurre a traves de un enlace de fosfodiester. Adyacente al tramo de siete a nueve 2'-desoxinucleotidos se conecta un tramo consistente de cinco a siete 2'-O-
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metilribonucleotidos. El ultimo 2'-O-desoxinucleotido se liga al primer 2'-O-metilribonucleotido del ultimo tramo mencionado que consiste de cinco a siete 2'-O- metilribonucleotidos ocurre mediante un enlace de fosforotioato. El tramo de cinco a siete 2'-O-metilribonucleotidos se ligan a fosfodiester. En el extremo terminal 3' del segundo tramo de cinco a siete 2'-O-metilribonucleotidos se adhiere otro abasico invertido.
Tambien se puede describir esta segunda clase mediante referencia a la siguiente estructura esquematica: (GeneBiocs que representa la 3a generacion de oligonucleotidos antisentido tambien tiene la siguiente estructura esquematica): cap- (np)x(Ns)y(np)z-cap o cap-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-cap. Por esto, cap representa abasicos de desoxi invertidos o modificaciones similares en ambos extremos; n significa ribonucleotidos de 2'-O-metilo (A, G, U, C); N representa desoxirribonucleotidos ligados a fosforotioato (A, G, T, C); x representa un entero de 5 a 7; y representa un entero desde 7 hasta 9; y z representa un entero desde 5 hasta 7.
Se debe observar que los enteros x, y y z se pueden seleccionar independientemente uno del otro aunque se prefiere que x y z sean iguales en un oligonucleotido antisentido dado. De acuerdo con lo anterior, las siguientes estructuras o disenos basicos de los oligonucleotidos antisentido de tercera generacion pueden ser como sigue: cap- (np)5(Ns)7(np)5- cap, cap-(np)6(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)7(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)6(Ns)8(np)5-cap, cap-(np)y(Ns)8(np)5- cap, cap- (np)5(Ns)g(np)5-cap, cap-(np)g(Ns)g(np)5-cap, cap-(np)7(Ns)g(np)5-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)6-cap, cap-(np)a(Ns)7(np)a- cap, cap-(np)7(Ns)7(np)6-cap cap-(np)5(Ns)8(np)6-cap cap-(np)a(Ns)8(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)a-cap, cap-(np)5(Ns)g(np)g- cap, cap-(np)g(Ns)g(np)6-cap, cap-(np)7(Ns)g(np)a-cap, cap-(np)5(Ns)7(np)7-cap, cap-(np)a(Ns)7(np)7-cap, cap-
(np)7(Ns)7(np)7cap, cap-(np)5(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)g(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)7(Ns)8(np)7-cap, cap-(np)5(Ns)g(np)7-cap, cap- (np)6(Ns)g(np)7-cap y cap-(np)7(Ns)g(np)7-cap.
Una clase adicional de compuestos que se puede generar con base en las ensenanzas tecnicas dadas aqrn y que se puede utilizar como medicamentos y/o agentes de diagnostico es el ARN de interferencia pequena (siARN) dirigido al acido nucleico, preferiblemente mARN, que codifica la protema quinasa N beta. El siARN es un ARN de doble cadena que tiene normalmente una longitud de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleotidos. La secuencia de una de las dos cadenas de ARN corresponde a la secuencia del acido nucleico objetivo tal como el acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, que se va a degradar. En otras palabras, conociendo la secuencia de acidos nucleicos de la molecula objetivo, en el presente caso la protema quinasa N beta, preferiblemente la secuencia de mARN, un ARN de doble cadena se puede disenar con una de las dos cadenas que es complementaria, por ejemplo, a dicho mARN de protema quinasa N beta y, despues de aplicacion de dicho siARN a un sistema que contiene el gen, ADN genomico, hnARN, o mARN que codifica la protema quinasa N beta, el acido nucleico objetivo respectivo se degradara y de esta manera se reducira el nivel de protema respectiva. Los principios basicos para disenar, construir, y utilizar dicho siARN como medicamento y agente de diagnostico, respectivamente, entre otros, se describe en las solicitudes de patente internacional WO 00/44895 y WO 01/75164.
Con base en los principios de diseno mencionados anteriormente, es posible generar dicho siARN, oligonucleotidos antisentido y ribozima, respectivamente, una vez que se conoce la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema quinasa N beta. Tambien es cierto para las moleculas precursoras de acidos nucleicos tales como hnARN, cADN y similares, que incluyen acido nucleico genomico. por supuesto, conociendo tambien la cadena antisentido respectiva se puede permitir el diseno de dichos compuestos con base en acido nucleico dado el principio basico de complementariedad de par base, preferiblemente con base en el emparejamiento base de Watson-Crick. De acuerdo con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invencion se relaciona con siARNs espedficos, ribozimas y nucleotidos antisentido los cuales se dirigen contra o son espedficos a protema quinasa N-beta. En lo siguiente, esto se ilustra adicionalmente mediante el siARN, sin embargo, esto tambien aplica a oligonucleotidos antisentido y ribozimas, como lo reconoceran los expertos en la tecnica.
Dicho siARN preferiblemente comprende una longitud desde 15 hasta 5 nucleotidos, por lo cual esto significa realmente cualquier longitud que comprende 15, 16,17, 18, 20,21, 22, 23, 24 o 25 nucleotidos. En realizaciones adicionales, el siARN puede exhibir incluso mas nucleotidos. De acuerdo con los principios de diseno conocidos en la tecnica, se puede generar el siARN respectivo. De acuerdo con lo anterior, el siARN reivindicado aqrn comprende un tramo de preferiblemente cualquier longitud de nucleotido desde 15 hasta 25 nucleotidos consecutivos que ya sea por lo menos parcialmente complementario a la cadena sentido o antisentido que codifica la pKN-beta, y una segunda cadena de ribonucleotidos la cual es por lo menos parcialmente complementaria a la primera y de esta manera a la cadena antisentido y cadena sentido respectivamente, que codifica la protema quinasa N-beta. se puede aplicar cualquier principio de diseno conocido en la tecnica de generacion o fabricacion de siARN a esta clase de estructura doble. El espacio de siARN descrito aqrn comprende moleculas de siARN cuya cadena antisentido inicia con un nucleotido que corresponde al nucleotido No. 1 de una secuencia que codifica la pKN-beta como se especifico anteriormente. Adicionalmente dichas moleculas de siARN comienzan con un nucleotido que corresponde al nucleotido no. 2 de una secuencia que codifica la pKN-beta como se especifico anteriormente, y asf sucesivamente. Esta clase de escaneo sobre la secuencia que codifica la pKN-beta se repite con el fin de suministrar todas las moleculas de siARN posibles las cuales se pueden dirigir contra pKN-beta. La longitud de cualquiera de las moleculas de siARN generadas de esta manera puede ser cualquier longitud adecuada para el siARN, particularmente cualquier longitud como se especifico anteriormente. preferiblemente, las diversas moleculas de siARN del espacio de molecula de siARN descrito aqrn, se sobreponen excepto el nucleotido mas terminal 5' de la cadena antisentido o cadena sentido. Es obvio que las
secuencias antisentido obtenidas de esta manera tienen que complementarse mediante el emparejamiento base con el fin de formar por lo menos parcialmente la estructura de doble cadena requerida para un siARN funcionalmente activo.
Con base en el modo de accion de las clases de compuestos mencionadas anteriormente, tales como anticuerpos, peptidos, anticalinos, aptameros, espiegelmeros, ribozimas, oligonucleotidos antisentido, as^ como tambien siARN, de 5 esta manera esta dentro de la presente invencion utilizar cualquiera de estos compuestos que se dirigen a la protema quinasa N beta y el acido nucleico que codifica la misma, respectivamente, para la fabricacion de un medicamento o un agente de diagnostico para cualquiera de las enfermedades que se describen aqrn y cualquiera de las condiciones de enfermedad descritas aqrn. Adicionalmente, se pueden utilizar estos agentes para monitorear el progreso de dichas enfermedades y condiciones de enfermedad y el exito de cualquier terapia aplicada, respectivamente.
10 Las diversas clases de compuestos disenados de acuerdo con la presente invencion tales como anticuerpos, peptidos, anticalinos, moleculas pequenas, aptameros, espiegelmeros, ribozimas, oligonucleotidos antisentido y siARN tambien pueden estar contenidos en una composicion farmaceutica. Preferiblemente dicha composicion farmaceutica se utiliza para el tratamiento de las enfermedades como se describe aqrn o las condiciones de enfermedad descritas aqrn. En una realizacion la composicion farmaceutica puede comprender una o varias de las clases de compuestos mencionadas 15 anteriormente y/o uno o mas miembros de una sola clase, y opcionalmente un compuesto farmaceutico activo adicional, y un portador farmaceuticamente aceptable. Dicho portador puede ser o lfquido o solido, por ejemplo, una solucion, un regulador, una solucion alcoholica o similares. Los portadores solidos adecuados, entre otros, son almidon y similares. El experto en la tecnica sabe suministrar formulaciones respectivas para los diversos compuestos de acuerdo con las clases de compuestos anteriormente mencionadas con el fin de realzar la ruta particular de administraciones tales como 20 oral, parenteral, subcutanea, intravenosa, intramuscular y similares.
Los diversos compuestos de las diferentes clases de compuestos como se menciono anteriormente, pueden estar tambien, solos o en combinacion, sujetos a o contenidos en un equipo. Dicho equipo comprende aparte de(los) compuesto(s) respectivo(s) adicionalmente uno o varios elementos o compuestos adicionales por lo cual los elementos se seleccionan del grupo que comprende reguladores, controles negativos, controles positivos e instrucciones sobre el 25 uso de los diversos compuestos. Preferiblemente, los diversos compuestos estan presentes ya sea en forma seca o lfquida, preferiblemente como una dosificacion unitaria para la administracion individual de cada uno. El equipo se puede utilizar particularmente para terapia, diagnostico o monitorizacion del progreso de la enfermedad o terapias aplicadas con relacion con las enfermedades y condiciones de enfermedad como se describe aqrn.
La presente invencion se ilustra ahora adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos que no pretenden limitar el 30 alcance de la proteccion. A partir de dichas figuras y ejemplos se pueden tomar caractensticas, realizaciones y ventajas adicionales, en donde
La Figura 1 muestra una representacion esquematica del factor de crecimiento inducido por la activacion de la ruta de PI 3-quinasa;
La Figura 2 muestra la medicion de metastasis del ganglio linfatico en un modelo de raton PC-3 ortotopico despues de 35 tratamiento con rapamicina;
La Figura 3 muestra el metodo experimental para identificar PKNbeta como un objetivo de farmaco en direccion 3' de la ruta de PI 3-Quinasa;
La Figura 4 muestra una pantalla de GeneBloc primaria sobre PKN beta;
La Figura 5 muestra el crecimiento de celulas PC3 transfectadas con GB espedfico de PKNbeta sobre matrigel;
40 La Figura 6 muestra la interferencia de ARN mediante expresion transitoria de siARN en las celulas HeLaB;
La Figura 7 muestra fotograffas de celulas de prostata humana y celulas de cancer de prostata humano luego de hibridacion utilizando secuencias antisentido y sentido de protema quinasa N beta como sondas;
La Figura 8 muestra un diagrama que representa el volumen de los tumores primarios en un modelo de tumor de prostata ortotopico que utiliza dos diferentes construcciones de siARN (Figura 8A); un diagrama que representa el 45 volumen de metastasis de ganglio linfatico en un modelo de tumor de prostata ortotopico que utiliza dos construcciones diferentes de siARN (Figura 8B), y fotograffas de prostata y ganglios linfaticos en un modelo de tumor de prostata ortotopico que utiliza siARN de control (Figura 8C1) y una construccion de siARN espedfica a la protema quinasa N beta (Figura 8C2);
La Figura 9 muestra un analisis de transferencia de Western de diferentes derivados de protema quinasa N beta y sus 50 actividades utilizando MPB como un sustrato de fosforilacion estandar despues de sobreexpresion transitoria en celulas HeLa y anticuerpo de anti-protema quinasa N beta (anti-PK) para detectar los niveles de expresion relativos de los
derivados de quinasa (Figura 9A), un analisis de transferencia de Western adicional de diferentes derivados de protema quinasa N beta utilizando un anticuerpo espedfico para la forma fosforilada de la protema quinasa N beta (Figura 9B), y una representacion esquematica de los diversos derivados de protema quinasa N beta utilizados (Figura 9C);
La Figura 10 muestra un analisis de transferencia de Western de diversos derivados de protema quinasa N beta (Figura 5 10A) para monitorizar los niveles de expresion de los mismos en celulas HeLa y un analisis de gel de la fosforilacion de
los derivados de protema quinasa N beta (Figura 10B);
La Figura 11 muestra los resultados de ensayos de inmunoprecipitacion para detectar la fosforilacion de los sustratos de protema quinasa N beta para detectar la forma fosforilada de la misma mediante analisis de transferencia de Western (Figura 11A) o la incorporacion de fosfato marcado 32P mediante autoradiograffa (Figura 11B). Con el fin de asegurar 10 que estuvieran presentes cantidades comparables de PKNbeta en los precipitados inmunes respectivos, se volvio a sondear el filtro mostrado en la Figura 11A utilizando un anticuerpo de anti-PKNbeta (“quinasa”, Figura 11C).
La Figura 12 muestra un analisis de transferencia de Western que compara la expresion de la protema quinasa N beta endogena en muestras que fueron tratadas con LY294002 durante diferentes momentos en celulas HeLa y PC-3. Fue monitorizado el nivel de AKT fosforilado en paralelo para confirmar la eficacia del inhibidor de PI 3-quinasa.
15 La Figura 13 muestra las cantidades de protema relativa y las actividades de quinasa de diversos derivados de PKNbeta recombinante presentes en inmunocomplejos. Las celulas que expresan las protemas recombinantes respectivas se hadan tratado con el inhibidor LY294002 de PI 3-quinasa antes de la lisis durante los momentos indicados.
La Figura 14 muestra un panel de imagenes, por lo cual se investigo la distribucion celular de PKN beta y derivados de la misma tales como PKN beta de tipo silvestre (Figura 14A), derivado TA de PKN beta (Figura 14B), derivado KE de 20 PKN beta (Figura 14C) y PKN beta deltaN (Figura 14D) por microscopfa de fluorescencia confocal. Los derivados recombinantes etiquetados con HA de PKNbeta se expresaron transitoriamente en celulas HeLa durante 48 horas. Despues de fijacion y permeabilizacion, se detecto la expresion de protemas recombinantes al utilizar un anticuerpo anti- HA seguido por un anticuerpo de anti-raton conjugado con FITC. Las celulas se contratineron al marcar la actina citoesqueletica con rodamina-paloidina.
25 La Figura 1 muestra una representacion esquematica del factor de crecimiento que induce la activacion de la ruta de PI 3-quinasa. La estimulacion del factor de crecimiento de las celulas lleva a una activacion de sus receptores afines en la membrana celular, que a su vez se asocian y activan moleculas de senalizacion intracelular tales como PI 3-quinasa. El PTEN supresor de tumores interfiere con las respuestas en direccion 3' mediadas por PI 3-quinasa y asegura que la activacion de a ruta ocurre de manera transitoria. El LY294002 es un inhibidor de moleculas pequenas de la PI 330 quinasa. Uno de los genes en direccion 3' conocidos de PI 3-K es mTOR (objetivo de marnffero de Rapamicina) que se puede inhibir por el farmaco rapamicina (Rapamune) aprobado clmicamente. La PI 3-K esta involucrada en la regulacion de la proliferacion celular, supervivencia celular, transporte de glucosa, traduccion, metastasis y migracion. X son los efectores en direccion 3' de indicacion que representan los objetivos de farmaco potenciales que se pronostican por estar involucrados en promover el comportamiento metastasico de celulas de cancer. Esta clase de moleculas efectoras 35 que actuan adicionalmente en direccion 3' en la ruta es probable que representen mejores objetivos de farmaco que los objetivos mas “en direccion 5'” tales como mTOR, dado que tienen pocos efectos pleiotropicos.
La materia objeto de la Figura 2 a la Figura 5 se describe en mas detalle en relacion con los siguientes ejemplos.
La Figura 6 muestra la interferencia por la expresion transitoria de siARN en celulas HeLaB.
(A) Las moleculas de siARN se generaron por la expresion accionada por el promotor (U6+2) de secuencias espedficas 40 objetivo (plantilla derivada del gen de interes que contiene secuencias complementarias sentido e inversa de 21-mero
ligadas por el tramo poli A 12-mero. Luego es probable que los ARN de transcripcion formen moleculas de siARN de doble cadena.
(B) Secuencias de plantilla de genes dirigidos para expresion de siARN. Las secuencias correspondientes se introdujeron en vectores de expresion que llevan el casete del promotor U6+2.
45 (C) Efecto de la expresion de siARN sobre el crecimiento y proliferacion celular. Las construcciones (vease
anteriormente) se expresaron transitoriamente mediante transfeccion en celulas HeLaB para experimentos de interferencia de ARNi. Las celulas se cosecharon 48 horas despues de ser transfectadas y se sembraron posteriormente (80000 celulas por pozo) en gel “matrigel”. El efecto de la interferencia de ARN en la expresion de los genes correspondientes se analizo al ensayar las celulas transfectadas para crecimiento/proliferacion en matrigel. La expresion 50 de siARN dirigida a a PTEN no tuvo efecto sobre el crecimiento de celulas HeLaB sobre el matrigel (panel derecho), mientras que la expresion de siARN espedfica a p110beta y PKNbeta alteraron severamente el comportamiento del crecimiento de HeLaB en matrigel (paneles intermedio y derecho).
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Ejemplo 1: Materiales y Metodos Cultivo celular
Se obtuvieron celulas PC-3 de carcinoma de prostata humano de la Coleccion Americana de Cultivos de Tipo (ATCC). Las celulas se cultivaron en una Mezcla Nutriente F12K (modificacion de Kaighn) que contema 10% de suero bovino fetal (CS), gentamicina (50 pg/ml) y anfotericina (50 ng/ml). Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de 96 pozos o de 10 cm (a una confluencia de 30% a 50%) al utilizar diversos lfpidos cationicos tales como Oligofectamina, Lipofectamina (Life Technologies), Argfectin50 o Profectin50 (Atugen/GOT Berlin, Alemania), o FuGene 6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los GeneBlocs se transfectaron al agregar un complejo concentrado 5x formado previamente de GeneBloc y Lfpido en un medio libre de suero a celulas en medio completo. El volumen de transfeccion total fue de 100 pl para las celulas colocadas en placas de 96 pozos y 10 ml para celulas en placas de 10 cm. La concentracion final de lfpidos fue de 0.8 a 1.2 pg/ml dependiendo de la densidad celular; la concentracion de GeneBloc se indica en cada experimento.
Las celulas cultivadas se sometieron a tripsina y cosecharon despues de detener el efecto de tripsina por el medio. Se agregan procedimientos de enjuague (PBS; Centrifugacion 5 min/1.000 rpm) y, finalmente, el sedimento se vuelve a suspender considerando el numero y volumen celular que se va a inocular.
Determinacion de las cantidades relativas de niveles de ARN mediante analisis Taqman.
El ARN de las celulas transfectadas en 96 pozos se aislo y purifico utilizando el equipo Invisorb RNA HTS 96 (InVitek GMBH, Berlin). La inhibicion de la expresion de mARN de PKN beta se detecto mediante analisis de RT-PCR (Taqman) en tiempo real utilizando cebador 5' de PKNbeta 300 nM, cebador 3' de PKNbeta 300 nM y 100 nM de sonda Taqman PKNbeta etiquetada con Fam-Tamra. La reaccion se llevo a cabo en 50 pl y se ensayo en el detector de Secuencias ABI PRlSM 7700 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante bajo las siguientes condiciones: 48° C durante 30 minutos, 95° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95° C y 1 minuto a 60° C.
Crecimiento in vitro sobre matriz de matrigel.
Las celulas de PC3 se trataron con 5 pM de LY294002 o DMSO cuando se sembraron sobre Matrigel. Si las celulas se transfectaron antes de sembrarlas, estas se transfectaron con GeneBloc y se sometieron a tripsina 48 horas despues de transfeccion. Las celulas se enjuagaron en medio y se sembraron en 24 pozos duplicados (100.000 celulas por pozo) se cubrieron previamente 250 pl de matriz de membrana base de matrigel (Becton Dickinson). Despues de incubacion durante 24 a 72 horas se tomaron fotograffas a una magnificacion de 5x con una camara Axiocam adherida a un microscopio Axiovert S1 00(Zeiss).
Affymetrix
Se preparo ARN total desde el crecimiento de celulas sobre Matrigel utilizando el equipo Totally ARN (AMBION) siguiendo el protocolo de los fabricantes. En la etapa final se volvio a suspender el ARN total precipitado en el regulador de lisis Invisorb y se purifico utilizando el equipo spin cell-RNA Invisorb (INVITEK). Se preparo el cARN marcado con biotina siguiendo los protocolos de Affymetrix y se hibridizaron 15 pg de cARN sobre el juego HG-U95 de Affymetrix Genechip.
Analisis de datos
Se analizaron los datos en bruto utilizando el software Microarray Suite v4.0 de Affymetrix Genechip. La intensidad de cada juego de sonda se calcula como la diferencia de la senal de hibridacion de oligonucleotidos de emparejamiento perfecto en comparacion con los oligonucleotidos mal emparejados promediados sobre el equipo de 16 a 20 pares de sondas que corresponden a una transcripcion. La diferencia promedio de un juego de sondas es proporcional a la abundancia de una transcripcion. Las intensidades totales de senal de diferentes arreglos se escalaron al mismo valor antes de comparacion. Los cambios de veces se calcularon utilizando el software Affymetrix mediante comparacion en forma de pares de las intensidades de los pares de sonda correspondientes a partir del experimento y los arreglos iniciales. Utilizando las matrices de decision descritas por Affymetrix el software tambien genera lecturas absolutas (la transcripcion esta ausente, marginal o presente en un experimento) y lecturas de diferencia (abundancia de una transcripcion en un experimento en comparacion con otro: incremento, incremento marginal, sin cambios, disminucion marginal, disminucion). Los resultados se exportaron a Microsoft Excel (lectura absoluta, lectura de diferencia, cambio de veces) y se filtraron. Se descartaron todos los conjuntos de sonda con lecturas ausentes o una lectura sin cambio y se clasificaron en la tabla por el cambio de veces.
Estudios en animales
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Se realizaron los experimented in vivo correspondientes a las Buenas Practicas de Laboratorio para Estudios No Clmicos de Laboratorio (GLP Regulations) de la Administracion de Farmacos y Alimentos y de acuerdo con la ley Alemana de proteccion a animales como base legal.
Ratones Shoe:NMRI-nu/nu machos (Tierzucht Schonwalde GmbH) conservados bajo condiciones de SPF (equipo de flujo de aire laminar, Scantainer, Scanbur) servidos como receptores para celulas de carcinoma de prostata humana. Los animales, con edades de 6-8 semanas y con pesos de 28-30 g, se inocularon con 2x106/0,03 ml de celulas de tumor en el lobulo dorsolateral izquierdo de la glandula prostatica (iprost; Orthotopic) o la punta del lobulo lateral izquierdo del tugado (ihep; Ectopic). Para este proposito, los ratones recibieron una anestesia corporal general utilizando una mezcla de Ketanest (Parke-Davis GmbH) y Rompun (Bayer Vital GmbH) 80:1 con dosificaciones de 100 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente. Siguiendo esterilizacion profunda de la superficie corporal ventral se llevo a cabo una incision a traves de la piel abdominal y la pared peritoneal comenzando cerca del borde de la glandula prepucial y que mide aproximadamente 1 cm. Por medio de un par de tenazas y un estropajo de algodon se visualizo la glandula prostatica. La celula ortotopica se inoculo seguida con la ayuda de una lupa y mediante el uso de una jeringa de 1 ml (Henke Sass Wolf GmbH) que tiene agujas microlanza 30G 0.30x13 (Becton Dickinson). Fue exitosa una administracion que observa una ampolla marcada en el sitio de inoculacion. La herida se cerro mediante material de sutura (PGA Resorba, Franz Hiltner GmbH) que se refiere a la pared peritoneal y con abrazaderas Michel de 11x2 mm (Heiland) para la piel abdominal. Un atomizador de heridas (Hansaplast Spruhpflaster, Beiersdorf AG) cubrio la lesion. Durante la fase posquirurgica los animales fueron mantenidos en un ambiente calentado hasta que se despertaron completamente. Los animales fueron seleccionados aleatoriamente de acuerdo con el numero de grupos de tratamiento que consisten de 510 animales por cada grupo. Fueron inspeccionados exitosamente inclusive al protocolizar los hallazgos. Se lleva autoclve Ssniff NM-Z, 10 mm (ssniff Spezialdiaten GmbH) como dieta fortificada y se acidifico el agua potable con HCl, ambas ad libitum.
Evaluaciones
Para recibir el nivel de dosificacion real se registraron los pesos corporales los dfas de tratamiento. Al mismo tiempo, se puede derivar del desarrollo de peso corporal con el fin de reconocer las influencias de realizaciones de tratamiento en todo el organismo.
Se realizaron punciones en sangre en el dfa o (valor inicial); 14; 28; y 35 (sacrificio). Se extrajo la sangre de la vena orbital del animal anestesiado a corto plazo (Dietileter, Otto Fischar GmbH). Los parametros de evaluacion que proporcionan datos a la compatibilidad y efectos secundarios de los tratamientos son los siguientes: numeros de leucocitos; numeros de trombocitos; enzimas. Los parametros adicionales transmitidos por la sangre fueron bilirrubina; creatinina; protema; urea; acido urico.
Todos los animales sacrificados se disectaron completamente y se documentaron fotograficamente. Se midieron los tumores (glandula prostatica) y metastasis (metastasis de ganglio linfatico caudal, lumbar, renal) en dos dimensiones por medio de un par de calibradores. Se calculo el volumen de acuerdo con V (mm3)= ab2/2 con b < a. En general, el numero de celulas que realizaron terapia provocaron una toma de tumor al 100% que se relaciona con glandula prostatica. Los pesos de algunos organos (Hfgado; Bazo; Rinon) fueron registrados con el fin de encontrar datos adicionales que se relacionen con el conocimiento de efectos secundarios.
Para analisis histologicos, las muestras de tejidos de tumor, es decir, tumores prostatico y metastasis de ganglio linfatico, se fijaron en formaldetudo al 5% y parafina incorporada. Habitualmente, las secciones se tineron con HE, si era necesario se realizaron tinciones espedficas (Azan, PAS).
Para detectar el origen humano de las celulas de tumor y metastasicas, se congelaron muestras de tejido adecuadas en nitrogeno lfquido. Al utilizar analisis de PCR y Taqman con amplicon espedfico de huHPRT se pudo detectar 50 celulas humanas en 5 mg de tejido.
Los resultados terapeuticos se verificaron estadfsticamente mediante la prueba u de Mann y Whitney.
Ejemplo 2: Prueba de concepto experimental sobre la adecuabilidad de objetivos de farmaco en direccion 3'.
Como se bosqueja en la parte introductoria de esta especificacion que se incorpora aqrn mediante referencia, los objetivos ligados en direccion 3' a una ruta de senalizacion son valiosos para el diseno o desarrollo de medicamentos y agentes de diagnostico. Es obvio que, si el objetivo particular se liga a otras rutas diferentes o se debe a su posicion dentro de la ruta de senalizacion se liga a un numero de fenomenos biologicos tales como, por ejemplo, metastasis y migracion, apoptosis de traduccion de crecimiento, ciclo celular, reparacion de ADN y similares como en el caso de la PI 3-quinasa, cualquier compuesto que aborde este objetivo es propenso a tener un cierto numero de efectos secundarios que pueden ser perjudiciales al sistema e indeseables desde el punto de vista medico. De acuerdo con lo anterior, los objetivos que actuan adicionalmente en direccion 3' deben ser la primera eleccion para la intervencion terapeutica.
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Los presentes inventores han encontrado que bajo el control de la ruta de PI 3-quinasa estan involucrados posibles objetivos de farmaco adicionales aparte del mTOR, los cuales son espedficos para controlar los fenomenos de metastasis y migracion y de esta manera tumorogenesis. En la industria farmaceutica se ha encontrado que la rapamicina vendida bajo el nombre comercial de Rapamune es adecuada para inhibir la metastasis y migracion. Esto confirma la idoneidad de la estrategia para abordar objetivos de farmaco en direccion 3'.
Como se puede observar de la Figura 2, la rapamicina es adecuada para reducir el volumen de metastasis de ganglio linfatico y es en la medida comparable en su efecto con el inhibidor LY294002 de PI 3-quinasa conocido. Como se representa en la Figura 2A, se utilizo el modelo de toma de tumor y el tratamiento con Rapamune inicio el dfa 1. Ambas concentraciones utilizadas, es decir, 0.4 mg/kg/dosis - 2 mg/kg/dosis llevaron a una tremenda disminucion del grado de metastasis de ganglio linfatico, expresada como un volumen medido de metastasis (mm3) en comparacion con el control negativo que era solucion salina regulada con fosfato.
Para los analisis histologicos, se fijaron muestras de tejidos de tumor, es decir, tumor prostatico y metastasis de ganglio linfatico, en formaldetndo al 5% y parafina incorporada. Rutinariamente, la secciones se tineron con HE, si era necesario se realizaron tinciones espedficas (Azan, PAS).
Basicamente tambien se obtuvieron los mismos resultados en el caso del tratamiento con Rapamune de un modelo de tumor establecido con el tratamiento que inicio el dfa 28.
Se midio la metastasis de ganglio linfatico en un modelo de raton PC-3 ortotopico despues del tratamiento con rapamicina (Rapamune). En la Figura 2(A) se muestran los resultados del modelo de toma de tumor (A). Ratones shoe:NMRI-nu/nu sin pelo (8 por grupo) se inyectaron con 2x106 celulas de PC3 en 0.03 ml de intraprostatico y se llevo a cabo el tratamiento utilizando Rapamune intraperitonealmente a diario durante 28 dfas en dosis de 2 mg/kg y 0.4 mg/kg de PBS sirvio como control.
Para el tratamiento de tumores (B) establecidos, se permitio que los ipro crecieran durante 28 dfas y el tratamiento se llevo a cabo oralmente utilizando Rapamune los dfas 29 a 50 despues de implante. Las dosis fueron seleccionadas como se representa en A. Los animales se sacrificaron el dfa 29 y 51, respectivamente y se determino la metastasis total de ganglio linfatico.
Ejemplo 3: Identificacion de PKN beta como objetivo de farmaco en direccion 3' dentro de la ruta de PI 3-quinasa
El metodo experimental basico se muestra en la Figura 3. Las celulas de PC3 que crecen sobre Matrigel se trataron con DMSO o con el inhibidor PI 3-K LY294002 K y se aislo el ARN total de cada muestra. Se realizo el perfil de expresion genetica Affymetrix y se confirmo la expresion utilizando en ensayo Taqman RT-PCR en tiempo real. Se utilizo p110p como un estandar no diferencial. Las celulas PC3 son PTEN -/- lo que significa que el PTEn supresor de tumores realmente carece de estas celulas de tal manera que la ruta de PI 3-quinasa se activa permanentemente lo cual conduce a un aumneto de la actividad o comportamiento metastasico de las celulas que se expresa por su patron de crecimiento en el ensayo de matrigel. Las celulas con un potencial de crecimiento invasivo exhiben un crecimiento mejorado sobre la membrana base tal como una matriz de matrigel. (Petersen, O.W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A.R. y Bissell, M.J. (1992). La interaccion con membranas base sirve para distinguir rapidamente el patron de crecimiento y diferenciacion de las celulas epiteliales de mama humanas normales y malignas. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 90649068. (Tambien: Sternberger et al., 2002 Antisense & Nucleic acid drug development 12:131-143).
En relacion con esto se debe observar que las celulas de PC3 se hicieron crecer sobre matrigel y tomaron esto como un sistema modelo que esta proximo al ambiente in vivo, se asume que el ARN aislado del mismo esta mas proximo a la situacion o resultados in situ que cualquier preparacion obtenida a partir de celulas que se hacen crecer en un ambiente diferente a matrigel tal como una placa de cultivo celular convencional.
Ejemplo 4: Filtracion de oligonucleotidos antisentido optimos dirigidos a la protema quinasa N beta.
Las celulas PC3 se transfectaron con diferentes concentraciones de GeneBloc como se describe y se determinaron los niveles de mARN 24 horas despues de la transfeccion utilizando ensayos de Taqman con 300 nM de cebadores directo e inverso espedficos a PKNbeta y 100 nM de sonda y 40 nM de cebador directo e inverso y 100 nM de sonda para la □- actina humana. Los niveles de mARN se estandarizaron a niveles de actina internos y las cantidades se muestran con relacion a GBC (celulas transfectadas con un Control Gene Bloc).
El resultado del mismo se muestra en la Figura 4. A partir de la Figura 4 se seleccionaron oligonucleotidos antisentido particularmente ventajosos GeneBlocs 70210 y 70211 para estudios adicionales.
En relacion con el GeneBloc como se utiliza aqrn en los diversos ejemplos se debe observar que todos son oligonucleotidos antisentido de tercera generacion como se espedfica aqrn lo que significa, que tambien es obvio a
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partir de la Tabla 1, que las letras mayusculas representan los desoxirribonucleotidos que estuvieron ligados a traves de un fosforotioato en lugar de un enlace de fosforodiester.
Tabla 1: Resumen de los diversos GeneBlocs utilizados, sus alias, emparejamientos erroneos relativos al acido nucleico objetivo y sus caractensticas estructuradas y de secuencia.
GeneBloc No
Alias MM Secuencia
70669
PKNbeta:706L21 0 ggagg uCC AGTTTCT gagag g
70670
PKNbeta:377L21 0 ug u uucACCTTC AGCu cca ca
24536
PKNbeta:2021L23 0 aggacaa C A CAAG CCAcgtagaa
24537
PKNbeta:2665L23 0 gctctga CAC AAAGT Cg aagtcc
24538
PKNbeta:2322L23 0 gcagtca AAC ACCTCTtcCtCtg
70210
PKNbeta;1034L21 0 ca aca cGGTTGTCCAccttta
70211
PKNbeta:i784L2i 0 tcag tgCTTTG ATGG cgtagt
70671
PKN beta: 183 L21 0 cuucucG C AGT AC AGgcucuC
70676
PKNbeta:1034L21 4 caag a cGCTTGTG C Acgttta
70677
PKNbeta:1784L21 4 tcagagCTTAGTTGGcgttgt
Los diversos GeneBlocs corresponden a las siguientes SEQ. ID. Nos:
70669:
SEQ. ID. NO.3
70670
SEQ. ID No. 4
24536
SEQ. ID No. 5
24537
SEQ. ID No. 6
24538
SEQ. ID No. 7
70210
SEQ. ID No. 8
70211
SEQ. ID No. 9
70671
SEQ. ID. NO.10
70676
SEQ. ID. NO.11
70677:
SEQ. ID. NO.12
Adicionalmente se debe observar que cualquiera de las “t” anteriores son realmente “u” dado el hecho de que los oligonucleotidos antisentido mencionados anteriormente son GeneBlocs, es decir, oligonucleotidos antisentido de tercera generacion.
Ejemplo 5: Desactivacion selectiva de protema quinasa N beta
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Con el fin de probar que la protema quinasa N beta es un objetivo de farmaco en direccion 3' adecuado de la ruta de PI 3-quinasa, se utilizaron los dos GeneBlocs particularmente ventajosos que se obtienen del ejemplo 4 en un matrigel con base en el experimento de crecimiento. El experimento de crecimiento de matrigel se toma como un modelo subrogado que muestra la metastasis y comportamiento de migracion de la celula respectiva. Un crecimiento mas confluente de las celulas se toma como indicacion de que se incrementan sus metastasis y comportamiento de migracion lo cual le permite a las celulas dispersarse sobre la estructura tridimensional suministrada por el matrigel.
Las celulas de PC3 se transfectaron y sembraron sobre matrigel como se describe y se monitorizo el crecimiento. Se aislo mARN de un almuota de celulas sembradas sobre matrigel y se analizo utilizando elensayo Taqman (panel izquierdo). El mARN espedfico de PKNbeta se estandarizo a niveles de mARN de p110a endogeno. Se utiliza un GeneBloc espedfico a PTEN como control negativo en las celulas de PC-3'/_PTEN- y se utilizo un GeneBloc espedfico de p110a como control positivo para el crecimiento en la matriz extracelular. La inhibicion de crecimiento espedfico se muestra al comparar el crecimiento de celulas tratadas con el GeneBloc 70210 o 7021 1 espedfico a PKN beta contra sus oligonucleotidos emparejados erroneamente correspondientes 70676 y 70677, respectivamente.
Tambien se ilustran los resultados respectivos en la Figura 5. A partir de esto se puede tener en cuenta que el bloque genetico 70211 y 70210 pueden ser compuestos adecuados para la fabricacion de un medicamento o agente de diagnostico para el tratamiento de enfermedades y condiciones de enfermedad como se describe aqrn.
Ejemplo 6: Interferencia de ARN mediante expresion transitoria de siARN en celulas HeLaB
Este experimento es un ejemplo del diseno exitoso de siARN que permite que se aborde espedficamente la protema quinasa N beta de objetivo de farmaco en direccion 3'. Como se ilustra en la Figura 6(A) las moleculas de siARN se generaron por la expresion abordada por el promotor (U6+2) de secuencias espedficas objetivo (plantilla derivada del gen de interes que contiene secuencias complementarias sentido e inversa de 21-mero ligadas por el tramo poli A 12- mero. Despues de transcripcion, los ARNs son propensos a formar moleculas de siARN de doble cadena.
Se utilizaron diversas construcciones tales como p110beta y PTEN como control positivo y negativo, respectivamente en la misma construccion vectorial que el siARN disenado contra la secuencia de mARN de PKNbeta. El diseno respectivo se muestra en la Figura 6(B) donde las secuencias de plantilla de los genes objetivo para la expresion de siARN se introdujeron en vectores de expresion que llevan el casete del promotor U6+2.
Las construcciones se expresaron transitoriamente por la transfeccion en celulas HeLaB para experimentos de interferencia de ARNi. Las celulas se cosecharon 48 horas despues de ser transfectadas y posteriormente se sembraron (80000 celulas por pozo) sobre matrigel. El efecto de interferencia de ARN en la expresion de genes correspondientes se analizo al ensayar celulas transfectadas para crecimiento/proliferacion sobre matrigel. La expresion de siARN dirigida a PTEN no tuvo efecto sobre el crecimiento de celulas HeLaB sobre matrigel (panel derecho), mientras que la expresion de siARN espedfica a p110beta y PKNbeta altero severamente el comportamiento del crecimiento de HeLaB sobre matrigel (paneles intermedio y derecho).
En vista de esto, la secuencia de siARN particular prueba que es un medio efectivo para el tratamiento de la enfermedad y condiciones de enfermedad como se describe aquf
Ejemplo 7: Deteccion de protema quinasa N beta en tumores de prostata humana
Con el fin de proporcionar evidencia adicional de que la protema quinasa N beta es un objetivo adecuado en el tratamiento de tumores de prostata, se sometio tejido de prostata humana respectivo a hibridacion in situ.
Para la hibridacion in situ se prepararon cadenas sentido y antisentido de las posiciones de nucleotidos 1672 a 2667 de la secuencia NM 013355 en el vector Topo pCR4, con lo cual se utilizo la polimerasa T7 y T3 para propositos de amplificacion. Se hicieron crecer en ratones celulas de tumor de prostata humana (PC-3). Despues de diseccion, el tejido se congelo a -20° C en solucion de isopentano, se corto en rebanadas a -15° C y se almaceo a -80° C. Antes de la hibridacion, las rebanadas se fijaron en paraformaldelddo. Las muestras de tumor humano se fijaron en paraformaldelddo y se incorporaron en parafina. Se trataron muestras de tumor con proteinasa K y se acetilaron. Las sondas de acido nucleico se mercaron doblemente con 35S-ATP y 35S-UTP y se incubaron con tejidos a 58° C en un regulador de hibridacion (NaCl 0.4 M, formamida al 50%, 1x Denhardt's, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, sulfato de dextrano al 10%, 10 |jg/ml de cada tARN y ADN de esperma de salmon, DTT 10 mM) que contiene formamida al 50%.
El resultado de la hibridacion in situ se representa en la Figura 7. Utilizando la sonda antisentido de protema quinasa N beta para la hibridacion in situ de tumor de prostata, las glandulas se tinen intensivamente (Figura 7A). En contraste con esto, el tejido de prostata saludable se tine menos y se proporciona para solo una senal de fondo, utilizando nuevamente la sonda antisentido (Figura 7C). En contraste a esto, el uso de la sonda sentido en relacion con ambos tejidos, no proporciono ninguna senal.
Ejemplo 8: Reduccion in vivo de tumores primarios y metastasis de ganglio linfatico mediante siARN.
Este ejemplo se relaciona con la validacion genica objetivo in vivo utilizando un modelo de tumor de prostata ortotopico en el que se puede mostrar que al utilizar el siARN dirigido a protema quinasa N beta se puede realizar una reduccion del tumor primario y la metastasis del ganglio linfatico. Los resultados se representan en las Figuras 8A a 8C.
5 En el diagrama de la Figura 8A, el volumen de tumores primarios, determinados como se describe en el ejemplo 1, en un modelo de tumor de prostata ortotopico se podna reducir significativamente utilizando cualquiera de las dos siguientes construcciones de siARN:
5'actgagcaagaggctttggag o
5'aaattccagtggttcattcca.
10 Como control negativo, se utilizo el siARN contra la subunidad de p110-a y como control positivo, el siARN contra la subunidad de p110-p. De esta manera, el control positivo aborda el regulador en direccion 5' de PTEN de protema quinasa N beta.
Se utilizo un grupo adicional de dos moleculas de siARN independientes para degradar el mARN que codifica la protema quinasa N beta en metastasis de ganglio linfatico. Las metastasis de ganglio linfatico son tumores secundarios 15 encontrados en los siguientes ganglios linfaticos: Ganglios linfaticos Caudales, Lumbares, Renales y mediastinales por los cuales los ganglios linfaticos caudales estan mas cerca la prostata y los ganglios linfaticos mediastinales est'na mas distantes al tumor de implante. Como en el caso del tumor primario, las construcciones de siARN obviamente redujeron exitosamente el mARN que codifica la protema quinasa N beta y de esta manera reduce el volumen del tumor (Figura 8B). Los controles positivo y negativo fueron como se describe en relacion con la reduccion del tumor primario. En 20 ambos casos, es decir, tumor primario y metastasis de ganglio linfatico, las celulas de tumor de prostata humana se disenaron geneticamente para expresar las moleculas de siARN respectivas a partir de un promotor U6 III de polimerasa.
Aparte de estos resultados, un analisis fenotfpico claro como se representa en la Figura 8C1 y la Figura 8C2 muestran que despues de la activacion de la transcripcion de la construccion de siARN en las celulas de tumor de prostata 25 humana, las metastasis de ganglio linfatico podnan reducirse significativamente y el ganglio linfatico hinchado representado en la Figura 8C1 no esta presente en el tejido tratado con siARN como se representa en la Figura 8C2.
Ejemplo 9: Caracterizacion funcional de la protema quinasa N beta
Este ejemplo se relaciona con la caracterizacion funcional de la protema quinasa N beta y particularmente con el impacto de la derivacion, es decir, el truncamiento o mutacion de residuos de aminoacidos funcionales, de protema 30 quinasa N beta sobre su actividad de quinasa y sobre la regulacion de su actividad de quinasa mediante fosforilacion.
Se generaron los siguientes derivados de protema quinasa N beta como tambien por lo menos parcialmente se representan en la Figura 9C con los residuos de aminoacidos referentes a la secuencia de tipo silvestre como se describe aqrn:
a) dominio de quinasa que comprende los aminoacidos 535- 889;
35 b) AN que comprende los aminoacidos 288-889;
c) dominio de quinasa que tiene una mutacion en la posicion 588 de lisina a arginina;
d) dominio de quinasa que tiene una mutacion en la posicion 588 de lisina a acido glutamico;
e) derivados del dominio de quinasa que tienen mutaciones en el sitio de fosforilacion (consenso de bucle de activacion de AGC) con el residuo de treonina en la posicion 718 del aminoacido ya sea se cambie a alanina (TA718) o a un acido
40 aspartico o acido glutamico (TD718 o Te7 18); y
f) molecula de PKNbeta de tipo silvestre de longitud completa (889 aminoacidos).
Los fragmentos respectivos se expresaron transitoriamente en celulas HeLa. Se determino su expresion relativa mediante analisis de transferencia de Western de los extractos de celulas HeLa utilizando un anticuerpo anti-PKNbeta.
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Se genera el antisuero de anti-PKNbeta policlonal despues de sobreexpresar los aminoacidos de terminal C (609-889) de PKNbeta en E.coli. El fragmento de proterna respectivo se purifico con gel a partir de cuerpos de inclusion, se recupero y concentro de acuerdo con procedimientos estandar.
La proterna quinasa N beta tiene homologfas a las moleculas de quinasa de tipo AGC en su dominio catalttico en el terminal C. La familia de quinasas se caracteriza por un residuo de treonina conservada en el bucle de activacion del dominio catalftico que necesita ser fosforilado para la actividad enzimatica. Debido a la alta conservacion de esta treonina y el contexto de aminoacidos circundantes en el bucle de activacion, los anticuerpos anti-fosfo contra este sitio estan disponibles de fuentes comerciales. Los anticuerpos respectivos son denominados como anti-P*-PRK en la Figura 9 y como anti-P*AGC quinasa en la Figura 10.
El MPB es la proterna basica de mielina que es un sustrato de fosforilacion in vitro estandar.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
Derivado de proterna quinasa N beta
Actividad
Wt de longitud completa
+ + *
Dominio de quinasa que comprende aminoacidos 535-889
+*
AN que comprende aminoacidos 288-289
*
Dominio de quinasa que tiene una mutacion en la posicion 588 de lisina a arginina (KR 588)
*
Dominio de quinasa que tiene una mutacion en la posicion 588 de lisina a acido glutamico (KE 588)
*
TA718
*
TD718o TE718
-*!
+ : activo
-: inactivo
!: no se observo ninguna “hiperactivacion” como se pudiese esperar de mutaciones comparables en otras quinasas (Morgan y Debond, 1994)
Los resultados se representan en la Figura 9.
La Figura 9A muestra un analisis en gel de diferentes derivados de proterna quinasa N beta y sus actividades utilizando MPB como un sustrato de fosforilacion convencional despues de sobreexpresion transitoria en celulas HeLa. Como se puede tomar de la Figura 9A aparte de la proterna quinasa N beta de longitud completa solo el dominio de quinasa en su otra forma silvestre se encuentra activo en MPB de fosforilacion.
Utilizando los mismos derivados de proterna quinasa N beta se puede observar que excepto el derivado que comprende el dominio de quinasa que tiene la mutacion T/A en la posicion 718, todos los otros derivados exhibidos tambien se fosforilaron independientemente de sus actividades intrrnsecas adicionales.
Los datos indican que la presencia de un dominio de quinasa funcional y fosforilacion en la posicion 718 son prerequisites para la actividad de quinasa de PKNbeta. Sin embargo, como se puede concluir de la incapacidad de la version de AN para actuar como una quinasa, no son suficientes. Los datos tambien indican que la PKNbeta no se autofosforila en el aminoacido 718, sino que en cambio, requiere fosforilacion por otra molecula de quinasa, dado que la proterna mutante KR588 defectuosa de quinasa mantiene la fosforilacion en la posicion 718.
Ejemplo 10: Caracterizacion de PKNbeta de longitud completa
Con el fin de analizar las mutaciones de residuos de aminoacidos funcionales de la proterna quinasa N beta en el contexto de la molecula de longitud completa, se llevaron a cabo los siguientes experimentos como se muestra en las Figuras 10 y 11:
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Para medir la actividad de quinasa de la PKNbeta in vitro, los derivados de PKNbeta recombinantes etiquetados con HA- o Myc se expresaron transitoriamente en celulas HeLa o COS-7. El derivado de dominio de quinasa mas pequeno sirvio como control. Los extractos celulares que contienen las versiones recombinantes de protema quinasa N beta se probaron en paralelo con el anticuerpo de anti-protema quinasa N beta (Figura 10A) como se describe en el Ejemplo 9 para demostrar niveles de expresion comparables, y un anticuerpo de sitio AGC anti-fosfo (denominado tambien como anti-P*-AGC-quinasa) (Figura 10B) para mostrar el grado diferente de fosforilacion de los derivados de protema quinasa N beta in vivo.
Ejemplo 11: Requisitos de fosforilacion para la actividad de la protema quinasa N beta de longitud completa y desarrollo de un ensayo no radioactivo de quinasa in vitro - idoneidad de la protema quinasa N beta para ensayos de HTS.
Las moleculas derivadas de PKNbeta se inmunoprecipitaron a partir de los extractos celulares mostrados en la Figura 10 al utilizar anticuerpos anti-tag. Los precipitados inmunes se enjuagaron como se describe (Klippel et al., 1996) y se dividieron en dos mitades. Una mitad se incubo con 5 |jg de MBP (UBI) como un sustrato de fosforilacion, MgCh 4 mM y gamma 32P-ATP en una solucion regulada durante 10 minutos a temperatura ambiente. Adicionalmente, se agregaron inhibidores de fosfatasa y los inhibidores contra quinasas que actuan no espedficamente como en Klippel et al., 1998. Se detecto incorporacion de fosfato radioactivo mediante autoradiograffa despues de separar los productos de reaccion por SDSPAGE al 16% (Figura 11 B).
La segunda mitad de los precipitados inmunes se incubo con 1 jg de protema de fusion GST-GSK3 (Cell Signaling Technology) como un sustrato de fosforilacion en presencia de 200 jM de rATP. La mezcla de reaccion posteriormente se analizo por un gradiente de SDS-PAGE al 8-16% y analisis de transferencia de Western utilizando el anticuerpo GSK3alfa anti-fosfo (Cell Signaling Technology) (Figura 11A). Luego el filtro se pelo y se volvio a probar con un antisuero de anti-PKNbeta para confirmar la presencia de cantidades comparables de protemas de PKNbeta en los precipitados inmunes respectivos (Figura 11 C).
La especificidad de las reacciones de fosforilacion in vitro se controlo analizando las variantes defectuosas de quinasa (por ejemplo, que contienen mutaciones en el sitio de union de ATP, ver anteriormente) en paralelo a la protema activa.
La falta de senal en el caso de la variante de mutacion de TA en el aminoacido 718 de la protema quinasa N beta es de otra forma la protema quinasa N beta de tipo silvestre de longitud completa indica que este residuo de aminoacido de hecho en la posicion de fosforilacion detectada por el anticuerpo (Figura 10B). El hecho de que las variantes deficientes en quinasa (mutacion KE o KR como se muestra en la Figura 10 y la Figura 9, respectivamente) se fosforilan en este sitio indica que la treonina 718 no es un sustrato para autofosforilacion. En cambio, otra quinasa en las celulas debe ser responsable de la fosforilacion de este sitio; por lo que la PDKl es un candidato posible.
Tambien, a partir de este experimento en combinacion con el del ejemplo 9 se revela que la fosforilacion de la protema quinasa N beta en la posicion 718 es un pre-requisito para la actividad de protema quinasa N beta; todas las mutaciones probadas en este sitio evitaron la fosforilacion y resultan en un molecula de quinasa inactiva. En la medida en que una protema quinasa N beta particularmente preferida que se puede utilizar en relacion con cualesquier aspectos de la invencion como se describe aqrn es una protema quinasa N beta que se fosforila en la posicion 718 o un derivado de la misma, que incluye el derivado que comprende el dominio de quinasa solo como se describe aqrn. Los datos indican adicionalmente que la PKNbeta de longitud completa no se autofosforila en el aminoacido 718, sino que en cambio, requiere la fosforilacion por otra molecula de quinasa, dado que la protema mutante de KE588 defectuosa de quinasa retiene la fosforilacion en la posicion 718.
Como se puede observar de la Figura 11, ensayar la actividad de la protema quinasa N beta se puede adaptar en un formato que permite la filtracion de los inhibidores de protema quinasa N beta en un sistema de alto rendimiento.
En una primera etapa, se determino la idoneidad de un formato de filtracion no radioactivo, por lo que los diversos derivados de protema-quinasa N beta como ya se describio con relacion con el ejemplo 10, se utilizaron para fosforilar un sustrato adecuado. Dicho sustrato puede, por ejemplo, ser MBP o un peptido de GSK3 que se inmoviliza normalmente sobre un portador adecuado tal como microesferas de agarosa o sefarosa o sobre superficies plasticas. En el presente caso y como se representa en la Figura 11A, el sustrato es un peptido derivado de GSK3 fusionado a paramiosina. La primera fila indica que todos los diversos ensayos que utilizan diferentes derivados de protema quinasa N beta que realmente contienen dichos derivados. Solo la protema de quinasa N beta tipo silvestre de longitud completa o el dominio de de quinasa como se definio en el ejemplo 9 fueron adecuados para fosforilar el sustrato. Se detecto el sustrato fosforilado en el presente caso por el anticuerpo alfa GSK anti-fosfo (mencionado anteriormente)
Para asegurarse de que el metodo no radioactivo como se representa en la Figura 11A es suficientemente sensible se llevo a cabo el metodo radioactivo en paralelo con la mitad de los precipitados inmunes utilizando MBP como un sustrato de fosforilacion. La eficacia de la actividad de quinasa puede tomarse a partir de la 3cantidad del sustrato fosforilado generado como se indica por la autoradiograffa despues de la incorporacion de [ P]. Como se puede observar a partir de las Figuras 11A y 11B, la protema quinasa N beta de tipo silvestre de longitud completa asf como
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tambien el dominio de quinasa muestran actividad, mientras que (Figura 11A) no se detecto actividad de fondo de las quinasas no espedficas (Figura 11B) con las protemas mutantes KE de longitud completa y TA de longitud completa, respectivamente.
Para resumir, el uso de la protema quinasa N beta de tipo silvestre de longitud completa asf como tambien el dominio de quinasa como se describe aqm, son objetivos adecuados o medios para el diseno de un procedimiento de filtracion en formato HTS. Las etapas respectivas comprenderan de acuerdo con lo anterior
a) generar protema quinasa N beta recombinante purificada mediante expresion en un sistema de expresion no bacteriano tal como el sistema de celulas de insecto (ejemplo para una quinasa diferente en Klippel e al., 1997) en vista del hecho de que la protema necesita fosforilarse para exhibir la actividad de quinasa, no que no se puede realizar facilmente por la expresion en sistemas bacterianos;
b) inmovilizar el sustrato derivado de GSK-3 o sustrato similar, e incubar el sustrato con protema quinasa N beta purificada en presencia de rATP, MgCh e inhibidores en una solucion regulada;
c) detectar la fosforilacion del sustrato por un medio de deteccion apropiado tal como un anticuerpo similar al anticuerpo anti-fosfo-GSK3 opcionalmente despues de enjuagues seriales y opcionalmente despues desarrollarse secuencialmente en sistemas de ensayo Delfia o Lance (Perkin Elmer), por lo que el sitio de fosforilacion se limita por un anticuerpo marcado con Europio. La cantidad de Europio unido se cuantifica despues por el analisis de fluorescencia de resolucion temporal.
Ejemplo 12: Determinacion del nivel de expresion de PKN-beta endogena
En este ejemplo se proporciona evidencia experimental de que la PKN-beta se expresa de manera dependiente a la PI 3-quinasa. La expresion dependiente de la PI 3-quinasa del ARN de PKNbeta mostrada en la Figura 3 se confirma aqm adicionalmente sobre el nivel de protema.
Las celulas de PC-3 se cultivaron como se describe en el ejemplo 1 aqm. Dichas celulas de PC-3 son PTEN -/-. Las celulas HeLa se obtuvieron de la Coleccion de Cultivos Tipo Americano (ATCC) y se hicieron crecer como se describe en Sternberger et al. (2002). Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de 10 cm (a una confluencia de 30% a 50%) utilizando Fugene 6 (Roche, Nutley, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas cultivadas se sometieron a tripsina y se cosecharon luego de detener el efecto de la tripsina por el medio.
Ambos tipos de celulas, es decir, celulas PC-3 y celulas HeLa se trataron durante los momentos indicados con 10 pM de LY294002 o DMSO, por lo cual se utilizo DMSO como solvente para LY294002 y, debido a esto, como control negativo.
Los extractos resultantes se fraccionaron por SDS-PAGE y se analizaron posteriormente mediante analisis de transferencia de Western. Se detectaron los niveles de las protemas indicadas tales como p110, las cuales sirvieron como control de carga, PKN-beta endogena y Akt fosforilada utilizando los anticuerpos respectivos. La Akt fosforilada (P*-Akt) sirve como control para la eficacia del tratamiento mediado por LY294002.
Los resultados se representan en la Figura 12.
En las celulas de PC-3, la inhibicion de PI 3-quinasa provoco una reduccion visible de la expresion de PKNbeta endogena despues de 24 horas, los niveles de protema se redujeron adicionalmente despues de 48 horas de tratamiento. En las celulas HeLa, que expresan cantidades mayores de protema PKNbeta, este efecto fue menos dramatico, pero se pueden detectar cantidades reducidas despues de tratamiento de 48 horas con LY 294002.
A partir de esto se puede concluir que la PI 3-quinasa controla la expresion de PKN-beta.
Ejemplo 13: La actividad de PKN-beta requiere PI3-quinasa
La PKN-beta de tipo silvestre recombinante o los derivados de PKN-beta (como se describe en las Figuras 10-11) se expresaron transitoriamente en las celulas HeLa. Dichos derivados fueron TA derivado y KE derivado de PKN-beta como se describe en el ejemplo 10 aqm. La PKN-beta se modifico en cada caso mediante myc-tag como se describe anteriormente lo cual permitio la precipitacion de PKN-beta y sus derivados utilizando un anticuerpo anti-Myc.
Para la evaluacion de la actividad de PKN-beta se llevo a cabo una actividad de quinasa in vitro utilizando los precipitados inmunes como se describe anteriormente. La mitad de los precipitados se sometio a la reaccion de quinasa in vitro, la segunda mitad se analizo mediante analisis de transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-fosfo- PRK. El filtro se pelo y se volvio a probar utilizando el antisuero anti-PKN-beta. Los niveles de Quinasa p70 S6 se analizaron a partir de los almuotas de lisados celulares, que se retiraron inicialmente, para confirmar la eficacia del
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tratamiento de LY294002 incluso solo despues de un tratamiento de 3 horas. Se obtuvo el anticuerpo anti-fosfo p70 de senalizacion Celular.
Como se puede observar de la Figura 12, el tratamiento con LY294002 lleva a una fuerte inhibicion de la actividad de quinasa de PKNbeta, medida nuevamente aqu mediante fosforilacion de MBP. Este efecto fue visible solo despues de 3 horas de tratamiento, en una actividad de PKNbeta de 24 horas casi se inhibieron completamente. La fosforilacion de PKNbeta en la posicion 718 tambien se comprometio despues de la inhibicion de PI 3-quinasa por LY294002, sin embargo, este efecto fue menos pronunciado que el efecto de la actividad de quinasa.
El derivado de TA de PKN-beta sirve como control inactivo como se mostro anteriormente y como control para la especificidad del anticuerpo PRK anti-fosfo para la fosfo-treonina en la posicion 718 (P*-PK).
La KE derivada de PKN-beta sirve como control deficiente de quinasa como se describe anteriormente. Su estado de Fosforilacion tambien se vio afectado en cierto grado por el tratamiento con LY294002. Esto indica que la quinasa, que es responsable de la fosforilacion de la PKNbeta en la posicion 718, lo hace de forma dependiente de la PI 3-quinasa.
De forma mas importante, este experimento muestra que la PKNbeta no se regula solo por la PI 3-quinasa mediante su nivel de expresion (vease las Figuras 3 y 12), tambien se regula en su nivel de activacion. Estos hallazgos indican que la PKNbeta representa un objetivo en direccion 3' “perfecto” para la interferencia con una ruta de PI 3-quinasa hiperactiva para intervencion terapeutica, dado que es exquisitamente dependiente de la PI 3-quinasa que se regula a diversos niveles. Esto permite la generacion de compuestos los cuales exhiben un efecto distinto tanto en la protema PKN-beta como en el acido nucleico que codifica la misma. Aun mas importante, esta clase de modulacion de actividad de PKNbeta en la traduccion en lugar del nivel de transcripcion, es decir, a nivel de la protema expresada, parece ser mas prominente y duradera que el impacto a nivel de transcripcion.
El metodo de filtracion adicional de acuerdo con la presente invencion se basa en esta busqueda particular y utiliza preferiblemente la prueba de quinasa in vitro radioactiva o no radioactiva segun la lectura de salida.
Ejemplo 14: Senales de localizacion de PKN-beta
En este experimento la localizacion de diversos derivados de PKN-beta se comparo con la localizacion de PKN-beta de tipo silvestre. La Figura 14 muestra imagenes, mediante las cuales la distribucion celular de PKNbeta y los derivados de la misma tales como PKNbeta de tipo silvestre (Figura 14A), TA derivada de PKN beta (Figura 14B), KE derivada de PKN beta (Figura 14C) y deltaN de PKN beta (Figura 14D) se investigaron mediante microscopfa de fluorescencia confocal. Los derivados recombinantes etiquetados con HA de PKNbeta se expresaron transitoriamente en celulas HeLa durante 48 horas. Despues de fijacion y permeabilizacion, se detecto la expresion de las protemas recombinantes utilizando un anticuerpo anti- hA seguido por un anticuerpo de anti-raton conjugado con FITC. Las celulas se contratineron al marcar la actina citoesqueletica con rodamina-faloidina.
Los resultados se representan en las Figuras 14A a 14D, por lo que la imagen respectiva en cada lado izquierdo del duplex de imagenes se relaciona con una imagen de celulas despues de excitacion espedfica a FITC y la imagen derecha ilustra las mismas celulas despues de excitacion utilizando una longitud de onda espedfica para la rodamina- faloidina. El tenido de FITC indica las celulas transfectadas con la protema recombinante respectiva. El tenido de Rodamina-faloidina muestra celulas transfectadas y no transfectadas.
Como se puede observar de la Figura 14A, la PKNbeta de tipo silvestre se ubica predominantemente en el nucleo de las celulas. El mutante del sitio de fosforilacion de TA de PKN-beta y el mutante de KE, ambos son deficientes de quinasa, y no se concentran mas dentro del nucleo en comparacion con la PKNbeta de tipo silvestre, sino que se dispersan sobre toda la celula. Finalmente, como se representa en la Figura 14D, el derivado AN de PKN-beta, que carece del tercer terminal N de la molecula y tambien tiene quinasa defectuosa (vease Figura 9), se excluye esencialmente del nucleo.
Estos datos indican que la localizacion nuclear apropiada de PKNbeta con el nucleo es dependiente de su capacidad para actuar como una molecula de quinasa activa e implica la presencia de su dominio de terminal N. Esto implica que la PI 3-quinasa puede regular tambien su ubicacion celular.
Las caractensticas de la presente invencion descritas en la especificacion, listado de secuencias, reivindicaciones y/o dibujos pueden separadamente y en cualquier combinacion de los mismos ser material para realizar la invencion en diversas formas de la misma.
Listado de Secuencias
<110> Silence Therapeutics AG <120> Uso adicional de protema quinasa N beta <130> A 19015 PCT-EP/A 5 <150> EP 02018572.4
<151> 2002-08-14 <150> US 60/409,570 <151> 2002-09-11 <170> PatentIn version 3.1 10 <210> 1 <211 > 889 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
15 <221> CARACTER^STICAS_MISC
<222> (1).. (889)
<223> protema quinasa N beta (PKN beta)
<400>

Claims (21)

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    REIVINDICACIONES
    1. Uso de la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
  2. 2. Una protema quinasa N beta, o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para uso en un metodo para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
  3. 3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado porque la protema quinasa N beta tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1.
  4. 4. Uso de un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo.
  5. 5. Un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta, o un fragmento de la misma, en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta, para uso en el diagnostico de un tumor de etapa tardfa, in vivo.
  6. 6. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4 o el acido nucleico para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado porque la protema quinasa N beta tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 1.
  7. 7. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4 o el acido nucleico para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado porque el acido nucleico es un acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2.
  8. 8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la protema quinasa N beta o fragmento de la misma para uso de acuerdo con la reivindicacion 2 en donde la protema quinasa N beta es codificada por un acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 2.
  9. 9. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4 o el acido nucleico para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde la secuencia de acidos nucleicos, excepto para la degeneracion del codigo genetico, se hibridana al acido nucleico como se especifica en la reivindicacion 4 y 5.
  10. 10. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4 en donde la secuencia de acidos nucleicos es una secuencia nucleica que se hibrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia de acidos nucleicos o parte de la misma, de acuerdo con la SEQ ID NO. 2.
  11. 11. El uso, la protema quinasa N beta o el acido nucleico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el tumor de etapa tardfa se caracteriza de tal manera que las celulas que estan involucradas en dicho tumor de etapa tardfa carecen de actividad PTEN o muestran un aumento en el comportamiento agresivo.
  12. 12. Uso de un acido nucleico que inhibe un acido nucleico que codifica la protema quinasa N beta o una parte de la misma, en donde dicha parte realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de un tumor de etapa tardfa, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
  13. 13. Uso de un acido nucleico que inhibe la protema quinasa N beta o una parte de la misma, en donde dicha parte realiza el efecto de protema quinasa N beta, para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
  14. 14. Un acido nucleico que inhibe la protema quinasa N beta o una parte de la misma, en donde dicha parte realiza el efecto de protema quinasa N beta, para uso en un metodo para el tratamiento de un tumor de etapa tardfa, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
  15. 15. Un acido nucleico que inhibe la protema quinasa N beta o una parte de la misma, para uso en un metodo para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa in vivo, en donde el acido nucleico que interactua es un oligonucleotido antisentido, una ribozima, aptameros, espiegelmeros o siARN.
  16. 16. Un metodo para la deteccion de un agente para el tratamiento de un tumor de etapa tardfa y/o para la fabricacion de un agente de diagnostico para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa, que comprende las etapas de:
    a) proporcionar un compuesto candidate,
    b) proporcionar un sistema de expresion para la protema quinasa N beta y/o un sistema que detecta la actividad de la protema quinasa N beta;
    c) poner en contacto el compuesto candidate con el sistema de expresion para la protema quinasa N beta y/o el sistema 5 que detecta actividad de la protema quinasa N beta;
    d) determinar si la expresion y/o la actividad de protema quinasa N beta se cambia bajo la influencia del compuesto candidato.
  17. 17. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 16, en donde el compuesto candidato se selecciona de peptidos, protemas, anticuerpos, anticalinos, acidos nucleicos funcionales, compuestos naturales y moleculas pequenas.
    10 18. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 17, en donde los acidos nucleicos funcionales se seleccionan de
    aptameros, aptazimas, ribozimas, espiegelmeros, oligonucleotidos antisentido y siARN.
  18. 19. Un metodo in vitro para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa que comprende el uso de la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema quinasa N beta.
  19. 20. Un metodo in vitro para el diagnostico de un tumor de etapa tardfa que comprende el uso de un acido nucleico que 15 codifica la protema quinasa N beta o un fragmento de la misma en donde dicho fragmento realiza el efecto de protema
    quinasa N beta.
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    Modulo de trjma de tumor: in icio de tratamiento en el d ia 1
    DMSO
    imagen5
    ARN aislado de celulas PC3 tratadas diferencialmente
    Perfil de expresion
    ' Perfil de expresion genica diferencial
    g^nica
    mediante analisis de Taqman
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    Analizado sobre Affymetrix chips
    Verificacion de expresion de diferenciacion utilizando PCR en tiempo real
    FKIMb/actina relativo a GEJC
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    Fig .6
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    24227 Tumor de Prostata
    ■ ^ .. **lmr*m* • ’
    *■ f H.-'-V’t'X
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    .Tf-^
    i ^^tvv *•
    ,200jiin.
    AW
    21619
    Prostata
    Normal
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    PKNB sentido
    |IM |pm ^
    jiW> lJmr
    Volumen de Tumor (mm3) rn Volumen de Tumor (mm )
    Modelo de tumor de prostata ortotopico (N=S)
    imagen12
    siARN: Negative Positivo
    Controles
    Tumor primario
    P'Q.OQJ p 0,001
    imagen13
    Construccion 1 Construction 2
    Quinasa novedosa
    met de ganglio linfatico
    imagen14
    Construccion 1 Construed on 2 Quinasa novedosa
    imagen15
    imagen16
    A. Expresion de “QUINASA” recombinante tran sferencia Western
    B. Fosforilacion in vivode “QUINASA” recombinante
    JFL,,, kq flke fl,a
    FL^ KD FLke FL1a
    3 12 56 7 S
    3 12 5 6 7 8
    . . T"" * ■. .‘.Siii ■‘■VV ■ r ."s ■ j'
    * fWWfWf
    mm
    anticuerpo atugeno anti-”QUINASA” ** **
    antiP'-AGC QUINASA
    FL, “QUINASA" de longitud complete Homologia para la Familia AGC de
    KD, dominio de “QUINASA" Moleculas de Quinasa
    FLKEl mutacion Lys-^GIu en dominio de “QUINASA"
    FLTA( mutacion Thr->Ala en bucle de activacion
    Inmunoprecipitacion anti-Mvc taq/Ensavo de Quinasa In vitro:
    A. No Radioactive
    B Radioactive
    C.Analisis de
    Inmunoensayo de IP
    FL^, KD
    #1 3 1 2
    5 6 7 0
    Transferencia Western
    Sustrato fosforilado in vitro
    J"Lkf F(_ta #1 J 12 56 7 a
    imagen17
    Incorporation de autoradiografia [!"P] Sustrato fosforilado in vitro
    FU, KD FLK£ FL
    #13 12
    K£
    5 6
    TTA
    7 S
    ** — _
    anticuerpo atugeno anti “QUINASA”
    Expresion de PK Dependiente de PI 3-quinasa
    ____HeLa____
    48h 24ti 48h 24 h
    ’ <1 i r-------------------11 -—-——
    D LY D LY D LY D LY
    cn
    NJ
    imagen18
    p110
    imagen19
    imagen20
    imagen21
    imagen22
    PK
    endogeno
    — P*-Akt
    Se requiere PI 3-quinasa para Actividad de PK
    Wt TA KE
    ' —I I --------------1 r-------------
    24h 3h
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    Transferencia Western 1 I 1 1 1 1 ***** r — PK
    Ensayo quinasa in-vitro — * — P*-PK
    - — 32(PJ-MBP
    — — «• - P*-p70 SGK
    Localization Nuclear de PK es Dependiente de la Actividad de Quinasa y terminal N
    Quinasa-FITC Rodamina-Faloidina
    imagen23
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