ES2562158T3 - Procedimiento para el diagnóstico y / o pronóstico del desarrollo de enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el diagnostico y / predicción del desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, en donde, el procedimiento, consta de las siguientes etapas: a) el aislamiento de los glóbulos blancos (leucoticos), a partir de una muestra de sangre, procedente de una persona examinada, b) el enriquecimiento y / o el cultivo de los glóbulos blancos las cuales se han aislado en la etapa a), para la formación de diversas unidades de formación de colonias (CFUs); mediante lo cual se forman CFU-M y otras CFU adicionales, y c) la determinación y la valoración del número de CFU-M, formados en la etapa b), con relación a las otras CFUs formadas.

Description

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resultados, consistente en una cantidad correspondiente a un porcentaje de aprox. un 45 % de CFU-G, una cantidad correspondiente a un porcentaje de aprox. un 33 % de CFU-M, y una cantidad correspondiente a un porcentaje de aprox. un 22 % de CFU—GM correspondiendo, estos resultados, a un considerable desfase de la formación de colonias, en el sentido de la CFU-M.

Análisis de muestras procedentes de personas con una mutación del LRRK2

En otros ensayos los cuales se llevaron a cabo de una forma adicional, se procedió a analizar muestras de personas, las cuales eran portadoras de diversas mutaciones en el Gen LRRK2. Las mutaciones, en el gen LRRK2 (LRRK2-Gen – [“Leucin-rich repeat Kinase 2” – Gen, – Gen quinasa 2 de repetición, rica en leucina ] -), según los nuevos conocimientos existentes en el arte de la técnica especializada, son biomarcadores para enfermedad de Parkinson familiar; Hasta el momento actual, se han identificado las mutaciones G20192, Q930R, y L1114L, del gen LRRK2.

La realización de los ensayos, se llevó a cabo de la forma la cual se encuentra descrita anteriormente, arriba. La formación de las colonias a partir de las muestras procedentes de personas, portadoras de las citadas mutaciones, se comparó con las de las muestras procedentes de las personas de control, así como, también, con las procedentes de aquélla personas las cuales procedían de los pacientes afectados de la enfermedad de Parkinson (véase, a dicho efecto, la Fig. 4). Mediante los resultados obtenidos en la realización de estos ensayos, se confirman los conocimientos existentes en el arte especializado de la técnica, y ya conocidos, para los pacientes los cuales estén afectados de la enfermedad de Parkinson, a saber, el hecho consistente en que, la porción porcentual relativa de las CFU-M, en los portadores de las mutaciones en cuestión, y para las personas afectadas de la enfermedad de Parkinson, era, en valor medio, mayor que la correspondiente a la de las personas de control.

Así, de este modo, mediante estas evidencias, los inventores demuestran el hecho consistente en que, el procedimiento en concordancia con la presente invención, representa un medio apropiado, mediante el cual, pueden realizarse afirmaciones, en cuanto al riesgo de desarrollar enfermedades neurodegenerativas.

Las muestras de sangre, se obtuvieron a raíz de un estudio científico de la Sección para Neurodegeneración, en el Hertie Institut fuer Hirnforchung, -Instituto Herti de la Investigación sobre el Cerebro -, Tübigen (Alemania). Existe a disposición, una instancia ética.

La sangre (una cantidad de aprox. 10 ml), se diluyó mediante una solución salina equilibrada, HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution, Invitrogen, Carlsbad, USA), en un factor de relación de 1 : 1, y ésta se aplicó sobre 15 ml de Ficoll-Paque Plus (de procedencia de GE Healthcare). Mediante un proceso de centrifugación, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a 400 x g, se obtuvieron los glóbulos blancos y, éstos, se lavaron 2 x con, respectivamente, 20 ml de tampón HBSS, en 10 ml de IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Media, -Medio Iscove modificado Dulbecco -, de la firma Invitrogen), se recogieron, y se efectuó un recuento de éstos. Con objeto de efectuar un cultivo adicional de los glóbulos blancos obtenidos, se procedió a utilizar medios de cultivo, con contenido en metilcelulosa, de procedencia de la firma R&D Systems (Human Methylcellulose Complete Media, medio humano completo de metilcelulosa – y Human Methylcellulose Complete Media without Epo -, medio humano completo de metilcelulosa sin EPO). Se procedió a llevar a cabo un recubrimiento de las células, a razón de 500.000 células / ml de medio. El cultivo de las células se llevó a cabo en placas de cultivo de células de 3,5 cm (de procedencia de la firma BD Biosciences Falcon, San Jose, USA), a una temperatura de 37 °C, a un 5 % de CO2, y a un alto porcentaje de humedad. En el día 15, después del recubrimiento (es decir, desde el inicio del cultivo), se procedió a valorar las colonias, con la ayuda de un microscopio de luz, y se calcularon los porcentajes de la poblaciones de clones individuales.

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